JP5081462B2 - トランススプライシング法による融合タンパク質作製方法 - Google Patents
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Description
(1) 第一のタンパク質と第二のタンパク質とからなる融合タンパク質の製造方法において、第二のタンパク質をコードする遺伝子配列を含み、且つ第一のタンパク質をコードする遺伝子配列を含む領域から生成するpre-mRNAに結合してトランススプライシングを誘導できる配列を含む核酸分子(プレトランススプライシング分子)又は該核酸分子を発現できるベクターを、第一のタンパク質を発現する細胞内に導入する工程、及び該細胞内で生成した第一のタンパク質と第二のタンパク質とからなる融合タンパク質を回収する工程を含む、融合タンパク質の製造方法。
(a)5’スプライス配列、3’スプライス配列、又はSμ配列から選択される少なくとも1以上の配列;
(b)分岐点;及び
(c)ピリミジントラクト;
を含む核酸分子又は該核酸分子を発現できるベクターである、(1)又は(2)に記載の方法。
(7) 第一のタンパク質が、抗体H鎖の可変領域タンパク質(VH)を含むタンパク質であり、第二のタンパク質が、抗体H鎖の定常領域CH1タンパク質を含むタンパク質である、(1)から(6)の何れかに記載の方法。
(8) 第一のタンパク質が、抗体L鎖の可変領域タンパク質(VL)を含むタンパク質である、(1)から(5)の何れかに記載の方法。
(9) 第一のタンパク質が、抗体L鎖の可変領域タンパク質(VL)を含むタンパク質であり、第二のタンパク質が抗体L鎖の定常領域CLタンパク質を含むタンパク質である、(1)から(5)、又は(8)の何れかに記載の方法。
(11) 第一のタンパク質を発現する細胞がハイブリドーマである、(1)から(9)の何れかに記載の方法。
(12) 第一のタンパク質を発現する細胞がニワトリ体細胞DT40である、(1)から(9)の何れかに記載の方法。
(14) 第二のタンパク質がアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β―ガラクトシダーゼ、又はルシフェラーゼを含むタンパク質である、(1)から(12)のいずれかに記載の方法。
(16) (1)から(14)のいずれかに記載の方法により抗体H鎖の可変領域タンパク質(VH)及び/または抗体L鎖の可変領域タンパク質(VL)を含む融合タンパク質を製造する工程、及び得られた融合タンパク質を用いて免疫測定を行う工程を含む、免疫測定方法。
本発明では、トランススプライシングを融合タンパク質発現方法として利用するものである。本発明の融合タンパク質は、融合遺伝子を作製して人工的に2種類の以上の異なるタンパク質を結合させたものであればよく、特に限定されるものではないが、例えば、「抗体可変領域をコードするタンパク質」と「酵素」の融合タンパク質などを挙げることができる。
本発明は、トランススプライシングを介して融合タンパク質を製造する方法に関する。本発明の方法では、標的プレmRNA分子(以下、「プレmRNA」という)と相互作用し、かつキメラRNA分子の形成をもたらすトランススプライシング反応を媒介するようにデザインされたプレトランススプライシング分子(以下、「PTM」という)を使用する。本発明の方法においては、上記したPTMと標的プレmRNAとを、PTMの一部がプレmRNAにスプライシングされて新規なキメラR N Aを形成するような条件下で接触させる。標的細胞としては、限定されるものではないが、免疫に関わる細胞、例えばミエローマ細胞のようなモノクローナル抗体産生細胞などが挙げられる。本発明ではハイブリドーマを好ましく用いることができる。ハイブリドーマとは、抗原を免疫した動物の脾臓のB細胞と骨髄腫細胞(ミエローマ)を細胞融合することによって得られる細胞である。ハイブリドーマはB細胞の抗体生産能力とミエローマの無限増殖性両方の能力を有する細胞で、これをクローン化することにより、目的とする抗原に特異的で均質なモノクローナル抗体を産生することができる。
標的プレmRNA分子は、細胞内にもともと存在するものでもよい。その場合、プレトランススプライシング分子は、標的プレmRNA分子を発現する細胞(即ち、第一のタンパク質を発現する細胞)内に導入することができる。あるいは、標的プレmRNA分子は外部から細胞に導入したものでよい。この場合は、第一のタンパク質をコードする遺伝子配列を含み、プレトランススプライシング分子と結合してトランススプライシングを誘導できる配列を含む第二の核酸分子又は該核酸分子を発現できるベクターとを、トランススプライシングが可能な細胞内に導入することになる。
(a)第一のタンパク質をコードする遺伝子配列:
(b)5’スプライス配列、Sμ配列、及び3’スプライス配列
(c)分岐点;及び
(d)ピリミジントラクト;
を含む核酸分子である。該核酸分子を発現できるベクターについては、プレトランススプライシング分子の場合と同様に構築することができる。
本発明の方法で作製される融合たんぱく質のうち、一方のタンパク質(第一のタンパク質)として好ましい抗体について説明する。すべての抗体は基本的には同じ構造を持っており、"Y"字型の4本鎖構造(軽鎖・重鎖の2つのポリペプチド鎖が2本ずつ)を基本構造としている。軽鎖(またはL鎖)は分子量約25,000ですべての免疫グロブリンに共通であり、重鎖(またはH鎖)は分子量50,000〜77,000で、免疫グロブリンの種類によって構造が異なる。この軽鎖と重鎖がジスルフィド結合(SS結合)で結びついてヘテロダイマーを形成し、さらにこのヘテロダイマーが左右2つジスルフィド結合で結合して "Y"字型のヘテロテトラマーを形成する。
本発明の方法で製造される融合たんぱく質のうちの一方のタンパク質(第二のタンパク質)に含まれることが好ましい酵素について説明する。酵素としては特に限定されないが、EIAに用いられる酵素が好ましい。EIAに用いられる酵素としては、より具体的には例えば、ペルオキシダーゼ(PEX)、アルカリフォスファターゼ(ALP)、β−ガラクトシダーゼ(β−Gal)、リンゴ酸脱水素酵素、アセチルコリンエステラーゼ、グルコースオキシダーゼ等が挙げられる。
本発明の方法で製造される融合タンパク質が、細胞内に溶解状態で発現した場合には、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得ることができる。また、本発明の方法で製造される融合タンパク質が、細胞外に分泌される場合には、遠心分離などの方法で細胞を含まない培地を回収することができる。これらの無細胞抽出液又は培地から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル(DEAE)セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、S-Sepharose FF(ファルマシア社製)等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、融合タンパク質を回収精製することができる。好ましくは、融合タンパク質は、プロテインGあるいはプロテインLを固定化したアガロース担体によって精製することができる。
本発明で得られた融合タンパク質は、免疫測定方法に用いることができる。以下、免疫測定方法について説明する。免疫測定法とは、サンプル中に含まれる微量の目的物質を、酵素標識した抗体または抗原を用い、抗原抗体反応を利用して定量的に検出する方法である。ELISA法は 1)目的物質を高感度で検出することができ、定量性にも優れている、2)抗原抗体反応を利用して検出するため粗抽出段階で測定が可能であり、他の検査法で必要とされる精製や前処理といった煩雑なステップを必要としない、3)短時間で大量のサンプルを測定できる、などのメリットがある。免疫測定法は、測定原理の違いからサンドイッチ法(非競合法)と競合法の二つに大別される。これらの方法については酵素免疫測定法(石川 栄治、医学書院(1987))や超高感度酵素免疫測定法(石川 栄治、学会出版センター(1993))に詳細に記載されている。
(1)材料及び方法
培養細胞
モデル系の発現細胞は、サル腎由来のCOS-1細胞を使用した。細胞は、37℃、5%CO2の加湿インキュベーターにて、10%ウシ胎児血清、ペニシリンストレプトマイシンを添加したDMEM培地で培養した。
また、酵素免疫測定法(ELISA)の際に用いる抗4-ヒドロキシ−3-ニトロフェニルアセチル(NP)抗体のλ鎖を発現する細胞J558Lは、The European Collection of Cell Culturesより購入した。
Mun2EcoFor;GGAATTCTTGTTGTTAACTTGTTTATTGC (配列番号1)
SeapHis6p2;CCGGGTTACTCTAGAGTCGGGGCGGCCGGCCACCACCACCACCACCACTGATAAGATACATTGATGAG (配列番号2)
PSEAPFor;GGAATTCCATGGCTTAATTAAGGCGCGCCTCCGGAATCATCCCAGTTGAGGAGGAGAA (配列番号3)
PSEAPBk;CCGGAATTCATATGGGAAGCGGTCCATTGCCAGGGGTAT (配列番号4)
IgMInt5;GGAATTCTTAATTAACTTAAGTAGGTTTGGGGGATG (配列番号5)
IgMInt3;GGAATTCTCCGGAACCTGCAGTCAAGAGAACAC (配列番号6)
VlamMfeBack;CAGGTCCAATTGGATGCTGTTGTGACTCAGGAATC (配列番号7)
VHAflfor2;TTTAAGCTTAAGGACTCACCCGAGGAACTGTGAGAGTGGT (配列番号8)
SuEcoFor;CCAGTACAGCTCAGTCTAGCACATCTGAATTCAGCTCAGCCCC (配列番号9)
SuAflBack1;CCGAGGTGAGTGTGAGAGGACAGGGGCTTAAGTATGGATACGCAGAAGGAAG (配列番号10)
SuAflBack2;GGTCGGCTGGACTAACTCTCCAGCCACCTTAAGGACCCAGACAGAGAAAGCC (配列番号11)
Int20028F;GTTTCGTCCTGTATACCAGG (配列番号12)
IntEcoNcoB;GGAATTCCATGGCTGAGGACCAGAGAGGGATAAAAG (配列番号13)
NPVHMfeBack;CAGGTCCAATTGCAGCAGCCTGGG (配列番号14)
MunIgMCH2for;CACATTTACATTGGGATTCAT (配列番号15)
ターゲットとなる抗体のモデルとして抗4-ヒドロキシ−3-ニトロフェニルアセチル(NP)抗体の重鎖を用い、真核細胞でこれを発現可能なベクターpSV-Vμ1を使用した。pSV-Vμ1は、英国Medical Research CouncilのMichael Neuberger博士より譲渡されたものを使用した(参考文献:EMBO、1983年、2号、1373-1378ページ)(図1)。
まず、pSEAP2_control (Clontech, Inc.)にコードされている分泌型ヒト胎盤アルカリフォスファターゼ(SEAP)のC末端にHis-tagを導入するために以下の操作を行った。
まず、鋳型としてpSEAP2_controlおよびプライマーMun2EcoForとプライマーSeapHis6p2を用いてPCR反応(条件1(表1))によりHis-tagを含むSEAP配列の3'末端付近を増幅した。これを制限酵素EcoRIおよびXbaIにより切断し、制限酵素XbaIおよびMunIで切断したpSEAP2_controlに挿入し、塩基配列を確認した(以下、pSEAP-His)。
pUC-19(TaKaRa Bio, Co.)のEcoRIサイトに鋳型としてpSEAP2_controlおよびプライマーpSEAPForとプライマーpSEAPBkを用いてPCR(条件2(表2))により増幅したSEAPのN末端付近の配列を制限酵素EcoRIで処理して組み込んだ。その上流に、pSV-Vμ1よりプライマーIgMInt5とIgMInt3を用いて増幅(条件3(表3))したCH1領域とCH2領域間のイントロン配列を、PacIおよびBspEIサイト用いて挿入し、さらにその上流に抗NP一本鎖抗体(scFv)をコードするpGEMSCA(Suzuki et al, J. Biochem., 122, 322-329 (1997))を鋳型としてプライマーVlamMfeBackおよびプライマーVHAflFor2でPCR(条件4(表4))より増幅した抗NP一本鎖抗体(scFv)の配列を組み込み、プラスミドpUC-scFv-int-SEAPを作製した。pUC-scFv-int-SEAPnを制限酵素EcoRI、NdeIで処理して、scFv-イントロン-SEPA N末端配列を有するDNA断片を切り出し、同じくEcoRI、NdeIで処理したpSEAP-Hisに組み込むことでベクター(以下pscFv-SEAP)を作製した(図2)。
接着細胞培養用の35mmディッシュ(IWAKI)にCOS-1細胞(1.5×105細胞)を播種し、12〜24時間後にベクターpSV-Vμ1と作製した3種類のTSベクター(pTS-3'ss-SEAP、pTS- Sμ1-SEAP、pTS- Sμ2-SEAP)の内1つのベクター各々をトランスフェクション試薬であるLipofectamine 2000 (Invitrogen, Inc.)またはCOSFectin (BIO RAD, Co.)を用いて通常のプロトコルに従いトランスフェクションを行った。
トランススプライシングによって生成されるmRNAを確認するために、トランスフェクション後48時間の細胞からRNAspin Mini(GE Healthcare)を用いてtotal RNAを抽出した。これにExscript (TAKARA Bio, Co.)を用いてcDNAを作製し、それを鋳型としてプライマーNPVHMfeBackとプライマーpSEAPBkまたはプライマーNPVHMfeBackとプライマーCH2forを用い、PCR反応により増幅(条件8(表8))を行った。
抗原(NP-BSAコンジュゲート)をPBSにより100μg /mlに調製し、それを96穴白色プレート(3922, Corning, Inc.)に100μlずつ分注し4℃で一晩保存し、固定化した。プレートを洗浄後、5倍希釈したイムノブロック(大日本住友製薬(株))を200μlずつ添加して、室温で2時間インキュベートしブロッキングを行った。ここに、COSFectinを用いたトランスフェクション後144時間の培養上清を30μlと、抗NP抗体λ鎖を発現する細胞J558Lの培養上清を10μl添加し、室温で1時間インキュベートを行った。洗浄後Protein Assay Kit -SEAP- (TOYOBO)の内在性AP阻害液を100μl添加し37℃で30分間インキュベートした。さらに洗浄後、同キットの発光基質を100μl添加して、Luminescenser-JNR AB2100 (ATTO, Co.)を用いて10秒間の発光量を積算し測定を行った。
RT-PCR
PSV-Vμ1と3種類のTSベクターのいずれかを導入したCOS-1細胞の全てで、目的のサイズ(605bp)付近のバンドを確認することができた。また、それぞれのバンドの濃度は、ポジコンpScFv-SEAPを導入した細胞のそれの半分程度であり、シススプライシング産物由来のバンドよりも有意に濃かった。これに対し、TSベクター単独あるいはPSV-Vμ1単独を導入した細胞では、この付近にはバンドは見られなかった。これらの結果から、ターゲットおよびTSベクターのpre-mRNA間で高い効率でトランススプライシングによるmRNAが生成されたことが示唆された(図5)。
ターゲット(pSV-Vμ1)とTSベクター(3'ssあるいはSμ-1)を両方導入したCOS-1細胞の培養上清のAP活性をJ588L培養上清存在下で測定した所、片方のベクターのみ、もしく何も導入していない細胞培養上清と比較して、有意に高いAP活性が検出された。また、抗原の有無(NP-BSAを固定した場合とBSAを固定した場合)で比較した場合、NP-BSAを固定化した場合にBSAを固定化した場合に比べて有意に高いAP活性を確認した(図6)。以上より、これらの培養上清中にTSにより生成されたRNA由来のVH-SEAP融合タンパク質が分泌され、λ鎖存在下で抗原結合能を示した事が強く示唆された。
Claims (13)
- 第一のタンパク質と第二のタンパク質とからなる融合タンパク質の製造方法において、第二のタンパク質をコードする遺伝子配列を含み、且つ第一のタンパク質をコードする遺伝子配列を含む領域から生成するpre-mRNAのイントロンに存在するターゲッティング領域に対して相補的なSμ領域を含む標的結合ドメイン、分岐点、ポリピリミジントラクト、及び、3’スプライス部位を含み、上記pre-mRNAに結合してトランススプライシングを誘導できる配列を含む核酸分子(プレトランススプライシング分子)又は該核酸分子を発現できるベクターを、第一のタンパク質を発現する細胞内に導入する工程、及び該細胞内で生成した第一のタンパク質と第二のタンパク質とからなる融合タンパク質を回収する工程を含む、融合タンパク質の製造方法。
- 第一のタンパク質と第二のタンパク質とからなる融合タンパク質の製造方法において、第一のタンパク質をコードする遺伝子配列を含む第一の核酸分子又は該核酸分子を発現できるベクターと、第二のタンパク質をコードする遺伝子配列を含み、且つ第一のタンパク質をコードする遺伝子配列を含む領域から生成するpre-mRNAのイントロンに存在するターゲッティング領域に対して相補的なSμ領域を含む標的結合ドメイン、分岐点、ポリピリミジントラクト、及び、3’スプライス部位を含み、上記pre-mRNAに結合してトランススプライシングを誘導できる配列を含む第二の核酸分子(プレトランススプライシング分子)又は該核酸分子を発現できるベクターとを、トランススプライシングが可能な細胞内に導入する工程、及び該細胞内で生成した第一のタンパク質と第二のタンパク質とからなる融合タンパク質を回収する工程を含む、融合タンパク質の製造方法。
- 第二のタンパク質をコードする遺伝子配列を含み、且つ第一のタンパク質をコードする遺伝子配列を含む領域から生成するpre-mRNAに結合してトランススプライシングを誘導できる配列を含む核酸分子(プレトランススプライシング分子)が、プラスミドベクターまたはレトロウイルスベクターに導入されている核酸分子である、請求項1又は2に記載の方法。
- 第一のタンパク質が、抗体H鎖の可変領域タンパク質(VH)を含むタンパク質である、請求項1から3の何れかに記載の方法。
- 第一のタンパク質が、抗体H鎖の可変領域タンパク質(VH)を含むタンパク質であり、第二のタンパク質が、抗体H鎖の定常領域CH1タンパク質を含むタンパク質である、請求項1から4の何れかに記載の方法。
- 第一のタンパク質が、抗体L鎖の可変領域タンパク質(VL)を含むタンパク質である、請求項1から3の何れかに記載の方法。
- 第一のタンパク質が、抗体L鎖の可変領域タンパク質(VL)を含むタンパク質であり、第二のタンパク質が抗体L鎖の定常領域CLタンパク質を含むタンパク質である、請求項1から3、又は請求項6の何れかに記載の方法。
- 第一のタンパク質を発現する細胞が、抗体を産生する細胞である、請求項1から7の何れかに記載の方法。
- 第一のタンパク質を発現する細胞がハイブリドーマである、請求項1から7の何れかに記載の方法。
- 第一のタンパク質を発現する細胞がニワトリ体細胞DT40である、請求項1から7の何れかに記載の方法。
- 第二のタンパク質が酵素を含むタンパク質である、請求項1から10の何れかに記載の方法。
- 第二のタンパク質がアルカリフォスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β―ガラクトシダーゼ、又はルシフェラーゼを含むタンパク質である、請求項1から11のいずれかに記載の方法。
- 請求項1から12のいずれかに記載の方法により抗体H鎖の可変領域タンパク質(VH)及び抗体L鎖の可変領域タンパク質(VL)を含む融合タンパク質を製造する工程、及び得られた融合タンパク質を用いて免疫測定を行う工程を含む、免疫測定方法。
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