NO324272B1

NO324272B1 - Humaniserte antistoff mot humant gp39, sammensetninger inneholdende dette, samt anvendelse derav ved fremstilling av medikamenter

Info

Publication number: NO324272B1
Application number: NO19982062A
Authority: NO
Inventors: Roland A Newman; Nabil Hanna; Amelia Black; Eduardo A Padlan
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1995-11-07
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2007-09-17
Also published as: WO1997017446A2; ATE364699T1; DE69637131T2; DE69637131D1; KR100389711B1; JP2000500334A; US6001358A; US20030175269A1; NZ324500A; NO982062L; US20060147446A1; EP0862630B1; EP0862630A2; NO982062D0; US7074406B2; HUP9902327A3; KR19990067370A; US6506383B1; AU1157697A; AU717762B2

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører humaniserte antistoffer som er spesifikke for humant gp39 som angitt i krav 1, DNA som koder for slike antistoffer som angitt i krav 8, far-masøytiske blandinger som inneholder dem som angitt i krav 10 og anvendelsen av slike humaniserte antistoffer til fremstilling av terapeutiske midler. Disse antistoffer finner en spesiell bruk ved behandling av autoimmune sykdommer omfattende f.eks. rheumatoid artritt, multippel sklerose, diabetes og systemisk lupus erythematose, samt ikke-autoimmune sykdommer omfattende f.eks. "graft-vs.-host-disease" og ved forebyggelse av transplantatutstøtning.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

Immunsystemet har evnen til å utløse to typer antigenspesifikke responser mot fremme-de antigener. Cellemediert immunitet er begrepet som brukes for å henvise til effektorfunksjoner av immunsystemet som medieres av T-lymfocytter. Humoral immunitet er begrepet som brukes for å henvise til produksjonen av antigenspesifikke antistoffer av B-lymfocytter. Det har lenge vært kjent at utviklingen av en humoral immunitet mot de fleste antigener ikke utelukkende er avhengig av antistoffproduserende B-lymfocytter, men også av medhjelpen av hjelper-T-lymfocytter (heretter benevnt Th-lymfocytter).

(Mitchison, Eur. J. Immunol., 1: 18-25 (1971); Clamanog Chaperon, Transplant Rev., 1: 92-119 (1969); Katz et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 70: 2624-2629 (1973); Raff et al., Nature, 226: 1257-1260 (1970)). Visse signaler, eller "hjelp", utløses av Th-celler som respons på stimulasjon av thymus-avhengige (heretter TD) antigener. Mens noe av B-lymfocytthjelpen medieres av oppløselige molekyler som frigis av Th-celler (f.eks. lymfokiner, såsom IL-4 og IL-5), krever en aktivering av B-celler også et kontaktavhengig vekselspill mellom B-celler og Th-celler. (Hirohata et al., J. Immunol., 140: 3736-3744 (1988); Bartlett et al., J. Immunol, 143: 1745-1765 (1989)). Dette tyder på at en B-celleaktivering er avhengig av et obligatorisk vekselspill mellom celleover-flatemolekyler på B-celler og Th-celler. Et slikt vekselspill støttes av iakttagelsen at isolerte plasmamembraner av aktiverte T-celler kan bringe hjelperfunksjonene som er nødvendige for en B-celleaktivering. (Brian, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85: 564-568

(1988); Hodgkin et al., J. Immunol, 145: 2025-2034 (1990); Noelle et al., J. Immunol, 146: 1118-1124(1991)).

Det er også kjent at i en kontaktavhengig prosess som benevnes "T-cellehjelperfunk-sjon", styrer CD4<+->T-lymfocytter aktiveringen og differensieringen av B-lymfocyttene, og regulerer dermed den humorale immunrespons ved å modulere spesifisiteten, ut-sondringen og isotype-kodede funksjoner av antistoffmolekyler (Mitchell et al., J. Exp. Med., 128: 821 (1968); Mitchison, Eur. J. Immunol, 1: 68 (1971); White et al., J. Exp.

Med., 14: 664 (1978); Reinherz et al., Proe. Nati Acad. Sei. USA, 74: 4061 (1979); Janeway et al., Immunol. Rev., 101: 39 (1988); 0'Brien et al., J. Immunol, 141: 3335

(1988) ; Rahemtulla et al., Nature, 353: 180 (1991); og Grusby et al., Science, 253: 1417

(1991)).

Prosessen ved hvilken T-cellene hjelper B-cellene å differensieres, er blitt oppdelt i to adskilte faser: den induktive fase og effektorfasen (Vitetta et al., Adv. Immunol, 45: 1

(1989) ; Noelle et al., Immunol. Today, 11: 361 (1990)). Under den induktive fase be-rører hvilende T-celler antigen-primede B-celler, og denne berøring gjør det mulig for klonotypiske T-cellereseptor (TCR)/CD4-komplekser å vekselspille med Ia/Ag-kom-plekser på B-celler (Janeway et al., Immunol. Rev., 101: 39 (1988); Katz et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 70: 2624 (1973); Zinkernagel, Adv. Exp. Med., 66: 527 (1976); Sprent, J. Exp. Med., 147: 1159 (1978); Sprent, Immunol. Rev., 42: 158 (1978); Jones et al., Nature, 292: 547 (1981); Julius et al., Eur. J. Immunol, 18: 375 (1982); Chestnut et al., J. Immunol, 126: 1575 (1981); og Rogozinski et al., J. Immunol, 126: 735 (1984)). TCR/CD4-gjenkjenning av Ia/Ag fører til dannelsen av stabile T-B-kognatpar og toveis T- og B-celleaktivering (Sanders et al., J. Immunol, 137: 2395 (1986); Snow et al., J. Immunol, 130: 614 (1983); Krusemeier et al., J. Immunol, 140: 367 (1988); Noelle et al., J. Immunol, 143: 1807 (1989); Bartlett et al., J. Immunol, 143: 1745 (1989); og Kupfer et al., Annu. Rev. Immunol, 7: 309 (1987)). Under effektorfasen driver aktiverte T-celler B-celledifferensieringen ved å utsondre lymfokiner (Thompson et al., J. Immunol, 134: 369 (1985)) og ved kontaktavhengige stimuli (Noelle et al., J. Immunol, 143: 1807 (1989); Clement et al., J. Immunol, 140: 3736 (1984); Crow et al., J. Exp. Med, 164: 1760 (1986); Brian, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 85: 564 (1988); Hirohata et al., J. Immunol. 140: 3736 (1988); Jover et al., Clin. Immunol. Immun., 53: 90 (1989); Whalen et al., J. Immunol, 141: 2230 (1988); Pollok et al., J. Immunol, 146: 1633

(1991); og Bartlett et al., J. Immunol, 143: 1745 (1990)), som begge er nødvendige for at T-cellene skal kunne drive små hvilende B-celler til å endelig differensiere til Ig-utsondrende celler (Clement et al., J. Immunol, 132: 740 (1984); Martinez et al., Nature, 290: 60 (1981); og Andersson et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77: 1612

(1980)).

Selv om den induktive fase av T-cellehjelpen avhenger av Ag og begrenses av MHC (Janeway et al., Immun. Rev., 101: 34 (1988); Katz et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 10: 2624 (1973); Zinkernagle, Adv. Exp. Med. Biol, 66: 527 (1976)), kan effektorfasen av T-cellehjelperfunksjonen være uavhengig av Ag og ikke begrenses av MHC (Clement et al., J. Immunol, 132: 740 (1984); Hirohata et al.,J. Immunol, 140: 3736

(1988); Whalen et al., J. Immunol, 143: 1715 (1988)). Et ytterligere trekk som er forskjellig, er at den induktive fase av T-cellehjelpen ofte er avhengig av CD4-molekyler og inhiberes med anti-CD4-mAb (Rogozinski et al., J. Immunol, 126: 735

(1984)), mens hjelpereffektorfunksjonen ikke krever CD4-molekyler (Friedman et al., CettImmunol, 103: 105 (1986)) og ikke inhiberes av anti-CD4-mAb'er (Brian, Proe. Nati Acad. Sei. USA, 85: 564 (1988); Hirohata et al., J. Immunol, 140: 3736 (1988); Whalen et al., J. Immunol, 143: 1745 (1988); og Tohma et al., J. Immunol, 146: 2547

(1991)). Den ikke-spesifikke hjelpereffektorfunksjon antas å rettes mot spesielle B-cellemål ved den lokaliserte natur av T-/B-cellevekselspillet med antigenspesifikke kognate par (Bartlett et al., J. Immunol, 143: 1745 (1989); Kupfer et al., J. Exp. Med, 165: 1565 (1987) og Poo et al., Nature, 332: 378 (1988)).

Selv om en terminal B-celledifferensiering er avhengig av både kontakt- og lymfokin-medierte stimuli fra T-celler, kan mellomliggende trinn av B-celledifferensieringen induseres av aktiverte T-celleoverflater i fravær av utsondrede faktorer (Crow et al., J. Exp. Med, 164: 1760 (1986); Brian, Proe. Nati Acad. Sei. USA, 85: 564 (1988); Sekita et al., Eur. J. Immunol, 18: 1405 (1988); Hodgkin et al., J. Immunol, 145: 2025 (1990); Noelle et al., FASEB J, 5: 2770 (1991)). Disse mellomliggende innvirkninger på B-cellene omfatter induksjonen av ekspresjon av overflate-CD23 (Crow et al., Cell Immunol, 121: 94 (1989)), enzymer forbundet med cellecyklusprogresjonen (Pollok et al., J. Immunol, 146: 1633 (1991)) og responsivitet til lymfokiner (Noelle et al., FASEB J, 5: 2770 (1989); Pollok et al., J. Immunol, 146: 1633 (1991)). I seneste tid har man identifisert enkelte av de aktivasjons-induserte T-celle-overflatemolekyler som styrer B-celleaktiveringen. I tillegg har funksjonelle undersøkelser kunnet karakterisere enkelte trekk av aktivasjons-induserte T-celle-overflatemolekyler som styrer B-celleaktiveringen. Først får T-cellene evnen til å stimulere B-cellene 4-8 timer etter aktiveringen (Bartlett et al., J. Immunol, 145: 3956 (1990) og Tohma et al., J. Immunol, 146: 2544

(1991)). For det andre konserveres den B-cellestimulatoriske aktivitet forbundet med overflaten av aktiverte T-celler, på paraformaldehyd-fikserte celler (Noelle et al., J. Immunol, 143: 1807 (1989); Cros et al., J. Exp. Med., 164: 1760 (1986); Pollok et al., J. Immunol, 146: 1633 (1991); Tohma et al., J. Immunol, 146: 2544 (1991); og Kubota et al., Immunol, 72: 40 (1991)) og på isolerte membranfragmenter (Hodgkin et al., J. Immunol, 145: 2025 (1990) og Martinez et al., Nature, 290: 60 (1981)). For det tredje er den B-cellestimulatoriske aktivitet følsom for proteasebehandling (Noelle et al., J. Immunol, 143: 1807 (1989); Sekita et al., Eur. J. Immunol, 18: 1405 (1988); og Hodgkin et al., J. Immunol, 145: 2025 (1990)). For det fjerde inhiberes prosessen ved opprettelse av disse overflateaktive strukturer etter T-celleaktiveringen, av cyklohek-simid (Tohma et al., J. Immunol, 196: 2349 (1991) og Hodgkin et al., J. Immunol, 195: 2025 (1990)). Et celleoverflatemolekyl, nemlig CD40, er blitt identifisert på umodne og modne B-lymfocytter som når det fornettes med antistoffer, induserer B-celleproliferasjon. Valle et al., Eur. J. Immunol, 19: 1463-1467 (1989); Gordon et al., J. Immunol, 140: 1425-1430 (1988); Gnider et al., J. Immunol, 142: 4144-4152 (1989).

CD40 er blitt molekylært klonet og kjennetegnet (Stamenkovic et al., EMBO J.,% : 1403-1410(1989)).

CD40 uttrykkes på B-celler, interdigiterende dendrittceller, makrofager, follikulære dendrittceller og thymisk epitel (Clark, Tissue Antigens 36: 33 (1990); Alderson et al., J. Exp. Med., 178: 669 (1993); Galy et al., J. Immunol 142: 772 (1992)). Humant CD40 er et type I-membranprotein med lengden 50 kDa, og tilhører nervevekstfaktor-reseptor-familien (Hollenbaugh et al., Immunol Rev., 138: 23 (1994)). Signalering gjennom CD40 i nærvær av IL-10 induserer lg A-, IgM- og IgG-produksjon, hvilket tyder på at isotypeskifting reguleres av disse vekselspill. Vekselspillet mellom CD40 og dets ligand fører til en primet tilstand av B-cellen, hvilket gjør den mottakelig for senere signaler.

Dessuten har man nylig molekylært klonet og kjennetegnet en ligand for CD40, nemlig gp39 (også benevnt CD40-ligand eller CD40L) (Armitage et al., Nature, 357: 80-82

(1992) ; Lederman et al., J. Exp. Med, 175: 1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al., EMBOJ., 11: 4313-4319 (1992)). gp39-proteinet uttrykkes på aktiverte, men ikke på hvilende, CD4<+->Th-celler. Spriggs et al., J. Exp. Med., 176: 1543-1550 (1992); Lane et al., Eur. J. Immunol, 22: 2573-2578 (1992); og Roy et al., J. Immunol, 151: 1-14

(1993) . Celler som er transfisert med gp39-genet og som uttrykker gp39-proteinet på sin overflate, kan utløse B-celleproliferasjon, og kan sammen med andre stimulatoriske signaler indusere antistoffproduksjon. Armitage et al., Nature, 357: 80-82 (1992); og Hollenbaugh et al., EMBOJ., 11: 4313-4319 (1992). Spesielt har man identifisert liganden for CD40, dvs. gp39, for mus (Noelle et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89: 6550 (1992); Armitage et al., Nature, 357: 80 (1992)) og for mennesker (Hollenbaugh et al., EmboJ. 11: 4313(1992); Spriggs et al., J. Exp. Med, 176: 1543(1992)). gp39 er et type Il-membranprotein, og er et medlem av en ny superfamilie av gener som omfatter TNF-a, TNF-p og ligandene for FAS, CD27, CD30 og 4-1BB.

Ekspresjonen av gp39 kan lett induseres in vitro på CD4<+->T-celler ved bruk av enten anti-CD3-antistoff eller forbolmyristatacetat (PMA) plus ionomycin. Ekspresjonen er rask og forbigående, idet den når en topp etter 6-8 timer og synker til tilnærmet hvilende nivå etter 24-48 timer (Roy et al., J. Immunol, 151: 2497 (1993)). In vivo rapporteres gp39 i mennesker å foreligge på CD4<+->T-celler i mantel- og centrocyttsoner av lymfe-follikler og det periarteriole lymfocyttlag i milten, i forbindelse med CD40<+->B-celler (Lederman et al., J. Immunol, 149: 3807 (1992)). gp39<+->T-celler produserer IL-2, IL-4 og IFN-Y (Van der Eetwegh et al., J. Exp. Med., 178: 1555 (1993)).

Man har kommet til tilsvarende erkjennelser angående den nye rolle av gp39 ved regu-leringen av humoral immunitet ved å undersøke en human sykdom, nemlig X-forbundet hyper-IgM-syndrom (HIM). HIM er en alvorlig og X-forbundet immundefekt som kjennetegnes ved et tap av thymusavhengig humoral immunitet og en manglende evne til å produsere IgG, IgA og IgE. Mutasjoner i gp39-genet var ansvarlige for ekspresjonen av et ikke-funksjonelt gp39-protein og for den manglende evne av hjelper-T-celler i HJM-pasienter til å aktivere B-cellene (Allen et al., Science, 259: 990 (1993); Aruffo et al., Cell, 72: 291 (1993); DiSanto et al., Nature, 361: 541 (1993); Korthauer et al., Nature, 361: 539 (1993)). Disse undersøkelser støtter konklusjonen at i et tidlig stadium etter T-cellereseptorens innfanging av peptid/MHC klasse Il-komplekset, induseres gp39 på den kognate hjelper-T-celle, og bindingen av gp39 til CD40 på B-cellen induserer B-cellen til å begi seg på cellecyklusen og differensiere til immunoglobulinutson-dring (Ig-utsondring) og isotypeskifting.

Funksjonelle undersøkelser har vist at en behandling av mus med anti-gp39 fullstendig fjernet antistoffresponsen mot thymusavhengige antigener (SRBC og TNP-KLH), men ikke mot ikke-thymusavhengige antigener (TNP-Ficoll) (Foy et al.,J. Exp. Med., 178: 1567 (1993)). I tillegg forebygget en behandling med anti-gp39 utviklingen av kollagenindusert artritt (CIA) i mus som hadde fått injisert kollagen (Durie et al., Science, 261: 1328 (1993)). Til slutt forebygget anti-gp39 dannelsen av hukommelses-B-celler og germinalsentre i musemilten (Foy et al., J. Exp. Med., 180: 157 (1994)). Tilsammen gir disse resultater omfattende bevis på at vekselspillet mellom gp39 på T-celler og CD40 på B-celler er vesentlig for en antistoffrespons mot thymusavhengige antigener.

I senere tid har man benyttet seg av et antall murine modeller av autoimmune sykdommer for å bedømme den potensielle terapeutiske verdi av en anti-gp39-administrasjon på utviklingen av sykdommen. En kort beskrivelse av resultatene av undersøkelser av disse modeller, skal bringes i det følgende: Kollagenindusert artritt: CIA er en dyremodell for den humane autoimmune sykdom rheumatoid artritt (RA) (Trenthorn et al., J. Exp. Med., 146: 857 (1977)). Denne sykdom kan induseres i mange arter ved administrasjon av heterolog type II-kollagen (Courtenay et al., Nature, 283: 665 (1980); Cathcart et al., Lab. Invest., 54: 26 (1986)). For å undersøke virkningen av anti-gp39 på induksjonen av CIA (Durie et al., Science, 261: 1328 (1993)), injiserte man intradermalt til hannlige DBAl/J-mus et type II-kollagen fra kylling som var emulgert i fullstendig Freunds adjuvans i haleroten. En påføl-gende behandling ble utført 21 dager senere. Musene ble deretter behandlet med det re-levante kontrollantistoff eller anti-gp39. Grupper av mus som var blitt behandlet med anti-gp39, viste ingen titere av anti-kollagen-antistoffer, sammenlignet med immuniserte og ubehandlede kontrollmus. En histologisk analyse viste at musene som var blitt behandlet med anti-gp39-antistoff, ikke viste noen tegn på betennelse eller noen av de andre typiske patohistologiske manifestasjoner av sykdommen som ble observert i immuniserte dyr. Disse resultater tyder på at gp39/CD40-vekselspill er absolutt nødven-dige under induksjonen av CIA. Hvis utgangs-kognatvekselspillet mellom T-cellen og B-cellen ikke oppnås, vil de senere prosesser, såsom autoantistoffdannelse og de resul-terende inflammatoriske responser, ikke forekomme.

I senere tid har man vist at gp39 er viktig ved aktivering av monocytter til å produsere TNF-a og IL-6 i fravær av GM-CSF, IL-3 og IFN-y (Alderson et al., J. Exp. Med., 178: 669 (1993)). TNF-a er blitt implisert i CIA-sykdomsforløpet (Thorbecke et al., Eur. J. Immunol, 89: 7375 (1992) og i RA (DiGiovane et al., Ann. Rheum. Dis., 47: 68 (1988); Chu et a. 1, Arthrit. Rheum., 39: 1125 (1991); Brennan et al., Eur. J. Immunol, 22: 1907

(1992)). Således kan en inhibering av TNF-a med anti-gp39 ha alvorlige anti-inflammatoriske virkninger i leddene av artrittiske mus. Både inhiberingen av TNF-a og av T-celle/B-celle-vekselspillene med anti-gp39 kan bidra til manifestasjonene av CIA.

Eksperimentell allergisk encefalomyelitt ( EAE) : EAE er en eksperimentell autoimmun sykdom i det sentrale nervesystem (CNS) (Zamvil et al, Ann. Rev. Immunol, 8: 579

(1990)), og er en sykdomsmodell for den humane autoimmune forstyrrelse multippel

sklerose (MS) (Alvord et al., "Experimental Allergic Model for Multiple Sclerosis", NY 511 (1984)). Den kan lett induseres i pattedyr ved immuniseringer med myelinbasepro-tein som isoleres fra CNS, eller et encefalitogent proteolipid (PLP). SJL/J-mus er en til-bøyelig musestamme (H-2<S>), og etter induksjon av EAE, utvikler disse musene en akutt paralytisk sykdom, og et akutt cellulært infiltrat kan identifiseres innen CNS.

Classen et al. (upublisert data) har undersøkt virkningene av anti-gp39 på induksjonen av EAE i SJL/J-mus. De fant at EAE-utviklingen ble fullstendig undertrykket i de anti-gp39-behandlede dyr. I tillegg ble anti-PLP-antistoffresponsene sinket og svekket sammenlignet med hva som ble oppnådd med kontrolldyrene.

EAE er et eksempel på en cellemediert autoimmun sykdom som medieres av T-celler, uten noen direkte tegn på at det er nødvendig med noen autoantistoffer i sykdommens forløp. En forstyrrelse av vekselspillet mellom gp39 og CD40 forebygger induksjonen av sykdommen og den adoptive overføring av sykdommen.

Kronisk ( c) og akutt ( a) " graft- vs.- host- disease" ( GVHD) : Kronisk og akutt GVHD kommer av at donorceller reagerer på vertens disparate MHC-alleler. I cGVHD (H-2d H-2<bd>) grunnes en hevet polyklonal immunoglobulinproduksjon i vekselspillet av allospesifikke hjelper-T-celler og vertens B-celler. In v/vø-administrasjon av anti-gp39-antistoffer blokkerte cGVHD-induserte serum-anti-DNA-autoantistoffer, IgE-produksjonen, den spontane immunoglobulinproduksjon in vitro, forbundet splenomegali og evnen til å overføre sykdommen. Durie, F.H. et al., J. Clin. Invest., 94: 133 (1994). Antistoffproduksjonen forble inhibert over lengre tidsrom etter avsluttet anti-gp39-administrasjon. Anti-allogeneiske cytotoksiske T-lymfocyttresponser (CTL-responser) som ble indusert i aGVHD, ble også forebygget av en in v/vo-administrasjon av anti-gp39. Disse resultater tyder på at CD40/gp39-vekselspill er vesentlige for genereringen av begge typer GVHD. Det faktum at CTL-responser ble inhibert og at en kortvarig behandling med anti-gp39 førte til en langvarig forebyggelse av sykdommen, tyder på en permanent endring i T-celleavdelingen ved koadministrasjonen av allogeneiske celler og anti-gp39-antistoff.

Forskjellige forskningsgrupper har rapportert en produksjon av murine antistoffer som er spesifikke for gp39, som beskrives å oppvise terapeutisk nytte som immunosuppres-siva. F. eks. beskriver WO 93/09812, publisert den 27. mai 1993 og overdratt til Columbia University; EP 0.555.880, publisert den 18. august 1993, og PCT/US94/09872, innlevert den 2. september 1994 av Noelle et al. og overdratt til Dartmouth College, murine antistoffer som er spesifikke for gp39, og deres bruk som terapeutika.

Selv om murine antistoffer kan brukes som terapeutiske midler i mennesker, er de allikevel ufordelaktige i enkelte hensyn. Spesielt kan murine antistoffer på grunn av at de stammer fra en fremmed art, være immunogene i mennesker. Dette fører ofte til en nøytraliserende antistoffrespons, som er spesielt problematisk når man ønsker å administrere antistoffene gjentatte ganger, f.eks. ved behandling av en kronisk eller til-bakevendende sykdomstilstand. Fordi de inneholder murine konstante domener, kan de heller ikke oppvise humane effektorfunksjoner.

I et forsøk på å eliminere eller redusere slike problemer, beskrives kimære antistoffer. Kimære antistoffer inneholder partier av to forskjellige antistoffer, vanligvis fra to forskjellige arter. Generelt inneholder slike antistoffer humant konstant parti og variabelt parti fra en annen art, vanligvis mus. F. eks. er noen mus/humane kimære antistoffer beskrevet som oppviser bindingsegenskapene av stam-antistoffet fra mus og effektorfunksjoner som forbindes med humant konstant parti. Jfr. f.eks. Cabilly et al., US-patent nr. 4.816.567; Shoemaker et al., US-patent nr. 4.978.745; Beavers et al., US-patent nr. 4.975.369; og Boss et al., US-patent nr. 4.816.397, som alle er innlemmet heri ifølge henvisning dertil. Generelt konstrueres disse kimære antistoffer ved å fremstille en genomisk gensamling utifrå DNA som ekstraheres fra allerede foreliggende murine hybridomaer (Nishimura et al., Cancer Research, 47: 999 (1987)). Samlingen siles deretter for å finne variabelt region-gener fra både tunge og lette kjeder som oppviser de riktige antistofrfagment-omplasseringsmønstre. Alternativt fremstilles cDNA-samlinger utifrå RNA som er trukket ut fra hybridomaene, og testes, eller det variable parti erholdes ved polymerasekjedereaksjon. De klonede variabelt parti-gener ligeres deretter inn i en ekspresjonsvektor som inneholder klonede kassetter av det egnede tung eller lett kjede-humant konstant parti-gen. De kimære gener uttrykkes deretter i en cellelinje etter ønske, vanligvis en murin myelomalinje. Slike kimære antistoffer er blitt brukt innen humanterapien.

I en patentsøknad som er overdratt til foreliggende søker, nemlig USSN 07/912.292, beskrives "primatized" ("primatiserte") antistoffer som inneholder humant konstant parti og østape-variabelt parti. Disse "primatized" antistoffer tåles godt av mennesker, grunnet deres lave eller svake immunogenisitet.

Det er også kjent humaniserte antistoffer innen faget. Ideelt fører "humanisering" til et antistoff som er mindre immunogent, idet de antigenbindende egenskaper av det opprinnelige molekyl beholdes i sin helhet. For å beholde alle de antigenbindende egenskaper av det opprinnelige antistoff, må strukturen av dens kombinasjonsstilling re-produseres nøyaktig i den "humaniserte" versjon. Dette kan potensielt oppnås ved å transplantere kombinasjonsstillingen av det ikke-humane antistoff på en human ramme, enten (a) ved å pode de fullstendige ikke-humane variable domener på humane konstante partier for å generere et kimært antistoff (Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81: 6801 (1984); Morrison og Oi, Adv. Immunol, 44: 65 (1988) (hvilket bevarer de ligandbindende egenskaper, men også beholder immunogenisiteten av de ikke-humane variable domener); (b) ved å pode kun de ikke-humane CDRer på humane ramme- og konstante partier med eller uten kritiske rammeresiduer i behold (Jones et al., Nature, 321: 522 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1539 (1988)); eller (c) ved å transplantere fullstendige ikke-humane variable domener (for å bevare de ligandbindende egenskaper), men også "bemantle" dem med en human-lignende overflate ved en gjennomtenkt erstatning av de utsatte residuer (for å nedsette antigenisiteten)

(Padlan, Molec. Immunol, 28: 489 (1991)).

I hovedsak omfatter humanisering ved CDR-poding å transplantere kun CDR'ene på humant fragment på humane ramme- og konstante partier. Teoretisk bør dette tilnærmet fjerne immunogenisiteten (unntatt hvis det foreligger allotypiske eller idiotypiske for-skjeller). Imidlertid er det blitt beskrevet at enkelte rammeresiduer av det opprinnelige antistoff også må beholdes (Riechmann et al., Nature, 332: 323 (1988); Queen et al., Proe. Nati Acad. Sei. USA, 86: 10.029 (1989)).

Rammeresiduene som må beholdes, kan identifiseres ved modeller med en datamaskin. Alternativt kan kritiske rammeresiduer potensielt identifiseres ved å sammenligne kjente antistoff-kombinasjonsstillingsstrukturer (Padlan, Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994)).

Residuene som potensielt kan påvirke antigenbindingen, tilfaller flere grupper. Den første gruppe omfatter residuer som angrenser kombinasjonsstillingsflaten og som dermed kunne komme i direkte berøring med antigener. De omfatter de aminoterminale residuer og residuene som angrenser CDRene. Den andre gruppe omfatter residuer som kunne endre strukturen eller den relative oppstilling av CDRene enten ved å berøre CDRene eller de motstående kjeder. Den tredje gruppe omfatter aminosyrer med skjulte sidekjeder som kunne påvirke den strukturelle integritet av de variable domener. Residuene i disse grupper finnes vanligvis i samme stillinger (Padlan, Molec. Immun., 31 (3): 169-217 (1994)) ifølge det vedtatte nummereringssystem (jfr. Kabat et al., "Sequences of proteins of immunological interest", 5. utg., pub. nr. 91-3242, U.S. Dept. Health & Human Services, NTH, Bethesda, MD, 1991).

Selv om humaniserte antistoffer er ønskelige på grunn av deres potensielt lave immunogenisitet i mennesker, er produksjonen derav imidlertid uforutsigbar. F. eks. kan en sek-vensmodifikasjon i antistoffer føre til et betydelig eller t.o.m. fullstendig tap av antigen-bindingsfunksjon, eller tap av bindingsspesifisitet. Alternativt kan "humaniserte antistoffer" fortsatt oppvise immunogenisitet i mennesker, uavhengig av sekvensmodifi-kasjonen.

Fra WO A3 96/23071 er det kjent humaniserte antistoffer som binder til gp39. WOA2 95/28957 og WO Al 95/06666 beskrives det å fremstille humaniserte antistoff av blant annet det murine monoklonale antistoff 24 - 31, men her beskrives ikke fremskaffelse av slike antistoffer, og heller ikke angis sekvensene til 24 - 31.

I EP Al 0519596 er det beskrevet en fremgangsmåte for å redusere immunogenisiteten av variable domener hos antistoff. Ingen av disse tidligere kjente antistoff angår imidlertid slike humaniserte antistoff som omfatter aminosyresekvensene angitt i krav 1.

Det finnes dermed fortsatt et betydelig behov innen faget for nye humaniserte antistoffer mot utvalgte antigener. Spesielt finnes det et behov innen faget for humaniserte antistoffer som er spesifikke for gp39, grunnet deres potensiale som immunoterapeutiske midler.

FORMÅL FOR OPPFINNELSEN

Med dette mål er det et formål for oppfinnelsen å frembringe humaniserte antistoffer som angitt i krav 1 og som er spesifikke for humant gp39.

Nærmere bestemt er det et formål for oppfinnelsen å frembringe slike humaniserte antistoffer avledet fra murine antistoffer mot gp39 og spesielt 24-31, som er et spesifikt murint antistoff som bindes til humant gp39.

Det er også et formål for oppfinnelsen å frembringe farmasøytiske blandinger som inneholder slike humaniserte antistoffer som er spesifikke for humant gp39.

Det er et mer spesielt formål for oppfinnelsen å frembringe farmasøytiske blandinger som inneholder slike humaniserte antistoffer avledet fra 24-31, som er et murint antistoff som spesifikt bindes til humant gp39.

Det er et ytterligere spesielt formål for oppfinnelsen å frembringe anvendelse av slike humaniserte antistoffer mot humant gp39 for fremstilling av medikamenter til behandling av humane sykdomstilstander, som kan behandles ved modulasjon av gp39-ekspresjonen og/eller inhibering av gp39/CD40-bindingsvekselspillet, omfattende f.eks. autoimmune sykdommer såsom systemisk lupus erythematose, rheumatoid artritt, multippel sklerose, idiopatisk trombocytopenisk purpura (ITP), diabetes, og ikke-autoimmune tilstander, såsom "graft-vs.-host-disease" og transplantasjon.

Det er enda et ytterligere formål for oppfinnelsen å frembringe nukleinsyresekvenser som koder for slike humaniserte antistoffer mot humant gp39.

Det er et enda mer spesielt formål for oppfinnelsen å frembringe nukleinsyresekvenser som koder for slike humaniserte antistoffer avledet fra 24-31, som er et murint antistoff som bindes spesifikt til humant gp39-antigen.

Det er et ytterligere formål for oppfinnelsen å frembringe vektorer som tilveiebringer en ekspresjon av slike humaniserte antistoffer mot humant gp39, spesielt humaniserte antistoffer avledet fra 24-31, som er et murint antistoff som bindes spesifikt til humant gp39-antigen.

SAMMENFATNING AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse retter seg dessuten mot humaniserte antistoffer som bindes til gp39 som har evnen til å inhibere bindingen gp39 til CD40 hvor nevnte antistoff inneholder et humanisert lettkjede variabelt område omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av:

og hvor nevnte antistoff inneholder et humanisert tungkjede variabelt område omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: Foreliggende oppfinnelse retter seg dessuten mot nukleinsyresekvenser som koder for ekspresjonen av slike humaniserte antistoffer, samt ekspresjonsvektorer som bevirker en produksjon av humaniserte antistoffer i rekombinante vertsceller. Disse DNA-sekvenser vil kode for de humaniserte variable tunge og/eller humaniserte variable lette sekvenser som er oppført i det følgende: og en humanisert variabel tung sekvens utvalgt fra den følgende gruppe:

Foreliggende oppfinnelse er også rettet mot bruken av de ovenfor anførte humaniserte antistoffer som er spesifikke for gp39, til fremstilling av farmasøytiske midler for behandling av autoimmune forstyrrelser, f. eks. rheumatoid artritt, multippel sklerose, diabetes, systemisk lupus erythematose og ITP, eller for behandling av ikke-autoimmune forstyrrelser, bl.a. "graft-vs.-host-disease", og for inhibering avtransplan-tatutstøtning.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Fifiur 1 viser IDECs ekspresjonsvektor N5KG1 som brukes for å uttrykke humaniserte og kimære antistoffer avledet fra 24-31.

Fifiur 2A viser resultater fra et B-celleproliferasjonsassay hvor humane PBL'er ble bragt i berøring med oppløselig gp39-CD8, rekombinant humant IL-4 og murint 24-31-antistoff eller murine IgGl-monoklonale kontrollantistoffer, som demonstrerer at 24-31-antistoffet inhiberer B-celleproliferasjonen som induseres av gp39.

Fifiur 2B viser resultater av et B-celledifferensieringsassay ved bruk av mitomycinbe-handlede T-celler som ble aktivert med immobilisert anti-CD3 som ble dyrket i nærvær av IgD<+->B-celler og forskjellige konsentrasjoner av 24-31-antistoffet, som viser at 24-31-antistoffet inhiberer den T-celleavhengige polyklonale antistoffproduksjon i humane B-celler.

Fifiur 3 viser FACS av ikke-transfiserte CHO-celler og en gp39-transfektant.

Figur 4 viser aminosyresekvensen og DNA-sekvensen som tilsvarer en foretrukket humanisert variabel lett sekvens (med de komplementaritetsbestemmende partier) som benevnes VL nr. 1 eller foretrukket humanisert variabel lett sekvens (1). Figur 5 viser aminosyre- og DNA-sekvensen som tilsvarer en foretrukket humanisert variabel ligandsekvens (med de komplementaritetsbestemmende partier) som benevnes VL nr. 2 eller foretrukket humanisert variabel lett sekvens (2). Figur 6 viser aminosyre- og DNA-sekvensen som tilsvarer en foretrukket humanisert variabel tung sekvens (med de komplementaritetsbestemmende partier) som benevnes VH nr. 1 eller foretrukket humanisert variabel tung sekvens (1). Figur 7 viser aminosyre- og DNA-sekvensen av den variable lette sekvens av 24-31 (ikke-humanisert). Figur 8 viser aminosyre- og DNA-sekvensen av den variable tunge sekvens av 24-31 (ikke-humanisert). Figur 9 sammenligner bindingen av murint 24-31, kimært 24-31 og et humanisert 24-31-antistoff til gp39-uttrykkende CHO-celler. Figur 10 viser resultatene av et konkurranseassay som sammenlignet bindingen av 24-31 (biotin) og humanisert, kimært og 24-31 til gp39-uttrykkende CHO-celler. Figur 11 viser resultatene av et assay som målte virkningen av murint 24-31 og et humanisert 24-31-antistoff ifølge oppfinnelsen på produksjonen av humant IgM i B-celler som ble dyrket i nærvær av mitomycin C-behandlede T-celler. Figur 12 viser resultatene av et assay som sammenlignet bindingen av to humaniserte antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse til gp39-uttrykkende CHO-celler.

Figur 13 viser Scatchard-plotten for murint 24-31.

Figur 14 viser Scatchard-plotten for humanisert versjon 1.

Figur 15 viser Scatchard-plotten for humanisert versjon 2.

Figur 16 viser FcRI-bindingen av H24-31.1 i nærvær av gp39/CD8-fusjonsprotein, og viser at H24-31.1 kun binder Fc-reseptor I når det foreligger i et kompleks med antigenet. Figur 17 viser FcRU-bindingen av H24-31.1 i nærvær av gp39/CD8-fusjonsprotein, og viser at H24-31.1 kun binder Fc-reseptor II når det foreligger i et kompleks med antigenet. Figur 18 viser den komplementavhengige cellulære cytotoksisitet ved bruk av" Alamar Blue", og viser at H24-31.1 inhiberer 50% av celleveksten ved ca. 0,5 ug/ml. Figur 19 viser bestemmelsen av Clq-bindingen av gp39+CHO-bundet H24-31.1 (humanisert 25-31 versjon 1). Nærmere bestemt ble gp39+CHO-celler som var merket med forskjellige konsentrasjoner av H24-31.1, inkubert i et overskudd av humant Clq (komplementfaktor 1) og deretter inkubert med FITC-merket geite-anti-humant Clq. Prøvene ble analysert ved strømningscytometri for å bestemme den relative merking av cellene med Clq. Figuren viser også at merkingen av cellene med Clq var avhengig av antistoffkonsentrasjonen, og at et H24-31.1-Fab-fragment (ingen Clq-binding) ikke bandt Clq. Figur 20 viser virkningen av H24-31.1 på T-celleresponsen på et T-celleavhengig hukommelses-antigen. Figuren viser også at den TT-induserte vekst og ny-produksjonen ble inhibert maksimalt, med rundt 40%, av > 1 n.g/ml H24-31.1. Figur 21 viser virkningen av H24-31.1 på den T-celleavhengige B-celledifferensiering. Figuren viser også at H24-31.1 inhiberer den T-celleavhengige IgG-produksjon med ca. 85% ved 1 ng/ml. Den tilsynelatende økning av IgG-produksjonen som observeres ved høyere konsentrasjoner, skyldes denne testens manglende evne til å skille mellom H24-31.1 og antistoff som fremstilles av B-cellene. Figur 22 viser virkningen av H24-31.1-Fab på den T-celleavhengige B-celledifferensiering. Anti-gp39-antistoffinhiberingenavB-cellenes T-celleavhengige IgG-produksjon vises også. Figuren viser også at det ikke var noen forskjellig inhibering av IgG-produksjonen mellom helt H24-31.1 -antistoffet og Fab-fragmentet. Figur 23 viser virkningen av H24-31.1 på genereringen av antigenspesifikke B-celleresponser på et T-celleavhengig hukommelsesantigen. Humane miltceller som var primet med tetanustoksin i 3 dager in vitro, ble overført til SCID-mus i en konsentrasjon på ca. 1 x IO<7> celler/SCID. Etter 6 dager fikk de dannede hu-SPL-SCID-mus injisert PBS (gruppe 1) eller 300 ug H24-31.1 (gruppene 1 og 2). På den følgende dag fikk Hu-SPL-SCID-musene boosterbehandlinger med tetanustoksin. Musene i gruppe 3 fikk to ytterligere injeksjoner av 300 ug H24-31.1 hver med tre dagers intervaller. Man tok blodprøver fra musene ved forskjellige tidspunkter, og nivået av humant IgG-anti-tetanustoksin-titrene ble bestemt ifølge ELISA. Figuren viser også at en injeksjon av H24-31.1 inhiberte genereringen av de tetanustoksinspesifikke responser med ca. 90% (gruppe 3). Nivået av det samlede humane IgG var sammenlignbart for alle tre grupper. Figur 24 viser proliferasjonen av humane B-celler med oppløselig gp39-CD8. Forskjellige konsentrasjoner av CD8-gp39 ble inkubert med anrikede humane B-celler plus IL-4, i et fire dagers proliferasjonsassay. CPM'et som ble oppnådd i B-celler-plus-IL-4-kulturer uten gp39-CD8, ble brukt som bakgrunnsverdi og subtrahert fra det samlede CPM i testkulturene som var blitt stimulert med gp39-CD8. Celler som ble dyrket med PWM plus IL-4, tjente som positivkontroll for B-celleproliferasjonen. CPM-verdien representerer det midlere CPM-nivå av prøvene, som hver ble testet i tre eksemplarer. Figur 25 viser inhiberingen av B-celleproliferasjonen med H24-31.1. Forskjellige konsentrasjoner av H24-31.1 -antistoff ble inkubert med B-celler (1 x 10<5>) som ble dyrket med IL-4 (1000 U/ml) og 10 \ ig/ ml gp39-CD8 i et fire dagers proliferasjons-

assay. Celler som ble dyrket med PWM plus IL-4, tjente som positivkontroll for B-celleproliferasjonen. CPM-verdien representerer det midlere CPM-nivå av prøvene, som hver ble testet i tre eksemplarer.

Figur 26 viser blokkeringen av CD40-Ig-bindingen til gp39 med humaniserte versjoner av 24-31. Denne figur illustrerer også at de murine og humaniserte versjoner av 24-31 blokkerer bindingen av CD40-Ig.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Før oppfinnelsen beskrives, bringes definisjoner av visse begreper som brukes i foreliggende beskrivelse, i det følgende: Humanisert antistoff: Dette begrep henviser til et antistoff som er avledet fra et ikke-humant antistoff, vanligvis murint, som bevarer eller i hovedsak bevarer de antigenbindende egenskaper av stam-antistoffet, men som er mindre immunogent i mennesker. Dette kan oppnås ved forskjellige fremgangsmåter, bl.a. (a) poding av de fullstendige ikke-humane variable domener på humane konstante partier for å generere kimære antistoffer, (b) pode kun de ikke-humane CDRer på humane ramme- og konstante partier, med eller uten kritiske rammeresiduer i behold, eller (c) transplantasjon av de fullstendige ikke-humane variable domener, men "bemantling" derav med et human-lignende parti ved erstatning av overflateresiduer. Slike fremgangsmåter beskrives av Jones et al., Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 81: 6851-6855 (1984); Morrison og Oi, Adv. Immunol., 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28: 489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31 (3): 169-217

(1994).

Komplementaritetsbestemmende parti, dvs. CDR: Begrepet CDR vedrører når det brukes heri, aminosyresekvenser som sammen bestemmer bindingsaffiniteten og spesifisiteten av det naturlige Fv-parti av en nativ immunoglobulin-bindingsstilling som skildret av Kabat et al. (1991).

Rammeparti ( FR): Begrepet FR vedrører når det brukes heri, aminosyresekvenser som ligger mellom CDRene. Disse partier av antistoffet tjener til å holde CDRene fast i riktig retning (gjør det mulig for CDRene å binde antigen).

Konstant parti: Det parti av antistoffmolekylet som formidler effektorfunksjoner. Ifølge foreliggende oppfinnelse er murine konstante partier substituert med humane konstante partier. De konstante partier av de kimære eller humaniserte antistoffer ifølge oppfinnelsen er avledet fra humane immunoglobuliner. Det tungkjedede konstante parti kan velges fra hvilken som helst av de fem isotyper: alfa, delta, epsilon, gamma eller my. Videre er tunge kjeder av forskjellige undergrupper (såsom IgG-undergruppene av tunge kjeder) ansvarlige for forskjellige effektorfunksjoner, og dermed kan man ved å velge det ønskede tungkjedede konstante parti, fremstille kimære antistoffer med den ønskede effektorfunksjon. Foretrukne konstante partier er gamma 1 (IgGl), gamma 3 (IgG3) og gamma 4 (IgG4). Mer foretrukket er et Fc-parti av gamma 1-isotypen (IgGl-isotypen). Det lettkjedede konstante parti kan være av kappa- eller lambda-typen, fortrinnsvis kappa-typen.

Kimært antistoff: Dette er et antistoff som inneholder sekvenser avledet fra to forskjellige antistoffer, som vanligvis stammer fra forskjellige arter. De vanligste kimære antistoffer omfatter humane og murine antistoffragmenter, generelt humane konstante og murine variable partier.

Immunogenisitet: Et mål for et målproteins eller en terapeutisk enhets evne til å utløse en immunrespons (humoral eller cellulær) når det/den administreres til en mottaker. Foreliggende oppfinnelse er opptatt av immunogenisiteten av de humaniserte antistoffer ifølge oppfinnelsen.

Humanisert eller kimært antistoff med nedsatt immunogenisitet: Dette vedrører et antistoff eller et humanisert antistoff som oppviser en nedsatt immunogenisitet sammenlignet med stam-antistoffet, f. eks. 24-31-antistoffet.

Humanisert antistoff som i hovedsak beholder bindingsegenskapene av stam- antistoffet: Dette vedrører et humanisert eller kimært antistoff som beholder sin evne til å spesifikt binde antigenet som gjenkjennes av stam-antistoffet som brukes for å fremstille et slikt humanisert eller kimært antistoff. Humaniserte eller kimære antistoffer som i hovedsak beholder bindingsegenskapene av 24-31, vil bindes til humant gp39. Fortrinnsvis vil det humaniserte eller kimære antistoff oppvise lik eller tilnærmet lik antigenbindingsaffi-nitet og -styrke som stam-antistoffet. Ideelt vil affiniteten av antistoffet ikke være lavere enn 10% av stam-antistoffets affinitet, mer foretrukket ikke lavere enn 30%, og mest foretrukket vil affiniteten ikke være lavere enn 50% av stam-antistoffets affinitet. Fremgangsmåter for testing av antigenbindingsaffiniteten er velkjent innen faget, og omfatter halvmaksimale bindingsassayer, konkurranseassayer og Scatchard-analyse. Egnede antigenbindingsassayer beskrives i foreliggende beskrivelse.

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot nye humaniserte monoklonale antistoffer som binder humant gp39, og deres anvendelse ved fremstilling av terapeutiske midler. Foreliggende oppfinnelse er dessuten rettet mot nukleinsyresekvenser som koder for disse humaniserte antistoffer, og deres ekspresjon i rekombinante vertceller.

Nærmere bestemt er foreliggende oppfinnelse rettet mot humaniserte antistoffer som angitt i krav avledet fra murint antistoff 24-31 og som spesifikt bindes til humant gp39.

Murint antistoff 24-31 er et murint antistoff som ble utviklet mot humant gp39 og som funksjonelt inaktiverer gp39 både in vitro og in vivo. Derfor har det egenskaper som gjør det potensielt nyttig for behandling av sykdommer hvor det er ønskelig med en gp39-inaktivering og/eller modulasjon eller inhibering av gp39/CD40-vekselspillet. Spesielt omfatter slike sykdommer autoimmune sykdommer, såsom f. eks. rheumatoid artritt, multippel sklerose, ITP, diabetes og systemisk lupus erythematose, samt ikke-autoimmune sykdommer, såsom "graft-vs. -host-disease" og transplantatutstøtning.

Selv om det murine antistoff 24-31 har funksjonelle egenskaper som gjør det potensielt egnet som et terapeutisk middel, har det imidlertid flere potensielle ulemper. Fordi det er av murint opphav, kan det potensielt være immunogent i mennesker. Fordi det inneholder murine konstante sekvenser, vil det dessuten sannsynligvis ikke oppvise hele rekken av humane effektorfunksjoner, og vil sannsynligvis klares raskere fra kroppen hvis det administreres til mennesker. Mens slike ulemper ikke skulle utgjøre noe pro-blem ved behandlingen av enkelte sykdomstilstander eller mennesker, utgjør de et alvorlig hinder hvis sykdommen som skal behandles, er av kronisk eller gjenopptredende natur. Eksempler på gjenopptredende eller kroniske sykdommer omfatter f. eks. autoimmune sykdommer, hvor verten kontinuerlig eller kronisk oppviser en autoimmun reaksjon på selv-antigener.

For å mildne ulempene som er forbundet med murint antistoff 24-31, nemlig en potensiell immunogenisitet i mennesker og nedsatte humane effektorfunksjoner, ønsket foreliggende oppfinnere derfor å fremstille forbedrede, humaniserte derivater av det murine 24-31-antistoff. Mens dette var målet for foreliggende oppfinnelse, var det ønskede resultat ikke av rutinemessig eller forutsigbar natur. En humanisering av antistoffer krever et omhyggelig valg av hvilke aminosyreresiduer som skal modifiseres, og et vel-overveid valg av hvilke residuer som skal erstatte dem. Dette kommer av at en modifikasjon av antistoffers variable partier, selv modifikasjoner som kun omfatter noen få aminosyreresiduer, kan ha en betydelig svekkende virkning på antigenbindingen. F. eks. kan humaniserte antistoffer oppvise en betydelig nedsatt antigenaffinitet og/eller antigenspesifisitet i forhold til stam-antistoffet.

Som nevnt ovenfor, er forskjellige fremgangsmåter for humanisering av antistoffer, også murine antistoffer, blitt beskrevet i litteraturen. Jfr. f.eks. Padlan, Molec. Immunol, 31 (3): 169-217 (1994); Padlan, Molec. Immunol, 28: 484-498 (1991); Morrison og Oi, Adv. Immunol, 44: 65-92 (1988), som alle er innlemmet i sin helhet heri ifølge henvisning dertil. Disse fremgangsmåter omfatter spesielt humanisering ved CDR-poding (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1539

(1988); og den mer egnede fremgangsmåte som beskrives av Padlan, Molec. Immunol, 28: 489 (1991) og Padlan, Molec. Immunol, 31: 169 (1994), som omfatter valget av ikke-essensielle ramme-aminosyreresiduer og en modifikasjon derav ved en egnet substitusjonsmutasjon.

Som nevnt kan CDR-podingsteknikker, selv om de i enkelte tilfeller er fremgangsrike, ha betydelige ugunstige virkninger på affiniteten av de erholdte humaniserte antistoffer. Dette antas å forekomme fordi enkelte rammeresiduer påvirker, eller er nødvendige for og i det minste påvirker, antigenbindingen. Vår teknikk (Padlan (1994) ( Idem)) er mer forfinet, fordi vi kun beholder slike murine rammeresiduer som vi anser å være nødven-dige for å bevare antistoffets kombinasjonsstilling, mens overflateegenskapene av mole-kylet holdes så humane som mulig. Følgelig har denne teknikk et potensiale for å fremstille humaniserte antistoffer som beholder antigenbindingsegenskapene av stam-antistoffet. Av denne grunn valgte foreliggende oppfinnere denne teknikk som fremgangsmåten ved hvilken man potensielt kunne erholde humaniserte antistoffer avledet fra murint antistoff 24-31 som er spesifikt for humant gp39.

Kloningen av de variable partier av 24-31 (som skal beskrives i detalj i de følgende eksempler) førte til identifikasjonen av Vl- og VH-sekvenser som benyttes av 24-31-antistoffet som vises på figur 7 hhv. figur 8. Etter sekvensieringen ble de variable partier humanisert. Som sagt, ble dette utført hovedsaklig ifølge fremgangsmåten som beskrives av Padlan (1994) ( Idem).

Denne fremgangsmåte omfatter i hovedsak å erstatte den ikke-humane ramme med humane rammeresiduer, idet kun slike rammeresiduer som vi anså å være nødvendige for bevaringen av antigenbindingsegenskapene, ble beholdt. Ideelt vil denne metode gi flaten av det xenogene antistoff en human-lignende karakter og dermed gjøre det mindre immunogent, mens de indre og berørende residuer som påvirker dets antigenbindende egenskaper, beholdes.

Nærmere bestemt ble 24-3 1-Vk- og VH-sekvensene som vises på figurene 7 og 8, humanisert ved sammenligning med humane antistoffer med kjent sekvens, som benevnes "sjabloner".

Nærmere bestemt ble 24-3 1-Vk humanisert ved bruk av:

(a) For VL nr. 1, de humane V-kappa-undergruppe I-sekvenser, feks. DEN og lignende, samt "germline" 012 (jfr. Cox et al., Eur. J. Immunol, 24: 827-836

(1994)), og for VL nr. 2, de humane V-kappa-undergruppe IV-sekvenser, feks.

LEN, som sjabloner. Slike sjablonesekvenser er kjent, og beskrives av Kabat et al. (1991) ( Idem) eller GenBank.

24-3 1-Vh nr. 1 ble humanisert ved bruk av:

(a) den humane VH-undergruppe IV-sekvens, dvs. 58p2, og (b) (GenBank-tilgangsnr.) Zl8320 og "germline" 3d75d (S. van der Maarel et al., J.

Immunol, 150: 2858-2868 (1993),

som sjabloner.

Slike variable tunge antistoff-sjablonesekvenser er også kjent, og beskrives i Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5. utg., NTH (1991) og i GenBank.

De humane variable tunge og lette sjablonesekvenser ble valgt på grunnlag av et antall forskjellige kriterier, omfattende spesielt en høy grad av sekvenslikhet med 24-31 i sin helhet, og likhet av de "viktige" residuer, dvs. residuene som anses å foreligge i Vl:Vh-grensesnittet; som står i berøring med de komplementaritetsbestemmende partier, eller som peker innover. Sjablonene ble også valgt således at de potensielt kunne bevare den elektrostatiske ladning av 24-31-FV i så stor grad som mulig, og også med sikte på å bevare glyciner, proliner og andre bestemte aminosyreresiduer som antas å påvirke antigenbindingen.

Denne fremgangsmåte førte til de foretrukne humaniserte Vl- og VH-tunge sekvenser avledet fra 24-31-antistoffet som vises nedenfor i tabell 1 og tabell 2. Som nevnt ovenfor, omfatter oppfinnelsen i tillegg ekvivalenter og varianter av disse foretrukne humaniserte sekvenser, feks. slike som inneholder én eller flere konservative aminosyresubstitusjoner som ikke påvirker gp39-bindingen til noen betydelig grad. De komplementaritetsbestemmende partier identifiseres i figurene 7 og 8, som fører opp de fullstendige variable tung og lett kjede-CDR-sekvenser av (det ikke-humaniserte) 24-31 -stam-antistoff Som vist på tabellene, utviklet man fire foretrukne humaniserte rammesekvenser hver for Vh- og VL-kjeden. Derfor finnes det 16 forskjellige mulige humaniserte 24-31-antistoffer som kan syntetiseres ved bruk av de ovennevnte humaniserte Vh- og Vl-24-31-sekvenser, i tillegg til varianter og ekvivalenter som inneholder konservative modifikasjoner.

Humaniserte 24-31-antistoffer som inneholder disse humaniserte variable tunge og lette sekvenser, kan erholdes ved rekombinante metoder. Det forventes at humaniserte sekvenser som inneholder hvilken som helst kombinasjon av de ovennevnte foretrukne humaniserte variable sekvenser, vil føre til humaniserte antistoffer som binder humant gp39. På grunnlag av disse sekvenser, forventes videre at fortrinnsrekkefølgen ved bruk av nummereringen som vises i tabell 1 og tabell 2, vil være som følger:

(1) nr. 1-Vl med nr. 1-Vh (versjon 1)

(2) nr. 2-VL med nr. 1-VH (versjon 2)

(3) nr. 1-Vl med nr. 2-Vh (versjon 3)

(4) nr. 2-Vl med nr. 2-Vh (versjon 4)

De ovennevnte humaniserte Vh- og VL-sekvenser kan modifiseres ytterligere, feks. ved innføring av en eller flere ytterligere substitusjonsmodifikasjoner, og ved tilføyelse av andre aminosyrer. Ytterligere modifikasjoner vil velges som ikke har noen ugunstig virkning på antigen- (gp39-) bindingen. F. eks. overveier oppfinnerne en ytterligere modifikasjon av VH-kjeden ved substitusjon av ett eller flere av residuene 34, 43, 44 og 68 (ifølge Kabats nummereringsskjema); Kabat et al. (1991) ( Idem). Dessuten overveier oppfinnerne en modifikasjon av residuum 85 av VL-kjeden. På grunnlag av de strukturelle egenskaper av antistoffets kombinasjonstilling, forventer man ikke at en modifikasjon av disse residuer skulle føre med seg noen ugunstig forstyrrelse av antigenbindingen. Videre forventes det at innføringen av ett eller flere konservative aminosyresubstitusjoner ikke vil ha noen ugunstig virkning på gp39-bindingen.

For en nærmere beskrivelse av de humaniserte 24-3 1-Vh- og VL-sekvenser ifølge oppfinnelsen, er de foretrukne humaniserte rammesekvenser også oppført i den følgende tabell 3, som sammenligner disse sekvenser med de humane variable tunge og lette ramme-sjablonesekvenser, dvs. humant DEN VK1, humant ol2/V36-"germline", humant LEN VKIV, humant 58p2, humant Z18320 og humant 3d75d, samt med de ikke-humaniserte murine 24-3 1-Vh- og VL-rammesekvenser. For å fremstille humaniserte antistoffer, syntetiseres DNA-sekvenser som koder for de ovennevnte humaniserte Vl- og Vji-sekvenser. Som nevnt, finnes det når man tar i betraktning disse fire humaniserte VL-sekvenser og fire humaniserte Vji-sekvenser, 16 potensielle humaniserte antigenkombinasjonsstillinger som kan syntetiseres. Det finnes også flere potensielle humaniserte antigenkombinasjonsstillinger når man tar i betraktning den potensielle substitusjon av residuene 34, 43, 44 og 68 av det humaniserte Vh og residuum 85 av det humaniserte Vl med andre aminosyreresiduer og/eller den potensielle innlemmelse av konservative substitusjonsmutasjoner. To av de foretrukne humaniserte variable lette sekvenser (1) og (2) og en foretrukket humanisert variabel tung sekvens (1) omfattende de komplementaritetsbestemmende partier og tilsvarende DNA-sekvenser er oppført på figurene 4, 5 hhv. 6.

Fremgangsmåter ved syntetisering av DNA som koder for et protein hvis sekvens er kjent, er velkjent innen faget. Ved bruk av slike metoder blir DNA-sekvenser som koder for de humaniserte Vl- og VH-sekvenser ifølge oppfinnelsen, syntetisert og deretter uttrykt i vektorsystemer som er egnet for ekspresjon av rekombinante antistoffer. Dette kan utføres i hvilket som helst vektorsystem som tillater at de humaniserte Vl- og Vh-sekvenser uttrykkes som et fusjonsprotein med humane konstant domene-sekvenser, og forbindes for å danne funksjonelle (antigenbindende) antistoffer.

Ekspresjonsvektorer og vertceller som er egnet for ekspresjon av rekombinante antistoffer og spesielt humaniserte antistoffer, er velkjent innen faget.

De følgende litteraturhenvisninger er representative for fremgangsmåter og vektorer som er egnet for ekspresjon av rekombinante immunoglobuliner: Weidle et al., Gene, 51: 21-29 (1987); Dorai et al., J. Immunol, 13 (12): 4232-4241 (1987); De Waele et al., Eur. J. Biochem., 176: 287-295 (1988); Colcher et al., Cancer Res., 49: 1738-1745

(1989); Wood et al., J. Immunol, 145 (a): 3011-3016 (1990); Bulens et al., Eur. J. Biochem., 195: 235-242 (1991); Beggington et al., Biol Technology, 10: 169 (1992); King et al., Biochem. J., 281: 317-323 (1992); Page et al., Biol. Technology, 9: 64

(1991); King et al., Biochem. J., 290: 723-729 (1993); Chaudary et al., Nature, 339: 394-397 (1989); Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Morrison og 0\, Ad\. Immunol, 44: 65-92 (1988); Benhar et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 91: 12051-12055

(1994); Singer et al., J. Immunol, 150: 2844-2857 (1993); Cooto et al., Hybridoma, 13 (3): 215-219 (1994); Queen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 86: 10029-10033 (1989); Caron et al., Cancer Res., 32: 6761-6767 (1992); Cotoma et al., J. Immunol. Meth., 152: 89-109 (1992). I tillegg er vektorer som er egnet for ekspresjon av rekombinante antistoffer, tilgjengelige i handelen. Vertsceller som er kjent for å ha evnen til å uttrykke funksjonelle immunoglobuliner, omfatter feks. pattedyrceller såsom ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO), COS-celler, myelomaceller, bakterier såsom Escherichia coli, gjærceller såsom Saccharomyces cerevisiae, blant andre vertceller. Av disse brukes CHO-celler av mange forskere, grunnet deres evne til å virksomt uttrykke og utsondre immunoglobuliner.

I hovedsak utløses en rekombinant ekspresjon av humaniserte antistoffer på én av to generelle fremgangsmåter. I den første fremgangsmåte transfiseres vertcellene med en enkelt vektor som tilveiebringer ekspresjonen av både tunge og lette variable sekvenser som er sammensmeltet med utvalgte konstante partier. I den andre fremgangsmåte transfiseres vertcellene med to vektorer som hver tilveiebringer en ekspresjon av enten den variable tunge eller den variable lette sekvens sammensmeltet med utvalgte konstante partier.

Humane konstant domene-sekvenser er velkjent innen faget, og beskrives i litteraturen. Foretrukne humane VL-sekvenser omfatter de kappa- og lambda-konstante lette sekvenser. Foretrukne humane tunge konstante sekvenser omfatter humant gamma 1, humant gamma 2, humant gamma 3, humant gamma 4 og muterte versjoner derav som tilveiebringer en endret virkning eller funksjon, feks. en forlenget halveringstid in vivo og en nedsatt Fc-reseptorbinding.

Foretrukne modifikasjoner av humant gamma 4-konstant domene omfatter P- og/eller E-modifikasjoner, som hver henviser til endringen av et leucin til glutamsyre i stilling 236 og/eller endringen av et serin til prolin (Kabat-nummerering) i stilling 229.

Et spesielt foretrukket vektorsystem omfatter ekspresjonsvektorene som beskrives i de følgende patentsøknader: USSN 08/476.237, innlevert den 7. juni 1995, USSN 08/397.072, innlevert den 25. januar 1995, 08/147.696, innlevert den 3. november 1993, 07/977.691, innlevert den 13. november 1992, 07/912.122, innlevert den 10. juli 1992, 07/886.281, innlevert den 23. mars 1992, og 07/735.064, innlevert den 25. juli 1991.

Spesielt beskriver disse søknader vektorsystemer for fremstilling av rekombinante antistoffer, som benevnes TCAE 5.2 og TCAE 6 og som omfatter det følgende:

1) Fire transkripsjonelle kassetter i tandemrekkefølge:

(a) et humant immunoglobulin-lett kjede-konstant parti. I TCAE 5.2 er dette humant immunoglobulin-kappa-lett kjede-konstant parti (Kabat-nummerering: aminosyrene 108-214, allotype Km 3), og i TCAE 6 er det humant immunoglobulin-lett kjede-lambda-konstant parti (Kabat-nummerering: aminosyrene 108-215, genotype Oz-minus, Mcg-minus, Ke-minus-allotype); (b) humant immunoglobulin-tung kjede-konstant parti; i begge konstruksjoner er human immunoglobulin-tung kjede et gamma/konstant parti (Kabat-nummerering: aminosyrene 114-478 allotype Gmla, Gml2); (c) DHFR; inneholdende sin egen eukaryotiske promoter og sitt eget

polyadenylasjonsparti; og

(d) NEO; også inneholdende sin egen eukaryotiske promoter og sitt eget polyadenylasjonsparti. 2) Humant immunoglobulin-lett og tung kjede-kassettene inneholder syntetiske signalsekvenser for utsondring av immunoglobulinkjedene; og 3) Humant immunoglobulin-lett og tung kjedekassettene inneholder spesifikke DNA-koblinger som tillater en innføyelse av lette og tunge immunoglobulinvariable partier som vedlikeholder den translasjonelle lese-ramme, og som ikke endrer aminosyrene som vanligvis forefinnes i immunog lobulinkj eder.

Vektoren i VEDLEGG 2 er en modifikasjon av TCAE-vektorene som inneholder to forskjellige modifikasjoner ved neomycinfosfotransferasets (neo) startkodon. Den første modifikasjon er at det er blitt tilføyd en oppstrøms translasjonen startstilling utenfor rammen. Den andre modifikasjon er at startstillingen av neo-genet er blitt modifisert for å gjøre det mindre virksomt. NEOSPLA-vektoren er en modifikasjon av VEDLEGG 2-vektoren. neo-genet er blitt delt opp i to deler ved bruk av syntetiske donor/akseptor-skjøtestillinger, og den lette kjede, tunge kjede og DHFR-genene er blitt plassert inne i neo-intronet.

Disse vektorer brukes fortrinnsvis i CHO-celler. Foreliggende antistoffer uttrykkes fortrinnsvis i de ovennevnte vektorsystemer.

Imidlertid kan de humaniserte antistoffsekvenser ifølge oppfinnelsen som er avledet fra 24-31-antistoffet, uttrykkes i hvilket som helst vektorsystem som tilveiebringer en ekspresjon av funksjonelle antistoffer, dvs. slike som binder gp39-antigenet.

Spesielt valgte oppfinnerne å uttrykke de humaniserte Vl- og Vti-sekvenser ifølge oppfinnelsen, samt de native (umodifiserte) Vl- og Vji-sekvenser avledet fra 24-31, i CHO-celler ved bruk av N5KG1-ekspresjonsvektoren som inneholder humant kappa-og humant gamma 1-konstante partier. N5KG1-ekspresjonsvektoren avbildes skjematisk på figur 1. Som man også hadde håpet, binder det kimære antistoff som er avledet fra 24-31, gp39 når det uttrykkes i CHO-celler (ifølge en demonstrert binding til CHO/gp39-transfektant). Også flere humaniserte antistoffer ifølge oppfinnelsen som var avledet fra 24-31, førte når de ble uttrykt ved bruk av dette vektorsystem, til funksjonelle (gp39-bindende) antistoffer.

Foreliggende oppfinnelse skal beskrives nærmere ved presentasjon av de følgende eksempler.

EKSEMPEL 1

Valg av 24-31-antistoff som skal humaniseres.

Stadig flere tegn i dyremodeller tyder på at en anti-gp39-administrasjon forebygger diverse autoimmune prosesser og forstyrrer transplantatutstøtningen. Disse resultater gir overbevisende tegn på at antistoffer mot humant gp39 kan ha en betydelig terapeutisk verdi ved behandling av autoimmune sykdommer og transplantasjon av allogene vev og organer i mennesker. Et monoklonalt antistoff (mAb) som er spesifikt for humant gp39, er blitt beskrevet (Lederman et al., J. Immunol., 199: 3817 (1992)), og dess funksjonelle aktivitet ved blokkering av gp39/CD40-vekselspill in vitro er blitt bedømt. For å oppnå en bedre forståelse for den funksjonelle betydning av anti-gp39-antistoffer på det humane immunsystem, genererte man en rekke anti-humant gp39-mAb'er. Fra denne rekke virket ett mAb å være overlegent, og ble omfattende testet for en funksjonell inaktivering av gp39 in vitro og in vivo.

Nærmere bestemt genererte man en rekke på 6 murine (alle IgGl) anti-gp39-antistoffer ved immunisering med et oppløselig fusjonsprotein av humant gp39 (gp39-CD8), etterfulgt av en behandling med aktiverte humane perifere blod-T-celler. En strømningscyto-metrisk analyse av humane perifere blod-T-celler viste at mAb'ene gjenkjente et celleoverflatemolekyl som uttrykkes på aktiverte (PMA/ionomycin), men ikke på hvilende, CD3<+->T-celler, og at mønstret for reaktiviteten lignet hva som observeres med et rekombinant CD40-fusjonsprotein (CD40-Ig) (data ikke vist). Immunofelning av [<35>S]-meta-bolsk merkede aktiverte humane perifere blod-T-celler viste at hvert av de 6 mAb'er felte et molekyl med lignende størrelse (33 kDa) som hva som ble felt av CD40-Ig. I tillegg ble bindingen av CD40-Ig til gp39 blokkert i nærvær av antistoffene, hvilket tyder på en gjenkjenning av det samme molekyl, hvilket ytterligere bekrefter deres spesifisitet. Selv om alle 6 mAb'ene hadde evnen til å blokkere gp39-funksjonen, valgte man ett mAb, nemlig 24-31, for en omfattende analyse.

EKSEMPEL 2

Den T-celleavhengige B-celleproliferasjon og differensiering (Ig-produksjon) blokkeres av anti-gp39.

Et antall undersøkelser har vist tegn på at signaler som leveres av CD40 via dets ligand, gp39, induserer en aktivering, proliferasjon, differensiering og isotypeendring av B-celler. For å bestemme om det monoklonale anti-gp39-antistoffet 24-31 blokkerte gp39-funksjonen, ble B-celler dyrket med et oppløselig fusjonsprotein av gp39 (gp39-CD8) i nærvær eller fravær av 24-31, og B-cellenes proliferative respons ble bedømt ved innlemmelse av <3>H-thymidin. Resultatene, som vises på figur 2 A, demonstrerer at gp39-CD8 induserte en kraftig proliferasjon av B-cellene. Nærværet av anti-gp39-mAb'et 24-31 fjernet fullstendig B-celleproliferasjonen som ble indusert av gp39-CD8, ved konsentrasjoner som var såpass lave som 2,5 ug/ml. For å bestemme om 24-31 forstyrret den T-celleinduserte B-celledifferensiering, ble B-celler kultivert sammen med anti-CD3-aktiverte T-celler i nærvær eller fravær av 24-31. Den polyklonale IgM-, IgG- og IgA-produksjon ble bedømt etter 12 dager. Som vist på figur 2B, inhiberte tilsetningen av 24-31 fremstillingen av polyklonale IgM-, IgG- og IgA-antistoffer (90-99%). Disse resultater bekrefter tidligere rapporter som beskrev nødvendigheten for gp39/CD40-vekselspill i den T-celleavhengige B-celledifferensiering (Nishioka et al, J. Immunol, 153: 1027 (1994)), og demonstrerer dessuten nytten av de nylig karakteri-serte anti-humant gp39-mAb'er 24-31 ved blokkering av gp39-funksjonen.

EKSEMPEL 3

Anti-gp39 blokkerer in vivo den tetanustoksin-spesifikke antistoffproduksjon i scid- mus som ble rekonstituert med humant PBL.

Tallrike undersøkelser har vist at det humane immunsystem kan undersøkes in vivo under eksperimentelle betingelser ved bruk av mus med alvorlig kombinert immundefekt ("severe combined immunodeficiency": seid) som er blitt podet med humane perifere blodlymfocytter (hu-PBL-sczVi-mus) (Mosler et al., Nature, 335: 256 (1988); McCune et al., Science, 241: 1632 (1988). En langsiktig kimærisme oppnås i scid-musene ved injeksjon av humant PBL, og antigenspesifikke sekundære antistoffresponser kan påvises i hu-PBL-sczVi-mus som er blitt behandlet in vivo med antigen (Carlsson et al., J. Immunol, 148: 1065 (1992); Duchosal et al., CellImmunol, 139:

468 (1992)). Dette system ble brukt for å bedømme de immunosuppressive virkninger av en anti-gp39-administrasjon in vivo på immunresponsene som utløses av humane T-og B-celler. Eksperimenter hvis resultater er oppført på figur 2B, demonstrerte at en blokkering av gp39-funksjonen med 24-31 inhiberte den T-celleavhengige polyklonale Ig-produksjon i humane B-celler in vitro. For å bestemme om 24-31 også kunne inhibere den antigenspesifikke antistoffproduksjon i B-cellene in vivo, fikk C. B- 17- scid/ scid- mus injisert i.p. humant PBL ( hxx- PBL- scid), og ble immunisert med tetanustoksin (TT), hvoretter de ble behandlet med 24-31 eller PBS, og den sekundære (IgG-) anti-TT-antistoffrespons ble bedømt. Immunisering av hu- FBL- scid med TT førte til påvisbare nivåer av IgG-anti-TT-antistoff innen 14 dager etter immuniseringen i de fleste dyr (tabell 4). Imidlertid fjernet en behandling med anti-gp39 (24-31; 250 ug/dag, to ganger i uken) fullstendig den sekundære anti-TT-antistoffrespons i 9 av de 10 undersøkte mus, hvilket demonstrerer at en in v/vo-blokkering av gp39-funksjonen også førte til en inhibering av de antigenspesifikke humorale responser.

Tabell 4. Fjerning av den sekundære anti-tetanus-antistoffrespons etter poding med humant PBL i C. B- 17- scid/ scid- mus som var blitt immunisert med tetanustoksin.<*> Fire til seks uker gamle C. B- 17- scid/ scid- mus fikk injisert i.p. 20 x IO<6 >humant PBL og 0,25 ml tetanustoksin.

Tf Anti-gp39 24-31 eller PBS (250 ug/injeksjon) ble administrert i.p. to ganger i uken under hele

eksperimentets varighet.

§ Mengden humant anti-tetanustoksin-antistoff i serumet ble bestemt ukentlig ifølge ELISA. Alle mus med et serumnivå av humant anti-tetanustoksin-antistoff > 0,100 O.D. ved en 1:10-fortynning, ble ansett å være positive. Kun positive mus ble brukt ved beregning av verdiene for gjennomsnitt ± SE som er oppført i tabellen. Mengden humant anti-tetanustoksin i sera fra for-immune mus som ikke var blitt immunisert med tetanustoksin, var <0,02 O.D. Dataen

presenteres i form av gjennomsnitt ± SE.

<*> Signifikant forskjellig (p = 0,222) fra den anti-gp39-behandlede gruppe.

<**> Signifikant forskjellig (p < 0,001) fra den anti-gp39-behandlede gruppe.

EKSEMPEL 4

Anti-gp39-behandling inhiberer ikke den antigenspesifikke T-celleproliferative respons av hu-PBL-sr/Vi-miltceller.

For å bestemme om en behandling av hu-PBL-sr/d-mus med anti-gp39 endret responsvilligheten av antigenspesifikke T-celler in vivo, bedømte man den proliferative respons av miltceller fra hu-PBL-sc/J-mus som var blitt immunisert med TT og behandlet med 24-31, in vitro. Miltceller fra kontroll- eller anti-gp39-behandlede hu-PBL-sc/J-mus ble dyrket med TT eller kun medium, og den proliferative respons ble bedømt ifølge <3>H-thymidin-innlemmelsen etter 6 dager. Tabell 5 oppsummerer resultatene av et slikt eksperiment. Hu-PBL-sc/Vi-mus som var blitt behandlet med anti-gp39, viste en lignende respons på in v/fro-stimulering med TT som hu-PBL-sr/d-mus som ikke var blitt behandlet (5/10 vs. 3/10 mus med respons). Eksperimenter som benyttet seg av NOD/LtSz- scid/ scid- mus som mottakere, gav lignende resultater, selv om anti-TT-antistoffer ikke kunne påvises i disse mus (data ikke vist). Denne data demonstrerer at en behandling med anti-gp39 ikke fører til noen utarming eller funksjonell inaktivering av antigenspesifikke T-celler i hu-PBL-sc/J-mus, og støtter teorien om at inhiberingen av TT-spesifikke antistoffresponser med anti-gp39 skyldes en blokkering av gp39/CD40-vekselspillet og de etterfølgende B-celleresponser, og ikke en inaktivering av T-cellene.

Tabell 5. Anti-gp39-behandling endrer ikke anti-tetanus-T-celle-proliferasjonsresponsen etter poding av humant PBL i C. B- 17- scid/ scid- mus eller NOD/LtSz-sc/dftc/rf-mus som er immunisert med tetanustoksin.

<*> Fire til seks uker gamle C.B-17' scid/ scid- mus eller NOD/ LtSz- scid/ scid- mas fikk injisert i.p. 20 x IO<6> humant PBL og 0,25 ml tetanustoksin.

J Anti-gp39 24-31 eller PBS (250 ^g/injeksjon) ble administrert i.p. to ganger i uken under hele

eksperimentets varighet.

Miltceller fra mus som fikk injisert humant PBL og var blitt immunisert med tetanustoksin, ble dyrket i konsentrasjonen 1 x IO<5> celler/ml i nærvær av kun medium eller av tetanustoksin (2,5 eller 5,0 ug/ml). Proliferasjonen ble bedømt ifølge <3>H-thymidin-innlemmelsen etter 6 dager. Stimulasjonsindikasjonene ble beregnet i henhold til den følgende formel: S.I. = cpm tetanus - cpm medium/cpm medium. S.I.-verdier over 2,0 ble ansett å være positive.

EKSEMPEL 5

Generering av en gp39-CHO-transfektant-cellelinje.

Nylig ble en CHO-transfektant som konstitutivt uttrykker celleoverflate-gp39, generert for bruk som reagens for bindingsstudiene for humanisert anti-gp39 24-31 som beskrives i foreliggende beskrivelse. Hellengdes gp39-gen (Hollenbaugh et al., Immunol. Rev., 138: 23 (1994)) ble amplifisert ved polymerasekjedereaksjon (PCR) av fytohema-gglutinin-aktivert humant PBL og klonet inn i IDECs INPEP4-vektor under trans-kripsjonen kontroll av cytomegalovirus' (CMV's) promoter- og forsterkerelementer. En CHO-transfektant ble opprettet og amplifisert i 50 nM metotreksat. Transfektanten, som benevnes 50D4, viste seg å uttrykke celleoverflate-gp39 ifølge ELISA (data ikke vist) og FACS-analyse (figur 3). Transfektanten benevnes også mgp39-CHO (membranbun-det gp39-transfiserte CHO-celler).

EKSEMPEL 6

Høynivå-ekspresjon av antistoffer ved bruk av et CHO-ekspresjonssystem.

IDECs patentbeskyttede N5KG1-ekspresjonsvektor brukes i CHO-celler for ekspresjon av humanisert anti-gp39-antistoffet 24-31. Denne vektor er avbildet skjematisk på figur 1. Et høyt nivå av ekspresjon av rekombinante antistoffer oppnås konsekvent i CHO-celler ved bruk av denne vektor og lignende vektorer. Ved bruk av disse vektorer viser seg en høy prosentandel av G418-resistente kloner, nemlig 5-10%, å uttrykke betydelige mengder av rekombinante proteiner (1-10 mg/l antistoff). Disse er vanligvis enkeltpla-smidkopi-integranter, og kan lett amplifiseres ved bruk av metotreksat, for å gi 30-100 pg/celle/dag utsondret immunoglobulin. I tabell 6 er antistoffnivåene som ble oppnådd før og etter genampliifkasjonen, oppført for 3 antistoffer som ble uttrykt i CHO-celler ved bruk av dette system.

Tabell 6. Antistoffproduksjonsnivåer ved brukav IDECs CHO-ekspresjons-teknologi.

EKSEMPEL 7

Kloninfi av 24- 31- Vy- or VH- DNA- sekvenser.

Vk- og VH-gensegmentene av anti-gp39-antistoffet 24-31 ble klonet og sekvensbestemt. Etter analyse av deres sekvens, utviklet man humaniserte versjoner av V-områdets gensegmenter. De tilsvarende DNA-sekvenser ble syntetisert og klonet inn i en høynivå-ekspresjonsvektor som inneholdt humane konstant parti-gener. En CHO-transfektant som fremstilte det humaniserte 24-31-antistoff, ble deretter opprettet. For å bestemme at den humaniserte versjon av anti-gp39-antistoffet beholdt sin gp39-bindingsaffinitet, sammenlignet man den relative affinitet av de murine og de humaniserte antistoffer i direkte bindings- og konkurranseassayer. I tillegg bedømte man evnen av de humaniserte 24-31 til å blokkere CD40-bindingen til gp39 og å inhibere den T-celleavhengige antistoffproduksj on.

1. Kloning av Vk- og VH-gensegmentene av 24-31

a. Fremstilling av cDNA. PolyA<+->mRNA ble fremstilt fra 2 x IO<6> celler hver av 24-31-hybridomaen og NS 1-cellelinjen (Carroll et al., Mol. Immunol, 10: 991 (1988)), som er fusjonspartneren som ble brukt ved generering av 24-31-hybridomaen, ved bruk av et "MicroFast Track"-mRNA-isolasjonssett fra Invitrogen Corporation, ifølge produsentens protokoll. Første kjede-cDNA ble syntetisert ved bruk av 50 pmol oligo-dT og 5 enheter M-MLV-revers transkriptase (Promega) (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), etterfulgt av kromatografi på Sephadex G-25.

b. PCR-amplifikasj on av Vk- og VH-cDNA. 24-31 - og NS 1 -cDNA ble amplifisert ved PCR ved bruk av 5'-primere som var spesifikke for Vk- eller VH-ledersekvensene, i kombinasjon med 3'-konstant parti-primere. Gruppen av 5'VH-primere er identisk med hva som beskrives av Jones og Bendig ( Bio/ Technol., 9: 88 (1991); Errata, Bio/ Technol., 9: 579 (1991)). Gruppen av 5'Vk-primere (Jones et al. ( Idem)) ble modifisert for å omdanne Sal I-kloningsstillingsgjenkjenningssekvensene (GTCGAC) til Bgl Il-gjenkjenningssekvenser (AGATCT) for å forenkle kloningen av de amplifiserte gensegmenter inn i IDE<C>s N5KG1-ekspresjonsvektor (jfr. figur 1). 3'-Vk- og VH-primere inneholder en Bsi WI-kloningsstillingssekvens ved aminosyreposisjonene 108-109 (nummerering ifølge Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunologicallnterest", 5. utg., NIH (1991)) hhv. en Nhe I-kloningsstillingssekvens ved stillingene 114-115, og har de følgende sekvenser:

GGGGGTGTCGTGCTAGCTG(A/C)(G/A)GAGAC(G/A)GTGA (Cyl). Denne

primersamling er tidligere blitt brukt av foreliggende søker for å amplifisere og klone C2B8-anti-CD20-antistoffet (Nishioka et al., J. Immunol, 153: 1027 (1994)) og tallrike andre Vk- og VH-gensegmenter fra mus (data ikke vist).

For å fastslå det riktige primerpar for amplifikasjon av 24-31-Vk- og VH-gensegmentene, ble 24-31-cDNA amplifisert i 23 adskilte reaksjonsblandinger som inneholdt én av de 11 5'Vk-primere i kombinasjon med CK-primeren eller én av de 12 5'VH-primere i kombinasjon med Cyl-primeren. For sammenligning ble NSl-cDNA amplifisert ved bruk av samme primergruppe. 1 ul cDNA (1/50 av cDNA-prøven) ble amplifisert i et 100 ul endelig volum som inneholdt 5 enheter Ta^-DNA-polymerase (Perkin Eimer), 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,25 mM hver av dCTP, dGTP, dATP og TTP, 50 pmol 3'-konstant parti-primer og 50 pmol 5'-primer. Amplifikasjons-syklusen omfattet denaturering i 1 minutt ved 95°C, sammenkobling i 2 minutter ved 50°C og forlengelse i 2 minutter ved 72°C, gjentatt 34 ganger. De amplifiserte produkter ble analysert ved agarosegel-elektroforese. 24-31-PCR-reaksjonene som gav et ensartet amplifisert produkt for Vk og for Vh, ble gjentatt, og produktene fra dobbelte PCR-reaksjoner ble klonet. PCR-amplifiserte produkter ble renset med agarosegel (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. utg. (1989)) og spaltet med Bgl II og Bsi WI (for Vk) eller med Sal I og Nhe I (for Vh). Produktene ble ligert (Ausabel et al., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, Green Publ. Assoc.

(1992)) sekvensielt inn i IDECs vektor N5KG1.

Etter transformasjonen avis. co//-XLl-blue-celler (Stratagene), fremstilte man plasmid-DNA, og Vk- og VH-sekvensene ble erholdt fra de doble konstruksjoner (sekvensiering ble utført av Scripps Research Institute Core Facility, La Jolla, CA, USA). Sekvensene av de endogene lette og tunge kjeder av NSl-fusjonspartneren er kjent (Carroll et al., Mol. Immunol, 10: 991 (1988); Kabat et al. (1991) ( Idem)), og ble brukt for å skille mellom PCR-produkter som dannedes ved amplifikasjon av 24-31-partiet, og produkter som dannedes ved amplifikasjon av NSl-fusjonspartnerens V-partier.

EKSEMPEL 8

Syntese av gensegmenter som koder for humaniserte 24-31-V-partier.

Humaniserte versjoner som inneholdt de mest foretrukne humaniserte 24-31-Vk- og Vh-segmenter som identifiseres i tabellene 1 og 2 med benevnelsen Vl og Vh (1), ble syntetisert. Nærmere bestemt ble fire par overlappende, komplementære oligonukleotider (oligoer) som koder for de ovennevnte humanserte Vk- eller VH-partier, syntetisert

(Midland Chemicals) og renset ved denaturerende polyakrylamidgel-elektroforese (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, vol. 2, GreenePubl. Assoc.

(1992)). Hver oligo er ca. 100 baser lang, og overlapper med 20 baser det angrensende komplementære oligonukleotid. Vk- og VH-5-oligoene inneholder BglII- og SalI-kloningsstillinger, og 3'-oligoene oppviser Bsi WI- hhv. Nhe I-kloningsstillinger. Hvert variabelt parti-gensegment ble satt sammen utifrå de syntetiske oligoer som er skjema-tisert i det følgende, ved bruk av den følgende prosess (oppsummeres i Watson et al., Recombinant DNA, 2. utg., Scientif. Amer. Books, NY, NY (1992)). Komplementære oligo-par (A+E, B+F, C+G, D+F) ble kinasebehandlet ved bruk av 300 pmol av hver primer og T4-polynukleotidkinase (Promega) ifølge produsentens protokoll. Oligoene ble sammenkoblet ved oppvarming til 95°C og langsom avkjøling til romtemperatur. De sammenkoblede oligopar ble ligert (A/E med B/F og C/G med D/H) ved bruk av 6 enheter T4-DNA-ligase (New England Biolabs). Etter spaltning med det egnede 5'- eller 3-kloningsstillings-restriksjonsendonuklease, ble de ca. 200basepar langeDNA-fragmenter renset ved elektroeluering etter polyakrylamidgel-elektroforese (Sambrook et al., ( Idem)). De syntetiske genfragmenter ble deretter innføyd i IDECs patentbeskyttede høynivå-ekspresjonvektor N5KG1, under den transkripsjonelle regulering av CMV-promoter- og forsterkerelementer. Ligeringsreaksjonen inneholder de to gelrensede fragmenter (A/E/B/F og C/G/D/H) og N5KG1 i det molare forhold 100:100:1. Etter transformasjon av XLl-blue-celler, fremstilte man plasmid-DNA, og sekvensene av de syntetiske gensegmenter ble bekreftet. Den erholdte konstruksjon, h24-31, koder for de humaniserte 24-31-V-partisegmenter og humane kappa- og gamma 1-konstante partier. Som sagt, inneholder dette antistoff de humaniserte variable tunge og humaniserte variable lette sekvenser som identifiseres i tabell 1 og tabell 2 i form av "(l)"-sekvensene, og benevnes versjon 1 eller H24-31.1, som forventes å føre til et humanisert antistoff med optimale gp39-egenskaper. I tillegg genererte man en konstruksjon som inneholder Vl nr. 2 i kombinasjon med Vh nr. 1 (versjon 2 av humanisert 24-31, eller H24-31.2). Lignende konstruksjoner som benytter seg av IDECs patentbeskyttede vektorer, er blitt brukt for høynivå-ekspresjon av IDECs anti-CD20-antistoffer (Reff et al., Blood, 83: 425 (1994)) og anti-CD4-antistoffer (Newman et al., Biol. Technology, 10: 1455 (1992)).

EKSEMPEL 9

2. Produksjon og karakterisering av humanisert 24-31

a. Generering av CHO-transfektanter som produserer humanisert 24-31

(versjon 1 og versjon 2)

CHO-transfektanter som uttrykte humanisert 24-31 (versjon 1 eller versjon 2), ble generert ved elektroporering av 4 x IO6 CHO-celler med linearisert h24-31-DNA (versjon 1 eller versjon 2) etterfulgt av utvalg i G418. Cellekultursupernatantene fra G418-resistente kloner ble testet for sin immunoglobulinproduksjon ifølge skiktvis ELISA ved bruk av et anti-humant kappa-antistoff fra get for å fange opp immuno-globulinet. Immunoglobulinbindingen ble målt ved inkubasjon med et pepperrotper-oksidase-konjugert (HRP) geiteantistoff som var spesifikt for humant IgG, etterfulgt av HRP-substrat, 0,4 mg/ml O-fenylendiamin (OPD) i en citratbuffer (9-34 g/l C6H807 og 14,2 g/l Na2HP04), pH 5,0, med 0,0175% H202. Platen ble avlest i et "Vmax, kinetic microplate reader"-spektrofotometer fra Molecular DeviCes ved 490 nm.

EKSEMPEL 10

Blokkering av CD40-Ig-bindingen til gp39 med humanisert 24-31.

Etter å ha fastslått at humanisert anti-gp39 bindes til gp39, utføres et assay for å bekrefte at det humaniserte anti-gp39 beholder sin evne til å blokkere bindingen av liganden til sin reseptor. Med denne hensikt forbehandles aktiverte humane perifere blod-T-celler, eller de gp39-transfiserte CHO-celler, 50D4, med trinnvis stigende konsentrasjoner av murint 24-31 eller med humanisert versjon 1- og versjon 2-24-31 i 15 minutter ved 4°C. Etter denne forinkubasjon, tilsettes CD40-Ig-biotin, og bindingen bestemmes ved strømningscytometri ved bruk av PE-avidin. Figur 26 illustrerer at versjon 1 nedsatte bindingen av CD40-Ig med 50% ved 4 ug/ml, murint 24-31 reduserte bindingen med 50% ved ca. 12 \ ig/ ml, og versjon 2 reduserte bindingen med 50% ved 20 ug/ml eller mer.

EKSEMPEL 11

Blokkering av B-cellers proliferasjon og differensiering med 24-31.

For å bekrefte at murint 24-31 blokkerer gp39-funksjonen, dyrkes B-celler med et oppløselig fusjonsprotein av gp39 (gp39-CD8) i nærvær eller fravær av en rekke doser av murint 24-31 eller humanisert 24-31. B-cellenes proliferative respons bedømmes ved <3>H-thymidininnlemmelse som vist på figur 2A.

Den T-celleavhengige B-celledifferensiering (Ig-produksjon) blokkeres av mAb'er mot gp39. For å bekrefte at murine 24-31-antistoffer virksomt blokkerer funksjonen av nativt gp39 som uttrykkes på flaten av aktiverte humane T-celler, bedømmes evnen av de humaniserte 24-31-antistoffer ifølge oppfinnelsen til å inhibere T-celleindusert B-celledifferensiering. B-celler dyrkes sammen med anti-CD3-aktiverte T-celler i nærvær eller fravær av humanisert 24-31 og murint 24-31. Produksjonen av polyklonalt IgM, IgG og IgA bedømmes etter 12 dager (jfr. figur 2B). Disse resultater bekrefter at anti-gp39-antistoffet 24-31 kan blokkere CD40-bindingen og forstyrre den T-celleavhengige B-cellaktivering via CD40.

EKSEMPEL 12

Bindingsevne

Dette eksperiment ble utført for å bestemme reaktiviteten av de murine, kimære og humaniserte (versjon 1) 24-31-antistoffer til gp39-antigenet i forhold til konsentrasjonen av antistoffet.

Protokoll:

Platepreparerinfi

1. Tilsett 50 poly-l-lysin til hver brønn på 96-brønners platen. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Gi platene et lett slag for å fjerne poly-l-lysinet. 2. Vask mgp39-CHO-celler (ovarieceller fra kinesisk hamster som uttrykker celleoverflate-, membran-gp39 som beskrevet i eksempel 5) 3 ganger med HBSS ved sentrifugering ved 1500 rpm i 5 minutter. Gjensuspender cellene i HBSS til

2 x IO6 celler/ml.

3. Tilsett 50 ul cellesuspensjon til hver brønn, og sentrifuger platene med 2000 rpm i 5 minutter. 4. Tilsett 50 ul/brønn iskaldt 0,5% glutaraldehyd, og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. 5. Gi platene et lett slag, og behandle med trekkpapir for å fjerne overflødig glutaraldehyd. Tilsett 150 ul/brønn 100 mM glycin med 0,1% BSA, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Platene kan brukes umiddelbart eller fryses ved

-20°C for fremtidig bruk.

Bindingsassav

1. Tin platen og fjern glycinbufferen.

2. Fortynn serielt 1:2 testantistoffene i fortynningsbuffer, startende med 1 ug/ml. Overfør 50 ug/brønn av hver fortynning i to eksemplarer. Inkuber i 2 timer ved

romtemperatur.

3. Vask platen 10 ganger i strømmende springvann.

4. Tilsett 50 ul/brønn av en 1:2000-fortynning av geite-anti-humant IgG-HRP eller geite-anti-murint IgG-HRP. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.

5. Vask platen 10 ganger i strømmende springvann.

6. Tilsett 50 ul/brønn ABTS-substrat og fremkall platen i 20-30 minutter. Avles platen ved bølgelengden 405 nm med en bakgrunns-bølgelengde på 490 nm.

7. Lag en plot-kurve over absorbansen vs. antistoffkonsentrasjonen.

Resultater or konklusjoner:

Bindingsevnen for de tre anti-gp39-antistoffer (murint, kimært og humanisert versjon 1 av 24-31) i forhold til konsentrasjonen av antistoffene, var nærmest identisk (jfr. figur 9). Dette er et godt tegn på at disse antistoffer har lignende bindingsevner for humant gp39, hvilket tyder på at det humaniserte antistoff har beholdt gp39-bindingsaffiniteten av det murine 24-31.

EKSEMPEL 13

Konkurranse mellom biotinmerket murint 24-31 og kimært og humanisert versjon 1 av 24-31.

For å bestemme likheten av bindingen mellom 24-31 og dets kimære og humaniserte versjoner, utførte man en undersøkelse som siktet på å måle evnen av disse derivater til å konkurrere med det opprinnelige murine antistoff om binding til gp39. Utifrå tidligere undersøkelser var det kjent at en 2/3 bindingsmetning ble oppnådd ved ca. 200 ng/ml 24-31. Denne mengde ble brukt i konkurranseassayene. H24-31 ble biotinylert for at kun den direkte binding av 24-31 ville måles, og at konkurransen ville måles i form av en nedsatt binding av 24-31. Forskjellige konsentrasjoner av de kimære og humaniserte 24-31-versjoner ble blandet med biotinylert murint 24-31 i en endelig konsentrasjon på 200 ng/ml og fordelt i brønnene av en ELISA-plate som var bestrøket med gp39<+->CHO-celler som var blitt festet til platen med glutaraldehyd. Mengden 24-31-binding ble målt ved bruk av avidin-HRP som skal beskrives i det følgende.

Protokoll:

Platepreparerinfi

1. Tilsett 50 poly-l-lysin til hver brønn på 96-brønners platen. Inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Gi platene et lett slag for å fjerne poly-l-lysinet. 2. Vask mgp39-CHO-cellene 3 ganger med HBSS ved sentrifugering med 1500 rpm i 5 minutter. Gjensuspender cellene i HBSS til 2 x IO<6> celler/ml. 3. Tilsett 50 ul cellesuspensjon til hver brønn, og sentrifuger platene ved 2000 rpm i 5 minutter. 4. Tilsett 50 ul/brønn iskaldt 0,5% glutaraldehyd, og inkuber i 15 minutter ved romtemperatur. 5. Gi platen et lett slag, og behandle med trekkpapir for å fjerne overflødig glutaraldehyd. Tilsett 150 ul/brønn 100 mM glycin med 0,1% BSA, og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur. Platene kan brukes umiddelbart eller fryses ved

-20°C for fremtidig bruk.

Konkurranseassay

1. Tin platen og fjern glycinbufferen.

2. Fortynn murint anti-gp39-biotin til 200 ng/ml i PBS med 1% BSA.

3. Fortynn testantistoffene (murint, kimært og humanisert 24-31) serielt 1:2, startende ved 10 ug/ml, i fortynningsbuffer. 4. Overfør 50 ul fortynnede antistoffer og muse-anti-gp39-biotin til hver brønn i dobbelt utføring. Flere brønner bør inneholde 50 ul fortynningsbuffer med muse-anti-gp39-biotinet som en maksimalkontrollgruppe. Inkuber i 2 timer ved

romtemperatur.

5. Vask platene 10 ganger i strømmende springvann.

6. Tilsett 50 ul/brønn l:2000-fortynning av streptavidin-HRP, og inkuber i 1 time ved romtemperatur.

7. Vask platene 10 ganger i strømmende springvann.

8. Tilsett 50 ul/brønn ABTS-substrat, og fremkall platen i 20-30 minutter. Avles platen ved bølgelengden 405 nm med en bakgrunns-bølgelengde på 490 nm. 9. Prosentandelen inhibering beregnes ved bruk av gjennomsnittet for kontrollbrønnene.

Resultater or konklusjoner:

Alle tre antistoffer konkurrerte like godt mot det biotinmerkede 24-31 (jfr. figur 10). Konkurranseprofilene er nærmest like ved alle konsentrasjoner, innen begrensningene for assayet. Dette viser at det testede humaniserte antistoff (versjon 1) beholder sin gp3 9-bindingsaffinitet.

EKSEMPEL 14

Modulasjon av den T-celleavhengige B-celledifferensiering.

For å bekrefte at det humaniserte 24-31 beholder den funksjonelle in vtfro-aktivitet av det murine 24-31, sammenlignet man det humaniserte 24-31 med det murine 24-31 i et "Lipsky"-assay. Perifere blod-mononukleære celler fra donorer ble delt opp i to fraksjoner, nemlig en T-cellefraksjon og en B-cellefraksjon. T-cellene ble først behandlet med mitomycin C for å forebygge mitose, og deretter aktivert med et anti-CD3-antistoff. B-cellene ble tilsatt, sammen med enten de murine eller humaniserte (versjon 1) 24-31-antistoffer. En positivkontroll uten antistoff og en negativkontroll uten B-celler ble tatt med i eksperimentet. Etter 10 dagers inkubasjon, testet man supernatantene for å påvise humant IgM.

Protokoll:

1. Bestryk en 96-brønners plate med 50 ul/brønn sterilt 4 ug/ml anti-CD3-antistoff (fortynnet i 50 mM Tris, pH 9) i 2 timer ved 37°C. 2. Isoler selektivt T- og B-celler fra en "buffy coat" ved bruk av "Lympho-Kwik"-reagenser. Aktiver T-cellene med 50 ug/ml mitomycin C pr. 5 x IO6 celler i 30

minutter ved 37°C.

3. Vask platebrønnene flere ganger med sterilt HBSS eller medium for å fjerne ikke-klebende antistoffer.

4. Tilsett 1 x 10<5> isolerte T-celler (2 x loVml) til hver brønn.

5. Tilsett 5 x 10<5> isolerte B-celler (5 x loVml) til hver brønn. Tilsett 50 ul anti-gp39-antistoff (10-0,1 ug/ml) til hver brønn i fire eksemplarer. Kontrollbrønner bør inneholde: a) 0 antistoff; b) 0 antistoff, ingen T-celler, og c) 0 antistoff,

ingen B-celler.

6. Inkuber platen ved 37°C/5% C02 i 12 dager.

7. Bedøm celleveksten etter 7 dager ved bruk av <3>H-thymidin eller hvilken som helst annen akseptabel metode, på to brønner hver. 8. Etter 12 dager, samle supernatantene fra to brønner hver, og utfør ELISA-assayer for å bestemme Ig-produksjonen (IgM).

Resultater or konklusjoner:

Resultatene viser at produksjonen av humant IgM inhiberes med 50% av humanisert 24-31 ved en konsentrasjon under 0,01 ug/ml, hvilket ligner inhiberingsnivået som oppnås med det murine 24-31 (jfr. figur 11). Det humaniserte antistoff beholdt sin evne til å inhibere den T-celleavhengige B-celledifferensiering (IgM-produksjon) i dette eksperiment.

EKSEMPEL 15

Bedømmelse av humanisert 24-31, versjon 2.

Dette eksperiment ble utført for å bestemme om humanisert 24-31, versjon 2, har en lignende gp39-bindingskapasitet som versjon 1 i et direkte bindingsassay.

Protokoll:

Samme som i eksempel 13 ovenfor.

Resultater or konklusjoner:

Resultatene viser at bindingskapasiteten av de to 24-31-versjoner er tilnærmet like (jfr. figur 12). Dette tyder på at de to versjoner har en sammenlignbar bindingsaktivitet til gp39.

EKSEMPEL 16

Dette eksperiment ble utført for å måle Kd-verdien for 24-31 og for to humaniserte versjoner, nemlig 1 og 2.

Protokoll:

En forutbestemt mengde av hvert av de tre antistoffer (murint, versjon 1 eller versjon 2 av 24-31) ble merket med 12<5>I ved bruk av "IODO-BEADS" (Pierce). Antistoffbundet <125>I ble adskilt fra det frie 125I ved størrelsesseparasjon på en Sephadex G25/DEAE/Amberlite-kolonne.

Den direkte binding av det <125>I-merkede antistoff til murine gp39-CHO-celler ble testet i serielle fortynninger, for å bestemme både antallet/^.g og den egnede arbeidskonsentra-sjon (ca. den halvmaksimale bindingskonsentrasjon).

<125>I-merket antistoff ble blandet og inkubert med ikke-merket antistoff i en fortynnings-serie. På grunnlag av den samlede mengde bundet antistoff og mengden fritt antistoff, genererte man en Scatchard-plot utifrå en bundet-vs.-ubundet-kurve. Den samlede anti-stoffkonsentrasjon baserte seg på en standardstørrelse på 75 kDa for én aktiv stilling.

Kd-verdien ble beregnet ved å generere en "beste tilpasnings"-kurve. Inversen av stigningen av kurven er Kd-verdien. Korrelasjonskoeffisienten r2 ble også beregnet.

Resultater:

Scatchard-plottene ble analysert. Kd-verdiene fra denne analyse er: versjon 2: Kd = 14 nM; murint 24-31: Kd = 8,51 nM; versjon 1: Kd = 5,6. Resultatene er avbildet på figur 13 (murint), 14 (versjon 1) hhv. 15 (versjon 2). Disse resultater gir ytterligere tegn på at de humaniserte antistoffer ifølge oppfinnelsen binder gp39-antigenet på lignende måte som 24-31.

EKSEMPEL 17

FcRI-bindingen av H24-31.1.

FcRI-binding ble utført på en CHO-cellelinje som var blitt transfisert med genet som koder for humant FcRI (figur 16). Bindingen til Fc-reseptor av H24-31.1 ble testet med eller uten oppløselig gp39 i form av et fusjonsprotein som bestod av det ekstracellulære parti av CD8 bundet til det ekstracellulære parti av humant gp39. Figur 16 illustrerer at H24-31.1 kun bindes til FCRI når det foreligger i et kompleks med antigen.

EKSEMPEL 18

FcRH-binding av H24-31.1.

FcRTJ-bindingen ble utført ved bruk av en murin fibroblast-cellelinje som var blitt transfisert med genet som koder for humant FcRII (figur 17). Bindingen til Fc-reseptor av H24-31.1 ble testet med eller uten oppløselig gp3 9 i form av et fusjonsprotein som bestod av det ekstracellulære parti av CD8 bundet til det ekstracellulære parti av gp39. Figur 17 illustrerer at H24-31.1 kun binder Fc-reseptor 11 når det foreligger i et kompleks med antigen.

EKSEMPEL 19

Virkningen av H24-31.1 i komplementavhengig cellulær cytotoksisitet.

H24-31.1 ble tilsatt i forskjellige konsentrasjoner til gp39+CHO-celler i nærvær av 5% kaninkomplement (figur 18). Veksten av CHO-cellene ble overvåket med "alamar blue". Figur 18 viser at H24-31.1 inhiberer 50% av celleveksten ved ca. 0,5 n.g/ml.

EKSEMPEL 20

Bestemmelse av Clq-bindingen av gp39+CHO-bundet H24-31.1.

gp39+CHO-celler som var merket med forskjellige konsentrasjoner av H24-31.1, ble inkubert i et overskudd av humant Clq (komplementfaktor 1) og deretter inkubert med FITC-merket geite-anti-humant Clq. Prøvene ble analysert ved strømningscytometri for å bestemme den relative merking av cellene med Clq (figur 19). Figur 19 illustrerer at merkingen av cellene med Clq var avhengig av antistoffkonsentrasjonen, og at et H24-31.1-Fab-fragment (ingen Clq-binding) ikke binder Clq.

EKSEMPEL 21

Virkning avH24-31.1 på T-celleresponsene på et T-celleavhengig hukommelsesantigen.

Humane perifere blodlymfocytter ble dyrket i Iscoves modifiserte Dulbecco-medium som inneholdt 10% humant AB-serum, L-glutamin, natriumpyruviat og ikke-essensielle aminosyrer (figur 20). Alle kulturer unntatt én fikk også 10 ug/ml tetanustoksin. Kulturene som var primet med tetanustoksin, fikk også mellom 0 og 10 [ Lg/ ml H24-31.1. Etter 3 dager ble supernatanten fjernet for å bestemme IL-2-innholdet. Etter ytterligere 2 dager fikk alle kulturer 1 uCi <3>H-thymidin/ml i 16 timer. Cellene ble samlet og testet for å bestemme thymidininnlemmelsen i kromosomalt DNA som et mål for veksten. Kulturer uten tetanustoksin hadde EL-2-nivåer under påvisningsgrensen, nemlig ca. 2 ng/ml. Disse samme kulturer hadde bakgrunnsnivåer av innlemmet <3>H-thymidin på ca. 300 cpm, og var tilsynelatende upåvirket av behandlingen med H24-31.1 (ikke vist). Figur 20 viser at den TT-induserte vekst og IL-2-produksjon ble inhibert maksimalt, nemlig med ca. 40%, av > 1 u^/ml H24-31.1.

EKSEMPEL 22

Virkning avH24-31.1 på den T-celleavhengige B-celledifferensiering.

En 96-brønners plate ble bestrøket med anti-CD3-antistoff i konsentrasjonen 2 ug/ml over natten, og ble vasket grundig med PBS før bruk. Perifere blodlymfocytter fra en "buffy coat" ble delt opp i en T-cellefraksjon og en B-cellefraksjon. T-cellene ble inkubert med mitomycin C i 1 time før de ble plassert i brønnene av 96-brønners platen. B-cellene ble deretter tilsatt i Iscoves modifiserte Dulbecco-medium som var blitt tilsatt 10% føtalt kalveserum, L-glutamin, natriumpyruviat og ikke-essensielle aminosyrer. Cellene ble inkubert i nærvær avH24-31.1 i forskjellige konsentrasjoner fra 0-10 \ ig/ ml. Etter 12 dager ble supernatantene fjernet og testet for å påvise nærværet av humant IgG (figur 21). Figuren illustrerer at humanisert H24-31.1 inhiberer den T-celleavhengige IgG-produksjon med ca. 85% i konsentrasjonen 1 ng/ml.

EKSEMPEL 23

Virkning avH24-31.1-Fab på den T-celleavhengige B-celledifferensiering.

En 96-brønners plate ble bestrøket med anti-CD3-antistoff i konsentrasjonen 2 ug/ml over natten, og ble grundig vasket med PBS før bruk. Perifere blodlymfocytter fra en "buffy coat" ble delt opp i en T-cellefraksjon og en B-cellefraksjon. T-cellene ble inkubert med mitomycin C i 1 time før de ble plassert i brønnene av 96-brønners platen. B-cellene ble deretter tilsatt i Iscoves modifiserte Dulbecco-medium som var blitt tilsatt 10% føtalt kalveserum, L-glutamin, natriumpyruviat og ikke-essensielle aminosyrer. Cellene ble inkubert i nærvær avH24-31.1 og H24-31.1-Fab i forskjellige konsentrasjoner fra 0-10 ug/ml. Etter 12 dager ble supernatantene fjernet og testet for å påvise nærværet av humant IgG (figur 22). Figuren viser at det ikke var noen forskjell på inhiberingen av IgG-produksjonen mellom helt H24-31.1-antistoff og Fab-fragmentet.

EKSEMPEL 24

Virkning av H24-31.1 på genereringen av antigenspesifikke B-celleresponser på et T-celleavhengig hukommelsesantigen.

Humane miltceller som var blitt primet med tetanustoksin i 3 dager in vitro, ble overført til SCID-mus i en konsentrasjon på ca. 1 x IO<7> celler/SCID. Etter 6 dager fikk de erholdte hu-SPL-SCID-mus injisert PBS (gruppe 1) eller 300 \ ig H24-31.1 (gruppene 1 og 2). Den følgende dag fikk alle Hu-SPL-SCID-mus boosterbehandlinger med tetanustoksin. Musene i gruppe 3 fikk dessuten 2 injeksjoner av 300 ug H24-31.1 hver med 3 dagers intervaller. Man tok blodprøver av musene ved forskjellige tidspunkter, og høyden av titrene av humant IgG-anti-tetanustoksin ble bestemt ifølge ELISA (figur 23). Figur 23 viser at en injeksjon av H24-31.1 inhiberte genereringen av tetanustoksin-spesifikke responser med ca. 90%.

EKSEMPEL 25

Virkning av H24-31.1 -antistoff på human B-celleproliferasjon.

Formålet for disse eksperimenter var å demonstrere inhiberingen av oppløselig gp39-CD8-induksjon av proliferasjonen av B-celler med H24-31.1-antistoffet.

Lymfocyttpreparater fra "buffy coats" ble anriket for B-celler (>90%) med "Lympho-Kwik"-reagens ifølge en protokoll som anbefales av produsenten (katalog-nr. LK-25-B, LK-50-B, One Lambda, Inc., CA 91303, USA). Anrikede humane B-celler som var blitt dyrket med 1000 U/ml IL4 (Genzyme, Corp.) med 1 x 10<5> celler pr. hver av de 96 brønner, ble inkubert med forskjellige konsentrasjoner av H24-31.1-antistoff plus 10 Hg/ml gp39-CD8 i 4 dager. Under de siste 16 timene av inkubasjonen ble kulturene pulsbehandlet med 1 ^.Ci/brønn <3>H-thymidin, og innlemmelsen av radioaktivitet i de prolifererende celler ble målt. Figur 24 viser B-celleproliferasjonen av gp39-CD8 på doseavhengig måte. Figur 25 demonstrerer at H24-31.1 inhiberer den gp39-CD8-avhengige B-celleproliferasjon.

Bruk

De humaniserte anti-gp39-antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse har et potensiale

ved behandling av hvilken som helst sykdomstilstand hvor det er terapeutisk fordelaktig med en modulasjon av gp39 og/eller inhibering av gp39/CD40-vekselspillet. Videre kan de humaniserte anti-gp39-antistoffer ifølge oppfinnelsen brukes ved behandling av sykdommer hvor det er ønskelig med en suppresjon av antistoffresponsene på antigener. Slike tilstander omfatter både autoimmune og ikke-autoimmune forstyrrelser.

Evnen av anti-gp39-antistoffene til å forebygge en CD40-signalering i B-celler, overfø-res funksjonelt til en markert inhibering av T-celleavhengige antistoffresponser in vivo. Derfor forventes det at autoimmune sykdommer som medieres av en autoantistoff-produksjon, vil kunne lindres med en anti-gp39-antistoffterapi. Slike sykdommer omfatter systemisk lupus erythematose, idiopatisk trombocytopenisk purpura, myasthenia gravis og en undergruppe av diabetiske pasienter med anti-insulin og anti-insulinreseptor-antistoffer. I tillegg er CD40-signalering i B-celler og dendrittceller nødvendig for en opp-regulering av kosignaleringsreseptorer, såsom B7.1- og B7.2-molekyler. En blokkering av denne CD40-signalering med anti-gp39-antistoffer forstyrrer antigenpresentasjonen til T-celler og fører til en inhibering av T-celleaktiveringen og de T-cellemedierte responser. Den terapeutiske effekt av anti-gp39-antistoffer i sykdomsmodeller såsom CIA, EAE, NOD-mus, GVHD og transplantatutstøtning, bekrefter ytterligere antistoffets in-hiberende virkning på de T-cellemedierte responer. På grunnlag av denne virknings-mekanisme som støttes av effekten i dyremodeller, strekker seg det terapeutiske potensiale av de humaniserte anti-gp39-antistoffer ifølge oppfinnelsen til slike sykdommer som RA, MS, diabetes, psoriasis, GVHD og transplantatutstøtning.

Bestemte forstyrrelser som potensielt kan behandles ved administrasjon av de humaniserte antistoffer ifølge oppfinnelsen, omfatter de følgende: Allergisk bronchopulmonær aspergillosis; autoimmun hemolytisk anemi; acanthosis nigricans; allergisk kontaktdermatitt; Addisons sykdom; atopisk dermatitt; alopecia areata; alopecia universalis; amyloidosis; anafylaktisk purpura; anafylaktisk reaksjon; aplastisk anemi; arvelig angioødem; idiopatisk angioødem; ankyloserende spondylitt; kranial arteritt; kjempecellearteritt; Takayasus arteritt; temporal arteritt; asthma; ataxia-teleangiektasia; autoimmun oophoritis; autoimmun orchitt; autoimmun polyendokrin-svikt; Behcets sykdom; Bergers sykdom; Buergers sykdom; bulløs pemfigus; kronisk mukokutan candidiasis; Caplans syndrom; post-myokardial infarkt-syndrom; post-perikardiotomisyndrom; karditt; cøliakisk sprue; Chagas sykdom; Chediak-Higashis syndrom; Churg-Strauss sykdom; Cogans syndrom; kuldehemagglutininsykdom; CREST-syndrom; Crohns sykdom; cryoglobulinemia; kryptogenetisk fibroserende alveolitt; dermatitis herpetiformis; dermatomyositis; diabetes mellitus; Diamond-Blackfan-syndrom; DiGeorge-syndrom; lupus erythematose discoides; eosinofil fasciitt; episkleritt; erythema elevatum diutinum; erythema marginatum; erythema multiforme; erythema nodosum; familiær middelhavsfeber; Feltys syndrom; fibrosis pulmonum; anafylaktisk glomerulonefritt; autoimmun glomerulonefritt; post-streptokokkal glomerulonefritt; post-transplantasjons glomerulonefritt; membranøs glomerulopati; Goodpastures syndrom; "graft-vs.-host-disease"; immunmediert granulocytopenia; granuloma annulare; allergisk granulomatosis; granulomatøs myositt; Graves sykdom; Hashimotos struma; hemolytisk sykdom i nyfødte; idiopatisk hemochromatosis; Henoch-Schønleins purpura; kronisk aktiv og kronisk progressiv hepatitt; histiocytosis X; hypereosinofilt syndrom; idiopatisk tromocytopenisk purpura; Jobs syndrom; juvenil dermatomyositt; juvenil rheumatoid artritt (juvenil kronisk artritt); Kawasakis sykdom; keratitt; keratoconjunctivitis sicca; Landry-Guillain-Barre-Strohls syndrom; lepra; lep-romatosa; Løfflers syndrom; Lyells syndrom; Lymes sykdom; lymfomatøs granulomatose; systemisk mastocytosis; blandet bindevevsykdom; mononeuritis multiplex; Muckle-Wells syndrom; mukokutant lymfeknutesyndrom; mukokutant lymfeknutesyndrom; multisentrisk retikulohistiocytose; multippel sklerose; myasthenia gravis; mycosis fungoides; systemisk nekrotiserende vaskulitt; nefrotisk syndrom; blandet bindevevssykdom; pannikulitt; paroksysmal kuldehemoglobinuria; paroksysmal nok-turnal hemoglobinur; pemphigoid; pemphigus; pemphigus erythematose; pemphigus foliaceus; pemphigus vulgaris; "pigeon breeder's disease"; overfølsomhetspneumonitt; polyarteritis nodosa; polymyalgia rheumatica; polymyositt; idiopatisk polyneuritt; por-tugisisk familiær polyneuropati; preeklampsia/eklampsia; primær biliær cirrhose; progressiv systemisk sklerose (skleroderma); psoriasis; psoriatisk artritt; pulmonal alveolær proteinose; pulmonal fibrose; Raynauds fenomen/syndrom; Reidels tyreoiditt; Reiters syndrom; esidiverende polychrondritis; rheumatisk feber; rheumatoid artritt; sarkoidose; skleritt; skleroserende cholangitt; serumsyken; Sézarys syndrom; Sjøgrens syndrom; Stevens-Johnsons syndrom; Stills sykdom; subakutt skleroserende panencefalitt; sympa-tetisk oftalmi; systemisk lupus erythematose; transplantatutstøtning; ulcerøs kolitt; udif-ferensiert bindevevsykdom; kronisk urticaria; kuldeurticaria; uveitis; vitiligo; Weber-Christians sykdom; Wegeners granulomatose; Wiskott-Aldrichs syndrom.

Av disse omfatter de foretrukne indikasjoner som kan behandles eller tilsiktes ved administrasjon av anti-gp39-antistoffer, autoimmun hemolytisk anemi; aplastisk anemi; temporal arteritt; diabetes mellitus; Feltys syndrom; Goodpastures syndrom; "graft-vs. - host-disease"; idiopatisk thromocytopenia purpura; myasthenia gravis; multippel sklerose, polyarteritis nodosa; psoriasis; psoriatisk artritt; rheumatoid artritt; systemisk lupus erythematose; asthma; allergiske tilstander og transplantatutstøtning.

Mengden antistoff som er nyttig for å utløse en terapeutisk virkning, kan bestemmes ifølge standardteknikker som er velkjent for fagmannen. Antistoffene vil generelt leveres ved en standardteknikk innen en farmasøytisk akseptabel buffer, og kan administreres ved hvilken som helst ønsket rute. Grunnet effekten av antistoffene ifølge oppfinnelsen som kreves beskyttet, og menneskers toleranse derav, er det mulig å administrere disse antistoffer repetitivt for å bekjempe forskjellige sykdommer eller sykdomstilstander i et menneske.

De humaniserte anti-gp39-antistoffer ifølge oppfinnelsen er også nyttige for å indusere immunomodulasjon, feks. indusering av suppresjon av et menneskes eller dyrs immunsystem.

Det faktum at antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse er nyttige ved induksjon av immunosuppresjon, betyr at de er nyttige ved behandling eller forebyggelse av resistens mot eller utstøtning av transplanterte organer eller vev (feks. nyre, hjerte, lunge, ben-marg, hud, cornea osv); behandling eller forebyggelse av autoimmune, inflammatoriske, proliferative og hyperproliferative sykdommer og av kutane manifestasjoner av immunologisk medierte sykdommer (feks. rheumatoid artritt, lupus erythematose, systemisk lupus erythematose, Hashimotos struma, multippel sklerose, EAE, myasthenia gravis, diabetes type 1, uveititt, nefrotisk syndrom, psoriasis, atopisk dermatitt, kontaktdermatitt og ytterligere eksematøse dermatitter, seboréisk dermatitt, lichen planus, pemfigus, bulløs pemfigus, epidermolysis bullosa, urticaria, angioødemer, vaskulitter, erythema, kutane eosinofiler, alopecia areata osv.); behandling av reversibel obstruktiv luftveisykdom, tarmbetennelser og allergier (feks. cøliakisk sykdom, proktitt, eosinofilia gastroenteritis, mastocytosis, Crohns sykdom og ulcerøs kolitt) og mat-forbundne allergier (feks. migrene, rhinitt og eksem). Antistoffene ifølge oppfinnelsen har også en potensiell nytte ved behandling av ikke-autoimmune tilstander hvor det er ønskelig med en immunomodulasjon, feks. "graft-vs.-host-disease" (GVHD), transplan-tatutstøtning, asthma, leukemi, HIV, lymfoma o.a.

I tillegg kan antistoffene ifølge oppfinnelsen administreres før, samtidig som eller etter administrasjonen av en vektor eller et rekombinant virus (som feks. inneholder et terapeutisk DNA) for å forebygge eller nedsette vertens (humorale) immunrespons mot vektoren.

Fagmannen vil ved rutinemessig eksperimentering kunne bestemme hva en virksom, ikke-toksisk mengde antistoff vil være for å indusere immunosuppresjon. Generelt vil imidlertid en virksom mengde ligge i området 0,05-100 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et menneske eller annet dyr ifølge de tidligere beskrevne behandlingsmetoder, og i en tilstrekkelig stor mengde for å fremkalle en slik virkning i terapeutisk eller profylaktisk grad. Slike antistoffer ifølge oppfinnelsen kan administreres til mennesket eller dyret i en konvensjonell doserings-form som fremstilles ved å kombinere antistoffet ifølge oppfinnelsen med et konven-sjonelt farmasøytisk akseptabelt bærerstoff eller tynningsmiddel ifølge kjente teknikker. Det vil forstås av en fagman at formen og egenskapene av det farmasøytisk akseptable bærerstoff eller tynningsmiddel bestemmes av mengden aktiv ingrediens som det skal kombineres med, administrasjonsruten og andre velkjente variabler.

Administrasjonsruten for antistoffet ifølge oppfinnelsen kan være oral, parenteral, ved inhalasjon eller topisk. Begrepet parenteral når det brukes her, omfatter intravenøs, intramuskulær, subkutan, rektal, vaginal eller intraperitoneal administrasjon. De subkutane og intramuskulære former for parenteral administrasjon foretrekkes generelt.

De daglige parenterale og orale doseringsmengder for å bruke forbindelsene ifølge oppfinnelsen for å profylaktisk eller terapeutisk indusere immunosuppresjon, vil generelt ligge innen området 0,05-100, fortrinnsvis 0,5-10, mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan også administreres ved inhalasjon. Med "inhalasjon" menes intranasal eller oral inhalasjonsadministrasjon. Egnende doseringsformer for en slik administrasjon, såsom en aerosolformulering eller en inhalator med oppmålt dose, kan fremstilles på vanlig måte. Den foretrukne doseringsmengde av en forbindelse ifølge oppfinnelsen som skal anvendes, ligger generelt innen området 10-100 mg.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan også administreres topisk. Med topisk administrasjon menes en ikke-systemisk administrasjon, og dette omfatter påføring av et antistoff (eller et fragment derav) ifølge oppfinnelsen eksternt på epidermis, i kinnhulen eller inndrypping av et slikt antistoff i øret, øyet eller nesen, og hvor det ikke tas opp i blodstrømmen i noen vesentlig grad. Med systemisk administrasjon menes oral, intravenøs, intraperitoneal eller intramuskulær administrasjon. Mengden av et antistoff som er nødvendig for den terapeutiske eller profylaktiske virkning, vil såklart variere ifølge det valgte antistoff, naturen og alvoret av tilstanden som skal behandles, og av dyret som skal behandles, og bestemmes i siste instans av den behandlende lege. En egnet topisk dose av et antistoff ifølge oppfinnelsen vil generelt ligge innen området fra 1-100 mg pr. kg kroppsvekt daglig.

Formuleringer

Selv om det er mulig å administrere et antistoff eller fragment derav for seg selv, foretrekkes det å presentere det i form av en farmasøytisk formulering. Den aktive ingrediens kan feks. for en topisk administrasjon utgjøre 0,001-10 vekr%, feks. 1-2% av formuleringens vekt, selv om det kan utgjøre inntil 10 vekt%, men fortrinnsvis ikke over 5 vekt%, og mer foretrukket utgjør det fra 0,1-1 vekt% av formuleringen.

De topiske formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en aktiv ingrediens sammen med et eller flere akseptable bærerstoffer og valgfritt også én eller flere andre terapeutiske ingredienser. Bærerstoffet eller bærerstoffene må være "akseptable" i den forstand at det/de er kompatible med de andre ingredienser av formuleringen, og ikke er skadelige for mottakeren derav.

Formuleringer som er egnet for topisk administrasjon, omfatter flytende eller halvfaste preparater som er egnet for penetrasjon gjennom huden til målområdet for behandlingen, såsom linimenter, losjoner, kremer, salver eller pastaer, og dråper som er egnet for administrasjon til øyet, øret eller nesen.

Dråper med antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte sterile vandige eller oljeholdige oppløsninger eller suspensjoner, og kan fremstilles ved å løse opp den aktive ingrediens i en egnet vandig oppløsning av et bakteriedrepende og/eller soppdrepende middel og/eller et annet egnet konserveringsmiddel, og som fortrinnsvis også inneholder et overflateaktivt middel. Den erholdte oppløsning kan deretter klarnes ved filtrering, overføres til en egnet beholder som deretter forsegles og steriliseres ved behandling i autoklav eller oppvarming til 90-100°C i en halv time. Alternativt kan oppløsningen steriliseres ved filtrering og overføres til beholderen ved en aseptisk teknikk. Eksempler på bakteriedrepende og soppdrepende midler som er egnet for innlemmelse i dråpene, er fenylkvikksølvnitrat eller -acetat (0,002%), benzalkonium-klorid (0,01%) og klorheksidinacetat (0,01%). Egnede oppløsningsmidler for fremstilling av en oljeholdig oppløsning omfatter glycerol, fortynnet alkohol og propylenglykol.

Losjoner med antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter slike som er egnet for påføring på huden eller øyet. En øyelosjon kan omfatte en steril vandig oppløsning som valgfritt inneholder et bakteriedrepende middel, og kan fremstilles ved lignende metoder som hva som ble nevnt for fremstilling av dråper. Losjoner eller linimenter for på-føring på huden kan også inneholde et middel for å fremskynde tørking og å avkjøle huden, såsom en alkohol eller aceton, og/eller et fuktemiddel såsom glycerol, eller en olje såsom en ricinusolje eller arachinolje.

Kremer, salver eller pastaer med antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er halvfaste formuleringer av den aktive ingrediens for ekstern påføring. De kan fremstilles ved å blande den aktive ingrediens i finoppdelt eller pulverisert form, for seg selv eller i oppløsning eller suspensjon i en vandig eller ikke-vandig væske, ved hjelp av egnede maskiner, med en fet eller ikke-fet basis. Basisen kan omfatte hydrokarboner såsom hard, bløt eller flytende parafin, glycerol, bivoks, en metallisk såpe; en slimet masse; en olje av naturlig opprinnelse, såsom mandelolje, kornolje, arachinolje, ricinusolje eller olivenolje; ullfett eller et derivat derav, eller en fettsyre, såsom stearinsyre eller oleinsyre, sammen med en alkohol, såsom propylenglykol eller makrogoler. Formuleringen kan innlemme hvilket som helst egnet overflateaktivt middel, såsom et anionisk, kationisk eller ikke-ionisk overflateaktivt middel, såsom sorbitanestere eller polyoksyetylenderivater derav. Suspensjonsmidler såsom naturlige gummier, cellulosederivater eller uorganiske materialer såsom silisiumholdige silikaer, og andre ingredienser såsom lanolin, kan også brukes.

En fagman vil forstå at den optimale mengde og tidsrommet mellom de enkelte dose-ringer av et antistoff ifølge oppfinnelsen vil være avhengig av naturen og utstrekningen av tilstanden som skal behandles, formen, ruten og stedet for administrasjonen, og det bestemte dyr som skal behandles, og at slike optima kan bestemmes ved konvensjonelle teknikker. Det vil også forstås av en fagman at det optimale behandlings løp, feks. an-tallet doser av et antistoff ifølge oppfinnelsen som skal gis i løpet av en dag i et bestemt antall dager, kan bestemmes av en fagman ved konvensjonelle tester for bestemmelse av behandlingsforløpet.

Kapselsammensetning

En farmasøytisk blanding ifølge foreliggende oppfinnelse i form av en kapsel fremstilles ved å fylle en standard todelt hårdgelatinkapsel med 50 mg antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen, i pulverisert form, 100 mg laktose, 32 mg talkum og 8 mg magnesiumstearat.

Injiserbar parenteral blanding

En farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen i en form som er egnet for administrasjon ved injeksjon, fremstilles ved å omrøre 1,5 vekt% antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen i 10 vol% propylenglykol og vann. Oppløsningen steriliseres ved filtrering.

Salveformulering

Antistoffet ifølge oppfinnelsen dispergeres i et lite volum av vehikkelen for å fremstille et glatt, homogent produkt. Sammenklembare metalltuber fylles deretter med dispersjonen.

Topisk krem- sammensetning

"Polawax", bivoksen og lanolinet oppvarmes sammen til 60°C. En oppløsning av metylhydroksybenzoat tilsettes, og en homogenisering oppnås ved høyhastighets omrøring. Temperaturen får synke til 50°C. Antistoffet ifølge oppfinnelsen tilsettes deretter og dispergeres gjennom det hele, og blandingen for kjøles ved lavhastighets omrøring.

Topisk losjonssammensetning

Metylhydroksybenzoat og glycerin oppløses i 70 ml vann ved 75°C. Sorbitanmonolau-rat, polysorbat 20 og cetostearylalkohol blandes sammen ved 75°C og tilsettes til den vandige oppløsning. Den erholdte emulsjon homogeniseres og får avkjøles under fortsatt omrøring, og antistoffet ifølge oppfinnelsen tilsettes i form av en suspensjon i resten av vannet. Hele suspensjonen omrøres inntil den er homogen.

Øyedråpe- sammensetning

Metyl- og propylhydroksybenzoatene oppløses i 70 ml renset vann ved 75°C, og den erholdte oppløsning far avkjøles. Antistoffet ifølge oppfinnelsen tilsettes deretter, og oppløsningen steriliseres ved filtrering gjennom et membranfilter (0,022 nm pore-størrelse), og pakkes aseptisk på egnede sterile beholdere.

Blanding for administrasjon ved inhalasjon

For en aerosolbeholder med et fyllvolum på 15-20 ml: bland 10 mg antistoff ifølge oppfinnelsen med 0,2-0,5% smøremiddel, såsom polysorbat 85 eller oleinsyre, og disperger denne blanding i et drivstoff, såsom freon, fortrinnsvis i kombinasjon med (1,2-diklortetrafluoretan) og difluorklormetan, og plasser det hele i en egnet aerosolbeholder som er tilpasset enten en intranasal eller oral inhalasjonsadministrasjon.

Blanding for administrasjon ved inhalasjon:

For en aerosolbeholder med et fyllvolum på 15-20 ml: oppløs 10 mg av et antistoff iføl-ge oppfinnelsen i etanol (6-8 ml), tilsett 0,1-0,2% smøremiddel, såsom polysorbat 85 eller oleinsyre; og disperger det hele i et drivstoff, såsom freon, fortrinnsvis i kombinasjon med (1,2-diklortetrafluoretan) og difluorklormetan, og plasser det hele i en egnet aerosolbeholder som er tilpasset enten en intranasal eller oral inhalasjonsadministrasjon.

Antistoffene og de farmasøytiske blandinger ifølge oppfinnelsen er spesielt nyttige for en parenteral administrasjon, dvs. subkutant, intramuskulært eller intravenøst. Blandingene for en parenteral administrasjon vil vanligvis omfatte en oppløsning av et antistoff ifølge oppfinnelsen eller en blanding derav, oppløst i et egnet bærerstoff, fortrinnsvis et vandig bærerstoff. Forskjellige vandige bærerstoffer kan anvendes, feks. vann, bufret vann, 0,4% saltvann, 0,3% glycin og lignende. Disse oppløsninger er sterile og generelt frie for partikkelformet materiale. Disse oppløsninger kan steriliseres ved konvensjonelle, velkjente sterilisasjonsteknikker. Blandingene kan inneholde farmasøytisk akseptable hjelpestoffer, etter behov for å tilpasse dem de fysiologiske betingelser, såsom pH-justerende og bufrende midler osv. Konsentrasjonen av antistoffet ifølge oppfinnelsen i en slik farmasøytisk formulering kan variere innen vide grenser, dvs. fra mindre enn ca. 0,5 vekt%, vanligvis minst 1 vekt%, opptil 15-20 vekt%, og vil velges primært på grunnlag av væskevolumene, viskositetene osv., ifølge den bestemte valgte administra-sjonsmåte.

Dermed kan en farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen for intramuskulær injeksjon fremstilles således at den inneholder 1 ml sterilt bufret vann og 50 mg antistoff ifølge oppfinnelsen. På lignende måte kan man fremstille en farmasøytisk blanding ifølge oppfinnelsen for intravenøs infusjon således at den inneholder 250 ml steril Ringers oppløsning og 150 mg antistoff ifølge oppfinnelsen. De faktiske fremgangsmåter for fremstilling av parenteralt administrerbare blandinger er velkjent eller vil være åpenbare for fagmannen, og beskrives i større detalj i feks. Remingtor<i>s Pharmaceutical Science, 15. utg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, som herved innlemmes heri ifølge henvisning dertil.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan lyofiliseres for lagring og rekondisjoneres i et egnet bærerstoff før bruk. Denne teknikk har vist seg å være virksom med konvensjonelle immunoglobuliner, og man kan benytte seg av lyofiliserings- og rekondisjoneringstek-nikker som er kjent innen faget.

Avhengig av det ønskede resultat, kan den farmasøytiske blanding ifølge oppfinnelsen administreres for en profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. Ved terapeutisk bruk administreres blandingene til en pasient som allerede lider av en sykdom, i en mengde som er tilstrekkelig for å helbrede eller i det minste delvis stanse sykdommen og dens komplikasjoner. Ved profylaktisk bruk administreres blandinger som inneholder foreliggende antistoffer eller en blanding derav, til en pasient som ikke allerede lider av sykdomstilstanden, for å forbedre pasientens motstand.

Enkle eller gjentatte administrasjoner av de farmasøytiske blandinger kan utføres idet doseringsmengden og -mønstret fastlegges av den behandlende lege. I hvert tilfelle bør den farmasøytiske blanding ifølge oppfinnelsen levere et tilstrekkelig antall endrede antistoffer ifølge oppfinnelsen for å virksomt behandle pasienten.

Det bør også bemerkes at antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan brukes for utvikling og syntese av enten peptidforbindelser eller ikke-peptidforbindelser (mime-tika), som ville være nyttige innen den samme terapi som antistoffet. Jfr. feks. Saragovi et al., Science 253: 792-795 (1991).

Claims

1. Humanisert antistoff som binder til gp39 og som inhiberer binding av gp39 til CD40, hvor nevnte antistoff inneholder en humanisert lettkjede variabelt område omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av: og hvor nevnte antistoff inneholder et humanisert tungkjede variabelt område omfattende en aminosyresekvens valgt fra gruppen bestående av

2. Humanisert antistoff ifølge krav 1, hvor antistoffet inneholder humanisert lettkjede variabel sekvens (1) og humanisert tungkjede variabel sekvens (1).

3. Humanisert antistoff ifølge krav 1, som inneholder humanisert lettkjede variabel sekvens (2) og humanisert tungkjede variabel sekvens (1).

4. Humanisert antistoff ifølge krav 1, som inneholder humanisert lettkjede variabel sekvens (1) og humanisert tungkjede variabel sekvens (2).

5. Humanisert antistoff ifølge krav 1, som inneholder humanisert lettkjede variabel sekvens (2) og humanisert tungkjede variabel sekvens (2).

6. Humanisert antistoff ifølge et av kravene 1 til 5, hvor den lette kjede omfatter humant kappa- eller lambda-lettkjede konstant område og den tunge kjede omfatter et humant konstant område valgt fra gruppen bestående av gamma 1, gamma 2, gamma 3 og gamme 4.

7. Humanisert antistoff ifølge krav 6, hvor den tunge kjede omfatter et gamma 4 konstant område som har en mutasjon eller mutasjoner valgt fra gruppen bestående av: (a) erstatning av serin med prolin ved posisjon 229; (b) erstatning av leucin med glutaminsyre ved posisjon 236; og (c) erstatning av serin med prolin ved posisjon 229 samt erstatning av leucin med glutaminsyre ved posisjon 236.

8. DNA-sekvens som koder for et humanisert antistoff ifølge ethvert av kravene 1-7.

9. Ekspresjonsvektor som inneholder en DNA-sekvens ifølge krav 8.

10. Farmasøytisk sammensetning som inneholder et humanisert antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 7.

11. Anvendelse av sammensetning omfattende minst et humanisert antistoff ifølge ethvert av kravene 1 til 7 for fremstilling av et medikament til behandling av en sykdom, lidelse eller tilstand som kan behandles ved å modulere gp39-ekspresjon eller inhibere gp3 9/ CD40- interaksjonen.

12. Anvendelse ifølge krav 11, hvor nevnte sykdom, lidelse eller tilstand er en autoimmun sykdom, lidelse eller tilstand.

13. Anvendelse ifølge krav 12, hvor den autoimmune sykdom, lidelse eller forstyrrelse velges fra gruppen bestående av autoimmun hemolytisk anemi, Goodpastures syndrom, rheumatoid artritt, psoriasis, multippel sklerose, diabetes mellitus, systemisk lupus erythematose og idiopatisk trombocytopenisk purpura.

14. Anvendelse ifølge krav 11, hvor sykdommen, lidelsen eller tilstanden er en ikke-autoimmun sykdom, lidelse eller forstyrrelse.

15 Anvendelse ifølge krav 14, hvor sykdommen, lidelsen eller forstyrrelsen er valgt fra gruppen bestående av astma, HIV, leukemi og lymfom.

16. Anvendelse ifølge krav 14, hvor sykdommen, lidelsen eller forstyrrelsen er "graft-vs.-host-disease" eller avstøtning av et transplantert vev eller organ.

17. Anvendelse ifølge krav 11, hvor sykdommen, lidelsen eller forstyrrelsen velges fra gruppen bestående av rheumatoid artritt, Feltys syndrom, lupus erythematose, systemisk lupus erythematose, Hashimotos struma, multippel sklerose, polyarteritis nodosa, myasthenia gravis, diabetes type 1, uveititt, nefrotisk syndrom, psoriasis, psoriatrisk artritt, atopisk dermatitt, kontaktdermatitt og andre eksematøse dermatitter, seboréisk dermatitt, lichen planus, pemfigus, bulløs pemfigus, epidermolysis bullosa, urticaria, angioødemer, vaskulitter, erythema, kutane eosinofiler, alopecia areata, reversibel obstruktiv luftveisykdom, migrene, eksem, rhinitt, samt andre allergiske tilstander, og dessuten sykdommer assosiert med tarmbetennelser innbefattende cøliaki, proktitt, eosinofilia gastroenteritis, mastocytosis, Crohns sykdom og ulcerøs kolitt.