NO326782B1

NO326782B1 - Monoklonalt anti-humant CD23-antistoff, anvendelse derav samt farmasoytisk preparat

Info

Publication number: NO326782B1
Application number: NO19994006A
Authority: NO
Inventors: Mitchell E Reff; William S Kloetzer; Takehiko Nakamura
Original assignee: Biogen Idec Inc
Priority date: 1997-02-20
Filing date: 1999-08-19
Publication date: 2009-02-16
Also published as: US20070065435A1; US20090018314A1; NO994006L; AU6146998A; IL131448A; US7332163B2; US20070065434A1; CA2281893A1; EP1019442A1; HK1025978A1; IL159642A0; AU725482B2; CN1310947C; NO20084032L; ID23805A; CN1252811A; IL131448A0; US20080193447A1; US20050054833A1; JP2002514071A

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører monoklonalt anti-humant CD23-antistoff, samt farmasøytisk preparat.

Foreliggende oppfinnelse angår følgelig monoklonalt anti-humant CD23-antistoff, kjennetegnet ved at det omfatter et humant gamma-1 eller human gamma-3 konstant område som bindes til humane Fc gamma RI, Fc gamma RN eller Fc gamma RUI reseptorer og inhiberer lgE-ekspresjon.

IgE er et medlem av immunglobulinfamilien som setter i gang allergiske responser så som astma, matvareallergier, hypersensitivitet type 1 og den familiære allergiske sinusinflammasjons-rhinitt og konjunktivitt, og som, som resultat av dette, forårsaker omfattende lidelse i hele den vanlige befolkning. IgE utsondres av, og uttrykkes på overflaten av, B-celler. IgE syntetisert av B-celler kan forankres i B-cellemembranen ved et kort transmembran-doméne knyttet til den ferdige IgE-sekvens. Membran- og utsondrede former for IgE dannes i samme celle ved differensial-spleising av IgE-RNA-transkriptet.

IgE kan også bindes til B-celler (og T-celler, monocytter, Langerhanske celler, follikulære dendrittceller, naturlige dreperceller, eosinofile celler og blodplater) via sitt Fc-område til en lavaffinitets-lgE-reseptor (FceRII, i det følgende «FCEL») og til mastceller og basofile celler via sitt Fc-område til en høyaffinitets-lgE-reseptor FceRl (i det følgende «FCEH»). Lavaffinitets-lgE-reseptoren omtales vanligvis i litteraturen som CD23.

Når et pattedyr eksponeres for et allergen, bearbeider antigenpresenterende celler antigenet for presentasjon for hjelper-T-celler. Disse hjelper-T-celler utsondrer cytokiner så som IL-4, som hjelper B-celler til å gjennomgå klonal amplifikasjon og utsondre mer allergen-spesifikt IgE. Dette nylig syntetiserte IgE frigjøres i sin tur i sirkulasjonen, hvor det bindes til mastceller og basofile celler via høyaffinitets-reseptoren på sin celleoverflate. Slike mastceller og basofile celler blir derved sensibilisert overfor det spesifikke allergen. Neste eksponering for det samme allergen bevirker binding til spesifikt IgE på overflaten av mastceller og basofile celler, hvorved FceRl på disse celler tverrbindes, og således aktiveres frigjøringen av histamin og andre faktorer som er ansvarlige for klinisk hypersensitivitet og anafylakse, fra disse celler.

Det er på området rapportert antistoffer som kan bindes til FCEL-(DC23)-bundet IgE, men ikke til IgE bundet til FCEH (se for eksempel WO 89/00138 og

US-patent 4 940 782). Disse antistoffer er beskrevet å være klinisk fordelaktige på grunn av at de bindes til IgE som er bundet til lavaffinitetsreseptoren (FCEL), eller til sirkulerende IgE, mens de ikke bindes til IgE bundet til høyaffinitetsreseptoren (FCEH). Disse antistoffer vil derfor ikke aktivere mastceller eller basofile celler.

Videre er anti-CD23-antistoffer blitt rapportert å ha potensial som terapeutiske midler f.eks. for behandling av allergiske forstyrrelser, inflammatoriske sykdommer og autoimmune sykdommer. For eksempel omtaler Bonnefoy et al., WO 9612741, at ligander som binder CD23, f.eks. monoklonale antistoffer, er nyttige ved behandling eller forebygging av inflammatoriske, autoimmune og allergiske sykdommer.

Anvendbarheten av monoklonale antistoffer overfor CD23 både som IgE-agonister og -antagonister er blitt rapportert. IgE-antagonister er blitt rapportert å ha potensiell anvendbarhet ved behandling av tilstander eller sykdommer hvor IgE-undertrykkelse er terapeutisk ønskelig, f.eks. allergiske tilstander så som allergisk rhinitt og konjunktivitt, atopisk dermatitt og astma. For eksempel omtaler Bonnefoy et al., WO 8707302 (1987) monoklonale antistoffer overfor human CD23, som man hevder er egnet for analysering av tilstedeværelse av IgE-reseptorer på celletyper og som terapeutiske midler ved sykdommer hvor modulering av IgE er terapeutisk ønskelig.

Delvis på grunn av deres potensial som terapeutiske og diagnostiske midler har mange grupper rapportert dannelse av monoklonale antistoffer overfor CD23. Se f.eks. Rector et al., I mm unoi., 55:481-488 (1985); Suemura et al., J. Immunol., 137-1214-1220 (1986); Nora et al., J. Immunol., 137:1258-1263 (1986); Bonnefoy et al., J. Immunol., 138:2970-2978 (1987); Flores-Romo et al., Science, 261:1038-1046 (1993); Sherr et al., J. Immunol., 142:481-489 (1989); og Pene et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 85:6880-6884 (1988). Som omtalt ovenfor, er anvendbarheten av slike antistoffer, spesifikt til inhibering av IgE-dannelse i systemer hvor IgE-syntesen er cytokin-(IL-4)-indusert, også blitt rapportert.

(Flores-Romo et al., (/of.); Sherr et al., ( Id) ; Bonnefoy et al. (WO 8707302); Bonnefoy et al. (WO 9612741); Bonnefoy et al., Eur. J. //7J/r?uno/20:139-144

(1990); Sarfati et al., J. Immunol 141:2195-2199 (1988) og Wakai et al., Hybridoma 12:25-43 (1993). Dessuten beskriver Flores-Romo et al. { Id.) at Fab fremstilt ut fra anti-CD23-antistoffer inhiberer antigénspesifikke induserte IgE-responser in vivo hos rotte. Uansett hva som er blitt rapportert, forblir imidlertid mekanismen ved hvilken anti-CD23-antistoffer modulerer IgE-ekspresjonen, og spesielt måten på hvilken de blokkerer IL-4-indusert IgE-dannelse, uklar.

Det er blitt antydet at anti-CD23-antistoffer inhiberer IgE-dannelsen ved signalisering via CD23 som finnes på overflaten av IgE-utsondrende B-celler. Man har fremsatt den teori at funksjonen av CD23, som er oppregulert på IgE-utsondrende B-celler, er feedback-inhibering av IgE-dannelse (Yu et al., Nature 369, 753-756 (1994)). Denne teori er blitt fremsatt på grunn av at mus hvor CD23-genet er blitt fjernet, har økt og vedvarende IgE-dannelse sammenliknet med kontroller (Yu et al.). Det er dessuten blitt rapportert at binding til CD23 ved IgE-komplekser eller ved et monoklonalt antistoff overfor anti-CD23 undertrykker pågående IgE-syntese ved en lymfoblastoid-cellelinje som konstitutivt utsondrer IgE (Sherr et al. { Id.)). Det viser seg at dette skyldes nedregulering av budbringer-RNA med hensyn til den utsondrede IgE-tungkjede i denne celle (Saxon et al., J. Immunol., 147-4000-4006 (1991)). Den nøyaktige mekanisme ved hvilken IgE-ekspresjonen inhiberes må imidlertid ennå forklares for systemer hvor IgE-sekresjonen er IL-4-indusert.

Det er også rapportert at tverrbinding av Fc gamma RN med overflate-lg (B-cellereseptor) på B-celler fører til nedregulering av lg-ekspresjon. (D'Ambrosia et al., Science, 268:293-297 (1995). En liknende mekanisme kan foreslås for B-celler som utsondrer IgE som også har celleoverflate-CD23 og Fc gamma Ril. Et anti-human CD23-antistoff bundet til en celle via antigen (CD23) og dessuten bundet til Fc gamma RN via Fc-vekselvirkninger kan overføre et signal for undertrykkelse av IgE-sekresjon via Fc gamma Ril.

Det er blitt foreslått mekanismer som inngår ved IgE-inhibering via anti-CD23-antistoffer, som innbefatter andre blokkerings-vekselvirkninger enn vekselvirkningen mellom membran-CD23 og IgE. I forbindelse med dette er CD23, som er et medlem av C-lektin-familietypen, blitt vist å vekselvirke med flere andre ligander så som CD21, CD11b og CD11c som finnes på forskjellige celletyper innbefattende T-celler og monocytter. I denne forbindelse kan man tenke seg at CD23 er et cellulært adhesjonsmolekyl.

Det er derfor foreslått at CD21-CD23-vekselvirkningen kan inngå ved antigen-presentasjon og etterfølgende IgE-dannelse. Modeller tyder på at CD21 på B-celler sender et aktiveringssignal for IgE-dannelse etter binding til CD23 på aktiverte T-celler som hovedsakelig finnes i atopiske individer. (Lecoanet et al., Immunol., 88:35-39 (1996); og Bonnefoy et al., Int. Amer. Allergy Immunol., 107:40-42 (1995). Blokkering av denne vekselvirkning med et anti-CD23 kan blokkere indusert IgE-dannelse. (Aubry et al., Nature, 358:505-507 (1992) og Immunol., 5:944-949 (1993); Grosjean et al., Curr. Opin. Eur. J. Immunol., 24:2982-2988 (1994); Henchoz-Lecoanet et al., Immunol., 88:35-39 (1996); Nambu et al., Immunol. Lett., 44:163-167 (1995); Bonnefoy et al., Int. Amer. Allergy Immunol., 107:40-42 (1995)). Det er også mulig at antigen-presentasjon oppreguleres ved CD23 på antigenpresenterende B-celler som bindes til CD21 på T-celler.

Enda en annen mekanisme som potensielt vil forklare virkningene av CD23 på IgE-dannelsen, innbefatter løselige former av CD23. Det er rapportert at CD23 spaltes fra celleoverflaten og frigjør flere forskjellige former av løselig CD23 eller IgE-bindende faktorer. (Sarfati et al., Immunol., 53:197-205 (1984)). Løselig CD23 er et cytokin, og én av dets rapporterte aktiviteter er forøkning av IL-4-indusert IgE-dannelse fra B-celler. (Pene et al., J. Cell Biochem., 39:253-269 (1989); (Pene et al., Eur. J. Immunol., 18:929-935 (1988); Sarfati et al., J. Immunol., 141:2195-2197 (1988); Sarfati et al. (1984) (/d.); (Saxon et al., J. Clin. Immunol. Allergy, 86 (3 pt 1) 333-344 (1990). Dessuten er visse former for løselig CD23 rapportert å inhibere IgE-dannelse (Sarfati et al., Immunol., 76:662-667 (1992)). Anti-CD23-antistoffer kan følgelig potensielt blokkere IgE-dannelsen ved 1) inhibering av de IgE-forsterkende virkninger av løselig CD23, og/eller 2) blokkering av den proteolytiske frigjøring av løselig CD23 fra celleoverflaten.

Basert på det foregående er det således klart at det er betydelig kompleksitet og usikkerhet på området med hensyn til funksjonene av mer spesifikk CD23 og virkningene på IgE-dannelsen, og videre med hensyn til virkemåten ved hvilke ligander som er spesifikke overfor denne, påvirker IgE-dannelsen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter følgelig nye ligander (anti-stoffer) som er spesifikke overfor CD23 og anvende slike antistoffer for belysning av den mekanisme ved hvilken anti-CD23-antistoffer modulerer IgE-ekspresjonen.

Foreliggende oppfinnelse omfatter videre nye ligander (antistoffer) som binder CD23, spesielt human CD23, med forbedret evne til inhibering av indusert lgE-ekspresjon.

Det er mulig å behandle eller forebygge allergiske tilstander, autoimmune sykdommer og inflammatoriske sykdommer under anvendelse av et monoklonalt anti-human CD23-antistoff omfattende enten et konstant humant gamma-1- eller humant gamma-3-doméne.

Det vises nå til tegningene.

Fig. 1 sammenlikner IgE-inhiberingsaktiviteten in vitro hos et monoklonalt muse-anti-human CD23-antistoff (MHM6) overfor fem monoklonale primat-anti-human CD23-antistoffer (5E8, 6G5, 2C8, B3B11 og 2G12); Fig. 2 viser at monoklonale primat-antistoffer 5E8 og 6G5 binder en epitop på human CD23 som er forskjellig fra kommersielt tilgjengelig monoklonalt muse-anti-human CD23-antistoff MHM6 (midtre diagram, fig. 2) og konkurrerer med hverandre (nedre diagram, fig. 2). Monoklonale primat-anti-human CD23-anti-stoffer 2C8 og B3B11 konkurrerer med MHM6-toppdiagram, fig. 2). Fig. 3 sammenlikner den IgE-inhiberende aktivitet in vitro av et spesielt monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff 5E8 med fire forskjellige PRIMATIZED®-former for det monoklonale primat-antistoff, hvis sekvenser er beskrevet nedenfor. p5E8G4P- Dette PRIMATIZED®-antistoff inneholder følgende sekvenser: Konstant humant kappa-lettkjedeområde og konstant humant gamma 4-område som inneholder en P-mutasjon (Angal et al., Mol. Immunol., 30:105-108 (1993)); P5E8G4PN- Dette PRIMATIZED®-antistoff inneholder det konstante humane kappa-lettkjedeområde og et konstant humant gamma 4-område med en P-mutasjon (Angal et al., Mol. Immunol., 30:105-108 (1993)). Dette antistoff inneholder også en mutasjon i det variable tungkjede-område som forandrer en asparaginrest (potensielt karbohydrat-tilknytningssted) til et lysin; p5E8G1 Dette PRIMATIZED®-antistoff inneholder det konstante humane kappa-lettkjedeområde og et konstant humant gamma 1-område; P5E8G1N- Dette PRIMATIZEDO-antistoff inneholder det konstante humane kappa-lettkjedeområde og det konstante humane gamma 1-område. Dette antistoff inneholder også en mutasjon i det variable tungkjede-område som forandrer en asparaginrest (karbohydrat-tilknytningssted) til et lysin; Fig. 4 inneholder en tabell som sammenlikner den tilsynelatende Kd i nM for antistoffene identifisert på fig. 3 og oppsummerer deres IgE-undertrykkende aktivitet. Fig. 5 sammenlikner den inhiberende IgE-aktivitet in vitro hos et spesielt monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff, 6G5, overfor to forskjellige PRIMATIZED®-typer av 6G5 som er beskrevet nedenfor: p6G5G1 Dette PRIMATIZED®-antistoff inneholder det konstante humane lambda-lettkjedeområde og det konstante humane gamma 1-område; p6G5G4P Dette PRIMATIZED®-antistoff inneholder det konstante humane lambda-lettkjedeområde og det konstante humane gamma 4-område med en P-mutasjon (Angal et al., Mol. Immunol., 30:105-108 (1993)); Fig. 6 sammenlikner den IgE-inhiberende aktivitet in vitro av monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff 2C8 overfor F(ab')2 avledet fra 2C8; Fig. 7 viser at F(ab')2 avledet fra 2C8 motvirker undertrykkelsen av IgE-aktivitet in vitro hos monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff 2C8; Fig. 8 viser den IgE-inhiberende aktivitet in vivo av et spesielt monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff, 5E8, i en SCID-dyremodell; Fig. 9 sammenlikner den inhiberende aktivitet in vivo av primat-anti-humant 6G5 og en PRIMATIZED®-form derav, p6G5G4P. Fig. 10 viser den IgE-inhiberende aktivitet in vivo hos det monoklonale primat-anti-human CD23-antistoff 6G5 og en PRIMATIZED®-form derav, P6G5G1.

Definisjon av betegnelser anvendt i denne patentsøknad

Kimært antistoff:

Et rekombinant antistoff inneholdende områder fra to forskjellige antistoffer, vanligvis antistoffer fra forskjellige arter, mest typisk variable gnagersekvenser og humane konstant-doméne-sekvenser.

Anti- human CD23- aamma 1- antistoff

Et antistoff som spesifikt binder human CD23 og som inneholder et konstant humant gamma 1-område eller et fragment eller en modifikasjon derav som inhiberer indusert IgE-dannelse. Dette innbefatter spesielt antistoffer inneholdende variable gnager- eller primat-doméner eller antigenbindende deler, humaniserte, PRIMATIZED®, og monoklonale humane anti-human CD23-antistoffer som omfatter et konstant humant gamma 1 -doméne, eller et fragment eller en modifikasjon derav, som inhiberer indusert IgE-dannelse in vitro.

Anti- human CD23- aamma 3- antistoff

Et antistoff som spesifikt binder human CD23, som inneholder et konstant humant gamma 3-område eller et fragment eller en modifikasjon derav som inhiberer indusert IgE-dannelse. Dette innbefatter spesielt antistoffer inneholdende variable gnager- eller primat-doméner eller antigenbindende deler, humaniserte, PRIMATIZED®, og monoklonale humane anti-human CD23-antistoffer som omfatter et konstant humant gamma 3-doméne, et fragment eller en modifikasjon derav, som inhiberer indusert IgE-dannelse in vitro.

Modifikasjoner av konstante antistoffdoméner

Antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse inneholdende mutasjoner, substitusjoner eller delesjoner av det konstante område, som kan frembringe en ønsket forandring i nivået av effektivitet, dvs. ved FcR-binding, uten forandring av de basiske effektorfunksjoner mediert ved det konstante område.

PRIMATIZED®- antistoff

Et rekombinant antistoff inneholdende variable primat-sekvenser eller antigenbindende primat-deler, og humane konstant-doméne-sekvenser.

Humanisert antistoff:

Et rekombinant antistoff inneholdende et ikke-humant variabelt område eller antigenbindende del som er blitt modifisert for mer nøyaktig å etterlikne et variabelt humant antistoff om råde og derved eliminere eller minimalisere potensiell immunogenitet hvis administrert til mennesker uten at man gir avkall på immun-globulinets spesifisitet eller affinitet. Det er flere kjente metoder for humanisering, innbefattende «finering», som omfatter selektiv modifisering av overflaterester, rammeverk-erstatning, (CDR-poding) og molekylmodellering.

Konstant gamma 1- doméne:

En spesiell type konstant-doméne-sekvens som gir et antistoff spesifikke effektor-aktiviteter. Ved foreliggende oppfinnelse angir konstant gamma 1-doméne et humant konstant gamma 1-doméne, et fragment eller en modifikasjon derav, som bibeholder gamma 1-effektorfunksjoner i kombinasjon med anti-CD23-variabeldoméne-sekvenser eller antigenbindende deler. Modifikasjoner innbefatter humane konstante gamma-1-doméner som omfatter delesjon, substitusjon eller addisjon av én eller flere aminosyrerester. Denne effektorfunksjon viser seg ved evnen hos et antistoff som inneholder et slikt konstant doméne til å inhibere indusert IgE-dannelse.

Konstant gamma 3- doméne:

En spesiell type konstant-doméne-sekvens som gir et antistoff spesifikke effektor-aktiviteter. Ved foreliggende oppfinnelse angir konstant gamma 3-doméne et humant konstant gamma 3-doméne, et fragment eller en modifikasjon derav, som bibeholder gamma 3-effektorfunksjoner i kombinasjon med anti-CD23-variabeldoméne-sekvenser eller antigenbindende deler. Modifikasjoner innbefatter konstante humane gamma-3-doméner som omfatter delesjon, substitusjon eller addisjon av én eller flere aminosyrerester. Denne effektorfunksjon viser seg ved evnen hos et antistoff som inneholder et slikt konstant doméne til å inhibere indusert IgE-dannelse.

CD23:

Dette angir lavaffinitetsreseptoren for IgE, FceRlI/CD23.

Anti- CD23- antistoff:

Et antistoff som spesifikt binder CD23, fortrinnsvis human CD23.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

Skjønt mange grupper tidligere har rapportert fremstilling av anti-CD23-antistoffer og anvendelse derav som antagonister og agonister for modulering av IgE-dannelsen, forblir, som omtalt ovenfor, den nøyaktige mekanisme ved hvilken slike antistoffer modulerer IgE-ekspresjonen i systemer hvor IL-4 induserer IgE-dannelsen, uklar. Det ville således være fordelaktig hvis måten på hvilken slike antistoffer modulerer IgE-ekspresjonen, ble belyst, eller i det minste bedre forklart, siden slik informasjon vil være potensielt nyttig ved utforming av terapeutiske midler for behandling av sykdommer hvor modulering av IgE-dannelsen er terapeutisk ønskelig. Det vil spesielt være fordelaktig hvis det ble oppnådd forbedrede antistoffer spesifikke overfor CD23 med forbedret evne til inhibering av indusert IgE-dannelse, siden forøkte IgE-nivåer antas å inngå ved tallrike sykdomsprosesser, f.eks. allergiske tilstander, inflammatoriske tilstander og autoimmunsykdommer. Slike sykdommer innbefatter for eksempel atopisk dermatitt, eksem, allergisk rhinitt og konjunktivitt, Jobs syndrom og astma.

For dette formål har de nærværende oppfinnere overraskende oppdaget at monoklonale anti-human CD23-antistoffer som inneholder konstante humane gamma-1-doméner, inhiberer IgE-dannelsen i systemer hvor IgE-dannelsen induseres ved IL-4 betydelig bedre enn monoklonale CD23-antistoffer av andre effektortyper, f.eks. slike som omfatter konstante humane gamma-4-doméner eller monoklonale CD23-antistoffer eller antistoff-fragmenter som helt mangler effektorfunksjoner. På grunn av at konstante humane gamma-3-doméner er blitt vist å mediere de samme effektorfunksjoner som monoklonalt humant gamma-1, er monoklonale anti-human CD23-antistoffer inneholdende konstante humane gamma-3-doméner også innbefattet.

Det er for tiden fem definerte effektorfunksjoner for IgG-(gamma)-antistoffklassen. To av disse funksjoner, komplementaktivering og FcyRN-vekselvirkning, finnes ikke i in vitro-forsøkene beskrevet ved foreliggende oppfinnelse, og det er derfor ikke sannsynlig at de inngår i molekylmekanismen. Det er blitt identifisert tre andre FcyR-reseptorer som vekselvirker med IgG-antistoff-klassen: FcyRI, FcyRII (hvorav det er minst seks forskjellige proteiner) og FcyRIII (med minst to forskjellige proteiner). Alle disse tre reseptorer vekselvirker både med lgG1 og lgG3.

FcyRI er det eneste av de tre som har noen vesentlig affinitet for IgG. Den binder både monomere gamma-1 og gamma-3 med en Ka på ca. 5 x 10<8> M'<1>. Dens affinitet for humant gamma-4 er imidlertid omkring 10 ganger mindre, og den binder ikke humant gamma-2 i det hele tatt (Fries et al., 1992, J. Immunol. 129: 1041-1049; Kurlanderog Batker, 1982, J. Clin. Invest. 69:1-8; Woof, 1984, G. Mol. Immunol. 21: 523-527; se også Burton og Woof, 1992, Human Antibody Effector Function, Adv. Immunol. 51:1-84).

Skjønt affiniteten hos human FcvRII og FcyRIII for humant IgG generelt er meget lav (Ka<10<7> M'<1>), øker affiniteten for humant lgG1 og humant lgG3 betydelig (Ka = 2-5 x 10<7> M'<1>) når de er bundet til antigen (Karas et al., 1982, Blood60: 1277-1282). Affiniteten hos human FcyRII for humant lgG2 bundet til antigen har gitt motstridende resultater. Human FcyRIII bindes ikke til humant lgG2. Human FC7RII og human FcyRIII bindes ikke til humant lgG4 (Van de Winkel og Anderson, 1991, J. Leuk. Biol. 49: 511-524; Huizinga et al., 1989, J. Immunol. 142: 2359-2364).

Skjønt Fc-formidlede effektorfunksjoner noen ganger er betydningsfulle for antistoffers terapeutiske virkning, var denne oppdagelse overraskende når det gjaldt anti-CD23-antistoffer på grunn av at effektorvirkningens rolle ved den IgE-inhiberende virkning av anti-CD23-antistoffer ikke tidligere var blitt rapportert. Tidligere tegn hadde faktisk tydet på at antistoff-effektorfunksjonen ikke hadde betydning for anti-CD23-antistoffers evne til å inhibere indusert IgE-dannelse. For eksempel hadde Flores-Romo et al., Science, 261:1038-1041 (1993) rapportert at Fab fremstilt ut fra et polyklonalt anti-CD23-antistoff inhiberte en in vivo-indusert antigenspesifikk IgE-respons.

Den oppdagelse at det tilsynelatende inngår effektorfunksjoner formidlet via det konstante område av anti-CD23-antistoffer ble gjort etter at de nærværende oppfinnere isolerte forskjellige primat-antistoffer som er spesifikke overfor CD23 og har anti-lgE-inhiberende virkning, og disse antistoffer ble sammenliknet med PRIMATIZED®-former med hensyn til sin evne til å inhibere IL-4-indusert IgE-dannelse in vitro og in vivo. Antistoffer konstruert med et humant konstant gamma-4-område inhiberte ikke IgE-antigenspesifikke responser in vitro, mens antistoffer inneholdende et humant konstant gam rna-1-område var vellykkede.

På grunn av at det er sannsynlig at én (eller flere) av de tre klasser av FcYR-reseptorer, FcryRI, FcyRII e,ler FcyRIII inngår i den spesifikke effektorfunksjon mediert via gamma-1-doménet, og på grunn av at disse reseptorklasser også bindes til antistoffer inneholdende gamma-3-doméner, er det logisk at anti-CD23-antistoffer inneholdende gamma-3-doméner også vil være vellykkede når det gjelder inhibering av IgE-antigenspesifikk respons in vitro.

Mer spesifikt, og som beskrevet mer detaljert nedenfor, ble fem mono-klonale primat-antistoffer som spesifikt bandt både cellulær og løselig CD23, isolert fra en ape av typen Old World (java-ape) i henhold til metodikken som er beskrevet i felles overdradd US-patentsøknad nr. 08/379 072 som ble utstedt som U.S. Patent Nr. 5,658,570,19. august 1997. Denne patentsøknad beskrev detaljert en metode for fremstilling av monoklonale antistoffer overfor ønskede antigener, ønskelig humane antigener, hos aper av typen Old World, og deres fordeler med hensyn til antistoffer fra andre arter som terapeutiske midler, for eksempel redusert eller potensielt mangel på immuno-genitet hos mennesker på grunn av den fylogenetiske nærhet mellom mennesker og aper av typen Old World. På grunn av den fylogenetiske nærhet mellom disse arter er det faktisk vanskelig å skjelne immunglobuliner fra aper av typen Old World fra humane immunglobuliner ved sekvenssammenlikning.

Fire av disse fem monoklonale primat-anti-humane CD23-antistoffer ble vist å kunne inhibere IL-4-indusert IgE-dannelse ved et B-celleforsøk in vitro beskrevet detaljert nedenfor, og det mest potente ble også vist å inhibere IL-4-indusert IgE i en SCID-muse-dyremodell (også beskrevet detaljert nedenfor). Basert på denne IgE-inhiberende virkning, og ventet lav immunogenitet hos mennesker, er slike antistoffer potensielt egnet som terapeutiske midler for behandling av sykdommer hvor inhibering av IgE-dannelse er terapeutisk ønskelig.

For ytterligere å redusere immunogeniteten ble det frembrakt to mono-klonale primat-antistoffer overfor PRIMATIZED® (en type antistoff-kimærisering) i henhold til den metodikk som også er beskrevet i US-patentsøknad nr. 08/379 072 (U.S. Patent Nr. 5,658,570). PRIMATIZATION® angir hovedsakelig dannelsen av rekombinante antistoffer utviklet av IDEC Pharmaceuticals Corporation, som omfatter variable primat-områder og konstante human-områder. PRIMATIZATION® av de to primat-anti-human CD23-antistoffer (5E8 og 6G5) med potent IgE-inhiberende virkning ble utført for eliminering av eventuell potensiell immunogenitet som skyldtes de konstante primat-doméner i mennesker.

På grunn av oppfinnernes forventning i begynnelsen ut fra publisert litteratur om at Fc-effektorfunksjon ikke var nødvendig for indusert IgE-inhibering, ble det i begynnelsen dessuten fremstilt humane gamma 4-typer av disse spesielle antistoffer. Det ble imidlertid ganske overraskende funnet at gamma-4-typene dannet ut fra begge disse monoklonale primat-antistoffer var ineffektive, dvs. at de fordret betydelig høyere konsentrasjoner av gamma-4-antistoff av typen PRIMATIZED® enn av primat-antistoffet for å inhibere IL-4-indusert IgE-dannelse ved in vitro-forsøk.

Enda mer overraskende var dessuten den oppdagelse at når de samme to primat-antistoffer så ble omdannet til humane gamma-1 -typer (ved erstatning av de konstante primat-doméner med konstante humane gamma-1-doméner), inhiberte disse gamma-1-antistoffer meget effektivt indusert IgE-dannelse in vitro.

Våre resultater tydet således på at Fc-effektorfunksjon tydeligvis er betydningsfull for evnen hos anti-human CD23-antistoffer til å inhibere indusert IgE-dannelse. Denne hypotese ble bekreftet når et tredje monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff, dvs. 2C8-antistoffet, som ble vist av oss å inhibere IgE-dannelse in vitro, ble omdannet til et F(ab')2, som ble funnet å være hovedsakelig uegnet til å inhibere indusert IgE-dannelse in vitro. Dette F(ab')2 ble faktisk funnet å motvirke de undertrykkende virkninger på indusert IgE-blokkeringsaktivitet hos det mono-klonale primat-anti-human CD23-antistoff 2C8.

Det ble dessuten funnet at fjerning av et glykosyleringssted i det variable tungkjedeområde på ett av antistoffene (5E8) ikke hadde noen virkning på binding av antistoffet til CD23 (påvist ved oppnådde Kd-verdier) eller på indusert IgE-inhibering. Det ble således vist at forskjellene i IgE-inhibering tydeligvis ikke innbefattet glykosyleringsforskjeller.

Gamma 1-PRIMATIZED®-typen av primat 6G5 ble funnet å inhibere indusert lgE-ekspresjon i SCID-mus mens den samme konsentrasjon av enten primat 6G5 eller PRIMATIZED® p6G5G4p ikke inhiberte indusert lgE-ekspresjon. Det ble derfor funnet at et antistoff inneholdende konstante humane gamma-1 - doméner var enda mer effektivt i en dyremodell in vivo enn det monoklonale primat-antistoff. Videre regner oppfinnerne med at anti-CD23-antistoffer inneholdende humane konstante gamma-3-doméner vil være like effektive som dem som har konstante gamma-1-doméner, på grunn av at konstante gamma-1-og gamma-3-doméner har affinitet for de samme klasser av Fc-reseptorer.

Basert på disse resultater er det følgelig, overraskende nok, blitt oppdaget at et aktivt Fc-område, spesielt hos humant gamma-1 eller humant gamma-3, inngår i betydelig grad i mekanismen som omfatter IL-4-indusert IgE-inhibering ved monoklonale anti-human CD23-antistoffer. Denne oppdagelse er ganske uventet, spesielt basert på tidligere rapporter at Fab avledet fra polyklonale anti-CD23-antistoffer kunne inhibere indusert IgE-dannelse, og også basert på de forskjellige teorier med hensyn til hvordan CD23 påvirker indusert lgE-ekspresjon.

Foreliggende oppfinnelse angår følgelig anti-human CD23-antistoffer inneholdende humane konstante gamma-1- eller gamma-3-doméner.

Foreliggende oppfinnelse vedrører også farmasøytisk preparat kjennetegnet ved at det inneholder et anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene.

Det er videre beskrevet anvendelse av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 -9 og 11, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av en sykdomstilstand hvor inhibering av IgE er terapeutisk eller profylaktisk fordelaktig.

Oppfinnelsen vedrører også anvendelse av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 -9 og 11, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av autoimmun sykdom eller en inflammatorisk sykdom.

Det er også beskrevet anvendelse av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 14-18 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av en sykdomstilstand hvori inhibisjon av IgE er terapeutisk eller profylaktisk fordelaktig.

Foreliggende oppfinnelse vedrører videre anvendelse av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 14-18 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en allergisk forstyrrelse, en autoimmun sykdom eller en inflammatorisk forstyrrelse.

En fagperson kan fremstille anti-human CD23-antistoffer inneholdende enten humane konstante gamma-1- eller gamma-3-doméner ved hjelp av metoder som er velkjente på området som gjelder fremstilling av kimære antistoffer. Slike metoder omfatter hovedsakelig fremstilling av anti-human CD23-antistoffer i en ønsket vert eller in vitro, kloning av et hybridom eller en cellelinje som danner et monoklonalt anti-human CD23-antistoff som oppviser ønskelige egenskaper, f.eks. tilstrekkelig CD23-bindingsaffinitet, kloning av nukleinsyresekvensene som koder for et slikt antistoff, ut fra nevnte hybridom eller cellelinje, f.eks. ved polymerasekjedereaksjon under anvendelse av passende primere, isolering av de variable doméner som finnes i disse, rekombinering av slike variable doméner med humane konstante gamma-1- eller gamma-3-doméner og det hensiktsmessige humane konstante lettkjede-doméne, og ekspresjon av den resulterende nukleinsyresekvens som koder for et kimært anti-human CD23-immunglobulin av typen gamma-1 eller gamma-3, i et egnet ekspresjonssystem. Anti-human CD23-antistoffene ifølge oppfinnelsen vil fortrinnsvis ha tilsynelatende CD23-bindende affiniteter i området fra 0,1 til 1000 nM, mer foretrukket minst 50 nM, og mest foretrukket minst 5 nM.

Vertsceller som er egnet for ekspresjon av rekombinante immunglobuliner, er velkjente på området. Rekombinante antistoffer kan for eksempel uttrykkes i ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO), DG44 eller DUXB11; eller CHO-celler CHO K-1; muse-myelomceller SP2/0 eller X63-Ag8.653 eller NSO; rotte-myelomceller YB2/0; babyhamster-nyreceller, BHK; human embryo-nyrelinje, 293; apenyreceller, CV1; humane lungefibroblaster, WI38; humane cervikal-karsinom-celler, HELA; insektceller, planteceller, gjærsopp eller i bakterier. Videre er vektorer egnet for ekspresjon av immunglobuliner også velkjente på området og er kommersielt tilgjengelige.

Et spesielt foretrukket vektorsystem er det translasjonelt svekkede vektorsystem beskrevet i US-patentsøknad nr. 08/147 696 som ble utstedt som U.S. Patent Nr. 5,648,267 15. juli 1997, som omfatter en translasjonelt svekket dominant selekterbar markør (neo) inneholdende et intron i hvilket en ønsket heterolog DNA er innført. Dette vektorsystem er blitt funnet å tilveiebringe meget høye utbytter av rekombinante proteiner, f.eks. immunglobuliner. Imidlertid kan de foreliggende anti- CD23-antistoffer dannes i hvilket som helst vektorsystem som er egnet for ekspresjon av funksjonelle immunglobuliner.

Humane monoklonale antistoffer kan være av typene gamma-1 eller gamma-3 som er spesifikke overfor human CD23. Metoder for isolering av humane monoklonale antistoffer er også velkjente på området og innbefatter in vitro-metoder, f.eks. in vitro-immunisering av humane B-celler i vevskultur, og in vivo-metoder, f.eks. syntese av humane monoklonale antistoffer i SCID-mus. En foretrukket måte til fremstilling av humane monoklonale antistoffer i SCID-mus som kombinerer in vitro-priming av humane miltceller som så innføres i SCID-mus, er beskrevet i US-patentsøknad nr. 08/488 376 som ble utstedt som U.S. Patent Nr. 5,811,524, 22. september 1998. Denne metode er fordelaktig, siden den gir repduserbar gjenvinning av monoklonale antistoffer med høy affinitet overfor et ønsket antigen, f.eks. et humant antigen.

De humane monoklonale antistoffer kan konkurrere med de monoklonale primat-anti-human CD23-antistoffer 5E8 og 6G5 med hensyn til binding til CD23.

EKSEMPEL 1

Fremstilling av primat- anti- CD23- antistoffer

Fem monoklonale primat-antistoffer spesifikke overfor CD23 ble isolert fra java-aper hovedsakelig ifølge metodikken beskrevet i patentsøknad nr.

08/379 072 (U.S. Patent Nr. 5,658,570), som er medtatt i det foreliggende som referanse. De nøyaktige anvendte teknikker er beskrevet detaljert nedenfor.

Metodikk for isolering og karakterisering av

monoklonale anti- human CD23- antistoffer

Rensing av immunooenet sCD23 fra 8866- celler

Under rensingen ble løselig CD23 (sCD23) kvantifisert ved hjelp av en tretrinns-ELISA-analyse under anvendelse av et muse-anti-CD23-antistoff (Binding Site; katalog nr. MC112) som oppfangingssubstans. Antigenet ble delvis renset fra kulturer av 8866-celler holdt i suspensjons-bioreaktorer under anvendelse av RPM11640 (JRH Biosciences; katalog nr. 56-509) supplert med 10% føtalt bovint serum (JRH Biosciences) og 4 mM glutamin (JRH Biosciences; katalog nr. 90114) ved 37°C. Karbondioksid ble anvendt til opprettholdelse av pH på 7,1. Etter fjerning av cellene ved hjelp av filtrering gjennom 0,45 |im, ble det tilsatt fenylmetylsulfonylfluorid (endelig konsentrasjon 0,2 mM, Sigma Chemical Co.; katalog nr. p-7626) og etylendiamintetraeddiksyre (endelig konsentrasjon 3 mM, Sigma Chemical Co.; katalog nr. EDS) til supernatanten, og løsningen ble oppbevart ved 2-8°C. Den cellefrie supernatant ble konsentrert omtrent 15-20 ganger under anvendelse av en hulfiber-ultrafiltreringspatron (A/T Technology; katalog nr. UFP-10-C-9A; 10 000 d MWCO) eller tangentialstrømnings-ultrafiltrerings-patron (Filtran Corporation; 10 000 d MWCO) ved omgivelsestemperatur. Den konsentrerte supernatant ble sterilfiltrert og oppbevart ved -70°C. Tinede konsentrater ble de-lipidert ved tilsetting av SM-2 BioBeads (BioRad Industries; katalog nr. 152-3920) i en konsentrasjon på 5 g/l og omrøring over natten ved 2-8°C. Harpiksen ble fjernet ved hjelp av filtrering, og løsningen ble oppbevart ved 2-8°C. Når det gjaldt en del preparater av sCD23, ble konsentratene fraksjonert under anvendelse av ammoniumsulfat (35-70% på vekt/volum-basis; Fisher, katalog nr. A702-3) før eller etter de-lipidering.

Den de-lipiderte løsning ble deretter renset ved anvendelse av affinitetskromatografi ved 2-8°C. Affinitetsmatriksen ble tillaget ved kovalent binding av et monoklonalt muse-anti-CD23-antistoff (BU38) til Sepharose under anvendelse av CNBr-aktivert Sepharose 4B (Sigma Chemical Co.; katalog nr. C-9142). BU38-antistoffet ble renset til > 90% homogenitet fra ascites (Binding Site; katalog nr. CUS830) under anvendelse av Protein A-kromatografi. Den de-lipiderte løsning ble påsatt på affinitetskolonnen (1,5 x 5 cm) ekvilibrert med 1XPBS (Gibco BRL; katalog nr. 70013-0,32), pH 7,2, og kolonnen ble vasket med 1XPBS, pH 7,2, inneholdende 0,05% NP40 (Sigma Chemical Co.) for fjerning av ikke-bundet protein. Løselig CD23 ble eluert under anvendelse av 3,5 M MgCI2 (Fisher; katalog nr. M33-500). Fraksjoner inneholdende sCD23 ble samlet og dialysert (Baxter Spectra/Por; katalog nr. D1615-1) mot 1XPBS, pH 7,2 ved 2-8°C. Etter dialysering ble proteinløsningen konsentrert ved hjelp av sentrifugering under anvendelse av sentrifugeringsfiltre av typen Centriprep 10 (Amicon Corporation; MWCO 10 000 d), og preparatene ble oppbevart ved -70°C. Renheten av sCD23 ble beregnet til > 70% ved anvendelse av SDS-PAGE-analyse (4-20% for-støpte geler, Novex Corporation) og Coomassie-farging.

Immunisering av primater oa isolering av immunceller

Cynomolgus-aper (White Sands Research Center, Alamogordo, New Mexico) ble immunisert med løselig CD23 som var blitt renset fra supernatanten fra humane RPMI 8866-celler (B-cellelymfom, Hassner og Saxon, J. Immunol., 132:2844 (1984)). Hver ape ble immunisert hver tredje uke med 200 ug løselig CD23 i 500 (il PBS blandet med 167 uJ Temuritide (hjelpe-peptid) (Sigma, St. Louis, MO, katalog nr. A-9519) og 333 uJ 3 X PROVAX® (IDEC Pharmaceuticals Corporation). Immuniseringen ble utført intradermalt, intraperitonealt, intramuskulært og subkutant. Titeren for anti-CD23-antistoffer i serum hos apene ble målt ved hjelp av ELISA for 8866-celler og sammenliknet med en for-blodtappings-prøve fra de samme aper.

Apen PRO 978, med en serumtiter på 50 000, ble avlivet, og milten og lymfeknutene ble fjernet ved kirurgi og transportert på is til IDEC Pharmaceuticals, nedsenket i sterilt RPMI-1640 (Gibco BRL, Gaithersburg, MD, katalog nr. 21870-050) supplert med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 2 mM natriumpyruvat og 50 |xg/ml gentamicin. Like etter ankomst ble milten homogenisert ved at den ble presset gjennom en metalltrådduk med en glasspistill. Røde blodlegemer ble lysert i en ammoniumklorid-basert hypotonisk buffer, og de gjenværende lymfocytter ble oppsamlet og vasket i RPMI-1640 minst 3 ganger. Lymfeknutene ble likeledes homogenisert til en enkeltcelle-suspensjon, oppsamlet og vasket minst 3 ganger i RPMI-1640.

Fremstilling av hvbridomer

Etter siste vask ble cellene tellet, og primatcellene oppnådd ovenfor ble deretter somatisk sammenkoplet med muse-human heterohybridom-cellelinjen H6K6/B5 (Carroll et al., J. Immunol. Methods, 89:61 (1986)) under anvendelse av standardteknikker (Boerner et al., J. Immunol., 147:86) (1991)) og utplatet i 96-brønnsplater (175 plater eller 14 700 brønner når det gjaldt milten, og 17 plater eller 1386 brønner når det gjaldt lymfeknutene) med 300 000 celler pr. brønn.

Denne metode innbefattet blanding av lymfocytter og den ovenfor identifiserte koplingspartner, i et forhold på 2:1, hvilke celler langsomt ble gjenoppslemmet i 50% PEG 1500 (Sigma, katalog nr. P5402) i 1 minutt. Disse celler fikk deretter hvile i 1 minutt og ble deretter videre langsomt gjenoppslemmet i overskudd av RPMI-1640. Deretter fikk cellene igjen hvile, denne gang i 15 minutter før en lett sentrifugering ved 250 x g. Cellene ble deretter gjenoppslemmet i RPMI-1640-vekstmedium, som var supplert med 20% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, natriumpyruvat, ikke-essensielle aminosyrer og 50 (ig/ml gentamicin, inneholdende 100 u.M hypoxantin, 16 u.M tymidin (Boehringer Mannheim, Tyskland, nr. 623091) og 5,8 |iM azaserin (Sigma, katalog nr. A 1164)

(HTA). HTA er et seleksjonsmiddel som gir overlevelse av vellykket koplede celler (primat-lymfocytt sammenkoplet med heterohybridom-koplingspartner).

Omtrent 65% av brønnene viste vekst (10 500 brønner). Disse brønner ble deretter undersøkt ved screening med hensyn til tilstedeværelse av anti-human CD23-antistoff ved hjelp av en tretrinns-celle-ELISA-analyse.

ELISA- metode

Det første trinn i ELISA omfattet overføring av 50 (il supernatant fra hver brønn til 96-brønns-plater som på forhånd var blitt belagt med 10<5> 8866-celler (CD23-positiv cellelinje) pr. brønn. Disse plater ble laget ved at platene først ble belagt med 50 (il vandig løsning inneholdende 20 ug/ml Poly L-Lysin (Sigma katalog nr. P1399, molekylvekt 150 000 - 300 000) i 30 minutter ved romtemperatur. Den gjenværende løsning ble fjernet («knipset ut»), og platene fikk stå og tørke. Straks de var tørre ble 50 (il 8866-celler i PBS overført og sentrifugert ved 600 g i 5 minutter. 8866-cellene ble kovalent bundet til platen ved tilsettig av 50 uJ 0,5% glutaraldehyd (Sigma katalog nr. G6257) i fosfatbufret saltløsning (PBS) i 15 minutter. Glutaraldehydet ble fjernet («knipset ut») og platene blokkert med 150 (il 100 mM glycin (Sigma katalog nr. G-2879) i 0,1% BSA-PBS. Etter tilsetting av supernatanter ble platene inkubert ved 37°C i 1 -2 timer og vasket 7-9 ganger med vann fra springen, og et geite-anti-human IgG-antistoff koplet til pepperrotperoksidase (HRPO) (Southern Biotech, Birmingham, Alabama, katalog nr. 2040-05) fortynnet 1:2000 i 1% tørr skummet melk (Vons) i PBS - 0,05% Tween 20 (Sigma, katalog nr. P1379) ble tilsatt. Platene ble inkubert i 45 minutter ved 37°C og igjen vasket 7-9 ganger i vann fra springen. Tilstedeværelse av HRPO ble påvist ved en fargeutvikling etter tilsetting av et TMF-reagens (Kirkegaard & Perry, Gaithersburg, MD, katalog nr. 50-76-02 og 50-65-02), 100 |il pr. brønn. Reaksjonen ble stoppet ved tilsetting av 25 uJ 4 N H2S04. Optisk densitet (OD) ble målt ved 470 nM på et spektrofotometer (Titertek Multiscan). OD-verdiene større enn to ganger bakgrunnen ble bedømt som positive.

Det annet trinn i ELISA ble utført for å bekrefte at supernatantene som var blitt bedømt som positive ved den første ELISA, reagerte overfor CD23 og ikke overfor et eller annet irrelevant antigen. Dette ble utført ved testing av supernatantene på SupT1 -celler (ERC BioServices Corporation, Rockville, MD, katalog nr. 100), en CD23-negativ humancellelinje, under anvendelse av den samme ELISA-metode. Supernatanter som ble bedømt likt i begge tester, ble kastet. Disse resultater tydet på at 56 av de 10 500 brønner med vekst viste tilstedeværelse av et monoklonalt primat-antistoff som ble bundet til 8866-celler i to atskilte screening-analyser på forskjellige tidspunkter og ikke ble bundet til SupT1 -celler.

Det tredje trinn i ELISA ble utført for bestemmelse av om hvorvidt supernatantene identifisert ifølge de første to ELISA-trinn reagerte med løselig CD23. Ved denne tredje ELISA ble 96-brønnsplater belagt ved 4°C over natten med 2 u.g/ml BG-6 (Biosource International, Camarillo, CA, katalog nr. CT-CD23-CF), et monoklonalt museantistoff som bindes til løselig CD23, men som ikke blokkerer CD23-lgE-binding, holdt i en 50 mM bikarbonatbuffer, pH 9,3. Etter fjerning av beleggingsbufferen ble 50 jxl halvrenset løselig CD23 i en for-bestemt fortynning i PBS tilsatt i platen og inkubert i 2 timer ved romtemperatur. Etter vasking av platen med vann fra springen 7-9 ganger, ble det tilsatt 50 uJ supernatanter fra utvalgte brønner. Etter vasking av platen med vann fra springen 7-9 ganger, ble det tilsatt 50 uJ kanin-anti-human IgG (muse-adsorbert)-HPRO (Southern Biotech, katalog nr. 6145-05) fortynnt 1:4000 i 1% tørr skummet melk i PBS med 0,05% Tween 20, dette ble inkubert i 2 timer ved 37°C, vasket 7-9 ganger med vann fra springen og fremkalt med TMB som beskrevet ovenfor. Brønner med OD høyere enn to ganger bakgrunnen ble igjen bedømt som positive.

Tjueen av de femtiseks brønner som viste binding til 8866-celler, ble også bundet til sCD23 ved ELISA-analysen. Disse brønner ble ekspandert og subklonet minst to ganger ved utplating av celler med 1 celle pr. 3 brønner. Etter omtrent 3 måneder ble det oppnådd 5 stabile hybridomer som dannet monoklonale primat-antistoffer overtor CD23.

Antistoffrensing ved hielp av protein A- metoder

Antistoffene renses hovedsakelig ved sentrifugering av dyrknings-supernatantene for fjerning av celler og rester. De resulterende sentrifugerte prøver blir så filtrert gjennom et 0,2 um filter. En protein A-sepharose-hurtigstrøm-ningskolonne blir så preparert og ekvilibrert under anvendelse av PBS (pH 7,4). Supernatanten blir så påsatt på kolonnen ved en passende strømningshastighet (2 ml/min). Etter påsetting vaskes kolonnen med 10 kolonnevolum PBS (pH 7,4). Antistoffet blir så eluert fra kolonnen med elueringsbuffer (0,2 M eddiksyre, 0,1 M glycin pH 3,5) ved en strømningshastighet på 1 ml/min. Énmilliliters-fraksjoner pr. rør (2,0 M Tris-HCI pH 10,0) innbefattende 100 (il Tris blir så oppsamlet. Deretter foretas spektrofotometeravlesninger ved 280 nm. De resulterende fraksjoner med høy absorbans ved 280 nm inneholdende antistoffet blir så oppsamlet og dialysert mot PBS over natten. Produktet blir så sterilisert ved hjelp av filtrering gjennom 0,22 u.m membran og oppbevart ved -20°C.

Fire av disse fem monoklonale primat-anti-human CD23-antistoffer (B3B11, 2C8, 5E8 og 6G5) ble påvist å inhibere IgE-dannelsen ved en in vitro-analyse som måler IgE-dannelsen ved kulturer av IL4-hydrokortison-induserte mononukleære celler fra perifert blod (PBMC). Disse resultater er vist på fig. 1. Analysebetingelsene er beskrevet nedenfor. Det femte monoklonale primat-anti-human CD23-antistoff 3G12 var inaktivt ved denne analyse.

IL- 4- Stimulert IgE- dannelse hos mononukleære celler fra perifert blod

Som omtalt ovenfor, ble de foreliggende primat-antistoffer og PRIMATIZED®-former derav vurdert med hensyn til sin evne til å inhibere IgE-dannelse ved et in vitro-forsøk som målte effekten av slike antistoffer på IgE-dannelsen ved IL-4-stimulerte mononukleære celler fra perifert blod.

Materialer for in vitro IL- 4- loE- forsøk

Flatbunnede 48-brønns-klaseplater (Costar katalog nr. 3548) (1,5 millioner PBMC pr. ml pr. brønn (48-brønnsplate))

Humant rekombinant IL-4 (Genzyme katalog nr. 2181-01; 10 ug (2,5 x 10<7 >enheter).

anti-CD23-Mab:

muse-Mab (MHM6; DAKO. katalog nr. M763)

primat-Mab (ingen konserveringsmidler)

PRIMATIZED® (ingen konserveringsmidler)

HB 101 basalmedium: (Irvine Scientific katalog nr. T000)

HB101 supplement: (Irvine Scientific katalog nr. T151)

Føtalt bovint serum: (FBS; Bio-Whittaker katalog nr. 14-501 F) dimetylsulfoksid: (DMSO; Fisher Scientific katalog nr. D128-500) hydrokortison: (Sigma katalog nr. H-0888)

puromycin: (Sigma katalog nr. P-7255)

cykloheksamid: (Sigma katalog nr. C-7698)

Histopaque®: (Sigma katalog nr. H-8889)

Hank's bufret saltløsning: (HBSS; Irvine Scientific katalog nr. 9232) 1%FBSiHBSS

konsentrert Dulbeccos fosfatbufret saltløsning (10x DPBS; Bio-Whittaker, katalog nr. 17-517Q)

Bath Clear Microbicide (Fisher, katalog nr. 13-641-334) i DPBS

Løsnin<g>er:

puromycin-løsning: 40 |xg/ml i HB101 vekstmedium cykloheksamidløsning: 200 rø/ml i HB101 vekstmedium hydrokortisonløsning: 0,1 M løsning i DMSO anti-CD23-muse-Mab ble dialysert grundig for fjerning av konserveringsmidler

In vitro- analvsemetode

Celler fra lettcellelaget (buffy coat) 1:4 fortynnes under anvendelse av HBSS ved romtemperatur. Disse celler fås fra fullblod etter inkubering over natten ved romtemperatur for oppløsing og separasjon av plasmakomponentene, klumpede blodplater og fibrin, og celler fra lettcellelaget (buffy coat).

Tretti mikroliter fortynnet buffy coat blir så lagt over 15 |il Histopaque i 50 ml koniske rør. Disse rør blir så sentrifugert i 20 minutter ved 1700 omdr. pr. min. ved romtemperatur uten bremser (IEC 216 svingebeholder-rotor). Det hvite PBMC-lag blir så oppsamlet under anvendelse av en steril pipette, idet man passer på ikke å forstyrre de andre sjikt. PBMC (mononukleære celler fra perifert blod) er buffy coat-cellene som er blitt bunnfelt ved sentrifugering delvis via en HISTOPAQUE®-densitetsgradient under dannelse av et tydelig synlig hvitt cellesjikt. Disse celler oppsamles med pipette, skylles med HBSS og telles deretter under anvendelse av et hemocytometer. Det kan typisk gjenvinnes fra 300 til 600 millioner PBMC fra en enkelt 450 ml buffy coat-mengde.

De oppsamlede PBMC blir så vasket 3 ganger i 1% FBS/HBSS. De vaskede celler oppsamles ved hjelp av sentrifugering i 7 minutter ved 1300 omdr. pr. min. ved 7°C.

Antallet oppsamlede celler bestemmes så under anvendelse av et hemocytometer. Cellekonsentrasjonen justeres til ca. 3 millioner celler pr. milliliter HB 101 vekstmedium.

Omtrent ca. 1,5 millioner celler (0,5 ml) tilsettes så i hver brønn i en 48 brønnsplate. Vanligvis tillages fem parallellprøver for hvert forsøk. Omkretsbrønnene i hver plate anvendes ikke for celleprøver. Følgelig fylles disse brønner f.eks. ved anvendelse av 0,5 ml 0,05% BathClear/DPBS.

0,5 ml vekstmedium HB101 inneholdende ønskede mengder IL-4 og Mab blir så tilsatt i brønnene. Det anvendte IL-4 er rekombinant DNA-dannet humant interleukin 4. Mab som anvendes ved analysen, er et muse-, primat- eller PRIMATIZED® -antistoff. IL-4 tilsettes typisk inntil et sluttkonsentrat på 100 E/ml, og Mab tilsettes inntil et sluttkonsentrat i området fra 0,01 til 3 ug/ml.

Cellene blir så inkubert i 9-11 dager ved 37°C i en fuktig inkubator innstilt på 5% C02. Etter inkubering oppsamles supernatantfluidene, og IgE-innholdet måles.

laE- ELISA

Følgende liste identifiserer materialer og løsninger som anvendes ved IgE-ELISA.

Materialer oa løsninger som er nødvendige for laE- ELISA

svovelsyre, 4 M

beleggingsbuffer: 10 mM natriumbikarbonatbuffer, pH 9,6

konsentrert fosfatbufret saltløsning (10x PBS) forrådsløsning:

blokkeringsbuffer: 10% FBS/PBS

fortynningsbuffer: 1% BSA/0,05% Tween 20/PBS

vaskebuffer: 0,05% Tween 20/PBS

geite-anti-humant IgE (epsilonkjede-spesifikt), umerket: (Tago katalog nr. 4104) humant IgE, standard: (The Binding Site katalog nr. BP094)

geite-anti-humant IgE, HRP-merket: (Tago katalog nr. AHI 0504) TMB-peroksidasesubstrat: (KPL katalog nr. 50-76-02)

peroksidaseløsning B: (KPL katalog nr. 50-65-02)

arbeids-substratløsning: bland substrat og løsning B i et forhold på 1:1

Immulon ll-mikrotiterplater (Dynatech Labs katalog nr. 011-010-3455)

laE- ELISA- metode

Hver brønn i en mikrotiterplate belegges under anvendelse av 100 (il av en beleggingsbuffer inneholdende 2 ug/ml geite-anti-humant Ige.

Den belagte plate blir så inkubert over natten ved 4°C.

Etter inkubering blir hver brønn i platen så vasket tre ganger med 200 |il Tween 20/PBS. Etter vasking blokkeres de ikke-spesifikke bindingssteder med 200 jil blokkeringsbuffer pr. brønn i 1 time ved 37°C.

100 uJ av prøver eller standarder blir så tilsatt i hver brønn, og brønnene inkuberes deretter over natten ved 4°C. Etter inkubering undersøkes prøvene med

eller uten fortynning. En standardkonsentrasjonskurve tillages for hver plate under anvendelse av flere fortynninger av IgE i området fra 0,1 til 50 ng/ml.

Etter inkubering over natten vaskes hver plate fem ganger med Tween 20/PBS.

100 uJ pepperrot-peroksidase-(HRP)-merket geite-anti-humant IgE fortynnet 1:10 000 i fortynningsbuffer blir så tilsatt i hver avrent brønn. Platen blir så inkubert i 4 timer ved 37°C.

Platene blir så vasket 5 ganger med Tween 20/PBS og 3 ganger med vann.

100 |xl 3,3'-5,5'-tetrametylbenzidin-arbeidssubstratløsning blir så tilsatt i hver brønn. Platen blir så inkubert i 25 minutter i mørke ved romtemperatur. Etter inkubering stoppes reaksjonen som er under utvikling, ved tilsetting av 50 jllI 4 M svovelsyre.

Absorbansen blir så avlest samtidig ved 450 og 540 nm. Absorbansverdiene ved 540 nm trekkes fra som bakgrunn.

Kd- målinas- forsøk for monoklonale primat- anti- human CD23- antistoffer Scatchard- analvsemetode

1. Radiomerkingsmetode

IODO-BEADS vaskes med 100 mN fosfatbuffer, pH 7,4, 2 ganger, under anvendelse av 1 ml buffer pr. 2 perler. Perlene blir så tørket på filterpapir.

De to perler tilsettes så til 100 uJ <125>l-løsning inneholdende ca. 1 mCi av I, fortynnes med 200 uJ av fosfatbufferen og får stå ved romtemperatur i 5 minutter.

Antistoffet (50 ug) tilsettes til de for-påførte perler. Reaksjonstiden for maksimal innlemming av radioaktivitet er 6 minutter.

Reaksjonen stoppes ved at det radiomerkede antistoff fjernes fra reaksjonsbeholderen.

Gelfiltrering utføres deretter for fjerning av overskudd av <125>l eller ikke-innlemmet <125>l fra den radiomerkede antistoffløsning. Dette utføres ved at det radiomerkede antistoff ledes over en kolonne som består av 1,5 ml Sephadex-G25,1,5 ml DEAE Sephadex-A25 og 0,5 ml Amberlite. Det radiomerkedé antistoff elueres fra i et totalt volum på 5 ml og ved en konsentrasjon på ca. 10 ug/ml.

(Elueringsbuffer: 1XPBS inneholdende 10% gelatin, 2% natriumazid og 1% BSA).

2. Optimaliseringsforsøk (direktebindingsundersøkelse)

Den spesifikke aktivitet av den radiomerkede løsning på 10 ug/ml bestemmes ved at det uttas en 1 uJ prøve, som kjøres på en gammateller.

Eksempel:

1 x 10<5> cpm (tellinger pr. minutt) /uJ x 1000 u.l/10 ug antistoff

1 x 10<7> cpm/ug antistoff

1 x 10<4> cpm/ng antistoff

Molekylvekt for antistoff = 75 000 ng/nmol

Spesifikk aktivitet:

1x10<4> cpm/ng x 75 000 ng/nmol = 7,5 x 10<8> cpm/nmol

Den antigenbelagte plate blokkeres (for eliminering av ikke-spesifikk binding, f.eks. med mB7.1-CHO) og bakgrunnsplaten (dvs. ikke-transfektert CHO) i 1 time ved romtemperatur med 200 uJ/brønn av blokkeringsbuffer (Blokkeringsbuffer: 1xPBS inneholdende 10% gelatin, 2% natriumazid, 1% BSA og 10% FBS).

Platen(e) blir så vasket, typisk 10 ganger for hånd med vann fra springen.

Det radiomerkede antistoff, 10 ug/ml, (50 uJ) blir så titrert ved to gangers seriefortynninger over platen(e) under anvendelse av en flerkanalpipette. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.

Platen(e) vaskes igjen ca. 6-7 ganger med 200 uJ vaskebuffer pr. brønn (Vaskebuffer: "IxPBS inneholdende 10% gelatin og 2% natriumazid).

Radioaktivitetstellingene i hver brønn blir så bestemt ved at brønnene kjøres på en gammateller.

Den optimale konsentrasjon av radiomerket antistoff er den konsentrasjon hvor forskjellen mellom de spesifikke tellinger og bakgrunnstellingene er ved et maksimum,.

3. Scatchard-analyse ved konkurranseforsøk

Den radiomerkede løsning på 10 ug/ml fortynnes til den optimale konsentrasjon bestemt i direktebindingsforsøket.

Den antigen-belagte plate og bakgrunnsplaten blokkeres i 1 time ved romtemperatur med 200 jil blokkeringsbuffer pr. brønn.

Platen(e) vaskes deretter, f.eks. ca. 10 ganger, for hånd med vann fra springen.

Det «kalde» (ikke radiomerkede) antistoff blir så titrert ved to gangers fortynninger i en separat U-bunns-mikrotiterplate. Utgangskonsentrasjonen for det «kalde» antistoff bør være minst 100 ganger større enn den optimale konsentrasjon av radiomerket antistoff.

Eksempel:

Optimalt radiomerket kons.: 0,5 ug/ml

Konsentrasjonen av «kaldt» antistoff: 100 ug/ml (Bemerkning: 1:2 titrering i den første brønn vil justere konsentrasjonen av det «kalde» antistoff til 50 ug/ml). 50 |il optimalt radiomerket antistoff pr. brønn tilsettes så i brønnene inneholdende «kaldt» antistoff.

100 |il pr. brønn av den blandede løsning overføres deretter til de tilsvarende brønner i den antigenbelagte plate og inkuberes i 1 time ved romtemperatur.

Det er dessuten ønskelig at følgende kontroller utføres:

a) Direkte binding av radiomerket antistoff til antigenbelagt plate (5 brønner), b) Direkte binding av radiomerket antistoff til bakgrunnsplate (5 brønner).

Etter inkubering vaskes platen(e), f.eks. ca. 6-7 ganger, med 200 ul

vaskebuffer pr. brønn.

Radioaktivitetstellingene i hver brønn blir så bestemt ved kjøring av brønnene på en gammateller.

Disse beregningene bestemmes ved beregning av de spesifikke tellinger i hver undersøkt brønn ved at bakgrunnstellingene trekkes fra tellingene bundet til den antigenbelagte plate.

4. Beregninger for Scatchard-analyse

Den molare konsentrasjon av bundet antistoff [B] kan så bestemmes som følger:

Eksempel: Med 50 ug/ml «kaldt antistoff»

Spesifikke tellinger bundet: 4382 cpm

Tellinger bundet i nærvær av 50 (ig/ml «kaldt» ab: 215 cpm

Differanse: 4382 cpm - 215 cpm = 4167 cpm

Spesifikk aktivitet (radiomerket ab): 5,54 x 10<9> cpm/mmol

4167 cpm -s- 5,44 x 10<9>cpm/nmol = 7,52 x 10"7 nmol

7,53 x 10*7 nmol + 0,05 ml (prøvevolum)

= 1,50 x 10"5 nmol/ml

= 1,50 x 10'8 umol/ml

[B] =1,50x10'11 mmol/ml (M)

Total molar konsentrasjon [T] bestemmes som følger:

50 u.g/ml x 1 umol/75 000 u.g = 6,67 x 10"4 u.mol/ml

= 6,67 x 10'7 mmol/ml (M)

[T] = 66667 x 10'11 mmol/ml (M)

Fritt antistoff [F] bestemmes som følger:

Fri molkons. = totalt minus bundet

[F] = (66667 x 10"<11>) - (1,50 x 10"<11>)

= 66665,5 x 10"11 mmol/ml (M)

Beregn B/F.

Avsett B sammenstilt med B/F på dataprogramvare av typen Cricket Graph.

Aktivitet oa affinitet av anti- human CD23- antistoffer ifølge oppfinnelsen Fire av de fem isolerte monoklonale primat-anti-human CD23-antistoffer (B3B11, 2C8, 5E8 og 6G5) ble funnet å inhibere IgE-dannelsen ved den ovenfor identifiserte in vitro-analyse som måler IgE-dannelsen ved kulturer av IL-4-hydrokortison-induserte mononukleære celler fra perifert blod (PBMC). Disse resultater er vist på fig. 1. Det femte monoklonale primat-anti-human CD23-antistoff 3G12 var inaktivt ved denne analyse.

To av de fire monoklonale primat-anti-human CD23-antistoffer (B3B11 og 2C8) som var funnet å være aktive ved denne in vitro-analyse, ble funnet å konkurrere med et kommersielt tilgjengelig muse-anti-human CD23-antistoff MHM6 (CAKO A/S, Glostrup, Danmark, katalog nr. M763). (Fig. 2, topp-diagram). Ved gjentatte analyser var imidlertid ikke disse antistoffer så potente IgE-inhibitorer som MHM6 (data ikke vist). I motsetning til dette ble de andre monoklonale primat-anti-human CD23-antistoffer (5E8 og 6G5) funnet å konkurrere med hverandre og konkurrerte ikke med MHM6. (Fig. 2, midtre og nederste diagram). Videre ble det monoklonale primat-anti-human CD23-antistoff 5E8 funnet å være en potent inhibitor for IL-4-indusert IgE ved in vitro-analysen.

(Se fig. 1 og 3).

Modifisert Hu- SCID- musemodell for syntese av humant IgE oa måling av inhiberinaen av IL- 4- indusert IgE- dannelse ved anti- CD23- antistoffer in vivo En modifisert hu-PBMC-SCID-musemodell ble også utviklet for påvisning av virkningen av de foreliggende antistoffer på indusert dannelse av humant IgE in vivo. PBMC tatt fra to donorer ble dyrket med IL-4 in vitro i 2 dager. PBMC ble blandet og anvendt til rekonstituering av grupper av C.B.-17 SCID-mus med og uten antistoffer. Musene ble tappet for blod på dag 14, 21, 28 og 35, og serum-IgG og -IgE-nivåer ble bestemt ved hjelp av ELISA. Denne in vivo-modell ble anvendt til analysering av primat-antistoff og to forskjellige typer av PRIMATIZED®-antistoffer overfor CD23 med hensyn til deres evne til inhibering av dannelsen av IgE.

En modifisert SCID-musemodell ble anvendt på grunn av at det er kjent at mus av typen C.B.-17, med kraftig kombinert immunmangel [scid/scid (SCID)]

(Bosma et al., Nature, 301:527 (1983)) rekonstituert med humane mononukleære celler fra perifert blod (hu-PBMC-SCID) kan danne betydelige mengder av humane immunglobuliner (lg) (Mosier et al., Nature, 335:256 (1988); Mosier et al., J. Clin. Immunol., 10:185 (1990); Abedi et al., J. Immunol., 22:823 (1992); og Mazingue et al., Eur. J. Immunol., 21:1763 (1991). Den fremherskende isotype av humant immunglobulin (lg) dannet i hu-PBMC-SCID-mus er IgG. Vanligvis finnes IgM-, IgA- og IgE-isotyper i meget lave eller ikke-påvisbare nivåer, bortsett fra i tilfeller hvor PBMC fås fra donorer med visse autoimmune eller allergiske sykdomstilstander. Det er også rapportert at manipulering av hu-PBMC-SCID-musemodell med visse cytokiner kan tilveiebringes for dannelse av betydelige nivåer av ikke-lgG-isotyper, innbefattende IgE (Kilschherr et al., Cellula Immunology, 151:241 (1993); Spiegelberg et al., J. Clin. Investigation, 93:711

(1994); og Carballido et al., J. Immunol., 155:4162 (1995)). hu-PBMC-SCID er

også blitt anvendt til frembringelse av antigenspesifikt lg under forutsetning av at donoren er blitt primet med hensyn til antigenet in vivo.

Målet hos de nærværende oppfinnere var derfor fokusert på opprettelse av en passende humant IgE-dannende hu-PBMC-SCID-musemodell som kunne anvendes til testing av effektiviteten av terapi for behandling av IgE-tilknyttede sykdommer så som allergiske forstyrrelser, innbefattende de foreliggende anti-CD23-antistoffer.

Materialer og metoder:

Følgende materialer og metoder ble anvendt i hu-PBMC-SCID-musemodellen beskrevet nedenfor.

SCID-mus: C.B-17 scid/scid-immunmangelmus ble anskaffet fra Taconic (C.B. -17/lcrTac-scidfDF) og holdt i IDEC Pharmaceuticals' dyrefasilitet. Musene ble oppbevart i steriliserte mikrobarriere-enheter med sterilisert strø-underlag. Dyreundersøkelser ble utført i henhold til «Guide for the Care and Use og Laboratory Animals» spesifisert av The Committee on Care of Laboratory Animal Resources Commission on Life Science-National Research Council (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHHS Publ. nr. (NIH) 86-23, Bethesda, MD, NIH, 1985).

Humane PBMC: PBMC ble isolert fra buffy coat anskaffet fra en blodbank, ved sentrifugering gjennom Ficoll-Hypaque (Histopaque-1077) som anbefalt av fabrikanten (Sigma Diagnostics katalog nr. 1077-1). Lymfocyttpreparater på grenseflaten av gradienten ble høstet og vasket tre ganger i Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (Bio-Whittaker katalog nr. 10-527F). For hvert forsøk ble PBMC tatt fra to atskilte donorer og dyrket separat in vitro. PBMC ble gjenoppslemmet i en konsentrasjon på 1-3 x 10<6> celler pr. ml i HB-Basalmedium pluss 1% HB101 lyofilisert supplement (Irvine Scientific katalog nr. T000 og T151) inneholdende 5% FCS pluss 1000 I E/ml av IL-4 (Genzyme, Inc., katalog nr. 2181-01) og inkubert i 48 timer ved 37°C med 5% C02. Etter inkubering ble cellene fra forskjellige buffy coat høstet, blandet og anvendt til rekonstituering av SCID-mus.

In vito- analvsebetinaelser

Grupper av mus (4-5 pr. gruppe) ble injisert med 56 x 106 lymfocytter i 200-300 |il volum HBSS intraperitonealt (i.p.) på dag 0. Når det gjaldt gruppene som fikk anti-CD23-antistoff, ble PBMC på dag 0 blandet med anti-CD23-antistoff (200-400 ug/mus) før i.p. injeksjon, og den annen injeksjon ble gitt på dag 7. Alle mus fikk 5000 IE pr. mus av IL-4 i.p. mellom dag 0 og dag 5. En gruppe som ikke ble injisert med antistoff, tjente som kontrollgruppe. Blod ble tatt fra musene via en retro-orbital vene, og serum ble analysert med hensyn til IgG og IgE på dagene 14, 21, 28 og 35 ved hjelp av ELISA.

Fig. 8 viser at det monoklonale primat-anti-human CD23-antistoff 5E8 er effektivt når det gjelder inhibering av IL-4-indusert IgE-dannelse in vivo hos SCID-musemodellen.

Kloning oa ekspresjon av monoklonale PRIMATIZED®- anti- human CD23-antistoffer

For kloning av variable primat-immunglobulin-doméner ble Poly A+ RNA isolert separat fra omtrent 2 x 106 celler fra primat-heterohybridomene som utsondrer de monoklonale anti-human CD23-antistoffer 6G5 og 5E8, ved anvendelse av mRNA-isolasjonssettet Micro-FastTrack (Invitrogen katalog nr. K1520-02) i henhold til metoder angitt av fabrikanten.

Den første kjede av cDNA ble syntetisert ut fra poly A+-RNA ved anvendelse av cDNA-cyklussettet (Invitrogen katalog nr. L1310-01) ifølge vanlige metoder.

De variable lett- og tungkjede-områder av 6G5 og 5E8 ble deretter isolert ved hjelp av PCR fra cDNA under anvendelse av PCR-primere som ble valgt basert på forskjellige konsenus-familier av humane immunglobuliner. Det ble valgt 5'-primere som svarte til begynnelsen av ledersekvensene av det variable lett- og tungområde, og det ble valgt 3'-primere som svarte til J-området (De spesifikke primere som ble anvendt for PCR-amplifikasjon av det variable lambda-lettkjede-doméne av 6G5, det variable kappa-lettkjede-doméne av 5E8 og de variable tungkjededoméner av 6G5 og 5E8, er oppført i tabellene 1-3). PCR ble utført i henhold til standardmetoder (30 sykluser med 1 minutt ved 94°C, VÆ minutt ved 54°C og 2 minutter ved 72°C i et Hot-start 100-rør (Gibco BRL katalog nr. 10332-013). PCR ble oppsatt i 50 \ i\ reaksjoner inneholdende 5 ul av 80 uJ cDNA (fra 2 x 10<6> celler) som templat, 2 uJ av 5 nM dNTP, 1 uJ av Taq-polymerase, 5 uJ Taq-polymerasebuffer, 2 ul av 5'-primeren (25 pm ol/ul), 2 ul av 3'-primeren (25 pmol/ul) og 36 uJ vann. (Taq-polymerase og buffer ble anskaffet fra Stratagene, katalog nr. 600131, dNTP fra Boehringer Mannheim katalog nr. 1581295).

A) Konstruksjon av plasmidene N5LG1 + 6G5 oa N5LG4P + 6G5

1) Kloning av det variable lettkiede- doméne av monoklonalt primat- anti- human CD23- antistoff 6G5 ved hielp av PCR

Den første PCR-amplifikasjon av det variable lettkjedeområde fra cDNA for monoklonalt primat-antistoff 6G5 viste bånd som var i overensstemmelse in situ med det variable lambda-lettkjedeområde. Disse bånd viste seg ved alle reaksjoner hvor de tre forskjellige tidlig-ledersekvens-primere ble anvendt. (Se tabeller 1-3). Imidlertid ble PCR-produktet oppnådd ved anvendelse av primer 745 (familie 2) ansett for mer spesifikt, på grunn av den forholdsvis større intensitet av PCR-produktbåndet.

Dette PCR-produkt ble isolert under anvendelse av et Qiaquick gelekstraksjonssett (Qiagen katalog nr. 28704). Det rensede PCR-fragment ble nedbrutt med restriksjons-endonukleasene Bgl II og Avr II og ligert i pattedyr-ekspresjons-vektoren N5LG1 som ble nedbrutt med de samme restriksjonsendonukleaser. 20 uJ av ligeringsblandingen inneholdende det rensede PCR-produkt fra én 50 uJ PCR-reaksjon, 100 mg N5LG1-vektor, 2 |il 10 x ligeringsbuffer (NEB katalog nr. 202S) og 2 uJ T4-ligase (NEB katalog nr. 202S) ble deretter inkubert ved 14°C over natten.

Pattedyr-ekspresjonsvektoren N5LG1 inneholder genetiske sekvenser (f.eks. regulatorsekvenser, kodingssekvenser) som tilveiebringer ekspresjon av 4 atskilte proteiner i en pattedyr-celle. De er: (i) en partial-immunglobulin-lettkjede med det humane konstante lambda-lettkjedeområde og unike restriksjonsendonuklease-seterfor innføring av variable lettkjede-doméner; (ii) en partial-immunglobulin-tungkjede med sekvensene som koder for det humane konstante gamma 1-kjedeområde, og unike restriksjonsendonukleaseseter for innføring av variable tungkjededoméner; (iii) et neomycin-fosfotransferase-gen anvendt til utvelging av celler som har innlemmet plasmidet og er resistente overfor antibiotikumet Geneticin (Gibco BRL katalog nr. 10131-1209); og (iv) Et muse-dihydrofolat-reduktasegen (DHFR) som gir seleksjon og genom-amplifikasjon når celler dyrkes i nærvær av metotrexat (MTX, Sigma katalog nr. A-6770) (Reff et al., Blood, 83:433-445 (1994).

Etter ligering ble blandingen nedbrutt under anvendelse av Pme I-restriksjonsendonuklease, som nedbryter moder-N5LG1-plasmidet, men ikke N5LG1-plasmidet som er blitt ligert til det variable lette doméne av 6G5. Etter nedbryting ble blandingen transformert til kompetente Epicurian coli® XL1 -Blue-celler (Stratagene katalog nr. 200249) som følger.

100 uJ kompetente celler ble blandet med 10 (il av ovennevnte ligeringsblanding, satt på is i 30 minutter og deretter oppvarmet ved 45°C i 30 sekunder. Denne blanding ble anbrakt på is i 2 minutter, og 900 (il SOC, for-varmet til romtemperatur, ble deretter tilsatt. (SOC er LB-buljong Gibco BRL katalog nr. 10855-013, pluss 0,02 M MgCI2, 0,02 M MgS04 og 0,02 M D-glukose). Etter inkubering ved 37°C i 1 time ble blandingen sentrifugert ved 4000 g i et minutt, og 800 (il supernatant ble kastet. Resten av blandingen ble utplatet på en LB-agar (Gibco BRL katalog nr. 12945-044) inneholdende 50 ug/ml ampicillin (Amp, Gibco, BRL katalog nr. 13075-015). Plasmid-DNA ble isolert fra individuelle kolonier av E. Coli som vokste på Amp-platen, ved anvendelse av DNA-rensesystemet av typen Wizard® Miniprep (Promega katalog nr. A7510).

Den isolerte plasmid-DNA ble deretter karakterisert ved nedbryting med Bgl II og Avr II, fulgt av agarosegel-elektroforese. Et etidiumfarget DNA-bånd på 400 bp tydet på en potensielt vellykket kloning av et variabelt lettkjede-doméne.

For bekreftelse av at dette var et variabelt immunglobulin-lettkjede-doméne ble sekvensering utført under anvendelse av Sequenase 7-Deaza-dGTP DNA-sekvenseringssettet (USB katalog nr. 70990) med sekvenseringsprimere 607 og GE 108. (Se Sekvenseringsprimere i tabell 4).

En andre uavhengig PCR-amplifikasjon av den lette kjede fra cDNA for monoklonalt primat-antistoff 6G5 ble utført under anvendelse av en 5'-primer-tidligledersekvens av lambda-lettkjedefamilie 2 (primer 745) og 3'-J-områdeprimeren 926. (Se Primere for PCR av det variable lambda-lettkjede-doméne av 6G5 i tabeller 1-3). Det isolerte PCR-produkt (se teknikk ovenfor) ble klonet i TA-vektor ved anvendelse av det originale TA-kloningssett (Invitrogen katalog nr. K2000-01). Den isolerte miniprep-DNA (se teknikk ovenfor) ble undersøkt under agarosegel-elektroforese etter nedbryting med EcoRI-restriksjonsendonuklease. Det resulterende PCR-produkt som befant seg i TA-vektoren, ble så sekvensert (som beskrevet tidligere) under anvendelse av Sp6- og M13-(-40)-foroverprimere (se Sekvenseringsprimere i tabell 4). Den resulterende lettkjedesekvens var identisk med sekvensen for lett kjede fra den første PCR. Hele denne sekvens av det variable lettkjede-doméne av monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff 6G5 er vist nedenfor.

Variabelt lettkiedeområde av monoklonalt primat- anti- human CD23- antistoff 6G5

Leder

Ferdig protein ( Nummereringen er Kabat)

Rammeverk 1

CDR 1

Rammeverk 2

CDR2 Rammeverk 3 CDR3 Rammeverk 4

2) Kloning av det variable tunakiededoméne av monoklonalt primat- anti-human CD23- antistoff 6G5 ved hielp av PCR

Den første PCR-amplifikasjon av det variable tungkjededoméne fra cDNA av monoklonalt primat-antistoff 6G5 ble utført ved anvendelse av settet av tidlig-ledersekvens-primere beskrevet ovenfor og 3'-J-områdeprimeren GE244. Disse primere er oppført i tabeller 1-3 nedenfor. Denne reaksjon resulterte i et PCR-produkt på 350 baser. Dette 350 base-produkt (renset som beskrevet ovenfor) ble nedbrutt med Nhe I og Sal I, og ligert i N5LG1 og nedbrutt med de samme endonukleaser som ved den første PCR-amplifikasjon. Den resulterende ligeringsblanding ble transformert i vertsceller under anvendelse av samme teknikker for kloning av den lette kjede. Plasmid N5LG1 inneholdende PCR-produktet på 350 baser ble deretter isolert og sekvensert (under anvendelse av sekvenseringsprimere 266 og 268). (Disse sekvenseringsprimere er oppført i tabell 4).

Sekvenseringen viste at PCR-produktet bare inneholdt en del av det tunge variable doméne og omfattet en delesjon i sin aminoterminale ende (sekvensen startet ved rammeverk 2, kodon 36).

En andre uavhengig PCR-reaksjon ble utført for amplifikasjon og isolering av det variable tungkjededoméne av monoklonalt primat-antistoff 6G5 under anvendelse av en 5'-tidligledersekvensprimer for familie 1 (MB1503) og en 3'-J'-områdeprimer GE244. (Disse primere finnes også i tabeller 1-3). Det resulterende PCR-produkt ble deretter klonet i N5LG1 under anvendelse av samme teknikker som beskrevet ovenfor. Dets sekvens ble funnet å være identisk med sekvensen for det første PCR-produkt.

For kloning av hele det variable tunge doméne av 6G5 innbefattende den manglende 5'-terminale ende, ble det derfor anvendt en ny lengre 3'-primer (MB1533) som innbefattet CDR3- og rammeverk 4-områdene av den tunge variable 6G5-kjede, ved en tredje uavhengig PCR-reaksjon med familie 1-5'-primeren (MB1503). (Disse primere er også oppført i tabeller 1-3).

Etter PCR ble det observert et større PCR-produkt på 420 baser på agarosegelen. Dette PCR-produkt ble isolert som beskrevet tidligere, og klonet i en TA-vektor. Det resulterende PCR-produkt som befant seg i TA-vektoren, ble deretter sekvensert. Sekvensering viste at denne DNA inneholdt hele det variable tunge doméne, og at 3'-delen var identisk med denne del av tidligere klonet variabelt partial-tungkjededoméne fra de første to PCR-reaksjoner.

En fjerde uavhengig PCR ble utført under anvendelse av de samme primere som ved den tredje PCR-amplifikasjon. Dette resulterte i et PCR-produkt som ble isolert og klonet i TA-vektoren som beskrevet tidligere. Sekvensen for det fjerde uavhengige PCR-produkt ble funnet å være identisk med den som ble oppnådd ved den tredje PCR-amplifikasjon. Denne sekvens, som omfatter det variable tungkjededoméne av monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff 6G5, er vist nedenfor.

Variabelt tunakiedeområde av monoklonalt primat- anti- human CD23- antistoff 6G5

Leder

Ferdig protein ( Nummereringen er Kabat) Rammeverk 1

Rammeverk 2

Rammeverk 3 Rammeverk 4

3) Konstruksjon av pattedvr- ekspresionsvektorer

For innføring av de klonede variable tungkjededoméner av 6G5 i en pattedyr-ekspresjonsvektor ble det variable tungkjededoméne i TA-vektoren (oppnådd ved den tredje uavhengige PCR) nedbrutt med Nhe I og Sal I og klonet i N5LG1-vektoren, som ble nedbrutt med de samme restriksjonsenzymer, og hvilken vektor allerede inneholder det variable lettkjede-doméne. Den resulterende pattedyr-ekspresjonsvektor ble kalt N5LG1 + 6G5.

For konstruksjon av N5LG4P + 6G5-vektoren ble både de variable lettkjede- og tungkjededoméner isolert fra N5LG1 + 6G5 ved nedbryting av henholdsvis Bgl II og Avr II og Nhe I og Sal I. Pattedyr-ekspresjonsvektoren N5LG4P er identisk med N5LG1-vektoren beskrevet ovenfor, bortsett fra at den humane gamma 1 var erstattet med et humant konstant gamma 4-område inneholdende en mutasjon av et serin til et prolin i hengselområdet for øking av stabiliteten av immunglobulinet og forbedring av farmakokinetikken in vivo («P»-mutasjon). Det variable lettkjede-doméne ble først klonet i plasmidet, og det variable tungkjede-doméne ble klonet i vektoren inneholdende det variable lettkjede-doméne under anvendelse av teknikker beskrevet tidligere. Denne pattedyr-ekspresjonsvektor ble kalt N5LG4P + 6G5.

B. Konstruksjon av plasmidene N5KG4P + 5E8. N5KG1 + 5E8. N5KG4P + 5E8N- og N5KG1 + 5E8N-1. Kloning av det variable lettkiede- doméne av monoklonalt primat- anti- human CD23- antistoff 5E8 ved hielp av PCR

Den første PCR-reaksjon av det variable lettkjede-doméne fra 5E8-CDNA ble utført under anvendelse av et sett av kappa-tidligledersekvens-primere og 3' J-områdeprimeren GE204. (Se primere for PCR av det variable kappa-lettkjede-doméne av 5E8 i tabeller 1-3). Et PCR-produkt på 420 baser ble oppnådd. Det isolerte PCR-produkt med 420 baser ble nedbrutt med Bgl II- og BsiW l-restriksjonsendonukleaser, klonet i pattedyr-ekspresjonsvektoren N5KG4P og sekvensert under anvendelse av GE108- og 377-primere (som finnes i tabell 4). Pattedyr-ekspresjonsvektoren N5KG4P er identisk med vektoren N5LG4P, bortsett fra at den inneholder det humane konstante kappa-lettkjedeområde i stedet for det humane konstante lambda-lettkjedeområde. Sekvensering av denne 420 polynukleotid-DNA viste at den inneholder hele det variable kappa-lettkjede-doméne.

En andre uavhenig PCR av det variable lettkjedeområde ble utført under anvendelse av 5'-familie 1-primeren GE201 og 3'-primeren GE204. (Se primere for PCR av det variable kappa-lettkjede-doméne av 5E8 i tabeller 1-3). Det isolerte PCR-produkt ble klonet i TA-vektoren (under anvendelse av metoder beskrevet tidligere) og sekvensert under anvendelse av Sp6- og T7-promotorprimere. Sekvensering viste at dette PCR-produkt var identisk med det som ble oppnådd ved den første PCR. Hele sekvensen av det variable lettkjede-doméne av monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff 5E8 er vist nedenfor.

Variabelt lettkjedeområde av monoklonalt primat- anti- human CD23- antistoff CD23

5E8

Leder

Ferdig protein ( Nummereringen er Kabat)

Rammeverk 1

Rammeverk 2 Rammeverk 3 Rammeverk 4

2) Kloning av det variable tunakiededoméne av monoklonalt primat- anti-human CD23- antistoff 5E8 ved hielp av PCR

Den første PCR for det variable tungkjededoméne av 5E8 ble utført under anvendelse av et sett av 5'-tidligleder-tungkjede-sekvensprimere og 3'-primeren

GE210. (Se primere for PCR for det variable tungkjededoméne av 6G5 og 5E8 i tabell 1). Et PCR-produkt med 420 baser viste seg i familie-3-primer-reaksjonen. PCR-produktet ble renset og deretter nedbrutt med Nhe I og Sal I og klonet i pattedyr-ekspresjonsvektoren N5KG4P-vektor (som beskrevet tidligere). PCR-produktet ble sekvensert under anvendelse av 268- og 928-primerne. (Se sekvensering av primere i tabell 4).

En andre uavhengig PCR for det variable tungkjededoméne av 5E8 ble utført under anvendelse av familie 3-5'-primeren GE207 og 3'-primeren GE210.

(Se primere for PCR for det variable tungkjededoméne av 6G5 og 5E8 i tabeller 1-3). Det isolerte PCR-produkt ble klonet i en TA-vektor under anvendelse av de samme teknikker som beskrevet tidligere, og sekvensert ved anvendelse av Sp6-og T7-primere. Sekvensering viste at TAC ved kodon 91 var blitt forandret til TGC.

For bestemmelse av det rette kodon ved 91 ble det utført en tredje uavhengig PCR under anvendelse av samme primere som ved andre PCR (se ovenfor). PCR-produktet ble igjen klonet i en TA-vektor og sekvensert under anvendelse av Sp6- og T7-primere. Sekvensen ble funnet å være identisk med den variable tungkjedesekvens oppnådd ved den første PCR. TGC i posisjon 91 i det andre uavhengige PCR-produkt er derfor tydeligvis resultatet av en feil som er innført under PCR. Hele denne sekvens av det variable tungkjededoméne i monoklonalt primat-anti-human CD23-antistoff 5E8 er vist nedenfor.

Variabelt tungkiedeområde av monoklonalt primat- anti- human CD23- antistoff 5E8

Leder

Ferdig protein ( Nummereringen er Kabat)

Rammeverk 1

Rammeverk 2

Rammeverk 3 Rammeverk 4

3) Konstruksjon av pattedvr- ekspresionsvektorer

Det variable tunge doméne i N5KG4P ble nedbrutt med Nhe I og Sal I, renset og klonet i N5KG4P som inneholder det variable lettkjededoméne av 5E8. Dette plasmid ble så nedbrutt med restriksjonsendonukleasene som beskrevet tidligere. Dette resulterte i en vektor som inneholdt både det lette og tunge variable doméne av 5E8. Denne vektor ble kalt N5KG4P + 5E8. De variable tunge og lette doméner av N5KG4P + 5E8 ble deretter begge innført i pattedyr-ekspresjonsvektoren N5KG1 for frembringelse av N5KG1 + 5E8-vektoren.

4) Forandring av en aminosyre i det variable tungkiedeområde av monoklonalt primat- antistoff 5E8 ved stedsoesifikk mutaaenese og konstruksjon av pattedvr- ekspresionsvektorer

Basert på sekvensen av variabelt 5E8-doméne er det et potensielt glykosyleringssted på immunglobulinet ved asparagin-kodon 75. Dette potensielle glykosyleringssted svarer til et konservert asparagin-tilknyttet glykosyleringsmønster med følgende tripeptidsekvens: (Asn) - (Hvilken som helst aminosyre bortsett fra prolin) - (Serin eller treonin). Det ble derfor dannet en glykosyleringsmutant av 5E8, som ikke ville være i stand til å glykosyleres i denne stilling på grunn av modifikasjon av dette glykosyleringsmønster, ved erstatting av asparagin-kodonet 75 med et lysin (som finnes i mange humane immunglobuliner i denne posisjon). Stedspesifikk mutagenese ble utført ved hjelp av følgende metoder.

Det ble utført en første PCR ved anvendelse av N5KG4P + 5E8 som templat og en 3'-primer (svarende til kodon 71-79) og som inneholder en mutasjon ved kodon 75 (AAC forandret til AAG, primer MB1654, og en 5'-primer i begynnelsen av ledersekvensen (primer MB1650). (Se PCR-primere anvendt for frembringelse av en glykosyleringsmutant til det variable tungkjedeområde av 5E8 oppført i tabell 5).

Det ble utført en andre PCR for den samme templat ved anvendelse av en 5'-primer (svarende til kodon 71-79) inneholdende samme mutasjon (primer MB1653) og en 3'-primer fra enden av rammeverk 4 (primer MB1651) (Se PCR-primere anvendt for frembringelse av en glykosyleringsmutant til det variable tungkjedeområde av 5E8 oppført i tabell 5).

Disse to PCR-produkter ble isolert og blandet i like molforhold. En tredje uavhengig PCR ble deretter utført under anvendelse av blandingen av det første og annet PCR-produkt som templat med en 5'-primer anvendt ved den første PCR (MB1650) og en 3'-primer anvendt ved den annen PCR (MB 1651). (Se PCR-primere anvendt for frembringelse av en glykosyleringsmutant til det variable tungkjedeområde oppført i tabell 5). PCR-produktet oppnådd ved den tredje PCR ble funnet å inneholde kodingsområdet for det variable tunge doméne av 5E8 hvor asparaginet 75 var blitt forandret til lysin.

Det tredje PCR-produkt ble renset, nedbrutt med restriksjonsendonukleaser Sal I og Nhe I og klonet i N5KG4P inneholdende bare det variable lette doméne. PCR-produktet ble sekvensert for bekreftelse av at det omfattet det variable tunge mutantdoméne. Dette pattedyr-ekspresjonsplasmid ble kalt N5KG4P + 5E8N-.

For konstruksjon av N5KG1 + 5E8N- ble både lette og tunge variable doméner fra N5KG4P - 5E8N- nedbrutt med henholdsvis Bgl II og BsiW I og Nhe I og Sal I. Det lette variable doméne ble klonet først, og deretter ble det tunge variable doméne innført i pattedyr-ekspresjonsplasmidet N5KG1 for dannelse av plasmidet N5KG1 +5E8N-.

Lettkiede Vk- 3'- primer ( BsiW I)

Lettkjede Vl- 3'- primer (Avr ID

Tunekiede- 3'- primer ( Nhe I)

C) Konstruksjon av aamma- 3- vektorer

Det finnes tallrike metoder for omdannelse av muse-antistoffer til kimærer hvor de konstante tung- og lettkjedeområder er substituert med humane typer, eller hvor alle, bortsett fra CDR (komplementære determineringsområder), er substituert med sine humane ekvivalenter. (Se King et al. Biochem. J. 281:317-23, 1992,Queen et al. Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86(24): 10029-33, 1989; Love et al. Methods Enzymol. 178:515-27, 1989; Hutzell et al. Cancer Res. 51:181, 1991; Chiang et al. Biotechniques 7(4):360-6, 1989; Heinreich et al. J. Immunof. 143:3589, 1989; Hardman et al. Int. J. Cancer 44:424, 1989; Orlandi et al. Proe. Nat. Acad. Sei. USA 86(10):3833-6, 1989).

Videre viser de foregående avsnitt spesifikt at konstruksjon av vektorer for ekspresjon av PRIMATIZED® gamma-1- og gamma-4-antistoffer kan utføres ved amplifikasjon av DNA som koder for de variable lett- og tungkjedeområder under anvendelse av PCR, og kloning av disse områder i en ekspresjonsvektor eller -vektorer som koder for de hensiktsmessige humane konstantområde-doméner. Det bør såldes være klart at det kan lages liknende konstruksjoner som koder for andre humane konstantområde-doméner, så lenge det er tilgjengelig hensiktsmessige pattedyr-ekspresjonsvektorer som også inneholder kloningssteder som muliggjør innføring av DNA for det amplifiserte variable område fra primat-antistoffene.

Det bør også være klart at PCR-primerne som anvendes til amplifikasjon av DNA for det variable område, kan utformes slik at de rommer forskjellige restriksjonskloningssteder avhengig av den anvendte vektor.

Vektorer som koder for konstantområde-doménet fra humant lgG3, er tilgjengelige på området og kan anvendes for konstruering av PRIMATIZED®-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse. Co et al. har for eksempel anvendt separate vektorer som uttrykker konstante humane lett- og tungkjede-områder, for konstruering av kimære og humaniserte antistoffer, og tilveiebringer tungkjedevektorer for både humant gamma-1 og gamma-3. For kloning av de variable doméne-områder av det aktuelle antistoff i disse vektorer anbringes det hensiktsmessig et Xbal-restriksjonssted like foran de konstante områder i Jk4- og JH3-intronsegmentene for henholdsvis de lette og tunge kjeder (Co et al., 1996, Cancer Res. 56:1118-1125; Co et al., 1991, J. Immunol. 148:1149-1154).

Ved utforming av PCR-primere som innbefatter Xbal-restriksjonssteder eller steder som frembringer de samme enkeltkjede-overheng som Xbal-restriksjonsenzymet (dvs. Nhel, Spel), kan således de variable områder fra et primat-antistoff knyttes sammen med det humane konstante gamma 3-område-doméne under anvendelse av vektorene beskrevet i Co et al. Alternativt kan det anvendes linkere eller adaptere for å gjøre kloningen lettere.

Det er også mulig å konstruere en cDNA-form av det humane konstante gamma-3-område ved anvendelse av DNA-synteseteknikker og å innføre det i N5KG1-vektorene beskrevet i det foreliggende i stedet for det humane konstante gamma-1-område mellom Nhel- og BamHI-stedene. Avhengig av hvilke restriksjonssteder som er mest hensiktsmessige for kloning av det spesielle aktuelle variable område, finnes det også andre gamma-3-vektorer som er beskrevet på området, og hvilket som helst av disse kan anvendes til konstruksjon og ekspresjon av gamma-3-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse. (Se for eksempel Parren et al., 1992, J. Immunol. 148(3) : 695-701; Steplewski et al., 1988, Proe. Nati. Acad. Sel. USA 85:4852-4856; og US-patent nr. 4 975 369, medtatt i det foreliggende som referanse).

D) Variasjoner av PRIMATIZED®- antistoffer

Foreliggende oppfinnelse omfatter også PRIMATIZED®-antistoffer inneholdende mutasjoner, substitusjoner eller delesjoner av det konstante område. Slike mutasjoner kan konstrueres under anvendelse av teknikker for stedrettet mutagenese som beskrevet ovenfor for glykosyleringsmutanten, som er velkjente teknikker for fagfolk på området.

De muterte antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er utformet med det formål å frembringe en ønsket forandring i nivået for terapeutisk effektivitet, dvs. ved FcR-binding. Det må imidlertid være klart at en eventuell mutasjon i det konstante område av antistoffene ikke bør forandre de grunnleggende effektorfunksjoner mediert ved gamma-1- eller gamma-3-konstantområde-doménene. Det kan også være mulig å forandre andre subklasser av gamma-antistoffer ved mutagenese slik at de har liknende effektorfunksjoner som et antistoff inneholdende et gamma-1- eller gamma-3-doméne. Slike antistoffer omfattes også av foreliggende oppfinnelse.

For eksempel er områdene av det konstante IgG-område som inngår ved FcR-binding og vekselvirkning med C1q-komplementkomponenten, blitt karakterisert, og det er blitt identifisert mutasjoner som enten øker eller reduserer bin-dingsaffiniteten. Som beskrevet i US-patent 5 648 260, medtatt i det foreliggende som referanse, ødelegger en forandring av Leu 235 til Glu i det humane konstante lgG3-område innvirkningen av mutanten for den humane Fc-gamma-R1 -reseptor. Videre tyder mutasjoner på nabo-steder eller nære steder i hengselbin-dingsområdet (dvs. erstatning av restene 234, 236 eller 237 med Ala) på at forandringer i restene 234, 235, 236 og 237 i det minste påvirker affiniteten for Fc-gamma R1-reseptoren.

Likeledes er det i US-patent 5 348 876, også medtatt som referanse, vist at ved reduksjon av lengden av hengselområdet i det human konstante lgG3-område og forandring av aminosyresekvensen i dette område ble Clq-binding og således komplement-mediert cytolyse ytterligere forbedret. Faktisk bandt variantene mer Clq enn viltype-lgG3 og mye mer enn lgG1.

Det er således klart ut fra teknikkens stand at mutasjoner kan anvendes til frembringelse av terapeutiske antistoffer med reduserte affiniteter for humane Fc-reseptorer, muligens for behandling av mildere medisinske tilstander. Dessuten kan det identifiseres mutasjoner som øker effektorfunksjons-aktiviteten, hvilket fører til sterkere former for terapeutisk anvendelse. Det må være klart at manipulasjoner av gen-sekvens for frembringelse av forandringer i medikament-effektiviteten er påtenkt og godt innenfor foreliggende oppfinnelses prinsipp og ramme.

E) Ekspresjon av PRIMATIZED®- antistoffer i ovarieceller fra kinesisk hamster

For isolering av PRIMATIZED®-antistoffene ble vektorene som koder for antistoffene, uttrykt i ovarieceller fra kinesisk hamster. under anvendelse av følgende protokoll.

En storskala-plasmid-DNA ble renset under anvendele av WIZARD® Maxipreps DNA-rensesystem (Promega katalog nr. A7421). Den rensede DNA ble nedbrutt med Ssp I og BspLlM 1 I, utfelt én gang med etanol og gjenoppslemmet i sterilt TE.

Renset, endonuklease-kuttet plasmid-DNA ble deretter innført i ovarieceller (dihydrofolat-reduktase minus DG44) fra kinesisk hamster (CHO) under anvendelse av elektroporering. Den anvendte elektroporeringsteknikk er beskrevet nedenfor.

Omtrent 1,6 x 10<8> CHO-celler ble sentrifugert i et sterilt Corning-rør med hensiktsmessig størrelse, i 1 minutt ved 1000 omdr. pr. min. Mediet ble fjernet, og cellene ble vasket i 15 milliliter steril iskald SBS (steril sakkarose-bufret løsning inneholder 272 mM sakkarose, 7 mM natriumfosfat pH 7,4, 1 mM MgCI2) og sentrifugert i 5 minutter ved 1000 omdr. pr. min. SBS ble fjernet, og cellene ble suspendert under anvendelse av frisk iskald steril SBS med en cellekonsentrasjon på 1 x 10<7> celler pr. ml, og fikk stå på is i 15 minutter. BTX 600-elektroporatoren ble slått på og for-innstilt på 230 volt, idet knappene for maksimal spenning ble innstilt på 500 volt/kapasitans og resistans. Kapasitansen ble innstilt på 400 mikrofaraday, og resistansen ble innstilt på 13 ohm (innstilling R1).

Plasmid-DNA (4 ug DNA eller 2 ug DNA) og 0,4 ml celler (4 x 10<6> celler) ble deretter anbrakt i BTX 0,4 ml-kyvetter (BTX katalog nr. 620). Cellene ble støtbehandlet ved at kyvetten ble anbrakt i BTX 600-stativet og den automatiske ladnings- og pulsknapp ble presset. Omtrent 20 atskilte elektroporeringer ble utført med hvert pattedyr-ekspresjonsplasmid.

Etter støtbehandling fikk kyvettene stå ved omgivelsestemperatur i 15 minutter. Cellene og DNA fra hver kyvette ble gjenoppslemmet i 20 ml CHO-SSFMII som ikke inneholdt noe hypoxantin eller tymidin (Gibco BRL katalog nr. 31033-012) til hvilken det var tilsatt HT-supplement (100 X supplement er 10 mM natriumhypoxantin, 1,6 mM tymidin Gibco BRL katalog nr. 11067-014). Cellene fra en enkelt elektroporert kyvette ble deretter utplatet i 96-brønnsplater (200 ul/brønn) og anbrakt i en 37°C C02-inkubator. Utvelgingen ble startet 2 eller 3 dager senere ved at mediet ble forandret til ovennenvte medium ved tilsetting av 400 mg/ml Geneticin® (G418, Gibco BRL katalog nr. 10131-019). Cellene ble dyrket ved 37°C, og cellemediet ble skiftet hver 3.-5. dag. Etter 16 dager viste det seg G418-bestandige kloner i brønnene, og supernatanten ble analysert med hensyn til antistoffekspresjon ved hjelp av ELISA. Klonene som hadde den høyeste ekspresjon, ble deretter ekspandert individuelt. Monoklonale antistoffer ble renset som beskrevet i det følgende.

Immunalobulin- ELISA

Plater (Immulon 2, Dynatech Laboratories, Inc., katalog nr. 011-010-3455) blir belagt over natten ved 4°C med 200 ng umerket geite-anti-humant IgG-antistoff med 100 [il pr. brønn. Dette utføres ved anvendelse av 20 ml umerket geite-anti-humant IgG pr. 10 ml beleggingsbuffer pr. plate (Boehringer Mannheim Ab katalog nr. 605 400). (1:500 fortynning av - 1 mg/ml forrådsløsning). Beleggingsbufferen blir så fjernet fra platene og tørket under anvendelse av papirhåndkle. Ett hundre mikroliter av en fortynningsbuffer pr. brønn blir deretter tilsatt.

Antistoffløsninger og standarder (100 ng/ml - 2,5 ng/ml) blir så tilsatt i to paralleller med 100 jil pr. brønn direkte til de 100 ml fortynningsbuffer. Antistoffløsningene og standardene holdes i fortynningsbuffer. De resulterende løsninger blir så inkubert i minst 1 time ved 37°C.

Etter inkubering fjernes innholdet i hver plate, og platene vasket med vann fra springen 5 ganger. Platene blir så tørket på et papirhåndkle.

Etter tørking av platene tilsettes så et andre antistoff med 100 jil pr. brønn. Dette annet antistoff er enten geite-anti-human Kappa-HRPO: tilsatt i en fortynning på 1/10 000 eller 1 uJ Ab/10 ml fortynningsbuffer pr. plate, levert fra Southern Biotechnology Associates, Inc., katalog nr. 2060-05 eller et geite-anti-human Lambda-HRPO; anvendt i 1/20 000 fortynning eller 1 uJ Ab/20 ml fortynningsbuffer pr. 2 plater (leveres fra Southern Biotechnology Associates, Inc., katalog nr. 2070-05).

Antistoffet og innholdet i platen får inkuberes i 1 time vd 37°C. Etter inkubering fjernes innholdet i hver plate. Platene vaskes igjen fem ganger med vann fra springen, og de vaskede plater tørkes. Til de tørkede plater tilsettes så HRPO-substrat (TMB Microwell - tokomponent) i en mengde på 100 uJ pr. brønn.

(5 ml TMB Peroksidasesubstrat + 5 ml Peroksidaseløsning B pr. plate (Kirdgaard and Perry Labs, TMB Microwell tokomponent-reagenser katalog nr. 50-76-00).

Reaksjonen stoppes ved tilsetting av 100 uJ 2M H2S04 i hver brønn når den svakeste standard (2,5 ng/ml) er synlig over bakgrunn. Den optiske densitet av brønner i platene avleses så under anvendelse av en plateavleser, f.eks. Molecular Devices Emax presisjons-mikroplateavleser innstilt på bølgelengde: OD 450 og OPT2 (OD 540).

ELISABUFFERE

Bele<gg>in<g>sbuffer

Fort<y>nnin<g>sbuffer

0,5% ikke-fet tørrmelk i PBS pluss 0,01% Thimerosal

Eksempler på ELISA-verdier oppnådd ved anvendelse av den ovenfor beskrevne analyse er oppført nedenfor.

STANDARDER I FORTYNNINGSBUFFER

Hensiktsmessig fortynning av forråds-AB (sterilfiltrert i normal saltløsning, proteinbestemmelse ved hjelp av OD) for oppnåelse av 1 mg/ml

EKSEMPEL:

Kimært ape/humant anti-CD4 (CE9.1) er 4,18 mg/ml

24 |il av ovennevnte i 76 uJ fortynningsbuffer er 1 mg/ml

50 uJ forråds-Ab (1 mg/ml) i 450 uJ fortynningsbuffer (F.B.) er 100 u.g/ml.

50 ul av ovennevnte blanding i 450 ul F.B. er 10 ua/ml

200 uJ av ovennevnte blanding i 1,8 ml F.B. er 1 u.g/ml

1 ml av ovennevnte blanding i 9 ml F.B. er 100 ng/ml <*>

5 ml av ovennevnte blanding i 5 ml F.B. er 50 ng/ml <*>

5 ml av ovennevnte blanding i 5 ml F.B. er 25 ng/ml <*>

4 ml av ovennevnte blanding i 6 ml F.B. er 10 ng/ml <*>

5 ml av ovennevnte blanding i 5 ml F.B. er 5 ng/ml <*>

5 ml av ovennevnte blanding i 5 ml F.B. er 2,5 ng/ml <*>

<*> Standarder anvendt i ELISA

Antistoffrensina ved hielp av protein A

Metode

Dyrkningssupernatanten sentrifugeres for fjerning av celler og rester. Sentrifugatet blir så filtrert gjennom et 0,2 um filter. En protein A-sepharose-hurtigstrømningskolonne (rekombinant protein A Sepharose-hurtigstrømning)

(Pharmacia Biotech katalog nr. 71-5000-09) blir så tillaget og ekvilibrert under anvendelse av PBS (pH 7,4).

Supernatanter) påsettes på kolonnen ved en hensiktsmessig strømningshastighet (f.eks. 2 ml/min). Etter påsetting vaskes kolonnen med 10 kolonnevolum PBS (pH 7,4). Antistoffet elueres fra kolonnen under anvendelse av en elueringsbuffer (0,2 M eddiksyre, 0,1 M glycin pH 3,5) ved en strømningshastighet på 1 ml/min. Det blir så oppsamlet 1 ml-fraksjoner pr. rør innbefattende 100 uJ Tris. Det foretas så en spektrofotometer-absorbansavlesning ved 280 nm. Antistoff-fraksjonene blir så oppsamlet og dialysert mot PBS (pH 7,9) over natten. Dialysatet blir så sterilisert ved filtrering gjennom en 0,22 u.m membran, og oppbevart ved -20°C.

Analyseresultater

Humant gamma-4-anti-human CD23-PRIMATIZED®-antistoffene som er beskrevet ovenfor, ble renset og analysert med hensyn til indusert IgE-inhiberende aktivitet in vitro. Disse resultater finnes på fig. 3 og 5. Dette ble utført under anvendelse av in vitro IL-4-lgE-analysen beskrevet ovenfor.

Disse analyseresultater viste overraskende at begge humant gamma-4-anti-human CD23-antistoffene ikke var så aktive som de tilsvarende primat-anti-human CD23-antistoffer, dvs. at de ikke inhiberte indusert IgE-dannelse in vitro i noen vesentlig grad.

På grunn av at primat 5E8 og p5E8G4P har et potensielt asparagin-tilknyttet glykosyleringssted i det variable tungkjedeområde, ble imidlertid virkningene av glykosyleringen på dette sted undersøkt. (Det ble funnet at begge disse antistoffer inneholder N-bundne oligosakkarider på dette sted. (Data ikke vist)). For forhindring av glykosylering ble derfor asparaginet på glykosyleringsstedet forandret til et lysin for eliminering av karbohydrat-tilsetting. Dette muterte antistoff ble kalt p5E8G4PN-. Analyseresultatene viste at dette antistoff oppførte seg identisk med p5E8G4P ved IL-4-lgE-analysen (se fig. 3) og viste også en identisk tilsynelatende affinitet Kd for human CD23. (Se fig. 4). Disse resultater tydet derfor på at forskjellen i IgE-inhibering observert fra 5E8-gamma 4-PRIMATIZED®-antistoffet sammenliknet med primat-5E8-antistoff ikke skyldtes glykosyleringsforskjeller.

De tre primat-antistoffer (p5E8G4P, p5E8G4PN- og p6G5G4P) ble deretter uttrykt som humant gamma-1-former under anvendelse av hovedsakelig samme metodikk. Alle de tre human gamma-1-anti-human CD23-antistoffer, betegnet henholdsvis p5E8G1, p5E8G1 N- og p6G5G1, ble funnet å være aktive ved in vitro IL-4/lgE-analysen (fig. 3 og 5).

p5EG1 ble funnet å være statistisk mer suppessivt enn p5E8G4P i en

konsentrasjon på 0,3 ug/ml (P [T,t] én hale + 0,0055) og 3 ug/ml (p [T<t] én hale + 0,0019). Dessuten er p5E8G1N- statistisk mer suppressivt enn p5E8G4PN- både ved 0,3 ug/ml (p [T<t] én hale + 0,0392) og 3 ug/ml (p [T<t] én hale + 0,0310) (fig. 3).

Likeledes inhiberte p6G5G1 fullstendig indusert IgE-dannelse ved en konsentrasjon på 3 mg/ml, mens p6G5G4P ikke inhiberte denne. (Disse resultater er oppført på fig. 5).

Disse resultater tydet således på at et aktivt Fc-område, spesielt av humant gamma-1, er signifikant for indusert IgE-inhibering ved anti-human CD23-antistoffer. Disse resultater tyder også på at humane anti-CD23-antistoffer inneholdende humane konstante gamma-3-områder vil være signifikante for indusert IgE-inhibering på grunn av at et konstant gamma-3-område bindes til de samme FcyR-reseptorer som gamma-1 bindes til og sannsynligvis vil formidle det samme resultat.

EKSEMPEL 2

For bekreftelse av vår hypotese med hensyn til Fc-effektordelens rolle ved IgE-inhibering av anti-human CD23-antistoffer ble et tredje primat-antistoff, betegnet 2C8, også vist å inhibere IgE in vitro, omdannet til et F(ab')2. IgE-inhiberende aktivitet ble bestemt under anvendelse av den samme IL-4/lgE-analyse som beskrevet tidligere.

Materialer

Følgende materialer ble anvendt i dette eksempel:

ImmunoPure F(ab')2 Preparation Kit (Pierce katalog nr. 44888) nedbrytningsbuffer: 20 mM natriumacetatbuffer, pH 4,5

0,1 M citronsyre, pH 3,0 (juster pH med NaOH)

0,1% natriumazid i vann

dialyseslanger; 50 000 molekylvekt-utelukkelse (Spectra Por katalog nr. 132 128)

rystevannbad som kunne opprettholde 37°C

polystyren-dyrkningsrør, 17 x 100 mm (Fisher katalog nr. 14-956-6B) BCA-proteinanalyse (Pierce katalog nr. 23224)

Centricon-50-konsentratorer (Amicon katalog nr. 4225).

Ekvilibrerina av immobilisert pepsin

0,25 ml av 50% oppslemningen av immobilisert pepsin tilsettes i et 17 x 100 mm testrør (0,125 ml gel). Det tilsettes så 4 ml nedbrytningsbuffer. Pepsinet blir så separert fra bufferen under anvendelse av serumseparatoren. Bufferen blir så kastet og vaskeprosessen gjentatt under anvendelse av ytterligere 4 ml buffer. Det immobiliserte pepsin blir så gjenoppslemmet i 0,5 ml nedbrytningsbuffer.

Preparering av kolonne av immobilisert protein A

Protein A AffinityPakO-kolonner og ImmunoPure bindings- og elueringsbuffere bringes til romtemperatur.

Preparering av 2C8 F( abVfragmenter

2C8 F(ab')2-fragmenter tillages ved hjelp av metoder som er velkjente på antistoff om rådet. Oppfinnerne valgte å anvende et kommersielt tilgjengelig utstyrssett, ImmunoPure F(ab')2 Preparation Kit (Pierce katalog nr. 44888) under anvendelse av fabrikantens oppskrifter. 10 mg lyofilisert 2C8-antistoff ble oppløst i 1 ml av en nedbrytningsbuffer (20 mM natriumacetatbuffer, pH 4,5). 1 ml av den antistoffholdige prøve ble deretter tilsatt i et rør inneholdende immobilisert pepsin.

Antistoffet og det immobiliserte pepsin ble deretter inkubert i 4 timer i et vannbad med høyhastighets-rysteinnretning ved 37°C (ved høy hastighet), idet man passet på å holde blandingen konstant under inkuberingen.

De resulterende solubiliserte F(ab')2- og Fc-fragmenter og de ikke-nedbrutte IgG ble deretter gjenvunnet fra den immobiliserte pepsin-gel under anvendelse av en serumseparator. Det ubearbeidede nedbrutte materiale ble så dekantert over i et rent rør.

For forøking av gjenvinningen av F(ab')2-fragmenter er det ønskelig at det immobiliserte pepsin deretter vaskes med 1,5 ml av ImmunoPure IgG-bindingsbufferen. Vaskevæsken tilsettes deretter til det ubearbeidede nedbrutte materiale.

Antistoff-fragmentene ble deretter gjenvunnet under anvendelse av en protein A-kolonne. Dette utføres ved åpning av en immobilisert protein A-kolonne. Man passer på å unngå at luftbobler trekkes inn i gelen. Lagringsløsningen (som inneholder 0,02% natriumazid) kastes.

Kolonnen med det immobiliserte protein A ble deretter ekvilibrert under anvendelse av 12 ml bindingsbuffer (holdt i ImmunoPure Preparation Kit). Kolonnen ble deretter overført til et 17 x 100 mm testrør i utstyrssettet (merket «F(ab')2») for oppsamling av eluat. 3 ml av det ubearbeidede nedbrytningsmateriale ble deretter påsatt på en kolonne og fikk strømme helt inn i gelen. Anvendelse av AffinityPak™-kolonner er ønskelig siden disse kolonner stopper strømningen automatisk når nivået når toppfritten.

Kolonnen ble så vasket under anvendelse av 6 ml bindingsbuffer. Eluatet som inneholdt F(ab')2-fragmenter, ble deretter oppsamlet. Dette eluat inneholder også små Fc-fragmenter som ikke lenger binder protein A (som ikke er bundet til Protein A-kolonnen). Imidlertid ble den vesentlige del derav eliminert ved dialyse.

Dialyse ble utført ved at man anvendte det F(ab')2-holdige eluat og dialyserte eluatet mot fosfatbufret saltløsning pH 7,4, under anvendelse av dialyseslange med en molekylvektutelukkelse på 50 000 for eliminering av de små Fc-fragmenter (Spectra Pur. katalog nr. 132 128).

Dette resulterte i en F(ab')2-fraksjon med en optisk densitet ved 280 nm på 0,707 (6 ml). Etter dialysering og konsentrering med Centricon-50-konsentratorer (Amicon katalog nr. 4225), ble 2C8 F(ab')2-produktet analysert med hensyn til proteininnhold under anvendelse av en BCA-proteinanalyse (Pierce katalog nr. 23224). Proteininnholdet ble funnet å være 3,76 mg pr. ml.

2C8 F(ab')2 ble analysert med hensyn til IgE-inhiberende aktivitet og ble funnet i det vesentlige ikke å kunne inhibere IgE-dannelse ved de samme in vitro-analyser som beskrevet tidligere. Disse resultater finnes på fig. 6. F(ab')2 ble faktisk funnet å motvirke de undertrykkende virkninger av indusert IgE på det monoklonale antistoff 2C8. Disse resultater er vist på fig. 7.

EKSEMPEL 3

Gamma 1- og gamma-4P-PRIMATIZED®-formene for monoklonalt primat-6G5 ble begge vurdert med hensyn til sin virkning på inhiberingen av indusert IgE-dannelse in vivo i SCID-musemodellen beskrevet tidligere. p5E8G1 N- ble funnet å være like effektivt som primat-5E8 med hensyn til inhibering av indusert IgE. (Se fig. 8 og 9). Skjønt verken primat 6G5 eller det primatiserte p6G5G4P var effektive når det gjaldt inhibering av indusert IgE in vivo, inhiberte primatisert p6G5G1 indusert IgE-dannelse. (Se fig. 9 og 10). Disse resultater underbygger videre vår konklusjon at et aktivt Fc-område har betydning for evnen hos et anti-human CD23-antistoff til effektivt å inhibere indusert IgE-dannelse.

Foreslått mekanisme

Skjønt resultatene ved foreliggende oppfinnelse på en avgjørende måte viser at et aktivt Fc-område er av betydning for evnen hos et anti-human CD23-antistoff til effektivt å inhibere indusert IgE-dannelse, er molekylmekanismen ikke blitt belyst. Det kan imidlertid fremsettes flere hypoteser.

For det første kan det være slik at anti-CD23-antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse virker slik at de utløser en liknende signaltransduksjonsvei som tydeligvis utløses ved tverrbinding av B-cellereseptor med anti-BCR-gamma-1 -antistoffer. Man har fremsatt den hypotese at nedreguleringen av antigenreseptor-signalisering i dette tilfelle er et resultat av ko-ligering av Fc gamma Ril og overflate-lg (B-cellereseptor) på samme B-celle, noe som fører til nedregulering av lg-ekspresjon. (D'Ambrosia et al., 1995, Science, 268:293-297; Ono et al., 1997, Cell90:293-301). Faktisk oppreguleres CD23 på overflaten av IgE-uttrykkende B-celler, slik at det er mulig at ko-ligering av CD23 og FcYRII-B-reseptoren via det konstante gamma-1-område resulterer i en liknende signaltransduksjonsvei.

Alternativt kan inhibering av indusert lgE-ekspresjon finne sted via tverrbinding av overflate-lgE på B-celler samtidig som Fc-området vekselvirker med en passende FcyR-reseoptor på en annen celletype, dvs. en dreper-T-celle, som så kan «instruere» B-cellen til å gjennomgå apoptose, eller føre til celledød på en annen måte (dvs. fagocytose). For eksempel foreslår US-patent nr. 5 543 144, medtatt i det foreliggende som referanse, en liknende mekanisme for inhibering av IgE-uttrykkende B-celler med anti-lgE-antistoffer. Som omtalt der, kan antistoffer i visse IgG-subklasser, så som muse-lgG2a og humant lgG1 og lgG3, mediere ADCC (antistoff-avhengig cellulær cytotoksisitet [Antibody Dependent Cellular Cytotoxicity]) utført av visse Fc-reseptor-bærende fagocyttiske leukocytter. For eksempel anvendes OKT3, et monoklonalt muse-lgG2a-antistoff spesifikt for humant T-celle-overflateantigen (som var det første monoklonale antistoffprodukt godkjent av FDA for markedsføring som terapeutisk middel) for pasienter for tilveiebringelse av hurtig uttømming av T-celler i blodet og for indusering av en immunundertrykket tilstand (for nyretransplantasjon). (P.S. Russel et al., Transpl. Proe. 17:39-41 (1985), OKT3, med en dosering på 5 mg/dag/individ, kan fullstendig uttømme sirkulerende T-celler. Man har antydet at de monoklonale antistoffer beskrevet i US-patent 5 543 144, spesielt i form av muse-gamma 2a-antistoffer eller humane eller humaniserte antistoffer som bærer humane gamma-1- eller gamma-3-kjeder, tømmer ut IgE-uttrykkende B-celler ved ADCC-mekanismen på liknende måte.

Uansett hva den aktuelle molekylmekanisme for inhibering av IgE-ekspresjon under anvendelse av anti-CD23-antistoffer kan være, er det imdlertid klart at Fc-området, og følgelig effektorfunksjonen, av anti-CD23-antistoffer er viktige faktorer. Siden komplement ikke er tilstede ved in vitro-analysene ifølge foreliggende oppfinnelse, er det, som omtalt tidligere, sannsynlig at fenomenet innbefatter én eller flere FcyR-reseptorer. Straks man har identifisert de aktuelle molekylkomponenter samt molekyler inne i de aktuelle celler som inngår ved signaltransduksjonsveiene, vil det være mulig å utforme andre terapeutiske midler som også kan anvendes til inhibering av indusert lgE-ekspresjon.

Anvendbarhet

På grunn av sin evne til effektivt å inhibere IgE-dannelsen, er de foreliggende anti-human CD23-antistoffer som omfatter humane konstante gamma-1-doméner, og slike som også kan konstrueres inneholdende gamma-3, effektive med hensyn til å behandle en eventuell sykdom hvor inhibering av IgE-dannelsen er terapeutisk ønskelig. Slike sykdommer innbefatter for eksempel allergiske sykdommer, autoimmune sykdommer og inflammatoriske sykdommer.

Spesifikke tilstander som potensielt kan behandles ved administrering av de foreliggende antistoffer inneholdende konstant humant gamma-1/gamma-3-anti-CD23-doméne, innbefatter følgende: Allergisk bronkopulmonal-aspergillose; allergisk rhinitt og konjunktivitt; autoimmun hemolytisk anemi; acanthosis nigricans; allergisk kontakt-dermatitt; Addisons sykdom; atopisk dermatitt, alopecia areata; alopecia universalis; amyloidose; anafylaktisk purpura; anafylaktisk reaksjon; aplastisk anemi; angioødem, arvelig; angioødem, idiopatisk; ankyloserende spondylitt; arteritt, kranial; arteritt, kjempecelle; arteritt, Takayasus; arteritt, temporal; astma; ataxia-telangiectasia; autoimmun eggstokkbetennelse; autoimmun orchitt; autoimmun polyendokrin svikt; Behcets sykdom; Bergers sykdom; Burgers sykdom; bronkitt; bulløs pemfigus; candidiasis, kronisk mukokutan; Caplans syndrom; postmyokard-infarkt-syndromet; post-perikardiotomi-syndrom; karditt; cøliaki; Chagas' sykdom; Chediak-Higashi-syndrom; Churg-Strauss-sykdom; Cogans syndrom; kuldeagglutininsykdom; CREST-syndrom; Crohns' sykdom; kryoglobulinemi; kryptogen fibroserende alveolitt; dermatitis herpetiformis; dermatomyositt; diabetes mellitus; Diamond og Blackfans syndrom; DiGeorges syndrom; diskoid lupus erythematosus; eosinofil fasciitt; episkleritt; erythema elevatum diutinum; erythema marginatum; erythema multiforme; erythema nodosum; familiær middelhavsfeber; Feltys syndrom; lungefibrose; glomerulonefritt, anafylaktoid; glomerulonefritt, autoimmun; glomerulonefritt, post-streptokokkisk, post-transplantasjons-glomerulonefritt; glomerulopati, membranøs; Goodpastures syndrom; transplantat-mot-vert-sykdom; granulocytopeni, immun-mediert; granuloma annulare; granulomatose, allergisk; granulomatøs myositt; Graves sykdom; Hashimotos tyreoiditt; hemolytisk sykdom hos nyfødte; hemokromatose, idiopatisk; Henoch-Schonleins purpura; hepatitt, kronisk aktiv og kronisk progressiv; histiocytose X; hypereosinofilt syndrom; idiopatisk trombocytopenisk purpura; Jobs syndrom; juvenil dermatomyositt; juvenil reumatoid artritt (juvenil kronisk artritt); Kawasakis sykdom; keratitt; keratoconjunctivitis sicca; Landry-Guillain-Barre-Strohls syndrom; lepra, lepromatøs; Lofflers syndrom; lupus; Lyells syndrom; Lyme-sykdommen; lymfomatoid granulomatose; mastocytose, systemisk; blandet bindevevssykdom; mononeuritis multiplex; Muckle-Wells syndrom; mukokutant lymfeknutesyndrom; multisentrisk retikulohistiocytose; multippel sklerose; myasthenia gravis; mycosis fungoides; nekrotiserende vaskulitt, systemisk; nefrotisk syndrom; overlap syndrome; pannikulitt;

paroksysmal kuldehemoglobinuri; paroksysmal nokturnal hemoglobinuri;

pemfigoid; pemfigus; pemphigus erythematosus; pemphigus foliaceus; pemphigus vulgaris; dueoppdretters sykdom; hypersensitivitets-pneumonitt; polyarteritis nodosa; polymyalgia rheumatica; polymyositt; polyneuritt, idiopatisk; portugisiske familære polyneuropatier; pre-eklampsi/eklampsi; primær biliær cirrhose;

progressiv systemisk sklerose (skleroderma); psoriasis; psoriatisk artritt; pulmonal alveolær proteinose; pulmonal-fibrose; Raynauds fenomen/syndrom; Riedels tyreoiditt; Reiters syndrom; residiverende polykondritt; reumatisk feber; reumatoid artritt; sarkoidose; skleritt; skleroserende cholangitt; serumsykdom; Sézarys syndrom; Sjogrens syndrom; Stevens-Johnsons syndrom; Stills sykdom; subakutt skleroserende panencefalitt; sympatiserende oftalmi; systemisk lupus erythematosus; transplantatforkastelse; ulcerøs kolitt; udifferensiert bindevevssykdom; uritcaria, kronisk, kulde-urticaria; uveitt; vitiligo; Weber-Christians sykdom; Wegeners granulomatose; Wiskott-Aldrich-syndromet.

Blant disse innbefatter de foretrukne indikasjoner som kan behandles eller presenteres ved administrering av anti-CD23-antistoffer, allergisk rhinitt og konjunktivitt, atopisk dermatitt; eksem; Jobs syndrom; astma; allergiske tilstander; og kroniske inflammatoriske sykdommer og tilstander, innbefattende CLL kronisk lymfocyttleukemi, typisk karakterisert ved høye nivåer av membran-CD23 og høye sirkulasjonsnivåer av sCD23 (Sarfati et al., Blood7"\: 94-98 (1988)).

Mengden av antistoff som er nyttig til frembringlse av en terapeutisk effekt, kan bestemmes ved hjelp av standardteknikker som er velkjente for vanlige fagfolk på området. Antistoffene vil vanligvis tilveiebringes ved standardteknikk i en farmasøytisk godtagbar buffer, og kan administreres på hvilken som helst måte. På grunn av effektiviteten av antistoffene som er patentsøkt i det foreliggende, samt toleranse for dem hos mennesker, er det mulig å administrere disse antistoffer gjentatte ganger for bekjempelse av forskjellige sykdommer eller sykdomstilstander hos et menneske.

En fagperson på området vil ved hjelp av rutineforsøk være i stand til å bestemme hvilken effektiv, ikke-toksisk mengde antistoff som vil være formålstjenlig for det formål å påvirke allergiske sykdommer og inflammatoriske tilstander. Vanligvis vil imidertid en effektiv dosering være i områder ca. 0,05-100 milligram pr. kilo kroppsvekt pr. dag.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan administreres til et menneske eller annet dyr i henhold til forannevnte behandlingsmetoder, i en mengde som er tilstrekkelig til frembringelse en slik effekt i en terapeutisk eller profylaktisk grad. Slike antistoffer ifølge oppfinnelsen kan administreres til et slikt menneske eller annet dyr i vanlig doseringsform tillaget ved kombinering av antistoffet ifølge oppfinnelsen med en vanlig farmasøytisk godtagbar bærer eller fortynningsmiddel i henhold til kjente teknikker. En fagperson på området vil være klar over at formen og karakteren av den farmasøytisk godtagbare bærer eller fortynningsmiddel tilsis ved den mengde av aktiv bestanddel som det skal kombineres med, administreringsmåten og andre velkjente variabler.

Administreringsmåten for antistoffet ifølge oppfinnelsen kan være oral, parenteral, ved inhalering eller topisk. Betegnelsen parenteral anvendt i det foreliggende innbefatter intravenøs, intramuskulær, subkutan, rektal, vaginal eller intraperitoneal administrering. Den intravenøse form for parenteral administrering er vanligvis foretrukket.

De daglige parenterale og orale doseringskurer for anvendelse av forbindelser ifølge oppfinnelsen for profylaktisk eller terapeutisk bevirkning av immun-undertrykkelse vil vanligvis være i området ca. 0,05-100, men fortrinnsvis ca. 0,5-10, milligram pr. kilo kroppsvekt pr. dag.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan også administreres ved inhalering. Med «inhalering» menes intranasal og oral inhalerings-administrering. Hensiktsmessige doseringsformer for slik administrering, så som et aerosolpreparat eller en inhalator med utmålt dose, kan fremstilles ved hjelp av vanlige teknikker. Den foretrukne doseringsmengde for en forbindelse som anvendes ifølge oppfinnelsen, er vanligvis i området ca. 10-100 miligram.

Antistoffet ifølge oppfinnelsen kan også administreres topisk. Med topisk administrering menes ikke-systemisk administrering, og det innbefatter anvendelse av en antistoff-(eller et fragment derav)-forbindelse ifølge oppfinnelsen utvendig på epidermis, på kinnhulen, og inndrypping av et slikt antistoff i øret, øyet og nesen, og hvor det ikke i noen betydelig grad går inn i blodstrømmen. Med systemisk administrering menes oral, intravenøs, intraperitoneal og intramuskulær administrering. Mengden av et antistoff som er nødvendig for terapeutisk eller profylaktisk effekt, vil selvfølgelig variere med det valgte antistoff, beskaffenheten og graden av tilstanden som behandles, samt dyret som gjennomgår behandlingen, og er til slutt legens valg. En egnet topisk dose av et antistoff ifølge oppfinnelsen vil vanligvis være i området ca. 1-100 milligram pr. kilo kroppsvekt daglig.

Preparater

Skjønt det er mulig å administrere et antistoff eller fragment derav alene, er det foretrukket å presentere det som et farmasøytisk preparat. Den aktive bestanddel kan for topisk administrering omfatte fra 0,001 til 10 vekt%, f.eks. fra 1 til 2 vekt%, basert på preparatet, skjønt den kan omfatte så mye som 10 vekt%, men fortrinnsvis ikke mer enn 5 vekt%, og mer foretrukket fra 0,1 til 1 vekt%, basert på preparatet.

De topiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en aktiv bestanddel sammen med én eller flere akseptable bærere for denne og eventuelt hvilke(n) som helst annen (andre) terapeutisk(e) bestanddel(er). Bæreren (bærerne) må være «godtagbar(e)» i den betydning at de(n) er forenlig(e) med de andre bestanddeler i preparater og ikke skadelige for mottakeren.

Preparater som er egnet for topisk administrering, innbefatter flytende eller halvflytende preparater egnet for gjennomtrenging gjennom huden til det sted hvor behandlingen trenges, så som linimenter, lotioner, kremer, salver eller pastaer, og dråper egnet for administrering til øyet, øret eller nesen.

Dråper kan omfatte sterile vandige eller oljeaktige løsninger eller suspensjoner, og kan fremstilles ved oppløsing av den aktive bestanddel i en egnet vandig løsning av et bakterici og/eller fungicid middel og/eller hvilket som helst annet egnet konserveringsmiddel, og fortrinnsvis innbefattende et overflateaktivt middel. Den resulterende løsning kan så klares ved filtrering, overføres til en egnet beholder som så forsegles og steriliseres ved autoklavering eller opprettholdelse ved 90-100°C i Vi time. Alternativt kan løsningen steriliseres ved filtrering og overføres til beholderen ved hjelp av en aseptisk teknikk. Eksempler på baktericide og fungicide midler egnet for innlemming i dråpene er fenylkvikksølvnitrat eller -acetat (0,002%), benzalkoniumklorid (0,01%) og klorheksidinacetat (0,01%). Egnede løsningsmidler for fremstilling av en oljeaktig løsning innbefatter glycerol, fortynnet alkohol og propylenglykol.

Lotioner innbefatter slike som er egnet for påføring på huden eller øyet. En øyelotion kan omfatte en steril vandig løsning som eventuelt inneholder et baktericid, og kan fremstilles ved hjelp av metoder i likhet med metodene for fremstilling av dråper. Lotioner eller linimenter for påføring på huden kan også innbefatte et middel for fremskyndelse av tørking og for avkjøling av huden, så som en alkohol eller aceton, og/eller et fuktiggjørende middel så som glycerol eller en olje så som ricinusolje eller arakisolje.

Kremer, salver eller pastaer er halvfaste preparater av den aktive bestanddel for utvendig påføring. De kan lages ved blanding av den aktive bestanddel i findelt eller pulverform, alene eller i løsning eller suspensjon i et vandig eller ikke-vandig fluid, ved hjelp av egnet maskineri, med fett- eller ikkefett-basis. Basisen kan omfatte hydrokarboner så som hard, myk eller flytende paraffin, glycerol, bivoks, en metallsåpe; et planteslim; en olje av naturlig opprinnelse så som mandelolje, maisolje, arakisolje, ricinusolje eller olivenolje; ullfett eller dets derivater, eller en fettsyre så som stearinsyre eller oljesyre sammen med en alkohol så som propylenglykol eller makrogeler. Preparatet kan innbefatte hvilket som helst egnet overflateaktivt middel så som et anionisk, kationisk eller ikke-ionisk overflateaktivt middel så som sorbitanestere eller polyoksyetylenderivater derav. Suspensjonsmidler så som naturlige gummiarter, cellulosederivater eller uorganiske materialer så som kiselholdige silisiumdioksider, og andre bestanddeler så som lanolin, kan også innarbeides.

En fagperson på området vil forstå at den optimale mengde og avstand mellom individuelle doseringer av et antistoff eller et fragment derav ifølge oppfinnelsen vil bli bestemt ved beskaffenheten og omfanget av tilstanden som behandles, formen, måten og stedet for administrering, samt det spesielle dyr som behandles, og at slike optima kan bestemmes ved hjelp av vanlige teknikker. En fagperson på området vil også forstå at fagfolk på området kan få kjennskap til det optimale behandlingsforløp, dvs. antallet doser av et antistoff eller et fragment derav ifølge oppfinnelsen som gis pr. dag for et definert antall dager, ved anvendelse av vanlige behandlingsforløps-bestemmelsestester.

Kapselpreparat

Et farmasøytisk preparat ifølge denne oppfinnelse i form av en kapsel fremstilles ved fylling av en hard standard-todelers-gelatinkapsel med 50 mg av et antistoff eller et fragment derav ifølge oppfinnelsen, i pulverform, 100 mg laktose, 32 mg talk og 8 mg magnesiumstearat.

Iniiserbart moderpreparat

Et farmasøytisk preparat ifølge denne oppfinnelse i en form som er egnet for administrering ved injeksjon, fremstilles ved omrøring av 1,5 k på vektbasis av et antistoff eller et fragment derav ifølge oppfinnelsen i 10 k på volumbasis av propylenglykol og vann. Løsningen steriliseres ved filtrering.

Salvepreparat

Antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen 10 g.

Hvit myk paraffin til 100,0 g.

Antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen dispergeres i et lite volum av bærermaterialet under dannelse av et glatt, homogent produkt. Nedbrytbare metallrør blir så fylt med dispersjonen.

Topisk krempreparat

Antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen 1,0 g.

Polawax GP 200 20,0 g.

Lanolin, vannfri 2,0 g.

Hvit bivoks 2,5 g.

Metylhydroksybenzoat 0,1 g.

Destillert vann til 100,0 g.

Polawax, bivoksen og lanolinet oppvarmes sammen ved 60°C. En løsning av metylhydroksybenzoat tilsettes, og homogenisering oppnås ved anvendelse av høyhastighetsomrøring. Temperaturen får falle til 50°C. Antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen blir så tilsatt og dispergert fullstendig, og preparatet får avkjøles med langsom omrøring.

Topisk lotion- preparat

Antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen 1,0 g. Sorbitanmonolaurat 0,6 g. Polysorbat 20 0,6 g.

Cetostearylalkohol 1,2 g. Glycerol 6,0 g.

Metylhydroksybenzoat 0,2 g.

Renset vann B.P. til 100,00 ml. (B.P. = British Pharmacopeia)

Metylhydroksybenzoatet og glycerolen oppløses i 70 ml av vannet ved 75°C. Sorbitanmonolauratet, polysorbat 20 og cetostearylalkoholen smeltes sammen ved 75°C og tilsettes til den vandige løsning. Den resulterende emulsjon homogeniseres og får avkjøles med kontinuerlig omrøring, og antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen tilsettes som en suspensjon i det gjenværende vann. Hele suspensjonen om røres til den er homogenisert.

Øvedråpe- preparat

Antistoff eller fragment derav ifølge oppfinnelsen 0,5 g. Metylhydroksybenzoat 0,01 g.

Propylhydroksybenzoat 0,04 g.

Renset vann B.P. til 100,00 ml.

Metyl- og propylhydroksybenzoatet oppløses i 70 ml renset vann ved 75°C, og den resulterende løsning får avkjøles. Antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen blir så tilsatt, og løsningen steriliseres ved filtrering gjennom et membranfilter (0,022 Am porestørrelse) og pakkes aseptisk i egnede sterile beholdere.

Preparat for administrering ved inhalering

Når det gjelder en aerosolbeholder med en kapasitet på 15-20 ml: Bland 10 mg av et antistoff eller et fragment derav ifølge oppfinnelsen med 0,2-0,5 k av et smøremiddel, så som polysorbat 85 eller oljesyre, og disperger en slik blanding i et drivmiddel, så som freon, fortrinnsvis i en kombinasjon av (1,2-diklotretrafluor-etan) og difluorklormetan, og innfør i en passende aerosolbeholder tilpasset for enten intranasal eller oral inhalerings-administrering. Preparat for administrering ved inhalering for en aerosolbeholder med en kapasitet på 15-20 ml: oppløs 10 mg av et antistoff eller et fragment derav ifølge oppfinnelsen i etanol (6-8 ml), tilsett 0,1-0,2 k av et smøremiddel, så som polysorbat 85 eller oljesyre; og disperger dette i et drivmiddel, så som freon, fortrinnsvis i en kombinasjon av (1,2-diklor-tetrafluoretan) og difluorklormetan, og innfør i en passende aerosolbeholder tilpasset for enten intranasal eller oral inhalerings-administrering.

Parenteralt administrerbare antistoffpreparater

Antistoffene og de farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen er spesielt egnet for parenteral administrering, dvs. subkutant, intramuskulært eller intravenøst. Preparatene for parenteral administrering vil vanligvis omfatte en løsning av et antistoff ifølge oppfinnelsen eller en blanding derav oppløst i en godtagbar bærer, fortrinnsvis en vandig bærer. Det kan anvendes forskjellige vandige bærere, f.eks. vann, bufret vann, 0,4 k saltløsning (normal saltløsning), 0,3% glycin og liknende. Anvendelse av normal saltløsning er foretrukket. Disse løsninger er sterile og generelt fri for partikkelformig materiale. Disse løsninger, kan steriliseres ved hjelp av vanlige, velkjente steriliseringsteknikker. Preparatene kan inneholde farmasøytisk godtagbare hjelpesubstanser etter behov for å komme nær opp til fysiologiske tilstander, så som pH-justerings- og bufringsmidler osv. Konsentrasjonen av antistoffet eller fragmentet derav ifølge oppfinnelsen i slike farmasøytiske preparater kan variere sterkt. Slike konsentrasjoner vil bli valgt hovedsakelig basert på fluidvolumer, viskositeter osv. i henhold til den spesielle administreringsmåte som velges. Generelt egnede intravenøse konsentrasjoner er i området ca. 1-100 milligram pr. milliliter.

Et farmasøytisk preparat ifølge oppfinnelsen for intravenøs injeksjon kan således omfatte 10 ml normal saltløsning inneholdende 40-50 mg av et anti-human CD23-antistoff ifølge oppfinnelsen. Metoder for fremstilling av parenteralt administrerbare preparater er velkjent eller vil være åpenbare for fagfolk på området, og er beskrevet mer detaljert for eksempel i Remington' s Pharmaceutical Science, 15. utg., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, herved medtatt i det foreliggende som referanse.

Antistoffene ifølge oppfinnelsen kan lyofiliseres for oppbevaring og rekondisjoneres i en egnet bærer før anvendelse. Denne teknikk er blitt vist å være effektiv for vanlige immunglobuliner, og lyofiliserings- og rekondisjoneringsteknikker kjent på området kan anvendes.

Avhengig av det påtenkte resultat kan det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen administreres for profylaktisk og/eller terapeutisk behandling. Ved terapeutisk anvendelse administreres preparatene til en pasient som allerede lider av en sykdom, i en mengde som er tilstrekkelig til å helbrede eller i det minste delvis stoppe sykdommen og komplikasjonene ved den. Ved profylaktiske anvendelser administreres preparater inneholdende de foreliggende antistoffer eller en blanding derav til en pasient som ikke allerede er i en sykdomstilstand, for forøking av pasientens motstandskraft.

Det kan utføres enkelt- eller multippel-administreringer av de farmasøytiske preparater, og dosenivåer og -mønster velges av den behandlende lege. I alle tilfeller bør det farmasøytiske preparat ifølge oppfinnelsen tilveiebringe en mengde av de foreliggende anti-CD23-antistoffer som er tilstrekkelig til effektivt å behandle pasienten.

Det skal også bemerkes at antistoffene ifølge denne oppfinnelse kan anvendes for utforming og syntetisering av enten peptid- eller ikke-peptid-forbindel-ser (mimetiske forbindelser) som vil være nyttige ved den samme terapi som antistoffet. Se f.eks. Saragovi et al., Science, 253:792-795 (1991).

Claims

1. Monoklonalt anti-humant CD23-antistoff, karakterisert ved at det omfatter et humant gamma-1 eller human gamma-3 konstant område som bindes til humane Fc gamma RI, Fc gamma RN eller Fc gamma RUI reseptorer og inhiberer lgE-ekspresjon.

2. Monoklonalt anti-humant CD23-antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en primat-antigen-bindende del.

3. Monoklonalt anti-humant CD23-antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det omfatter en gnagerantigen-bindende del.

4. Monoklonalt anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det er et humanisert antistoff, et primatisert antistoff eller et kimært antistoff.

5. Monoklonalt anti-humant CD23-antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det inhiberer lgE-ekspresjon in vitro, inhiberer IL-4-indusert lgE-ekspresjon ved B-celler in vitro eller inhiberer IL-4-indusert lgE-ekspresjon in vivo.

6. Monoklonalt anti-humant CD23-antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det har en bindingsaffinitet i området fra 0,01 nM til 1000 nM.

7. Monoklonalt anti-humant CD23-antistoff ifølge krav 1, karakterisert ved at det har en CD23-bindingsaffinitet på minst 5 nM eller en CD23-bindingsaffinitet på minst 100 nM.

8. Anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge krav 1,karakterisert ved at det omfatter (a) en tungkjede variabel region avledet fra 6G5 tungkjede variabel region kodende for nukleotidene 58-423 av SEKV ID NR: 2 og en lettkjede variabel region avledet fra 6G5 lettkjede variabel region kodet av nukleotidene 58-390 av SEKV ID NR:1; eller (b) en tungkjede variabel region avledet fra 5E8 tungkjede variabel region kodet av nukleotidene 58-411 av SEKV ID NR:4, en lettkjede variabel region avledet av 5E8 lettkjede variabel region kodet av nukleotidene 67-387 av SEKV ID NR:3.

9. Anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge krav 1,karakterisert ved a t det har evne til å inhibere bindingen av et monoklonalt anti-humant CD23 antistoff til CD23, idet det anti-humane CD23 monoklonale antistoffet omfatter: (a) en tungkjede variabel region kodende for nukleotidene 58-423 av SEKV ID NR:2 og en lettkjede variabel region kodet av nukleotidene 58-390 av SEKV ID NR:1; eller (b) en tungkjede variabel region kodet av nukleotidene 58-411 av SEKV ID NR:4, en lettkjede variabel region kodet av nukleotidene 67-387 av SEKV ID NR:3.

10. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder et anti- humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge et hvilket som helst av de foregående kravene.

11. Anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge krav 10, karakterisert ved at det kan inhibere bindingen av monoklonalt anti-humant CD23 antistoff 5E8 til CD23.

12. Anvendelse av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 -9 og 11, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av en sykdomstilstand hvor inhibering av IgE er terapeutisk eller profylaktisk fordelaktig.

13. Anvendelse av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 1 -9 og 11, for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av autoimmun sykdom eller en inflammatorisk sykdom.

14. Anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge krav 8, karakterisert ved a t det omfatter en tungkjede variabel region kodet av nukleotidene 58-423 av SEKV ID NR:2 og en lettkjede variabel region kodet av nukleotidene 58-390 av SEKV ID NR:1.

15. Anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge krav 8, karakterisert ved a t det omfatter en tungkjede variabel region kodet av nukleotidene 58-411 av SEKV ID NR:4 og en lettkjede variabel region kodet av nukleotidene 67-387 av SEKV ID NR:3, med den unntagelsen at aspargin kodonet kodet av nukleotidene 289-291 av SEKV ID NR:4 er erstattet av et lysinkodon.

16. Anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge krav 8, karakterisert ved a t det er et humanisert antistoff, et primatisert antistoff eller et kimært antistoff.

17. Anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge krav 16, karakterisert ved a t det blir fremstilt med CDR podning, venering, molekulær modellering eller rammeverk erstatning.

18. Anti-humant CD23 monoklonalt antistoff ifølge krav 1,karakterisert ved a t det omfatter en human gamma-1 eller human gamma-3 konstant region, og som inhiberer IL-4 indusert IgE produksjon av B celler i høyere grad enn et anti-humant CD23 antistoff som mangler en human gamma-1 eller human gamma-3 konstant region.

19. Anvendelse av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 14-18 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling eller forebygging av en sykdomstilstand hvori inhibisjon av IgE er terapeutisk eller profylaktisk fordelaktig.

20. Anvendelse av et antistoff ifølge et hvilket som helst av kravene 14-18 for fremstilling av et farmasøytisk preparat for behandling av en allergisk forstyrrelse, en autoimmun sykdom eller en inflammatorisk forstyrrelse.