KR20010023787A - 사람 ｇｐ39에 대한 사람화된 항체, 이러한 항체를함유하는 조성물 및 이의 치료학적 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사람 gp39와 결합하는 사람화된 항체 및 이의 치료제로의 용도에 관한 것이다. 이러한 사람화된 항체는 특히 자가면역 질환을 치료하는 데 유용하며, 이종 세포, 조직 또는 기관의 이식, 세포 치료 및 유전자 치료 동안에 면역억제제로서 유용하다.

Description

사람 ＧＰ39에 대한 사람화된 항체, 이러한 항체를 함유하는 조성물 및 이의 치료학적 용도 {HUMANIZED ANTIBODIES TO HUMAN gp39, COMPOSITIONS CONTAINING AND THERAPEUTIC USE THEREOF}
면역 시스템은 외래 항원에 대한 두 가지 형태의 항원 특이적 반응을 생성시킬 수 있다. 세포 매개된 면역성은 T 임파구에 의해 매개된 면역 시스템의 이펙터 작용을 나타내는데 사용하는 용어이다. 체액성 면역성은 B 임파구에 의한 항원 특이적 항체의 생성을 나타내는데 사용되는 용어이다. 대부분의 항체에 대한 체액성 면역성을 개발하는데는 항체 생성 B 임파구 뿐만 아니라 헬퍼 T(이하 "Th"라 칭함) 임파구의 관련을 필요로 한다는 것이 오래 전부터 인지되어 왔다. [문헌: Mitchison, Eur. J. Immunol., 1:18-25 (1971); Claman and Chaperon, Transplant Rev., 1:92-119 (1969); Katz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70:2624-2629 (1973); Reff et al, Nature, 226:1257-1260 (1970)]. 특정의 시그날 또는 "헬프(help)"는 흉선 의존성 (이하 "TD"라 칭함) 항원에 의한 자극에 대해 반응으로 Th 세포에 의해 제공된다. 어떠한 B 임파구 헬프는 Th 세포(예를 들어, IL-4 및 IL-5와 같은 림포킨)에 의해 분비된 가용성 분자에 의해 매개되며, B 세포의 활성화는 B 세포와 Th 세포 사이의 접촉 의존성 상호작용을 필요로 한다. [문헌: Hirohata et al, J. Immunol., 140:3736-3744 (1988); Bartlett et al, J. Immunol., 143:1745-1765 (1989)]. 이러한 결과는 B 세포 활성화가 B 세포와 Th 세포상의 세포 표면 분자 사이의 필수적인 상호작용과 관련이 있음을 나타낸다. 이러한 상호작용은 활성화된 T 세포의 단리된 원형질막이 B 세포 활성화에 필요한 헬퍼 기능을 제공할 수 있다는 연구 결과에 의해 지지된다. [문헌: Brian, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:564-568 (1988); Hodgkin et al, J. Immunol., 145:2025-2034 (1990); Noelle et al, J. Immunol.., 146:1118-1124 (1991)].
"T 세포 헬퍼 작용"이라 일컬어지는 접촉 의존성 과정에서, CD4+T 임파구는 B 임파구의 활성화 및 분화를 유도하고, 그로 인해서, 항체 분자의 특이성, 분비 및 이소타입 코드화 기능을 조절함으로써 체액성 면역반응을 조절한다는 것이 또한 공지되어 있다. [문헌: Mitchell et al, J. Exp. Med., 128:821 (1968); Mitchison, Eur. J. Immunol., 1:68 (1971); White et al, J. Exp. Med., 14:664(1978); Reinherz et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74:4061 (1979); Janeway et al, Immunol. Rev., 101:39 (1988); O'Brien et al, J. Immunol., 141:3335 (1988); Rahemtulla et al, Nature, 353:180 (1991); and Grusby et al, Science, 253:1417 (1991)].
T 세포가 B 세포를 분화되게 하는 과정은 두 가지의 독특한 단계, 즉, 유도성 단계 및 이펙터 단계로 구분된다. [문헌: Vitetta et al, Adv. Immunol., 45:1 (1989); Noelle et al, Immunol. Today, 11:361 (1990)]. 유도성 단계에서, 휴면 T 세포는 항원 시발된 B 세포와 접촉되고, 이러한 관계는 클론형 T 세포 수용체 (TCR)-CD4 복합체가 B 세포상의 Ia/Ag 복합체와 접촉되게 한다. [문헌: Janeway et al, Immunol. Rev., 101:39 (1988); Katz et al, Proc. Natl. Acad. Sci., 70:2524 (1973); Zinkernagel, Adv. Exp. Med., 66:527 (1976); Sprent, J. Exp. Med., 147:1159 (1978); Sprent, Immunol. Rev., 42:158 (1978); Jones et al, Nature, 292:547 (1981); Julius et al, Eur. J. Immunol., 18:375 (1982); Chestnut et al, J. Immunol., 126:1575(1981); and Rogozinski et al, J. Immunol., 126:735 (1984)]. Ia/Ag의 TCR/CD4 인식은 안정한 T-B 동족쌍의 형성 및 이방향성 T 및 B 세포 활성화를 유도한다. [문헌: Sanders et al, J. Immunol., 137:2395 (1986); Snow et al, J. Immunol., 130:614 (1983); Krusemeier et al, J. Immunol., 140:367 (1988); Noelle et al, J. Immunol., 143:1807 (1989); Bartlett et al, J. Immunol., 143:1745 (1989); and Kupfer et al, Annu. Rev. Immunol., 7:309 (1987)]. 이펙터 단계에서, 활성화된 T 세포는 림포킨의 분비[문헌: Thompson et al, J. Immunol., 134:369(1985)] 및 접촉 의존성 자극[문헌: Noelle et al, J. Immunol., 143:1807 (1989); Clement et al., J. Immunol., 140:3736 (1984); Crow et al, J. Exp. Med., 164:1760 (1986); Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:564 (1988); Hirohata et al, J. Immunol., 140:3736 (1988); Jover et al, Clin. Immunol. Immun., 53:90 (1989); Whalen et al, J. Immunol., 141:2230 (1988); Pollok et al, J. Immunol., 146:1633 (1991); and Bartlett et al, J. Immunol., 143:1745., (1990)]에 의해서 B 세포 분화를 유도하며, 이러한 림포킨의 분비와 접촉 의존성 자극 둘 모두는 T 세포가 작은 휴면 B 세포를 유도하여 Ig 분비 세포내로 분화되게 하는데 요구된다 [문헌: Clement et al., J. Immunol., 132:740 (1984); Martinez et al, Nature, 290:60 (1981); and Andersson et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 77:1612 (1980)].
T 세포 헬프의 유도 단계가 Ag 의존성 및 MHC-제한성이지만[문헌: Janeway et al, Immun. Rev., 101:34 (1988); Katz et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 10:2624 (1973); Zinkernagle, Adv. Exp. Med. Biol., 66:527 (1976)], T 세포 헬퍼 작용의 이펙터 단계는 Ag 독립성 및 MHC-비제한성일 수 있다[문헌: Clement et al, J. Immunol., 132:740 (1984); Hirohata et al, J. Immunol., 140:3736 (1988); Whalen et al, J. Immunol., 143:1715 (1988)]. 또 다른 대조적인 특징은 T 세포 헬프의 유도성 단계는 CD4 분자을 필요로 하며, 항 CD4 mAb에 의해 억제되지만[문헌: Rogozinski et al, J. Immunol., 126:735 (1984)], 헬퍼 이펙터 작용은 CD4 분자를 필요로 하지 않으며[문헌: Friedman et al, Cell. Immunol., 103:105 (1986)], 항 CD4 mAbs에 의해 억제되지 않는다 [문헌: Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:564 (1988); Hirohata et al, J. Immunol., 140:3736 (1988); Whalen et al, J. Immunol., 143:1745 (1988); and Tohma et al, J. Immunol., 146:2547 (1991)]. 비특이성 헬퍼 이펙터 작용은 항원 특이성 동족쌍과의 T-B 세포 상호작용의 편재 특성에 의해 특이성 B 세포 표적에 집중되는 것으로 사료된다 [문헌: Bartlett et al, J. Immunol., 143:1745 (1989);Kupfer et al, J. Exp. Med., 165:1565 (1987) and Poo et al, Nature, 332:378 (1988)].
말단 B 세포 분화가 T 세포로부터의 접촉 및 림포킨 매개된 자극을 필요로 하지만, B 세포 분화의 중간 단계는 분비된 인자의 부재하에 활성화된 T 세포 표면에 의해 유도될 수 있다 [문헌: Crow et al., J. Exp. Med., 164:1760 (1986); Brian, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 85:564 (1988); Sekita et al, Eur. J. Immunol., 18:1405 (1988); Hodgkin et al, J. Immunol., 145:2025 (1990); Noelle et al, FASEB J, 5:2770 (1991)]. B 세포상의 이러한 중간 효과는 표면 CD23 발현[문헌: Crow et al, Cell Immunol., 121:94 (1989)], 세포 사이클 진행과 연관된 효소[문헌: Pollok et al, J. Immunol., 146:1633 (1991)] 및 림포킨에 대한 반응성[문헌: Noelle et al, FASEB J, 5:2770 (1989); Pollok et al, J. Immunol., 146:1633 (1991)]을 유도함을 포함한다. 최근, B 세포 활성화를 유도하는 활성화 유도된 T세포 표면 분자의 일부가 동정되었다. 또한, 작용성 연구에서는 B 세포 활성화를 유도하는 활성화 유도된 T 세포 표면 분자의 어떠한 특징을 특정화하고 있다. 첫째로는, T 세포는 활성화 후에 B 세포를 4 내지 8 시간 동안 자극하는 능력을 취득한다[문헌: Bartlett et al, J. Immunol., 145:3956 (1990) and Tohma et al, J. Immunol., 146:2544 (1991)]. 두 번째로는, 활성화된 T 세포의 표면과 연관된 B 세포 자극 활성은 파라포름알데히드 고정된 세포[문헌: Noelle et al, J. Immunol., 143:1807 (1989); Cros et al, J. Exp. Med., 164: 1760 (1986); Pollok et al, J. Immunol., 146:1633 (1991); Tohma et al, J. Immunol., 146:2544(1991); and Kubota et al, Immunol., 72:40 (1991)] 및 정제된 막 단편[문헌: Hodgkin et al, J. Immunol., 145: 2025 (1990) and Martinez et al, Nature, 290:60 (1981)]상에 보존된다. 세 번째로는, B 세포 자극성 활성은 단백질 분해효소 처리에 민감하다[문헌: Noelle et al, J. Immunol., 143:1807 (1989); Sekita et al, Eur. J. Immunol., 18:1405 (1988); and Hodgkin et al, J. Immunol., 145:2025 (1990)]. 네 번째로는, T 세포 활성화 후에 표면활성 구조를 취득하는 과정이 사이클로헥시미드에 의해 억제된다[문헌: Tohma et al, J. Immunol. 196:2349 (1991) and Hodgkin et al, J. Immunol., 195:2025 (1990)].
세포 표면 분자, CD40은 항체에 의해 가교 결합되는 경우에 B 세포 증식을 유도하는 미숙 B 임파구 및 성숙한 B 임파구 상에서 동정되고 있다. [문헌: Valle et al, Eur. J. Immunol., 19:1463-1467 (1989); Gordon et al, J. Immunol., 140:1425-1430 (1988); Gruder et al, J. Immunol., 142:4144-4152 (1989)]
CD40은 분자적으로 클로닝되며 특성화된다[문헌: Stamenkovic et al, EMBO J., 8:1403-1410 (1989)].
CD40은 B 세포, 수지상 세포, 대식세포, 포상 수지상 세포 및 흉성 상피세포상에서 발현된다[문헌: Clark, Tissue Antigens 36:33 (1990); Alderson et al, J. Exp. Med., 178:669 (1993); Galy et al, J. Immunol. 142:772 (1992)]. 사람 CD40은 50kDa의 타입 I 막 단백질이며, 신경 성장인자 수용체계에 속한다[문헌: Hollenbaugh et al, Immunol. Rev., 138:23 (1994)]. IL-10의 존재하에 CD40을 통한 신호는 IgA, IgM 및 IgG 생산을 유도하여, 이소타입 전환이 이들의 상호작용에 의해 조절됨을 나타내고 있다. CD40과 이의 리간드 사이의 상호작용은 B 세포의 시발된 상태를 유도하여, 후속 신호를 수용하게 한다.
또한, CD40에 대한 리간드, gp39(또한, CD40 리간드 또는 CD40L이라 일컬어짐)가 최근 분자적으로 클로닝되고 특성화되어 있다[문헌: Armitage et al, Nature, 357:80-82 (1992); Lederman et al, J. Exp. Med., 175:1091-1101 (1992); Hollenbaugh et al, EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]. gp39 단백질은 휴면하는 것이 아니라 활성화된 CD4+Th 세포상에서 발현된다. [문헌: Spriggs et al., J. Exp. Med., 176:1543-1550 (1992); Lane et al, Eur. J. Immunol., 22:2573-2578 (1992); and Roy et al, J. Immunol., 151:1-14 (1993)]. gp39 유전자로 트랜스펙션되고 표면상에서 gp39 단백질을 발현하는 세포가 B 세포 증식을 개시시킬 수 있으며, 다른 자극 시그날과 함께, 항체 생성을 유도할 수 있다. [문헌: Armitage et al, Nature, 357:80-82 (1992); and Hollenbaugh et al, EMBO J., 11:4313-4319 (1992)]. 특히, CD40에 대한 리간드, gp39가 마우스[문헌:Noelle et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:6550 (1992); Armitage et al, Nature, 357:80 (1992)] 및 사람[문헌: Hollenbaugh et al, Embo. J. 11:4313 (1992); Spriggs et al, J. Exp. Met., 176:1543 (1992)]에 대해 동정되었다. gp39는 타입 II 막 단백질이며, FAS, CD27, CD30 및 4-1BB에 대한 리간드, TNF-α 및 TNF-β를 포함하는 새로운 유전자 수퍼 페밀리의 일부이다.
gp39의 발현은 항 CD3 항체 또는 포르볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)와 이오노마이신을 사용한 CD4+T 세포상에서 용이하게 시험관내 유도될 수 있다. 발현은 신속하고 일시적인데, 6 내지 8 시간에 최대이고 24 내지 48 시간에서 거의 휴면 수준으로 되돌아간다[문헌: Roy et al, J. Immunol., 151:2497 (1993)]. gp39는 사람 생체내에서, CD40+B 세포와 관련하여, 비장의 동맥주위 임파구 외피와 유임파절의 외부 및 중심세포 영역내의 CD4+T 세포상에 존재하는 것으로 보고되어 있다[문헌: Lederman et al, J. Immunol., 149:3807 (1992)]. gp39+T 세포는 IL-2, IL-4 및 IFN-γ를 생성한다[문헌: Van der Eetwegh et al, J. Exp. Med., 178:1555(1993)].
체액성 면역성의 조절에서 gp39의 새로운 역할에 대한 유일한 연구결과가 사람 질환, X-결합된 하이퍼-IgM 증후군(X-linked hyper-IgM syndrome: HIM)의 연구에 의해 제공되었다. HIM은 흉선 의존 체액성 면역성의 상실, 즉 IgG, IgA 및 IgE 생성 불능에 의해 정형화된 심한 X-결합된 면역결핍증이다. gp39 유전자의 변이는 비작용성 gp39 단백질의 발현에 기인되고 HIM 환자로부터의 헬퍼 T 세포가 B 세포를 활성화시키지 못하는데서 기인된다[문헌: Allen et al, Science, 259:990 (1993); Aruffo et al, Cell, 72:291 (1993); DiSanto et al, Nature, 361:541 (1993); Korthauer et al, Nature, 361:539 (1993)]. 이러한 연구는 펩티드/MHC 클래스 II 복합체의 T 세포 수용체 결합 직후에, gp39가 동족 헬퍼 T 세포상에서 유도되며, B 세포상에서 CD40에 대한 gp39의 결합이 B 세포가 세포 사이클로 이동하게 하고 면역글로불린(Ig) 분비 및 이소타입 전환으로 분화되게 한다는 결론을 지지하고 있다.
기능 연구에서는 마우스를 항 gp39로 처리하면 흉선 의존 항원(SRBC 및 TNP-KLH)에 대한 항체반응이 완전히 사라지지만, 흉선 독립성 항원(TNP-Ficoll)에 대한 항체 반응은 사라지지 않음이 입증되고 있다[문헌: Foy et al, J. Exp. Med., 178:1567 (1993)]. 또한, 항 gp39로 처리하면 콜라겐이 주입된 마우스에서 콜라겐 유도된 관절염(CIA)의 발병이 억제된다[문헌: Durie et al, Science, 261:1328 (1993)]. 결론적으로, 항 gp39는 마우스 비장내의 메모리 B 세포 및 배중추의 형성을 억제한다[문헌: Foy et al, J. Exp. Med., 180:157(1994)]. 종합하여 보면, 이러한 데이터는 T 세포상의 gp39와 B 세포상의 CD40 사이의 상호작용이 흉선 의존성 항원에 대한 항체 반응에 필수적이라는 광범위한 증거가 된다.
최근, 많은 자가면역 질환의 쥐 모델이 질환의 발병에 대한 항 gp39 투여의 효능적인 치료학적 가치를 평가하는데 시험되고 있다. 이들 모델에서의 연구 결과를 간단히 논하면 다음과 같다:
콜라겐 유도된 관절염:
CIA는 사람 자가면역 질환 류머티스 관절염(RA)에 대한 동물 모델이다[문헌: Trenthorn et al, J. Exp. Med., 146:857 (1977)]. 이러한 질환은 이질성 타입 II 콜라겐을 투여함으로써 다양한 종류로 유도될 수 있다[문헌: Courtenary et al, Nature, 283:665 (1980); Cathcart et al, Lab. Invest., 54:26 (1986)].
CIA의 유도에 대한 항 gp39의 효과를 연구[문헌: Durie et al, Science, 261:1328 (1993)]하기 위해서, 웅성 DBA1/J 마우스에게 순수한 프로인트 보조액(Freund's adjuvant)에 유화된 병아리 타입 II 콜라겐을 꼬리의 기저부에 피하 주입시켰다. 후속 주입은 21일 후에 수행하였다. 이어서 마우스를 관련 대조군 항체 또는 항 gp39로 처리하였다. 항 gp39로 처리된 마우스 그룹은 면역된 비처리 대조군 마우스에 비한 항 콜라겐 항체의 역가를 나타내지 않았다. 조직학적 분석은 항 gp39 항체로 처리된 마우스가 염증을 나타내지 않거나, 면역된 동물에서 관찰된 질환의 어떠한 전형적인 병인학적 증거를 보이지 않음을 나타냈다. 이러한 결과는 gp39-CD40 상호작용이 CIA의 유도에 절대적으로 필요하다는 것을 나타낸다. T 세포와 B 세포 사이의 초기의 동종 상호작용이 일어나지 않는다면, 자가 항체 형성 및 그로 인한 염증 반응과 같은 하향 진행과정은 일어나지 않는다.
최근, gp39는 GM-CSF, IL-3 및 IFN-γ의 부재하에 TNF-α 및 IL-6을 생성하도록 단구를 활성화시키는데 중요하다는 것이 밝혀졌다[문헌: Alderson et al, J. Exp. Med., 178:669 (1993)]. TNF-α는 CIA 질환 과정[문헌: Thorbecke et al, Eur. J. Immunol., 89:7375 (1992)] 및 RA [문헌: DiGiovane et al, Ann. Rheum. Dis., 47:68 (1988); Chu et al, Arthrit. Rheum., 39:1125 (1991); Brennan et al, Eur. J. Immunol., 22:1907 (1992)]와 관련이 있다. 따라서, 항 gp39에 의한 TNF-α의 억제는 관절염 마우스의 관절에서 소염 효과를 생성시킬 수 있다. 항 gp39에 의한 TNF-α 및 T 세포- B 세포 상호작용의 억제는 모두가 CIA의 발병에 기여할 수 있다.
실험용의 알레르기성 뇌척수염(EAE):
EAE는 중추 신경계(CNS)의 실험용 자가면역 질환이며[문헌: Zamvil et al, Ann. Rev. Immunol., 8:579 (1990)], 사람 자가면역 상태, 다발성 경화증(MS)에 대한 질환 모델이다[문헌: Alvord et al, "Experimental Allergic Model for Multiple Sclerosis," NY 511 (1984)]. 이러한 모델은 CNS로부터 정제된 미엘린 기본 단백질 및 뇌척수염발생 프로테오리피드(PLP)의 면역화에 의해 포유동물종에서 용이하게 유도된다. SJL/J 마우스는 감수성 마우스 혈통(H-2s)이며, EAE를 유도시키는 경우에, 이들 마우스는 급성 마비 질환이 발병되며, 급성 세포 침윤물이 CNS내에서 동정될 수 있다.
클라센(Classen)과 그의 공동 연구자(공개되지 않은 데이터)들은 SJL/J 마우스에서 EAE의 유도에 대한 항 gp39의 효과를 연구하였다. 그들은 EAE 발병이 항 gp39 처리된 동물에서 완전히 억제됨을 발견하였다. 또한, 항 PLP 항체 반응이 대조군 동물에서 얻은 반응에 비해 지연되며 감소된다.
EAE는, 질환의 진행에서 자가항체의 요건에 대한 직접적인 증거는 없으면서, T 세포를 통해 매개되는 세포 매개된 자가면역 질환의 한 예이다. gp39와 CD40 사이의 상호작용을 억제하면 질환의 유발 및 질환의 이환이 억제된다.
만성(c) 및 급성(a) 이식편 대 숙주 질환(GVHD):
만성 및 급성 GVHD는 숙주 비대증 MHC 대립 유전자에 반응하는 공여 세포로부터 유발된다. cGVHD (H-2d--〉H-2bd)에서, 폴리클론성 면역글로불린의 높아진 생산성은 이질 특이적 헬퍼 T 세포와 숙주 B 세포 사이의 상호작용에 기인된다. 항 gp39 항체의 생체내 투여는 cGVHD 유도된 혈청 항 DNA 자가항체, IgE 생산, 자발적인 시험관내 면역글로불린 생산, 관련된 비종 및 질환을 옮기는 능력을 억제한다. [문헌: Durie F.H. et al, J. Clin. Invest., 94:133 (1994)]. 항체 생산은 항 gp39 투여 후에 장시간 동안 억제된 상태로 유지된다. GVHD에서 유도된 항 이질 생성 세포독성 T 임파구(CTL) 반응은 항 gp39의 생체내 투여에 의해 억제된다. 이러한 데이터는 CD40-gp39 상호작용이 두 가지 형태의 GVHD의 발생에 중요하다는 것을 제시하고 있다. CTL 반응이 억제되고 항 gp39에 의한 간단한 치료가 질환을 장시간 동안 억제시킨다는 사실은 이질성 세포와 항 gp39 항체의 동시 투여에 의한 T 세포 구역에서의 영구적인 변화를 제시한다.
다양한 연구 그룹들이 gp39에 특이적인 쥐과 동물의(murine) 항체의 생성 방법을 보고하고 있는데 이러한 항체는 면역억제제로서 치료학적 유용성이 있는 것으로 밝혀졌다. 예를 들어, 1993년 5월 27일에 공개되고 콜럼비아 유니버시티(Columbia University)에 양도된 WO 93/09812호; 1993년 8월 18일자 공개된 EP 0,555,880호 및 노엘리(Noelle)등에 의해 1994년 9월 2일자 출원되고 다트마우스 컬리지(Dartmouth College)에 양도된 PCT US/94/09872호에는 gp39에 특이적인 쥐과 동물의 항체, 및 치료제 및 면역 억제제로서의 이의 용도가 기재되어 있다.
또한, 문헌[Scaria et al, Gene Therapy, 4:611-617 (1997)]에는 DNA(아데노바이러스성/벡터)에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 억제하는 gp39에 대한 항체의 용도가 보고되어 있다.
그러나, 쥐과 동물의 항체는 치료제로서 사람에게 적용될 수 있지만, 이러한 항체는 몇 가지 관점에서 단점이 있다. 특히, 쥐과 동물의 항체는 외래종에서 기원된다는 사실로 인해서, 이들은 사람에서 면역원성일 수 있다. 이러한 면역원성은 종종 중화 항체 반응을 유발시키고, 이러한 중화 항체반응은 항체가 반복적으로 투여되어야 하는 경우에, 예를 들어, 만성 또는 재발성 질환의 치료시에 특히 문제가 된다. 또한, 이러한 항체는 쥐과 동물 불변 도메인을 함유하기 때문에, 사람 이펙터 기능을 나타내지 않을 수 있다.
이러한 문제를 제거하거나 완화시키기 위한 연구에서, 키메라 항체가 밝혀졌다. 키메라 항체는 두 가지의 상이한 항체, 전형적으로는 두 가지의 상이한 종의 부분을 함유한다. 일반적으로, 이러한 항체는 사람의 불변영역 및 또 다른 종, 전형적으로는 쥐과 동물 가변 영역을 함유한다. 예를 들어, 모체 마우스 항체의 결합 특성, 사람 불변 영역과 연관된 이펙터 기능을 나타내는 몇 가지 마우스/사람 키메라 항체가 보고되었다. 이러한 예로는 카빌리(Cabilly)등의 미국특허 제4,816,567호; 소에메이커(Shoemaker)등의 미국특허 제4,978,745호; 배버(Beaver)등의 미국특허 제4,975,369호 및 보스(Boss)등의 미국특허 제4,816,397호가 있으며, 이들 모두는 본 발명에서 참조로 인용된다. 일반적으로, 이들 키메라 항체는 기존의 쥐 하이브리도마로부터 추출된 DNA로부터 게놈성 유전자 라이브러리를 제조함으로써 구성된다 [문헌: Nishimura et al, Cancer Research, 47:999 (1987)]. 상기 라이브러리는 정확한 항체 단편 재배열 패턴을 나타내는 중쇄 및 경쇄로부터의 가변영역 유전자에 대해 스크리닝된다. 또한, cDNA 라이브러리는 하이브리도마로부터 추출되고 스크리닝된 RNA로부터 제조되거나, 가변 영역이 폴리머라아제 연쇄 반응에 의해 얻어진다. 클로닝된 가변영역 유전자는 적절한 중쇄 또는 경쇄 사람 불변영역 유전자의 클로닝된 카세트를 함유하는 발현벡터내로 결찰된다. 키메라 유전자는 선택 세포주, 일반적으로 쥐과 동물의 미엘로마 주에서 발현된다. 이러한 키메라 항체가 사람의 치료에 사용된다.
공동 출원된 특허 출원 제07/912,292호에서, "영장류화된"TM("Primatized"TM) 항체가 개시되어 있는데, 이러한 항체는 사람 불변영역 및 올드 월드 원숭이(Old World monkey) 가변영역을 함유한다. 이러한 영장류화된TM항체는 낮거나 약한 면역원성이 주어진 인체내에서 내성이 있다.
또한, 사람화된 항체는 본 기술분야에 공지되어 있다. 이상적으로는, "사람화"는 본래 분자의 항원 결합 특성을 완전히 보유하면서 덜 면역원성인 항체를 생성시킨다. 본래 항체의 모든 항원 결합 특성이 보유되게 하기 위해서는, 항체 결합 부위의 구조가 "사람화된" 항체에서 잘 재생되어야 한다. 이러한 재생은 비사람 항체의 결합 부위를 사람 골격상으로 이식함으로써, 즉, (a) 키메라 항체(리간드 결합 특성이 보존되어 있으며, 비사람 가변 도메인의 면역원성이 유지되고 있는)를 생성하도록 사람 불변영역상으로 전체 비사람 가변 도메인을 이식하거나[문헌: Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6801 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65 (1988)], (b)중요한 골격 잔기를 보유하거나 보유하지 않은 사람 골격 및 불변영역상으로 비사람 CDR를 이식하거나[문헌: Jones et al, Nature, 321:522 (1986); Verhoeyen et al, Science, 239:1539 (1988)], (c) (리간드 결합 특성을 보유하도록) 전체 비사람 가변 도메인을 이식하고, (면역원성이 감소되도록) 노출된 잔기의 치환을 통해서 사람 유사 표면으로 이들을 "클로우킹(cloaking)시킴[문헌: Padlan, Molec. Immunol., 28:489 (1991)]으로써 효능적으로 달성될 수 있다.
기본적으로는, CDR 이식에 의한 사람화는 단지 사람 단편상의 CDR을 사람 골격 및 불변영역으로 이식함을 포함한다. 이론적으로는, 이러한 사람화는 면역원성(알로타입(allotype) 또는 이디오타입(idiotype) 차이가 존재하는 경우를 제외)을 실질적으로 제거해야 한다. 그러나, 본래 항체의 어떠한 골격 잔기는 보존되어야 한다고 보고하고 있다[문헌: Riechmann et al, Nature, 332:323 (1988); Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10,029 (1989)].
보존되어야 할 골격 잔기는 컴퓨터 모델링에 의해 동정될 수 있다. 또한, 중요한 골격 잔기는 공지된 항체 결합 부위 구조와 비교함으로써 효능적으로 동정될 수 있다[문헌: Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)].
항원 결합에 효능적으로 영향을 주는 잔기는 몇 가지 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째 그룹은 항원과 직접적인 접촉을 할 수 있는 결합 부위 표면과 접촉하는 잔기를 포함한다. 이러한 잔기는 아미노 말단 잔기 및 CDR에 인접한 잔기를 포함한다. 두 번째 그룹은 CDR 또는 반대 쇄를 접촉시킴으로써 CDR의 구조 또는 상대적인 배열을 변화시킬 수 있는 잔기를 포함한다. 세 번째 그룹은 가변 도매인의 구조적 단일성에 영향을 줄 수 있는 묻혀 있는 측쇄를 지닌 아미노산을 포함한다. 이들 그룹에서의 잔기는 일반적으로 채택된 넘버링 시스템에 따르는 경우 동일한 위치(Padlan, 1994 (Id.))에서 발견된다[문헌: Kabat et al, "Sequences of proteins of immunological interest, 5th ed., Pub. No. 91-3242, U.S. Dept. Health ＆ Human Services, NIH, Bethesda, MD, 1991].
그러나, 사람화된 항체가 인체에서의 낮은 면역원성으로 인해서 바람직하지만, 이들의 생산은 예측 불가능하다. 예를 들어, 항체의 서열 변화는 항원 결합 기능이 실질적으로 또는 전체적으로 상실되게 하거나, 결합 특이성이 상실되게 할 수 있다. 또한, "사람화된 항체"는 서열 변화와는 무관하게 인체에서 면역원성을 나타낼 수 있다.
따라서, 목적하는 항원에 대한 새로운 사람화된 항체가 본 기술분야에서 여전히 요구되고 있다. 더욱 특히, 면역치료제로서의 효능 때문에 gp39에 특이적인 사람화된 항체가 본 기술분야에서 요구되고 있다.
발명의 목적
따라서, 본 발명의 목적은 사람 gp39에 특이적인 사람화된 항체를 제공하는데 있다.
더욱 특히, 본 발명의 목적은 gp39에 대한 쥐과 동물의 항체, 특히, 24-31 항체, 즉, 사람 gp39에 결합하는 특이적 쥐과 동물의 항체로부터 유도된 사람화된 항체를 제공하는데 있다.
본 발명의 목적은 또한 사람 gp39에 특이적인 사람화된 항체를 함유하는 약제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 24-31 항체, 즉, 사람 gp39에 특이적으로 결합하는 쥐과 동물의 항체로부터 유도된 사람화된 항체를 함유하는 약제 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 gp39에 대한 사람화된 항체를 사용하여, 자가면역 질환, 예컨대, 전신 홍반성 루푸스, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 자연발생 혈소판감소 자반병(ITP), 당뇨병 및 비자가면역 질환, 예컨대, 이식편 대 숙주 질환 및 이식 거부증을 포함한 gp39/CD40 결합 상호작용의 gp39 발현 및/또는 억제의 조절에 의해 치료될 수 있는 사람 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 gp39에 대한 사람화된 항체를 코드화하는 핵산 서열을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 24-31 항체, 즉, 사람 gp39 항원에 특이적으로 결합하는 쥐과 동물의 항체로부터 유도된 사람화된 항체를 코드화하는 핵산 서열을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람 gp39에 대한 사람화된 항체, 특히, 24-31 항체, 즉, 사람 gp39 항원에 특이적으로 결합하는 쥐과 동물의 항체로부터 유도된 사람화된 항체를 발현시킬 수 있는 벡터를 제공하는데 있다.
발명의 요약
가장 광범위한 양태로, 본 발명은 쥐과 동물의 24-31 항체의 gp39 항원 결합 친화성의 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상의 친화성을 보유하고/거나, 예를 들어, T-세포 의존성 항체 생성을 측정하는 B-세포 검정에서, 쥐과 동물의 항체 24-31의 시험관내 기능 활성의 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상의 활성을 보유하는 사람화된 항체에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명의 사람화된 항체는 24-31 항체의 농도에 대한 3 배 이하 농도의 B 세포 검정에서 시험관내 기능 활성을 절반-최대 효능(half-maximal potency)에 대해 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상 보유한다.
본 발명은 또한 쥐과 동물의 24-31 항체와 동일한 에피토프에 결합하고/거나 gp39에 대한 CD40의 결합을 억제하는 쥐과 동물의 24-31 항체와 경합할 수 있고/거나 24-31 항체의 CDR을 함유하는 사람화된 항체에 관한 것이다.
본 발명은 더욱 바람직하게는 이하 기재된 사람화된 가변 경쇄 서열 및/또는 사람화된 가변 중쇄 서열:
및 이하 기재된 군으로부터 선택된 사람화된 가변 중쇄 서열:
뿐만 아니라, 이의 변이체 및 등가물을 보유하는 쥐과 동물의 24-31 항체로부터 유도된 사람화된 항체에 관한 것이다. 본 발명에서 변이체 및 등가물은 상기 동정된 사람화된 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄 서열내에 있는 하나 또는 수 개의 아미노산 잔기가 gp39 항원 결합 친화성에는 실질적으로 영향을 주지 않는 방법으로 치환, 첨가 및/또는 삭제됨으로써 변화되는 사람화된 면역글로불린 서열을 포함하는 것들이다. 특히, 본 발명은 보존성 치환 변이, 즉, 유사한 아미노산에 의한 하나 이상의 아미노산의 치환을 포함하는 변이체 및 등가물을 포함한다. 예를 들어, 보존성 치환은 동일한 일반 종류내의 아미노산, 예를 들어, 산성 아미노산, 또는 염기성 아미노산, 즉, 동일한 종류내의 또 다른 아미노산에 의한 중성 아미노산의 치환을 나타낸다. 보존성 아미노산 치환의 의미는 본 기술분야에 공지되어 있다. 바람직하게는, 상기 변이체 및 등가물은 모체 쥐과 동물의 24-31 항체의 gp39 항원 결합 친화성의 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상의 gp39 항원 결합 친화성을 보유하며, 더욱 바람직하게는 쥐과 동물의 24-31 항체의 gp39 항원 결합 친화성의 약 1/3 이상을 보유할 수 있다. 또한, 이러한 변이체 및 등가물은 바람직하게는, 예를 들어, T-세포 의존성 항체 생산을 측정하는 B-세포 검정에서 쥐과 동물의 항체 24-31의 시험관내 기능 활성의 약 1/10 이상, 더욱 바람직하게는 약 1/3 이상을 보유할 것이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 변이체 및 등가물은, 예를 들어, T-세포 의존성 항체 생성을 측정하는 B-세포 검정에서, 쥐과 동물의 항체 24-31의 시험과내 기능 활성의 약 1/3 이상을 보유할 것이다. 더욱 특히, 이러한 항체는 모체 24-31 항체 농도의 3배 미만의 농도로 수행하는 B 세포 검정에서 시험관내 기능 활성의 절반-최대 효능을 보유할 것이다.
본 발명은 또한 사람화된 항체의 발현을 코드화하는 아미노산 서열 뿐만 아니라, 재조합 숙주 세포내에서 사람화된 항체를 생성하는 발현 벡터에 관한 것이다. 가장 바람직한 양태에 있어서, 이들 DNA 서열은 이하 기재된 사람화된 가변 중쇄 및/또는 사람화된 가변 경쇄 서열:
및 이하 기재된 군으로부터 선택된 사람화된 가변 중쇄 서열:
을 코드화할 것이다.
또한, 본 발명은 상기 정의된 서열의 등가물 및 변이체를 포함한다.
본 발명은 또한 약제로서 gp39에 특이적인 상기 사람화된 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 gp39 발현의 조절 또는 gp39/CD40 상호작용의 억제에 의해 치료될 수 있는 질환을 치료하기 위한 사람화된 항 gp39 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 특히 자가면역 질환, 예를 들어, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병, 전신 홍반성 루푸스, 및 ITP의 치료를 위한 gp39에 특이적인 상기된 사람화된 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이식편 대 숙주 질환을 포함한 비자가 면역 질환을 치료 및 이식편 거부 반응을 억제하기 위한 gp39에 대한 사람화된 항체의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 또한 유전자 또는 세포 치료동안 면역억제제로서 사람화된 항체의 용도에 관한 것이다. 사람화된 항체는 사용된 벡터 또는 세포에 대한 면역원성 역반응을 억제함으로써 유전자 치료 또는 세포 치료 효능을 증진시킬 수 있다. 예를 들어, 사람화된 항체는 바이러스성 벡터, 예를 들어, 레트로바이러스성 벡터(retroviral vector), 아데노바이러스성 벡터(adenoviral vector)에 대한 체액성 및 세포성 면역 반응을 억제시키는데 사용될 수 있다. 또한, 상기된 항체를 사용하면 암 및 자가면역 질환과 같은 만성 질환의 치료를 용이하게 할 수 있는 세포 또는 벡터가 반복 투여될 수 있게 한다.
본 발명은 사람 gp39에 특이적인 사람화된 항체, 이러한 항체를 코드화하는 DNA 및 이를 제조하는 방법, 이를 함유하는 약제 조성물 및 치료제로서의 이러한 항체의 용도에 관한 것이다. 이러한 항체는 류머티스 관절염, 다발성 경화증, 당뇨병 및 전신 홍반성 루푸스를 포함한 자가면역 질환 뿐만 아니라, 이식편 대 숙주 질환을 포함한 비자가면역 질환의 치료에 사용되며, 이식편 거부 반응을 억제하는데 사용된다.
도 1은 24-31 항체로부터 유도된 사람화된 항체 및 키메라 항체를 발현시키는데 사용되는 IDEC 발현 벡터 N5KG1을 도시하는 도면이다.
도 2a는 사람 PBL을 가용성 gp39-CD8, 재조합 사람 IL-4 및 쥐과 동물의 24-31 항체 또는 대조군 쥐과 동물의 IgG1 단일클론성 항체와 접촉시키는 B 세포 증식 검정의 결과를 도시하는 도면으로서, 24-31 항체가 gp39에 의해 유도된 B 세포 증식을 억제함을 입증하고 있는 도면이다.
도 2b는 IGD+B 세포 및 상이한 농도의 24-31 항체의 존재하에 배양된 고정 항 CD3으로 활성화된 미토마이신 처리된 T 세포를 사용하는 B 세포 분화 검정의 결과를 도시하는 도면으로서, 24-31 항체가 사람 B 세포에 의한 T-세포 의존성 폴리클로날 항체 생성을 억제함을 입증하고 있는 도면이다.
도 3은 gp39 트랜스펙턴트 및 비트랜스펙션된 CHO 세포의 FACS를 도시하는 도면이다.
도 4는 VL#1 또는 바람직한 사람화된 가변 경쇄 서열(1)이라 일컬어지는 바람직한 사람화된 가변 경쇄 서열(영역을 결정하는 상보성을 포함)에 상응하는 아미노산 서열 및 DNA 서열을 도시하는 도면이다.
도 5는 VL#2 또는 바람직한 사람화된 가변 경쇄 서열(2)라 일컬어지는 바람직한 사람화된 가변 리간드 서열(영역을 결정하는 상보성을 포함)에 상응하는 아미노산 서열 및 DNA 서열을 도시하는 도면이다.
도 6은 VL#1 또는 바람직한 사람화된 가변 중쇄 서열(1)이라 일컬어지는 바람직한 사람화된 가변 중쇄 서열(영역을 결정하는 상보성을 포함)에 상응하는 아미노산 서열 및 DNA 서열을 도시하는 도면이다.
도 7은 24-31 항체(비사람화된)의 가변 경쇄 서열의 아미노산 및 DNA 서열을 도시하는 도면이다.
도 8은 24-31 항체(비사람화된)의 가변 중쇄 서열의 아미노산 및 DNA 서열을 도시하는 도면이다.
도 9는 gp39 발현 CHO 세포에 대한 쥐과 동물의 24-31 항체, 키메라 24-31 항체 및 사람화된 24-31 항체의 결합을 비교하는 도면이다.
도 10은 gp39 발현 CHO 세포에 대한 24-31 (비오틴) 항체와, 사람화된 항체, 키메라 항체 및 24-31 항체의 결합을 비교하는 경합 검정의 결과를 도시하는 도면이다.
도 11은 미토마이신 C 처리된 T 세포의 존재하에 배양된 B 세포에 의한 사람 IgM 생산에서의 쥐과 동물의 24-31 항체 및 본 발명의 사람화된 24-31 항체의 효과를 특정하는 검정 결과를 도시하는 도면이다.
도 12는 gp39 발현 CHO 세포에 대한 본 발명의 두 가지의 사람화된 항체의 결합을 비교하는 검정 결과를 도시하는 도면이다.
도 13은 쥐과 동물의 24-31 항체에 대한 스캐챠드 플롯(Scatchard plot)을 도시하는 도면이다.
도 14는 사람화된 항체(1)에 대한 스캐챠드 플롯을 도시하는 도면이다.
도 15는 사람화된 항체(2)에 대한 스캐챠드 플롯을 도시하는 도면이다.
발명의 상세한 설명
본 발명을 상세히 설명하기 전에, 본원에서 사용되고 있는 특정의 용어를 정의하면 다음과 같다.
사람화된 항체-본 용어는 비사람 항체, 전형적으로는 모체 항체의 항원 결합 특성을 보유하거나 실질적으로 보유하며 인체에서 면역원성이 덜한 쥐과 동물의 항체로부터 유도된 항체를 나타낸다. 이러한 항체의 유도는 (a) 키메라 항체를 생성하도록 사람 불변영역상으로 전체 비사람 가변 도메인을 이식하거나, (b) 중요한 골격 잔기를 보유하거나 보유하지 않은 사람 골격 및 불변영역상으로 비사람 CDRs만을 이식하거나, (c) 전체 비사람 가변 도메인을 이식하고, 표면 잔기의 치환에 의한 사람 유사 단편으로 이들을 "클로우킹(cloaking)시킴을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있다. 이러한 방법은 문헌[Morrison et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851-6855 (1984); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1536 (1988); Padlan, Molec. Immun., 28:489-498 (1991); Padlan, Molec. Immun., 31(3):169-217 (1994)]에 기재되어 있으며, 상기문헌의 모든 내용은 본원에서 참조로 인용된다.
상보성 결정 영역, 또는 CDR-본원에 기재된 용어 CDR은 카베트(Kabat)(1991)등에 의해 묘사된 본래의 면역글로불린 결합 부위의 천연 Fv 영역의 결합 친화성 및 특이성을 함께 정의하는 아미노산 서열을 의미한다.
골격 영역(FR)-본원에 사용된 용어 FR은 CDR들 사이에 끼워져 있는 아미노산 서열을 나타낸다. 항체의 이들 부위는 적절한 배향으로 CDR을 고정하고 있다(CDR이 항원과 결합되게 한다).
불변 영역-이펙터 기능을 부여하는 항체 분자 부위. 본 발명에서, 쥐 불변 영역은 사람 불변 영역에 의해 치환된다. 키메라 또는 사람화된 항체의 불변영역은 사람 면역글로불린으로부터 유도된다. 중쇄 불변영역은 다섯 가지의 이소타입, 즉, 알파, 델타, 엡실론, 감마 또는 뮤의 이소타입으로부터 선택될 수 있다. 또한, 다양한 서브클래스의 중쇄(예컨대, 중쇄의 IgG 서브클래스)가 상이한 이펙터 기능에 원인이 되며, 그로 인해서, 요구되는 이펙터 기능을 지닌 키메라 항체가 생성될 수 있다. 바람직한 불변영역은 감마 1(IgG1), 감마 3(IgG3) 및 감마 4(IgG4)이다. 더욱 바람직한 영역은 감마 1(IgG1) 이소타입의 Fc 영역이다. 경쇄 불변영역은 카파 또는 람다 타입, 바람직하게는 카파 타입이다.
키메라 항체-본 용어는 전형적으로는 상이한 종인 두 가지의 상이한 항체로부터 유도된 항체 함유 서열이다. 가장 전형적인 키메라 항체는 사람 및 쥐과 동물의 항체 단편, 일반적으로는 사람 불변영역 및 쥐 가변영역을 포함한다.
면역원성-수용자에게 투여되는 경우에 면역반응(체액성 또는 세포성)을 유도하는 표적화 단백질 또는 치료학적 잔기의 능력 측정치. 본 발명은 사람화된 항체 또는 이의 단편의 면역원성에 관한 것이다.
감소된 면역원성의 사람화된 항체 또는 키메라 항체-본 용어는 모체 항체, 예를 들어, 24-31 항체에 비해 감소된 면역원성을 나타내는 항체 또는 사람화된 항체를 나타낸다.
모체 항체의 결합 특성을 실질적으로 보유하는 사람화된 항체-본 용어는 사람화된 항체 또는 키메라 항체로서, 사람화된 항체 또는 키메라 항체를 생성시키는데 사용된 모체 항체에 의해 인식된 항체를 특이적으로 결합시키는 능력을 보유하고 있는 항체를 나타낸다. 24-31 항체의 결합 특성을 실질적으로 보유하는 사람화된 항체 또는 키메라 항체가 사람 gp39에 결합할 것이다. 바람직하게는 사람화된 항체 또는 키메라 항체는 모체 항체와 동일하거나 실질적으로 동일한 항체 결합 친화성 및 결합성을 나타낸 것이다. 이상적으로는, 항체의 친화성은 모체 항체 친화성의 10% 이상, 더욱 바람직하게는 30% 이상일 것이며, 가장바람직하게는 친화성은 모체 항체의 50% 이상일 것이다. 항체 결합 친화성을 검정하는 방법은 본 기술 분야에 공지되어 있으며, 하프-최대 결합 검정, 경합 검정, 및 스캐챠드 분석을 포함한다. 적합한 항원 결합 검정이 본원에 기재되어 있다.
본 발명은 사람 gp39에 결합하는 신규한 사람화된 단일클론성 항체 및 치료제로서의 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 사람화된 항체를 코드화하는 핵산서열 및 재조합 숙주 세포에서의 이들의 발현에 관한 것이다.
더욱 특이하게는, 본 발명은 사람 gp39에 특이적으로 결합하는 쥐과 동물의 항체 24-31로부터 유도된 사람화된 항체에 관한 것이다.
쥐과 동물의 항체 24-31은 시험관내 및 생체내에서 gp39를 기능적으로 불활성화시키는 사람 gp39에 대한 쥐과 동물의 항체이다. 따라서, 이러한 항체는 gp39/CD40의 gp39 불활성화 및/또는 조절 또는 억제가 요구되는 질환을 치료하기에 효능적으로 유용하게 하는 특성을 지닌다. 특히, 그러한 질환은 자가면역 질환, 예컨대, 류머티스 관절염, 다발성 경화증, ITP, 당뇨병 및 전신 홍반성 루푸스 뿐만 아니라 비자가면역 질환, 예컨대, 이식편 대 숙주 질환 및 이식편 거부증을 포함한다.
그러나, 쥐과 동물의 항체 24-31은 치료제로서 효능적으로 적합하게 하는 기능 특성을 보유하지만, 몇 가지의 가능한 단점도 보유하고 있다. 즉, 이러한 항체가 쥐에서 유래되기 때문에, 인체에서 면역원성일 수 있다. 또한, 이러한 항체는 쥐과 동물의 불변 서열을 함유하기 때문에, 이러한 항체는 사람 이펙터 기능의 전체 범위를 나타내지 않을 것이며, 사람에게 투여되는 경우에 아마도 신속하게 사라질 것이다. 이러한 단점은 어떠한 질환 또는 환자의 치료에서는 문제가 되지 않을 수 있지만, 치료된 질환이 만성 또는 재발 특성인 경우가 실질적으로 우려되고 있다. 재발성 또는 만성 질환의 예에는 숙주가 자기항원에 대해 자가면역 반응을 연속적으로 또는 만성적으로 나타내는 자가면역 질환이 포함된다.
따라서, 쥐과 동물의 항원 24-31과 연관된 단점, 즉, 인체에서의 가능한 면역원성 및 사람 이펙터 기능의 감소를 완화시키기 위해서, 본 발명의 발명자들은 쥐과 동물의 24-31 항체의 개선되고 사람화된 유도체를 제조하고자 하였다. 이러한 사항이 본 발명의 목적이지만, 요구되는 결과는 통상적이거나 예측 가능한 성질이 아니다. 항체의 사람화에는 변화되는 아미노산 잔기의 신중한 선택 및 치환되는 잔기의 신중한 선택이 요구된다. 그 이유는 몇 개의 아미노산 잔기와 관련된 경우에도 항체 가변 영역의 변화가 항원 결합에 유해 효과를 유발할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 사람화된 항체는 모체 항체에 비해 항원 친화성 및/또는 항원 특이성을 실질적으로 감소시킬 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 쥐과 동물의 항체를 포함한 항체의 상이한 사람화 방법이 문헌에 보고되어 있다. 그러한 문헌으로는 문헌[Padlan, Molec. Immunol., 31(3):169-217 (1994); Padlan, Molec. Immunol., 28:484-498 (1991); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988)]이 있으며, 본 발명에서는 상기 문헌의 모든 내용을 참조로 인용한다. 이러한 방법은 특히 CDR 이식에 의한 사람화[문헌: Jones et al, Nature, 321:522-525 (1986); Verhoeyen et al, Science, 239:1534-1539 (1988); Padlan, Molec. Immunol., 28:489 (1991) and Padlan, Molec. Immunol., 31:169 (1994)]를 포함하며, 이러한 사람화는 비필수 골격 아미노산의 선택 및 적절한 치환 변이에 의한 이들의 변화를 포함한다. 이러한 참조문헌은 이의 전체 내용이 본원에서 참조로 인용되는 것이다.
상기 주지된 바와 같이, 어떠한 예에서 성공적이기는 하지만 CDR 이식 기술은 사람화된 항체의 친화성에 실질적으로 역효과가 있다. 이러한 역효과는 어떠한 골격 잔기가 항원 결합에 영향을 주거나 항원 결합에 필수적이고 적어도 영향을 주기 때문이다. 우리의 기술; 문헌[Padlan (1994) (Id.)]에는 보다 더 상세하게 정의되어 있는데 그 이유는 본 발명자들이 인체에서와 같이 가능하게 분자의 표면 특성을 유지시키면서 항체 결합부위의 보존에 중요한 것으로 사료되는 단지 이들 쥐과 동물의 골격 잔기를 유지하기 때문이다. 따라서, 이러한 기술은 모체 항체의 항원 결합 특성을 유지시키는 사람화된 항체를 제조하는데 유용하다. 이러한 이유 때문에, 본 발명의 기술은 사람 gp39에 특이적인 쥐과 동물의 항체 24-31로부터 유도된 사람화된 항체가 효능적으로 얻어지는 수단으로서 본 발명에 의해 선택되었다.
24-31 항체에 의해 유용화된 VL및 VH서열의 동정에서 생성되는 24-31(하기 실시예에서 상세히 기재됨)의 가변영역의 클로닝이 도 7 및 도 8에 각각 도시되어 있다. 서열화 후에, 가변 영역은 사람화된다. 상기 주지된 바와 같이, 이러한 방법은 본원에 참조로 인용된 문헌[Padlan (1994) (Id.)]의 방법에 따라 수행될 수 있다.
이러한 방법은 일반적으로 항원 결합 특성의 보존에 중요한 골격 잔기만을 유지시키면서 사람 골격 잔기에 의한 비사람 골격의 치환을 포함한다. 이상적으로는 이러한 방법은 이종 항체의 표면상에 사람 유사 특성을 부여하여, 항원 결합 특성에 영향을 주는 잔기를 접촉시키고 내부를 보유시키면서 보다 덜 면역원성이 되게 할 수 있다.
더욱 특히, 도 7 및 도 8에 기재된 24-31 VK및 VH서열은 "주형"이라 일컬어지는 보고된 서열의 사람 항체에 비교함으로써 사람화된다.
특히, 24-31 VK는 (a) VL#1, 즉, 사람 V-카파 서브그룹 I 서열, 예를 들어, DEN 등 뿐만 아니라, 생식세포주 012[문헌: Cox et al, Eur. J. Immunol. 24:827-836 (1994)] 및 VL#2, 즉, 사람 V-카파 서브그룹 IV 서열, 예를 들어, IEN을 주형으로 사용함으로써 사람화된다. 이러한 주형 서열은 공지되어 있으며 문헌[Kabat et al (1991) (Id.)]에 보고되어 있거나 유전자 은행으로부터 얻을 수 있다.
24-31 VH#1은 주형으로서 (a) 사람 VH서브그룹 IV 서열, 58p2 및 (b) (Genbank Accession No.) Z18320 및 생식세포주 3d75d[문헌: S. van der Maarel et al, J. Immunol., 150:2858-2868 (1993)]를 사용함으로써 사람화된다.
이러한 주형 가변 중쇄 항체 서열은 공지되어 있으며 문헌[Kabat et al, "Sequences of Proteins of Immunological Interest," 5th Ed., NIH (1991)]에 기재되어 있으며, 유전자 은행으로부터 얻을 수 있다.
주형 사람 가변 중쇄 및 경쇄 서열은 특히 전체 24-31과의 서열 유사성 정도, 뿐만 아니라 "중요한" 잔기에서의 유사성, 즉, VL:VH인터페이스에 포함되는 것으로 사료되는 잔기; 상보성 결정 영역과 접촉되거나 안으로 향하고 있는 잔기에서의 유사성을 포함한 많은 상이한 기준에 근거하여 선택된다. 또한, 주형은 가능한 한 많은 24-31 Fv정전하를 보유하도록 및 항원 결합에 영향을 주는 것으로 사료되는 글리신, 프롤린 및 그밖의 특정 아미노산 잔기를 보유하도록 선택된다.
이러한 방법은 표 1 및 표 2에 기재된 24-31 항체로부터 유도된 바람직하게 사람화된 VL및 VH중쇄 서열을 생성시킨다. 상기 기재된 바와 같이, 본 발명은 바람직하게 사람화된 서열의 등가물 및 변이체, 예를 들어, gp39 결합에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환체를 함유하는 등가물 및 변이체를 포함한다. 모체 (비사람화된) 24-31 항체의 전체 가변 중쇄 및 경쇄 CDR 서열을 함유하는 상보성 결정 영역이 도 7 및 도 8에 정의되어 있다.
설명으로부터 알 수 있는 바와 같이, 4 개의 바람직한 사람화된 골격 서열은 VH및 VL쇄에 대해 디자인된다. 따라서, 보존성 변화부를 함유하는 변이체 및 등가물을 제외하고도, 16 가지의 상이한 사람화된 24-31 항체가 있는데, 이러한 항체는 상기 사람화된 VH및 VL24-31 서열을 사용함으로써 합성될 수 있다.
사람화된 가변 중쇄 및 경쇄 서열을 함유하는 사람화된 24-31 항체는 재조합 방법으로 얻을 수 있다. 상기 바람직한 사람화된 가변 서열의 어떠한 조합 형태를 함유하는 사람화된 서열은 사람 gp39에 결합하는 사람화된 항체를 생성시킬 것이다. 또한, 이러한 서열을 기준으로 하여, 표 1 및 표 2에 기재된 번호 부여된 바람직한 서열은 다음과 같은 것으로 기대된다:
(1) #1 VH를 지닌 #1 VL(서열 1)
(2) #1 VH를 지닌 #2 VL(서열 2)
(3) #2 VH를 지닌 #1 VL(서열 3)
(4) #2 VH를 지닌 #2 VL(서열 4)
상기 사람화된 VH및 VL서열은, 또한, 하나 이상의 추가 치환 변화부분의 도입 및 다른 아미노산의 첨가에 의해 변화될 수 있다. 항원 (gp39) 결합에 역효과를 주지 않는 추가의 변화가 선택될 것이다. 예를 들어, 본 발명의 발명자들은 문헌[Kabat et al (1991) (Id.)]에 기재된 카베트 번호부여 도식에 따른 하나 이상의 잔기 34, 43, 44 및 68의 치환에 의한 VH쇄의 변화를 고찰하고 있다. 또한, 본 발명의 발명자들은 VL쇄의 잔기 85의 변화를 고찰하고 있다. 항체 결합 부위의 구조적인 특징을 근거로 하면, 이러한 잔기의 변화는 항원 결합에 역효과를 주지 않을 것으로 사료된다. 또한, 하나 이상의 보존성 아미노산 치환부의 도입은 gp39 결합에 역효과를 주지 않을 것으로 예상된다.
사람화된 24-31, VH및 VL서열을 더 상세히 기재하기 위해서, 바람직한 사람화된 골격 서열을 하기 표 3에 기재하고 있으며, 하기 표 3은 이들 서열을 주형 사람 가변 중쇄 및 경쇄 골격 서열, 즉, 사람 DEN VK1, 사람 o12/V36 생식세포주, 사람 LEN VKIV, 사람 58p2, 사람 Z18320, 및 사람 3d75d 뿐만 아니라, 비사람화된 쥐과 동물의 24-31 VH및 VL골격 서열과 비교하고 있다.
표 3
VK 골격 영역 비교- 사람화된 항 gp39
사람화된 항체를 생성시키기 위해서, 상기된 사람화된 VL및 VH서열을 코드화하는 DNA 서열을 합성한다. 상기 주지된 바와 같이, 상기 4 가지의 사람화된 VL서열 및 4 가지의 사람화된 VH서열을 고려하여 보면, 합성될 수 있는 16 가지의 효능적이고 사람화된 항원 결합 부위가 있다. 또한 다른 아미노산 잔기 및/또는 보존성 치환 변이부의 효능적인 혼입에 의한 사람화된 VL의 잔기 85 및 사람화된 VH의 잔기 34, 43, 44 및 68의 효능적인 치환을 고려한 보다 더 효능적인 사람화된 항체 결합 부위가 있다. 상보성 결정 영역 및 상응하는 DNA 서열을 포함한 두 가지의 바람직한 사람화된 가변 경쇄 서열 (1) 및 (2)와 바람직한 사람화된 가변 중쇄 서열이 도 4, 도 5 및 도 6에 각각 기재되어 있다.
공지된 서열의 일부를 코드화하는 DNA를 합성하는 방법이 본 기술분야에 공지되어 있다. 이러한 방법을 사용하여, 사람화된 VL및 VH서열을 코드화 DNA 서열을 합성하고, 재조합 항체의 발현에 적합한 벡터 시스템에서 발현시켰다. 이러한 방법은 사람 불변 도메인 서열을 지닌 융합 단백질로서 발현되는 사람화된 VL및 VH서열을 제공하고 기능적 (항원 결합) 항체를 생성하는 것과 연관되는 어떠한 벡터 시스템에서 수행될 수 있다.
재조합 항체 및 사람화된 항체의 발현에 적합한 발현 벡터 및 숙주 세포는 본 기술 분야에 공지되어 있다.
하기 참조문헌은 본 발명에서 참조로 인용되고 있으며 재조합 면역글로불린의 발현에 적합한 방법 및 벡터의 대표적인 예를 나타내는 문헌이다. 문헌[Weidle et al, Gene, 51:21-29 (1987); Dorai et al, J. Immunol., 13(12):4232-4241 (1987); De Waele et al, Eur. J. Biochem., 176:287-295 (1988); Colcher et al, Cancer Res., 49:1738-1745 (1989); Wood et al, J. Immunol., 145(a):3011-3016(1990); Bulens et al, Eur. J. Biochem., 195:235-242 (1991); Beggington et al, Biol. Technology, 10:169 (1992); King et al, Biochem. J., 281:317-323 (1992); Page et al, Biol. Technology, 9:64 (1991); King et al, Biochem. J., 290:723-729 (1993); Chaudary et al, Nature, 339:394-397 (1989); Jones et al, Nature, 321:522-525(1986); Morrison and Oi, Adv. Immunol., 44:65-92 (1988); Benhar et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12051-12055 (1994); Singer et al, J. Immunol., 150:2844-2857 (1993); Cooto et al, Hybridoma, 13(3):215-219 (1994); Queen et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989); Caron et al, Cancer Res., 32:6761-6767 (1992); Cotoma et al, J. Immunol. Meth., 152:89-109 (1992)]. 또한, 재조합 항체의 발현에 적합한 벡터는 시판되고 있다.
기능적인 면역글로불린을 발현시킬 수 있는 것으로 공지된 숙주 세포는, 여러 가지 숙주 세포중에서도, 예를 들어, 포유동물 세포, 예컨대, 중국 햄스터 난소(Chinese Hamster Ovary: CHO) 세포, COS 세포, 미엘로마 세포, 박테리아, 예컨대, 대장균, 효모 세포, 예컨대, 사카로미세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae)를 포함한다. 이들 중에서, CHO 세포가 많은 연구자들에 의해 사용되고 있으며, 면역글로불린을 효과적으로 발현하고 분비하는 능력이 있다.
기본적으로는, 사람화된 항체의 재조합 발현은 두 가지의 일반적인 방법중 한 가지 방법에 의해 수행된다. 첫 번째 방법에서, 숙주 세포는 선택된 불변영역에 융합된 중쇄 및 경쇄 가변서열을 발현시키는 단일 벡터로 트랜스펙션된다. 두 번째 방법에서, 숙주 세포는 선택된 불변 영역에 융합된 가변 중쇄 또는 경쇄 서열을 각각 발현하는 두 가지의 벡터로 트랜스펙션된다.
사람 불변 도메인 서열은 당해 널리 공지되어 있으며, 문헌에 보고되어 있다. 바람직한 사람 VL서열은 카파 및 람다 불변 경쇄 서열을 포함한다. 바람직한 사람 중쇄 불변 서열은 사람 감마 1, 사람 감마 2, 사람 감마 3, 사람 감마 4, 및 예컨대 생체내 반감기를 증진시키고, Fc 리셉터 결합을 감소시키는 변형된 효과 또는 기능을 제공하는 상기 서열의 변이된 변형을 포함한다.
사람 감마 4 불변 도메인의 바람직한 변경은 P 및/또는 E 변경을 포함하는 이들 변경은 각각 위치 236에서의 류신의 글루탐산으로의 변화 및/또는 위치 229에서의 세린의 프롤린(카베트 넘버링: Kabat numbering)으로의 변화를 의미하며, 이는 본원에서 참고 문헌으로 인용되는 1995년 9월 6일자 공동 출원된 대리인 번호 012712-165호에 기재된 바와 같다.
특히 바람직한 벡터 시스템은 모두 참고 문헌으로 인용되는 문헌에 기재된 발현 벡터를 포함한다[참고: 1995년 6월 7일자 공동 출원된 미국 특허 출원 제 08/476,237호, 1995년 1월 25일자 출원된 제 08/397,072호, 1992년 7월 10일자 출원된 07/912,122호, 1992년 3월 23일자 출원된 07/886,281호 및 1991년 7월 25일자 출원된 07/735,064호].
특히 상기 출원들은 하기를 포함하는 TCAE 5.2 및 TCAE 6으로 언급된 재조합 항체의 생성을 위한 벡터 시스템을 기술하고 있다:
1) 직렬로 된 4개의 전사 카세트:
(a) 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역. TCAE 5.2에서는 사람 면역글로불린 카파 경쇄 불변 영역(카베트 넘버링 아미노산 108-214, 동종이인자형 Km 3)이고, TCAE 6에서 사람 면역글리불린 경쇄 람다 영역(카베트 넘버링 아미노산 108-215, 인자형 Oz 마이너스, Mcg 마이너스, Ke 마이너스 동종이인자형)이다.
(b) 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역; 두 구성물 모두에서 사람 면역글로불린 중쇄는 감마/불변 영역(카베트 넘버링 아미노산 114-478 동종이인자형 Gm1a, Gm12).
(c) DHFR; 자체 진핵세포 프로모우터 및 폴리아데닐화 영역 함유.
(d) NEO; 또한 자체 진핵세포 프로모우터 및 폴리아데닐화 영역 함유.
2) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카세트는 면역글로불린 쇄의 분비를 위한 합성 시그날 서열을 함유한다;
3) 사람 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 카세트는 전사 판독 프레임을 유지하고 면역글로불린에서 정상적으로 발견되는 아미노산을 변경시키지 않는 경쇄 및 중쇄 면역글로불린 가변 영역의 분비를 가능하게 하는 특이적 DNA 링크를 함유한다.
이러한 벡터는 바람직하게는 CHO 세포에 사용된다. 대상 항체는 바람직하게는 상기 기재된 벡터 시스템에서 발현된다.
그러나, 수 24-31 항체로부터 유도된 대상 사람 항체 서열은 작용 항체, 즉 gp39 항원을 결합시키는 항체의 발현을 제공하는 어떠한 벡터 시스템에도 발현될 수 있다.
특히, 본 발명자들은 대상 사람화된 VL및 VH서열 뿐만 아니라 CHO 세포의 24-31로부터 유도된 원래(비변형된) VL및 VH서열을 사람 카파 및 사람 감마 1 불변 영역을 함유하는 N5KG1 발현 벡터를 사용하여 발현시키는 것을 선택하였다. N5KG1 발현 벡터는 도 1에 개략적으로 도시되어 있다. 바라던 바 대로, 24-31로부터 유도된 키메라 항체는 CHO 세포에서 발현되는 경우에 gp39와 결합한다(입증된 CHO- gp 39 트랜스펙턴트에 결합에 의해). 또한, 이러한 벡터 시스템을 사용하여 발현되는 경우에 본 발명의 수개의 사람화된 항체는 작용성(gp39 결합) 항체를 유도한다.
본 발명은 추가로 하기 실시예의 제시를 통해 기술된다. 이러한 실시예는 예시를 위한 것이며 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
사람화를 위한 24-31 항체의 선택
동물 모델에서의 축적 증거는 항 gp39 투여가 여러 가지 자가면역 과정을 억제하며, 동종이식편 거부를 방해함을 시사한다. 이러한 결과는 사람 gp39에 대한 항체가 자가면역 질환의 치료 및 사람의 동종 조직 및 기관의 이식에 상당한 치료적 가치를 가질 수 있다는 억지적인 증거를 제공한다. 사람 gp39에 특이적인 단클론성 항체(mAb)는 문헌(Lederman et al, J. Immunol., 199:3817(1992))에 보고되어 있으며, 시험관내 gp39-CD40 상호작용을 블록킹하는 데 있어 그 작용성이 평가되었다. 사람 면역 시스템에 대한 항 gp39 항체의 작용 효과에 대해 보다 자세한 통찰을 얻기 위해, 항 사람 gp 39의 mAb의 패널을 생성시켰다. 이러한 패널로부터, 어느 한 mAb은 우수한 것으로 나타났으며, 이를 시험관내 및 생체내에서 gp39의 작용 비활성에 대해 광범위하게 시험하였다.
보다 구체적으로, 6개의 쥐과 동물의(모두 IgG1) 항 gp39 항체의 패널을 사람 gp39(gp39-CD)의 가용성 융합 단백질로 면역화시켜 생성시킨 후, 활성화된 사람 말초혈 T 세포로 자극하였다. 사람 말초혈 T 세포의 유동 세포계산 분석에 의해, mAb는 활성화된 (PMA/이노마이산)에 발현된 세포 표면 분자를 인식하나 잔류하는 CD3+T 세포는 인식하지 못하며, 반응성의 패턴은 재조합 CD40 융합 단백질(CD40-Ig)(데이타는 기재되지 않음)에서 보여진 것과 유사하였음을 입증되었다. [35S] 대사적으로 표지된 활성화된 사람 말초혈 T 세포의 면역침강법에 의해서는 각각의 6mAb가 CD40-Ig에 의해 침강된 것과 유사한 크기(33kDa)의 분자를 침강시킴을 밝혀냈다. 끝으로, CD40-Ig의 gp39로의 결합은 동일 분자의 인식을 나타내며, 추가로 이들의 특이성을 확인시켜주는 항체의 존재하에서 블록킹되었다. 모든 6개의 mAb가 gp39 작용을 블록킹할 수 있더고 하더라도, mAb, 24-31은 대규모 분석에서 선택되었다.
실시예 2
T 세포 의존성 B 세포 증식 및 분화(Ig 생성)가 항 gp39에 의해 블록킹됨
CD40을 통해 그 리간드, gp 39에 의해 전달된 시그날이 B 세포 활성, 증식, 분화 및 이소타입 전환을 유도한다는 증거가 많은 연구에 의해 제공되었다. 항 gp39 24-31 mAb가 gp39 작용을 블록킹하는 지에 대해 결정하기 위해, B 세포를 24-31의 존재 또는 부재하에서 gp39(gp39-CD8)의 가용성 융합 단백질로 배양하고, B 세포 증식 반응을3H-티미딘 혼입에 의해 평가하였다. 도 2A에 도시된 결과는, gp39-CD8이 B 세포의 왕성한 증식을 유도함을 입증하고 있다. 항 gp39 24-31 mAb의 존재는 2.5㎍/ml 정도로 낮은 농도에서 gp39-CD8에 의해 유도된 B 세포 증식을 완전히 제거하였다. 24-31이 T 세포 유도된 B 세포 분화를 방해하는 지에 대해 결정하기 위해, B 세포를 24-31의 존재 또는 부재하에서 항 CD3 활성화된 T 세포와 함께 배양시켰다. 다클론성 IgM, IgG 및 IgA 생성에 대해 12일 후에 평가하였다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 24-31의 첨가가 다클론성 IgM, IgG 및 IgA 항체 생성을 억제하였다(90-99%). 이러한 결과는 T 세포 의존성 B 세포 분화에 있어서 gp39-CD40에 대한 요건을 달성시키는 이전 보고(Nishioka et al, J. Immunol., 153:1027(1994))들을 확인시켜 주며, 또한 gp39 작용을 블록킹시킴에 있어 사용되는 새롭게 특징화된 항 사람 gp39 24-31을 입증한다.
실시예 3
항 gp39는 사람 PBL로 재구성된 SCID 마우스에서의 생체내 파상풍 독소 특이적 항체 생성을 블록킹한다.
많은 연구로 사람 면역계가 사람 말초혈 림프구(hu-PBL-scid 마우스)로 이식된 엄밀히 결합된 면역결핍(scid) 마우스를 사용하는 실험 조건하에서 생체내 연구될 수 있음을 달성하였다[참조: Mosler et a, Nature, 335:256(1988); McCune et al, Science, 241:1632(1988)]. 장기간 키메리즘(chimerism)이 사람 PBL의 주입으로 scid 마우스에서 달성되며, 항원 특이적 2차 항체 반응이 항원에 의해 생체내 자극된 hu-PBL-scid 마우스에게서 검출된다[참조: Carlsson et al, J. Immunol., 148:1065(1992); Duchosal et al, Cell Immunol., 139:468(1992)]. 이러한 계는 사람 T 및 B 세포에 의해 유도된 면역 반응에 대한 생체내 항 gp39 투여의 면역억제 효과를 평가하기 위해 이용하였다.
그 결과가 도 2b에 포함되어 있는 실험에서는, 24-31에 의한 gp39의 블록킹이 시험관내 사람 B 세포에 의한 T 세포 의존성 다클론상 Ig 생성을 억제함을 입증하고 있다. 24-31이 또한 생체내 항원 특이적 B 세포 항체 생성을 억제할 수 있는 지를 측정하기 위해, 사람 PBL(hu-PBL-scid)로 복강내 주입되고 파상풍 독소(TT)로 면역된 C.B-17 scid/scid 마우스를 24-31 또는 PBS로 처리하고, 2차 (IgG) 항 TT 항체 반응을 평가하였다. TT로의 hu-PBL-scid의 면역화는 대부분의 동물에서 14일 후면역화 기간내에 IgG 항 TT 항체의 검출가능한 수준을 초래하였다(표 4). 그러나, 항 gp39(24-31; 250 ㎍/일, 주당 2회)로의 처리는 조사된 9/10 마리의 마우스에서 2차 항 TT 항체 반응을 완전히 제거하였으며, 이는 gp39 작용의 생체내 블록킹이 항원 특이적 체액성 반응의 억제를 초래함을 입증하는 것이다.
표 4. 파상풍 독소로 면역화된 C.B-17 scid/scid 마우스에서의 2차 항 파상풍 항체 반응 제거 후의 사람 PBL의 이식*. 4 내지 6주령의 C.B-17 scid/scid 마우스에 20 x 106사람 PBL 및 0.25ml의 파상풍 독소를 복강내 주입하였다.
¶ 항 gp39 24-31 또는 PBS(250㎍/주입)을 전체 실험 기간에 걸쳐 매주 2회 복강내 투여하였다.
§ 혈청내 사람 항 파상풍 독소 항체의 수준을 매주 ELISA로 측정하였다. 1:10의 희석에서 0.100 O.D.을 초과하는 사람 항 파상풍 독소 항체의 혈청 수준을 갖는 모든 마우스는 양성인 것으로 간주하였다. 양성인 마우스만을 상기 표에 포함된 평균 ± SE 값의 계산에 사용하였다. 파상풍 독소로 면역화되지 않은 사전 면역 마우스로부터의 혈청에서의 사람 항 파상풍 독소의 수준은 0.02 O.D. 미만이었다. 데이타는 평균 ± SE로서 제시된다.
* 항 gp39 처리된 군에 비해 현저히 다름(p=0.222)
** 항 gp39 처리된 군에 비해 현저히 다름(p〈0.001)
실시예 4
항 gp39 처리는 hu-PBL-scid 비장 세포의 항원 특이적 T 세포 증식 반응을 억제하지 않는다.
hu-PBL-scid 마우스의 항 gp39로의 처리가 생체내에서 항원 특이적 T 세포의 반응성을 변경시키는 지를 결정하기 위해, TT로 면역화되고 24-31로 처리된 hu-PBL-scid 마우스로부터 비장 세포의 증식 반응을 시험관내에서 평가하였다. 대조군 또는 항 gp39 처리된 hu-PBL-scid 마우스로부터의 비장 세포를 TT 또는 배지 단독으로 배양하고, 증식 반응을 6일 후3H-티미딘을 혼입하여 평가하였다. 표 5는 이러한 실험의 결과를 요약한 것이다. 항 gp39로 처리된 hu-PBL-scid 마우스는 비처리된 hu-PBL-scid 마우스에서와 같이 시험관내 자극에 대해 유사하게 반응하였다(반응하는 마우스 5/10 대 3/10). 항 TT 항체가 이러한 마우스에 검출될 수 없었다고 하더라도(데이타는 제시되지 않음), 수용자로서 NOD/LtSz-scid/scid 마우스를 사용하는 실험에서는 유사한 결과를 나타냈다. 이러한 데이타는 항 gp39로의 처리가 hu-PBL-scid 마우스의 항원 특이적 T 세포의 삭제 또는 작용 비활성화를 초래하지 않음을 입증하며, 항 gp39에 의한 TT 특이적 항체 반응의 억제가 T 세포 비활성화가 아닌 gp39-CD40 상호작용 및 B 세포 반응의 블록킹에 기인한다는 주장을 지지한다.
표 5. 항 gp39 처리는 파상풍 독소로 면역화된 C.B-17-scid/scid 또는 NOD/LtSz scid/scid 마우스에서 사람 PBL의 이식 후에 파상풍 독소 T 세포 증식 반응을 변경시킨다.
*4 내지 6주령의 C.B-17 scid/scid 또는 NOD/LtSz-scid/scid 마우스에 20 x 106사람 PBL 및 0.25ml의 파상풍 독소를 복강내 주입하였다.
¶ 항 gp39 24-31 또는 PBS(250㎍/주입)을 전체 실험 기간에 걸쳐 매주 2회 복강내 투여하였다.
§ 사람 PBL이 주입되고 파상풍 독소로 면역화된 마우스로부터의 비장 세포를 배지 단독 또는 파상풍 독소(2.5 또는 5.0㎍/ml)의 존재하에 1 x 105세포/ml이 농도로 배양하였다. 증식은 6일 후에3H-티미딘을 혼입하여 평가하였다. 자극 지수는 하기 식에 따라 계산하였다: S.I. = cpm 파상풍 - cpm 배지/cpm 배지. 2.0보다 큰 S.I.은 양성인 것으로 간주하였다.
실시예 5
gp 39 CHO 트랜스펙턴트 세포주의 생성
최근에, 세포 표면 gp39를 구조적으로 발현시키는 CHO 트랜스펙턴트가 생성되어 본원에서 제안된 사람화된 항 gp39 24-31 결합 연구를 위한 시제로서 사용되었다. 전체 길이의 gp 39 유전자(Hollenbaugh et al, Immunol. Rev., 138:23(1994))를 시토메칼로바이러스(CMV) 프로모우터 및 인핸서 성분의 전사 조절 하에서 식물성적혈구응집소 활성화된 사람 PBL의 폴리머라아제 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키고, 아이덱(IDEC)의 INPEP4 벡터로 클로닝시켰다. CHO 트랜스펙턴트를 형성시키고, 50nM 메토트렉세이트중에서 증폭시켰다. 트랜스펙턴트 50D4가 ELISA(데이타는 기재되지 않음) 및 FACS 분석(도 3)에 의해 세포 표면 gp39를 발현시키는 것으로 나타났다.
실시예 6
CHO 발현계를 사용하는 항체의 고수준 발현
아이덱 소유의 N5KG1 발현 벡터를 사람화된 항 gp39 24-31 항체의 발현을 위해 CHO 세포에 사용하였다. 상기 벡터는 도 1에 개략적으로 도시된다. 고수준의 재조합 항체는 상기 벡터 및 유사 벡터를 사용하여 CHO 세포에서 일관되게 수득되었다. 이들 벡터를 사용하여 5 내지 10%의 고비율의 G418 저항성 클론이 상당량의 재조합 단백질(1 내지 10 mg/l의 항체)을 발현시키는데 나타났다. 이들은 통상 단일 플라스미드 복사 성분이며, 메토트렉세이트를 사용하여 증폭되므로써 30 내지 100pg/세포/일의 분비된 면역글로불린을 얻을 수 있다. 표 6은 이러한 계를 사용하는 CHO 세포에서 발현된 3개의 항체의 유전자 증폭 전 및 후에 얻어진 하에 수준을 기록한 것이다.
표 6. 아이덱의 CHO 발현 기술을 사용한 항체 생성 수준
실시예 7
24-31 VK및 VHDNA 서열의 클로닝
항 gp39 24-31 VK및 VH유전자 세그먼트를 클로닝시키고, 서열화시켰다. 이들 서열을 분석한 후에 V 영역 유전자 세그먼트의 사람화된 변형을 설계하였다. 상응하는 DNA 서열을 합성하고 사람 불변 영역 유전자를 함유하는 고수준 발현 벡터로 클로닝하였다. 이후 사람화된 24-31 항체를 생성시키는 CHO 트랜스펙턴트가 형성되었다. 사람화된 변형의 항 gp39 항체가 그의 gp 결합 친화성을 보유하는 지를 확인하기 위해, 쥐과 동물의 및 사람화된 항체의 상대 친화성을 직접 결합 및 경합 검정으로 비교하였다. 추가로, 사람화된 24-31의 gp39와의 CD40 결합 블록킹과 T 세포 의존성 항체 생성 억제 능력을 평가하였다.
1. 24-31 VK및 VH유전자 세그먼트의 클로닝
a. cDNA의 제조. 폴리A+mRNA를 2 x 106세포로부터 24-31 하이브리도마 및 NS1 세포주를 제조하고(Carroll et al, Mol. Immunol., 10:991(1988)), 24-31 하이브리도마의 생성에 융합 파트너를 사용하고, 제조업자의 원안에 따라 인비트로겐 코포레이션 마이크로패스트 트랙™(Invitrogen Corporation MicroFast Track) mRNA 단리 키트를 사용하였다. 제 1 가닥의 cDNA를 50pmol의 올리고-dT 및 5 유닛의 M-MLV 역전사효소(Promega)(Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))를 사용하여 합성한 후, 세파덱스 G-25 크로마토그래피하였다.
b. VK및 VHcDNA의 PCR 증폭. 24-31 및 NS1 cDNA를 3' 불변 영역 프라이머와 조합하여 VK또는 VH리더 서열에 대해 특이적인 5' 프라이머의 패널을 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. 5'VH프라이머의 패널은 존스(Jones)와 베디그(Bendig)에 의해 기술된 바와 같은 것과 동일하다[참조: Bio/Technol., 9:88(1991); Errata, Bio/Technol., 9:579(1991)). 5'VK프라이머의 패널(Jones et al, (Id.))을 변형시켜 Sal I 클로닝 부위 인식 서열(GTCGAC)를 Bgl II 인식 서열(AGATCT)로 전환시키므로써 증폭된 유전자 세그먼트의 아이덱의 N5KG1 발현 벡터로의 클로닝을 용이하게 하였다(도 1 참조). 3' VK및 VH프라이머는 각각 아미노산 위치 108-109(카베트 등에 따른 넘버링, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5th Ed., NIH(1991))에서 Bsi WI 클로닝 부위 서열 및 위치 114-115에서 Nhe I 클로닝 부위를 포함하며 하기 서열을 갖는다: TGCAGCATCCGTACGTTTGATTCCAGCTT(Ck) 및 GGGGGTGTCGTGCTAGCTG(A/C) (G/A) GAGAC (G/A) GTGA (Cγ1). 상기 프라이머 패널은 본 양도인들에 의해 C2B8 항 CD20 항체(Nishioka et al, J. Immunol., 153:1027(1994)) 및 다수의 그 외의 마우스 VK및 VH유전자 세그먼트(데이타는 미도시됨)를 증폭시키고 클로닝시키기 위해 이미 사용하였다.
24-31 VK및 VH유전자 세그먼트의 증폭을 위한 올바른 프라이머 쌍을 결정하기 위해, 24-31 cDNA를, CK프라이머와 조합하여 11 5'VK프라이머 중 하나 또는 Cγ1 프라이머와 조합하여 12 5'VH프라이머 중 하나를 포함하는 23개의 개별적인 반응으로 증폭시켰다. 비교를 위해, NS1 cDNA(cDNA 샘플의 1/50)을 5 유닛의 Taq DAN 폴리머라아제(Perkin Elmer), 10mM의 트리스-HCl, pH 8.3, 50mM의 KCl, 1.5mM의 MgCl2, 각각 0.25mM의 dCTP, dGTP, dATP, 및 TTP, 50pmol의 3' 불변 영역 프라이머 및 50pmol의 5' 프라이머를 함유하는 100㎕의 최종 부피로 증폭시켰다. 증폭 사이클은 95℃에서 1분간 변성화, 50℃에서 2분간 어닐링, 및 72℃에서 2분간 신장으로 이루어지며 34회 반복하였다. 증폭된 생성물을 아가로스 겔 전기영동법에 의해 분석하였다. VK및 VH에 대한 특이한 증폭된 생성물을 생성시키기 위한 24-31 PCR 반응을 반복하고, 복사 PCR 반응으로부터의 생성물을 클로닝하였다. PCR 증폭된 생성물을 아가로스 겔 정제하고(Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed. (1989)), Bgl II 및 Bsi WI(VK에 대해) 또는 Sal I 및 Nhe I(VH에 대해)로 분해시켰다. 생성물을 아이덱의 벡터 N5KG1으로 서열로 결찰시켰다(Ausabel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Pub1. Assoc. (1992)).
E. coli Xl1-블루 세포(Stratagene)의 형질전환후, 플라스미드 DNA를 제조하고, VK및 VH서열을 복사 구성물(스크립스 리서치 인스티튜트 코어 퍼실러티(Scripps Research Institute Core Facility, La Jolla, Ca)에 의해 수행되는 서열화)로부터 얻었다. NS1 융합 파트너의 내인성 경쇄 및 중쇄 서열은 공지되어 있으며(Carroll et al, Mol. Immunol., 10:991(1988); Kabat et al, (1991)(Id.)), 24-31 대 NS1 융합 파트너 V 영역의 증폭으로 인한 PCR 생성물을 구별하는 데 사용하였다.
실시예 8
사람화된 24-31 V 영역을 코드화하는 유전자 세그먼트의 합성
사람화된 VK및 VH(1)로서 표 1 및 2에서 확인된 가장 바람직한 사람화된 24-31 VK및 VH서열을 포함하는 사람화된 변형을 합성하였다. 구체적으로, 상기 확인된 사람화된 VK또는 VH영역을 코드화하는 네 쌍의 중복되는 상보성 올리고누클레오티드(올리고)를 합성하고(Midland Chemicals), 탈성화 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법에 의해 정제하였다[참조: Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, Greene Publ. Assoc. (1992)]. 각각의 올리고는 그 길이가 약 100개의 염기이고, 인접하는 상보성 올리고누클레오티드와 20개의 염기가 중복한다. VK및 VH5' 올리고는 각각 Bgl II 및 Sal I 클로닝 부위를 포함하고, 3' 올리고는 Bsi WI 및 Nhe I 클로닝 부위를 갖는다. 각각의 가변 영역 유전자 세그먼트를 하기 도식화된 합성 올리고로부터 하기 절차를 사용하여 모았다[참조: Watson et al, Recombinant DNA, 2nd Ed., Scientif. Amer. Books. NY, NY(1992)에 요약됨]. 상보성 올리고 쌍(A+E, B+F, C+G, D+F)을 제조업자의 원안에 따라 300pmol의 각각의 프라이머 및 T4 폴리누클레오티드 키나아제(Promega)를 사용하여 키네이징(kinasing)시켰다. 올리고를 95℃로 가열하여 어닐링시키고, 실온으로 서서히 냉각시켰다. 어닐링된 올리고 쌍을 6 유닛의 T4 DNA 리가아제(New England biolabs)를 사용하여 결찰시켰다(A/E와 B/F 및 C/G와 D/H). 적합한 5' 또는 3' 클로닝 부위 제한 엔도누클레아제로 분해시킨 후, 약 200 염기쌍의 DNA 단편을 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 후에 전기용리에 의해 정제하였다(Sambrook et al,(Id.)). 합성 유전자 단편을 CMV 프로모우터 및 인핸서 성분의 전사 제어하에서 아이덱 소유의 고수준 발현 벡터 N5KG1에 삽입시켰다. 결찰 반응에는 2개의 겔 정제 단편(A/E/B/F 및 C/G/D/H) 및 N5KG1을 각각 100:100:1의 몰비로 함유한다. XL1-블루 세포의 형질전환 후, 플라스미드 DNA를 제조하고, 합성 유전자 세그먼트의 서열을 확인하였다. 형성된 구성물 h24-31은 사람화된 24-31 V 영역 세그먼트 및 사람 카파 및 감마 1 불변 영역을 코드화한다. 기재된 바와 같이, 이러한 항체는 표 1 및 2에서 "(1)" 서열로서 확인된 사람화된 가변 중쇄 서열 및 사람화된 가변 경쇄 서열을 포함하며, 이는 최적의 gp39 성질을 가지는 사람화된 항체를 제공하는 것으로 예상된다. 또한, VH#1(사람화된 24-31의 변형 2)과 함께 VL#2을 함유하는 구성물을 생성시켰다. 아이덱 소유 벡터를 사용하는 유사한 구성물을 아이덱 항 CD20(Reff et al, Blood, 83:425(1994)) 및 항 CD4(Newman et al, Biol. Technology, 10:1455(1992)) 항체의 고수준 발현을 위해 사용하였다.
실시예 9
2. 사람화된 24-31의 제조 및 특징화
a. 사람화된 24-31(변형 1 및 변형 2)을 제조하는 CHO 트랜스펙턴트의 생성
사람화된 24-31(변형 1 또는 변형 2)를 발현시키는 CHO 트랜스펙턴트를 선형화된 h24-31 DNA(변형 1 또는 변형 2)로 4 x 106개의 CHO 세포를 일렉트로포레이션시킨 후에 G418에서 선택하여 생성시켰다. G418 내성 클론으로부터의 세포 배양 상청액을, 염소 항 사람 카파를 사용하여 면역글로불린을 포획하는 샌드위치 ELISA에 의해 면역글로불린 생성에 대해 검정하였다. 면역글로불린 결합을 사람 IgG에 대해 특이적인 양고추냉이 퍼옥시다아제(HRP) 컨쥬게이트된 염소 항체로 인큐베이팅시키고, HRP 기질, 즉, 0.0175% H2O2를 포함하고 pH 5.0인 시트레이트 완충액(9-34 g/l C6H8O7및 14.2g/l Na2HPO4) 중의 0.4mg/ml의 O-페닐렌-디아민(OPD)로 인큐베이팅시켰다. 플레이트를 490nm에서 모리큘라 디바이시스 "Vmax, 키네틱 마이크로플레이트 리더"(Molecular Devices "Vmax, kinetic microplate reader")분광계로 판독하였다.
실시예 10
b. 사람화된 24-31(변형 1)의 특징화
사람화된 항 gp39 24-31 항체를 실시예 5에 기술된 gp39 CHO 트랜스펙턴트인 50D4상에서 발현된 세포 표면 gp39로의 직접 결합에 대해 초기에 평가하였다. 면역글로불린을 생성하는 G418 내성 h24-31 CHO 트랜스펙턴트로부터의 상청액을 50D4 세포와의 결합에 대해, 그리고, 네가티브 대조군으로서 CHO 세포와의 결합에 대해 시험하였다. 이 검정에서, 50D4, 1 x 105/웰이 폴리-L-리신 피복된 폴리스티렌 플레이트인 96웰의 바닥에 결합되었다. 상기 세포를 15분 동안 인산염 완충 염수(PBS)중의 0.5% 글루타르알데히드에 고정시켰다. CHO 세포로 피복된 플레이트를 유사하게 생성시켰다. 세포 배양 상청액을 첨가하고, 상기 기재된 바와 같이 HRP 컨쥬게이트된 염소 항 사람 IgG를 사용하여 항체 결합을 측정하였다.
(i) 절반 최대 결합 농도 및 (ii) 50D4 세포를 사용하는 경합 검정의 두가지 검정을 사용하여 사람화된 24-31 항체가 원래 쥐과 동물의 24-31 항체에 대해 gp39에 대한 친화성을 보유하는 지를 결정하였다. 이를 위해 항체가 단백질 A 상에서 정제될 것이며, 각각의 항체의 농도는 이소타입 매칭 대조군과 비교하여 ELISA에 의해 측정될 것이다. 절반 최대 결합(i)은 사람화된 24-31을 2㎍/ml 내지 0.1ng/ml의 다양한 농도로 50D4 세포로 인큐베이팅시켜 측정하였다. 상기 기재된 바와 같이 절반 최대 OD 490 판독 결과의 농도를 쥐과 동물의 24-31의 절반 최대 결합과 비교하였다. 경합 검정(ii)에서 사람화된 24-31 항체와 쥐과 동물의 24-31 항체를 100:1 내지 1:100의 다양한 몰비로 혼합하고, 50D4 세포로의 결합에 대한 경합능을 측정하였다. 두가지 셋트를 수행하였는데, 하나에서는 사람화된 항체의 결합을 염소-항 사람 IgG(항 마우스 IgG 고갈된) HRP를 사용하여 측정하고, 하나에서는 쥐과 동물의 항체의 결합이 염소-항 마우스 IgG(항 사람 IgG 고갈된) HRP를 사용하여 측정할 것이다. 몰비를 기초로 하는 결합 곡선, 즉, 쥐과 동물의 항체 대한 곡선 및 사람화된 항체에 대한 곡선을 만들어서 이들의 상대적 친화도를 계산하였다. 이러한 검정은 24-31로부터 유도된 대상 사람화된 항체의 항 gp39 결합 특성을 확인시켜 줄 것이다.
실시예 11
사람화된 24-31에 의한 gp39로의 CD40-Ig 결합의 블록킹
사람화된 항 gp39가 gp39와 결합된 후, 검정을 수행하여 사람화된 항 gp39가 리간드의 리셉터와의 결합을 블록킹하는 능력을 보유하는 지에 대해 확인하였다. 이를 위해, 활성화된 사람 말초혈 T 세포 또는 gp39 트랜스펙션된 CHO 세포, 50D4를 4℃에서 15분 동안 쥐과 동물의 24-31 또는 사람화된 24-31의 등급화된 농도로 사전처리하였다. 이를 사전 인큐베이션한 후, CD40-Ig-비오틴을 첨가하고, 결합을 PE-아비딘을 사용하는 유동 세포계산법에 의해 측정하였다. CD40-Ig 결합에서 50% 감소를 달성하는 mAb의 농도를 측정하였다.
실시예 12
사람화된 24-31에 의한 B 세포 증식 및 분화의 블록킹
사람화된 24-31이 gp39 기능을 블록킹하는 가를 확인하기 위해, B 세포를 특정 투여량의 쥐과 동물의 24-31 또는 사람화된 24-31의 존재 또는 부재하에서 gp39(gp39-CD8)의 가용성 융합 단백질로 배양하였다. B 세포 증식 반응을 도 2a에 도시된 바와 같이3H-티미딘 혼입에 의해 검정하였다.
T 세포 의존성 B 세포 분화(Ig 제조)가 gp39에 대한 mAb에 의해 블록킹되었다. 대상 사람화된 24-31 항체가 활성화된 사람 T 세포의 표면 상에서 발현된 원래의 gp39의 기능을 블록킹하는데 효과적인 가를 확인하기 위해, 대상 사람화된 24-31 항체가 T 세포 유도된 B 세포 분화를 억제하는 능력을 평가하였다. B 세포를, 사람화된 24-31 및 쥐과 동물의 24-31의 존재 또는 부재하에서 항 CD3 활성화된 T 세포와 공동 배양하였다. 다클론성 IgM, IgG 및 IgA 생성을 12일 후에 평가하였다(도 2B 참조). 이들 결과는 사람화된 항 gp39가 CD40 결합을 블록킹하며, CD 40을 통해 T-세포 의존성 B 세포 활성을 방해할 수 있음을 확인시켜 줄 것이다.
실시예 13
결합능
본 실험은 항체 농도와 관련하여 gp39 항원에 대한 쥐과 동물, 키메라 및 사람화된(변형 1) 24-31 항체의 반응성을 측정하기 위해 수행되었다.
원안:
플레이트 제조
1: 96웰 플레이트의 각각의 웰이 50의 폴리-1-리신을 첨가한다. 실온에서 30분 동안 인큐베이팅시킨다. 플레이트를 가볍게 쳐서 폴리-1-리신을 제거한다.
2. mgp39-CHO 세포(세포 표면을 발현시키는 중국산 햄스터 난소 세포, 막 gp39)를 5분 동안 1500rpm에서 원심분리시키므로써 HBSS로 3회 세척한다.
3. 50㎕의 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 2000rpm에서 원심분리시킨다.
4. 50㎕/웰의 빙냉된 0.5% 글루타르알데히드를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이팅시킨다.
5. 플레이트 및 블롯을 쳐서 과량의 글루타르알데히드를 제거한다. 150㎕/웰의 0.1% BSA와 함께 100mM 글리신을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅시킨다. 플레이트는 즉시 사용되거나 차후 사용을 위해 -20℃에서 냉동될 수 있다.
경합 검정
1. 플레이트를 해동시키고, 글리신 완충액을 제거한다.
2. 시험 항체를 1㎍/ml에서 출발하는 희석 완충액으로 연속적으로 1:2로 희석한다. 50㎍/웰의 각각의 희석물을 옮기고, 이를 두개의 복사물을 형성시킨다. 실온에서 2시간 인큐베이팅시킨다.
3. 플레이트를 흐르는 수돗물로 10회 세척한다.
4. 50㎕/웰의 1:2000 희석된 염소 항 사람 IgG HRP 또는 염소 항 마우스 IgG HRP를 첨가한다. 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅시킨다.
5. 플레이트를 흐르는 수돗물로 10회 세척한다.
6. 50㎕/웰의 ABTS 기질을 첨가하고, 20 내지 30분 동안 플레이트를 전개시킨다. 플레이트를 기준 파장이 490인 경우에 405nm 파장에서 판독한다.
7. 흡광도 대 항체 농도에 대한 그래프를 플롯한다.
결과 및 결론:
항체의 농도에 대한 세가지 항 gp39 항체(24-31의 쥐과 동물, 키메라 및 사람화된 변형 1)의 결합능은 사실상 중첩되었다(도 9 참조). 이는 이들 항체가 사람 gp39에 대해 유사한 결합능을 가짐을 시사하며, 사람화된 항체가 쥐과 동물의 24-31의 gp39 결합 친화도를 보유함을 시사한다.
실시예 14
비오틴 표지된 쥐과 동물의 24-31과, 키메라 및 사람화된 변형 1 24-31 간의 경합
mgp39-CHO 세포 주성분과의 결합에 대한 쥐과 동물의 24-31과 경합하는 키메라 및 사람화된(변형 1) 24-31 항체의 능력을 평가하였다. mgp39-CHO와 결합에 대한 쥐과 동물의 24-31과 경합하는 사람화된 24-31의 능력을, 사람화된 항체에 있어서 쥐과 동물의 구조 잔류물의 이에 상대하는 사람 부분으로의 변경이 친화성의 상당한 손실(≥ 3x 감소)을 초래하였는 가를 평가하는 데 사용하였다.
원안:
플레이트 제조
1: 96웰 플레이트의 각각의 웰이 50의 폴리-1-리신을 첨가한다. 실온에서 30분 동안 인큐베이팅시킨다. 플레이트를 가볍게 쳐서 폴리-1-리신을 제거한다.
2. mgp39-CHO 세포를 5분 동안 1500rpm에서 원심분리시키므로써 HBSS로 3회 세척한다. 세포를 2 x 106세포/ml로 HBSS에 재현탁시킨다.
3. 50㎕의 세포 현탁액을 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 5분 동안 2000rpm에서 원심분리시킨다.
4. 50㎕/웰의 빙냉된 0.5% 글루타르알데히드를 첨가하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이팅시킨다.
5. 플레이트 및 블롯을 쳐서 과량의 글루타르알데히드를 제거한다. 150㎕/웰의 0.1% BSA와 함께 100mM 글리신을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이팅시킨다. 플레이트는 즉시 사용되거나 차후 사용을 위해 -20℃에서 냉동될 수 있다.
경합 검정
1. 플레이트를 해동시키고, 글리신 완충액을 제거한다.
2. 마우스 항 gp39 비오틴을 1% BSA를 함유하는 PBS로 200ng/ml로 희석한다.
3. 시험 항체(마우스, 키메라 및 사람화된 24-31)를 10㎍/ml에서 출발하는 희석 완충액으로 연속적으로 1:2로 희석한다.
4. 50㎕웰의 희석된 시험 항체 및 마우스 항 gp39 비오틴을 각각의 웰에 옮기고, 이를 두개의 복사물로 형성시킨다. 수개의 웰은 최대 대조군으로서 마우스 항 gp39 비오틴으로 50㎕의 희석 완충액을 함유해야 한다.
5. 플레이트를 흐르는 수돗물로 10회 세척한다.
6. 50㎕/웰의 1:2000로 희석된 스트렙타비딘 HRP를 첨가하고, 실온에서 1시간 동안 인큐베이팅시킨다.
7. 플레이트를 흐르는 수돗물로 10회 세척한다.
8. 50㎕/웰의 ABTS 기질을 첨가하고, 20 내지 30분 동안 플레이트를 전개시킨다. 플레이트를 기준 파장이 490인 경우에 405nm 파장에서 판독한다.
9. 대조군 웰의 평균값을 사용하여 억제율을 계산한다.
결과 및 결론:
세가지 항체 모두 비오틴 표지된 24-31과 동등하게 경합하였다(도 10 참조). 경합 프로파일은 검정 한계내에모든 농도에서 실질적으로 중첩되었다. 이는 시험된 사람화된 항체(변형 1)이 이의 gp39 친화도를 보유함을 입증한다.
실시예 15
T 세포 의존성 B 세포 분화의 변형
사람화된 24-31이 쥐과 동물의 24-31의 시험관내 기능 활성을 보유하는 가를 확인하기 위해, 사람화된 24-31을 "립스카이(Lipsky)" 검정으로 쥐과 동물의 24-31과 비교하였다. 도너 말초혈 단핵 세포를 두 단편, 즉, T 및 B 세포 단편으로 분리시켰다. T 세포를 먼저 미토마이신 C로 처리하여 유사분열을 방지시킨 후, 항 CD3 항체로 활성화시켰다. B 세포를 쥐과 동물의 또는 사람화된(변형 1) 24-31 항체와 함께 첨가하였다. 항체가 없는 포지티브 대조군 및 B 세포가 없는 네가티브 대조군을 실험에 포함시켰다. 10일 인큐베이션 후, 상청액을 사람 IgM의 존재에 대해 시험하였다.
원안:
1. 96웰 플레이트를 50㎕/웰의 살균된 4㎍/ml 항 CD3 항체(50mM 트리스로 희석됨, pH 9)로 37℃에서 2시간 동안 피복한다.
2. 림포-퀵(Lympho-Kwik) 시약을 사용하여 담황갈색 피복물로부터 T 및 B 세포를 선택적으로 정제한다. T 세포를 37℃에서 30분 동안 5x106개의 세포당 50㎍/ml의 미토마이신 C로 활성화시킨다.
3. 플레이트 웰을 살균된 HBSS 또는 배지로 수회 세척하여 비부착 항체를 제거한다.
4. 각 웰에 1x105개의 정제된 T 세포(2x106/ml)를 첨가한다.
5. 각 웰에 5x105개의 정제된 T 세포(5x106/ml)를 첨가한다. 각 웰에 50㎕의 항 gp39 항체(10-0.1㎍/ml)를 첨가하고, 이를 4개의 복사물로 형성시킨다. 대조군 웰은 a) 0 항체, b) 0 항체, T 세포 없음, 및 c) 0 항체, B 세포 없음을 포함해야 한다.
6. 12일 동안 37℃/5% CO2에서 플레이트를 인큐베이팅시킨다.
7. 이중 웰에 대해 3H 티미딘을 사용하거나 허용되는 방법을 사용하여 7일 후에 세포 성장에 접근한다.
8. 12일 후, 복사 웰로부터 상청액을 모우고, ELISA 검정을 수행하여 Ig 생성(IgM)을 결정한다.
결과 및 결론:
이 결과는 쥐과 동물의 24-31에서 얻어진 억제 수준과 유사하게 사람 IgM의 생성이 0.01㎍/ml 미만의 농도에서 사람화된 24-31에 의해 50% 억제됨을 보여준다(도 11 참조). 사람화된 항체는 이 실험에서 T 세포 의존성 B 세포 분화(IgM 생성)를 억제하는 능력을 보유하였다.
실시예 16
사람화된 24-31, 변형 2의 평가
본 실험은 변형 1과 비교하여 사람화된 24-31 변형 2가 직접 경합 검정에서 유사한 gp39 결합 능력을 가지는 가를 측정하기 위해 수행하였다.
원안:
상기 실시예 13에서와 동일하다.
결과 및 결론
결과는 두가지 24-31 변형의 결합 능력이 사실상 중첩됨을 보여준다(도 12 참조). 이는 두가지 변형이 gp39에 대한 결합 활성이 유사함을 시사한다.
실시예 17
본 실험은 24-31, 및 두가지 사람화된 변형 1 및 2의 Kd를 측정하기 위해 수행하였다.
원안:
세가지 각각의 항체(쥐과 동물, 변형 1 또는 변형 2 24-31)의 사전 결정된 양을 IODO-BEAD(등록상표명, Pierce)를 사용하여125I로 표지화시켰다. 항체 결합된125I를 세파덱스G25/DEAE/암버라이트 칼럼상에서 크기 분리에 의해 유리125I로부터 분리시켰다.
카운트/㎍ 및 적합한 작용 농도(약 절반 최대 결합 농도) 두 모두를 측정하기 위해125I 표지된 항체의 쥐과 동물의 gp CHO 세포와의 직접 결합을 일련의 희석으로 시험하였다.
125I 표지된 항체를 비표지 항체와 일련의 희석으로 혼합하고 인큐베이팅시켰다. 결합된 항체의 총량과 유리 항체의 양을 기준으로 하여, 스캐챠드 플롯을 결합 대 무결합 그래프로부터 생성시켰다. 전체 항체 농도는 하나의 활성 부위에 대해 75kD의 표준크기를 기초로 하였다.
Kd는 "베스트 핏트(best fit)" 라인을 생성시키므로써 계산하였다. 곡선의 역경사도가 Kd이다. 상관 계수 r2또한 계산하였다.
결과:
스캐챠드 플롯을 분석하였다. 이 분석으로부터의 Kd는 하기와 같다: 변형 2, Kd = 14nM; 쥐과 동물의 24-31, Kd = 8.51nM; 변형 1, Kd = 5.6. 결과를 각각 도 13, 14 및 15에서 각각 도시하였다. 이 들 결과는 추가로 대상 사람화된 항체가 24-31에 대해 유사하게 gp39 항원을 결합한다는 증거를 제공한다.
용도
본 발명의 사람화된 항 gp39 항체는, gp39 변형 및/또는 gp39-CD40 상호작용의 억제가 치료적으로 유용한 질환 상태를 치료하는데 효능이 있다. 또한, 대상 사람화된 항 gp39 항체는, 항원에 대한 항체 반응의 억제가 바람직한 질병의 치료에 사용될 수 있다. 이러한 상태에는 자가면역 및 비자가 면역 질환이 포함된다.
항 gp39 항체의 B 세포에서의 CD40 시그널링을 억제하는 능력은 기능적으로 생체내 T 세포 의존성 항체 반응의 현저한 억제로 번역된다. 따라서, 자가항체 생성에 의해 매개된 자가면역 질환은 항 gp39 항체 치료에 유리한 것으로 예상될 수 있다. 이러한 질병에는 전신 홍반성 루푸스, 특발성 혈소판 감소 자반병, 중증근 무력증 및 항인슐린 및 항인슐린 리셉터 항체를 가지는 당뇨 환자의 부차집단이 포함된다. 또한, B 세포 및 수상 돌기 세포에서의 CD40 시그널화는 B7.1 및 B7.2 분자와 같은 공동 시그널화 리셉터의 상향 조절에 필수적이다. 항 gp39 항체에 의한 이러한 CD4O 시그널화의 블록킹은 T 세포에 대한 항원 제공을 방해하며, 이로써 T 세포 활성화 및 T 세포 매개된 반응을 억제한다. CIA, EAE, NOD 마우스, GVHD 및 이식 거부증과 같은 질병 모델에서의 항 gp39 항체의 치료적 효능은 추가로 T 세포 매개된 반응에 대한 항체의 억제 효과를 확인시켜 준다. 동물 모델에서의 효능을 에 의해 지지된 작용의 이러한 메카니즘을 기초로 하여, 대상 사람화된 항 gp39 항체의 치료 효능은 RA, MS, 당뇨, 건선, GVHD 및 이식 거부증과 같은 질병에 까지 미칠 수 있다.
대상 사람화된 항체의 투여에 의해 효과적으로 치료가능한 특이적 상태는 하기와 같다:
알레르기성 기관지폐 국균증; 자가면역 용혈성 빈혈; 흑색극세포증; 알레르기성 접촉 피부염; 아디슨병; 아토피성 피부염; 원형탈모증; 범탈모증; 아밀로이드증; 아나필락토이드 자반병; 아나필락토이드 반응; 재생불량성 빈혈; 유전성 혈관부종; 특별성 혈관 부종; 강직성 척추염; 두개 동맥염; 거대세포 동맥염; 다가야스 동맥염; 측두 동맥염; 천식; 모세혈관확장성운동실조증; 자가면역 난소염; 자가면역 고환염; 자가면역 다내분비선 부전증; 베세트 증후군; 베르게르 증후군; 뷰르거 증후군; 수포성 천포창; 만성 점액피부 칸디다증; 카플란 증후군; 후방 심근경색 증후군; 심막절개술후 증후군; 심염; 복강 스프루우; 샤가스병; 셰디악-히가시 증후군; 처그-스트라우스 증후군; 코간 증후군; 한랭 응집소병; 크레스트 증후군; 크론병; 저온형글로불린혈증; 잠원성 섬유성 폐포염; 포진성 피부염; 피부근염; 진성당뇨병; 다이아몬드-블랙판 증후군; 디죠지 증후군; 원판상 홍반성 루푸스; 호산성 근막염; 상공막염; 드리테마 엘레바툼 디우티눔(Drythema elevatum diutinum); 윤곽성 홍반; 다형 홍반; 결절성 홍반; 가족성 지중해열; 펠티 증후군; 폐섬유증; 아나필락토이드 사구체신염; 자가면역성 사구체신염; 연쇄구균성 사구체신염; 이식후 사구체신염; 막성 사구체병증; 굿파스튜어 증후군; 이식편대 숙주병; 면역 매개 과립구감소증; 환상 육아종; 알레르기성 육아종증; 육아종성 근염; 그레이브병; 하시모토 갑상선염; 신생아의 용혈성 질병; 특발성 혈색소증; 헤노흐-쉴렌레인 자반병; 만성 활성 간염 및 만성 진행성 간염; 엑스 조직구증식증; 과호산구증가증; 특발성 혈소판장애성 자반병; 죠브 증후군; 연소성 피부근염; 연소성 류마티스성 관절염(연소성 만성 관절염); 가와시키병; 각막염; 건성각결막염; 란드리-귈라인-바르-스트롤 증후군; 나종성 나병; 뢰플러 증후군; 라이엘 증후군; 라임병; 림프종양 육아종증; 전신성 비만세포증; 혼성연결조직병; 다발성 단신경염; 무클-웰즈 증후군; 점액피부 림프절 증후군; 다중심성 망내조직구증; 다발성 경화증; 중증근 무력증; 균상식육종; 전신성 괴사성 맥관염; 신증; 중복 증후군; 지방층염; 발작성 냉간 혈색소뇨증; 발작성 야간 혈색소뇨증; 유천포창; 펨티구스; 홍반성 천포창; 낙엽성 천포창; 심상성천포창; 피죤 브리더병; 과민성 폐렴; 결절성 다발성 동맥염; 류마티스성 다발성 근육통; 다발성근염; 특발성 다발성 신경염; 포르투갈 가족성 다발성 신경병증; 자간전증; 원발성 담증성 간경변; 진행성 전신성 경화증; 건선; 건선성 관절염; 폐포단백질증; 폐섬유증; 레이노병; 리이텔 갑상선염; 라이터 증후군; 재발성 폴리크론드리티스(polychrondritis); 류마티스열; 류마티스성 관절염; 유육종증; 공막염; 경화성 담관염; 혈청병; 세자리 증후군; 쇼그렌 증후군; 스티븐스-존슨 증후군; 스틸병; 아급성 경화성 범뇌염; 교감성안염; 전신 홍반성 루푸스; 이식 거부증; 궤양성 대장염; 미분화 연결조직병; 만성 두드러기; 한랭 두드러기; 포도막염; 백반; 웨버-크리스찬병; 웨그너 육아종증; 비스코트-알드리히 증후군.
이들 중에서, 항 gp39 항체의 투여에 의해 치료될 수 있거나 제공될 수 있는 증상에는 자가면역 용혈성 빈혈; 재생불량성 빈혈; 측두 동맥염; 당뇨병; 펠티 증후군; 굿타스튜어 증후군; 이식편 대 숙주병; 특발성 혈소판감소성 자변병; 중증근 무력증; 다발성 경화증; 결절성 다발성 동맥염; 건선; 건선성 관절염; 류마티스성 관절염; 전신 홍반성 루푸스; 천식; 알레르길 질병; 및 이식 거부증이 포함된다.
치료적 효과를 나타내는 데 유용한 항체의 양은 당해 통상의 기술자들에게 널리 공지된 표준 기술에 의해 결정될 수 있다. 항체는 약제학적으로 허용되는 완충액내 표준 기술에 의해 제공될 것이며, 바람직한 경로에 의해 투여될 수 있다. 본 청구되는 항체의 효능 및 이의 사람에 의한 내성으로 인해 사람의 여러 질병 또는 질병 상태를 퇴치하기 위해 반복적으로 이러한 항체를 투여할 수 있다.
본 발명의 대상 항 gp39 사람화된 항체(또는 이의 단편)은 또한 예를 들어 사람 또는 동물의 면역계 억제를 포함하여, 면역조절을 유도하는 데 유용하다. 따라서, 본 발명은 효과적인 비독성량의 본 발명의 항체를 이러한 사람 또는 이외 동물에 투여하므로써 필요한 사람 또는 이외 동물에 예방적으로 또는 치료적으로 면역조절을 유도하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 항체가 면역조절을 유도하는 데 유용성을 갖는다는 의미는 본 발명의 항체가 이식된 기관 또는 조직(예를 들어, 신장, 심장, 폐, 골수, 피부, 각막 등)에 대한 내성 또는 거부의 치료 또는 예방; 자가면역, 염증, 증식성 및 과증식성 질병 및 면역 매개 질병(예를 들어, 류마티스성 관절염, 홍반성 루푸스, 전신 홍반성 루푸스, 하시모토 갑상선염, 다발성 경화증, 증증근 무력증, 제 1형 당뇨병, 포도막염, 신증, 건선, 아토피성 피부염, 접촉성 피부염 및 추가로 습진성 피부염, 지루성 피부염, 편평태선, 펨티구스(Pemplgus), 수포성 천포창, 표피수포증, 두드러기, 혈관부종, 맥관염, 홍반, 피부 호산구증가증, 원형 탈모증, 등)의 치료 또는 예방; 가역성 폐색성 기도병, 장감염 및 알레르기(예를 들어, 체강병, 직장염, 호산구증다성 위장염, 비만세포증, 크론병 및 궤양성 대장염) 및 음식 관련 알레르기(예를 들어, 편두통, 비염 및 습진)의 치료에 유용함을 의미한다. 또한, 본 발명의 항체는 면역조절이 바람직한, 상기 질병중 예를 들어, 이식편대 숙주병(GVHD), 이식 거부증, 천식, 백혈병, 림프종과 같은 비자가 면역성 질병의 치료에 효능적인 유용성을 갖는다.
또한, 대상 항체는 세포 또는 유전 치료 동안에 면역억제물로서 사용될 수 있다. 이는 가능하게는 이러한 세포 또는 유전자 치료 구성물이 반복적으로 투여가능하도록, 즉, 부작용의 면역원성 반응 없이 다량의 투여가 가능하도록 할 것이다.
당해 기술자들은 통상의 실험에 의해 면역억제를 유도할 항체의 비독성 유효량을 측정할 수 있을 것이다. 그러나, 일반적으로, 유효량은 약 0.05 내지 100mg/kg 체중/일의 범위일 것이다.
본 발명의 항체는 치료적 또는 예방적으로 상기 효과를 내기에 충분한 양으로 처리하는 상기 방법에 따라 사람 또는 이외 동물에 투여될 수 있다. 이러한 본 발명의 항체는 공지된 기술에 따라 통상의 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 본 발명의 항체를 혼합시켜 제조된 통상의 투여 형태로 이러한 사람 또는 이외 동물에 투여될 수 있다. 당해 기술자들은 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제의 형태 및 특성이 혼합되는 활성 성분의 양, 투여 경로 및 기타 공지된 변수에 의해 규정됨을 인지할 것이다.
항체(또는 이의 단편)의 투여 경로는 경구, 비경구, 흡입에 의해 또는 국부적일 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 비경구에는 정맥내, 근육내, 피하, 직장, 질내 또는 복강내 투여가 포함된다. 일반적으로 피하 및 근육내 형태의 비경구 투여가 바람직하다.
예방적으로 또는 치료적으로 면역억제를 유도하기 위해 본 발명의 화합물을 사용하기 위한 매일의 비경구 및 경구 투여량은 일반적으로 약 0.05 내지 100, 바람직하게는 약 0.5 내지 10mg/체중 kg/일일 것이다.
본 발명의 항체는 또한 흡입에 의해 투여될 수 있다. "흡입"은 비강 및 경구 흡입 투여를 의미한다. 이러한 투여에 적합한 투여 형태는 에어로졸 제형 또는 계량 투여 흡입제와 같은 형태가 통상의 기술에 의해 제조될 수 있다. 사용되는 본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 일반적으로 약 10 내지 100mg의 범위내에 있다.
본 발명의 항체는 또한 국부적으로 투여될 수 있다. 국부 투여는 비전신성 투여를 의미하며, 본 발명의 항체(또는 이의 단편) 화합물의 표피, 구강에 외면으로 도포되고, 귀, 눈 및 코에 이러한 항체를 점적시키는 것을 포함하나 중요하게는 혈류에 유입되는 것은 아니다. 전신성 투여는 경구, 정맥내, 복강내 및 근육내 투여를 의미한다. 치료 또는 예방 효과에 요구되는 항체의 양은 물론 선택된 항체, 처리하려는 상태의 특성 및 중증도 및 치료하려는 동물에 따라 다양할 것이며, 궁극적으로는 의사의 판단에 따를 것이다. 본 발명의 항체의 적합한 국부 투여량은 일반적으로 약 1 내지 100mg/체중 kg/일의 범위내에 있을 것이다.
제형
항체 또는 이의 단편은 단독으로 투여가능하나, 약제 제형으로서 제공되는 것이 바람직하다. 활성 성분은 국부 투여에 대해서는 제형 중량의 0.001% 내지 10%w/w, 예를 들어 1% 내지 2%로 포함될 수 있으며, 제형의 10% w/w를 포함할 수는 있으나, 5% w/w를 초과하지 않는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 제형의 0.1% 내지 1% w/w로 포함될 수 있다.
본 발명의 국부 제형은 활성 성분을 이에 대한 하나 이상의 허용되는 담체 및 임의의 이외의 치료 성분을 포함한다. 담체는 제형의 나머지 성분과 상용될 수 있으며, 수용자에 유해하지 않다는 의미에서 허용될 수 있어야 한다.
국부 제형에 적합한 제형에는 처리가 요구되는 부위에 피부를 통해 침투하는데 적합한, 예컨대, 바르는 약, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트와 같은 액체 또는 반액체 제조물 및 눈, 귀 또는 코에 투여하기에 적합한 점적제를 포함한다.
본 발명에 따른 점적제는 살균된 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있으며, 활성 성분을 살균제 및/또는 진균제 및/또는 기타 적합한 방부제, 바람직하게는 계면활성제를 포함하는 수용액에 용해시키므르써 제조될 수 있다. 형성되는 용액은 이후 여과에 의해 분류되어 적합한 용기에 옮겨져, 밀봉되고, 30분 동안 90 내지 100℃에서 오토클레이빙시키거나 유지시키므로써 살균될 수 있다. 다르게는, 상기 용액은 여과에 의해 살균되어 방부 기술에 의해 용기에 옮겨질 수 있다. 점적제에 내포되기에 적합한 살균제 및 진균제의 예는 페닐수은산 니트레이트 또는 아세테이트(0.002%), 벤즈알코늄 클로라이드(0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트(0.01%)가 있다. 유성 용액의 제조에 적합한 용매에는 글리세롤, 희석된 알코올 및 프로필렌 글리콜이 포함된다.
본 발명에 따른 로션에는 피부 또는 눈에 적용하기에 적합한 것들이 포함된다. 안용 로션은 임의로 살균제를 함유하는 살균 수성 용액을 포함할 수 있으며, 점적제의 제조를 위한 방법과 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 피부에 적용하기 위한 로션 또는 바르는 약은 또한 알코올 또는 아세톤과 같은 건조를 촉진시키고, 피부를 시원하게 하는 시제 및/또는 글리세롤과 같은 수분제 또는 카스터오일 또는 아라키스 오일과 같은 오일을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림, 연고 또는 패이스트는 외면 적용을 위한 활성 성분의 반고체 제형이다. 이들은 활성 성분을 미세하게 분할되거나 분말화된 형태로 혼합하거나, 적합한 기계의 보조로 유지성 또는 비유지성 기재와 함께 수성 또는 비수성 유체 중의 용액 또는 현탁액으로 또는 단독으로 형성될 수 있다. 기재는 경질, 연질 또는 액체 파라핀과 같은 탄화수소, 글리세롤, 밀랍, 금속성 비누; 점액; 아몬드, 옥수수, 아라키스, 카스터오일 또는 올리브오일과 같은 천연 오일; 양모지 또는 이의 유도체, 또는 프로필렌 글리콜 또는 매크로겔과 같은 알코올과 함께 스테르산 또는 올레산과 같은 지방산을 포함할 수 있다. 제형은 소르비탄 에스테르 또는 이의 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 음이온계, 양이온계, 또는 비이온계 계면활성제와 같은 적합한 계면활성제를 혼입시킬 수 있다. 천연 검과 같은 현탁화제, 셀룰로오스 유도체 또는 규산질 실리카와 같은 무기 물질 및 라놀린과 같은 그 밖의 성분 또한 포함될 수 있다.
당업자들은 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 적정량 및 개별적 투여의 적정 간격이 처리하려는 상태의 특성 및 정도, 투여 형태, 경로 및 부위, 및 치료하려는 특정 동물에 의해 결정될 것이며, 이러한 것들이 종래의 기술에 의해 결정될 수 있음을 인지할 것이다. 또한, 당업자들은 적정한 치료의 과정, 즉, 정해진 기일수에 대한 일당 주어지는 본 발명의 항체 또는 이의 단편의 투여 횟수가 통상적인 치료 측정 시험 과정을 사용하여 당업자들에게 확인될 수 있음을 인지할 것이다.
추가의 수고를 요하지 않고, 당업자들은 상기 설명을 이용하여 본 발명을 완전히 사용할 수 있음을 인지할 것으로 여겨진다. 따라서, 하기 내용은 단지 예시적인 것일 뿐이며, 본 발명을 어떠한 식으로든 제한하는 것은 아니다.
캡슐 조성물
본 발명의 캡슐 형태의 약제 조성물은 두조각의 경질 젤라틴 캡슐을 분말 형태의 50mg의 본 발명의 항체 또는 이의 단편, 100mg의 락토오스, 32mg의 탈크 및 8mg의 마그네슘 스테아레이트로 충전시켜 제조한다.
주입가능한 비경구 조성물
주입에 의해 투여하기에 적합한 형태의 본 발명의 약제 조성물은 1.5k의 본 발명의 항체 또는 단편을 10k 부피의 프로필렌 글리콜 및 물에서 교반시키므로써 제조한다. 이 용액을 여과에 의해 살균한다.
연고 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편: 1.0g
백색 연질 파라핀으로 100.0g이 되도록.
본 발명의 항체 또는 이의 단편을 소량의 비히클에 분산시켜 연하고 균질인 생성물을 수득한다. 접힐 수 있는 금속 관에 분산액을 충전시킨다.
국부용 크림 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편: 1.0g
폴라왁스(Polawax) GP 200: 20.0g
무수 라놀린: 2.0g
화이트 밀랍: 2.5g
메틸 히드록시벤조에이트: 0.1g
증류수로 100.0g이 되도록.
폴라왁스, 밀랍 및 라놀린을 함께 60℃에서 가열한다. 메틸 히드록시벤조에이트 용액을 첨가하고, 고속 교반으로 균질화시킨다. 이후, 온도를 SOOC로 떨어지도록 한다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 첨가하고, 전체적으로 분산시키고, 조성물을 느리게 교반하여 냉각시킨다.
국부용 로션 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편: 1.0g
소르비탄 모노라우레이트: 0.6g
폴리소르베이트 20: 0.6g
세토스테아릴 알코올: 1.2g
글리세린: 6.0g
메틸 히드록시벤조에이트: 0.2g
정제수 B.P.으로 100.00ml가 되도록(B.P. = 영국 약전).
메틸 히드록시벤조에이트 및 글리세린을 75℃에서 70ml의 물에 용해시킨다. 소르비탄 모노라우레이트, 폴리소르베이트 20 및 세토스테아릴 알코올을 함께 75℃에서 녹이고, 수용액에 첨가한다. 형성된 유화액을 균질화시키고, 지속적으로 교반하여 냉각시키고, 본 발명의 항체 또는 이의단편을 잔류하는 물에 현탁액으로서 첨가한다. 전체 현탁액을 균질화될 때까지 교반한다.
점안 조성물
본 발명의 항체 또는 이의 단편: 0.5g
메틸 히드록시벤조에이트: 0.01g
프로필 히드록시벤조에이트: 0.04g
정제수 B.P.으로 100.00ml가 되도록.
메틸 및 프로필 히드록시벤조에이트를 75℃에서 70ml의 정제수에 용해시키고, 형성된 용액을 냉각시킨다. 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 첨가하고, 용액을 막 필터(0.022Am 공극 크기)를 통해 여과하여 살균시키고, 적합한 살균 용기에 방부적으로 충전시킨다.
흡입 투여용 조성물
15-20ml 용량의 에어로졸 용기에 대해: 10mg의 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 0.2-0.5k의 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 윤활제와 혼합하고, 혼합물을 바람직하게는 (1,2 디클로로테트라플루오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄과 혼합하여 프레온과 같은 추진제에 분산시키고, 비강내 또는 경구 흡입 투여에 적합한 에어로졸 용기에 넣는다. 15-20ml 용량의 에어로졸 용기에 대한 흡입 투여용 조성물: 에탄올(6-8ml)에 10mg의 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 용해시키고, 0.1-0.2k의 폴리소르베이트 85 또는 올레산과 같은 윤활제를 첨가하고; 이를 바람직하게는 (1,2 디클로로테트라플루오로에탄) 및 디플루오로클로로메탄과 혼합하여 프레온과 같은 추진제에 분산시키고, 비강내 또는 경구 흡입 투여에 적합한 에어로졸 용기에 넣는다.
본 발명의 항체 및 약제 조성물은 특히 비경구 투여, 즉, 피하적으로, 근육내 또는 정맥내 투여에 유용하다. 비경구 투여용 조성물을 통상 허용되는 담체, 바람직하게는 수성 담체에 용해된 본 발명의 항체 또는 이의 단편 또는 이의 혼합물 용액을 포함할 것이다. 여러 수성 담체가 사용될 수 있으며, 예를 들면, 물, 완충된 물, 0.4k 염수, 0.3% 글리신 등이 있다. 이러한 용액은 살균되어 있으며, 일반적으로 미립물질을 함유하지 않는다. 이러한 용액은 통상적으로 널리 공지된 살균 기법에 의해 살균될 수 있다. 이러한 조성물은 pH 조정과 같은 적합한 생리적 조건에 요구되는 약제학적으로 허용되는 보조제 및 완충제 등을 함유할 수 있다. 이러한 약제 제형에서 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 약 0.5k 미만, 통상은 약 1% 이상 내지 15 또는 20중량%으로 매우 다양할 수 있으며, 선택된 특정한 투여 방식에 따라 주로 유체 용량, 점도 등을 기초로 선택될 것이다.
따라서, 근육내 주입을 위한 본 발명의 약제 조성물은 1ml의 살균 완충수, 및 50mg의 본 발명의 항체 또는 이의 단편을 함유하도록 제조될 수 있다. 유사하게, 정맥내 주입을 위한 본 발명의 약제 조성물은 250ml의 살균된 링거 용액(Ringer's solution) 및 150mg의 본 발명의 항체 또는 이의 단편으로 이루어질 수 있다. 비경구적으로 투여가능한 조성물을 제조하기 위한 실제 방법은 널리 공지되어 있거나 당업자들에게 인지되어 있으며, 보다 상세하게는 본원에서 참고문헌으로 인용되는 문헌을 참고한다[참고예: Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA].
본 발명의 항체(또는 이의 단편)은 저장을 위해 동결건조되고, 사용전에 적합한 담체로 재구성될 수 있다. 이러한 기술은 통상의 면역 글로불린에 효과적인 것으로 나타났으며, 당해 공지된 동결건조법 및 재구성법이 사용될 수 있다.
의도되는 결과에 따라, 본 발명의 약제 조성물은 치료적 및/또는 예방적 치료를 위해 투여될 수 있다. 치료적 적용에 있어서, 조성물은 이미 질병을 앓고 있는 환자에게 질병을 완치시키거나 적어도 부분적으로 그 질병 및 그의 합병증을 저지시키에 충분한 양으로 투여된다. 예방적 적용에 있어서, 본 발명의 항체 또는 이의 혼합물을 함유하는 조성물은 아직 질병 상태에 있지 않은 환자에게 환자의 내성을 강화시키기 위해 투여된다.
약제 조성물의 단일 또는 다중 투여는 치료하는 의사에 의해 선택되는 투여 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다. 어떠한 경우에도, 본 발명의 약제 조성물은 환자를 효과적으로 치료하기에 충분한 양의 본 발명의 변형된 항체(또는 이의 단편)를 제공해야 한다.
또한, 본 발명의 항체는 항체로서 동일 치료에 유용할 수 있는 펩티드 또는 비펩티드 화합물(유사 화합물)의 구상 및 합성에 사용될 수 있다[참조예: Saragovi et al, Science, 253:792-795(1991)].
상기로부터, 본 발명의 특이적 구체예가 예시를 위해 본원에 기술되었지만, 본 발명의 사상으로부터 출발하지 않고, 다양한 변경이 이루어질 수 있음을 주지하여야 한다. 따라서, 본 발명은 첨부되는 청구범위에 의해 제한되지 않는다.

Claims (34)

  1. gp39와의 CD40 결합을 억제시키기 위해 쥐과 동물의 24-31 항체와 경합할 수 있는 사람화된 항체.
  2. 제 1 항에 있어서, 도 4-8에 도시된 바와 같은 24-31 항체의 상보성 결정 영역 또는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 변이체 및 등가물을 함유함을 특징으로 하는 항체.
  3. 쥐과 동물의 단클론성 항체 24-31로부터 유도된 사람화된 항체.
  4. 쥐과 동물의 24-31 항체의 약 1/3 이상의 gp39 항원 결합 친화도를 보유하는 쥐과 동물의 단클론성 항체 24-31로부터 유도된 사람화된 항체.
  5. 모체 쥐과 동물의 24-31 항체의 농도보다 3배 이하의 농도에서 B 세포 검정에서의 시험관내 기능 활성에서 절반 최대 효능을 보유하는 쥐과 동물의 단클론성 항체 24-31로부터 유도된 사람화된 항체.
  6. B 세포 검정이 T 세포 의존성 항체 생성을 측정함을 특징으로 하는 제 5 항에 따른 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 항체가 하기 군으로부터 선택된 사람화된 가변 경쇄 서열, 및 형성된 사람화된 항체가 gp39 항원에 결합하는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체 및 등가물을 함유함을 특징으로 하는 사람화된 항체:
  8. 제 1 항에 있어서, 항체가 하기 군으로부터 선택된 사람화된 가변 중쇄 서열, 및 형성된 사람화된 항체가 gp39 항원에 결합하는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체 및 등가물을 함유함을 특징으로 하는 사람화된 항체:
  9. 제 1 항에 있어서, 항체가 하기 군으로부터 선택된 사람화된 가변 경쇄 서열:
    및 하기 군으로부터 선택된 사람화된 가변 중쇄 서열:
    및 형성된 사람화된 항체가 gp39 항원에 결합하는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체 및 등가물을 함유함을 특징으로 하는 사람화된 항체.
  10. 제 5 항에 있어서, 사람화된 가변 경쇄 서열(1) 및 사람화된 가변 중쇄 서열(1)을 함유함을 특징으로 하는 사람화된 항체.
  11. 제 5 항에 있어서, 사람화된 가변 경쇄 서열(2) 및 사람화된 가변 중쇄 서열(1)을 함유함을 특징으로 하는 사람화된 항체.
  12. 제 5 항에 있어서, 사람화된 가변 경쇄 서열(1) 및 사람화된 가변 중쇄 서열(2)를 함유함을 특징으로 하는 사람화된 항체.
  13. 제 5 항에 있어서, 사람화된 가변 경쇄 서열(2) 및 사람화된 가변 중쇄 서열(2)를 함유함을 특징으로 하는 사람화된 항체.
  14. 제 1 항에 있어서, 사람 카파 또는 람다 경쇄 불변 영역 및 사람 감마 1 또는 감마 4 중쇄 불변 영역을 함유함을 특징으로 하는 사람화된 항체.
  15. 제 1 항에 따른 사람화된 항체를 코드화하는 DNA 서열.
  16. 제 10 항에 따른 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터.
  17. 쥐과 동물의 단클론성 항체 24-31로부터 유도된 사람화된 항체를 함유하는 약제 조성물.
  18. 제 17 항에 있어서, 사람화된 항체가 하기 군으로부터 선택된 사람화된 가변 중쇄 서열, 및 형성된 사람화된 항체가 gp39 항원에 결합하는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체 및 등가물을 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물:
  19. 제 18 항에 있어서, 사람화된 항체가 하기 군으로부터 선택된 사람화된 가변 중쇄 서열, 및 형성된 사람화된 항체가 gp39 항원에 결합하는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체 및 등가물을 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물:
  20. 제 17 항에 있어서, 사람화된 항체가 하기 군으로부터 선택된 사람화된 가변 경쇄 서열:
    및 하기 군으로부터 선택된 사람화된 가변 중쇄 서열:
    및 형성된 사람화된 항체가 gp39 항원에 결합하는 능력에 실질적으로 영향을 미치지 않는 하나 이상의 보존성 아미노산 치환을 포함하는 이의 변이체 및 등가물을 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
  21. 제 20 항에 있어서, 사람화된 가변 경쇄 서열(1) 및 사람화된 가변 중쇄 서열(1)을 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
  22. 제 20 항에 있어서, 사람화된 가변 경쇄 서열(2) 및 사람화된 가변 중쇄 서열(1)을 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
  23. 제 5 항에 있어서, 사람화된 가변 경쇄 서열(1) 및 사람화된 가변 중쇄 서열(2)를 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
  24. 제 5 항에 있어서, 사람화된 가변 경쇄 서열(2) 및 사람화된 가변 중쇄 서열(2)를 함유함을 특징으로 하는 약제 조성물.
  25. 제 1 항에 따른 치료 유효량의 사람화된 항체를 투여하는 것을 포함하여, gp39 발현을 조정하거나 gp39/CD40 상호작용을 억제시키므로써 치료될 수 있는 질환을 치료하는 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 질환이 자가면역 질환임을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 21 항에 있어서, 자가면역 질환이 류마티스 관절염, 다발성 경화성 건선, 당뇨, 전신 홍반성 루푸스 및 ITP로 이루어진 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 질환이 비자가면역 질환임을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 27 항에 있어서, 질환이 이식편 대 숙주 질환 또는 이식편 거부증임을 특징으로 하는 방법.
  30. 유전자 치료 전, 동안 또는 후에 유전자 치료 동안에 사용되는 세포 또는 벡터에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 억제시키기에 충분한 양의 쥐과 동물의 항체 24-31로부터 유도된 사람화된 항체를 투여하는 것을 추가로 포함하여, 세포 또는 유전자 치료 동안에 투여되는 세포 또는 벡터에 대한 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 억제시키는 방법.
  31. 제 30 항에 있어서, 벡터가 바이러스성 벡터, DNA 또는 안티센스 RNA임을 특징으로 하는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 바이러스성 벡터가 아데노바이러스 또는 레트로바이러스임을 특징으로 하는 방법.
  33. 제 30 항에 있어서, 사람화된 항체가 도 5-8중 적어도 하나에서 도시된 서열을 함유함을 특징으로 하는 방법.
  34. 치료가 요구되는 대상체에 동일하거나 상이한 종의 세포, 조직 또는 기관의 이식을 포함하는 치료 방법에 있어서, 이식 전, 동안 또는 후에 쥐과 동물의 항체 24-31로부터 유도된 사람화된 항 사람 gp39 항체를 이식된 세포, 조직 또는 기관에 대한 면역 반응을 억제시키거나 숙주에 대해 이식된 세포, 조직 또는 기관에 의해 유도된 면역 반응을 억제시키기에 충분한 양으로 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
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