KR100697465B1 - 감마-1 및 감마-3 항사람 ｃｄ23 단클론성 항체 및치료제로서 이들을 사용하는 방법 - Google Patents

감마-1 및 감마-3 항사람 ｃｄ23 단클론성 항체 및치료제로서 이들을 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람의 CD23, IgE에 대한 저친화도 수용체(FceRII/CD23)에 특이적으로 결합하고 사람 감마-1 또는 사람 감마-3 불변 도메인을 함유하는 단클론성 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는 유도된 IgE 발현을 조절하거나 억제하는데 유용하다. 따라서, 이러한 항체는 알레르기성 질환, 자가면역 질환 및 염증성 질환을 포함하여, 유도된 IgE 생성의 억제가 치료적으로 요망되는 질환의 치료 또는 예방에 실제적인 용도를 갖는다.

Description

감마-1 및 감마-3 항사람 ＣＤ23 단클론성 항체 및 치료제로서 이들을 사용하는 방법 {GAMMA-1 AND GAMMA-3 ANTI-HUMAN CD23 MONOCLONAL ANTIBODIES AND USE THEREOF AS THERAPEUTICS}
도 1은 뮤린의 항사람 CD23 단클론성 항체(MHM6)의 시험관내 IgE 억제 활성을 5가지 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체(5E8, 6G5, 2C8, B3B11 및 3G12)와 비교한 것이다.
도 2는 영장류 단클론성 항체 5E8 및 6G5가 시판되는 뮤린의 항사람 CD23 단클론성 항체 MHM6과 구별되는 사람의 CD23상의 에피토프에 결합되고(도 2의 중간 패널), 서로 경쟁하는 것(도 2의 아래 패널)을 나타내는 그래프이다. 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체 2C8 및 B3B11은 MHM6과 경쟁한다(도 2의 상부 패널).
도 3은 특정 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체 5E8과 네 개의 상이한 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00001
) 버전의 상기 영장류 단클론성 항체의 시험관내 IgE 억제 활성을 비교하는 그래프로서, 서열을 하기에 설명하였다.
p5E8G4P - 이러한 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00002
) 항체는 사람 카파 경쇄 불변 영역, 및 P 돌연변이를 함유하는 사람 감마 4 불변 영역을 함유한다[참고문헌 : Angal et al., Mol . Immunol., 30:105-108 (1993)];
p5E8G4PN - 이러한 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00003
) 항체는 사람 카파 경쇄 불변 영역, 및 P 돌연변이를 갖는 사람 감마 4 불변 영역을 함유한다[참고문헌 : Angal et al., Mol . Immunol., 30:105-108 (1993)]. 이러한 항체는 또한 아스파라긴 잔기(잠재적인 탄수화물 부착 부위)를 리신으로 변경시키는 중쇄 가변 영역에서 돌연변이를 함유한다;
P5E8G1 - 이러한 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00004
) 항체는 사람 카파 경쇄 불변 영역 및 사람 감마 1 불변 영역을 함유한다;
p5E8G1N - 이러한 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00005
) 항체는 사람 카파 경쇄 불변 영역 및 사람 감마 1 불변 영역을 함유한다. 이러한 항체는 또한 아스파라긴 잔기(잠재적인 탄수화물 부착 부위)를 리신으로 변경시키는 중쇄 가변 영역에서 돌연변이를 함유한다.
도 4는 도 3에서 동정된 항체의 겉보기 Kd(nm)를 비교하고 이들의 IgE 억제 활성을 요약하는 표이다.
도 5는 특정 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체인 6G5와 두 가지 상이한 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00006
) 버전의 6G5의 시험관내 IgE 억제 활성을 비교하는 그래프로서, 서열을 하기에 설명하였다:
p6G5G1 - 이러한 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00007
) 항체는 사람 람다 경쇄 불변 영역 및 사람 감마 1 불변 영역을 함유한다;
p6G5G4P - 이러한 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00008
) 항체는 사람 람다 경쇄 불변 영역 및 P 돌연변이를 갖는 사람 감마 4 불변 영역을 함유한다[참고문헌 : Angal et al., Mol . Immunol., 30:105-108 (1993)].
도 6은 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체 2C8과 2C8로부터 유도되는 F(ab')2의 시험관내 IgE 억제 활성을 비교하는 그래프이다.
도 7은 2C8로부터 유도되는 F(ab')2가 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체 2C8의 시험관내 IgE 활성 억제의 길항을 나타내는 그래프이다.
도 8은 SCID 동물 모델에서 특정 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체인 5E8의 생체내 IgE 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
도 9는 영장류의 항사람 6G5 및 이들의 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00009
) 버전인 p6G5G4P의 생체내 억제 활성을 비교하는 그래프이다.
도 10은 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체 6G5 및 이들의 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00010
) 버전인 p6G5G1의 생체내 IgE 억제 활성을 나타내는 그래프이다.
기술분야
본 발명은 사람 CD23, IgE에 대한 저친화도 수용체(FceRII/CD23)에 특이적으로 결합하고 사람 감마-1 또는 사람 감마-3 불변 도메인을 포함하고 있는 단클론성 항체 및 치료제로서 이들을 사용하는 방법에 관한 것이다.
배경기술
IgE는 천식, 음식물 알레르기, 타입 1 과민증 및 흔한 동(sinus) 염증 알레르기성 비염 및 결막염과 같은 알레르기성 반응을 매개하여 일반적인 개체군 전체에 걸쳐 광범위하게 피해를 입히는 면역글로불린 패밀리의 일원이다. IgE는 B-세포에 의해 분비되고 B-세포의 표면상에서 발현된다. B-세포에 의해 합성된 IgE는 성숙된 IgE 서열에 연결되어 있는 짧은 트랜스멤브레인 도메인에 의해 B-세포막에 고정될 수 있다. 막 및 분비된 형태의 IgE는 IgE RNA 전사체의 차별적인 스플라이싱에 의해 같은 세포내에서 형성된다.
또한 IgE는 이의 Fc 영역을 통해 B-세포(및 T 세포, 단핵세포, 랑게르한스 세포, 소포의 수상돌기 세포, 내츄럴 킬러 세포, 호산구 및 혈소판)에 결합되어 저친화도 IgE 수용체 FceRII(이하 "FCEL")가 되고, 이의 Fc 영역을 통해 마스트 세포 및 호염기성 세포에 결합되어 고친화도 IgE 수용체 FceRI(이하 "FCEH")가 될 수 있다. 저친화도 IgE 수용체는 문헌에서 일반적으로 CD23으로서 언급된다.
포유동물을 알레르겐에 노출시킬 때, 항원 제시 세포는 헬퍼 T 세포에 제시하기 위한 항원을 프로세싱한다. 이들 헬퍼 T 세포는 B-세포가 클로날 증폭되도록 돕는 IL-4와 같은 시토카인을 분비하고, 알레르겐에 더욱 특이적인 IgE를 분비한다. 그런 다음, 이러한 새로 합성된 IgE는 세포 표면상의 고친화도 수용체를 통해 마스트 세포 및 호염구에 결합되는 순환으로 방출된다. 이러한 마스트 세포 및 호염구는 그 때문에 특이적 알레르겐에 민감해진다. 이후 동일한 알레르겐에 노출시키게 되면 마스트 세포의 표면상의 특이적 IgE, 및 호염구에 결합되어 이들 세포상 의 FceRI과 가교를 형성함으로써 히스타민, 및 임상적 과민증 및 아나필락시스를 유발시키는 그 밖의 인자의 방출을 활성화시킨다.
FCEL(CD23)에 결합된 IgE에는 결합될 수 있지만 FCEH에 결합된 IgE에는 결합될 수 없는 항체는 문헌에 보고된 바 있다[참조예 : WO 89/00138호 및 U.S. 특허 제 4,940,782호]. 이들 항체는 저친화도 수용체(FCEL)에 결합된 IgE에 결합되거나 순환성 IgE에 결합되지만, 고친화도 수용체(FCEH)에 결합된 IgE에는 결합되지 않기 때문에 임상적으로 유리한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 이들 항체는 마스트 세포 또는 호염구를 활성화시키지 않을 것이다.
또한, 항-CD23 항체는, 예를 들어, 알레르기성 질환, 염증성 질환 및 자가면역 질환에 대한 치료제로서의 잠재력을 가지고 있다고 보고되었다. 예를 들어, 보네포이(Bonnefoy) 등의 WO 9612741호에는 CD23에 결합되는 리간드, 예를 들어 단클론성 항체가 염증성 질환, 자가면역 질환 및 알레르기성 질환의 치료 또는 예방에 유용하다고 보고되어 있다.
IgE 작용제 및 길항제 둘 모두로서 CD23에 대한 단클론성 항체의 용도는 보고되었다. IgE 길항제는 IgE 억제가 치료적으로 바람직한 질환 또는 질병, 예를 들어 알레르기성 비염 및 결막염, 아토피성 피부염 및 천식과 같은 알레르기성 질환의 치료에 잠재적인 유용성을 갖는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 보네포이 등의 WO 8707302호(1987)에는 사람 CD23에 대한 단클론성 항체가 보고되어 있는데, 상기 항체는 세포 유형에 따른 IgE 수용체의 존재를 검정하는데 명백히 유용하며, IgE의 조절이 치료학적으로 바람직한 질환의 치료제로서 유용하다.
부분적으로, 치료제 또는 진단제로서의 이들의 잠재성 때문에, 여러 그룹은 CD23에 대한 단클론성 항체의 생성을 보고하였다[참조예: Rector et al., Immunol., 55:481-488 (1985) ; Suemura et al., J. Immunol., 137:1214-1220 (1986) ; Noro et al., J. Immunol., 137:1258-1263 (1986) ; Bonnefoy et al., J. Immunol., 138:2970-2978 (1987) ; Flores-Romo et al., Science, 261:1038-1046 (1993) ; Sherr et al., J. Immunol., 142:481-489 (1989); and Pene et al., Proc. Natl . Acad . Sci., USA, 85:6880-6884 (1988)]. 또한, 상기에 기술한 바와 같이, IgE 합성이 시토카인(IL-4)에 의해 유도되는 시스템에서 IgE 생성을 특이적으로 억제하기 위한 상기 항체의 용도가 보고되었다[참고문헌 : Flores-Romo et al (Id.); Sherr et al. (Id.) ; Bonnefoy et al. (WO 8707302) ; Bonnefoy et al. (WO 8707302) ; Bonnefoy et al. (WO 9612741); Bonnefoy et al., Eur . J. Immunol 20:139-144 (1990) ;Sarfati et al., J. Immunol 141:2195-2199 (1988) and Wakai et al., Hybridoma 12:25-43 (1993)]. 또한, 플로레스-로모(Flores-Romo) 등(Id.)은 항-CD23 항체로부터 제조된 Fab가 래트의 생체내에서 항원 특이적으로 유도된 IgE 반응을 억제한다고 기술하였다. 그러나, 보고된 바가 있더라도, 항-CD23 항체가 IgE 발현을 조절하는 메카니즘 및 특히 이들이 IL-4 유도된 IgE 생성을 블로킹하는 방법은 여전히 불분명하다.
항-CD23 항체는 IgE를 분비하는 B 세포의 표면상에 존재하는 CD23을 통해 시그날링함으로써 IgE 생성을 억제한다고 제안되었다. IgE를 분비하는 B 세포상에서 상향 조절된 CD23의 기능은 IgE 생성의 피드백 억제인 것으로 제안되었다[참고문헌 : Yu, et al. Nature 369, 753-756 (1994)]. 이러한 제안은 CD23 유전자가 제거된 마우스가 대조군에 비해 IgE의 생성을 증가시키고 지속적으로 생성시키기 때문에 이론화되었다[Yu, et al.]. 또한, IgE 복합체에 의해 또는 항-CD23에 대한 단클론성 항체에 의해 CD23에의 결합은 구성적으로 IgE를 분비하는 림프아구성 세포주에 의해 진행중인 IgE 합성을 억제하는 것으로 보고되었다[Sherr et al., (Id.)]. 이것은 이러한 세포내에서 분비된 IgE 중쇄에 대한 메신저 RNA의 하향 조절에 기인하는 것으로 보인다[참고문헌 : Saxon et al., J. Immunol., 147:4000-4006 (1991)]. 그러나, IgE 발현이 억제되는 정확한 메카니즘은 IgE 분비가 IL-4 유도되는 시스템에서 아직 설명된 바 없다.
또한 Fc 감마 RII가 B 세포상의 표면 Ig(B 세포 수용체)와 가교를 형성하는 것이 Ig 발현의 하향 조절을 유도하는 것으로 또한 보고되었다[참고문헌: D'Ambrosia et al., Science, 268:293-297 (1995)]. 세포 표면 CD 23 및 Fc 감마 RII를 또한 가지는 IgE를 분비하는 B 세포에 대해 유사한 메카니즘이 제안될 수 있다. 항원(CD23)에 의해 세포에 결합되고 Fc 상호작용을 통해 Fc 감마 RII에도 결합되는 항사람 CD23 항체는 Fc 감마 RII를 통해 IgE 분비를 억제하는 시그날을 보낼 수 있다.
항-CD23 항체에 의한 IgE 억제와 관련된 메카니즘은 막 CD23과 IgE 사이의 상호작용 이외의 블로킹 상호작용을 포함하는 것으로 제안되었다. 이와 관련하여, C-타입 렉틴 패밀리의 일원인 CD23은 T 세포 및 단핵세포를 포함하는 다양한 세포 유형에 존재하는 CD21, CD11b 및 CD11c와 같은 수 개의 다른 리간드와 상호작용하 는 것으로 밝혀졌다. 이러한 문맥에 있어서, CD23은 세포 부착 분자로서 생각될 수 있다.
따라서, CD21 - CD23 상호작용이 항원 제시 및 후속하는 IgE 생성에 관련될 수 있다고 제안되었다. 모델은 아토피성 개체에 주로 존재하는 활성화된 T 세포상에서 CD23에 결합된 후 IgE 생성을 위한 활성화 시그날을 보내는 B 세포상의 CD21이 제안되었다[참고문헌 : Lecoanet et al., Immunol., 88:35-39 (1996); and Bonnefoy et al, Int . Amer . Allergy Immunol., 107:40-42 (1995)]. 항-CD23과의 이러한 상호작용을 블로킹시키는 것은 유도된 IgE 생성을 블로킹시킬 수 있었다[참고문헌 : Aubry et al., Nature, 358:505-507 (1992) and Immunol., 5:944-949 (1993); Grosjean et al., Curr. Opin. Eur . J. Immunol., 24:2982-2988 (1994); Henchoz-Lecoanet et al., Immunol., 88:35-39 (1996) Nambu et al., Immunol . Lett., 44:163-167 (1995) ; Bonnefoy et al., Int . Amer . Allergy Immunol., 107:40-42 (1995)]. 항원 제시가 T 세포상의 CD21에 결합되는 항원 제시 B 세포상의 CD23에 의해 상향 조절되는 것이 또한 가능하다.
IgE 생성에 대한 CD23의 효과를 가능성 있게 설명할 또 다른 메카니즘은 가용성 형태의 CD23과 관련된다. CD23은 몇가지 상이한 형태의 가용성 CD23 또는 IgE 결합 인자를 방출시키는 세포 표면으로부터 절단된다고 보고되었다[참고문헌 : Sarfati et al., Immunol., 53:197-205 (1984)]. 가용성 CD23은 시토카인인데, 이의 보고된 활성중의 하나는 B 세포로부터의 IL-4 유도된 IgE 생성의 증가이다[참고문헌 : Pene et al., J. Cell Biochem., 39:253-269 (1989); Pene et al., Eur . J. Immunol., 18:929-935 (1988); Sarfati et al., J. Immunol., 141:2195-2197 (1988) ; Sarfati et al. (1984) (Id.); Saxon et al., J. Clin . Immunol. Allergy, 86 (3 pt 1) 333-344 (1990)]. 또한, 특정 형태의 가용성 CD23은 IgE 생성을 억제하는 것으로 보고되었다[참고문헌 : Sarfati et al., Immunol., 76:662-667 (1992)]. 따라서, 항-CD23 항체는 1) 가용성 CD23의 IgE 증가 효과를 억제하고/하거나 2) 세포 표면으로부터 가용성 CD23의 단백질분해 방출을 블로킹함으로써 IgE 생성을 블로킹할 수 있다.
이와 같이, 전술한 내용을 토대로 하여, 보다 특이적으로 CD23의 기능 및 IgE 생성에 대한 효과, 및 특이적인 리간드가 IgE 생성에 영향을 미치는 수단에 관한 종래기술이 상당히 복잡하며 불명료하다는 것은 명백하다.
따라서, 본 발명의 목적은 CD23에 특이적인 신규한 리간드(항체)를 생성시키고, 이러한 항체를 사용하여 항-CD23 항체가 IgE 발현을 조절하는 메카니즘을 설명하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유도된 IgE 발현을 억제하는 개선된 능력을 갖는 CD23, 특히 사람 CD23에 결합하는 신규한 리간드(항체)를 생성시키는 데에 있다.
본 발명의 더욱 특이적인 목적은 사람 감마-1 또는 사람 감마-3 불변 도메인을 포함하는 항사람 CD23 항체를 생성시키는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD23과 Fc 수용체를 가교 결합시키기 위한 향상된 잠재력에 의해 보다 효과적일 수 있는 다가의 항사람 CD23 항체를 생성시키는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유도된 IgE 생성을 억제할 수 있는 사람 감마-1 또는 감마-1 불변 도메인을 포함하는 항사람 CD23 단클론성 항체를 함유하는 약제 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 유도된 IgE 생성의 억제가 치료학적으로 바람직한 질환의 치료 또는 예방을 위해 사람 감마-1 또는 사람 감마-3 불변 도메인을 포함하는 항사람 CD23 단클론성 항체를 사용하는 데에 있다.
보다 특히, 본 발명의 목적은 사람 감마-1 또는 사람 감마-3 불변 도메인을 포함하는 항사람 CD23 단클론성 항체를 사용하여 알레르기성 질환, 자가면역 질환 및 염증성 질환을 치료하거나 예방하는 데에 있다.
본원에서 사용되는 용어의 정의
키메라 항체 :
두 개의 상이한 항체, 보편적으로는 상이한 종의 항체, 가장 전형적으로는 설치류 가변 서열 및 사람의 불변 도메인 서열로부터의 영역을 포함하는 재조합 항체.
항사람 CD23 감마 1 항체
유도된 IgE 생성을 억제하는 사람 감마 1 불변 영역, 또는 이들의 단편 또는 변형체를 함유하는 사람의 CD23에 특이적으로 결합되는 항체. 이러한 항체는 특히, 설치류 또는 영장류 가변 도메인 또는 항원 결합 부분(사람화된, 영장류화된 (PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00011
)을 포함하는 항체, 및 시험관내에서 유도된 IgE 생성을 억제하는 사람 감마 1 불변 도메인, 이들의 단편 또는 변형체를 포함하는 사람의 항사람 CD23 단클론성 항체를 포함한다.
항사람 CD23 감마 3 항체
유도된 IgE 생성을 억제하는 사람 감마 3 불변 영역, 또는 이들의 단편 또는 변형체를 함유하는 사람의 CD23에 특이적으로 결합되는 항체. 이러한 항체는 특히, 설치류 또는 영장류 가변 도메인 또는 항원 결합 부분(사람화된, 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00012
))을 포함하는 항체, 및 시험관내에서 유도된 IgE 생성을 억제하는 사람 감마 3 불변 도메인, 이들의 단편 또는 변형체를 포함하는 사람의 항사람 CD23 단클론성 항체를 포함한다.
항체 불변 도메인의 변형체
불변 영역의 돌연변이체, 치환 또는 결실을 가진 본 발명에 따른 항체로서, 불변 영역에 의해 매개되는 기본적인 이펙터 기능을 변화시키지 않으면서 효능, 즉 FcR 결합의 수준을 바람직하게 변화시킬 수 있는 본 발명에 따른 항체.
영장류화된 ( PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00013
) 항체
영장류 가변 서열 또는 항원 결합 부분, 및 사람의 불변 도메인 서열을 포함하는 재조합 항체.
사람화된 항체
사람의 항체 가변 영역을 거의 근사하게 모방하도록 변형시킴으로써 면역글 로불린의 특이성 또는 친화도를 없애지 않으면서 사람에게 투여되는 경우에 잠재적인 면역원성을 제거하거나 최소화시키는 비사람 가변 영역 또는 항원 결합 부분을 포함하는 재조합 항체. 표면 잔기의 선택 변형, 프레임워크(framework) 대체, (CDR 이식) 및 분자 모델링을 포함하는 "버니어링(veneering)"을 포함하여, 몇가지의 공지된 사람화 방법이 있다.
감마 1 불변 도메인:
항체 특이적 이펙터 활성을 부여하는 특정 형태의 불변 도메인 서열. 본 발명에서, 감마 1 불변 도메인은 항-CD23 가변 도메인 서열 또는 항원 결합 부분과 조합된 형태로 감마 1 이펙터 기능을 보유하는 사람 감마 1 불변 도메인, 이들의 단편 또는 변형체를 언급한다. 변형체는 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환 또는 첨가를 포함하는 사람 감마-1 불변 도메인을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 유도된 IgE 생성을 억제하는 이러한 불변 도메인을 포함하는 항체의 능력에 의해 명시된다.
감마 3 불변 도메인:
항체 특이적 이펙터에 활성을 부여하는 특정 형태의 불변 도메인 서열. 본 발명에서, 감마 3 불변 도메인은 항-CD23 가변 도메인 서열 또는 항원 결합 부분과 조합된 상태로 감마 3 이펙터 기능을 보유하는 사람 감마 3 불변 도메인, 이들의 단편 또는 이들의 변형체를 언급한다. 변형체는 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실, 치환 또는 첨가를 포함하는 사람 감마-3 불변 도메인을 포함한다. 이러한 이펙터 기능은 유도된 IgE 생성을 억제하는 이러한 불변 도메인을 함유하는 항체의 능력에 의해 명시된다.
CD23:
이것은 IgE에 대한 저친화도 수용체, FceRII/CD23으로 언급된다.
항- CD23 항체:
CD23, 바람직하게는 사람 CD23에 특이적으로 결합하는 항체.
발명의 상세한 설명
앞서 언급된 바와 같이, 다수의 그룹이 항-CD23 항체의 생성 및 IgE 생성을 조절하기 위한 길항제 및 작용제로서의 이들의 용도를 보고하였지만, IL-4가 IgE 생성을 유도하는 시스템에서 이러한 항체가 IgE 발현을 조절하는 정확한 메카니즘은 여전히 불명확하다. 이와 같이, 이러한 항체가 IgE 발현을 조절하는 수단이 명료하게 설명될 수 있거나 적어도 보다 구체적으로 설명된다면 유리할 것인데, 그 이유는 이러한 정보가 IgE 생성의 조절이 치료적으로 요망되는 질환의 치료를 위한 치료제를 설계하는데 잠재적으로 유용할 것이기 때문이다. 특히, 유도된 IgE 생성을 억제하는 개선된 능력을 갖는 CD23에 특이적인 개선된 항체가 수득된다면 유리할 것인데, 그 이유는 상승된 IgE 수준이 다수의 질환 과정, 예를 들어 알레르기성 질환, 염증성 질환 및 자가면역 질환과 관련이 있다고 생각되기 때문이다. 이러한 질환의 예로는 아토피성 피부염, 습진, 알레르기성 비염 및 결막염, 죠브증후군(Job's syndrome), 및 천식이 있다.
이에 대해, 본 발명자들은 놀랍게도 사람 감마-1 불변 도메인을 포함하는 항사람 CD23 단클론성 항체가, IgE 생성이 다른 이펙터 타입, 예를 들어 사람 감마-4 불변 도메인 또는 CD23 단클론성 항체 또는 이펙터 기능이 전혀 없는 항체 단편을 포함하는 이펙터 타입의 CD23 단클론성 항체 보다 현저하게 우수한 IL-4에 의해 유도되는 시스템에서 IgE 생성을 억제한다는 것을 발견하였다. 사람 감마-3 불변 도메인이 사람 감마-1과 동일한 이펙터 기능을 매개하는 것으로 드러났기 때문에, 사람 감마-3 불변 도메인을 포함하는 항사람 CD23 단클론성 항체도 또한 포함된다.
IgG(감마) 클래스의 항체에 대해 현재 5개의 규정된 이펙터 기능이 있다. 이들 기능 중 2가지 기능으로서 보충 활성화 및 FcγRN 상호작용은 본 발명에 기술된 시험관내 검정에서는 발견되지 않았으므로, 분자 메카니즘과 관련이 없는 것 같다. 나머지 세 개의 FcγR 수용체는 IgG 클래스의 항체와 상호작용하는 것으로 확인되었다: FcγRI, FcγRII(6개 이상의 상이한 단백질이 존재함) 및 FcγRIII(2개 이상의 상이한 단백질을 함유). 이들 세가지 수용체 모두는 IgG1 및 IgG3 둘 모두와 상호작용한다.
FcγRI는 세 가지 수용체 중 유일하게 IgG에 대하여 뚜렷한 친화도를 갖는다. 상기 수용체는 Ka가 약 5×108M-1인 단량체 감마-1 및 감마-3 둘 모두에 결합된다. 그러나, 사람 감마-4에 대한 이의 친화도는 약 10배 적으며, 사람 감마-2에는 전혀 결합하지 않는다[참고문헌 : Fries et al., 1982, J. Immunol. 129: 1041-1049; Kurlander and Batker, 1982, J. Clin. Invest. 69:1-8; Woof, 1984, G. Mol. Immunol. 21:523-527; Burton and Woof, 1992, Human Antibody Effector Function, Adv. Immunol. 51:1-84].
사람 IgG에 대한 사람 FcγRII 및 FcγRIII의 친화도가 일반적으로 매우 낮음(Ka<107M-1)에도 불구하고, 이들이 항원에 결합될 때는 사람 IgG1 및 사람 IgG3에 대한 친화도는 상당히 증가한다(Ka
Figure 112005058783527-pat00014
2 내지 5×107M-1)[참고문헌 : Karas et al., 1982, Blood 60: 1277-1282]. 항원에 결합된 사람 IgG2에 대한 사람 FcγRII의 친화도는 상반된 결과를 초래하였다. 사람 FcγRIII는 사람 IgG2에 결합하지 않는다. 사람 FcγRII 및 사람 FcγRIII는 사람 IgG4에 결합하지 않는다[참고문헌 : Van de Winkel and Anderson, 1991, J. Leuk. Biol. 49:511-524; Huizinga et al., 1989, J. Immunol. 142:2359-2364].
Fc 매개된 이펙터 기능이 때때로 항체의 치료적 활성에 중요하지만, 이러한 발견은 항-CD23 항체의 경우에는 놀라운데, 그 이유는 항-CD23 항체의 IgE 억제 활성에 있어 이펙터 기능의 역할이 이전에는 보고된 바가 없기 때문이다. 실제로, 이전의 증거는 항체 이펙터 기능이 유도된 IgE 생성을 억제하는 항-CD23 항체의 능력에 중요하지 않았음을 시사하였다. 예를 들어, 문헌[Flores-Romo et al., Science, 261:1038-1041(1993)]에는 다클론성 항-CD23 항체로부터 제조된 Fab가 생체내에서 유도된 IgE 항원 특이적 반응을 억제한다고 보고되어 있다.
항-CD23 항체의 불변 영역을 통해 매개되는 이펙터 기능이 명백히 관련되어 있다는 사실은, 본 발명자들이 항-IgE 억제 활성을 갖는 CD23에 특이적인 다양한 영장류 항체를 단리해내고 시험관내 및 생체내에서 IL-4 유도된 IgE 생성을 억제하 는 이들의 능력과 관련하여 이들 항체를 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00015
) 버전과 비교한 후에 밝혀졌다. 사람 감마-4 불변 영역으로 구성된 항체가 시험관내에서 IgE 항원 특이적 반응을 억제하는데 실패했지만, 사람 감마-1 불변 영역을 함유하는 항체는 성공적이었다.
세가지 클래스의 FcγR 수용체인 FcγRI, FcγRII 또는 FcγRIII 중의 하나(또는 그 이상)가 감마-1 도메인을 통해 매개되는 특이적 이펙터 기능과 관련이 있을 것이고, 또한 이들 클래스의 수용체가 감마-3 도메인을 포함하는 항체에 결합하기 때문에, 감마-3 도메인을 포함하는 항-CD23 항체가 시험관내에서 IgE 항원 특이적 반응을 억제하는 데에도 성공적일 것이라는 논리이다.
보다 구체적으로, 그리고 하기에 보다 상세하게 설명되듯이, 세포 및 가용성 CD23 둘 모두에 특이적으로 결합하는 5개의 영장류 단클론성 항체는 본원에 참고문헌으로 인용되고 공동으로 양도된 출원 제 08/379,072호, 즉 1997년 8월 19일자로 특허된 미국 특허 제 5,658,570호에 기술된 방법에 따라서 오울드 월드 원숭이(짧은꼬리원숭이)로부터 단리되었다. 상기 출원은 오울드 월드 원숭이에서 요망되는 항원, 요망되는 사람 항원에 대한 단클론성 항체를 생성시키기 위한 수단, 및 치료제로서 그 밖의 종의 항체와 관련된 이들의 장점, 예를 들어 사람과 오울드 월드 원숭이의 계통발생학적 근접성 때문에 사람에 있어서 면역원성을 감소시키거나 잠재적으로 소실시키는 장점을 상세하게 기술하고 있다. 실제로, 이들 종의 계통발생학적 근접성 때문에, 서열 비교에 의해서 오울드 월드 원숭이 면역글로불린과 사람의 면역글로불린을 구별하는 것은 어렵다.
이들 5개의 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 중 4개는 하기에 상세하게 기술하는 시험관내 B 세포 검정에서 IL-4 유도된 IgE 생성을 억제할 수 있는 것으로 입증되었으며, 가장 효능이 있는 항체는 SCID 마우스 동물 모델에서 IL-4 유도된 IgE를 억제하는 것으로 또한 밝혀졌다(또한 하기에 설명됨). 이러한 IgE 억제 활성, 및 사람에서의 예기된 낮은 면역원성에 근거할 때, 이러한 항체는 IgE 생성의 억제가 치료적으로 요망되는 질환을 치료하기 위한 치료제로서 잠재적으로 적합하다.
그러나, 면역원성을 추가로 감소시키기 위해서, 본원에 참고문헌으로 인용된 미국특허출원 제 08/379,072호(미국 특허 제 5,658,570호)에 또한 기술되어 있는 방법에 따라서 2개의 영장류 단클론성 항체(키메라화된 항체의 한 유형)를 영장류화(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00016
)시키는 것이 선택되었다. 영장류화(PRIMATIZATION
Figure 112005058783527-pat00017
)는 본질적으로 영장류 가변 영역 및 사람 불변 영역을 포함하는 아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션(IDEC Pharmaceuticals Corporation)에 의해 개발된 재조합 항체의 생성을 언급한다. 강력한 IgE 억제 활성을 갖는 두 개의 영장류 항사람 CD23 단클론성 (5E8 및 6G5) 항체의 영장류화(PRIMATIZATION
Figure 112005058783527-pat00018
)는 영장류 불변 도메인에 기인하는 사람에서의 임의의 잠재적인 면역원성을 제거하기 위해 효과적이었다.
또한, Fc 이펙터 기능이 유도된 IgE 억제를 위해 필요하지 않다는 문헌으로부터의 발명자들의 처음 예상 때문에, 이들 특정 항체의 사람 감마 4 버전을 초기에 생성시켰다. 그러나, 매우 놀랍게도, 이들 영장류 단클론성 항체 둘 모두로부 터 생성된 감마-4 버전이 효과가 없는 것으로, 즉, 이들이 시험관내 검정에서 IL-4 유도된 IgE 생성을 억제하는 영장류 항체 보다 상당히 높은 농도의 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00019
) 감마 4 항체를 필요로 한다는 것이 밝혀졌다.
더욱이, 동일한 두 개의 영장류 항체가 (영장류 불변 도메인 대신 사람 감마-1 불변 도메인을 사용함으로써) 사람 감마-1 변형체로 전환될 때, 이들 감마-1 항체가 시험관내에서 유도된 IgE 생성을 매우 효과적으로 억제한다는 발견은 더욱 더 놀라운 것이었다. 이와 같이, 본 발명자들의 결과는 Fc 이펙터 기능이 유도된 IgE 생성을 억제하는 항사람 CD23 항체의 능력에 명백하게 중요하다는 것을 시사한다. 이러한 가설은 시험관내에서 IgE 생성을 억제하는 것으로 본 발명자들에 의해 밝혀진 제 3의 항사람 CD23 단클론성, 즉, 2C8 항체가 시험관내에서 유도된 IgE 생성을 실질적으로 억제할 수 있는 것으로 밝혀진 F(ab')2로 전환되었을 때 확정되었다. 실제로, 이 F(ab')2는 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체 2C8의 활성을 블로킹하는 유도된 IgE에 대한 억제 효과를 길항시키는 것으로 밝혀졌다.
또한, 항체들 중의 하나(5E8)의 중쇄 가변 영역에서 글리코실화 부위를 제거하는 것이 CD23에 항체의 결합(수득된 Kd값에 의해 증명된 바와 같이), 또는 유도된 IgE 억제에 어떠한 영향도 미치지 않음이 밝혀졌다. 이와 같이, IgE 억제에 있어서의 차이는 명백하게 글리코실화 차이와 관계가 없는 것으로 밝혀졌다.
영장류 6G5의 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00020
) 감마 1 버전은 SCID 마우스에서의 유도된 IgE 발현을 억제하는 것으로 밝혀졌지만, 동일한 농도의 영장류 6G5 또는 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00021
) p6G5G4p는 유도된 IgE 발현을 억제하지 않았다. 따라서, 사람 감마-1 불변 도메인을 포함하는 항체는 영장류 단클론성 항체 보다 생체내 동물 모델에서 훨씬 더 효과적인 것으로 밝혀졌다. 더욱이, 본 발명자들은 감마-1 및 감마-3 불변 도메인이 동일한 클래스의 Fc 수용체에 대한 친화도를 갖기 때문에, 사람 감마-3 불변 도메인을 포함하는 항-CD23 항체가 감마-1 불변 도메인을 갖는 항체와 같이 효과적일 것이라고 예상한다.
따라서, 이러한 결과에 근거하여, 놀랍게도 활성 Fc 영역, 특히 사람 감마-1 또는 사람 감마-3 영역이 항사람 CD23 단클론성 항체에 의해 IL-4 유도된 IgE 억제 메카니즘과 상당히 관련이 있다는 것이 밝혀졌다. 이러한 발견은 특히, 다클론성 항-CD23 항체로부터 유도되는 Fab가 유도된 IgE 생성을 억제할 수 있다는 초기의 보고서에 근거할 때, 그리고 CD23이 유도된 IgE 발현에 영향을 미치는 방법에 관한 다양한 이론에 근거할 때 매우 뜻밖의 발견이다.
따라서, 본 발명은 사람 감마-1 또는 감마-3 불변 도메인을 함유하는 항사람 CD23 항체 및 IgE 발현을 효과적으로 억제하는 이들의 능력에 기초한 치료제로서의 이들의 용도에 관한 것이다.
당업자라면 키메라 항체를 제조하기 위한 당해기술분야에 널리 공지된 방법에 의해 사람 감마-1 또는 감마-3 불변 도메인을 함유하는 항사람 CD23 항체를 제조할 수 있다. 본질적으로, 이러한 방법은 바람직한 숙주 또는 시험관내에서 항사람 CD23 항체를 제조하고, 바람직한 특성, 예를 들어 적합한 CD23 결합 친화도를 나타내는 항사람 CD23 단클론성 항체를 생성시키는 하이브리도마 또는 세포주를 클 로닝시키고, 상기 하이브리도마 또는 세포주로부터 이러한 항체를 엔코딩하는 핵산 서열을 예를 들어 적합한 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응에 의해 클로닝시키고, 내부에 포함된 가변 도메인을 단리시키고, 이러한 가변 도메인을 사람 감마-1 또는 감마-3 불변 도메인 및 적합한 사람 경쇄 불변 도메인과 재조합시키고, 적합한 발현 시스템에서 키메라 항사람 CD23 감마-1 또는 감마-3 면역글로불린을 엔코딩하는 핵산 서열을 발현시키는 것을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 항사람 CD23 항체는 0.1nM 내지 1000nM, 보다 바람직하게는 50nM 이상, 가장 바람직하게는 5nM 이상의 명백한 CD23 결합 친화도를 가질 것이다.
재조합 면역글로불린의 발현에 적합한 숙주 세포는 당해기술분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 재조합 항체는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, DG44 또는 DUXB11 ; 또는 CHO 세포 CHO K-1; 마우스 골수종 세포 SP2/0 또는 X63-Ag8.653 또는 NSO; 래트 골수종 세포 YB2/0; 햄스터 새끼 신장 세포, BHK; 사람의 배아 신장 세포주, HEK293; 원숭이 신장 세포, CV1; 사람의 폐 섬유아세포, WI38; 사람의 경부 암종 세포, HELA; 곤충 세포, 식물 세포, 효모 또는 박테리아에서 발현될 수 있다. 추가로, 면역글로불린의 발현에 적합한 벡터도 당해기술분야에 널리 공지되어 있으며 현재 시판되고 있다.
특히 바람직한 벡터 시스템은 미국특허출원 제 08/147,696호, 즉 1997년 7월 15일자로 특허된 미국 특허 제 5,648,267호에 기술된 번역적으로 손상된 벡터 시스템으로서, 바람직한 이종 DNA가 삽입되어 있는 인트론을 포함하고 있는 번역적으로 손상된 주요 선별 마커(neo)를 포함하고 있다. 이러한 벡터 시스템은 매우 높은 수율의 재조합 단백질, 예를 들어 면역글로불린을 제공하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 목적하는 항-CD23 항체는 기능적인 면역글로불린의 발현에 적합한 어떠한 벡터 시스템에서도 생성될 수 있다.
또한, 본 발명은 사람 CD23에 특이적인 감마-1 또는 감마-3 타입의 사람 단클론성 항체를 포함한다. 사람 단클론성 항체의 단리 방법은 당해기술분야에 널리 공지되어 있으며, 시험관내 방법, 예를 들어 조직 배양시에 사람 B 세포의 시험관내 면역화, 및 생체내 방법, 예를 들어 SCID 마우스에서 사람 단클론성 항체의 합성을 포함한다. 사람의 비장 세포의 시험관내 프라이밍을 조합한 후 이를 SCID 마우스에 도입시켜 SCID 마우스에서 사람 단클론성 항체를 제조하는 바람직한 방법은 본원에 참고문헌으로 인용된 미국특허출원 제 08/488,376호, 즉 1998년 9월 22일자로 특허된 미국 특허 제 5,811,524호에 기술되어 있다. 이러한 방법은 바람직한 항원, 예를 들어 사람 항원에 대하여 고친화도를 갖는 단클론성 항체의 재현가능한 회복을 제공하기 때문에 유리하다.
또한, 본 발명은 CD23에 결합하기 위해 영장류의 항사람 CD23 단클론성 항체 5E8 및 6G5와 경쟁하는 사람 단클론성 항체를 포함한다.
실시예
실시예 1
영장류 항- CD23 항체의 생성
CD23에 특이적인 5개의 영장류 단클론성 항체를 실질적으로 본원에 참조로 기술된 미국특허출원 제 08/379,072호(미국 특허 제 5,658,570호)에 기술된 방법에 따라서 짧은꼬리원숭이로부터 단리시켰다. 사용된 정확한 기술은 하기에 상세하게 기술한다.
항사람 CD23 단클론성 항체의 단리 및 특성화 방법
8866 세포로부터 면역원 sCD23 의 정제
정제하는 동안, 포획물로서 뮤린 항-CD23 항체(바인딩 사이트(Binding Site); 카탈로그 # MC112)를 사용하여 3 단계 ELISA에 의해 가용성 CD23(sCD23)을 정량하였다. 37℃에서 10% 우태아 혈청(제이알에이치 바이오사이언시즈(JRH Biosciences)) 및 4mM 글루타민(제이알에이치 바이오사이언시즈; 카탈로그 # 90114)으로 보충된 RPMI 1640(제이알에이치 바이오사이언시즈; 카탈로그 # 56-509)을 사용하여 현탁액 생반응기내에서 유지시킨 8866 세포의 배양액으로부터 항원을 부분적으로 정제하였다. 이산화탄소를 사용하여 pH 7.1로 유지시켰다. 0.45㎛ 여과에 의해 세포를 제거한 후, 페닐메틸 설포닐 플루오라이드(최종 농도 0.2mM, 시그마 케미칼 컴파니(Sigma Chemical Co.); 카탈로그 # P-7626) 및 에틸렌디아민테트라아세트산 (최종 농도 3mM, 시그마 케미칼 컴파니; 카탈로그 # EDS)을 상층액에 첨가하고 생성된 용액을 2-8℃에서 저장하였다. 무세포 상층액을 주위 온도에서 중공 섬유 한외여과 카트리지(A/T 테크놀로지; 카탈로그 # UFP-10-C-9A; 10,000 d MWCO) 또는 접선 흐름 한외여과 카트리지(필트론 코포레이션(Filtron Corporation); 10,000 d MWCO)를 사용하여 약 15배 내지 20배 농축시켰다. 농축된 상층액을 멸균 여과하고 -70℃에서 보관하였다. 해빙시킨 농축물을 5g/L으로 SM-2 바이오비즈(BioBeads)(바이오래드 인더스트리즈(BioRad Industries); 카탈로그 # 152-3920)를 첨가함으로써 탈지시키고 2-8℃에서 밤새 교반하였다. 수지를 여과에 의해 제거하고 생성된 용액을 2-8℃에서 저장하였다. sCD23의 일부 제조물에 대해, 탈지전 또는 후에 농축물을 황산암모늄(35-70%(w/v); 피셔(Fisher); 카탈로그 # A702-3)을 사용하여 분별시켰다.
그런 다음, 탈지된 용액을 2 내지 8℃에서 친화도 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다. CNBr 활성화된 세파로오스 4B(시그마 케미칼 컴파니; 카탈로그 # C-9142)를 사용하여 뮤린 항-CD23 단클론성 항체(BU38)을 세파로오스에 공유 결합시킴으로써 친화도 매트릭스를 제조하였다. 단백질 A 크로마토그래피를 사용하여 복수(바인딩 사이트; 카탈로그 # CUS830)로부터 BU38 항체를 90% 동질성 미만까지 정제하였다. 탈지된 용액을 pH 7.2인 1XPBS(기브코 비알엘(Gibco BRL); 카탈로그 # 70013-0.32)로 평형화시킨 친화도 칼럼(1.5×5cm)에 적용하고 칼럼을 pH 7.2이고 0.05% NP40(시그마 케미칼 컴파니)을 함유하는 1XPBS로 세척하여 비결합된 단백질을 제거하였다. 가용성 CD23을 3.5M MgCl2(피셔; 카탈로그 # M33-500)를 사용하여 용리시켰다. sCD23을 함유하는 분획을 조합시키고 2 내지 8℃에서 pH 7.2인 1XPBS에 대하여 투석시켰다(박스터 스펙트라/포어(Baxter Spectra/Por); 카탈로그 # D1615-1). 투석 후에, 센트리프렙 10 스핀 여과기(아미콘 코포레이션(Amicon Corporation); MWCO 10,000d)를 사용하여 원심분리하여 단백질 용액을 농축시키고 제조물을 -70℃에 보관하였다. sCD23의 순도는 SDS-PAGE 분석(4-20% 프리케스트 겔, 노벡스 코포레이션(Novex Corporation)) 및 쿠마쉬(Coomasie) 착색법을 사용하 여 측정한 결과 70% 미만인 것으로 평가되었다.
영장류의 면역화 및 면역 세포의 단리
사이노몰거스 원숭이(뉴 멕시코 알라모고르도에 소재하는 화이트 샌즈 리서치 센터)를 사람의 RPMI 8866 세포[B cell lymphoma, Hassner and Saxon, J. Immunol., 132:2844 (1984)]의 상층액으로부터 정제된 가용성 CD23으로 면역화시켰다. 각각의 원숭이를 167㎕의 테뮤리티드(애쥬번트 펩티드)(미주리 세인트 루이스에 소재하는 시그마, 카탈로그 # A-9519) 및 333㎕의 3×프로박스(PROVAX
Figure 112005058783527-pat00022
)(아이덱 파마슈티칼즈 코포레이션)와 혼합된 500㎕ PBS 중의 200㎍의 가용성 CD23으로 3주 마다 면역화시켰다. 면역은 피내, 복막내, 근육내 및 피하적으로 수행되었다. 원숭이 혈청내 항-CD23 항체의 역가를 8866 세포상에서 ELISA에 의해 측정하고 동일한 원숭이로부터 사전에 채취한 혈액과 비교하였다.
혈청 역가가 50,000인 원숭이 PRO 978을 희생시키고, 비장 및 림프마디를 외과적으로 제거하고, 얼음상에서 아이덱 파마슈티칼즈로 수송하고 10% 우태아 혈청, 2mM L-글루타민, 2mM 소듐 피루베이트 및 50㎍/ml의 젠타마이신으로 보충된 멸균 RPMI-1640 (메릴랜드 가이테르스베르그에 소재하는 기브코 비알엘, 카탈로그 # 21870-050)에 넣었다. 도착하자마자, 비장을 유리 암술로 와이어 메쉬를 통해 압착시킴으로써 균질화하였다. 적혈구를 염화암모늄 기재의 저장성 완충액에서 용해시키고 잔류하는 림프구를 수집하고 RPMI-1640 중에서 세 번 이상 세척하였다. 림프마디를 단일 세포 현탁액내로 유사하게 균질화시키고, 수집하고 RPMI-1640중에서 세 번 이상 세척하였다.
하이브리도마의 생성
마지막으로 세척한 후, 세포의 수를 세고, 이어서 상기 수득된 영장류 세포를 표준 기술[참고문헌 : Boerner et al., J. Immunol., 147:86 (1991)]을 사용하여 마우스-사람 헤테로하이브리도마 세포주 H6K6/B5[참고문헌 : Carroll et al., J. Immunol. Methods, 89:61 (1986)]에 체세포적으로 융합시키고, 웰 당 300,000 세포로 96웰 디쉬(비장의 경우 175 디쉬 또는 14,700 웰, 및 림프마디의 경우 17 디쉬 또는 1386 웰)내로 플레이팅시켰다.
이러한 과정은 2:1의 비로 림프구와 상기 동정된 융합 파트너를 혼합시키고 세포를 1분 동안 50% PEG 1500(시그마, 카탈로그 # P5402)중으로 서서히 재현탁시키는 것을 포함하였다. 그런 다음, 이들 세포를 1분 동안 방치시킨 후 과량의 RPMI-1640중에 서서히 재현탁시켰다. 그런 다음, 250×g으로 광 스핀 전에 15분 동안 세포를 다시 방치시켰다. 그 다음, 20% 우태아 혈청, 2mM L-글루타민, 소듐 피루베이트, 비필수 아미노산, 및 100μM 하이포잔틴, 16μM 티미딘(독일의 뵈링거만하임, #623091) 및 5.8μM 아자세린(시그마, 카탈로그 # A 1164)(HTA)을 함유하는 50㎍/ml 젠타마이신으로 보충된 RMPI-1640 성장 배지중에 세포를 재현탁시켰다. HTA는 성공적으로 융합된 세포(헤테로하이브리도마 융합 파트너와 융합된 영장류 림프구)의 생존을 제공하는 선택 제제이다.
약 65%의 웰은 성장을 보여주었다(10,500웰). 그런 다음, 이들 웰을 3 단계 세포 ELISA에 의해 항사람 CD23의 존재하에 스크리닝하였다.
ELISA 방법
ELISA의 제 1 단계는 각각의 웰로부터 웰 당 105 8866 세포(CD23 포지티브 세포주)로 이전에 코팅된 96 웰 플레이트로 50㎕의 상층액을 옮기는 것을 포함하였다. 실온에서 30분 동안 20㎍/ml 폴리 L-리신(시그마, 카탈로그 #P1399, MW 150,000 내지 300,000)을 함유하는 50㎕의 수용액으로 플레이트를 먼저 코팅시킴으로써 이들 플레이트를 제조하였다. 잔류 용액을 제거("플리키드 아웃(flicked out"))하고 남겨진 플레이트를 건조시켰다. 한차례 건조하고, PBS중의 50㎕의 8866 세포를 옮기고 5분 동안 600 g로 회전시켰다. 15분 동안 포스페이트 완충된 염수(PBS)중에 50㎕의 0.5% 글루타르알데히드(시그마, 카탈로그 # G6257)를 첨가함으로써 8866 세포를 플레이트에 공유결합시켰다. 글루타르알데히드를 제거하고(플리키드 아웃) 0.1% BSA-PBS중의 150㎕의 100mM 글리신(시그마, 카탈로그 # G-2879)으로 플레이트를 블로킹시켰다. 상층액의 첨가 후, 플레이트를 37℃에서 1 내지 2 시간 동안 인큐베이션시키고 수돗물로 7 내지 9회 세척하고, PBS - 0.05% 트윈 20(시그마, 카탈로그 # P1379)중의 1% 건조 탈지유(본스(Vons))중으로 1:2000의 비로 희석된 양고추냉이 페록시다아제(HRPO)(알라바마 버밍햄에 소재하는 서던 바이오테크(Southern Biotech), 카탈로그 # 2040-05)에 커플링된 염소 항사람 IgG 항체를 첨가하였다. 플레이트를 37℃에서 45분 동안 인큐베이션시키고 다시 수돗물로 7회 내지 9회 세척하였다. HRPO의 존재는 TMB 시약(메릴랜드 가이테르스베르그의 커케가드 앤 페리(Kirkegaad & Perry), 카탈로그 # 50-76-02 및 50-65-02)을 100㎕/웰로 첨가한 후의 발색에 의해 검출하였다. 반응을 25㎕ 4N H2SO4를 첨가함으로써 중 지시켰다. 분광광도계(티터테크 멀티스캔(Titertek Multiscan))상에서 470nM에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다. 백그라운드 보다 2배 더 큰 OD 값이 포지티브로 기록되었다.
ELISA의 제 2 단계는 제 1 ELISA에서 포지티브로 기록된 상층액이 CD23에는 반응하지만 일부 부적합한 항원에는 반응하지 않는다는 것을 확정하기 위해 수행되었다. 이러한 단계는 동일한 ELISA 방법을 사용하여 SupT1 세포(메릴랜드 록빌에 소재하는 이알씨 바이오서비시즈 코포레이션(ERC BioServices Corporation), 카탈로그 # 100), CD23 네거티브 사람 세포주상에서 상층액을 시험함으로써 수행하였다. 양 시험에서 유사하게 기록된 상층액은 폐기시켰다. 이들 결과는 성장시킨 10,500 웰중 56개가 상이한 시간에 두 개의 별도의 스크리닝에서 8866 세포에 결합되고 SupT1 세포에는 결합하지 않는 영장류 단클론성 항체의 존재를 보여줌을 나타낸다.
ELISA의 제 3 단계는 먼저의 두 ELISA 단계에 따라서 동정된 상층액이 가용성 CD23과 반응하는 지의 여부를 결정하기 위해 수행되었다. 이러한 제 3 ELISA에서, 96웰 플레이트를 2㎍/ml BG-6(캘리포니아 카마릴로에 소재하는 바이오소스 인터내셔날(Biosource International), 카탈로그 # CT-CD23-CF), 및 pH 9.3의 50mM 중탄산염 완충액에 함유된, 가용성 CD23에는 결합하지만 CD23-IgE 결합을 블로킹시키지 않는 마우스 단클론성 항체로 4℃에서 밤새 코팅하였다. 코팅 완충액을 제거한 후, PBS중에 소정량 희석된 50㎕의 반정제된 가용성 CD23을 플레이트에 첨가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 플레이트를 수돗물로 7회 내지 9회 세 척한 후, 선택된 웰로부터 50㎕의 상층액을 첨가하였다. 플레이트를 수돗물로 7회 내지 9회 세척한 후, 0.05% 트윈 20을 함유하는 PBS중의 1% 건조 탈지유중에 1:4000으로 희석된 50㎕의 토끼 항사람 IgG(마우스 흡수된)-HRPO (서던 바이오테크, 카탈로그 # 6145-05)를 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시키고, 수돗물로 7회 내지 9회 세척하고 상기된 바와 같이 TMB로 발색시켰다. 백그라운드 보다 2배 높은 OD를 갖는 웰을 다시 포지티브로 기록하였다.
8866 세포에 결합하는 것으로 나타난 56개 웰 중 21개 웰은 ELISA에서 sCD23에도 결합하였다. 이들 웰을 증량시키고 세 개의 웰 당 하나의 세포로 세포를 플레이팅시킴으로써 적어도 2회 서브클로닝시켰다. 약 3개월 후, CD23에 대한 영장류 단클론성 항체를 생성시키는 5개의 적합한 하이브리도마를 수득하였다.
단백질 A 방법에 의한 항체 정제
본질적으로, 항체는 배양 상층액을 원심분리하여 세포 및 찌꺼기를 제거함으로써 정제된다. 그 다음, 생성된 원심분리된 샘플을 0.2㎛ 필터를 통해 여과시킨다. 그 다음, 단백질 A 세파로오스 패스트 플로우 칼럼을 제작하고 PBS(pH 7.4)를 사용하여 평형화시킨다. 그 다음, 상층액을 적합한 유속(2ml/분)으로 칼럼에 로딩시킨다. 로딩시킨 후, 세척 칼럼을 10 칼럼 부피의 PBS(pH 7.4)로 세척한다. 그 다음, 항체를 1ml/분의 유속으로 용리 완충액(0.2M 아세트산, 0.1M 글리신 pH 3.5)을 사용하여 칼럼으로부터 용리시켰다. 그 다음, 100㎕의 트리스를 포함하는 1 ml의 분획/튜브(2.0M 트리스-HCl pH 10.0)를 수집하였다. 그 다음, 분광광도계 판독치는 280nm에서 취하였다. 그 다음, 항체를 함유하고 280nm에서 높은 흡광도를 갖 는 생성된 분획을 수집하고 PBS에 대하여 밤새 투석시켰다. 그 다음, 생성물을 0.22㎛ 막을 통해 여과시킴으로써 멸균하고 -20℃에 보관하였다.
이들 5개의 영장류 항사람 CD23 단클론성 항체중 네 개(B3B11, 2C8, 5E8 및 6G5)는 IL4-하이드로코르티손 유도된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 배양에 의해 IgE 생성을 측정하는 시험관내 검정에서 IgE 생성을 억제하는 것으로 입증되었다. 이들 결과는 도 1에 도시된다. 검정 조건은 하기에 기술된다. 5번째 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 3G12는 본 검정에서는 비활성적이었다.
말초 혈액 단핵 세포에 의해 IL-4 자극된 IgE 생성
앞서 기술된 바와 같이, IL-4 자극된 말초 혈액 단핵 세포에 의해 IgE 생성에 대한 항체의 효과를 측정하는 시험관내 검정에서 IgE 생성을 억제하는 이들의 능력에 대하여 목적하는 영장류 항체 및 이들의 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00023
) 형태를 평가하였다.
시험관내 IL-4 IgE 검정을 위한 물질
48개의 웰의 평평한 바닥 클러스터 플레이트(코스타(Costar), 카탈로그 # 3548)(1개의 웰에 대하여 1ml 당 1,500,000 PBMCs (48 웰 플레이트))
사람의 재조합 IL-4 (겐자임(Genzyme), 카탈로그 # 2181-01; 10㎍ (2.5×107 유닛).
항-CD23 Mab :
뮤린 Mab (MHM6 ; DAKO. 카탈로그 # M763)
영장류 Mab (보존제 부재)
영장류화(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00024
) (보존제 부재)
HB 101 기초 배지: (어빈 싸이언티픽(Irvine Scientific) 카탈로그 # T000)
HB 101 보충물: (어빈 싸이언티픽 카탈로그 # T151)
우태아 혈청: (FBS; 바이오-위태커(Bio-Whittaker), 카탈로그 # 14-501F)
디메틸설폭시드: (DMSO; 피셔 싸이언티픽 카탈로그 # D128-500)
하이드로코르티손: (시그마 카탈로그 # H-0888)
퓨로마이신: (시그마 카탈로그 # P-7255)
사이클로헥사미드: (시그마 카탈로그 # C-7698)
히스토페이크(Histopaque
Figure 112005058783527-pat00025
): (시그마 카탈로그 # H-8889)
행크스 완충화된 염 용액: (HBSS; 어빈 싸이언티픽 카탈로그 # 9232)
HBSS중의 1% FBS
농축된 둘베코스 포스페이트 완충화된 염수(10×DPBS; 바이오-위태커, 카탈로그 # 17-517Q)
DPBS중의 배쓰 클리어 살균제(피셔, 카탈로그 # 13-641-334)
용액:
퓨로마이신 용액 : HB101 성장 배지 중의 40㎍/ml
사이클로헥사미드 용액 : HB101 성장 배지 중의 200㎍/ml
하이드로코르티손 용액 : DMSO 중의 0.1M 용액
항-CD23 뮤린 Mab를 광범위하게 투석하여 보존제를 제거하였다.
HB101 성장 배지
HB101 기초 배지 500ml
HB101 보충물 10ml
멸균 여과된 증류수 5ml
FBS 10ml
하이드로코르티손 용액(최종농도5μM) 0.25ml
시험관내 검정 방법
실온에서 HBSS를 사용하여 연막(Buffy coat) 세포를 1:4로 희석시켰다. 실온에서 밤새 인큐베이션시킨 후에 이들 세포를 전혈로부터 유도하여 혈장 성분, 응고된 혈소판 및 피브린, 및 연막 세포를 용해시키고 분리하였다.
그 다음, 30㎕의 희석된 연막을 50ml 원뿔형 삼각 플라스크중의 15㎕의 히스토페이크상에 오버레이시켰다. 그 다음, 이들 튜브를 제동 없이 실온에서 20분 동안 1700rpm으로 원심분리하였다(IEC 216 스윙 버킷 로터 사용). 그 다음, 다른 층에 영향을 미치지 않도록 주의하면서 멸균 피펫을 사용하여 백색의 PBMC 층을 수집하였다. PBMC(말초 혈액 단핵 세포)는 세포의 명백하게 가시화될 수 있는 백색층을 형성시키기 위해 히스토페이크
Figure 112005058783527-pat00026
밀도 구배를 통한 부분적인 원심분리에 의해 침전된 연막 세포이다. 피펫으로 이들 세포를 수집하고, HBSS로 세정시키고, 이어서 헤모사이토미터를 사용하여 그 수를 세었다. 전형적으로, 30억 내지 60억 PBMC가 단일의 450ml 연막 패키지로부터 회수될 수 있다.
그 다음, 수집된 PBMC를 1% FBS/HBSS 중에서 3회 세척하였다. 세척된 세포를 7℃에서 1300rpm으로 7분 동안 원심분리하여 수집하였다.
그 다음, 수집된 세포의 수를 헤모사이토미터를 사용하여 결정하였다. 세포 농도를 HB101 성장 배지의 1ml 당 약 3백만개의 세포가 되도록 조정하였다.
그 다음, 약 1.5 백만 세포(0.5ml)를 48웰 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 일반적으로, 각 실험때마다 5개의 복제 샘플을 제조하였다. 각 플레이트의 주변 웰은 세포 샘플로서 사용하지 않았다. 따라서, 이들 웰은 예를 들어 0.05% 배쓰 클리어/DPBS를 사용하여 충전된다.
그 다음, 바람직한 양의 IL-4 및 Mab를 함유하는 0.5ml의 HB101 성장 배지를 웰에 첨가하였다. 사용된 IL-4는 재조합 DNA 발생된 사람의 인터루킨 4였다. 검정에 사용된 Mab는 뮤린, 영장류 또는 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00027
) 항체였다. 전형적으로, IL-4를 100U/ml의 최종 농도로 첨가하고 Mab를 0.01 내지 3㎍/ml의 최종 농도로 첨가하였다.
그 다음, 세포를 5% CO2로 설정된 가습 인큐베이터내에 37℃에서 9 내지 11일 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션시킨 후, 상층액을 수집하고 IgE 함량을 측정하였다.
IgE ELISA
다음의 리스트는 IgE ELISA에서 사용되는 물질 및 용액이다.
IgE ELISA에 필요한 물질 및 용액
황산, 4M
코팅 완충액: 10mM 중탄산나트륨 완충액, pH 9.6
농축된 포스페이트 완충화된 염수(10×PBS) 스톡 용액:
NaH2PO4 26.6gm
Na2HPO4 289gm
NaCl 1064gm
증류수 10 L
블로킹 완충액: 10% FBS/PBS
희석 완충액: 1% BSA/0.05% 트윈 20/PBS
세척 완충액: 0.05% 트윈 20/PBS
비표지된 염소 항사람 IgE(엡실론 사슬 특이적): (타고(Tago) 카탈로그 # 4104)
표준 사람 IgE: (더 바인딩 사이트 카탈로그 # BP094)
HRP 표지된 염소 항사람 IgE: (타고 카탈로그 # AHI0504)
TMB 페록시다아제 기질: (KPL 카탈로그 # 50-76-02)
페록시다아제 용액 B: (KPL 카탈로그 # 50-65-02)
작업 기질 용액 : 1:1 비로 기질과 용액 B가 혼합된 용액
이뮤론(Immulon) II 마이크로역가 플레이트(다이나테크 랩스(Dynatech Labs) 카탈로그 # 011-010-3455)
IgE ELISA 방법
2㎍/ml의 염소 항사람 IgE를 함유하는 100㎕의 코팅 완충액을 사용하여 마이크로역가 플레이트의 각 웰을 코팅하였다.
그 다음, 코팅된 플레이트를 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 플레이트내 각 웰을 200㎕의 트윈 20/PBS로 3회 세척하였다. 세척 후, 비특이적 결합 부위를 37℃에서 1시간 동안 200㎕의 블로킹 완충액/웰로 블로킹시켰다.
그 다음, 100㎕의 샘플 또는 표준물을 각각의 웰에 첨가한 다음; 웰을 4℃에서 밤새 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 샘플을 희석하여 또는 희석 없이 시험하였다. 표준 농도 곡선을 각 플레이트에 대해 0.1 내지 50ng/ml 범위의 수개의 IgE 희석액을 사용하여 작성하였다.
밤새 인큐베이션시킨 후, 각각의 플레이트를 트윈 20/PBS로 5회 세척하였다.
그 다음, 희석 완충액중에서 1:10,000로 희석된 100㎕의 양고추냉이 페록시다제(HRP) 표지된 염소 항사람 IgE를 각각의 배수된 웰에 첨가한다. 그 다음, 플레이트를 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션시킨다.
그 다음, 플레이트를 트윈 20/PBS로 5회 세척하고 물로 3회 세척하였다.
그 다음, 100㎕의 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 작업 기질 용액을 각각의 웰에 첨가하였다. 그 다음, 플레이트를 실온에서 암실에 25분 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 50㎕의 4M 황산을 첨가하여 발색 반응을 중지시켰다.
450 및 540nm에서의 흡광도를 동시적으로 판독하였다. 540nm에서의 흡광도 값을 백그라운드에서 감산하였다.
영장류 단클론성 항사람 CD23 항체의 Kd 측정을 위한 검정
스케차드 ( Scatchard ) 분석 방법
1. 방사성 표지 방법
2개의 비드 당 1mL의 완충액을 사용하여 2회에 걸쳐 IODO-BEADS를 pH 7.4의 100mN 포스페이트 완충액으로 세척하였다. 그 다음, 비드를 여과지상에서 건조시켰다.
그 다음, 두 개의 비드를 약 1mCi의 I를 함유하는 100㎕ 125I 용액에 첨가하고, 200㎕의 포스페이트 완충액으로 희석시키고 5분 동안 실온에서 방치시켰다.
항체(50㎍s)을 사전 로딩된 비드에 첨가하였다. 방사성의 최대 혼입을 위한 반응 시간은 6분이었다.
반응 용기로부터 방사성 표지된 항체를 제거함으로써 반응을 중지시켰다.
그 다음, 겔 여과를 수행하여 방사성 표지된 항체 용액으로부터 과량의 125I 또는 혼입되지 않은 125I를 제거하였다. 이것은 1.5mL 세파덱스-G25, 1.5mL DEAE 세파덱스-A25 및 0.5mL 암베르리트(Amberlite)로 구성된 칼럼상에서 방사성 표지된 항체를 통과시킴으로써 수행하였다. 방사성 표지된 항체를 약 10㎍/mL의 농도로 5mL의 전체 부피중에 용리시켰다. (용리 완충액: 10% 젤라틴, 2% 소듐 아지드 및 1% BSA를 함유하는 1XPBS).
2. 최적화 검정 (직접 결합 연구)
1㎕ 샘플을 취하고 감마 카운터상에서 이 샘플을 런닝시킴으로써 10㎍/mL의 방사성 표지된 용액의 특이적 활성을 결정하였다.
예:
· 1×105cpm/㎕×1000㎕/10㎍ 항체
1×105cpm/㎍ 항체
1×104cpm/ng 항체
· 항체의 분자량 = 75,000ng/nmole
· 특이적 활성
1×104cpm/ng×75,000ng/nmole = 7.5×108cpm/nmole
항원 코팅된 플레이트를 블로킹시키고(예를 들어 mB7.1-CHO와의 비특이적 결합을 제거하기 위함), 백그라운드 플레이트(즉, 트렌스펙션되지 않은 CHO)를 200㎕/웰의 블로킹 완충액(블로킹 완충액: 10% 젤라틴, 2% 소듐 아지드, 1% BSA 및 10% FBS를 함유하는 1xPBS)으로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다.
그 다음, 플레이트(들)를 전형적으로는 수돗물을 사용하여 손으로 10회 세척한다.
그 다음, 멀티채널 피펫을 사용하여 플레이트(들)를 가로질러 2배 연속 희석시킴으로써 10㎍/ml의 방사성 표지된 항체(50㎕)를 적정하였다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
플레이트(들)를 200㎕/웰의 세척 완충액(세척 완충액: 10% 젤라틴 및 2% 소듐 아지드를 함유하는 1×PBS)으로 약 6 내지 7회 세척하였다.
그 다음, 각각의 웰에서의 방사능 카운트를 감마 카운터상에서 웰을 런닝시킴으로써 결정하였다.
최적의 방사성 표지된 항체 농도는 특정 카운트와 백그라운드 카운트 사이의 차가 최대인 농도이다.
3. 경쟁 검정의 스케차드 분석
10㎍/ml의 방사성 표지된 용액을 희석하여 직접 결합 실험에서 결정된 최적 농도가 되게 하였다.
항원 코팅된 플레이트 및 백그라운드 플레이트를 200㎕/웰의 블로킹 완충액으로 실온에서 1시간 동안 블로킹시켰다.
그 다음, 플레이트를 예를 들어 수돗물을 사용하여 손으로 약 10회 세척하였다.
그 다음, "차가운"(방사성 표지되지 않은) 항체를 별도의 U-바닥 마이크로역가 플레이트에서 2배 희석함으로써 적정하였다. "차가운" 항체의 출발 농도는 최적의 방사성 표지된 항체 농도 보다 100배 이상 커야 한다.
예:
· 최적의 방사성 표지된 농도: 0.5㎍/mL
· "차가운" 항체 농도 : 100㎍/mL (주: 첫 번째 웰에서의 1:2 적정은 "차가운" 항체 농도를 50㎍/mL가 되게 할 것이다.)
그 다음, 50㎕/웰의 최적의 방사성 표지된 항체를 "차가운" 항체를 함유하는 웰에 첨가하였다.
그 다음, 100㎕/웰의 혼합 용액을 항원 코팅된 플레이트의 상응하는 웰로 옮기고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다.
또한, 다음과 같이 조절하는 것도 바람직하다 :
a) 방사성 표지된 항체를 항원 코팅된 플레이트(5 웰)에 직접 결합,
b) 방사성 표지된 항체를 백그라운드 플레이트(5 웰)에 직접 결합.
인큐베이션 후, 플레이트(들)를 200㎕/웰의 세척 완충액으로 예를 들어 약 6 내지 7회 세척하였다.
그 다음, 각 웰에서의 방사능 카운트를 감마 카운터상에서 웰을 런닝시킴으로써 결정하였다.
이들 계산은 항원 코팅된 플레이트에 결합된 카운트로부터 백그라운드 카운트를 감하여 시험된 각 웰에서의 특정 카운트를 계산함으로써 결정된다.
4. 스케차드 분석에 대한 계산
결합된 항체[B]의 몰농도는 다음과 같이 결정될 수 있다:
예: 50㎍/mL의 "차가운 항체"에서
결합된 특정 카운트 : 4382cpm
50㎍/mL의 "차가운" ab의 존재하에 결합된 카운트: 215cpm
차 : 4382cpm - 215cpm = 4167 cpm
특이적 활성(방사성 표지된 ab) : 5.54×109cpm/nmole
4167cpm ÷5.54×109cpm/nmole = 7.52×10-7nmole
7.53×10-7nmole ÷0.05mL (샘플 부피)
= 1.50×10-5nmole/mL
= 1.50×10-8μmole/mL
[B] = 1.50×10-11mole/mL (M)
전체 몰농도[T]는 다음과 같이 결정된다:
50㎍/mL × 1μmole/75,000㎍ = 6.67×10-4μmole/mL
= 6.67×10-7mmole/mL (M)
[T] = 66667×10-11mmole/mL (M)
유리된 항체[F]는 다음과 같이 결정된다:
유리된 항체의 몰농도 = 전체 항체 마이너스 결합된 항체
[F] = (66667×10-11) - (1.50×10-11)
= 66665.5×10-11mmole/mL (M)
계산 B/F.
크리켓 그래프 소프트웨어상에서 B 대 B/F를 플롯.
본 발명에 따른 항사람 CD23 항체의 활성도 및 친화도
5개의 단리된 영장류 항사람 CD23 단클론성 항체 중 4개의 항체(B3B11, 2C8, 5E8 및 6G5)는 IL4- 하이드로코르티손 유도된 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 배양에 의한 IgE 생성을 측정하는 상기 동정된 시험관내 검정에서 IgE 생성을 억제하는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 도 1에 도시하였다. 다섯 번째 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 3G12는 이러한 검정에서 비활성적이었다.
이러한 시험관내 검정에서 활성적인 것으로 밝혀진 4개의 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 중의 2개의 항체(B3B11 및 2C8)는 시판중인 마우스 항사람 CD23 항체 MHM6(덴마크 글로스트럽에 소재하는 카코 에이/에스(CAKO A/S) 카탈로그 # M763)과 경쟁하는 것으로 밝혀졌다(도 2의 상부 패널). 그러나, 반복 검정에서, 이들 항체는 MHM6과 같이 효능이 있는 IgE 억제제가 아니었다(데이터는 도시되지 않음). 이와 대조적으로, 그 밖의 영장류 항-CD23 단클론성 항체(5E8 및 6G5)는 서로 경쟁하지만 MHM6과는 경쟁하지 않는 것으로 밝혀졌다(도 2의 중간 및 하부 패널). 더욱이, 영장류 항사람 CD23 단클론성 항체 5E8은 시험관내 검정에서 IL-4 유도된 IgE의 유효한 억제제인 것으로 밝혀졌다(도 1 및 3 참조).
사람 IgE 합성을 위한 변형된 Hu - SCID -마우스 모델 및 생체내 항- CD23 항체에 의한 IL-4 유도된 IgE 생성의 억제의 측정
변형된 hu-PBMC-SCID 마우스 모델을 개발하여 생체내에서 유도된 사람 IgE 생성에 대한 목적하는 항체의 효과를 검출하였다. 2개의 공여체로부터 수득된 PBMC를 2일 동안 시험관내에서 IL-4와 함께 인큐베이션시켰다. PBMC를 합치고 항 체를 갖는 및 항체를 갖지 않는 C.B.-17 SCID 마우스 그룹을 재구성하기 위해 사용하였다. 14, 21, 28 및 35일에 마우스로부터 혈액을 채취하고 ELISA에 의해 혈청 IgG 및 IgE 레벨을 결정하였다. 이러한 생체내 모델을 사용하여 IgE의 생성을 억제하는 이들의 능력에 대하여 CD23에 대한 영장류 및 두 개의 상이한 형태의 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00028
) 항체를 검정하였다.
사람의 말초 혈액 단핵 세포(hu-PBMC-SCID)로 재구성된 엄격하게 조합된 면역 결핍 scid/scid(SCID) 마우스, C.B.-17[참고문헌 : Bosma et al., Nature, 301:527 (1983)]가 상당히 많은 양의 사람 면역글로불린(Ig)을 생성시킬 수 있음이 공지되었기 때문에 변형된 SCID 마우스 모델을 사용하였다[참고문헌 : Mosier et al., Nature, 335:256 (1988); Mosier et al., J. Clin . Immunol., 10:185 (1990); Abedi et al., J. Immunol., 22:823 (1992); and Mazingue et al., Eur . J. Immunol., 21:1763 (1991)]. hu-PBMC-SCID 마우스에서 생성된 사람 면역글로불린(Ig)의 우세한 이소타입은 IgG이다. 일반적으로, IgM, IgA 및 IgE 이소타입은 PBMC가 특정의 자가면역원 또는 알레르기성 질환을 갖는 공여체로부터 수득되는 경우를 제외하고는 매우 낮거나 검출될 수 없을 정도의 레벨인 것으로 밝혀졌다. 또한 특정의 시토카인을 갖는 hu-PBMC SCID 마우스 모델의 조작이 IgE를 포함하여 상당 레벨의 비-IgG 이소타입을 발생시키도록 제공될 수 있다는 것이 보고되어 있다[참고문헌 : Kilchherr et al., Cellular Immunology, 151:241 (1993); Spiegelberg et al., J. Clin. Investigation, 93:711 (1994); and Carballido et al., J. Immunol., 155:4162 (1995)]. 공여체가 생체내 항원에 대하여 프라이밍되는 경우 에 hu-PBMC SCID는 항원 특이적 Ig를 발생시키는데도 사용되었다.
따라서, 본 발명자들의 목표는 목적하는 항-CD23 항체를 포함하여, 알레르기성 질환과 같은 IgE 관련된 질환의 치료를 위한 치료 효능을 시험하는데 사용될 수 있는 hu-PBMC SCID 마우스 모델을 생성시키는 적합한 사람 IgE를 수립하는데 집중되었다.
물질 및 방법 :
하기에 기술하는 hu-PBMC SCID 마우스 모델에서 다음의 물질 및 방법을 사용하였다.
SCID 마우스 : C.B-17 scid/scid 면역 결핍 마우스를 타코닉(Taconic)(C.B.-17/IcrTac-scidfDF)으로부터 입수하고, 아이덱 파마슈티칼즈의 동물 시설에서 사육하였다. 마우스를 멸균된 짚을 갖춘 멸균된 마이크로배리어 유닛에 수용시켰다. [Committee on Care of Laboratory Animal Resources Commission on Life Science-National Research Council]에 의해 명시된 "실험 동물의 보호 및 사용에 관한 지침"에 따라서 동물 연구를 수행하였다[참조 : Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHHS Publ. No. (NIH) 86-23, Bethesda, MD, NIH, (1985)].
사람의 PBMC : 제조업자의 추천(시그마 다이아그노스틱스 카탈로그 # 1077-1)대로 피콜-하이페이크(Histopaque-1077)를 통해 원심분리에 의해 혈액 은행으로부터 입수된 연막으로부터 PBMC를 단리시켰다. 구배 경계에서 림프구 제조물을 수확하고 행크스 밸런스드 염 용액(HBSS)(바이오-위태커 카탈로그 # 10-527F)중에서 3회 세척하였다. 각각의 실험에 있어서, PBMC를 별도의 두 공여체로부터 수득하고 시험관내에서 별도로 배양하였다. PBMC를 5% FCS 플러스 1000IU/ml의 IL-4(젠자임, 인코포레이티드 카탈로그 # 2181-01)를 함유하는 1% HB101 동결 건조된 보충물(어빈 싸이언티픽 카탈로그 # T000 & T151) 및 HB-기초 배지중에 1 내지 3×106 세포/ml로 재현탁시키고 37℃에서 48시간 동안 5% CO2와 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 상이한 연막으로부터의 세포를 배양하고 합치고, SCID 마우스를 재구성하는데 사용하였다.
생체내 검정 조건
200-300㎕ 부피의 HBSS중의 50 내지 60×106 림프구를 0일에 마우스 그룹(1개의 그룹 당 4 내지 5마리)에 복막내로 주입하였다. 항-CD23 항체를 수용한 그룹에 대해, 0일에, 복막내로 주입하기 전에 PBMC를 항-CD23 항체(200 내지 400㎍/마우스)와 혼합하고 7일에 2차 주입하였다. 모든 마우스는 0일 내지 5일 사이에 IL-4의 마우스 당 5000IU를 복막내로 수용하였다. 항체를 주입하지 않은 그룹을 대조군으로서 사용하였다. 역궤도 정맥으로부터 마우스 혈액을 채취하고 ELISA에 의해 14일, 21일, 28일 및 35일에 IgG 및 IgE에 대하여 혈청을 분석하였다.
도 8은 영장류 항사람 CD23 단클론성 항체 5E8이 SCID 마우스 모델에서 생체내 IL-4 유도된 IgE 생성을 억제하는데 효과적임을 보여준다.
영장류화된 ( PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00029
) 항사람 CD23 단클론성 항체의 클로닝 및 발현
영장류의 면역글로불린 가변 도메인을 클로닝시키기 위해, 제조업자가 설명하는 방법에 따라서 마이크로-패스트트랙 mRNA 단리 키트(인비트로젠 카탈로그 # K1520-02)를 사용하여 항사람 CD23 단클론성 항체 6G5 및 5E8을 분비하는 영장류 헤테로하이브리도마로부터 약 2×106 세포로부터 폴리 A + RNA를 개별적으로 단리시켰다.
통상의 방법에 따라서 cDNA 사이클 키트(인비트로젠 카탈로그 # L1310-01)를 사용하여 폴리 A + RNA로부터 cDNA의 제 1 가닥을 합성하였다.
그 다음, 사람의 면역글로불린의 상이한 컨센서스 패밀리에 기초하여 선택된 PCR 프라이머를 사용하여 cDNA로부터 PCR에 의해 6G5 및 5E8의 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 단리시켰다. 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 리더 서열의 시작에 상응하는 5' 프라이머를 선택하고 J 영역에 상응하는 3' 프라이머를 선택하였다. (6G5의 람다 경쇄 가변 도메인, 5E8의 카파 경쇄 가변 도메인, 및 6G5 및 5E8의 중쇄 가변 도메인을 PCR 증폭시키는데 사용된 특정의 프라이머를 표 1-3에 도시하였다). PCR을 표준 방법(핫 스타트 100 튜브(기브코 비알엘 카탈로그 # 10332-013)에서 94℃에서 1분, 54℃에서 1.5분, 및 72℃에서 2분으로 30 사이클)에 따라 수행하였다. PCR을 주형으로서 80㎕ cDNA(2×106 세포로부터) 중 5㎕, 5nM dNTP 2㎕, Taq 중합효소 1㎕, Taq 중합효소 완충액 5㎕, 5' 프라이머(25pmol/㎕) 2㎕, 3' 프라이머(25pmol/㎕) 2㎕, 및 물 36㎕를 함유하는 반응액 50㎕중에서 수행하였다. (Taq 중합효소 및 완충액은 스트라타젠 카탈로그 # 600131로부터 수득하였고, dNTP는 뵈링거 만하임 카탈로그 # 1581295로부터 입수하였다).
A) 플라스미드 N5LG1 + 6 G5 및 N5LG4P + 6 G5 의 구성
1) PCR 에 의한 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 6 G5 의 경쇄 가변 도메인의 클로닝
영장류 단클론성 항체 6G5의 cDNA로부터 경쇄 가변 영역의 제 1 PCR 증폭은 동일 반응계에서 람다 경쇄 가변 영역과 일치하는 밴드를 나타냈다. 이들 밴드는 3가지의 상이한 초기 리더 서열 프라이머를 사용하는 모든 반응에서 나타났다. (표 1 내지 표 3 참조) 그러나, 프라이머 745(패밀리 2)를 사용하여 수득한 PCR 생성물은 PCR 생성물 밴드의 비교적 높은 강도로 인해 더욱 특이한 것으로 고려되었다.
이러한 PCR 생성물은 퀴아퀵 겔 엑스트랙션 키트(퀴아젠(Qiagen) 카탈로그 # 28704)를 사용하여 단리시켰다. 정제된 PCR 단편을 Bgl II 및 Avr II 제한 엔도누클레아제로 분해시키고, 동일한 제한 엔도누클레아제로 분해시킨 포유류 발현 벡터 N5LG1내로 연결시켰다. 그 다음, 하나의 50㎕ PCR 반응으로부터의 정제된 PCR 생성물을 함유하는 연결 혼합물 20㎕, 100mg N5LG1 벡터, 10x 연결 완충액(NEB 카탈로그 # 202S) 2㎕, T4 리가제(NEB 카탈로그 # 202S) 2㎕를 14℃에서 밤새 인큐베이션시켰다.
포유류 발현 벡터 N5LG1은 포유류 세포중의 4개의 개별적인 단백질의 발현을 위해 제공되는 유전자 서열(예를 들어, 조절 서열, 코딩 서열)을 포함한다. 이들은 다음과 같다:
(i) 경쇄 가변 도메인을 삽입시키기 위한 유일한 제한 엔도누클레아제 부위 및 사람 람다 경쇄 불변 영역을 가진 부분 면역글로불린 경쇄;
(ii) 중쇄 가변 도메인을 삽입시키기 위한 유일한 제한 엔도누클레아제 부위 및 사람 감마 1 사슬 불변 영역 코딩 서열을 가진 부분 면역글로불린 중쇄;
(iii) 플라스미드가 혼입되고 항생물질 제네티신(기브코 비알엘 카탈로그 # 10131-1209)에 내성이 있는 세포를 선택하는데 사용되는 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 유전자; 및
(iv) 세포가 메토트렉세이트(MTX, 시그마 카탈로그 # A-6770)의 존재하에서 배양되는 경우 선택 및 게놈 증폭을 위해 제공되는 뮤린 디히드로폴레이트 환원효소 유전자(DHFR) [참고문헌: Reff et al., Blood, 83:433-445 (1994)].
연결 후에, 혼합물을 모 N5LG1 플라스미드를 분해시키는 Pme I 제한 엔도누클레아제를 사용하여 분해시켰지만 6G5의 경쇄 가변 도메인에 연결되어 있는 N5LG1 플라스미드는 분해되지 않았다. 분해 후에, 하기와 같이, 혼합물을 에피쿠리안 콜리(Epicurian coli: 등록상표명) XL1-Blue 수용 세포(스트라타진 카탈로그 # 200249)내로 형질전환시켰다.
수용 세포 100㎕를 상기의 연결 혼합물 10㎕와 혼합시키고, 30분 동안 얼음위에 정치시킨 다음, 30초 동안 45℃에서 가열하였다. 이 혼합물을 2분 동안 얼음위에 놓은 다음, 실온으로 미리 가온시킨 SOC 900㎕를 첨가하였다. (SOC는 엘비 브로쓰 기브코 비알엘(LB broth Gibco BRL) 카탈로그 # 10855-013에 0.02M MgCl2, 0.02M MgSO4 및 0.02M D-글루코오스를 가한 것이다). 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션시킨 후에, 혼합물을 1분 동안 4000g에서 원심분리시키고, 상층액 800㎕를 따 라냈다. 혼합물의 나머지를 50㎕/ml 암피실린(Amp, 기브코 비알엘 카탈로그 # 13075-015)를 함유하는 LB 아가(기브코 비알엘 카탈로그 # 12945-044) 디시상에 플레이팅하였다. 플라스미드 DNA를 위자드(Wizard: 등록상표명) 미니프렙(Miniprep) DNA 정제 시스템(프로메가 카탈로그 # A7510)을 사용하여 Amp 플레이트상에서 성장한 대장균의 개개의 콜로니로부터 단리시켰다.
그 다음, 단리된 플라스미드 DNA를 Bgl II 및 Avr II로의 분해에 이은 아가로오스 겔 전기영동에 의해 특징화하였다. 400bp의 에티듐으로 염색된 DNA 밴드는 경쇄 가변 도메인의 잠재적으로 성공적인 클로닝을 나타냈다.
이것을 확인시켜 주는 것은 면역글로불린 경쇄 가변 도메인이며, 서열분석은 서열분석 프라이머 607 및 GE 108이 있는 시쿼나아제 7-데아자-dGTP DNA 시퀀싱 키트(USB 카탈로그 # 70990)를 사용하여 수행하였다. (표 4의 서열분석 프라이머 참조).
람다 경쇄 패밀리 2(프라이머 745) 및 3' J 영역 프라이머 926의 5' 프라이머 초기 리더 서열을 사용하여 영장류 단클론성 항체 6G5의 cDNA로부터의 경쇄의 제 2 독립 PCR 증폭을 수행하였다. (표 1 내지 표 3의 6G5의 람다 경쇄 가변 도메인의 PCR을 위한 프라이머 참조). 단리된 PCR 생성물(상기 기술 참조)을, 오리지날 TA 클로닝 키트(인비트로젠 카탈로그 # K2000-01)을 사용하여 TA 벡터내로 클로닝시켰다. 단리된 미니프렙 DNA(상기 기술 참조)를 EcoR I 제한 엔도누클레아제로 분해시킨 후에 아가로오스 겔 전기영동하에서 조사하였다. 그 다음, TA 벡터내에 포함된 생성된 PCR 생성물을 Sp6 및 M13(-40) 정방향 프라이머를 사용하여 (이전에 설명된 바와 같이) 서열분석하였다 (표 4의 서열화 프라이머 참조). 생성된 경쇄 서열은 제 1 PCR로부터의 경쇄 서열과 동일하였다. 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 6G5의 경쇄 가변 도메인의 이러한 전체 서열을 하기에 제시하였다.
영장류 단클론성 항체 항사람 CD23 6 G5 리더의 경쇄 가변 영역
Figure 112005058783527-pat00030
성숙 단백질(번호는 Kabat 에 의한 것이다)
프레임워크 1
Figure 112005058783527-pat00031
CDR 1
Figure 112005058783527-pat00032
프레임워크 2
Figure 112005058783527-pat00033
CDR 2
Figure 112005058783527-pat00034
프레임워크 3
Figure 112005058783527-pat00035
CDR 3
Figure 112005058783527-pat00036
프레임워크 4
Figure 112005058783527-pat00037
2) PCR 에 의한 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 6 G5 의 중쇄 가변 도메인의 클로닝
영장류 단클론성 항체 6G5의 cDNA로부터의 중쇄 가변 도메인의 제 1 PCR 증폭을 상기 설명한 초기 리더 서열 프라이머 및 3' J 영역 프라이머 GE244의 세트를 사용하여 수행하였다. 이들 프라이머는 하기 표 1 내지 표 3에 기재되어 있다. 이 반응으로 350개 염기의 PCR 생성물이 생성되었다. 이러한 350개 염기 생성물(상기 설명한 바와 같이 정제됨)을 Nhe I 및 Sal I으로 분해시키고, N5LG1내로 연결시키고 제 1 PCR 증폭에서 동일한 엔도누클레아제로 분해시켰다. 생성된 연결 혼합물을 경쇄를 클로닝시키기 위해 동일한 기술을 사용하여 숙주 세포내로 형질전환시켰다. 그 다음, 350개 염기 PCR 생성물을 함유하는 플라스미드 N5LG1을 단리시키고 서열분석하였다(서열분석 프라이머 266 및 268 사용). (이러한 서열분석 프라이머는 표 4에 제시되어 있다).
서열분석은 PCR 생성물이 단지 중쇄 가변 도메인의 일부만을 포함하며, 이것의 아미노 말단에 결실부위가 포함되어 있는 것으로 나타났다 (서열은 프레임워크 2, 코돈 36에서 시작하였다).
제 2 독립 PCR 반응을 수행하여 패밀리 1 (MB1503)에 대한 5' 초기 리더 서열 프라이머 및 3' J' 영역 프라이머 GE244를 사용하여 영장류의 단클론성 항체 6G5의 중쇄 가변 도메인을 증폭시키고 단리시켰다. (이러한 프라이머는 또한 표 1 내지 3에 기재되어 있다). 그 다음, 생성된 PCR 생성물을 상기 설명된 동일한 기술을 사용하여 N5LG1으로 클로닝시켰다. 이 서열은 제 1 PCR 생성물과 동일한 것으로 밝혀졌다.
그러므로, 유실된 5' 말단을 포함하는 6G5의 전체 중쇄 가변 영역을 클로닝시키기 위해서, 6G5 가변성 중쇄의 프레임워크 4 영역 및 CDR3을 포함하는 새로운 긴 3' 프라이머(MB1533)를 패밀리 1 5' 프라이머(MB1503)를 사용하는 제 3 독립 PCR 반응에 사용하였다. (이들 프라이머는 또한 표 1 내지 표 3에 기재되어 있다).
PCR 후에, 거대 420개 염기 PCR 생성물을 아가로오스 겔상에서 관찰하였다. 이러한 PCR 생성물을 이전에 설명한 바와 같이 단리시키고, TA 벡터내로 클로닝시켰다. 그 다음, TA 벡터내에 포함되어 있는 생성된 PCR 생성물을 서열분석하였다. 서열분석에서는 상기 DNA가 전체 중쇄 가변 도메인을 함유하고, 3' 부분이 2개의 제 1 PCR 반응으로부터의 이전에 클로닝된 부분 중쇄 가변 도메인의 부분과 동일한 것으로 나타났다.
제 4 독립 PCR을 제 3 PCR 증폭과 동일한 프라이머를 사용하여 수행하였다. 이 증폭으로부터 생성된 PCR 생성물을 이전에 설명한 바와 같이, 단리시키고 TA 벡터내로 클로닝시켰다. 제 4 독립 PCR 생성물의 서열은 제 3 PCR 증폭에서 수득된 것과 동일한 것으로 밝혀졌다. 영장류의 단클론성 항사람 CD23 항체 6G5의 중쇄 가변 도메인을 포함하는 상기 서열을 하기에 기재하였다.
영장류 단클론성 항체 항사람 CD23 6 G5 의 중쇄 가변 영역
리더
Figure 112005058783527-pat00038
성숙 단백질(번호는 Kabat 에 의한 것이다)
프레임워크 1
Figure 112005058783527-pat00039
CDR 1
Figure 112005058783527-pat00040
프레임워크 2
Figure 112005058783527-pat00041
CDR 2
Figure 112005058783527-pat00042
프레임워크 3
Figure 112005058783527-pat00043
CDR 3
Figure 112005058783527-pat00044
프레임워크 4
Figure 112005058783527-pat00045
3) 포유류 발현 벡터의 구성
포유류 발현 벡터내로 6G5의 클로닝된 중쇄 가변 도메인을 삽입하기 위해, TA 벡터내의 중쇄 가변 도메인(제 3 독립적인 PCR에 의해 수득됨)을 NheⅠ 및 SalⅠ으로 분해하고, 상기와 동일한 제한 효소로 분해되고 이미 경쇄 가변 도메인을 함유하는 N5LG1 벡터내로 클로닝하였다. 생성된 포유류 발현 벡터를 N5LG1 + 6G5로 칭하였다.
N5LG4P +6G5 벡터를 구성하기 위해, 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두를 BglⅡ와 AvrⅡ 및 NheⅠ과 SalⅠ으로 각각 분해하여 N5LG1 + 6G5로부터 단리시켰다. 포유류 발현 벡터 N5LG4P 벡터는, 생체내에서 약리역학을 개선시키고 면역글로불린의 안정성을 증가시키기 위해 사람 감마 1이 힌지 영역에서 세린의 프롤린으로의 돌연변이를 함유하는 사람 감마 4 불변 영역으로 대체된 것("P" 변이)을 제외하고는 상기 설명된 N5LG1 벡터와 동일하다. 경쇄 가변 도메인을 우선 플라스미드내로 클로닝하고, 중쇄 가변 도메인을 앞서 설명된 방법을 사용하여 경쇄 가변 도메인을 함유하는 벡터내로 클로닝하였다. 이 포유동물 발현 벡터를 N5LG4P + 6G5로 칭하였다.
B. 플라스미드 N5KG4P + 5 E8 , N5KG1 + 5 E8 , N5KG4P + 5 E8N - 및 N5KG1 + 5E8N-의 구성
1. PCR 에 의한 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 5 E8 의 경쇄 가변 도메인의 클로닝
5E8 cDNA로부터의 경쇄 가변 도메인의 제 1 PCR 반응을 카파 초기 리더 서열 프라이머 및 3' J 영역 프라이머 GE204의 세트를 사용하여 수행하였다(표 1 내지 표 3의 5E8의 카파 경쇄 가변 도메인의 PCR을 위한 프라이머 참조). 420 염기 PCR 생성물을 수득하였다. 단리된 420 염기 PCR 생성물을 BglⅡ 및 BsiWⅠ 제한 엔도누클레아제로 분해하고, 포유류 발현 벡터 N5KG4P내로 클로닝하고, GE108 및 377 프라이머(표 4에 도시)를 사용하여 서열분석하였다. 포유류 발현 벡터 N5KG4P는, 사람 람다 경쇄 불변 영역 대신에 사람 카파 경쇄 불변 영역을 함유하는 것을 제외하고는 벡터 N5LG4P와 동일하다. 이러한 420 폴리누클레오티드 DNA의 서열분석에 서는 이것이 전체 카파 경쇄 가변 도메인을 함유하는 것으로 나타났다.
경쇄 가변 영역의 제 2 독립적인 PCR을 5' 패밀리 1 프라이머 GE201 및 3' 프라이머 GE204를 사용하여 수행하였다(표 1 내지 표 3의 5E8의 카파 경쇄 가변 도메인의 PCR을 위한 프라이머 참조). 단리된 PCR 생성물을 TA 벡터내로 클로닝하고(앞서 설명된 방법을 사용), Sp6 및 T7 프로모터 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 서열분석에서는 이 PCR 생성물이 제 1 PCR에 의해 수득된 생성물과 동일한 것으로 나타났다. 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 5E8의 경쇄 가변 도메인의 전체 서열을 하기에 나타내었다.
영장류 단클론성 항체 항사람 CD23 5 E8 의 경쇄 가변 영역
리더
Figure 112005058783527-pat00046
성숙 단백질(번호는 Kabat 에 의한 것이다)
프레임워크 1
Figure 112005058783527-pat00047
CDR 1
Figure 112005058783527-pat00048
프레임워크 2
Figure 112005058783527-pat00049
CDR 2
Figure 112005058783527-pat00050
프레임워크 3
Figure 112005058783527-pat00051
CDR 3
Figure 112005058783527-pat00052
프레임워크 4
Figure 112005058783527-pat00053
2) PCR 에 의한 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 5 E8 의 중쇄 가변 도메인의 클로닝
5E8의 중쇄 가변 도메인의 제 1 PCR을 5' 초기 리더 중쇄 서열 프라이머 및 3' 프라이머 GE210의 세트를 사용하여 수행하였다(표 1의 6G5 및 5E8의 중쇄 가변도메인의 PCR을 위한 프라이머 참조). 420 염기 PCR 생성물이 패밀리 3 프라이머 반응에서 생성되었다. PCR 생성물을 정제한 다음, NheⅠ 및 SalⅠ으로 분해하고, 포유류 발현 벡터 N5KG4P 벡터(앞서 설명된 바와 같이)내로 클로닝하였다. PCR 생성물을 268 및 928 프라이머를 사용하여 서열분석하였다(표 4의 서열분석 프라이머 참조).
5E8의 중쇄 가변 도메인의 제 2 독립 PCR을 패밀리 3 5'프라이머 GE207 및 3' 프라이머 GE210을 사용하여 수행하였다(표 1 내지 표 3의 6G5 및 5E8의 중쇄 가변 도메인의 PCR을 위한 프라이머 참조). 단리된 PCR 생성물을 앞서 설명한 방법을 사용하여 TA 벡터내로 클로닝하고, Sp6 및 T7 프라이머를 사용하여 서열분석하 였다. 서열분석에서는 코돈 91에서의 TAC가 TGC로 변화된 것으로 나타났다.
91에 타당한 코돈을 결정하기 위해, 제 3 독립 PCR을 제 2 PCR(상기 참조)과 동일한 프라이머를 사용하여 수행하였다. PCR 생성물을 TA 벡터로 다시 클로닝하고, Sp6 및 T7 프라이머를 사용하여 서열분석하였다. 이 서열은 제 1 PCR에서 수득된 중쇄 가변 서열과 동일한 것으로 밝혀졌다. 따라서, 제 2 독립 PCR 생성물에서 위치 91에서의 TGC는 분명히 PCR 동안 도입된 오류의 결과이다. 영장류 단클론성 항사람 CD23 항체 5E8의 중쇄 가변 도메인의 이러한 전체 서열을 하기에 나타내었다.
영장류 단클론성 항체 항사람 CD23 5 E8 의 중쇄 가변 영역
리더
Figure 112005058783527-pat00054
성숙 단백질(번호는 Kabat 에 의한 것이다)
프레임워크 1
Figure 112005058783527-pat00055
CDR 1
Figure 112005058783527-pat00056
프레임워크 2
Figure 112005058783527-pat00057
CDR 2
Figure 112005058783527-pat00058
프레임워크 3
Figure 112005058783527-pat00059
CDR 3
Figure 112005058783527-pat00060
프레임워크 4
Figure 112005058783527-pat00061
3) 포유동물 발현 벡터의 구성
N5KG4P에서의 중쇄 가변 도메인을 NheⅠ 및 SalⅠ으로 분해하고, 정제하고, 5E8의 경쇄 가변 도메인을 함유하는 N5KG4P내로 클로닝하였다. 그 후, 이 플라스미드를 앞서 설명된 바와 같이 제한 엔도누클레아제로 분해하였다. 이는 5E8의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두를 함유하는 벡터를 생성시켰다. 이 벡터를 N5KG4P + 5E8로 칭하였다. N5KG4P + 5E8의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인 둘 모두를 포유류 발현 벡터 N5KG1내에 삽입하여 N5KG1 + 5E8 벡터를 제조하였다.
4) 특정 부위 돌연변이유발에 의한 영장류 단클론성 항체 5 E8 의 중쇄 가변 영역에서의 아미노산의 변경 및 포유류 발현 벡터의 구성
5E8 중쇄 가변 도메인의 서열에 기초하여, 아스파라긴 코돈 75에서 면역글로불린의 잠재적 글리코실화 부위가 존재한다. 이 잠재적인 글리코실화 부위는 다음의 트리펩티드 서열을 갖는 보존된 아스파라긴 연결된 글리코실화 모티프에 상응한다: (Asn) - (프롤린을 제외한 모든 아미노산) - (세린 또는 트레오닌). 따라서, 글리코실화 모티프의 변형으로 인해 이 위치에서 글리코실화될 수 없는 5E8의 글리코실화 돌연변이체를 아스파라긴 코돈 75를 리신(이 위치에 많은 사람 면역글로불린에서 발견됨)으로 대체하므로써 생성시켰다. 특정 부위 돌연변이유발법은 하기 방법에 의해 수행된다.
제 1 PCR을 주형으로서 N5KG4P + 5E8을 사용하고, 3' 프라이머(코돈 71 내지 79에 상응)를 사용하여 수행하였으며, 이는 코돈 75(AAG로 변화된 AAC), 프라이머 MB1654, 및 리더 서열의 개시부위에서의 5' 프라이머(프라이머 MB1650)를 함유한다(표 5에 기재된 5E8의 중쇄 가변 영역 5E8의 글리코실화 돌연변이체의 생성에 사용되는 PCR 프라이머 참조).
제 2 PCR을 동일한 돌연변이를 함유하는 5' 프라이머(코돈 71 내지 79에 상응)(프라이머 MB1653) 및 프레임워크 4의 말단으로부터의 3' 프라이머(프라이머 MB1651)를 사용하여 동일한 주형상에서 수행하였다(표 5의 5E8의 중쇄 가변 영역의 글리코실화 돌연변이체의 생성에 사용되는 PCR 프라이머 참조).
이러한 두 PCR 생성물을 단리하고, 동일한 몰비로 혼합하였다. 제 1 PCR에 사용된 5' 프라이머(MB1650) 및 제 2 PCR에 사용된 3' 프라이머(MB 1651)를 주형으로서 제 1 및 제 2 PCR 생성물의 혼합물을 이용하여 제 3 독립 PCR을 수행하였다(표 5의 중쇄 가변 영역의 글리코실화 돌연변이체의 생성에 사용되는 PCR 프라이머 참조). 제 3 PCR에서 수득된 PCR 생성물은 5E8의 중쇄 가변 도메인 코딩 영역을 함유하는 것으로 밝혀졌으며, 여기에서 아스파라긴 75는 리신으로 변화되었다.
제 3 PCR 생성물을 정제하고, 제한 엔도누클레아제 SalⅠ 및 NheⅠ으로 분해 하고, 경쇄 가변 도메인만을 함유하는 N5KG4P내로 클로닝하였다. PCR 생성물을 서열분석하여, 이것이 돌연변이체 중쇄 가변 도메인을 포함하는 지를 확인하였다. 이 포유류 발현 플라스미드를 N5KG4P + 5E8N- 라고 명명하였다.
N5KG1 + 5E8N- 를 구성하기 위해, N5KG4P - 5E8N-로부터의 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘 모두를 각각 Bgl II 및 BsiW I, 및 Nhe I 및 Sal I으로 분해하였다. 먼저 경쇄 가변 도메인을 클로닝한 다음, 중쇄 가변 도메인을 포유류 발현 플라스미드인 N5KG1에 삽입시켜서, 플라스미드 N5KG1 + 5E8N- 를 생성시켰다.
표 1
5 E8 의 카파 경쇄 가변 도메인의 PCR 을 위한 프라이머
Figure 112005058783527-pat00062
표 2
6 G5 의 람다 경쇄 가변 도메인의 PCR 을 위한 프라이머
Figure 112005058783527-pat00063
표 3
6 G5 및 5 E8 로부터의 중쇄 가변 도메인의 PCR 을 위한 프라이머
Figure 112005058783527-pat00064
표 4
서열분석 프라이머
Figure 112005058783527-pat00065
표 5
5 E8 의 중쇄 가변 영역의 글리코실화 돌연변이체를 생성시키기 위해 사용되는 PCR 프라이머
Figure 112005058783527-pat00066
C) 감마-3 벡터의 구성
뮤린 항체를, 중쇄 및 경쇄 불변 영역이 사람 버전으로 치환되거나, CDR(상보성 결정 영역)외에는 모두 이들의 사람 등가물로 거의 치환된 키메라로 전환시키 기 위한 다수의 방법이 존재한다 [참조: King et al., Biochem. J. 281:317-23, 1992; Queen et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86(24):10029-33, 1989; Love et al., Methods Enzymol. 178:515-27, 1989; Hutzell et al., Cancer Res. 51:181, 1991; Chiang et al., Biotechniques 7(4):360-6, 1989; Heinrich et al., J. Immunol. 143:3589, 1989; Hardman et al., Int. J. Cancer 44:424, 1989; Orlandi et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86(10):3833-6, 1989].
또한, 앞 단락에는, 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00067
) 감마-1 및 감마-4 항체를 발현시키기 위한 벡터의 구성이, 경쇄 및 중쇄 가변 영역을 엔코딩하는 DNA를 PCR을 사용하여 증폭시키고, 이들 영역을 적당한 사람 불변 영역 도메인을 엔코딩하는 발현 벡터(들)에 클로닝시킴으로써 달성될 수 있다는 것이 상세하게 입증되어 있다. 따라서, 영장류 항체로부터의 증폭된 가변 영역 DNA가 삽입되는 클로닝 부위를 또한 함유하는 적당한 포유류 발현 벡터가 입수가능한 한은, 그 밖의 사람 불변 영역 도메인을 엔코딩하는 유사한 구성물이 제조될 수 있다는 것이 명백할 것이다.
또한, 가변 영역 DNA를 증폭시키기 위해 사용되는 PCR 프라이머가, 사용되는 벡터에 따라 다양한 제한 클로닝 부위를 수용하도록 고안될 수 있다는 것이 명백할 것이다.
사람 IgG3로부터의 불변 영역 도메인을 엔코딩하는 벡터는 당해기술분야에서 입수가능하고, 본 발명의 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00068
) 항체를 구성하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 코(Co) 등은 사람 경쇄 및 중쇄 불변 영역을 발현시키는 별 도의 벡터를 사용하여 키메라 및 사람화된 항체를 구성하였고, 사람 감마-1 및 감마-3 둘 모두를 위한 중쇄 벡터를 제공하였다. 관심있는 항체의 가변 도메인 영역을 이들 벡터내로 클로닝시키기 위해, XbaI 제한 부위를 경쇄 및 중쇄 각각에 대해 Jκ4 및 JH3 인트론 세그먼트내의 불변 영역 바로 앞에 정위시키는 것이 편리하다 [참조: Co et al., 1996, Cancer Res. 56: 1118-1125; Co et al., 1992, J. Immunol. 148: 1149-1154].
따라서, XbaI 제한 부위, 또는 XbaI 제한 효소와 동일한 단일 가닥 오버행(overhang)을 생성시키는 (즉, NheI, SpeI) 부위를 포함하는 PCR 프라이머를 고안함으로써, 영장류 항체로부터의 가변 영역을 코 등의 문헌에 기재된 벡터를 사용하여 사람 감마-3 불변 영역 도메인과 결합시킬 수 있다. 대안적으로, 링커 또는 어댑터를 사용하여 클로닝을 용이하게 할 수 있다.
사람 감마-3 불변 영역의 cDNA 버전을 DNA 합성 기술을 사용하여 구성하고, 이것을 Nhe I과 BamH I 부위 사이의 사람 감마-1 불변 영역 대신 본 명세서에 기술된 N5KG1 벡터내에 삽입시킬 수 있다. 관심있는 특정 가변 영역을 클로닝시키기에 가장 편리한 제한 부위가 어느 것인 가에 따라, 당해기술분야에 공지된 그 밖의 감마-3 벡터가 존재하며, 이들 중의 어느 하나를 사용하여 본 발명의 감마-3 항체를 구성하고 발현시킬 수 있다 [참조: Parren et al., 1992, J. Immunol. 148(3) : 695-701; Steplewski et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 4852-4856; 및 U.S. Patent No. 4,975,369, 본원에 참고문헌으로 인용되어 있음].
D) 영장류화된 ( PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00069
) 항체의 변이
또한, 본 발명은 불변 영역의 돌연변이, 치환 또는 결실을 함유하는 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00070
) 항체를 포함한다. 이러한 돌연변이는, 당업자에게 널리 공지된 기술인 글리코실화 돌연변이체에 대해 전술된 특정 부위 돌연변이유발 기술을 사용하여 구성될 수 있다.
본 발명의 돌연변이된 항체는 치료 효능의 레벨, 즉, FcR 결합에서 요망되는 변화를 생성시키기 위해 고안된다. 그러나, 항체의 불변 영역의 임의의 돌연변이는 감마-1 또는 감마-3 불변 영역 도메인에 의해 매개되기 때문에 기본적인 이펙터 기능을 변화시키지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 감마 항체의 기타 서브클래스를 돌연변이유발에 의해 변화시켜서, 이들이 감마-1 또는 감마-3 도메인을 함유하는 항체와 동일한 이펙터 기능을 갖게 할 수 있다. 이러한 항체는 또한 본 발명에 포함된다.
예를 들어, FcR 결합 및 C1q 보체 성분과의 상호작용에 관여하는 IgG 불변 영역의 영역들이 특징화되었고, 돌연변이는 결합 친화도를 증가시키거나 감소시키는 것으로 확인되었다. 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 미국 특허 제 5,648,260호에 기재된 바와 같이, 사람 IgG3 불변 영역에서 Leu 235를 Glu로 변화시키면 사람 Fc 감마 R1 수용체에 대한 돌연변이체의 상호작용이 파괴된다. 또한, 힌지 결합 영역의 인접 또는 근접 부위에서의 돌연변이(즉, Ala에 의한 잔기 234, 235, 236 또는 237의 치환)는 잔기 234, 235, 236 및 237의 변화가 적어도 Fc 감마 R1 수용체에 대한 친화도에 영향을 미친다는 것을 나타낸다.
유사하게는, 본원에 참고문헌으로 인용되어 있는 미국 특허 제 5,348,876호에는, 사람 IgG3 불변 영역의 힌지 영역의 길이를 감소시키고, 이 영역의 아미노산 서열을 변경시킴으로써, C1q 결합, 즉, 보체 매개성 세포용해가 추가로 개선되는 것으로 나타났다. 실제로, 변이체는 야생형 IgG3 보다는 잘, IgG1 보다는 훨씬 잘, C1q와 결합하였다.
따라서, 보다 가벼운 내과 질환을 치료하기 위해, 돌연변이를 사용하여 사람 Fc 수용체에 대한 친화도를 감소시키는 치료용 항체를 생성시킬 수 있다는 것이 당해기술분야로부터 명백하다. 또한, 이펙터 기능 활성을 증가시키는 돌연변이를 확인함으로써, 치료에 사용하기 위한 보다 강력한 버전을 유도시킬 수 있다. 약제 효능을 변화시키기 위한 유전자 서열의 조작이 고려되며, 이것이 본 발명의 사상 및 범위에 충분히 속하는 것으로 인지되어야 한다.
E) 중국산 햄스터 난소 세포에서의 영장류화된 ( PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00071
) 항체의 발현
영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00072
) 항체를 단리시키기 위해, 항체를 엔코딩하는 벡터를 하기 프로토콜을 사용하여 중국산 햄스터 난소 세포에서 발현시켰다.
대규모 플라스미드 DNA를 위자드(등록상표: WIZARD) 맥시프렙스(Maxipreps) DNA 정제 시스템(프로메가 카탈로그 #A7421)을 사용하여 정제하였다. 정제된 DNA를 Ssp I 및 BspLUll I로 분해시키고, 에탄올로 1회 침전시키고, 멸균 TE 중에 재현탁시켰다.
그 후, 정제된 엔도누클레아제 제한된 플라스미드 DNA를 일렉트로포레이션을 사용하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 디히드로폴레이트 환원효소 마이너스 DG44 세포내로 도입시켰다. 사용된 일렉트로포레이션 기술은 하기 설명된다.
약 1.6 x 108 CHO 세포를 적당한 크기의 멸균 코닝(Corning) 튜브에서 1000 RPM에서 1분간 스피닝시켰다. 배지를 제거하고, 세포를 멸균 빙냉 SBS(멸균 수크로오스 완충 용액은 272 mM 수크로오스, 7mM 인산나트륨 pH 7.4, 1mM MgCl2) 15ml로 세척하고 1000 RPM에서 5분 동안 스피닝시켰다. SBS를 제거하고, 세포를 신선한 빙냉 멸균 SBS를 사용하여 1x107개 세포/ml의 농도로 현탁시키고, 얼음상에서 15분간 방치시켰다. BTX 600 일렉트로포레이터를 동작시키고, 최대 전압 납(knob)을 500 볼트/정전용량 및 저항으로 셋팅시키면서 230볼트로 미리조절하였다. 정전용량을 400 마이크로패러데이로 셋팅하고, 저항을 13 오옴으로 셋팅하였다 (셋팅 R1).
그 후, 플라스미드 DNA (4㎍ DNA 또는 2㎍ DNA) 및 0.4ml의 세포(4 x 106개 세포)를 BTX 0.4㎖ 큐벳 (BTX 카탈로그 # 620)에 넣었다. 큐벳을 BTX 600 스탠드에 넣고, 자동 전하 및 펄스 버튼을 누름으로써, 세포에 충격을 주었다. 약 20회의 개별적인 일렉트로포레이션을 각각의 포유류 발현 플라스미드로 수행하였다.
충격 후, 큐벳을 주위 온도에서 15분간 방치시켰다. 각각의 큐벳으로부터의 세포 및 DNA를, HT 보충물(100X 보충물은 10 mM 나트륨 하이포잔틴, 1.6 mM 티미딘 기브코 BRL 카탈로그 # 11067-014)이 첨가된 하이포잔틴 또는 티미딘을 함유하지 않는 CHO-SSFMII 20㎖(기브코 BRL 카탈로그 # 31033-012)에 재현탁시켰다. 그 후, 1회 일렉트로포레이션된 큐벳으로부터의 세포를 96 웰 플레이트에 플레이팅시키고 (200㎕/웰), 37℃ CO2 인큐베이터에 넣었다. 선택을, 2일 또는 3일 후, 배지를 제네티신(등록상표: Geneticin)(G418, 기브코 비알엘 카탈로그 # 10131-019) 400㎎/㎖가 첨가된 상기 배지로 교환시킴으로써 개시하였다. 세포를 37℃에서 성장시키고, 세포 배지를 3일 내지 5일 마다 교환하였다. 16일 후, 웰 및 상층액에 나타난 G418 내성 클론을 ELISA에 의해 항체 발현에 대해 검정하였다. 그 후, 최고수준으로 발현하는 클론을 개별적으로 증식시켰다. 단클론성 항체를 하기 기술하는 바와 같이 정제하였다.
면역글로불린 ELISA
플레이트[이뮬론(Immulon) 2, 다이나테크 래버러토리스, 인코포레이티드 (Dynatech laboratories, Inc.) 카탈로그 # 011-010-3455]를 200ng의 비표지된 염소 항사람 IgG 항체를 사용하여 100㎕/웰로 4℃에서 밤새 코팅시켰다. 이는 20㎖의 비표지된 염소 항사람 IgG/10㎖ 코팅 완충액/플레이트[뵈링거 만하임 아베(Boehringer Mannheim Ab) 카탈로그 # 605 400]를 사용하여 수행하였다 (~1mg/㎖ 스톡의 1:500 희석액). 이후, 코팅 완충액을 플레이트로부터 제거하고, 종이 타월로 건조시켰다. 이후, 100㎕의 희석 완충액/웰을 첨가하였다.
이후, 항체 용액과 표준 물질(100ng/㎖ - 2.5ng/㎖)을 100㎕/웰로 중복하여 100㎖ 희석 완충액에 직접 첨가하였다. 항체 용액과 표준물질은 희석 완충액 중에 함유되어 있다. 이후, 생성된 용액을 37℃에서 1시간 이상 인큐베이션시켰다.
인큐베이션 후, 각 플레이트의 내용물을 제거하고, 플레이트를 수돗물로 5회 세척하였다. 이후, 플레이트를 종이 타월로 건조시켰다.
플레이트를 건조시킨 후, 제 2 항체를 100㎕/웰로 첨가하였다. 이 제 2 항체는 1/10,000 희석액 또는 1㎕ Ab/10㎖ 희석 완충액/플레이트로 첨가되는 염소 항사람 카파-HRPO[서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠, 인코포레이티드(Southern Biotechnology Associates, Inc.) 카탈로그 # 2060-05]이거나, 1/20,000 희석액 또는 1㎕ Ab/20㎖ 희석 완충액/2 플레이트로 사용되는 염소 항사람 람다-HRPO(서던 바이오테크놀로지 어소시에이츠, 인코포레이티드 카탈로그 # 2070-05)이다.
항체와 플레이트의 내용물을 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후, 각각의 플레이트의 내용물을 제거하였다. 플레이트를 다시 수돗물로 5회 세척하고, 세척된 플레이트를 건조시켰다. 건조된 플레이트에 HRPO 기질(TMB 마이크로웰 - 2 성분)을 100㎕/웰의 양으로 첨가하였다. (5㎖의 TMB 과산화효소 기질 + 5㎖의 과산화효소 용액 B/플레이트[키르드가아드 앤드 페리 랩스(Kirdgaard and Perry Labs), TMB 마이크로웰 2 성분 시약 카탈로그 # 50-76-00]).
가장 약한 표준 물질(2.5ng/㎖)이 백그라운드 상에 가시화될 때에 각각의 웰에 100㎕의 2M H2SO4를 첨가하여 반응을 중단시켰다. 플레이트 중의 웰의 광학 밀도를 플레이트 판독기, 예를 들어 파장이 세팅된 분자 장치(Molecular Devices) Emax 정밀 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 판독하였다 : OD 450 및 OPT2(OD 540).
ELISA 완충액
코팅 완충액
탄산나트륨 0.8g/ℓ
중탄산나트륨 1.55g/ℓ
약 1㎖ 1N HCl을 사용하여 pH를 9.5로 조절함
희석 완충액
PBS 중의 0.5% 건조 탈지유(5g/ℓ) 및 0.01% 티메로살(100㎎/ℓ)
상기 기술된 검정을 사용하여 얻은 ELISA 값의 예를 하기에 기재하였다.
표준물질 OD450 OD450 평균
100ng/㎖ 0.805 0.876 0.841
50ng/㎖ 0.395 0.472 0.434
25ng/㎖ 0.213 0.252 0.233
10ng/㎖ 0.089 0.105 0.097
5ng/㎖ 0.054 0.055 0.055
2.5ng/㎖ 0.031 0.035 0.033
0ng/㎖ 0.004 0.006 0.005
희석 완충액 중의 표준물질
1mg/㎖를 제공하기 위한 스톡 AB의 적절한 희석액(정상 염수 중에서 멸균 여 과됨, OD에 의한 단백질 측정).
예 :
키메라 원숭이/사람 항-CD4(CE9.1)는 4.18mg/㎖이다.
76㎕ 희석 완충액 내로의 24㎕의 상기 물질은 1mg/㎖이다.
450㎕ 희석 완충액(D.B.) 내로의 50㎕의 스톡 Ab(1mg/㎖)는 100㎍/㎖이다.
450㎕ D.B. 내로의 50㎕의 상기 혼합물은 10㎍/㎖이다.
1.8㎖ D.B. 내로의 200㎕의 상기 혼합물은 1㎍/㎖이다.
9㎖ D.B. 내로의 1㎖의 상기 혼합물은 100ng/ml이다. *
5㎖ D.B. 내로의 5㎖의 상기 혼합물은 50ng/㎖이다. *
5㎖ D.B. 내로의 5㎖의 상기 혼합물은 25ng/㎖이다. *
6㎖ D.B. 내로의 4㎖의 상기 혼합물은 10ng/㎖이다. *
5㎖ D.B. 내로의 5㎖의 상기 혼합물은 5ng/㎖이다. *
5㎖ D.B. 내로의 5㎖의 상기 혼합물은 2.5ng/㎖이다. *
*는 ELISA에서 사용되는 표준물질이다.
단백질 A에 의한 항체 정제
방법
배양 상층액을 원심분리시켜서 세포 및 찌꺼기를 제거하였다. 원심분리물을 0.2㎛ 필터를 통해 여과시켰다. 단백질 A 세파로오스 패스트 플로우 칼럼(재조합 단백질 A 세파로오스 패스트 플로)[파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech) 카탈로그 # 71-5000-09]을 준비하고, PBS(pH 7.4)를 사용하여 평형화시켰다.
상층액을 적절한 유속(예를 들어, 2㎖/분)으로 칼럼 상에 로딩시켰다. 로딩 후에, 칼럼을 10 칼럼 부피의 PBS(pH 7.4)로 세척하였다. 항체를 용리 완충액 (0.2M 아세트산, 0.1M 글리신 pH 3.5)를 사용하여 1㎖/분의 유속으로 칼럼으로부터 용리시켰다. 100㎕의 Tris를 포함하는 1㎖ 분획/튜브를 수집하였다. 분광기 흡수 판독값을 280nm에서 취하였다. 그 다음, 항체 분획을 수집하고, PBS(pH 7.9)에 대해 밤새 투석하였다. 그 다음, 투석물을 0.22㎛ 막을 통한 여과에 의해 살균시키고, -20℃에서 저장하였다.
검정 결과
상기 기술된 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00073
) 사람 감마-4 항사람 CD23 항체를 정제하고, 시험관내에서 유도된 IgE 억제 활성에 대해 검정하였다. 결과는 도 3 및 도 5에 포함되어 있다. 이를 싱기 기술된 시험관내에서 IL-4 IgE 검정을 사용하여 수행하였다.
이들 검정 결과는 놀랍게도, 사람 감마-4 항사람 CD23 항체가 상응하는 영장류 항사람 CD23 항체만큼의 활성이 아니며, 즉 이들이 시험관내에서 유도된 IgE 생성을 상당히 억제시키지 않음을 시사하는 것이다.
그러나, 영장류 5E8 및 p5E8G4P는 중쇄 가변 영역에 잠재적 아스파라긴 결합 글리코실화 부위를 가지기 때문에, 이 부위에서의 글리코실화의 효과를 연구하였다 [이들 항체 둘 모두가 이 부위에서 N-결합 올리고당류를 함유하는 것으로 밝혀졌다 (데이터는 제시되지 않음)]. 따라서, 글리코실화를 방지하기 위해, 글리코실화 부위에 있는 아스파라긴을 리신으로 변화시켜서 탄수화물 첨가를 생략하였다. 이러 한 돌연변이된 항체를 p5E8G4PN-으로 명명하였다. 검정 결과는 상기 항체가 IL-4 IgE 검정에서 p5E8G4P과 동일하게 작용하고(도 3 참조), 또한 사람 CD23에 대한 동일한 겉보기 친화도 Kd를 나타냄(도 4 참조)을 입증하는 것이다. 따라서, 이들 결과는 영장류 5E8 항체와 비교하여 5E8 감마 4 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00074
) 항체로부터 얻어진 IgE 억제의 차이가 글리코실화 차이에 기인하지 않음을 시사하는 것이다.
3개의 영장류 항체(p5E8G4P, p5E8G4PN- 및 p6G5G4P)를 실질적으로 동일한 방법을 사용하여 사람 감마-1 버전으로서 발현시켰다. p5E8G1, p5E8G1N- 및 p6G5G1으로 각각 표시되는 3개의 사람 감마-1 항사람 CD23 항체 모두는 시험관내 IL-4/IgE 검정에서 활성인 것으로 밝혀졌다 (도 3 및 도 5 참조).
p5E8G1은 0.3㎍/㎖(P[T,t] 1 테일 + 0.0055) 및 3㎍/㎖(P[T<t] 1 테일 + 0.0019)의 농도에서 p5E8G4P보다 통계학적으로 더욱 억제성인 것으로 밝혀졌다. 또한, p5E8G1N-는 0.3㎍/㎖(P[T<t] 1 테일 + 0.0392) 및 3㎍/㎖(P[T<t] 1 테일 + 0.0310)의 농도 둘 모두에서 p5E8G4PN-보다 통계학적으로 더욱 억제성이다 (도 3).
유사하게는, p6G5G1은 유도된 IgE 생성을 3㎎/㎖에서 완전히 억제하지만, p6G5G4P는 그렇지 않다 (이러한 결과를 도 5에 나타내었다).
따라서, 이들 결과는 활성 Fc 영역, 특히 사람 감마-1의 영역이 항사람 CD23 항체에 의한 유도된 IgE 억제를 위해 중요함을 시사하는 것이다. 이들 결과는 또한, 감마-3 불변 영역이 감마-1이 결합하는 동일한 FcγR 수용체에 결합하기 때문에, 사람 감마-3 불변 영역을 함유하는 사람 항-CD23 항체가 유도된 IgE 억제를 위 해 중요할 것이고, 또한 동일한 결과를 나타낼 것임을 시사한다.
실시예 2
항사람 CD23 항체의 IgE 억제에서 Fc 이펙터 부분의 포함에 대한 본 발명자들의 가설을 확정하기 위해, 2C8로 표시되는 제 3 영장류 항체(또한, 시험관내에서 IgE를 억제하는 것으로 입증됨)를 F(ab')2로 전환시켰다. IgE 억제 활성을 앞서 기술한 동일한 IL-4/IgE 검정을 사용하여 결정하였다.
재료
본 실시예에서는 하기의 재료를 사용하였다 :
이뮤노퓨어(ImmunoPure) F(ab')2 제조 킷(Preparation Kit) [피어스(Pierce) 카탈로그 # 44888]
분해 완충액 : 20 mM 아세트산 나트륨 완충액(pH 4.5)
0.1 M 시트르산(pH 3.0) (NaOH로 pH를 조절함)
물중의 0.1% 나트륨 아지드
투석 튜빙(tubing) : 50,000 MW 컷오프 [스펙트라 포어(Spectra Por) 카탈로그 # 132 128]
37℃에서 유지될 수 있는 진탕 항온조
폴리스티렌 배양튜브(17x100 mm) [피셔 카탈로그 # 14-956-6B]
BCA 단백질 검정 [피어스 카탈로그 # 23224]
센트리콘-50(Centricon-50) 농축기 [아미콘 카탈로그 # 4225].
고정된 펩신의 평형화
고정된 펩신의 50% 슬러리 0.25㎖를 17x100 mm 시험관에 첨가하였다 (겔 0.125㎖). 그 다음, 분해 완충액 4㎖를 첨가하였다. 그 다음, 펩신을 혈청 분리기를 사용하여 완충액으로부터 분리시켰다. 그 다음, 완충액을 버리고, 또 다른 완충액 4㎖를 사용하여 세척 과정을 반복하였다. 그 다음, 고정된 펩신을 분해 완충액 0.5㎖ 중에 재현탁시켰다.
고정된 단백질 A 칼럼의 제조
단백질 A 어피니티팩(AffinityPak
Figure 112005058783527-pat00075
) 칼럼 및 이뮤노퓨어 결합 및 용리 완충액을 실온으로 유지시켰다.
2 C8 F(ab') 2 단편의 제조
2C8 F(ab')2 단편을 항체 분야에 널리 공지된 방법에 의해 제조하였다. 본 발명자들은 제조업자의 프로토콜을 사용하여, 시판용 키트, 즉 이뮤노퓨어 F(ab')2 제조 키트(피어스 카탈로그 # 44888)을 사용하기로 결정하였다.
동결건조된 2C8 항체 10 mg을 분해 완충액(20 mM 아세트산 나트륨 완충액, pH 4.5) 1㎖ 중에 용해시켰다. 그 다음, 항체 함유 샘플 1㎖를 고정된 펩신을 함유하는 튜브에 첨가하였다.
항체 및 고정된 펩신을 37℃에서 고속 진탕 수조에서 4시간 동안 인큐베이션시키면서(고속으로), 인큐베이션 동안 혼합을 일정하게 유지시켰다.
생성된 용해된 F(ab')2 및 Fc 단편, 및 비분해 IgG를 혈청 분리기를 사용하 여 고정된 펩신 겔로부터 회수하였다. 미정제 분해물을 깨끗한 튜브 내로 따라내었다.
F(ab')2 단편의 회수를 향상시키기 위해, 고정된 펩신을 이뮤노퓨어 IgG 결합 완충액 1.5㎖로 세척하는 것이 바람직하다. 그 다음, 세척물을 미정제 분해물에 첨가하였다.
그 다음, 항체 단편을 단백질 A 칼럼을 사용하여 회수하였다. 이것을 고정된 단백질 A 칼럼을 개방시킴으로써 수행하였다. 기포가 겔 내로 들어가는 것을 방지하도록 주의하였다. 저장 용액(0.02% 나트륨 아지드를 함유함)을 버렸다.
그 다음, 고정된 단백질 A 칼럼을 결합 완충액(이뮤노퓨어 제조 키트에 포함됨) 12㎖를 사용하여 평형화시켰다. 그 다음, 칼럼을 키트(표지된 "F(ab')2")에 함유된 17x100 mm 시험관으로 옮겨 용리물을 수집하였다.
미정제 분해물 3㎖를 칼럼에 공급하고, 겔 내로 완전히 유동시켰다. 이들 칼럼이 높이가 상부 프릿에 도달할 때에 칼럼이 자동적으로 유동하는 것을 중단시키기 때문에 어피니티팩(상표명) 칼럼의 사용이 바람직하다.
칼럼을 결합 완충액 6㎖를 사용하여 세척하였다. F(ab')2 단편을 함유하는 용리물을 수집하였다. 이 용리물은 또한, 단백질 A에 더 이상 결합될 수 없는 작은 Fc 단편(이것은 단백질 A 칼럼에 결합되지 않음)을 함유한다. 그러나, 이들의 실질적 부분을 투석에 의해 제거하였다.
투석을 F(ab')2 함유 용리물을 취하고, 용리물을 분자량 컷오프가 50,000인 투석튜빙을 사용하여 pH 7.4의 인산염 완충 염수에 대해 투석시킴으로써 수행하여 작은 Fc 단편 불순물을 제거하였다[스펙트라 퍼.(Spectra Pur.) 카탈로그 # 132 128].
이것은 280nm의 광학 밀도가 0.707(6㎖)인 F(ab')2 분획을 생성시켰다. 투석 및 센트리콘(Centricon)-50 농축기(아미콘 카탈로그 # 4225)에 의한 농축 후에, 2C8 F(ab')2 생성물을 BCA 단백질 검정(피어스 카탈로그 # 23224)을 사용하여 단백질 함량에 대해 검정하였다. 단백질 함량은 3.76㎎/㎖인 것으로 관찰되었다.
2C8 F(ab')2를 IgE 억제 활성에 대해 검정하였으며, 앞서 기술된 동일한 시험관내 검정에서 실질적으로 IgE 생성을 억제할 수 없는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 도 6에 포함되어 있다. 사실상, F(ab')2는 단클론성 항체 2C8에 대한 유도된 IgE의 억제 효과를 길항하는 것으로 밝혀졌다. 이러한 결과는 도 7에 도시되어 있다.
실시예 3
영장류 단클론성 6G5의 영장류화된(PRIMATIZED
Figure 112005058783527-pat00076
) 감마 1 및 감마 4P 변형물 둘 모두를 앞서 기술된 SCID 마우스 모델에서 생체내에서 유도된 IgE 생성의 억제에 대한 이들의 영향에 대해 평가하였다. p5E8G1N-은 유도된 IgE를 억제시키는 데에 있어서 영장류 5E8만큼 효과적인 것으로 밝혀졌다 (도 8 및 도 9 참조). 영장류 6G5 또는 영장류화된 p6G5G4P 중 어느 것도 생체내에서 유도된 IgE를 억제하는 데에 효과적이지 못하였지만, 영장류화된 p6G5G1은 유도된 IgE 생성을 억제하였 다 (도 9 및 도 10 참조). 이러한 결과는 활성 Fc 영역이 유도된 IgE 생성을 효과적으로 억제하기 위한 항사람 CD23 항체의 능력에 대해 중요하다는 본 발명자들의 결론을 추가로 입증하는 것이다.
제안된 메카니즘
본 발명의 결과가 결과적으로, 활성 Fc 영역이 유도된 IgE 생성을 효과적으로 억제하기 위한 항사람 CD23 항체의 능력에 대해 중요하다는 것을 입증하였지만, 분자 메카니즘은 해명되지 않았다. 그러나, 수가지 가설이 이루어질 수 있다.
첫번째로, 본 발명의 항-CD23 항체가 B 세포 수용체를 항-BCR 감마-1 항체와 가교시킴으로써 명백히 유발되는 것과 같이, 유사한 신호전달 경로를 유발시키는 기능을 함이 가정될 수 있다. 이 경우에 항원 수용체 신호의 하향 조절이 동일한 B 세포 상에서의 Fc 감마 RII 및 표면 Ig(B 세포 수용체)의 콜리게이션 (coligation)으로부터 초래되어, Ig 발현의 하향 조절을 유도함이 가정되었다 [참조 : D'Ambrosia et al., 1995, Science, 268:293-297; Ono et al., 1997, Cell 90:293-301]. 실제로, CD23은 IgE 발현 B 세포의 표면에서 상향조절되어, 감마-1 불변 영역을 통한 CD23 및 FcγRII-B 수용체의 콜리게이션이 유사한 신호전달 경로를 유발시키는 것이 가능해진다.
대안적으로, 유도된 IgE 발현의 억제는 Fc 영역이 또 다른 세포 유형, 즉 킬러 T 세포 상에서 적절한 FcγR 수용체와 상호작용하는 것과 동시에 B 세포 상의 표면 IgE의 가교를 통해 일어날 수 있으며, 그 다음에 B 세포에게 아폽토시스를 일으키도록 "지시"할 수 있거나, 일부 다른 방식(즉, 식세포작용)으로 세포 사멸을 유도할 수 있다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 인용된 미국 특허 제 5,543,144호에는, IgE 발현 B 세포를 항-IgE 항체로 억제시키기 위한 유사한 메카니즘이 제안되어 있다. 상기 문헌에서 논의된 바와 같이, 마우스 IgG2a 및 사람 IgG1 및 IgG3와 같은 특정 IgG 서브클래스의 항체는 특정 Fc 수용체를 가진 식세포 백혈구에 의해 수행되는 ADCC(항체 의존성 세포 독성)을 매개할 수 있다. 예를 들어, 사람 T 세포 표면 항원에 대해 특이적인 마우스 IgG2a 단클론성 항체인 OKT3(이것은 치료제로서 시판하도록 FDA에서 승인한 최초의 단클론성 항체 생성물이었다)는 혈중 T 세포의 신속한 고갈을 제공하고, (신장 이식을 위해)면역억제된 상태를 유도하기 위해 환자에게 사용된다 [참조 : Russell, P. S. et al., Transpl. Proc. 17:39-41 (1985)]. OKT3는 5㎎/일/환자의 투여량으로 순환 T 세포를 완전히 고갈시킬 수 있다. 미국 특허 제 5,543,144호에 기술된 단클론성 항체는, 특히 마우스 감마 2a 항체 또는 사람 또는 사람화된 항체를 가진 사람 감마-1 또는 감마-3 사슬의 형태에서, 유사한 방식으로 ADCC 메카니즘에 의해 IgE 발현 B 세포를 고갈시키는 것으로 제안되었다.
그러나 항-CD23 항체를 사용하여 IgE 발현을 억제시키기 위한 실제 분자 메카니즘이 무엇이든 간에, 항-CD23 항체의 Fc 영역, 따라서 이펙터 기능이 중요한 것으로 고려됨이 명백하다. 상기 기술된 바와 같이, 본 발명의 시험관내 검정에는 보체가 존재하지 않기 때문에, 이 현상은 하나 이상의 FcγR 수용체와 연관되어 있는 것 같다. 일단 적절한 분자 성분이 확인되면, 신호전달 경로에 관여하는 세포에 대한 내부 분자 뿐만 아니라, 유도된 IgE 발현을 억제하기 위해 사용될 수 있는 다른 치료제를 설계하는 것이 가능해질 것이다.
이용성
IgE 생성을 효과적으로 억제하는 이들의 능력 때문에, 사람 감마-1 불변 도메인을 포함하고 또한 감마-3을 함유하여 구성될 수 있는 대상 항사람 CD23 항체는 IgE 생성의 억제가 치료적으로 요망되는 임의의 질환을 치료하는 데에 효과적이다. 이러한 질환은 예를 들어 알레르기성 질환, 자가면역 질환 및 염증성 질환을 포함한다.
항체를 함유하는 대상 항-CD23 사람 감마-1/감마-3 불변 도메인의 투여에 의해 치료될 수 있는 특정 질환의 예는 다음과 같다 :
알레르기성 기관지폐 아스퍼질루스증; 알레르기성 비염 및 결막염 자가면역 용혈성 빈혈; 흑색극세포증; 알레르기성 접촉성 피부염; 애디슨병; 아토피성 피부염; 원형탈모증; 범탈모증; 아밀로이드증; 아나필락시스 자색반증; 유사 아나필락시스 반응; 재생불량성 빈혈; 유전성 혈관부종; 특발성 혈관부종; 강직성 척추염; 두개동맥염; 거대세포성 동맥염; 다가야스동맥염; 측두동맥염; 천식; 모세혈관확장성운동실조증; 자가면역 난소염; 자가면역 고환염; 자가면역 내분비선 기능장애; 베세트병; 베르게르병; 뷰르거병; 기관지염; 수포성 펨피구스; 만성 점액피부 캔디다증; 카플란 증후군; 심근경색후 증후군; 심막절개술후 증후군; 심장염; 복강 스프루우; 샤가스병; 셰디악-히가시 증후군; 처그-스트라우스 증후군; 코간 증후군; 한냉응집소 질환; 크레스트 증후군; 크론병; 저온형글로불린혈증; 잠재성 섬유성폐포염; 포진성피부염; 피부근염; 진성 당뇨병; 다이아몬드-블랙판 증후군; 디죠지 증후군; 원판상홍반성루푸스; 호산성 근막염; 상공막염; 드리트마 엘리바툼 디우티눔; 윤곽성 홍반; 다형홍반; 결절성홍반; 가족성 지중해열; 펠티 증후군; 폐섬유증; 아나필락시스 사구체신염; 자가면역성 사구체신염; 연쇄상구균 감염후 사구체신염; 이식후 사구체신염; 막성 사구체신염; 굿파스테르 증후군; 이식편 대 숙주 질환; 면역 중개 과립구 감소증; 환상육아종; 알레르기성 육아종증; 육아종성 근염; 그레이브병; 하시모토 갑상선염; 신생아의 용혈성 질환; 특발성 혈색증; 쉔라인-헤노흐 자반병; 만성 활동성 및 만성 진행성 간염; 엑스조직구증식증; 과호산구증가증 증후군; 특발성 혈소판감소증; 죠브 증후군; 유년기 피부근염; 유년기 류머티스성 관절염(유년기 만성 관절염); 가와사키병; 각막염; 건성각결막염; 랑드리-귈랑-바레-스트롤 증후군; 나병; 뢰플러 증후군; 루프스; 리엘 증후군; 라임병; 림프종양 육아종증; 전신성 비만 세포증; 혼성 연결 조직 질환; 다발성 단신경염; 무클-웰즈 증후군; 점막피부 림프절 증후군; 다중심성 망내조직구증; 다발성 경화증; 중증근무력증; 군상식육종; 전신성 괴사성 혈관염; 신증 증후군; 중복 증후군; 지방층염; 발작성 한냉 헤모글로빈뇨증; 유천포창; 홍반성 유천포창; 엽상 유천포창; 심상 유천포창; 비둘기 종축 질환; 과민성 폐렴; 결절성 다발성동맥염; 류머티스성 다발성근육통; 다발성근염; 특발성 다발성신경염; 포르투갈 가족성 다발신경병; 자간전증/자간증; 원발성 담즙 간경변; 진행성 전신 경화증(경피증); 건선; 관절건선; 폐포단백질증; 폐섬유증, 레이노 현상/증후군; 레이델 갑상선염; 라이터 증후군, 재발성 폴리크론드리티스; 류머티스열; 류머티스성 관절염; 유육종증; 공막염; 경화성 담관염; 혈청병; 세자리 증후군; 쇼그렌 증후군; 스티븐스-존슨 증후군; 스 틸병; 아급성 경화성 범뇌염; 교감성안염; 전신성 홍반 루프스; 이식 거부증; 궤양성 대장염; 미분화 연결 조직 질환; 만성 두드러기; 한냉 두드러기; 포도막염; 백반; 웨버-크리스챤병; 베그너 과립구감소증; 비스코트-올드리치 증후군.
이 중에서, 항-CD23 항체의 투여에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 바람직한 징후로는 알레르기성 비염 및 결막염, 아토피성 피부염; 습진; 조브 증후군, 천식; 알레르기성 질환; 및 전형적으로 고수준의 막 CD23 및 고순환 수준의 sCD23을 특징으로 하는 CLL 만성 림프구 백혈병을 포함하는 만성 염증 질환 및 질병이 있다 [참조 : Sarfati et al., Blood 71:94-98 (1988)].
치료 효과를 발생시키는 데에 유용한 항체의 양은 당업자에게 널리 공지된 표준 기술에 의해 결정될 수 있다. 항체는 약제학적으로 허용될 수 있는 완충액 내에서 표준 기술에 의해 제공되는 것이 일반적일 것이고, 임의의 바람직한 경로에 의해 투여될 수 있다. 현재 청구되는 항체의 효능 및 이들의 사람에 대한 내성 때문에, 이들 항체를 반복적으로 투여하여 인체 내의 다양한 질병 또는 질환에 대항하는 것이 가능하다.
당업자는 일상적 실험에 의해, 알레르기성 질환 및 염증 질환에 영향을 주기 위한 항체의 일상적 비독성량이 어느 정도인지를 결정할 수 있다. 그러나, 일반적으로, 효과적인 투여량은 하루에 사람 체중 1㎏당 약 0.05 내지 100㎎일 것이다.
본 발명의 항체는 치료 또는 예방 효과를 발생시키기에 충분한 양으로 상기 언급된 치료 방법에 따라 사람 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 본 발명의 이러한 항체는 공지된 기술에 따라 본 발명의 항체를 통상적인 약제학적으로 허용될 수 있는 담체 또는 희석제와 배합시킴으로써 제조되는 통상적인 투여 형태로 사람 또는 다른 동물에 투여될 수 있다. 당업자는 약제학적으로 허용될 수 있는 담체 또는 희석제의 형태 및 특징이 배합시키려는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 다른 널리 공지된 변수에 의해 규정됨을 인지할 것이다.
본 발명의 항체의 투여 경로는 경구 투여, 비경구 투여, 흡입 또는 국소 투여일 수 있다. 본원에 사용되는 용어 "비경구 투여"는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질내 또는 복강내 투여를 포함한다. 비경구 투여 중 정맥내 투여 형태가 일반적으로 바람직하다.
면역억제를 예방적으로 또는 치료적으로 유도하기 위해 본 발명의 화합물을 사용하기 위한 일일 비경구 및 경구 투여 섭생법은 하루에 체중 1㎏당 약 0.05 내지 100㎎, 바람직하게는 약 0.5 내지 10㎎인 것이 일반적일 것이다.
본 발명의 항체는 또한, 흡입에 의해 투여될 수 있다. 용어 "흡입"은 비내 및 경구 흡입 투여를 의미한다. 에어로졸 제형 또는 계측 투여 흡입제와 같은 이러한 투여를 위한 적절한 투여 형태는 통상적인 기술에 의해 제조될 수 있다. 사용하려는 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 약 10 내지 약 100㎎이 일반적이다.
본 발명의 항체는 또한 국소적으로 투여될 수 있다. 국소 투여는 비전신 투여를 의미하고 표피, 협강에 대한 본 발명의 항체(또는 이것의 단편) 화합물의 외부적 적용 및 귀, 눈 및 코 내로의 이러한 항체의 점적주입을 포함하며, 여기에서 이러한 항체는 혈류 내로 현저하게 들어가지 않는다. 전신 투여는 경구, 정맥내, 복강내 및 근육내 투여를 의미한다. 물론, 치료 또는 예방 효과를 위해 필요한 항체의 양은 선택되는 항체, 치료하려는 질환의 성질 및 경중도 및 치료를 하려는 동물에 따라 달라지며, 궁극적으로는 의사의 결정에 따른다. 본 발명의 항체의 적합한 국소 투여량은 하루에 체중 1㎏당 약 1 내지 100㎎이 일반적일 것이다.
제형
항체 또는 이의 단편은 단독으로 투여되는 것이 가능하나, 약제학적 제형으로 제공하는 것이 바람직하다. 상기 활성성분은, 국소적인 투여를 위해, 제형의 0.001% 내지 10% w/w, 예를 들어 1중량% 내지 2중량%를 포함할 수 있으며, 제형에 대해 10% w/w 만큼을 포함할 수도 있으나, 바람직하게는 5% w/w를 초과하지 않으며 더욱 바람직하게는 0.1% 내지 1% w/w이다.
본 발명의 국소적용 제형은 하나 이상의 허용가능한 담체(들)와 함께 활성성분을 포함하며, 임의적으로 다른 치료성분(들)을 포함한다. 상기 담체는 제형의 다른 성분과의 적합성이라는 관점에서 볼 때, "허용될 수" 있어야 하며, 이들의 수용자에 대해 유해하지 않아야 한다.
국소적인 투여에 적합한 제형은 눈, 귀 또는 코에 투여하는데 적합한 리니먼트제(liniments), 로션, 크림, 연고, 페이스트 및 점적제와 같은 피부를 통하여 치료를 요하는 영역으로 침투하는데 적합한 액상 또는 반-액상제를 포함한다.
본 발명에 따른 점적제는 멸균수용액 또는 오일 용액 또는 현탁제를 포함할 수 있고, 살균제 및/또는 살진균제 및/또는 그 밖의 다른 적절한 보존제의 적절한 수용액에 활성성분을 용해시킴으로써 제조될 수 있으며, 바람직하게는 계면활성제 를 포함한다. 생성된 용액을 여과하여 정화시키고, 적절한 용기로 이동시킨 후 밀봉하며, 오토클레이빙(autoclaving) 또는 90 내지 100 ℃에서 30분 동안 유지시켜 멸균시킬 수 있다. 또한, 상기 용액을 여과에 의해 멸균시키고, 무균적 기술에 의해 용기로 이동시킬 수 있다. 점적제에 포함되기에 적합한 살균제 및 살진균제의 예로는 페닐수은 니트레이트 또는 페닐수은 아세테이트(0.002%), 벤즈알코늄 클로라이드(0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트(0.01%) 등이 있다. 오일계 용액의 제조에 적합한 용매로는 글리세롤, 희석 알코올 및 프로필렌 글리콜이 있다.
본 발명에 따른 로션은 피부 또는 눈에 적용하기에 적합한 것을 포함한다. 눈 로션은 임의적으로 살균제를 함유하는 멸균수 용액을 포함할 수 있으며, 점적제의 제조방법과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 피부에 적용하기 위한 로션 또는 리니먼트제는 알코올 또는 아세톤과 같이 건조가 빠르고, 피부를 시원하게 하는 제제 및/또는 글리세롤과 같은 보습제 또는 피마자유나 땅콩 오일과 같은 오일을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림제, 연고제 또는 페이스트는 외부적용을 위한 활성성분의 반고형 제형이다. 상기 제형은 미세-분할되거나 분말인 형태, 단독 또는 수성 또는 비수성 액 중의 용액 또는 현탁액 중의 활성성분을, 적절한 장치를 사용하여, 유지상 또는 비유지상 베이시스(basis)와 혼합시켜 제조할 수 있다. 상기 베이시스는 경질, 연질 또는 액상 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속비누와 같은 탄화수소; 점액질; 아몬드, 옥수수, 땅콩, 피마자유 또는 올리브유 등의 천연유; 양모지(wool fat) 또는 그 유도체, 또는 프로필렌 글리콜 또는 마크로겔과 같은 알코올과 함께 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산 등을 포함할 수 있다. 상기 제형은 소르비탄 에스테르 또는 이들의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 음이온, 양이온 또는 비이온성 계면활성과 같은 임의의 적절한 계면활성제를 혼입할 수 있다. 천연 고무와 같은 현탁제, 실리카시어스 실리카(silicaceous silicas)와 같은 셀룰로오스 유도체 또는 무기 물질 및 라놀린 같은 기타 성분 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 항체 또는 이의 단편에 있어서 개개 복용의 최적량 및 간격은 치료되어야 할 질환의 특성 및 정도, 투여의 형태, 경로 및 부위 및 치료되어야 할 특정동물에 따라 결정되는 것임은 당업자에게 자명하며, 상기 최적조건은 통상적인 기술에 의해 결정될 수 있다. 또한 최적의 치료과정, 즉, 정해진 일수 동안 하루 당 제공되는 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 복용 횟수가 통상적인 치료과정 결정 시험을 사용하여 당업자에 의해 확인될 수 있음은 당업자에 의해 이해될 것이다.
추가의 상세한 설명 없이도, 당업자는 상기 명세서의 상세한 설명을 이용하여 본 발명을 충분히 실시할 수 있다. 따라서, 다음은 단순한 예시에 불과하며 어떠한 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
캡슐 조성물
캡슐형태의 본 발명의 약제학적 조성물을 표준의 2-편 경질 젤라틴 캡슐을 분말형태의 본 발명의 항체 또는 이의 단편 50㎎, 락토오스 100㎎, 활석 32㎎ 및 마그네슘 스테아레이트 8㎎으로 채움으로써 제조하였다.
비경구 주사용 조성물
주사 투여에 적합한 형태의 본 발명의 약제학적 조성물을 프로필렌 글리콜 및 물 10k 부피에 본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.5k 중량을 교반하여 제조하였다. 이 용액을 여과에 의해 멸균시켰다.
연고제 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 10g.
백색의 연질 파라핀 100.0g.
본 발명에 의한 항체 또는 이의 단편을 잘 개어진 균질의 제품을 생산하기 위해 작은 부피의 비히클에 분산시켰다. 연질 금속튜브(collapsible metal tube)에 상기 분산물을 채웠다.
국소용 크림 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g.
폴라왁스(polawax) GP 200 20.0g.
무수 라놀린 2.0g.
흰색 밀랍 2.5g.
메틸 하이드록시벤조에이트 0.1g.
전체 중량이 100.0g이 될 때까지 증류수를 채움.
상기 폴라왁스, 밀랍 및 라놀린을 60℃에서 함께 가열하였다. 메틸 하이드록시벤조에이트의 용액을 가하고, 고속으로 교반하여 균질화시켰다. 그런 다음 SOOC로 온도를 떨어뜨렸다. 본 발명에 의한 항체 또는 이의 단편을 첨가하고 완전히 분산시키고, 상기 조성물을 저속 교반하여 냉각시켰다.
국소용 로션 조성물(Topical Lotion Composition)
본 발명의 항체 또는 이의 단편 1.0g.
소르비탄 모노라우레이트 0.6g.
폴리소르베이트 20 0.6g.
세토스테아릴 알코올 1.2g.
글리세린 6.0g.
메틸 하이드록시벤조에이트 0.2g.
전체 부피가 100.00㎖가 될 때까지 정제수 B.P. 채움. (B.P. = 영국 약전)
상기 메틸 하이드록시벤조에이트 및 글리세린을 75℃의 물 70 ㎖에 용해시켰다. 상기 소르비탄 모노라우레이트, 폴리소르베이트 20 및 세토스테아릴 알코올을 75℃에서 함께 녹이고, 수용액에 첨가하였다. 생성된 에멀전을 균질화시키고, 연속 교반하여 냉각시키고, 본 발명에 의한 항체 또는 이의 단편을 현탁물로서 남아있는 물에 첨가하였다. 전체 현탁액을 균질화될 때까지 교반시켰다.
점안제 조성물
본 발명의 항체 또는 그 단편 0.5g.
메틸 하이드록시벤조에이트 0.01g.
프로필 하이드록시벤조에이트 0.04g.
전체 부피가 100.00㎖가 되도록 정제수 B.P. 채움.
상기 메틸과 프로필 하이드록시벤조에이트를 75℃에서 정제수 70㎖에 용해시키고, 생성된 용액을 냉각시켰다. 다음으로 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 첨 가하고, 상기 용액을 막 필터(0.022 Am 포어 크기)를 통해 여과하여 멸균시키고, 적절한 멸균용기에 무균적으로 포장하였다.
흡입투여용 조성물
15-20㎖ 용량의 에어로졸 용기에 대해 본 발명의 항체 또는 이의 단편 10㎎과 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 윤활제 0.2 - 0.5k를 혼합하고, 상기 혼합물을 프레온과 같은 추진제, 바람직하게는 (1,2-디클로로테트라플루오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄의 조합물로 분산시키고, 비내 또는 경구 투여용으로 적합한 에어로졸 용기에 넣었다. 15-20㎖ 용량의 에어로졸 용기에 적합한 흡입 투여용 조성물: 본 발명의 항체 또는 이의 단편 10mg을 에탄올(6 내지 8㎖)에 용해시키고, 폴리소르베이트 85 또는 올레산 같은 윤활제 0.1-0.2k 를 첨가하며; 프레온과 같은 추진제, 바람직하게는 조합물(1,2-디클로로테트라플루오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄의 조합물로 분산시키고 비내 또는 경구 흡입 투여용으로 적합한 에어로졸 용기에 넣었다.
비경구투여용 항체 조성물
본 발명의 항체 및 약제학적 조성물은 비경구 투여, 즉 피하적으로, 근육내적으로 또는 정맥내적으로 특히 유용하다. 비경구 투여용 상기 조성물은 일반적으로 본 발명의 항체 또는 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체 중에 용해된 이 칵테일의 용액을 포함할 것이다. 다양한 수성 담체로는, 예컨대 물, 완충수, 0.4k 염수(정상 염수), 0.3% 글리신 등이 사용될 수 있다. 정상 염수의 사용이 바람직하다. 이들 용액은 멸균상태이며 일반적으로 입상물질이 없다. 이들 용액은 통상 의 널리 공지된 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다. 상기 조성물은 pH 조절제 및 완충제 등과 같은 흡사한 생리학적 조건을 위한 요구로서 약제학적으로 허용되는 보조물질을 포함할 수 있다. 상기 약제학적 제형에 있어서 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 농도는 폭넓게 변할 수 있다. 상기 농도는 일차적으로, 선택된 특정 투여 모드에 따라 액체의 부피, 점도 등에 기초하여 선택될 것이다. 일반적으로 적합한 정맥내 농도는 ㎖ 당 약 1 내지 100 ㎎ 이다.
따라서, 정맥내 주사용의 본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 항사람 CD23 항체 40 내지 50㎎을 함유하는 정상 염수 10㎖를 포함할 수 있다. 비경구적으로 투여될 수 있는 조성물을 제조하는 방법은 널리 공지되어 있거나 당업자에 자명하며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania]에 상세하게 기술되어 있으며, 이는 본 명세서에 참고로 인용되었다.
본 발명의 항체는 저장을 위해 동결건조될 수 있고, 사용에 앞서 적절한 담체에 재구성될 수 있다. 상기 기술은 통상적인 면역글로불린과 함께 효과적인 것으로 알려졌으며, 당분야에 공지되어 있는 동결건조 및 재구성 기술이 사용될 수 있다.
의도하는 결과에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 예방 및/또는 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용에 있어서, 조성물은 이미 질환에 걸린 환자에게 치료 또는 최소한 부분적으로 질환 및 이의 합병증을 저지하기에 충분한 양으로 투여된다. 예방적인 적용에 있어서, 상기 항체 또는 이들의 칵테일을 함유하는 조 성물은 환자의 저항성을 향상시키기 위해 아직 질환에 걸리지 않은 환자에게 투여된다.
약제학적 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료 의사에 의해 선택되는 용량수준 및 패턴에 따라 수행될 수 있다. 어떤 경우에는, 본 발명의 약제학적 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 대상 항-CD23 항체를 제공하여야 한다.
또한, 본 발명의 항체가 항체로서 동일한 치료에 유용한 펩티드 또는 비펩티드 화합물(모사체)의 설계 및 합성에 사용될 수 있다는 사실은 주목할 만하다[참조예: Saragovi et al., Science, 253:792-795(1991)].
상기 본 명세서에서 예시의 목적으로 본 발명의 특정 구체예를 기술하고 있으나, 다양한 변형이 본 발명의 범위를 벗어남이 없이 이루어질 수 있음이 이해될 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따르면, 사람의 CD23, IgE에 대한 저친화도 수용체(FceRII/CD23)에 특이적으로 결합하고 사람 감마-1 또는 사람 감마-3 불변 도메인을 함유하는 단클론성 항체가 제공된다. 이러한 항체는 유도된 IgE 발현을 조절하거나 억제하는데 유용하므로, 알레르기성 질환, 자가면역 질환 및 염증성 질환을 포함하여, 유도된 IgE 생성의 억제가 치료적으로 요망되는 질환의 치료 또는 예방에 실제적인 용도를 갖는다.
서열목록
(1) 일반적 사항
(i) 출원인: 레프, 미첼 이.; 클로에저, 윌리암 에스.; 나카무라, 타케히코
(ii) 발명의 명칭: 감마-1 및 감마-3 항사람 CD23 단클론성 항체 및 치료제로서 이들을 사용하는 방법
(iii) 서열의 수: 35개
(iv) 연락처:
(A) 수신인: 번스, 도안, 스웨커 앤 마티스
(B) 거리: 피. 오. 박스 1404
(C) 도시: 알렉산드리아
(D) 주: 버지니아
(E) 국가: 미합중국
(F) 우편 번호: 22313-1404
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환기종
(C) 작업 시스템: PC-DOS / MS-DOS
(D)소프트웨어: Patentin Release #1.0, 버전 # 1.30
(vi) 현재 출원 상황:
(A) 출원 번호: US 08/803,085
(B) 출원일: 1997-2-20
(C) 분류:
(viii) 변리사/대리인 상황
(A) 성명: 테스킨, 로빈 엘.
(B) 등록 번호: 35,030
(C) 참고/서류 번호: 012712-353
(ix) 통신처
(A) 전화: (703) 836-6620
(B) 팩스: (703) 836-2021
(2) 서열 번호 1에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 390 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1 본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재위치: 1..390
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: mat_peptide
(B) 존재위치: 58..390
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :1:
Figure 112005058783527-pat00077
(2) 서열번호 2에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 423 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재위치: 1..423
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: mat_peptide
(B) 존재위치: 58..423
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :2:
Figure 112005058783527-pat00078
(2) 서열 번호 3에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 387 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재위치: 1..387
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: mat_peptide
(B) 존재위치: 67..387
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :3:
Figure 112005058783527-pat00079
(2) 서열 번호 4에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 411 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: CDS
(B) 존재위치: 1..411
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: mat_peptide
(B) 존재위치: 58..411
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :4:
Figure 112005058783527-pat00080
(2) 서열 번호 5에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 41 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :5:
Figure 112005058783527-pat00081
(2) 서열 번호 6에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 35 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :6:
Figure 112005058783527-pat00082
(2) 서열 번호 7에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 35 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 24
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 24는 N (N=A/G)이다."
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 32
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 32는 N (N=T/G)이다."
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :7:
Figure 112005058783527-pat00083
(2) 서열 번호 8에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 38 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :8:
Figure 112005058783527-pat00084
(2) 서열 번호 9에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 29 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 24
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 24는 N (N=C/T)이다."
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 29
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 29는 N (N=G/C)이다."
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :9:
Figure 112005058783527-pat00085
(2) 서열 번호 10에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 34 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 21
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 21은 N (N=G/A)이다."
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 26
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 26은 N (N=G/C)이다."
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :10:
Figure 112005058783527-pat00086
(2) 서열 번호 11에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 34 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 27
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 27은 N (N=A/G)이다."
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 31
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 31은 N (N=T/C)이다."
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :11:
Figure 112005058783527-pat00087
(2) 서열 번호 12에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 35 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 23
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 23은 N (N=A/C)이다."
(ix) 서열의 특징:
(A) 명칭/키: misc_feature
(B) 존재위치: 29
(D) 기타 정보: /주 = "누클레오티드 29는 N (N=T/C)이다."
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :12:
Figure 112005058783527-pat00088
(2) 서열 번호 13에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 21 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA(genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :13:
Figure 112005058783527-pat00089
(2) 서열 번호 14에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :14:
Figure 112005058783527-pat00090
(2) 서열 번호 15에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍 아미노산
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :15:
Figure 112005058783527-pat00091
(2) 서열 번호 16에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 33 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :16:
Figure 112005058783527-pat00092
(2) 서열 번호 17에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 33 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :17:
Figure 112005058783527-pat00093
(2) 서열 번호 18에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 33 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :18:
Figure 112005058783527-pat00094
(2) 서열 번호 19에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 46 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :19:
Figure 112005058783527-pat00095
(2) 서열 번호 20에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 31 아미노산
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :20:
Figure 112005058783527-pat00096
(2) 서열 번호 21에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 51 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :21:
Figure 112005058783527-pat00097
(2) 서열 번호 22에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 17 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :22:
Figure 112005058783527-pat00098
(2) 서열 번호 23에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 16 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :23:
Figure 112005058783527-pat00099
(2) 서열 번호 24에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :24:
Figure 112005058783527-pat00100
(2) 서열 번호 25에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 24 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :25:
Figure 112005058783527-pat00101
(2) 서열 번호 26에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :26:
Figure 112005058783527-pat00102
(2) 서열 번호 27에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 21 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :27:
Figure 112005058783527-pat00103
(2) 서열 번호 28에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :28:
Figure 112005058783527-pat00104
(2) 서열 번호 29에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :29:
Figure 112005058783527-pat00105
(2) 서열 번호 30에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :30:
Figure 112005058783527-pat00106
(2) 서열 번호 31에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 20 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :31:
Figure 112005058783527-pat00107
(2) 서열 번호 32에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 30 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :32:
Figure 112005058783527-pat00108
(2) 서열 번호 33에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :33:
Figure 112005058783527-pat00109
(2) 서열 번호 34에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :34:
Figure 112005058783527-pat00110
(2) 서열 번호 35에 대한 사항:
(i) 서열의 특성:
(A) 서열의 길이: 27 염기쌍
(B) 서열의 형: 핵산
(C) 쇄의 수: 1본쇄
(D) 형태: 선형
(ii) 서열의 종류: DNA (genomic)
(xi) 서열 설명: 서열 번호 :35:
Figure 112005058783527-pat00111

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  35. (a) 서열 번호 1에서 아미노산 (+)1-111의 6G5 경쇄 가변 영역으로부터 유래된 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 2에서 아미노산 (+)1-122의 6G5 중쇄 가변 영역으로부터 유래된 중쇄 가변 영역; 또는
    (b) 서열 번호 3에서 아미노산 (+)1-107의 5E8 경쇄 가변 영역으로부터 유래된 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에서 아미노산 (+)1-118의 5E8 중쇄 가변 영역으로부터 유래된 중쇄 가변 영역; 및
    사람의 Fc 감마 수용체에 결합하는 불변 영역을 포함하고,
    사람 CD23에 특이적으로 결합하며 IgE 발현을 억제하는 항사람 CD23 항체를 코딩하는 재조합 핵산 분자.
  36. 제35항에 있어서, 사람 감마-1 또는 사람 감마-3 불변 영역으로부터 유래된 불변 영역을 포함하는 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  37. 제35항에 있어서, 사람화된 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  38. 제35항에 있어서, 시험관내에서 B 세포에 의한 IgE 발현을 억제하는 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  39. 제38항에 있어서, 시험관내에서 B 세포에 의한 IL-4 유도된 IgE 발현을 억제하는 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  40. 제35항에 있어서, 생체내에서 B 세포에 의한 IL-4 유도된 IgE 발현을 억제하는 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  41. 제35항에 있어서, 결합 친화도가 0.01nM 내지 1000nM인 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  42. 제35항에 있어서, CD23 결합 친화도가 5nM 이상인 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  43. 제42항에 있어서, CD23 결합 친화도가 100nM 이상인 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  44. 제36항에 있어서, 사람 감마-1 불변 영역을 포함하는 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  45. 제36항에 있어서, 사람 감마-3 불변 영역을 포함하는 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  46. 제35항에 있어서, 서열 번호 1에서 아미노산 (+)1-111의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 2에서 아미노산 (+)1-122의 중쇄 가변 영역을 포함하는 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  47. 제46항에 있어서, 서열 번호 1의 누클레오티드 58-390을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 2의 누클레오티드 58-423을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  48. 제35항에 있어서, 서열 번호 3에서 아미노산 (+)1-107의 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 4에서 아미노산 (+)1-118의 중쇄 가변 영역을 포함하고, 서열 번호 4의 (+)78 위치에서 아스파라긴이 리신으로 대체된 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 재조합 핵산 분자.
  49. 제48항에 있어서, 서열 번호 3의 누클레오티드 67-387을 포함하는 경쇄 가변 영역 및 서열 번호 4의 누클레오티드 58-411을 포함하는 중쇄 가변 영역을 코딩하고, 서열 번호 4의 누클레오티드 289-291에 의해 코딩되는 아스파라긴 코돈이 리신 코돈으로 대체됨을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  50. 제35항에 있어서, 키메라 항체인 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  51. 제35항에 있어서, 영장류화된(PRIMATIZED®) 항체인 항사람 CD23 항체를 코딩함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  52. 제37항에 있어서, 사람화된 항체가 CDR 이식에 의해 제조됨을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  53. 제37항에 있어서, 사람화된 항체가 버니어링(veneering)에 의해 제조됨을 특징으로 재조합 핵산 분자.
  54. 제37항에 있어서, 사람화된 항체가 분자 모델링에 의해 제조됨을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  55. 제37항에 있어서, 사람화된 항체가 프레임워크 대체에 의해 제조됨을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  56. 제35항에 있어서, 사람 감마-1 불변 영역을 포함하는 항사람 CD23 항체를 코딩하고, 시험관내에서 B 세포에 의한 IL-4 유도된 IgE 생성을 사람 감마-1 불변 영역이 없는 항사람 CD23 항체보다 크게 억제함을 특징으로 하는 재조합 핵산 분자.
  57. 제35항 내지 제56항 중의 어느 한 항에 따른 재조합 핵산 분자를 발현시키는 세포.
  58. 제57항에 있어서, 세포가 포유류 세포임을 특징으로 하는 세포.
  59. 제57항에 있어서, 세포가 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, HEK293 세포(사람의 배아 신장 세포주), SP2/0 세포(마우스 골수종 세포), BHK 세포(햄스터 새끼 신장 세포), YB2/0 세포(래트 골수종 세포), CV1 세포(원숭이 신장 세포), WI38 세포(사람의 폐 섬유아세포), 또는 HELA 세포(사람의 경부 암종 세포)로 구성된 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 세포.
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6893636B2 (en) * 1997-02-20 2005-05-17 Biogen Idec Ma Inc. Gamma-1 and gamma-3 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
US7033589B1 (en) * 1997-02-20 2006-04-25 Biogen Idec Ma Inc. γ-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
US20030211107A1 (en) * 2002-01-31 2003-11-13 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders
JP4571952B2 (ja) * 2004-02-05 2010-10-27 アクセス ビジネス グループ インターナショナル リミテッド ライアビリティ カンパニー 抗アレルギー組成物及び関連方法
WO2007095230A2 (en) * 2006-02-13 2007-08-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania TREATMENT OF AUTOIMMUNE BLISTERING DISEASE USING ANTI-IgE ANTIBODY
WO2009043051A2 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Biogen Idec Ma Inc. Cd23 binding molecules and methods of use thereof
EA031737B1 (ru) 2010-06-03 2019-02-28 Фармасайкликс, Инк. Применение ингибиторов тирозинкиназы брутона (btk) для лечения лейкоза и лимфомы
CN111234010A (zh) * 2020-01-20 2020-06-05 华兰生物工程重庆有限公司 降低静注人免疫球蛋白中aca的处理方法
CN113980092B (zh) * 2021-12-09 2024-05-14 上海药明生物技术有限公司 一种蛋白质亲和纯化方法

Family Cites Families (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3167442D1 (en) * 1980-07-07 1985-01-10 Nat Res Dev Improvements in or relating to cell lines
US4816567A (en) * 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4629783A (en) * 1985-04-29 1986-12-16 Genetic Systems Corporation Synthetic antigen for the detection of AIDS-related disease
US4714759A (en) * 1985-12-02 1987-12-22 Whitaker Jr Robert B Immunotoxin therapy of allergy
FR2599513B1 (fr) 1986-05-27 1989-09-15 Unicet Laboratoires Anticorps monoclonaux inhibant la liaison de ige soluble aux lymphocytes humains, hybridomes monoclonaux produisant de tels anticorps, leur utilisation
US5635600A (en) 1986-07-07 1997-06-03 Trustees Of Dartmouth College Bifunctional and heteroantibodies specific for the high affinity Fc receptor for immunoglobulin G on human mononuclear phagocytes
SE8701004D0 (sv) 1987-03-11 1987-03-11 Astra Ab Method for therapy of leukemias and certain other malignancies
WO1988007089A1 (en) 1987-03-18 1988-09-22 Medical Research Council Altered antibodies
US4940782A (en) 1987-06-08 1990-07-10 G. D. Searle & Co. Monoclonal antibodies against IgE-associated determinants, hybrid cell lines producing these antibodies, and use therefore
SE459001B (sv) 1987-07-06 1989-05-29 Gunnar Karl Stroemberg Anordning med hjul vid tillslutbar lastbehaallare av containertyp med bakre belaegna doerrar
US5428133A (en) * 1987-12-31 1995-06-27 Tanox Biosystems, Inc. Chimeric anti-human IgE-monoclonal antibody which binds to secreted IgE and membrane-bound IgE expressed by IgE-expressing B cells but notto IgE bound to FC receptors on basophils
US5449760A (en) 1987-12-31 1995-09-12 Tanox Biosystems, Inc. Monoclonal antibodies that bind to soluble IGE but do not bind IGE on IGE expressing B lymphocytes or basophils
US4975369A (en) 1988-04-21 1990-12-04 Eli Lilly And Company Recombinant and chimeric KS1/4 antibodies directed against a human adenocarcinoma antigen
DE3814113A1 (de) 1988-04-27 1989-11-09 Hal Allergie Gmbh Physiologisch aktive fluessige wirkstoff-zubereitungen, insbesondere allergen-zubereitung, aus biologischem ursprungsmaterial
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
GB8916400D0 (en) 1989-07-18 1989-09-06 Dynal As Modified igg3
HUT60768A (en) * 1990-03-16 1992-10-28 Sandoz Ag Process for producing cd25 fixing molecules
WO1992017207A1 (en) * 1991-03-26 1992-10-15 Tanox Biosystems, Inc. MONOCLONAL ANTIBODIES WHICH BIND TO SECRETED AND MEMBRANE-BOUND IgE, BUT NOT TO IgE ON BASOPHILS
DE4109952A1 (de) 1991-03-26 1992-10-01 Springfix Befestigungstechnik Ausgleichsanordnung
IE922437A1 (en) * 1991-07-25 1993-01-27 Idec Pharma Corp Recombinant antibodies for human therapy
US6136310A (en) 1991-07-25 2000-10-24 Idec Pharmaceuticals Corporation Recombinant anti-CD4 antibodies for human therapy
NZ243706A (en) 1991-07-25 1994-08-26 Idec Pharma Corp Recombinant monkey antibodies, pharmaceutical compositions
US5736137A (en) 1992-11-13 1998-04-07 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
US5648267A (en) 1992-11-13 1997-07-15 Idec Pharmaceuticals Corporation Impaired dominant selectable marker sequence and intronic insertion strategies for enhancement of expression of gene product and expression vector systems comprising same
US5914110A (en) * 1993-09-07 1999-06-22 Smithkline Beecham Corporation Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders
DK0788513T3 (da) * 1994-10-25 2001-04-02 Glaxo Group Ltd Anvendelse af bindingsmidler for CD23 i behandlingen af atoimmune sygdomme
US5811524A (en) 1995-06-07 1998-09-22 Idec Pharmaceuticals Corporation Neutralizing high affinity human monoclonal antibodies specific to RSV F-protein and methods for their manufacture and therapeutic use thereof
US6001358A (en) 1995-11-07 1999-12-14 Idec Pharmaceuticals Corporation Humanized antibodies to human gp39, compositions containing thereof
US6893636B2 (en) * 1997-02-20 2005-05-17 Biogen Idec Ma Inc. Gamma-1 and gamma-3 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
US7033589B1 (en) * 1997-02-20 2006-04-25 Biogen Idec Ma Inc. γ-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies and use thereof as therapeutics
US6011138A (en) 1997-02-20 2000-01-04 Idec Pharmaceuticals Corporation Gamma-1 anti-human CD23 monoclonal antibodies
US6127588A (en) * 1998-10-21 2000-10-03 Phillips Petroleum Company Hydrocarbon hydrogenation catalyst and process
US20020006404A1 (en) * 1999-11-08 2002-01-17 Idec Pharmaceuticals Corporation Treatment of cell malignancies using combination of B cell depleting antibody and immune modulating antibody related applications
US20030211107A1 (en) * 2002-01-31 2003-11-13 Kandasamy Hariharan Use of CD23 antagonists for the treatment of neoplastic disorders

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