JP5108942B2 - プロモーター - Google Patents
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Description
タンパク質の発現は、生細胞における基本的な過程である。タンパク質の発現に必要な情報はすべて、単一の核酸により提供される。この核酸は、タンパク質のアミノ酸配列の情報を含有するだけでなく、プロモーター/プロモーター配列を含む必要な制御情報(たとえば、リボソーム結合部位、転写開始および終結シグナル、スプライスシグナル、エンハンサーエレメントなど)もまた提供する。
(a)
(i)異種ポリペプチドをコードする核酸を含む第1の発現カセット、
(ii)SEQ ID NO:04の第1の核酸および選択マーカーをコードする第2の核酸を含む第2の発現カセットであって、第1の核酸が第2の核酸に機能的に連結している、第2の発現カセット
を含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程:
(b)トランスフェクトされた細胞を、非トランスフェクト真核細胞の増殖に適した条件下で培養する工程;
(c)工程(b)において増殖し、かつ
(i)選択的培養条件下で増殖する、または
(ii)選択マーカーを発現する
細胞を選択する工程。
(a)哺乳動物細胞に、異種ポリペプチドをコードする第2の核酸に機能的に連結したSEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03またはSEQ ID NO:04またはSEQ ID NO:06の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸をトランスフェクトする工程;
(b)工程(a)においてトランスフェクトされた細胞を選択する工程;
(c)選択された細胞を、異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程;
(d)異種ポリペプチドを該細胞または培養培地から回収する工程。
[請求項101]
SEQ ID NO:04の核酸配列を有するプロモーター。
[請求項102]
SEQ ID NO:04の核酸からなり、かつSEQ ID NO:07の核酸に機能的に連結した場合にSEQ ID NO:05のSV40プロモーターの20%またはそれ未満のプロモーター強度を有することを特徴とする、核酸。
[請求項103]
SEQ ID NO:04の核酸の前にSEQ ID NO:14の核酸を含むことを特徴とする、請求項102記載の核酸。
[請求項104]
シミアンウイルス40プロモーターのSEQ ID NO:14の第2の72bp反復配列を含むことを特徴とする、請求項102記載の核酸。
[請求項105]
SV40プロモーターの第1の72bp反復配列が欠失しており、かつSV40プロモーターの第2の72bp反復配列が維持されていることを特徴とする、請求項102〜104のいずれか一項記載の核酸。
[請求項106]
以下の工程を含むことを特徴とする、細胞を選択するための方法:
(a)
(i)異種ポリペプチドをコードする核酸を含む第1の発現カセット、
(ii)SEQ ID NO:04の第1の核酸および選択マーカーをコードする第2の核酸を含む第2の発現カセットであって、第1および第2の核酸が機能的に連結している、第2の発現カセット
を含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程;
(b)トランスフェクトされた細胞を、非トランスフェクト細胞の増殖に適した条件下で培養する工程;
(c)工程(b)で増殖する細胞を選択的培養条件下で選択する工程。
[請求項107]
工程(c)が、工程(b)で増殖する細胞を選択的培養条件下で選択する工程であることを特徴とする、請求項106記載の方法。
[請求項108]
工程(c)が、工程(b)で増殖し、かつ第2の核酸によりコードされる選択マーカーを発現する細胞を選択する工程であることを特徴とする、請求項106記載の方法。
[請求項109]
以下の工程を含むことを特徴とする、異種ポリペプチドを発現するための方法:
(a)真核細胞に、異種ポリペプチドをコードする第2の核酸に機能的に連結したSEQ ID NO:04の第1の核酸を含む発現カセットを含む核酸をトランスフェクトする工程;
(b)工程(a)でトランスフェクトした細胞を選択する工程;
(c)異種ポリペプチドの発現に適した条件下で、工程(b)で選択された細胞を培養する工程;
(d)細胞または培養培地から異種ポリペプチドを回収する工程。
[請求項110]
核酸が、選択マーカーをコードする第2の発現カセットを含むことを特徴とする、請求項109記載の方法。
[請求項111]
真核細胞が哺乳動物細胞であることを特徴とする、請求項106〜110のいずれか一項記載の方法。
[請求項112]
哺乳動物細胞が、CHO細胞、BHK細胞、HEK細胞、Sp2/0細胞、またはPer.C6(登録商標)細胞であることを特徴とする、請求項111記載の方法。
[請求項113]
哺乳動物細胞がCHO細胞またはHEK細胞であることを特徴とする、請求項112記載の方法。
[請求項114]
異種ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートであることを特徴とする、請求項106〜113のいずれか一項記載の方法。
[請求項115]
選択マーカーが、ネオマイシンアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、またはハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、またはdLNGFR、またはGFPであることを特徴とする、請求項106〜108および110〜114のいずれか一項記載の方法。
[請求項116]
第1の核酸が請求項102記載の核酸であることを特徴とする、請求項109〜114のいずれか一項記載の方法。
[請求項117]
第1の核酸が野生型SV40プロモーターの第2の72bp反復配列のみを含むことを特徴とする、請求項116記載の方法。
[請求項118]
以下を含むことを特徴とする、異種ポリペプチドを発現するための方法:
(i)選択マーカーをコードする核酸に機能的に連結した、野生型SV40プロモーターの第2の72bp反復配列を含むSEQ ID NO:04の核酸;
(ii)異種ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結したSEQ ID NO:05またはCMVプロモーターの核酸;
(iii)CHO細胞またはHEK細胞;
(iv)(iii)の細胞に(i)および(ii)の核酸をトランスフェクトする工程;
(v)(iv)でトランスフェクトされた細胞を選択物質の存在下で選択する工程;
(vi)(v)で選択された細胞を、(v)で使用された選択物質の非存在下、異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程;
(vii)培養培地または細胞から異種ポリペプチドを回収する工程。
[請求項119]
選択する工程が、フローサイトメトリー、ELISA、免疫沈降、免疫親和性カラムクロマトグラフィー、磁気ビーズ免疫親和性選別、顕微鏡に基づく単離法、または免疫学的結合より選択される方法によることを特徴とする、請求項106〜118のいずれか一項記載の方法。
本発明は、SEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03またはSEQ ID NO:04またはSEQ ID NO:06を有するヌクレオチド配列を有する新規のプロモーター核酸を報告する。
(a)
(i)異種ポリペプチドをコードする核酸を含む第1の発現カセット、
(ii)SEQ ID NO:04の第1の核酸および選択マーカーをコードする第2の核酸を含む第2の発現カセットであって、第1の核酸が第2の核酸に機能的に連結している、発現カセット
を含む核酸を真核細胞にトランスフェクトする工程;
(b)トランスフェクトした細胞を、非トランスフェクト真核細胞の増殖に適した条件下で培養する工程;
(c)工程(b)において増殖し、かつ
(i)選択条件下で増殖するか、
(ii)選択マーカーを発現する
細胞を選択する工程。
(a)哺乳動物細胞に、異種ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結したSEQ ID NO:02またはSEQ ID NO:03またはSEQ ID NO:04またはSEQ ID NO:06のプロモーターを含む発現カセットを含む核酸をトランスフェクトする工程;
(b)工程(a)でトランスフェクトした細胞を選択する工程;
(c)選択された細胞を、異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程;
(d)異種ポリペプチドを細胞または培養培地から回収する工程。
SEQ ID NO:02の核酸の構築
SEQ ID NO:02の5’短縮SV40プロモーターを、dLNGFR (プラスミド4788)をコードする核酸に機能的に連結した全長SV40プロモーターをテンプレートとするPCR反応によって得た。PCR混合物は、MgSO4 2 mMを加えた1×PWO緩衝液(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)、dNTP PCR Nucleotide Mix(Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) 200 μM、SEQ ID NO:08のフォワードプライマー 1 μM、SEQ ID NO:13のリバースプライマー 1 μM、プラスミド4788のテンプレートDNA 50 ng、PWO-DNAポリメラーゼ (PWO = パイロコッカス・ヴェッセイ(Pyrococcus woesei); Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany) 2.5 U、および二回蒸留超純水 100 μLであった。PCR条件は、94℃で1分間を1サイクル;94℃で0.5分間を25サイクル;55℃で0.5分間を25サイクル;72℃で1分間を25サイクル;72℃で5分間を1サイクルであった。
SEQ ID NO:03の核酸の構築
SEQ ID NO:03の5’短縮SV40プロモーター変種を、プラスミド4788由来のdLNGFRをコードする核酸に機能的に連結した全長SV40プロモーターをテンプレートとするPCR反応によって得た。PCR混合物は、MgSO4 2 mMを加えた1×PWO緩衝液、dNTP PCR Nucleotide Mix 200 μM、SEQ ID NO:09のフォワードプライマー 1 μM、SEQ ID NO:13のリバースプライマー 1 μM、プラスミド4788のテンプレートDNA 50 ng、PWO-DNAポリメラーゼ 2.5 U、および二回蒸留超純水 100 μLであった。PCR条件は、94℃で1分間を1サイクル;94℃で0.5分間を25サイクル;55℃で0.5分間を25サイクル;72℃で1分間を25サイクル;72℃で5分間を1サイクルであった。
SEQ ID NO:04の核酸の構築
SEQ ID NO:04の5’短縮SV40プロモーター変種を、dLNGFR(プラスミド4788)をコードする核酸に機能的に連結した全長SV40プロモーターをテンプレートとするPCR反応によって得た。PCR混合物は、MgSO4 2 mMを加えた1×PWO緩衝液、dNTP PCR Nucleotide Mix 200 μM、SEQ ID NO:10のフォワードプライマー 1 μM、SEQ ID NO:13のリバースプライマー 1 μM、プラスミド4788のテンプレートDNA 50 ng、PWO-DNAポリメラーゼ 2.5 U、および二回蒸留超純水 100 μLであった。PCR条件は、94℃で1分間を1サイクル;94℃で0.5分間を25サイクル;55℃で0.5分間を25サイクル;72℃で1分間を25サイクル;72℃で5分間を1サイクルであった。
さらなるプロモーターの構築
さらなる5’短縮SV40プロモーター変種を、dLNGFRをコードする核酸に機能的に連結した全長SV40プロモーターをテンプレートとするPCR反応によって産生した。PCR混合物は、MgSO4 2 mMを加えた1×PWO緩衝液、dNTP PCR Nucleotide Mix 200 μM、SEQ ID NO:11(SEQ ID NO:06を生じる)またはSEQ ID NO:12のフォワードプライマー 1 μM、SEQ ID NO:13のリバースプライマー 1 μM、プラスミド4788のテンプレートDNA 50 ng、PWO-DNAポリメラーゼ 2.5 U、および二回蒸留超純水 100 μLであった。PCR条件は、94℃で1分間を1サイクル;94℃で0.5分間を25サイクル;55℃で0.5分間を25サイクル;72℃で1分間を25サイクル;72℃で5分間を1サイクルであった。
SEQ ID NO:02、03、04、および06に機能的に連結したdLNGFRの発現
SEQ ID NO:02、03、04、および06の核酸を得るプライマーは、制限エンドヌクレアーゼSalIおよびEcoRIの制限部位を含んだ。これらの制限部位/制限エンドヌクレアーゼを用いて、dLNGFR(LNGFR(低親和性神経成長因子)については、たとえばPhilipps, K., et al., Nat. Med. 2 (1996) 1154-1156; またはMachl, A.W., et al., Cytometry 29 (1997) 371-374を参照)をコードする核酸に機能的に連結したこれらの核酸を、制限部位SalIおよびPvuIIを用いて直線化されたプラスミド4736-pUC-DHFRにライゲーションした。結果として生じるプラスミドは以下のとおりである:
5500-pUC-DHFR_dLNGFR_wildtypeSV40(図1のプラスミドマップ)、
5501-pUC-DHFR_dLNGFR_Shortening_2 (図2のプラスミドマップ)、
5502-pUC-DHFR_dLNGFR_Shortening_3、
5503-pUC-DHFR_dLNGFR_Shortening_4、
5504-pUC-DHFR_dLNGFR_Shortening_6。
SEQ ID NO:02、03、04、および06に機能的に連結したGFPの発現
SEQ ID NO:02、03、04、および06の核酸を得るプライマーは、制限エンドヌクレアーゼSalIおよびEcoRIの制限部位を含んだ。これらの制限部位/制限エンドヌクレアーゼを用いて、GFPをコードする核酸(SEQ ID NO:07)に機能的に連結したこれらの核酸を、制限部位SalIおよびPvuIIを用いて直線化されたプラスミド4703-pUC-OriPにライゲーションした(図3)。結果として生じるプラスミドは以下のとおりである:
4712-pUC-Hyg_GFP_wildtypeSV40(図4のプラスミドマップ)、
4713-pUC-Hyg_GFP_Shortening_2(図5のプラスミドマップ)、
4714-pUC-Hyg_GFP_Shortening_3、
4715-pUC-Hyg_GFP_Shortening_4、
4716-pUC-Hyg_GFP_Shortening_6。
Claims (8)
- SEQ ID NO:04の核酸配列からなることを特徴とするプロモーター。
- 以下の工程を含むことを特徴とする、異種ポリペプチドを発現する細胞を選択するための方法:
(a)
(i)異種ポリペプチドをコードする核酸を含む第1の発現カセット、
(ii)請求項1記載のプロモーターと、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンおよびG418アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼから選択されるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードする第2の核酸とを含む第2の発現カセットであって、請求項1記載のプロモーターと第2の核酸が機能的に連結している、第2の発現カセット
を含む核酸を哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程;
(b)トランスフェクトされた細胞を、非トランスフェクト細胞の増殖に適した条件下で培養する工程;
(c)工程(b)で増殖する細胞を選択的培養条件下でフローサイトメトリーにより選択する工程。 - 以下の工程を含むことを特徴とする、異種ポリペプチドを発現する細胞を選択するための方法:
(a)
(i)異種ポリペプチドをコードする核酸を含む第1の発現カセット、
(ii)請求項1記載のプロモーターと、dLNGFRまたはGFPをコードする第2の核酸とを含む第2の発現カセットであって、請求項1記載のプロモーターと第2の核酸が機能的に連結している、第2の発現カセット
を含む核酸を哺乳動物細胞にトランスフェクトする工程;
(b)トランスフェクトされた細胞を、非トランスフェクト細胞の増殖に適した条件下で培養する工程;
(c)工程(b)で増殖する細胞を選択的培養条件下でフローサイトメトリーにより選択する工程。 - 以下の工程を含むことを特徴とする、異種ポリペプチドを発現するための方法:
(a)哺乳動物細胞に、異種ポリペプチドをコードする第2の核酸に機能的に連結した請求項1記載のプロモーターを含む発現カセットを含む核酸をトランスフェクトする工程;
(b)工程(a)でトランスフェクトした細胞をフローサイトメトリーにより選択する工程;
(c)異種ポリペプチドの発現に適した条件下で、工程(b)で選択された細胞を培養する工程;
(d)細胞または培養培地から異種ポリペプチドを回収する工程。 - 核酸が、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ、ネオマイシンおよびG418アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼから選択されるアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをコードする第2の発現カセットを含むことを特徴とする、請求項4記載の方法。
- 異種ポリペプチドが、免疫グロブリン、免疫グロブリン断片、または免疫グロブリンコンジュゲートであることを特徴とする、請求項2〜5のいずれか一項記載の方法。
- 以下の工程を含むことを特徴とする、異種ポリペプチドを発現するための方法:
(a)CHO細胞に選択マーカーをコードする核酸に機能的に連結した請求項1記載のプロモーターを含む核酸および異種ポリペプチドをコードする核酸に機能的に連結したSV40またはCMVから選択される野生型プロモーターを含む核酸をトランスフェクトする工程;
(b)工程(a)でトランスフェクトされたCHO細胞をフローサイトメトリーにより選択する工程;
(c)工程(b)で選択されたCHO細胞を異種ポリペプチドの発現に適した条件下で培養する工程;
(d)細胞または培養培地から異種ポリペプチドを回収する工程。 - フローサイトメトリーが蛍光活性化細胞選別であることを特徴とする、請求項2〜7のいずれか一項記載の方法。
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