KR101262374B1 - 아글리코실 항-ｃｄ154(ｃｄ40 리간드) 항체 및 이의 용도 - Google Patents

아글리코실 항-ｃｄ154(ｃｄ40 리간드) 항체 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 항체의 Fc 부분의 CH2 도메인 중 보존된 N-연결 부위에서의 변형이 특징인 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 면역 반응과 관련된 질환을 치료하고, 상기 비글리코실화 항-CD154 항체 또는 이의 항체 유도체로 원하지 않는 면역 반응을 억제하는 것에 관한 것이다.

Description

아글리코실 항-ＣＤ154(ＣＤ40 리간드) 항체 및 이의 용도{AGLYCOSYL ANTI-CD154(CD-40 LIGAND) ANTIBODIES AND USES THEREOF}
본 발명은 CD154와 CD40 분자의 상호작용을 차단하는 아글리코실(aglycosyl) 항-CD154 항체 또는 이의 항체 유도체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 아글리코실 항-CD154 항체 및 항체 유도체를 생산하는 방법을 제공한다. 본 발명의 항체 및 항체 유도체는 바람직하지 않은 면역 반응을 수반하는 질병의 치료 및 예방에 유용하며, CD154-CD40 상호작용에 의해 조절된다.
체액성 및 세포성 면역의 발생은 항원 제시 세포("APC") 및 효과인자 T 세포와 활성화된 헬퍼 T 세포의 상호작용으로 조정된다. 헬퍼 T 세포의 활성화는 항원-특이적인 T-세포 수용체("TCR")와 이의 동족 펩티드-MHC 리간드의 상호작용에 좌우될 뿐 아니라, 다수의 세포 부착 및 공동자극 분자에 의한 배위 결합 및 활성화를 필요로 한다[Salazar-Fontana, 2001].
중요한 공동자극 분자는 CD154(CD40 리간드, CD40L, gp39, T-BAM, T-세포 활성화 분자, TRAP으로도 알려짐)로, 활성화-의존성으로, 일시적으로 제한되는 방식으로 CD4+ T 세포 상에 발현되는 Ⅱ형 막통과 단백질이다. 활성화에 이어, CD154는 CD8+ T 세포의 서브세트, 호염기성 세포, 비만 세포, 호산 백혈구, 자연 살해 세포, B 세포, 대식 세포, 수상돌기 세포 및 혈소판 상에서도 발현된다.
CD154 반대-수용체인 CD40은 APC를 비롯하여 많은 세포 형태의 표면 상에 구조적으로 및 광범위하게 발현되는 Ⅰ형 막 단백질이다[Foy, 1996].
CD154에 의해 CD40을 통한 신호 전달로 CD40 수용체 포함 세포 및 최적 CD4+ T 세포 감작(priming)의 활성화 결과인 캐스캐이드가 개시된다. 더 구체적으로, CD154와 CD40 간의 동족 상호작용은 B 세포의 항체 분비 세포 및 메모리 B 세포로의 분화를 촉진시킨다[Burkly, 2001]. 또한, CD154-CD40 상호작용은 대식세포 및 수상돌기 세포의 활성화, 및 자연 살해 세포 및 세포독성 T 림프구의 생성을 통해 세포성 면역을 촉진시킨다[Burkly, 2001].
체액성 및 세포성 면역 반응 둘 다의 기능을 조절하는 CD154의 중추적인 역할은 치료적 면역조절에 대한 경로의 억제제 사용에 대한 큰 관심을 불러 일으켰다[미국 특허 제5,474,771호]. 이와 같이, 항-CD154 항체는 다른 치료 단백질에 대한 면역 반응 또는 유전자 치료, 알레르겐, 자가면역 및 이식에 대한 광범위한 모델에서 유용하다는 것이 밝혀졌다[미국 특허 제5,474,771호; Burkly, 2001].
CD40-CD154 상호작용은 여러 실험으로 유도된 자가면역 질환(예, 콜라겐 유도성 관절염, 실험 알레르기 뇌척수염("EAE"), 난소염, 대장염, 약물-유도성 낭창 신염)에서 중요하다는 것이 밝혀졌다. 구체적으로, 상기 모델 모두에서의 질환 유도는 항원 투여 시 CD154 길항제로 차단할 수 있다는 것이 밝혀졌다[Burkly, 2001].
항-CD154 길항제를 이용한 질환의 차단은 인슐린 의존성 당뇨병 및 낭창 신염을 비롯한 자발적 자가면역 질환의 동물 모델에서 뿐 아니라, 이식편 대 숙주 질환, 이식, 폐 섬유증 및 아테롬성 동맥 경화증 질환 모델에서도 발견되었다[Burkly, 2001].
글리코실화 항-CD154 항체가 여러 면역 반응-관련성 질환의 예방 및 치료에서 유용하다는 것이 입증되었지만, 때때로 일부 피험체에서는 이를 이용한 치료로 인해 혈전색전성 질환 활성이 악화된다[Biogen Press Release, 2001; IDEC Press Release, 2001]. 이 부작용의 기작은 밝혀지지 않았지만, 항-CD154 항체 또는 이의 응집체에 의해 부적절한 혈소판 활성화를 유도하는 혈소판 상에서의 FcgRⅡa 및 CD154의 결합을 포함할 수 있다. 다른 Fcγ 수용체 및 보완물에 대한 결합 또한 이러한 효과를 가능하게 할 수 있다. 따라서, 효과인자 수용체에 결합하지 않는 항-CD154 항체 형태가 치료 용도로는 더 안전하고/하거나 더 효과적일 수 있다.
항-CD154 항체가 면역 기능을 억제하는 기작은 CD40과의 상호작용을 차단하기 위한 CD154에 대한 단순 결합보다 더 복잡할 수 있으며, 사실, 효과인자 경로에 의한 기여를 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체-항원 결합은 Fcγ 수용체 또는 보완물 성분에 대한 Fc 도메인 결합을 통해 활성화된 T 세포의 결실을 유도할 수 있다. 대안으로, CD154에 대한 항체의 결합은 Fcγ 수용체-포함 세포 상에서 항체의 세포 표면 스캐폴드 형성으로 강화될 수 있다. 또한 Fcγ 수용체 결합 상호작용에 의해 이 작용 부위에 대한 항체의 접근이 촉진될 수 있다.
항-CD154 항체를 비롯한 글리코실화 항체에서, Fc 이량체의 CH2 도메인 중 보존된 N-연결 부위에 결합된 글리칸은 CH2 도메인 사이에서 대립 CH2 도메인 상의 특이적인 아미노산 잔기와 접촉하는 당 잔기로 둘러싸여 있다[Jeffries, 1998]. 다양한 글리코실화 항체를 이용한 시험관내 연구에서, CH2 글리칸을 제거하면 Fc 구조가 변경되어, Fc 수용체에 대한 항체 결합 및 보완물 단백질 C1Q가 상당히 감소한다는 사실이 입증되었다[Nose, 1983; Leatherbarrow, 1985; Tao, 1989; Lund, 1990; Dorai, 1991; Hand, 1992; Leader, 1991; Pound, 1993; Boyd, 1995]. 생체내 연구에서는 아글리코실 항체의 효과인자 기능이 감소됨을 확인하였다. 예를 들어, 아글리코실 항-CD8 항체는 마우스 내 CD8-포함 세포를 고갈시킬 수 없고[Isaacs, 1992], 아글리코실 항-CD3 항체는 마우스 또는 인간의 사이토카인 방출 증후군을 유도하지 않는다[Boyd, 1995; Friend, 1999].
CH2 도메인 중 글리칸을 제거하면 효과인자 기능에 대해 유의적인 효과를 보이지만, 항체의 다른 기능성 및 물성은 변경되지 않은 채 남아있다. 구체적으로, 글리칸 제거로 인한 혈청 반감기 및 항원 결합에 대한 효과는 거의 나타나지 않는다는 것이 밝혀졌다[Nose, 1983; Tao, 1989; Dorai, 1991; Hand, 1992; Hobbs, 1992].
발명의 개요
본 발명에서, 항-CD154 항체 작용의 기작과 관련된 Fc 효과인자 작용은 항-CD154 항체를 사용하여 설명하며, Fc 효과인자 작용은 "아글리코실" 항-CD154 항체 를 유도하는 Fc 이량체의 CH2 도메인 중 보존된 N-연결 부위의 변형에 의해 감소된다. 상기 변형의 예는, Fc 이량체의 CH2 도메인 중 보존된 N-연결 부위의 돌연변이, CH2 도메인 중 N-연결 부위에 결합된 글리칸의 제거 및 글리코실화의 방지를 포함한다.
항-CD154 항체에 의한 억제 기작이 이의 Fc 효과인자 상호작용에 좌우되는지를 설명하기 위해, CD154-CD40 상호작용을 차단하여 항-CD154 항체 및 이의 아글리코실 대응물이 여러 질환을 억제하는 이들의 능력에 대해 비교하였다. 본원에 보고된 본 발명의 결과는, 항-CD154 항체의 비글리코실화(aglycosylated) 형태가 항-CD154 항체의 글리코실화 형태로서 동등하게 보호됨을 입증한다.
본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체는 감소된 효과인자 작용을 특징으로 하기 때문에, 이들 항체는 바람직하지 않은 혈전색전성 질환 활성에 대한 잠재성이 존재하는 피험체에서 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 아글리코실 항-CD154 항체의 감소된 Fc 효과인자 작용은 CD154를 발현하기 위해 유도된 활성화된 T 세포 및 다른 세포군의 결실, 또는 단핵구/대식세포의 Fc-의존성 활성화와 같은 항-CD154 항체 치료의 다른 잠재적인 부작용을 감소 또는 제거시킬 수 있다.
구체적으로, 본 발명은 CD154를 인지하는 아글리코실 항-CD154 항체를 제공한다. 또한 특히, 본 발명은 인간화, 비글리코실화 항-CD154 항체 - 즉 "아글리코실 hu5c8", 및 뮤린(murine), 비글리코실화 항-CD154 항체 - 즉 "아글리코실 muMR1"을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 hu5c8 항체는 2003년 1월 14일에 버지니아주 마나사스 유니버시티가 10801 미국 표준 균주("ATCC")에 기탁된 NSO 아글리코실 hu5c8 항체 세포주(수탁 번호 PTA-4931)로부터 생산되고, 아글리코실 MR1 항체는 2003년 1월 14일에 ATCC에 기탁된 NSO 아글리코실 뮤린 MR1 세포주(수탁 번호 PTA-4934)로부터 생산된다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체는 CD154와 CD40간의 상호작용을 억제할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체는 CD40-포함 세포의 활성화를 직간접적으로 차단하는 방식으로 CD154와 결합할 수 있다.
본 발명은 또한 아글리코실 항-CD154 항체 또는 이의 항체 유도체를 피험체에 투여하는 것을 포함하는, 피험체의 면역 반응을 억제하는 방법을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 유도체는 피험체 면역 세포의 활성화를 억제하기 위한 유효량으로 투여된다.
본 발명은 또한 아글리코실 항-CD154 항체 또는 이의 항체 유도체를 피험체에 투여하는 것을 포함하는, 피험체의 면역 반응-의존성 병태 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 상기 항체 또는 항체 유도체는 피험체 면역 세포의 활성화를 억제하기 위한 유효량으로 투여하여 면역 반응-의존성 병태 또는 질환을 치료 또는 예방한다.
도 1은 아글리코실 hu5c8 모노클로날 항체("mAb") 및 글리코실화 hu5c8 mAb 가 인간 CD154에 대해 동일한 상대 친화도로 결합하는 것을 예시한다. 세포 표면 CD154에 대한 비오티닐화 hu5c8 mAb의 결합은 비표지된 글리코실화 hu5c8 mAb 또는 아글리코실 hu5c8 mAb의 적정과 경쟁하였다. 비표지된 항체 농도에 대해 스트렙타비딘-PE로 검출한 비오티닐화 항체의 평균 형광 강도를 플롯팅하였다. 종합하여, 4-변수 곡선 피트(curve fit)를 도시한다.
도 2는 FcR 결합 능력이 손상된 아글리코실 hu5c8을 예시한다. huCD154와 FcγRⅠ+ 세포간의 가교(a) 또는 huCD154+ CHO 세포와 FcγRⅢ+ 세포간의 가교(b)를 형성하기 위한 항-CD154 항체, 즉 아글리코실 hu5c8 mAb의 능력을 평가하였다. 형광으로 표지된 FcγR+ 세포는 CD154에 사전 결합된 글리코실화 hu5c8 mAb 또는 아글리코실 hu5c8 mAb를 함유하는 미량적정 플레이트에 첨가하였다. 결합된 FcγR+ 세포는 여기/방출 스펙트럼, 485/530 nm를 사용하여 각 웰에서 상대적 형광 단위("RFU")를 측정하여 검출하였다.
도 3은 글리코실화 hu5c8 mAb 및 아글리코실 hu5c8 mAb가 시노몰구스 원숭이에서 동일한 혈청 반감기를 가진다는 것을 예시한다. 글리코실화 hu5c8 mAb 및 아글리코실 hu5c8 mAb의 농도는 단일 정맥내 투여량 20 ㎎/㎏을 투여한 뒤 시노몰구스 원숭이의 혈청에서 측정하였다. 각 치료군의 평균 혈청 농도는 ±표준 편차("SD")로 도시한다.
도 4는 글리코실화 hu5c8 mAb 및 아글리코실 hu5c8 mAb가 파상풍 톡소이드("TT")에 대한 1차 면역 반응을 억제한다는 것을 예시한다. 글리코실화 hu5c8 mAb 연구(폐쇄형 심벌) 및 아글리코실 hu5c8 mAb 연구(개방형 심벌)에서의 mAb 처리군 및 염수 대조군의 시노몰구스 원숭이에 대한 결과를 도시한다.
도 5는 아글리코실 hu5c8 mAb가 TT에 대한 2차 면역 반응을 억제한다는 것을 예시한다. 개별 시노몰구스 원숭이의 TT에 대한 1차(폐쇄형 바) 및 2차(개방형 바) 전체 항체 반응(EAUC)을 도시한다. 1A 군 동물은 1차 및 2차 TT 공격(challenge) 전 염수로 처리하였다. 1B 군 동물은 1차 TT 공격 전 염수로, 2차 TT 공격 전 아글리코실 hu5c8 mAb로 처리하였다.
도 6은 BALB/c 마우스 중 글리코실화 뮤린 키메라 MR1("muMR1") 및 아글리코실 muMR1 항체의 약동력학을 예시한다. 글리코실화 muMR1 항체(다이아몬드형 심벌) 및 아글리코실 muMR1 항체(사각형 심벌)에 대한 결과를 도시한다.
도 7(A 및 B)은 아글리코실 항-CD154 항체가 SNF1 마우스에서 단일 가닥(A) 및 이중 가닥(B) DNA에 대한 자가항체 반응를 감소시킨다는 것을 예시한다. muMR1 항체(다이아몬드형 심벌) 및 아글리코실 muMR1 항체(사각형 심벌)에 대한 결과를 도시한다. 대조군 muIgG2a 항체는 삼각형 심벌로 나타낸다.
도 8은 아글리코실 항-CD154 항체가 SNF1 마우스에서 사구체신염의 발생을 감소시킨다는 것을 예시한다. 복합 조직학 점수를 muIgG2a(대조군), muMR1 및 아글리코실 muMR1으로 처리한 마우스에 대해 도시하였다.
도 9는 아글리코실 항-CD154 항체가 SNF1 마우스에서 사구체 신염의 발생을 지연시킨다는 것을 예시한다. muMR1 항체(다이아몬드형 심벌) 및 아글리코실 muMR1 항체(사각형 심벌)에 대한 결과가 나타나 있다. 대조군 muIgG2a 항체는 삼각형 심 벌로 나타나 있다.
도 10은 아글리코실 항-CD154 항체가 SNF1 마우스에서 증가된 혈액 요소 질소("BUN")의 시작을 지연시키는 것을 예시한다. muMR1 항체(다이아몬드형 심벌) 및 아글리코실 muMR1 항체(사각형 심벌)에 대한 결과가 나타나 있다. 대조군 muIgG2a 항체는 삼각형 심벌로 나타나 있다.
도 11은 아글리코실 항-CD154 항체가 SNF1 마우스에서 혈청 크레아티닌의 증가를 방지한다는 것을 예시한다. muMR1 항체(다이아몬드형 심벌) 및 아글리코실 muMR1 항체(사각형 심벌)에 대한 결과가 나타나 있다. 대조군 muIgG2a 항체는 삼각형 심벌로 나타나 있다.
도 12는 이소타입 대조군 P1.17 항체로 처리한 마우스와 비교했을 때, muMR1 항체로 처리한 마우스에서 실험 자가면역 뇌척수염("EAE")의 증상이 발생하지 않았음을 예시한다. muMR1 항체(개방형 원) 및 P1.17 대조군 항체(폐쇄형 원)에 대한 결과를 도시한다.
도 13은 아글리코실 muMR1 항체로 처리한 마우스에서, 아글리코실 muMR1 항체가 muMR1 항체로서 EAE의 임상학적 징후를 억제하는 데 효과적이었음을 예시한다. 결과는 질환 유도 후의 일수와 관련하여 장애 점수(평균 + 평균 표준 오차 - "SEM") 및 초기 중량% (평균 + SEM)를 도시한다. P1.17은 대조군 Ig이다.
도 14는 동종이계 도세포 이식에 따라 붉은털 원숭이의 공복시 혈당치("FBG") 수준을 도시한 것이다. 급성 거부반응은 FBG > 100㎎/dl로 정하였다. 아글리코실 hu5c8 mAb(점선) 및 글리코실화 hu5c8 mAb(실선)로 처리한 동물을 도시한 다.
본원에 기재된 발명을 충분히 더 이해하기 위해, 다음의 상세한 설명을 개시한다. 달리 정의하지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 발명과 관련된 당업자가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 가진다. 예시적인 방법 및 물질이 하기에 기재되어 있으나, 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 방법 및 물질 또한 본 발명의 실시에 사용될 수 있으며, 이는 당업자에게 명백할 것이다.
본 출원에는, 다양한 공보 및 참조 문헌이 괄호 안에 언급되어 있다. 이들 공보 및 참조 문헌의 개시 내용 전문은 본 발명과 관련된 기술 상태를 더 충분하게 설명하고자 본 출원에 참조 인용된다. 상기 참조 문헌에 대한 서지 인용은 본문에서 찾을 수 있거나, 상세한 실험 설명 다음 부분에 번호를 매겨 열거해 두었다. 논쟁이 있을 경우, 본 명세서가 좌우될 것이다. 물질, 방법 및 실시예는 단지 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하고자 함은 아니다.
당업자에게 공지된 재조합 DNA 기술에 대한 일반 원칙이 개시되어 있는 표준 참조 연구로는, 문헌 [Ausubel et al., Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York(1998 and Supplements to 2001)]; [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York(1989)]; [Kaufman et al., Eds., Handbook Of Molecular And Celluar Methods In Biology And Medicine, CRC Press, Boca Raton(1995)]; [McPherson, Ed., Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford(1991)]이 포함된다.
당업자에게 공지된 면역학의 일반 원칙이 개시되어 있는 표준 참조 연구로는, 문헌 [Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y.(1999)]; 및 [Roitt et al., Immunology, 3d Ed., Mosby-Year Book Europe Limited, London(1993)]이 포함된다. 당업자에게 공지된 의학 생리학 및 약리학의 일반 원칙이 개시되어 있는 표준 참고 연구로는, 문헌 [Fauci et al., Eds., Harrison's Principles Of Internal Medicine, 14th Ed., McGraw-Hill Companies, Inc.(1998)]이 포함된다.
본 발명의 제제 및 방법은 면역 반응을 억제하고, 면역 반응으로 유도되는 질환 및 병태(예, 자가면역 질환, 알레르기, 이식 거부반응, 염증, 이식편 대 숙주 질환, 섬유증 및 아테롬성 동맥 경화증)를 치료하기 위해, 아글리코실 항체 또는 이의 항체 유도체의 사용을 고려한다.
더 구체적으로, 치료용, 특히 인간 치료용으로 사용되는 아글리코실 항-CD154 항체는 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 폴리클로날 항체 및 다량체 항체를 포함한다.
항체
항체는 대략 분자량이 150 kD인 당단백질로, 체내에 이질 분자가 존재할 경우 이에 대한 반응으로 척추 동물 면역계의 체액성 암(humoral arm)에 의해 생산되는 것이다. 기능성 항체 또는 항체 유도체는 생체내 또는 시험관내에서 이의 특이적인 항원을 인지하여 결합할 수 있고, 예를 들어, 직접적인 세포독성, 보완물-의존성 세포독성("CDC"), 항체-의존성 세포독성("ADCC") 및 항체 생산을 비롯하여, 항체-결합에 관련된 임의의 후속 작용을 개시할 수 있다.
항원에 결합할 때, 항체는 감염성 미생물 또는 다른 항원-함유 실체(예, 암 세포)의 중화, 파괴 및 제거에 기여하는 면역계의 다수의 효과인자계 중 하나 이상을 활성화시킨다.
자연 발생적인 항체가 단일 종에서 유래된다 하더라도, 유전자 조작된 항체 및 항체 단편은 하나 이상의 동물 종에서 유래할 수 있다(예, 키메라 항체). 최근, 마우스(뮤린)/인간 키메라 및 뮤린/비인간 영장류 항체를 생성하였으나, 다른 종들 간의 조합도 가능하다.
한 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체는 키메라 항체이다. 통상적으로, 키메라 항체는 다른 종(통상적으로 인간)의 불변 영역에 융합된 한 종(통상적으로 마우스)의 상보성 결정 영역("CDR")과 골격 잔기를 비롯한 중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역을 포함한다. 이들 키메라 마우스/인간 항체는 각각 대략 75% 인간 및 25% 마우스 아미노산 서열을 함유한다. 인간 서열은 항체의 불변 영역을 나타내는 반면, 마우스 서열은 항체의 가변 영역(따라서 항원-결합 부위를 함유)을 나타낸다.
상기 키메라 항체를 사용하는 것에 대한 원리는, 마우스 항체에 대한 항원 특이성은 보유하지만 마우스 항체(마우스 항체는 마우스 이외의 종에서의 항체에 대한 면역 반응을 야기함)의 면역원성은 감소시켜, 인간 치료 시 키메라 항체를 사용할 수 있다는 것이다.
다른 특이적인 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체는 한 항체로부터의 골격 영역과 다른 항체로부터의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체를 포함한다.
더 특이적인 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체는 상이한 인간 항체로부터의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체를 포함한다.
다른 특이적인 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체는 둘 이상의 상이한 인간 항체로부터의 CDR 영역을 포함하는 키메라 항체를 포함한다.
상기 기재된 모든 키메라 항체에 대한 제조 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다[미국 특허 제5,807,715호; Morrison, 1984; Sharon, 1984; Takeda, 1985].
본 발명의 다른 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체는 영장류화, 인간화 및 완전한 인간 항체도 포함한다. 영장류화 및 인간화 항체는 통상적으로 대개 추가 인간 불변 영역을 포함하는, 비인간 영장류 또는 인간 항체 V 영역 골격으로 이식된 뮤린 항체로부터의 중쇄 및/또는 경쇄 CDR을 포함한다[Riechmann, 1988; Co, 1991; 미국 특허 제6,054,297호; 제5,821,337호; 제5,770,196호; 제5,766,886호; 제5,821,123호; 제5,869,619호; 제6,180,377호; 제6,013,256호; 제5,693,761호; 및 제6,180,370호].
1. 인간화 항체
인간화 항체는 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조한 항체로, 항원 결합이 불필요한(예, 가변 도메인의 불변 영역 및 골격 영역) 인간 면역 글로불린 경쇄 또는 중쇄의 아미노산 일부 또는 전부를 사용하여, 동족, 비인간 항체의 경쇄 또는 중쇄로부터 상응하는 아미노산을 치환한다. 예를 들어, 소정의 항원에 대한 뮤린 항체의 인간화 버전은 이의 중쇄 및 경쇄 상에서, (1) 인간 항체의 불변 영역; (2) 인간 항체의 가변 도메인으로부터의 골격 영역; 및 (3) 뮤린 항체로부터의 CDR을 가진다. 필요할 경우, 인간 골격 영역 중 하나 이상의 잔기를 뮤린 항체 중 상응하는 부위에서의 잔기로 바꿔, 항원에 대한 인간화 항체의 결합 친화도를 유지할 수 있다. 이 변화를 종종 "복귀 돌연변이(back mutation)"라 부른다. 키메라 인간 항체와 비교했을 때 인간화 항체는 일반적으로 인간에서 면역 반응을 덜 유도하는 경향이 있는데, 이는 인간화 항체가 비인간 성분을 상대적으로 덜 함유하고 있기 때문이다. 인간화 항체의 제조 방법은 항체 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다[유럽 특허 제239400호; Jones, 1986; Riechmann, 1988; Verhoeyen, 1988; Queen, 1989; Orlandi, 1989; 미국 특허 제6,180,370호].
본 발명의 한 구체예에서, 인간화 항체는 인간 항체 상의 뮤린(또는 다른 비인간) CDR을 이식하여 생성한다. 더 구체적으로, 인간화 항체는 다음과 같이 얻는다: (1) 중쇄 및 경쇄 가변 도메인을 코딩하는 cDNA를 하이브리도마에서 분리한다; (2) CDR을 비롯한 가변 도메인의 DNA 서열은 서열화로 결정한다; (3) CDR을 코딩하는 DNA는 부위 지정 돌연변이 유발에 의해 인간 항체 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인 코딩 서열에 상응하는 영역으로 옮긴다; 그리고, (4) 소정의 이소타입(예, CH에 대해 1 및 CL에 대해 k)의 인간 불변 영역 유전자 분절을 첨가한다. 마지막으로, 인간화 중쇄 및 경쇄 유전자를 포유류 숙주 세포(예, CHO 또는 NSO 세포)에서 함께 발현시켜, 가용성 인간화 항체를 생산한다.
가끔, 인간 골격에 대한 CDR의 직접 이동은 생성된 항체의 항원-결합 친화도를 소실시킨다. 이는 몇몇 동족 항체에서, 골격 영역 내의 특정 아미노산이 CDR과 상호작용하여 항체의 전체 항원 결합 친화도에 영향을 미치기 때문이다. 이 경우, 동족 항체의 항원-결합 활성을 유지하기 위해, 수용체 항체의 골격 영역에 "복귀 돌연변이"를 도입하는 것이 중요할 것이다. 일반적인 복귀 돌연변이의 제조 접근법은 당업자에게 잘 알려져 있다[Queen, 1989; Co, 1991; PCT 특허 출원 WO 90/07861; Tempest, 1991].
2. 인간 항체
본 발명의 한 구체예에서, 항체 및 항체 유도체는 완전한 인간 아글리코실 항-CD154 항체이다.
본 발명의 특정 구체예에서, 완전한 인간 항체는 시험관내-감작된(primed) 인간 비장세포[Boerner, 1991] 또는 파지-발현형 항체 라이브러리[미국 특허 제6,300,064호]를 사용하여 제조한다.
본 발명의 특정 구체예에서, 완전한 인간 항체는 클로닝 레퍼토리에 의해 제조한다[Persson, 1991; Huang and Stollar, 1991]. 또한, 미국 특허 제5,798,230호에는 인간 B 세포로부터의 인간 모노클로날 항체의 제조에 대해 기재되어 있는데, 인간 항체-생산 B 세포는 불멸화에 필요한 단백질인 엡슈타인-바르 바이러스 핵 항원 2("EBNA2")를 발현하는 엡슈타인-바르 바이러스, 또는 이의 유도체로 감염시켜 불멸화시킨다. 그 뒤 EBNA2 기능을 차단하여, 항체 생산을 증가시킨다.
완전한 인간 항체를 생산하기 위한 다른 방법은 비활성화된 내인성 Ig 유전자 좌를 가지고, 재배열되지 않은 인간 항체 중쇄 및 경쇄 유전자에 대해 유전자 이식된 비인간 동물의 용도를 포함한다. 상기 유전자 이식 동물은 활성화된 T 세포 또는 D1.1 단백질로 면역화시킬 수 있고[미국 특허 제5,474,771호; 미국 특허 제6,331,433호; 미국 특허 제6,455,044호], 하이브리도마는 여기에서 유래된 B 세포로부터 생성할 수 있다. 이 방법에 대한 상세한 내용은 종래 기술에 설명되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제5,789,650호를 비롯하여, 인간 Ig 미니좌(miniloci)를 함유하는 유전자 이식 마우스에 관한 다양한 GenPharm/Medarex(Palo Alto, CA) 공보/특허; 미국 특허 제6,075,181호, 제6,150,584호 및 제6,162,963호를 비롯하여, XENOMOUSE? 마우스에 관한 다양한 Abgenix(Fremont, CA) 공보/특허; Green, 1997; Mendez, 1997; 및 유럽 특허 제843961호 및 Tomizuka, 1997를 비롯하여, "트랜소믹(transomic)" 마우스에 관한 다양한 Kirin(일본) 공보/특허를 참조한다.
디글리코실화 항체의 생성
현재, mAb의 효과인자 기능은 감소시키지만, 이의 다른 귀중한 Fc 부분의 속성은 유지시키기 위한 2가지 방법이 존재한다. 항체를 변형시키는 한 방법은 효과인자 결합 상호작용에 관련된 mAb 표면 상에서 아미노산을 돌연변이시키는 것이다[유럽 특허 제239400호; Jefferies, 1998]. 몇몇 돌연변이 조합이 효과인자 기능을 적절하게 감소시킬 것 같지만, 지금까지 실험한 표면 돌연변이 항체는 잔여 활성을 보유하는 것으로 나타났다. 이 접근법을 이용한 다른 논점은, mAb 표면 상에서의 아미노산 변화가 면역원성을 유발할 수도 있다는 것이다.
본 발명은 항체의 Fc 부분의 CH2 도메인 중 보존된 N-연결 부위에서의 변형이 특징인, 효과인자 기능이 감소된 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체에 관한 것이다.
본 발명의 한 구체예에서, 변형은 중쇄 글리코실화 부위에서의 글리코실화를 방지하기 위해 이 부위에서의 돌연변이를 포함한다. 따라서, 본 발명의 한 바람직한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체는 중쇄 글리코실화 부위의 돌연변이 - 즉, N298Q(Kabat EU 넘버링을 사용하면 N297)의 돌연변이에 의해 제조하여, 적절한 숙주 세포에서 발현된다. 예를 들어, 이 돌연변이는 Amersham-Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ, USA)로부터의 독특한 부위 돌연변이 발생 키트에 대한 제조업자 추천 프로토콜에 따라 수행할 수 있다. 돌연변이된 항체는 숙주 세포(예, NSO 또는 CHO 세포)에서 안정하게 발현시킨 뒤 정제할 수 있다. 한 예로서, 정제는 단백질 A 및 겔 여과 크로마토그래피를 사용하여 수행할 수 있다. 추가 발현 및 정제 방법을 사용할 수도 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체는 감소된 효과인자 기능을 가지는데, 상기 항체 또는 항체 유도체의 Fc 부분의 CH2 도메인 중 보존된 N-연결 부위에서의 변형은 CH2 도메인 글리칸의 제거, 즉 디글리코실화를 포함한다. 이러한 아글리코실 항-CD154 항체는 통상적인 방법으로 생성한 뒤, 효소적으로 디글리코실화시킬 수 있다. 항체의 효소적 디글리코실화 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다[Williams, 1973; Winkelhake & Nicolson, 1976].
본 발명의 다른 구체예에서, 디글리코실화는 글리코실화 억제제 투니카마이신을 사용하여 이룰 수 있다[Nose & Wigzell, 1983]. 즉, 변형은 상기 항체의 Fc 부분의 CH2 도메인 중 보존된 N-연결 부위에서의 글리코실화를 방지하는 것이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 재조합 CD154 폴리펩티드(또는 상기 폴리펩티드를 함유하는 세포 또는 세포막)를 항원으로 사용하여 항-CD154 항체 또는 항체 유도체를 생성한 뒤, 글리코실화시킬 수 있다. 항원은 보조제와 혼합하거나 합텐에 연결시켜, 항체 생산을 증가시킬 수 있다.
본 발명의 아글리코실 항체 또는 항체 유도체를 상기 기재한 부위 지정 돌연변이 또는 효소 디글리코실화 방법으로 변형시킬지에 대한 항체 생성의 기본 원리는 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 비인간 포유동물을 면역화하기 위한 프로토콜은 종래 기술에 잘 성립되어 있다[Harlow, 1998; Coligan, 2001; Zola, 2000].
면역화에 이어, 본 발명의 항체 또는 항체 유도체는 임의의 종래 기법을 사용하여 생산할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Howard, 2000]; [Harlow, 1998]; [Davis, 1995]; [Delves, 1997]; [Kenney, 1997]을 참조한다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 숙주 세포는, 예를 들어, (1) 박테리아 세포(예, 이. 콜라이(E. coli), 카울로박테르 크레켄투스(Caulobacter crescentus), 스트렙토마이시스(Streptomyces) 종 및 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium)); (2) 효모 세포(예, 사카로마이시스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이시스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 메타놀리카(Pichia methanolica); (3) 곤충 세포주(예, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda)로부터의 곤충 세포주 - 예, Sf9 및 Sf21 세포주, 및 expresSFTM 세포(Protein Sciences Corp., Meriden, CT, USA) - 초파리 S2 세포, 및 High Five? 세포 중 트리코플루시아(Trichoplusia)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); 또는 (4) 포유류 세포일 수 있다. 보편적인 포유류 세포는 COS1 및 COS7 세포, 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포, NSO 골수종 세포, NIH 3T3 세포, 293 세포, HEPG2 세포, HeLa 세포, L 세포, HeLa, MDCK, HEK293, WI38, 뮤린 ES 세포주(예, 129/SV, C57/BL6, DBA-1, 129/SVJ 균주로부터), K562, Jurkat 세포 및 BW5147을 포함한다. 다른 유용한 포유류 세포주는 잘 알려져 있으며, 미국 표준 균주("ATCC")(Manassas, VA, USA) 및 코리엘 세포 저장소의 국립 종합의학연구소(NIGMS) 인간 유전 세포 저장소(Camden, NJ, USA)로부터 쉽게 입수할 수 있다. 이들 세포형은 단지 대표적인 것으로, 모든 리스트를 의미하는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체는 무세포 번역으로 제조한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체는, 대규모 생산을 용이하게 하기 위해, 항체-발현 세포를 함유하는 생물 반응기에서 생산한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체는, 아글리코실 항-CD154 항체의 대규모 생산을 용이하게 하기 위해, 모유 중에서 항체를 발현하는 유전자 이식 포유류(예, 염소, 소 또는 양)에서 생산한다[미국 특허 제5,827,690호; Pollock, 1999].
상기한 바와 같이, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체는 원핵 세포 및 진핵 세포에서 생산할 수 있다. 따라서 본 발명은 하이브리도마 세포, B 세포, 혈장 세포 뿐 아니라 재조합으로 변형된 숙주 세포를 비롯하여, 본 발명의 항체를 발현하는 세포를 제공하여, 본 발명의 항체를 발현시킨다.
일부가 상기 기재되어 있는 다른 고려 사항 중에서, 숙주 세포 균주는 소정의 방식으로 발현된 CD154 단백질을 처리하기 위한 이의 능력에 따라 선별될 수 있다. 비글리코실화 외에, 상기 폴리펩티드의 번역후 변형은, 비제한적으로 아세틸화, 카르복실화, 인산화, 지질화 및 아실화를 포함하고, 상기 번역후 변형 중 하나 이상을 이용하여 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체를 제공하는 것이 본 발명의 한 측면이다.
항체 변형
투여 시, 항체는 종종 순환에 의해 빠르게 제거되어, 상대적으로 단기간의 약리적 활성을 유도할 수 있다. 결론적으로, 상대적으로 다량의 항체를 자주 주사하면 항체 치료의 치료 효능을 지속할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체를 변형시켜(즉, 다른 부분에 결합시켜), 생체내 항체의 완전성 및 수명을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체를 안정성을 증가시킬 수 있는 부분을 포함하도록 변형시켜, 항체의 혈장 반감기를 연장시킬 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체는 수용성 중합체(예, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린)의 공유 결합에 의해 변형된다 - 이들 모두는 상응하는 비변형된 단백질보다 정맥 주사 후 혈중 반감기가 실질적으로 더 길게 나타나는 것으로 알려져 있다[Abuchowski, 1981; Anderson, 1992; Newmark, 1982; Katre, 1987].
항체 변형은 또한 수용액 중 단백질의 가용성을 증가시키고, 응집체를 제거하고, 단백질의 물리 화학적 안정성을 강화시키며, 단백질의 면역원성 및 항원성을 크게 감소시킬 수 있다. 결과적으로, 소정의 생체내 생물학적 활성은 비변형된 단백질보다 더 적은 양 또는 더 적은 횟수로 상기 중합체-단백질 부가물을 투여하여 얻을 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체는 검출 가능한 마커(예, 방사성 동위원소, 효소, 염료 또는 비오틴)로 표지하여 변형시킨다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체는 치료제, 예를 들어, 방사성 동위원소 또는 방사성 핵종(예, 111In 또는 90Y), 독소 부분(예, 파상풍 톡소이드 또는 리신), 톡소이드 또는 화학치료제에 접합시켜 변형시킨다[미국 특허 제6,307,026호].
본 발명의 몇몇 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체는 영상화제에 접합시켜 변형시킨다. 영상화제는 용이한 분리 또는 검출을 위해, 예를 들어, 표지 부분(labelling moiety)(예, 비오틴, 형광 부분, 방사성 부분, 히스티딘 태그 또는 다른 펩티드 태그)을 포함할 수 있다.
항체 유도체
본 발명은 또한 아글리코실 항-CD154 항체 유도체에 관한 것이다. 아글리코실 항-CD154 항체에 대해 상기한 모든 방법 및 제제를 사용하여 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체 유도체를 생산할 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체 유도체는 이형이량체 항체 복합체 및 항체 융합체(예, 이특이성 항체), 반이량체 항체, 다가 항체(즉, 4가 항체) 및 단일쇄 항체를 포함한다. 반이량체 항체는 Fc 부분 및 Fab 부분으로 구성된다. 단일쇄 항체는 단일 단백질 쇄 중 단백질 스페이서로 연결된 가변 영역으로 구성된다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체 유도체는 또한 하나 이상의 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄를 함유하는 단백질(예, 단량체 및 상기 쇄의 호모- 또는 헤테로-다량체(예, 이량체 또는 삼량체))을 포함할 수 있으며, 상기 쇄는 선택적으로 이황화 결합, 다른 방법으로는 교차 결합되어 있다. 이들 항체 유도체는 하나 이상의 항원에 결합할 수 있다.
대안 구체예에 따라, 본 발명은 전체 항체의 비글리코실화 항원-결합 단편(예, Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v) 항체 단편)을 포함한다. 추가 구체예에서, 본 발명은 전체 항체의 항원-결합 단편(예, Fab, Fab', F(ab')2 및 F(v) 항체 단편)을 포함한다
세포주
본 발명은 또한 본원에 개시된 아글리코실 항-CD154 항체를 생산하는 세포주를 제공한다. 아글리코실 hu5c8 항체를 생산하는 상기 세포주는 특허 절차 목적상 미생물 기탁의 세계적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정 하에, 2003년 1월 14일 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 10801 유니버시티가 ATCC에 기탁되어 ATCC 수탁 번호 PTA-4931로 지정되었다. 키메라 뮤린, 아글리코실 mu5c8 항체를 생산하는 제2 상기 세포주는 특허 절차 목정상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정 하에, 2003년 1월 14일 미국 20110-2209 버지니아주 마나사스 10801 유니버시티가 ATCC에 기탁되어 ATCC 수탁 번호 PTA-4934로 지정되었다.
치료 방법
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 또는 이의 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 피험체의 면역 반응을 억제할 수 있다. 항체, 항체 유도체 또는 약학 조성물은 억제 유효량으로 피험체에 투여한다.
항체, 항체 유도체 또는 약학 조성물의 "억제 유효량"이란, 이를 투여한 피험체에서의 CD154-CD40 상호작용을 억제하는 데 효과적인 임의의 양을 뜻한다. "억제량"을 결정하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 비제한적으로, 관련된 피험체의 형태, 피험체의 크기 및 전달된 치료제를 비롯하여 요인에 따라 다르다.
본 발명의 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 CD154 단백질 분자에 결합할 수 있다.
본 발명의 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 ATCC 수탁 번호가 PTA-4931인 세포주에 의해 생산되는 아글리코실 hu5c8에 의해 특이적으로 결합된 CD154 단백질에 결합할 수 있다.
본 발명의 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 ATCC 수탁 번호가 PTA-4931인 세포주에 의해 생산되는 아글리코실 hu5c8에 의해 특이적으로 결합된 CD154 에피토프에 결합할 수 있으며, 이 때 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체는 N298Q(EU Kabat 넘버링을 사용하면 N297)의 돌연변이인 것이 특징이다.
본 발명의 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 효과인자 수용체에 결합하지 않는다. 본 발명의 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 ATCC 수탁 번호가 PTA-4931인 세포주에 의해 생산된 아글리코실 hu5c8에 의해 특이적으로 결합된 CD154 단백질에 결합할 수 있으며, 이 때 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체 또는 약학 조성물은 효과인자 수용체에 결합하지 않는다.
본 발명의 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 혈전증을 일으키지 않는다. 본 발명의 더 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 ATCC 수탁 번호가 PTA-4931인 세포주에 의해 생산된 아글리코실 hu5c8에 의해 특이적으로 결합된 CD154 단백질에 결합할 수 있으며, 이 때 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체 또는 약학 조성물은 혈전증을 일으키지 않는다.
본 발명의 다른 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 CD154-CD40 상호작용을 억제하여 면역 반응을 억제할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 염증을 억제할 수 있다. 본 발명에 대해, 염증 반응은 적열상태, 붓기, 열 및 통증이 특징으로, 이는 부종과 모세관 팽창 및 포식성 백혈구 이동의 결과이다. 염증 반응의 몇몇 예는 관절염, 접촉 피부염, 과다-IgE 증후군, 염증성 장 질환, 알레르기성 천식 및 특발성 염증성 질환을 포함한다[Gallin, 1989]. 관절염의 몇몇 예는 류마티스성 관절염, 비류마티스성 염증성 관절염, 라임병과 관련된 관절염 및 염증성 골관절염을 포함한다. 특발성 염증성 질환의 몇몇 예는 건선 및 전신성 낭창을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 피험체의 이식 장기에 대한 거부반응을 억제할 수 있다.
본 발명의 더 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 피험체의 이식된 심장, 신장, 간, 피부, 췌도 세포 또는 골수에 의한 거부반응을 억제할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 피험체에서의 이식편 대 숙주 질환을 억제할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 피험체의 알레르기 반응, 예를 들어 고초열, 또는 페니실린 또는 다른 약물에 대한 알레르기를 억제할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 자가면역 질환을 앓는 환자의 자가면역 반응을 억제할 수 있다. 자가면역 질환의 예는, 비제한적으로, 류마티스성 관절염, 중증근무력증, 전신성 홍반성 낭창, 그레이브스 병, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 당뇨병, 염증성 장 질환, 크론병, 다발성 경화증, 건선 및 약물-유도성 자가면역 질환(예, 약물-유도성 낭창)을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 감염성 질환에서 유래된 자가면역 반응을 앓고 있는 환자의 자가면역 반응을 억제할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 라이터 증후군, 척추관절염, 라임병, HIV 감염, 매독 또는 결핵에서 유래된 자가면역 반응을 앓고 있는 환자의 자가면역 반응을 억제할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 피험체의 섬유증을 억제할 수 있다.
섬유증의 몇몇 예는 폐 섬유증 또는 섬유화 질환을 포함한다. 폐 섬유증의 몇몇 예는 성인 호흡 곤란 증후군에 의한 폐 섬유증, 약물 유도성 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증 또는 과민성 폐렴을 포함한다. 섬유화 질환의 몇몇 예는 C형 간염; B형 간염; 경화; 독성 손상에 의한 간경화; 약물에 의한 간경화; 바이러스 감염에 의한 간경화; 및 자가면역 질환에 의한 간경화를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 위장 질환을 억제할 수 있다. 위장 질환의 몇몇 예는 식도 운동장애, 염증성 장 질환 및 공피증을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 혈관 질환을 억제할 수 있다. 혈관 질환의 몇몇 예는 아테롬성 동맥 경화증 또는 재관류 손상을 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 T 세포 암(예, T 세포 백혈병 또는 림프종)을 앓고 있는 피험체의 T 세포 종양 세포의 증식을 억제할 수 있다. 상기 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체 또는 약학 조성물은 피험체의 T 세포 종양 세포의 증식을 억제하는 데 유효한 양으로 피험체에 투여할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 피험체 T 세포의 HTLV Ⅰ 바이러스에 의한 바이러스 감염을 억제할 수 있다. 상기 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 또는 약학 조성물은 바이러스 감염을 억제하는 데 유효한 양으로 피험체에 투여할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 ATCC 수탁 번호가 PTA-4931인 세포주에 의해 생산된 아글리코실 hu5c8에 의해 특이적으로 인지되는 단백질을 발현하는 피험체 중 종양 세포 또는 신생물 세포를 영상화할 수 있다. 피험체 중 종양 세포 또는 신생물 세포를 영상화하는 방법은,
종양 세포 또는 신생물 세포의 표면 상에 단백질과 항체 또는 항체 유도체 간의 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체, 또는 약학 조성물의 유효량을 피험체에 투여하는 단계; 및
형성된 임의의 항체/단백질 복합체 또는 항체 유도체/복합체를 영상화하여, 피험체 중 임의의 종양 세포 또는 신생물 세포를 영상화하는 단계
를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체, 또는 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물은 ATCC 수탁 번호가 PTA-4931인 세포주에 의해 생산된 아글리코실 hu5c8에 의해 특이적으로 인지되는 단백질을 발현하는 피험체 중 종양 세포 또는 신생물 세포의 존재를 검출할 수 있다. 피험체 중 종양 세포 또는 신생물 세포의 존재를 검출하는 방법은,
항체 또는 항체 유도체와 단백질 간의 복합체를 형성할 수 있는 조건 하에서, 아글리코실 항체, 항체 유도체 또는 약학 조성물의 유효량을 피험체에 투여하는 단계;
피험체로부터 임의의 비결합 영상화제를 제거하는 단계; 및
형성된 임의의 항체/단백질 복합체 또는 항체 유도체/복합체의 존재를 검출하는 단계로서, 이러한 복합체의 존재는 피험체 중 종양 세포 또는 신생물 세포의 존재를 나타내는 것인 단계
를 포함한다.
약학 조성물
본 발명은 본원에 기재된 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 한 구체예에서, 약학 조성물은 하나 이상의 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 유도체를 포함한다.
본 발명의 다른 구체예에서, 약학 조성물은 약학적 허용 담체, 보조제, 전달 비히클(delivery vehicle), 완충액 또는 안정화제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 약학적 허용 담체는 인산 완충 식염수, 생리 식염수, 물, 시트레이트/수크로스/Tween 제형 및 에멀션(예, 오일/물 에멀션)이다.
본 발명의 한 구체예에서, 약학 조성물을 미세캡슐 장치로 옮겨 넣어, 단백질에 대한 숙주 면역 반응을 감소 또는 방지할 수 있다. 항체 또는 항체 유도체는 또한 막(예, 리포솜) 내로 미세캡슐화하여 옮겨 넣을 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 약학 조성물은 주사가능한 살균 제제(예, 주사가능한 살균 수성 또는 유성 현탁액)의 형태일 수 있다. 이 현탁액은 적절한 분산제, 습윤제 및 현탁제를 사용하여, 종래 기술에 공지된 기법에 따라 제형화할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 약학 조성물은 경구, 국소 또는 정맥내로 전달할 수 있다.
본 발명의 더 특이적인 구체예에서, 경구 투여를 위한 약학 조성물은 적절한 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액으로 제형화된다. 경구 투여용 조성물의 고체 제형은 적절한 담체 또는 부형제(예, 옥수수 전분, 젤라틴, 락토스, 아카시아, 수크로스, 미정질 셀룰로스, 카올린, 만니톨, 이인산칼슘, 탄산칼슘, 염화나트륨 또는 알긴산)를 함유할 수 있다. 사용될 수 있는 붕해제는, 비제한적으로, 미정질 셀룰로스, 옥수수 전분, 나트륨 전분 글리콜레이트 및 알긴산을 포함한다. 사용될 수 있는 정제 결합제는 아카시아. 메틸셀룰로스, 소듐 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈(포비돈TM), 히드록시프로필 메틸셀룰로스, 수크로스, 전분 및 에틸셀룰로스를 포함한다. 사용될 수 있는 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 실리콘 유액, 활석, 왁스, 오일 및 콜로이드성 실리카를 포함한다.
본 발명의 더 특이적인 구체예에서, 국소 용도를 위한 약학 조성물은 적절한 연고로 제형화할 수 있다. 국소용 조성물의 제형 중 몇몇 예는, 활성 성분 및 다양한 지지물 및 비히클을 함유하는 연고, 용액, 크림, 로션, 팅크제 및 점적제를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 국소 반고체 연고 제형은 통상적으로 담체(예, 약학 크림 베이스) 중 활성 성분 농도 약 1∼20%(예, 5∼10%)를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 흡입 및 경피 조성물용 약학 조성물은 또한 쉽게 제조할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 물 또는 다른 수성 비히클 중에서 제조된 경구 투여용 약학 조성물의 액체 제형은 다양한 현탁제(예, 메틸셀룰로스, 알기네이트, 트래거캔스, 펙틴, 켈긴, 카라기난, 아카시아, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리비닐 알코올)를 함유할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물 중 액체 제형은 활성 화합물(들)과 함께, 습윤제, 감미료 및 착색제와 착향제를 함유하는, 용액, 에멀션, 시럽 및 엘릭시르를 포함할 수 있다. 약학 조성물의 다양한 액체 및 분말 제형은 치료되는 포유류 폐로의 흡입을 위해 통상적인 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 주사용 약학 조성물의 액체 제형은 다양한 담체(예, 식물성 오일, 디메틸아세트아미드, 디메틸포름아미드, 에틸 락테이트, 에틸 카르보네이트, 이소프로필 미리스테이트, 에탄올, 폴리올, 즉, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜 등)를 포함할 수 있다. 몇몇 구체예에서, 조성물은 시트레이트/수크로스/Tween 담체를 포함한다. 정맥내 주사를 위해 수용성 버전의 조성물을 드립법으로 투여하여, 항진균제 및 생리적 허용 부형제를 함유하는 약학 제형을 주사할 수 있다. 생리적 허용 부형제는, 예를 들어, 5% 덱스트로스, 0.9% 염수, 링거액 또는 다른 적절한 부형제를 포함할 수 있다. 적절한 불용성 형태의 조성물은, 장쇄 지방산의 에스테르(예, 에틸 올레이트)와 같은 약학적 허용 오일 베이스 또는 수성 베이스 중 현탁액으로서 제조 및 투여할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 약학 조성물은 약학적 허용 담체 중 아글리코실 항-CD154 항체 또는 이의 항체 유도체 약 0.1∼90 중량%(예, 1∼20% 또는 1∼10%)를 포함한다.
본 발명의 한 구체예에서, 각 약학 조성물 중 항체 또는 항체 유도체의 최적 백분율은 제형 그 자체 및 특이적인 병리에서의 바람직한 치료 효과 및 관련된 치료법에 따라 다양하다. 약학 제형은 종래 기술에 잘 성립되어 있다[Gennaro, 2000; Ansel, 1999; Kibbe, 2000]. 의학 분야의 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여, 피험체에 약학 조성물을 투여할 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 약학 조성물은 면역억제 화합물 또는 면역조절 화합물을 추가로 포함한다. 예를 들어, 상기 면역억제 화합물 또는 면역조절 화합물은, CD28을 통한 T 세포 공동자극 신호 전달을 방해하는 제제; 칼시네우린 신호 전달을 방해하는 제제; 코르티코스테로이드; 항-증식제; 및 비제한적으로 CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 및 RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTβ 및 VLA-4를 비롯하여, 면역 세포의 표면에 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 중 하나일 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 면역억제 화합물 또는 면역조절 화합물은 타크롤리무스, 시롤리무스, 마이코페놀레이트 모페틸, 미조루빈, 데옥시스퍼구알린, 브레퀴나 소듐, 레플루노마이드, 라파마이신 또는 아자스피란이다.
본 발명의 다른 구체예에서, 상기 화합물을 포함하는 항체, 항체 유도체 또는 약학 조성물은 용기, 패키지 또는 디스펜서 중에 단독으로, 또는 키트의 한 부분으로서 라벨 및 투여 설명서와 함께 포함될 수 있다.
투여 및 전달 경로
본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체 또는 이의 항체 유도체, 및 약학 조성물은 의학적으로 허용가능한 임의의 방식으로 피험체에 투여할 수 있다. 본 발명에 있어서 "투여"란, 당업자에게 알려져 있는 항체, 항체 유도체 또는 약학 조성물을 임의의 표준 방법으로 투여하는 것을 의미하는 것으로, 본원에 기재된 예로 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 표준 방법을 사용하여 정맥내, 피하, 복강내, 근내, 수질내, 심실내, 경막외, 동맥내, 혈관내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 포막내, 간장내, 척추골내, 종양내, 두개내, 장내, 폐내, 점막내, 자궁내, 설하 또는 염증 또는 종양 성장 부위에서 국소 주사하여 피험체에 투여할 수 있다.
본 발명의 몇몇 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 경구, 비강, 안, 직장 또는 국소를 비롯한 경로로 피험체에 투여할 수 있다.
더 특이적인 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 캡슐, 정제, 수성 현탁액 또는 용액 형태로 피험체에 경구 투여할 수 있다.
더 특이적인 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 크림, 연고 등을 도포하여 피험체에 국소 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 연무기, 건조 분말 흡입기 또는 정량식 흡입기를 사용하여 흡입 투여할 수 있다.
본 발명의 추가 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 서방성 투여로, 수술 도중 직접 적용되는 침식성 임플란트의 데포 주사와 같은 수단으로, 또는 주사 펌프 또는 생체적합성 서방성 임플란트의 피하 주사로 피험체에 투여할 수 있다.
더 특이적인 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 1개월, 3개월 또는 6개월 데포 주사가능성 또는 생분해성 물질 및 방법을 사용하여, 주사가능한 데포 투여 경로로 피험체에 투여할 수 있다.
더 특이적인 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은, 항체, 항체 유도체 또는 약학 조성물을 함유하는 경피성 패치를 피험체 피부에 적용하여, 일반적으로 패치당 1∼5시간 동안 이 패치를 피험체 피부와 접촉시키는 방식으로 피험체에 투여할 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 의학적으로 허용가능한 체중당 임의 투여량 및 임의의 투여 빈도로 피험체에 투여할 수 있다. 허용가능한 투여량은 약 0.01∼200 ㎎/㎏ 피험체 체중 범위를 포함한다.
추가 구체예에서, 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 매일 내지 두 달에 한번씩의 간격을 두고 반복적으로 피험체에 투여할 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 유도체 및 약학 조성물은 바람직하다면 하루에 다회 투여량으로 투여하여, 소정의 전체 하루 투여량을 얻을 수 있다. 치료법의 효과는 질병의 공지된 징후 또는 증상에 대해 환자를 모니터링하여 평가할 수 있다.
본 발명의 모든 구체예에 있어서, 소정의 효과를 얻기 위해 효과적인 본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체, 이의 항체 유도체 및 약학 조성물의 투여량 및 투여 속도는 다양한 요소, 예를 들어, 치료되는 질환의 특성, 피험체의 크기, 치료 목적, 사용된 구체적인 약학 조성물 및 담당 의사의 판단에 따라 다를 것이다.
본 발명의 아글리코실 항-CD154 항체, 이의 항체 유도체 및 약학 조성물은 피험체가 단기간 노출된 항원(예, 1일 치료로 투여되는 외인성 항원)에 대한 면역 반응을 방지하는 것과 같이, 특정 지시에 대해 단일 투여량으로 투여할 수 있다. 상기 요법의 예는, 치료제(예, 항원성 약학물, 알레르겐 또는 혈액 제제), 또는 유전자 치료 벡터와 함께 본 발명의 항체 또는 항체 유도체의 동시투여를 포함한다. 이식된 조직 또는 만성적으로 투여된 항원성 약학물에 대한 면역 반응을 조절하는 것과 같이, 항원이 만성적으로 존재한다는 징후가 있을 경우, 본 발명의 항체, 항체 유도체 또는 약학 조성물은 수일 또는 수주 내지 피험체의 수명에 이르는 의학적으로 처방된 기간 동안 간격을 두고 투여한다.
본 발명의 한 구체예에서, 상기한 방법으로 치료될 수 있는 피험체(들)는 동물이다. 바람직하게, 동물은 포유류다. 치료될 수 있는 포유류의 예는, 비제한적으로, 인간, 비인간 영장류, (래트, 마우스, 햄스터 및 기니 피그를 비롯한) 설치류, 소, 말, 양, 염소, 돼지, 개 및 고양이를 포함한다. 바람직하게, 포유류는 인간이다.
본 발명은 하기 실시예를 기초로 하여 더 잘 이해할 수 있다. 그러나 당업자는 논의된 구체적인 방법 및 결과가 본 발명의 구체예에 이어 충분히 더 설명되는 것처럼 본 발명을 단지 예시한다는 것을 쉽게 이해할 것이다.
상세한 실험 내용
하기 실시예는 본 발명의 방법 및 생성물을 예시한다. 당업자에게 명백한 분자 생물학 기술에서 일반적으로 만나게 되는 상술한 조건 및 변수의 적절한 변형 및 변경은 본 발명의 발명 사상 및 범위 내에 속한다.
실시예 1: 아글리코실 hu5c8 항체의 생성 및 평가
아글리코실 hu5c8 mAb의 발현 및 특성
hu5c8 mAb의 효과인자 기능을 감소시키기 위해, 중쇄 CH2 도메인 중 정준(canonical) N-연결 Asn 부위를 Gln 잔기로 변형시켜 아글리코실 형태를 만들었다.
경합성 결합 분석(competitive binding assay)으로, 글리코실화 hu5c8 mAb와 비교했을 때, 세포-표면 CD154에 대한 아글리코실 hu5c8 mAb의 결합 능력은 변하지 않았음을 입증하였다(도 1).
효과인자 기능의 감소는 가교 분석 포맷을 사용하여 시험관 내에서 측정하였다. 글리코실화 hu5c8 mAb와 비교했을 때, FcγRⅠ에 대한 아글리코실 hu5c8 mAb의 상대적 결합은 25배 감소하였다(도 2A). FcγRⅢ에 대한 아글리코실 hu5c8 mAb의 잔기 결합은 최대 5 ㎎/㎖의 농도에서 나타나지 않았지만, 동일한 분석 포맷에서 정상 글리코실화 hu5c8 mAb는 EC50이 50 ng/㎖였다(도 2B).
시노몰구스 원숭이에서의 아글리코실 hu5c8 mAb의 약동력학
2개의 독립 연구로부터의 hu5c8 mAb 및 아글리코실 hu5c8 mAb의 단일 투여량 20 ㎎/㎏을 1차 제거 속도 상수와 2개의 구획 모델(compartment model)을 사용하는 약동학적 분석에 적용한 뒤, 혈청 농도-시간을 도표화한다(WinNolin Professional Software v3.1, Pharsight Corp., Cary, NC). 도 3은 약동학적 도표를 포함하고, 표 1은 hu5c8 mAb 및 아글리코실 hu5c8 mAb에 대한 평균 약동학적 변수를 포함한다. hu5c8 mAb에 대한 청소율 및 분포 용적은 아글리코실 hu5c8 mAb보다 조금 더 컸다.
hu5c8 또는 아글리코실 hu5c8의 단일 정맥 투여량 20 ㎎/㎏을 시노몰구스 원숭이 A 에 투여한 뒤 평균 약동학적 변수

항체		 CmaxB
(㎍/㎖)		 ClC
(㎖hr/㎏)		 VssD
(㎖/㎏)		 t1/2 E
(d)
hu5c8 515(±16) 4.61(±0.70) 71(±10) 11.5(±2.5)
아글리코실
hu5c8 		869(±360) 3.10(±1.10) 47(±11) 11.8(±3.0)
A데이터는 산술 평균 ± 표준 편차로서, hu5c8 치료군에 대해 n = 3, 아글리코실 hu5c8 치료군에 대해 n = 4임을 보고하였다. B최대 혈청 농도, C전신 청소율, D안정 상태에서의 분포 용적, E최종 단계 혈청 반감기.
방법 - 실시예 1
1. 항체의 생성
hu5c8 mAb의 선별, 클로닝 및 인간화는 이미 설명하였다. 문헌 [Lederman, 1992] 및 [Karpusas, 2001]을 각각 참조한다. hu5c8 mAb 하이브리도마는 ATCC에서 입수할 수 있다(HB10916). 제조업자의 추천 프로토콜에 따라 Amersham-Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ, USA)에서 만든 키트를 사용하여, 독특한 부위 제거 돌연변이 생성에 의한 중쇄 글리코실화 부위 돌연변이 N298Q(EU 넘버링을 사용하면 N297)를 글리코실화 hu5c8 mAb에서 만들었다. 생성된 아글리코실 hu5c8은 NSO 골수종 세포에서 안정하게 발현시켜, 단백질 A 및 겔 여과 크로마토그래피로 정제하였다. 아글리코실 hu5c8 항체를 생산하는 세포주는 ATCC에서 입수할 수 있다(PTA-4931). SDS-PAGE 및 분석 겔 여과 크로마토그래피로 단백질이 소정의 이황화 결합된 4량체를 형성하였음을 입증하였다.
2. CD154 결합 분석
FACS계 경합성 결합 분석은 huCD154+ D1.1 세포(콜롬비아 대학의 Leonard Chess 박사로부터 받음, ATCC에서도 입수 가능함(CRL-10915)) 상에서 수행하였다. 세포 표면 CD154에 대한 비오티닐화 hu5c8 mAb 0.1 ㎎/㎖의 결합은 hu5c8 mAb 및 아글리코실 hu5c8 mAb의 적정과 경쟁하였다. 세포에 결합된 비오티닐화 hu5c8 mAb는 스트렙타비딘-피코에리테린(PE)으로 검출하였다(BD-PharMingen San Diego, CA, USA). 상대적인 결합 친화도는 4-변수 곡선 피트의 IC50 값으로 추정하였다.
3. CD154-FcγR 가교 분석
FcγR 결합 친화도는 항원과 FcγR 포함 세포 간의 "가교"를 형성하기 위해 항체 능력을 기초로 한 분석법을 사용하여 측정하였다(하기 참조). FcγRⅠ(CD64) 가교 분석은 4℃에서 밤새 PBS 중 재조합 가용성 인간 CD154(Biogen, Karpusas, 1995) 1 ㎎/㎖로 96-웰 Maxisorb ELISA 플레이트(Nalge-Nunc Rochester, NY, USA)를 코팅한 뒤, PBS 중 BSA 1%로 차단하여 수행하였다. 이어서 hu5c8 mAb(글리코실화 또는 아글리코실)의 적정을 30분간 37℃에서 CD154에 결합시키고, 플레이트는 세척하고, 형광으로 표지된 U937(CD64+) 세포의 결합을 측정하였다. U937 세포는 FBS 10%, HEPES 10 mM, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신이 함유된 RPMI 배지에서 성장시켜, 1:2로 분리한 뒤, IFNγ 1000 단위/㎖로 분석하기 전 하루 동안 활성화시켜 FcγRⅠ 발현을 증가시켰다.
FcγRⅢ(CD16) 가교 분석은 96-웰 조직 배양 플레이트에서 성장시킨 CD154-발현 차이니스 햄스터 난소(CHO) 세포(Biogen)의 단분자층을 사용하여 수행하는 동시에, CD16으로 형질감염된 형광으로 표지된 Jurkat 세포(Dana Farber Institute, Boston, MA, USA에서 받음)의 mAb-의존성 결합을 측정하였다. CHO-CD154+ 세포는 1x105 세포/㎖에서 96-웰 플레이트에 뿌리고, 투석된 FBS 10%, 메토트렉사트 100 nM, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신(모두 Gibco-BRL Rockville, MD, USA에서 입수한 제제임)이 함유된 α-MEM에서 컨플루언시(confluency)가 되도록 성장시켰다. FBS 10%, Geneticin 400 ㎎/㎖, HEPES 1O mM, 소듐 피루베이트, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신(모두 Gibco-BRL에서 입수한 제제임)이 함유된 RPMI에서 성장시킨 CD16+ Jurkat 세포를, 분석 수행 하루 전 1:2로 분리하였다.
FcγRⅠ 및 FcγRⅢ 수용체 둘 다에 대한 분석에서, Fc 수용체-포함 세포는 37℃에서 20분간 2',7'-비스-(2-카르복시에틸)-5-(및-6)-카르복시플루오레신 아세톡시메틸 에스테르(BCECF-AM)(Molecular Probes Eugene, OR, USA)로 표지하였다. 세척하여 과량의 BCECF-AM을 제거한 뒤, 표지된 세포 1x105를 37℃에서 30분간의 분석에서 항온배양하였다. 결합되지 않은 FcγR+ 세포는 수회 세척으로 제거하고, 여기 파장은 485 nm, 방출 파장은 530 nm인 Cytofluor 2350 Fluorescent Microplate Reader(Millipore Corporation Bedford, MA, USA) 상에서 플레이트를 읽었다.
실시예 2: 1차 및 2차 체액성 반응을 억제하는 아글리코실 hu5c8 항체
시노몰구스 원숭이 중 파상풍 톡소이드(TT) 항원에 대한 1차 체액성 반응의 억제
실시예 1에 따라 제조한 아글리코실 hu5c8 mAb 및 글리코실화 hu5c8 mAb 각각의 단일 투여량 20 ㎎/㎏의 TT에 대한 1차 항체 반응의 억제 능력은 별도 연구에서 평가하였다. 아글리코실 hu5c8 mAb 또는 글리코실화 hu5c8 mAb를 투여하면, 염수로 처리한 대조군에 비해, 전체 1차 면역 반응(EAUC)이 각각 70% 및 77% 감소하였다. 도 4에는 아글리코실 hu5c8 mAb가 이의 FcγR 결합 능력이 감소되었다 하더라도 글리코실화 hu5c8 mAb에 필적할 만한 정도로 1차 체액성 반응을 억제한다는 것을 입증하는, 42일에 걸친 TT 항체 역가가 그래프 형태로 나타나 있다.
인간화 mAb의 면역원성은 비인간 영장류 모델에서 이의 효능의 다른 척도이다. 아글리코실 hu5c8 mAb의 단일 투여량 20 ㎎/㎏로 처리한 4마리의 동물 중 3마리는, 약물이 혈청에서 제거된 직후인 82일 즈음, 아글리코실 mAb가 존재하는 도중의 체액성 반응의 억제와 일치하는 저역가의 항-hu5c8 항체를 발달시켰다(데이터는 도시하지 않음).
추가 1차 반응 억제의 척도로서, 서혜부 림프절 생검은 아글리코실 hu5c8 mAb로 처리한 동물 중 종자 중심("GC")이 존재할 경우 대조군에 비해 상당히 감소한다는 것을 나타냈다. 처리한 동물에서, GC는 피질의 20% 미만을 차지할 정도로 드물고 적다. 대조군 동물은 현저하게 반응성인 2차 여포에 대해 적당한 다중 GC를 가졌다. 관찰된 림프절 형성 부전의 적당한 정도에서 심각한 정도는 글리코실화 hu5c8 mAb로 사전 관찰한 것과 일치하였다(데이터는 도시하지 않음).
시노몰구스 원숭이에 대한 글리코실화 또는 아글리코실 hu5c8 mAb의 단일 투여량 20 ㎎/㎏을 투여한 뒤 혈액학적 변수의 전체 변화는 관찰되지 않았으며, 전체 림프구 수는 유의적으로 변하지 않았다. 또한, CD4/CD8 T 세포 비는 일정하게 유지되었는데, 이는 광범위한 CD4+ T 세포 고갈은 일어나지 않았음을 나타낸다(데이터는 도시하지 않음).
시노몰구스 원숭이 중 파상풍 톡소이드(TT) 항원에 의한 2차 체액성 반응의 억제
2차 면역 반응을 억제하기 위한 아글리코실 hu5c8 mAb의 단일 투여량 20 ㎎/㎏의 능력은, 상기한 아글리코실 hu5c8 mAb 연구 단계에서 정상적인 1차 반응을 보인 8마리의 염수 대조군 동물에 대해 2차 TT 공격을 가하여 평가하였다. 2차 TT 공격 전, 8마리의 동물 중 4마리에는 아글리코실 hu5c8 mAb 20 ㎎/㎏을 투여하고(1B 군), 4마리에는 염수를 투여하였다(1A 군).
2차 면역 반응은 그 개시가 더 빠른 것이 특징으로, 1차 면역 반응보다 강도가 더 세다. 개별 동물에 대해 1차 반응에 대한 2차 반응의 강도(EAUC 2차/EAUC 1차)를 계산하였다(표 2). 도 5는 전체 1차 및 2차 개별 면역 반응을 나타낸다. 개별 동물 간의 면역 반응 정도의 다양성이 상당하다는 것에 주목해야 한다. 평균적으로, 염수 대조군에서의 2차 TT 공격(1A 군)으로 항원에 대한 1차 반응보다 6.5배 더 높은 전체 항체 반응이 나타났지만, 아글리코실 hu5c8 mAb를 투여한 동물(1B 군)에서는 평균적으로 1차 반응에 비해 2.0배만 더 높은 전체 2차 항체 반응이 나타났다. 따라서, 아글리코실 hu5c8 mAb를 투여한 경우, 염수 대조군에 비해 2차 항체 반응의 강도는 70% 감소하였다.
시노몰구스 원숭이 중 파상풍 톡소이드에 대한 전체 1차 및 2차 면역 반응(E AUC )
치료군 1A 군(염수-염수)A 1B 군(염수-아글리코실 hu5c8)B
동물 # 1A-1 1A-2 1A-3 1A-4 1B-1 1B-2 1B-3 1B-4
1차 EAUC
(×105)		 2.1 1.1 2.0 0.3 3.9 0.9 1.6 2.6
2차 EAUC
(×105)		 8.7 5.2 9.6 6.0 8.3 1.5 3.3 5.5
강도 4.2 4.8 4.8 18.8 2.1 1.6 2.1 2.2
군 평균 강도 6.5 2.0
A1차 및 2차 TT 공격 전 염수를 투여한 1A 군 동물. 1차 TT 공격 전 염수를, 2차 TT 공격 전 아글리코실 hu5c8을 투여한 1B 군 동물.B 2차 반응의 강도는 2차 EAUC/1차 EAUC의 비로 나타낸다.
방법 - 실시예 2
1. TT에 대한 체액성 면역 반응
실시예 1과 동일한 원숭이를 사용하여, 2개의 독립 연구를 시노몰구스 원숭이에서 수행하였다. 각 연구로부터 혈청 샘플을 회수하고 면역아형검사용 전혈을 상온에서 유지시킨 당일, 분석을 수행하였다.
이 아글리코실 hu5c8 mAb 연구는 2개의 치료군을 포함하였다. 각각 4마리의 수컷 및 암컷으로 구성된 1군에는 1일째 염수를 투여하여, 미처리된 대조군으로 사용하였다. 각각 2마리의 수컷 및 암컷으로 구성된 2군에는 1일째 아글리코실 hu5c8 mAb 단일 투여량 20 ㎎/㎏을 정맥내 투여하였다(상기함). 처리 4시간 뒤, 모든 동물에 흡착된 TT를 5 Lf(limes flocculating)의 투여량으로 근내(IM) 투여하였다. 투여 후 1일째 및 최대 190일의 선택된 날에, 처리전 및 처리후의 혈액을 수거하였다. 림프절 생검 샘플은 15일째 수거하였다.
글리코실화 hu5c8 mAb 연구는 각각 3마리의 암컷을 포함하는 5개의 치료군으로 구성하였다. 1일째, 1군에는 염수를 투여하고(미처리된 대조군), 2∼5군에는 ATCC(CRL-10915)로부터 입수할 수 있는 글리코실화 hu5c8 mAb의 단일 투여량 0.2, 1, 5 또는 20 ㎎/㎏을 각각 투여하였다. 처리 4시간 후, 모든 동물에 흡착된 TT의 단일 IM 주사량 5 Lf를 투여하였다. 투여 후 1일째 및 최대 42일의 선택된 날에, 처리전 및 처리후의 혈액을 모든 군에서 수거하였다. 이들 2개의 독립 연구를 비교하기 위해, 선별된 혈청 샘플은 항-TT ELISA로 나란히 분석하였다.
상기한 아글리코실 연구에서 1차 TT 공격 후 230일째, 대조군 1을 2그룹으로 나누었다. 1A 군은 미처리된 대조군으로 사용하고, 1B 군은 아글리코실 hu5c8 mAb로 처리하여, 2차 면역 반응을 억제하는 이의 능력을 평가하였다. 동물은 다음과 같이 처리하였다: 1B 군에는 1일째 아글리코실 hu5c8 mAb 단일 투여량 20 ㎎/㎏을 정맥내 투여하였다. 1A 군에는 1일째 동일한 부피의 인산 완충 식염수를 정맥내 투여하였다. 처리 4시간 후, 모든 동물에 흡착된 TT의 IM 투여량 5 Lf를 투여하였다. 투여 후 1일째 및 최대 85일의 선택된 날에, 처리전 및 처리후의 혈액을 수거하였다.
2. 면역 반응의 평가
면역 반응은 비구획 분석을 사용하여 평가하였다. 계산된 면역 변수는 최대 역가 값(Emax), 이 최대 값에 이르는 시간(tmax) 및 항원 투여 시간에서 마지막 샘플링 시점까지 투여된 항체에 대한 전체 항체 반응(EAUC(0-last))을 포함하였다. 약동학적 분석은 1차 제거 속도 상수와 2개의 구획 모델을 사용하여 수행하였다(WinNolin Professional Software v3.1, Pharsight Corp., Cary, NC, USA). 결정된 약동학적 변수는 최대 혈청 농도(Cmax), 전신 청소율 속도(cl), 안정 상태에서의 분포 용적(Vss) 및 항체의 최종 단계 반감기(t1/2)를 포함한다. 산술 평균, 표준 편차 및 기하 평균을 비롯한 통계 분석은 마이크로소프트 엑셀 5.0 버전 소프트웨어(Microsoft Corp., Redmond, WA, USA)를 사용하여 수행하였다.
3. 시노몰구스 원숭이의 면역아형검사
림프구 면역아형검사는 2색의 전혈 염색 프로토콜에 이어 FACS 분석을 사용하여 수행하였다. 간단하게, EDTA로 처리한 전혈 100 ㎕는 하기의 표지된 mAb의 조합 중 하나를 사용하여 실온에서 20분간 항온배양하였다: CD20-FITC 클론 2H7(BD-Pharmingen San Diego CA, USA) 및 CD2-PE 클론 RPA-2.10(BD-Pharmingen), CD3-FITC 클론 SP-34(BD-Pharmingen) 및 CD4-PE 클론 OKT4(Ortho Diagnostic Systems Raritan, NJ, USA) 또는 CD3-FITC 및 CD8-PE 클론 DK-25(Dako Corporation Carpinteria, CA, USA). 적혈구는 1× FACS 용리액 2 ㎖로 용리시켰다(Becton-Dickinson Franklin Lakes, NJ, USA). 림프구는 1% 파라포름알데히드로 고정시키고, Cellquest software(Becton-Dickinson)가 장착된 FACScan으로 분석하였다. 전체 림프구 수는 CD2 및 CD20 양성 세포 모두를 합하여 측정하였다. B 세포는 CD20 양성 세포로 확인되었다. T 세포 서브세트는 CD3 및 CD4 또는 CD3 및 CD8에 대한 이중 양성으로 확인되었다. 전체 림프구, B 세포, CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포는 림프구 분석 게이트 내에서 양성 세포의 백분율로 나타냈다. CD4/CD8 비는 각 데이터 세트에 대해 계산하였다.
4. hu5c8 mAb 약동력학에 대한 ELISA
ELISA 플레이트(Nalge-Nunc Rochester, NY, USA)는 4℃에서 밤새 PBS 중 재조합 가용성 인간 CD154(Biogen, Karpusas 1995도 참조) 5 ㎍/㎖로 코팅하고, 2% 당나귀 혈청(Jackson ImmunoResearch Laboratories West Grove, PA, USA - Catalog # 017-000-121)으로 차단하였다. hu5c8 mAb 8∼500 ng/㎖에 대한 표준 곡선 및 혈청의 연속 희석도는 실온에서의 1시간 항온배양 중 기록하였다. 결합된 hu5c8 mAb는 당나귀 항-인간 IgG 양고추냉이 퍼옥시다제(HRP)(Jackson ImmunoResearch Laboratories West Grove, PA, USA)를 사용한 뒤, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘("TMB") Substrate Kit(Pierce Biotechnology Rockland, IL, USA)로 전개시켜 검출하였다. 플레이트는 Spectromax plate reader(Molecular Devices Sunnyvale, CA, USA)를 사용하여 450 nm에서 읽었다. Softmax Pro Software(Molecular Devices)를 사용하여, 희석된 혈청을 표준물의 4-변수 곡선 피트의 직선 부분에 대해 교정하였다.
5. 항-hu5c8 항체 반응을 측정하기 위한 ELISA
ELISA 플레이트(Corning-Costar)는 밤새 4℃에서 pH 9.6의 이탄산 완충액 중 아글리코실 hu5c8 mAb(상기함) 1 ㎍/㎖으로 코팅하고, 1% BSA로 차단하였다. 시노몰구스 원숭이 혈청의 연속 희석물은 실온에서 1.5시간 동안 항온배양하였다. 결합된 항-hu5c8 mAb는 비오티닐화 hu5c8 mAb 100 ng/㎖에 이어 스트렙타비딘-HRP(Pierce Biotechnology)를 사용하고, TMB Substrate Kit(Pierce Biotechnology)로 전개시켜 검출하였다. 플레이트는 Spectromax plate reader(Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서 읽었다. 항체 역가는 사전방혈 값에 대해 > 0.100 OD 단위를 산출한 최대 희석도의 역수로 정의하였다.
6. 항-TT 반응에 대한 ELISA
ELISA 플레이트(Corning-Costar)는 밤새 4℃에서 pH 9.6의 이탄산 완충액 중 TT(Massachusetts Public Health Biologic Laboratories Boston, MA, USA) 5 ㎍/㎖로 코팅하였다. 연속적으로 희석된 시노몰구스 혈청을 실온에서 2시간 동안 차단된 플레이트에 첨가하였다. 결합된 항-TT 항체는 래빗 항-원숭이 IgG-HRP(Cappel-Organon Teknika Durham, NC, USA)를 사용한 뒤 TMB Substrate Kit(Pierce Biotechnology)로 전개시켜 검출하였다. 플레이트는 Spectromax plate reader(Molecular Devices)를 사용하여 450 nm에서 읽었다. Softmax Pro software(Molecular Devices)를 사용하여 연속적으로 희석된 혈청 샘플 각각에 대한 4-변수 곡선 피트를 만들었다. 항체 역가는 사전방혈 값에 대해 0.100 OD 단위를 산출한 희석도의 역수로 정의하였다.
7. 혈액학
칼륨 EDTA 항-응고된 혈액 샘플을 수거하여 하기 혈액학 변수에 대해 매달 분석하였다: 전체 백혈구 수, 적혈구 수, 헤모글로빈 농도, 헤마토크리트(hematocrit) 값, 평균 미립자 부피, 평균 미립자 헤모글로빈, 평균 미립자 헤모글로빈 농도, 혈소판 수 및 혈액 도말 평가(분별화 포함).
8. 림프절 생검
아글리코실 hu5c8 mAb의 1차 TT-반응 연구를 시작한 지 15일째 서혜부 림프절을 모든 동물에서 수거하였다. 림프절 조직을 손질하여, 파라핀에 포매시키고, 얇은 조각으로 만든 뒤, 글래스 슬라이드 위에 올려놓았다. 슬라이드는 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 슬라이드는 종자 중심의 존재 여부에 대해 시각적으로 분석하고, 종자 중심의 크기 및 빈도를 기준으로 정량적으로 분석하였다.
실시예 3: 낭창 신염을 억제하는 아글리코실 muMR1 항체
전신성 홍반성 낭창("SLE")은 여성에게서 우세하게 나타나는 특발성 자가면역 질환으로, 다양한 병원성 항-핵 자가항체를 생산하는 것이 특징이다. 낭창 신염에서, 신장 손상은 신장 사구체에 축적되고 보완물 캐스캐이드를 활성화시키는 면역 복합체의 형성을 비롯하여, 세포성 및 체액성 면역 기작으로 조정되어, 사구체 신염을 일으킨다. 인간 및 마우스 SLE에서의 항-핵 자가항체는 B 세포 및 자가면역 Th 세포의 선별군 간의 동족 상호작용에 의해 생산된다는 것은 이미 입증되어 있다[Kalled 등, 1998].
입증된 낭창 신염을 앓는 (SWR x NZB)F1(SNF1) 마우스에 있어서, 5.5개월령에서 시작한 햄스터 MR1(haMR1)에 대해 항-CD154 mAb를 이용하여 장기간 치료하면 생존율이 증가되고, 심각한 신염의 발병률이 감소한다는 것은 이전 연구에서 밝혀졌다.
본 실시예에서는, 상기 모델 중 2개의 뮤린 키메라 MR1 mAb의 효능을 설명한다. 뮤린 키메라 MR1("muMR1")은 뮤린 IgG2a 종쇄 및 카파 경쇄 불변 도메인에 융합된 원래 햄스터 중쇄 및 경쇄 가변 도메인으로 구성된다. muMR1의 아글리코실 버전은 IgG2a Fc의 CH2 도메인 중 N-연결 글리코실화 부위의 돌연변이로 형성된다. 상기 두 항체를 사용하여, 항-CD154 mAb 효능에 대한 Fc 글리코실화의 역할을 낭창 신염에서 평가하였다.
본 실시예의 결과는 키메라 mAb, 즉 muMR1 및 아글리코실 muMR1 둘 다 자가항체 반응을 억제하는 능력을 가지고 있음을 입증한다. 구체적으로, 야생형인 모 햄스터 MR1과 유사하게, 뮤린 IgG2a 대조군 mAb로 처리한 마우스와 비교했을 때, 뮤린화된 항체 둘 다는 뮤린으로 처리한 마우스에서 신장 염증, 섬유증, 경화증 및 맥관염을 감소시키는 능력을 보유하였다.
muMR1 및 아글리코실 muMR1의 약동력학
muMR1 및 아글리코실 muMR1 항체의 약동력학 분석에서, 항체 둘 다 BALB/c 마우스의 혈청에 대해 동일한 동력학 프로필을 나타낸다는 것이 드러났다(도 6). 구체적으로, 정상 마우스 중 이들 키메라 분자의 반감기는 햄스터 MR1과 유사하게 ∼9일인 것으로 추정된다(데이터는 도시하지 않음).
자가항체 반응의 분석
muMR1 또는 아글리코실 muMR1으로 처리할 경우, 대조군 동물에 비해 dsDNA 및 ssDNA에 대한 자가항체 반응이 상당히 감소하였다(도 7 A 및 B).
조직학적 분석
신장의 조직학적 분석에서, 5마리의 이소타입 대조군 동물 중 3마리가 점수화 기법(scoring scheme)으로 약술된 다양한 특성을 특징으로 하는 심각한 말기 신증을 앓았다. 치료군의 동물은 예외 없이 명백하게 덜 심각한 질환을 앓았다. muMR1의 야생형(n = 11) 및 아글리코실(n = 12) 형태로 처리한 동물간의 차는 최소한이었지만, 야생형 형태에 대한 복합 조직학 점수가 다소 더 낮았다. 도 8은 신장에 대한 복합 조직학 점수 군을 나타낸다. 아글리코실 muMR1으로 처리한 동물 중, 대부분은 유의적인 세노관간질 변화가 거의 없거나 완전히 없는 사구체의 약한 초기 변화를 보였다. muMR1으로 처리한 모든 동물(n = 11)은 그 초기 변화가 약하며, 유의적인 세뇨관간질 변화는 없었다. 이 결과로, muMR1 및 아글리코실 muMR1 모두 낭창 신염의 조직학적 변화 특성을 방지할 때 효과적이라는 것이 명백해진다.
B 및 T 세포 영역에서 림프 팽창 정도는 처리한 동물의 비장 각각에 대한 조직학으로 평가하였다. 동결 절편 제조와 관련된 인공 산물로 인해 2차 여포의 확인은 어려웠다. 비장의 림프 영역 확장 정도 및 신장 질환 점수 간의 상관성은 명백하지 않다는 것이 밝혀졌다. 그러나, muMR1으로 처리한 동물과 비교했을 때, 세동맥주위림프구집(PALS) 확장 정도는 이소타입 대조군 및 아글리코실 muMR1-처리한 동물에서 명백하게 더 크다고 나타났다(데이터는 도시하지 않음).
신장 기능 분석
신장 기능을 평가하기 위해, 각 동물의 혈청 크레아티닌 및 혈중 요소 질소(BUN) 뿐 아니라 단백뇨(PU) 수준을 측정하였다. 키메라 muMR1 mAb 둘 다는 소변 중 단백질 함량으로 측정했을 때, SNF1 동물에서의 심각한 신염 발병을 지연시켰다. 대조군 동물과 비교했을 때, 항-CD154로 처리한 마우스는 6∼9개월 시점에서 더 낮은 PU 값을 보였다(도 9). 그러나, ∼10개월령에서, 모든 군이 신부전을 나타내는 PU 값을 보였다(도 9). 이 결과는, 항-CD154 처리가 단백뇨 발병을 지연시킨다는 것을 암시한다.
도 11은 SNF1 마우스의 혈청 중 크레아티닌 수준을 도시한 것이고, 도 10은 SNF1 마우스의 혈청 중 BUN 수준을 도시한 것이다. 대조군에서 동물은 7.25∼10.5개월령에서 혈청 크레아티닌 및 BUN 수준이 상승하였다. 대조적으로, 글리코실화 muMR1으로 처리한 마우스는, 연구 전체에 걸쳐 혈청 크레아티닌 또는 BUN이 실질적으로 증가 또는 감소하지 않고 안정된 수준을 유지하였다. 아글리코실 muMR1으로 처리한 동물은 약간의 증가가 관찰된 ∼9개월령까지 정상적인 혈청 크레아티닌 수준을 유지하였다. 유사하게, 이 군의 BUN 수준은 11개월령에서 상승하였다.
생존율 평가
항-CD154 mAb 처리는 SNF1 마우스의 생존율을 연장시켰다. 11개월령에서, 처리한 마우스 90% 이상이 살아있었지만, 대조군에서는 56%였다. 14개월까지, 모든 대조군 마우스는 죽었지만, muMR1 및 아글리코실 muMR1 마우스 각각의 86% 및 75%는 여전히 살아있었다(데이터는 도시하지 않음).
종합하면, muMR1 또는 아글리코실 muMR1으로 신염에 걸린 SNF1 마우스를 장기간 치료하면 생존율은 증가되고, 자가항체 생산은 감소하며, 신장 병리의 전개는 지연된다는 것이 이들 실험에서 입증되었다. 글리코실화 및 아글리코실 muMR1을 사용하여 얻은 다소 상이한 결과는 낭창에서 항-CD154 mAb의 효능에 대한 Fc 글리코실화의 역할이 작다는 것을 나타낸다. 따라서 아글리코실 항-CD154 mAb는 낭창 신염에 대해 효과적인 치료를 나타낸다.
방법 - 실시예 3
1. 마우스
BALB/c, SWR 및 NZB 마우스는 The Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입하였다. (SWRx NZB) F1(SNF1) 잡종은 통상적인 방벽 조건 하에 Biogen의 동물 실험실에서 사육하였다. 암컷 SNF1 마우스는 모든 낭창 연구에 사용되었다. BALB/c 마우스는 약동학("PK") 연구에 사용되었다.
2. 항체
아르메니아 햄스터 항-마우스 CD154 mAb를 생산하는 MR1 하이브리도마(ATCC # CRL-2580)는 미국 표준 균주(Rockville, MD)에서 구입하였다.
3. 치료 프로토콜
모든 주사는 복강내 경로로 제공하였다. 낭창 연구는 PI.17 muIgG2a를 투여한 SNF1 마우스의 대조군 및 키메라 항-CD154 mAb 중 하나를 투여한 처리한 SNF1 군으로 구성되었다. 주당 1회 mAb 단일 투여량 500 ㎍을 첫 6주간 제공한 뒤, 동물이 죽고 연구가 끝날 때까지 매달 500 ㎍을 단독 주사하였다. 연구는 동물이 ∼5.5개월령일 때 시작하고, 혈청 샘플은 매달 수거하였다. PK 연구를 위해, BALB/c 마우스에 muMR1 또는 아글리코실 muMR1의 단일 투여량 100 ㎍을 투여하고, 혈액 샘플을 4시간 후 1, 2, 4, 7, 9, 11 및 14일째 수거하였다.
4. ELISA 분석
혈청 중 키메라 MR1 mAb를 검출하기 위해, NUNC Maxisorp 플레이트는 밤새 4℃에서 재조합 가용성 뮤린 CD154 5 ㎍/㎖로 코팅하였다. 다음 날, 플레이트를 차단하고, 희석시킨 혈청을 첨가한 뒤, 양고추냉이 퍼옥시다제를 항-마우스 IgG2a(Southern Biotech)와 접합시키고, TMB 기질을 이용하여 발색도를 측정하였다. 반응은 2 N 황산으로 정지시키고, 플레이트는 Spectramax plate reader(Molecular Devices, CA) 상의 450 nm에서 읽었다. 항-단일 나선형 DNA(ssDNA) 및 항-이중 나선형 DNA("dsDNA") ELISA는 NUNC MaxiSorp 플레이트를 사용하여 수행하였다. 플레이트는 4℃에서 밤새 메틸화 BSA(Calbiochem Corp, La Jolla, CA) 10 ㎍/㎖로 코팅한 뒤, 25℃에서 2시간 동안 1등급 송아지 흉선 DNA(SIGMA, St. Louis, MO) 5 ㎍/㎖로 코팅하였다. 송아지 흉선 DNA는 사용하기 전 초음파 분해로 전단시킨 뒤, SI 뉴클레아제로 침지시켰다. 항-ssDNA 분석을 위해, 사용하기 전 DNA를 10분간 끓이고, 얼음 위에서 급속히 식혔다. 차단 후, 혈청 샘플의 연속 희석물을 첨가하여, 2시간 동안 실온에서 항온배양하였다. 자가항체는 염소 항-마우스 IgG-알칼라인 포스파타제(SIGMA, ST. LOUIS, MO)로 검출하고, 1 M 디에탄올아민 완충액 중 ρ-니트로페닐 포스페이트(SIGMA, ST. LOUIS, MO)로 발색도를 측정하였다. 플레이트는 405 nm에서 읽었고, 표준 곡선은 ssDNA 및 dsDNA 둘 다에 대해 특이적인 항-DNA mAb 205 또는 mAb 5c6의 공지된 양을 사용하여 얻었다. 항-DNA 역가는 배경값에 대해 0.1 OD 단위에서 희석도의 역수로 정의하였다.
5. 조직학
신장 및 비장 동결절편 및 포르말린 고정된 파라핀 포매된 조직을 염증성 침윤을 위해 헤마톡실린-에오신("H & E")으로 염색하였다. 신장은 또한 섬유증에 대해서는 Masson Trichrome 염색을, 기저막 농화를 위해서는 과요오드산 쉬프 염색("PAS")을 하였다. 염색된 조직 단편은 수의 병리학에 의해 점수화하였다. 낭창 신염의 조직학 등급에 대한 전체 점수는 사구체, 간질 및 세뇨관 변화에 기초하였다. 0∼4+ 등급은 시험한 구조(즉, 사구체, 혈관 등)의 관련율에 기초하여 나타낸 것으로, 다음과 같다: 0, 유의적인 손상 없음; 1+, 1∼30%의 구조가 영향을 받음; 2+, 30∼60%의 구조가 영향을 받음; 3+, > 60%의 구조가 어느 정도 영향을 받음; 4+, > 60%의 구조가 심각하게 영향을 받음.
6. 소변 및 혈청의 분석
각 마우스의 소변을 Albustix(Bayer Corp., Tarrytown, NY)로 매주 모니터링하여, 단백뇨("PU")를 측정하였다. 단백뇨 수준은 다음과 같이 점수화한다: 0.5+, 15∼30 ㎎/dl; 1+, 30 ㎎/dl; 2+, 100 ㎎/dl ; 3+, 300 ㎎/dl; 4+, > 2000 ㎎/dl. 크레아티닌 및 혈중 요소 질소(BUN)는 COBAS Chemistry Analyzer(Roche) 상에서 연구 전체에 걸쳐 간헐적으로 혈청 중에서 측정하여, PU 외의 신장 기능을 측정하였다.
실시예 4: 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)을 억제하는 아글리코실 muMR1 항체
면역화가 일어날 때 CD40 리간드를 차단하면 EAE의 전개가 억제된다는 것이 밝혀졌다[Samoilova,1997]. 본 실시예에서는 EAE를 억제하는 muMR1 및 아글리코실 muMR1 항체의 능력에 대해 분석하였다. 본 실시예에서는 또한 항-CD154 mAb에 의한 EAE의 억제가 활성 억제 기작과 관련이 있는지, 어느 범위까지 항체의 Fc-의존적 상호작용에 의존적인 기작에 의해 조정되는지를 평가하였다.
본 실시예의 결과는 아글리코실 muMR1 mAb가 야생형, 즉 임상 질환의 전개를 차단할 때 글리코실화 햄스터 MR1 mAb만큼 EAE의 억제제로서 효과적이라는 것을 입증한다. 더 구체적으로, 질환의 평균 최대 임상 점수 및 평균 심각도로 분석했을 때, 햄스터 MR1-처리군 중 1마리의 마우스만을 제외하고, 모든 MR1 mAb는 질환의 전개를 완전하게 억제하였다. 이 결과는 항-CD154 mAb에 의한 EAE에 대한 기작 기본 보호가 T 조절인자의 유도를 포함하고자 함은 아님을 암시한다. 이는 또한 mAb의 Fc-의존성 효과인자 기능이 임상 효능에 대해 주역할을 하는 것이 아니라, EAE의 자가면역 설정 시 억제의 기본 기작에 기여하는 것으로 보인다.
글리코실화 muMR1을 이용한 임상 EAE의 억제
도 12는 이소타입 대조군 PI.17로 처리한 마우스와 비교했을 때, 1차 펩티드 면역화 이후 muMR1으로 처리한 마우스에서 질환 증상이 전개되지 않았음을 나타낸다. muMR1으로 처리한 동물은 후속 80일의 기간 동안 임상 증상을 전개시키지 않았다(데이터는 도시하지 않음). 마우스를 완전 프로인트 보조제 중 유화시킨 PLP139-151로 재면역화할 경우, P1.17로 처리한 동물의 임상 증상의 심각성이 증가하였다. 0, 2 및 4일째 muMR1으로 처리한 마우스는 재공격(re-challenge) 후 P1.17로 처리한 마우스에서의 EAE 1단계 심각성과 동일한 수준의 EAE를 전개시켰다. 이 결과는 항-CD154 mAb 치료가 활성 억제로 끝나지 않았음을 입증한다. 본 발명자들은 또한, EAE-유도 및 muMR1을 이용한 치료 1 또는 3주 후 마우스에서 수거한 20 x 106개 비장 세포를 이동시키면, 나이브(naive) 수용체 마우스가 후속 활성 EAE 유도에 대해 저항성을 보이는지를 연구하였다. 이는 사실이 아니었다(데이터는 도시하지 않음)
아글리코실 muMR1을 이용한 임상 EAE의 억제
도 13 및 표 3은, 3 투여량으로서 200 ㎍을 투여할 경우, 대조군 Ig P1.17과 비교했을 때, muMR1 및 아글리코실 muMR1 mAb 둘 다 전체 후속 기간 도중 EAE에 대한 임상 징후를 억제하는 데 효과적이었음을 입증한다. 이에 대해, muMR1 및 아글리코실 muMR1 항체는 햄스터 MR1과 동등하게 효과적이었다(데이터는 도시하지 않음). EAE를 억제하는 항체 능력에 대해, 이들 항체의 더 적은 투여량의 투여로 인한 항체 간의 주요한 차이는 드러나지 않았다.
CNS 염증성 침윤물의 억제
항체가 중추신경계("CNS") 내 염증성 침윤물의 억제에서 상이한지를 평가하기 위해, 상이한 양의 항체(muMR1 및 아글리코실 muMR1, 또는 3 투여량 200 ㎍ 및 P1.17 대조군 Ig)로 처리한 4∼5마리의 마우스 별도 군을 이소타입 대조군 항체로 처리한 마우스의 질환 활성이 정점에 달한 16일째 치사시켰다.
글리코실화는 항-CD154의 억제 효과를 필요로 하지 않는다
항체 투여량
(㎍)		 N 발생률 평균 최대 점수 ± SD1 평균 누적 점수 ± SD1
P1.17 3×200 14 13 2.4±0.8 32.1±32.5
muMR1 3×200 13 0 0±0§ 0±0＃
muMR1 3×75 6 0 0±0§ 0.8±1.2＃＃
muMR1 3×25 6 3 1.4±1.6§§ 39.3±53.1
아글리코실 MR1 3×200 14 0 0±0§ 0±0＃
아글리코실 MR1 3×75 6 1 0.6±1.4§ 19.7±47.9
아글리코실 MR1 3×25 6 2 0.8±1.3§ 9±17.4＊
1. 질환 전개는 도 1에 나타나 있다. 군 평균을 계산하기 전, 각 개별 마우스에 대해, 전체 모니터링 기간 도중 최대 장애 점수 및 누적 점수를 별도로 평가하였다.
§ P1.17로 처리한 마우스와 비교했을 때, p < 0.0005; §§ P1.17로 처리한 마우스와 비교했을 때, p < 0.05
＃ P1.17로 처리한 마우스와 비교했을 때, p = 0.002; ＃＃ P1.17로 처리한 마우스와 비교했을 때, p < 0.02
＊ muMR1 25 ㎍과 비교했을 때, p = 0.05
표 4에 나타낸 바와 같이, 초기 질환 전개 단계 도중 CNS 내의 염증성 침윤물의 전개를 억제하는 항체의 능력에 대해, 이들 항체는 차이점을 보이지 않았다. EAE 징후가 없을 경우 마우스가 준임상적인 활성을 전개시키는지의 여부가 불확실하기 때문에, 군 당 6∼14마리 마우스로부터의 CNS-조직을 본 연구 종점(58일째)에서 분석하였다.
muMR1 200 ㎍으로 처리한 마우스와는 대조적으로, P1.17로 처리한 마우스 및 aglyMR1 200 ㎍으로 처리한 마우스 둘 다는 소뇌에 우세하게 국재화된 가벼운 염증성 침윤물이 존재함을 나타냈다(표 5). 그러나, 더 소량의 항체로 처리한 결과, aglyMR1이 이의 글리코실화 형태보다 더 보호적이지 않더라도 유사하다는 것이 드러났다. 이 결과는 상기 두 항체가 동등하게 임상 EAE의 전개를 억제한다는 것을 입증한다.
방법 - 실시예 4
1. EAE의 유도
암컷 SJL 마우스(10∼12개월령, Harlan)를 완전 프로인트 보조제(Difco, Detroit, MI) 중에 유화시킨 PLP139-151 50 ㎍으로 피하로 면역화시켰다. 3일 후, 마우스에 열로 사멸시킨 109개의 B. 파상풍 유기체(RIVM, Bilthoven, The Netherlands)를 정맥내로 주사하였다. 체중 및 장애 점수를 매일 평가하여 EAE 전개를 모니터링하였다. 이 점수 범위는 다음과 같다; 0: 무증상, 0.5: 꼬리 긴장도의 부분 소실, 1: 꼬리 긴장도의 완전 소실, 2: 사지 약화, 2.5: 부분 마비, 3: 후방 사지의 완전 마비, 3.5: 횡경막 및 후방 사지로부터의 완전 마비, 실금, 4: 빈사 상태, 내지는 5: EAE로 인한 사망.
CNS 침윤에 대한 항-CD154의 효과(16일째)

항체		 투여량
(㎍)		 침윤된 동물의 수
없음 산발성 보통 심각
P1.17 3×200 0 3 1 1
muMR1 3×200 3 1 0 0
muMR1 3×75 3 2 0 0
muMR1 3×25 1 1 3 0
아글리코실 MR1 3×200 5 0 0 0
아글리코실 MR1 3×75 4 1 0 0
아글리코실 MR1 3×25 2 1 2 0
CNS 침윤에 대한 항-CD154의 효과(58일째)

항체		 투여량
(㎍)		 침윤된 동물의 수
없음 산발성 보통 심각
P1.17 이소타입 200 3 8 3 0
muMR 200 12 1 0 0
muMR 75 3 3 0 0
muMR 25 0 5 1 0
아글리코실 MR1 200 8 5 1 0
아글리코실 MR1 75 4 2 0 0
아글리코실 MR1 25 4 2 0 0
2. 항체 생성
햄스터 항-마우스 CD154 mAb MR1의 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인을 RT-PCR로 하이브리도마에서 전체 RNA로부터 클로닝하였다. 햄스터/마우스 키메라 mAb에 대한 발현 벡터는, 표준 재조합 DNA 기법을 사용하여 각각 중쇄 및 경쇄의 가변 도메인 상에 유전자 조작된 뮤린 IgG2a 또는 뮤린 카파 불변 영역 cDNA(항-인간 CD154 mAb, 즉, 글리코실화 hu5c8로부터의 중쇄 및 경쇄의 전장 cDNA 클론에서 유래됨)로 구성하였다. muMR1으로 나타내는, 일시적으로 발현된 키메라 MR1 mAb가, 유세포 분석기 및 면역 침강에 의해, 햄스터 mAb의 CD154 결합성이 반복된다는 것을 입증하였다.
aglyMR1으로 나타내는 아글리코실 키메라 MR1은 Fc의 N-연결 글리코실화 부위 중 아스파라긴 잔기(Kabat EU 명명법으로는 N297)를 글루타민 잔기로 바꾸는 중쇄의 부위 지정 돌연변이로 구성하였다. 면역글로불린 경쇄 및 중쇄에 대한 CMV-IE 프로모터-구동성 탠덤 전사 카세트(CMV-IE promoter-driven tandem transcription cassette) 및 선택 마커로서의 글루타민 신테타제 유전자를 함유하는 안정된 발현 벡터는 muMR1 및 agly muMR1 IgG2a, 카파 mAb에 대해 구성하였다. 발현 벡터는 NSO 세포로 형질감염시키고, 안정된 클론은 무글루타민 배지에서 선별하여 분리하였다.
muMR1 및 aglyMR1은 단백질 A 세파로스 상에서 생물반응기 세포 상청액으로부터 친화도 정제한 뒤 Sephacryl 300 상에서 크기 배제 크로마토그래피로 정제하여 응집물을 제거하였다. 크로마토그래피 수지는 Amersham Pharmacia Biotech(Piscataway, NJ)에서 구입하였다. mAb는 SDS-PAGE에 의해 > 95% 의 순도를 보였고, 내독소 분석으로 이들 제제의 생체내 용도로의 안전성을 확인하였다. muMR1 및 aglyMR1은 생체내 분석에서 세포 표면 muCD154에 대해 동일한 상대적 친화도를 가지고, BALB/c 마우스 생체내에서 동일한 약동학적 반감기를 가진다는 것이 발견되었다(데이터는 도시하지 않음). 뮤린 IgG2a 이소타입 대조군 mAb, 즉 P1.17(ATCC ＃ TIB-10)은, 바이오겐과의 계약 하에 Protos Immunoresearch(Burlingame, CA)에서 복수로부터 정제한 단백질 A였다.
3. 항-CD154 항체의 전달
0, 2 및 4일째, 각 마우스에 다음을 또한 함유하는 PBS 200 ㎕를 복강내로 투여하였다: 1군 = PBS(대조군); 2군 = muMR1 200 ㎍; 3군 = 햄스터 Ig 200 ㎍(Ig 대조군); 4군 = 뮤린화 MR1 200 ㎍; 5군 = PI.17 IgG2a 대조군 200 ㎍; 6군 = 아글리코실 muMR1 200 ㎍.
몇몇 실험에서, 마우스는 완전 프로인트 보조제 중에 유화된 PLP139-151 50 ㎍으로 80일째 재면역화시켰다.
4. 질환 평가
하기 점수화 시스템에 따라, 56일의 기간 중 마우스의 무게를 매일 측정하고, 임상 활성에 대해 모니터링하였다: 0: 무증상, 0.5: 꼬리 긴장도의 부분 소실, 1: 꼬리 긴장도의 완전 소실, 2: 사지 약화, 2.5: 부분 마비, 3: 후방 사지의 완전 마비, 3.5: 횡경막 및 후방 사지로부터의 완전 마비, 실금, 4: 빈사 상태, 내지는 5: EAE로 인한 사망.
5. 조직학
각 개별 마우스의 뇌 조직 및 척수를 10% 포르말린으로 고정시키고, 파라핀에 포매시켰다. 각 개별 마우스에 대해, 3∼6개의 척수 단편(4 ㎛) 및 100 ㎛로 분리된 6개의 뇌 단편(각각은 소뇌, 대뇌, 뇌간 및 지주막하강을 포함함)을, 헤마톡실린으로 염색한 뒤, 염증성 침윤물의 범위에 대해 분석하였다.
각 개별 단편은 하기 스케일에 따라 점수화하였다: 0 = 침윤물 없음; 1 = 산발성, 가벼운 혈관주변 침윤(단편 당 2개 미만의 염증성 손상); 2 = 다병소, 가벼운 혈관주변 침윤; 4 = 다병소, 유연조직으로의 확산을 수반하는 심각한 혈관주변 침윤. 모든 단편의 평균값을 기준으로, 마우스를 없음, 산발성, 중간 또는 심각한 침윤으로 분류하였다.
6. 통계 분석
결과는 One-Way ANOVA에 이어, LSD-시험을 사용하는 post-hoc 분석법으로 분석하였다. P 값 < 0.05은 유의적인 것으로 간주하였다.
실시예 5: 도세포 이식을 억제하는 아글리코실 hu5c8 항체
글리코실화 hu5c8의 유도/유지-투여량 20 ㎎/㎏로 처리한 붉은털 원숭이는 신장 동종이식편 기능을 유지하며, 한 마리도 6개월의 투여 기간 중 거부반응을 보이지 않았지만, 신장 동종이식편을 투여한 미처리된 원숭이는 8일 내에 즉시 거부반응을 보였다는 것은 이전 연구에서 밝혀졌다[Kirk, 1999]. Kirk의 연구 그룹에 의한 관련 연구에서, 아글리코실 hu5c8은 이식 거부 치료에 대해 효과적이지 않음을 입증되었다.
Kirk의 발견과는 현저하게 대조적으로, 본 발명의 결과는, hu5c8 mAb의 비글리코실화 형태가 사실 다른 환경에서 이식 거부반응의 치료에 효과적일 수 있음을 입증한다.
붉은털 원숭이에서의 도세포 동종이식편 이식
글리코실화 hu5c8이 도세포를 생착시키고, 동종이식편의 생존을 유지할 수 있음은 이미 입증되어 있다[Kenyon, 1999].
이식 후 > 213, > 255, > 269 및 > 341일간 유도/유지 투여량 20 ㎎/㎏으로 처리한 4마리의 붉은털 원숭이에 인슐린을 개별 투여하였다. 이 연구 결과로, 도세포 동종이식편을 투여한 미처리된 대조군 원숭이가 8일까지 급성 거부반응을 나타냈는데, 11∼14일까지의 지속적인 고혈당 및 c-펩티드 생산(내인성 인슐린 생산의 생성물)의 결핍이 그 증거였다(데이터는 도시하지 않음).
미처리된 대조군 동물과는 대조적으로, 도 14는 아글리코실 hu5c8의 유도/유지 투여량으로 처리한 2마리의 붉은털 원숭이 중 한 마리의 치료가 성공적임을 나타낸다(상기함). 원숭이를 인슐린으로 처리하고 아글리코실 hu5c8 처리를 계속했을 경우, 두 원숭이 모두 7일째 고혈당과 초기 거부반응을 겪었지만, 2마리의 원숭이 중 한 마리는 28일째 c-펩티드의 존재로 측정된 동종이식편의 부분 기능을 나타냈으며(개방형 다이아몬드), 45일째까지 이를 유지하였다.
이들 결과는, 비글리코실화 항-CD154 mAb가 이식 환경의 치료법으로 유용하다는 것을 암시한다. 그러나, 이식 중의 면역 반응은 강한 반응, 즉, 체액성, 세포성 및 염증성 면역 반응이기 때문에, 아글리코실 항-CD154 항체는 면역억제 화합물 또는 면역조절 화합물과의 조합으로 전달될 때 가장 효과적일 수 있다. 예를 들어, CD28을 통한 T 세포 공동자극 신호 전달을 방해하는 제제; 칼시네우린 신호 전달을 방해하는 제제; 코르티코스테로이드; 항-증식제; 및 비제한적으로 CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 및 RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTβ 및 VLA-4를 비롯하여, 면역 세포의 표면에 발현된 단백질에 특이적으로 결합하는 다른 항체가 있다.
방법 - 실시예 5
1. 도세포 동종이식편 이식
본 연구는 상기한 바와 같이 수행하였다[Kenyon, 1999]. 요컨대, 붉은털 원숭이의 동종반응성 도너-수용체 쌍은 각각 양성 혼합된 림프구 배양물을 기준으로 선별하였다. 0일째, 수용자에 완전 췌장 절제 및 간문맥내 동종이계 도세포 이식을 시행하였다.
2. 항체 치료
-1, 0, 3, 10 및 18일째 20 ㎎/㎏으로 구성된 유도량 및 28일째부터 시작하여 매달 투여량 20 ㎎/㎏로 구성된 유지량을 사용하여 투여를 수행하였다.
3. 이식 기능 평가
도세포 이식 기능은 단식 및 식후 혈당 수준을 통해 매일 모니터링하였다. 도세포 기능 부전(1차 무기능 또는 급성 거부반응)은 자극된 c-펩티드 생산(내인성 인슐린 생성물) 및 단식의 부재로 정의하였다. 1차 무기능은 이식 직후 기간에서 기능하기 위한 이식된 조직의 기능 부전으로 정의되고, 지속적인 고혈당 및 불안정한 혈당 조절이 그 특징이다. 급성 거부반응은 단식시 글루코스 > 100 ㎎/dL 및 식후 혈당 > 150∼175 ㎎/dL로 정의하였다. 전체 이식 기능은 정상적인 혈당 수준을 유지할 필요가 있는 외인성 인슐린의 양을 모니터링하여 평가하였다.
실시예 6: 항-CD154로 조절된 T-세포 동종반응성을 방지하기 위한 비글리코실화 hu5c8(항-CD154) 항체의 용도
T 세포 상에서 CD154를 표적으로 하는 모노클로날 항체는 시험관내 뿐 아니라 생체내 동종반응성을 부분적으로 방지하는 것으로 나타났다. 그러나, 항-CD154 mAb의 억제 활성이 자극성 CD40-CD154 상호작용의 차단, 또는 대안으로, CD154를 통한 억제 신호의 직접적인 전달에 좌우되는지의 여부는 확실하지 않다.
시험관내 인간 T 세포 동종반응성에 대한 CD154의 자극(즉, CD154를 통한 억제 신호의 직접적인 전달)과는 반대로 자극성 CD40-CD154 상호작용의 차단 효과를 평가하기 위해, 비분획화된 PBMC 또는 정제된 CD4+ 세포를 인간화 항-CD154 mAb(hu5c8, Biogen Inc., MA, USA)의 존재 시 가용성이거나 배양 웰에 고정된 동종이계의 HLA-불일치된 자극성 세포(CD40 양성 세포)와 함께 배양하였다. 대부분의 차단 실험은 Fc-효과인자 기능을 감소시키는 유전자 조작된 가용성 항-CD154(비글리코실화 hu5c8)의 변형체로 수행하여, CD154를 교차결합하는 능력을 감소시킬 수 있다. 본 실시예에서 사용된 비글리코실화 hu5c8은 본 출원서에 기재된 아글리코실 hu5c8 mAb와 동일한 것이다. 예를 들어, 상기 실시예 1, ¶ 15 및 ¶ 83을 참조한다. 가용성이지만 코팅되지 않은 항-CD154 항체는 우선 혼합된 림프구 배양물("MLC") 중 동종이계 T 세포 증식을 억제하였다(억제율 40±23% 대 3±18%, n = 4). 유사하게, 2차 MLC(n = 5 실험) 중 동종항원-특이적인 T 림프구의 증식은 (가용성 항체와) CD154 차단을 감작하여 억제하는 반면, (항체로 코팅된) CD154 자극에 의해 증가하였다. 또한, 코팅된 항-CD154 항체에 의한 자극은 동종항원-특이적인 CTL 효과인자의 생성을 강하게 강화시키지만, CTL은 CD154 차단에 영향을 받지 않았다.
항-CD154의 자극 활성이 B7-CD28 공동자극 상호작용을 필요로 하는지를 시험하기 위해, CD28에 대한 B7 분자의 결합을 방지하는 분자인 CTLA4-Ig의 존재 하에 MLC를 수행하였다. CTLA4-Ig의 존재시 감작은 1차 및 2차 MLC에서 각각 75±14%(n = 3) 및 64±28%(n = 6)로 동종항원-특이적인 T 림프구의 증식을 억제하고, 48±23%(n = 2)로 CTL 생성을 저해하였다. 코팅된 항-CD154 항체의 신호 전달은 1차(58±0.6%, n = 2) 및 2차(61±49%, n = 6) MLC 둘 다에서 동종항원-특이적인 T 세포의 잔여 CD28-독립적 증식을 유의적으로 증가시켰지만, 이는 CTLA4-Ig-유도성 억제를 완전히 종료시키지 않았다. 그러나 CTL의 생성 시 CTLA4-Ig의 억제 효과는 (코팅된 항-CD154 항체를 통한) CD154 자극에 의해 종료되었다. 동종반응성 T 세포 상에서의 CD25, HLA-DR 및 CD95의 발현은, CTLA4-Ig가 있거나 없는 대조군 배양물과 비교했을 때, CD154(n = 2)의 자극으로 강하게 증가하였다.
본 발명자들의 데이터는, 항-CD154 항체가 배양 플레이트에 고정될 때 T 세포 동종반응성을 차단하기보다 강화시킬 수 있음을 나타낸다. 가용성 비글리코실화 hu5c8 mAb에 의한 CD154의 차단은 생체내에서의 T 세포 활성화를 강화시킬 수 없어 생체내에서 유리할 수 있으며, 상기 발견을 기초로 이식 실험 모델에서 생체내 동종항원 T 세포 반응을 감소시키기 위해 단독으로 또는 다른 공동자극 경로를 차단하는 분자와 조합할 경우 효과적일 수 있다.
본 발명의 발명 사상을 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변화 및 변형이 본 발명의 바람직한 구체예에 대해 만들어질 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 상기 모든 변경은 본 발명의 범위 내에 속해야 한다.
Figure 112005072492182-pct00001
Figure 112005072492182-pct00002
Figure 112005072492182-pct00003
Figure 112005072492182-pct00004

Claims (68)

  1. 항체의 Fc 부분의 CH2 도메인 중 보존된 N-연결 글리코실화 부위에서의 변형이 특징인 아글리코실(aglycosyl) 항-CD154 항체 또는 이의 항체 단편으로서,
    이때, 상기 변형이 N298 (EU Kabat 넘버링을 이용하면 N297)의 돌연변이를 포함하고 이러한 돌연변이가 상기 부위에서의 글리코실화를 방지하며,
    상기 항체 또는 이의 단편은 다량체 항체, 헤테로이량체 항체, 이특이성 항체 (bispecific antibody), 반이량체 항체, 4가 항체, 단일쇄 항체, 중쇄 또는 경쇄 또는 중쇄와 경쇄가 가교된 항체, Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단편 또는 F(v) 단편인 것인,
    아글리코실 항-CD154 항체 또는 이의 항체 단편.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 변형은 N298Q(EU Kabat 넘버링을 사용하면 N297)의 돌연변이를 포함하는 것인 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 단편.
  4. 삭제
  5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 효과인자 수용체 (effector receptor)에 결합하지 않는 것인 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 단편.
  6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 뮤린(murine) 항체, 키메라 항체, 영장류화 항체, 인간화 항체 및 완전한 인간 항체로 구성된 군에서 선택되는 것인 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 단편.
  7. 삭제
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 항체는 ATCC 수탁 번호가 PTA-4931인 세포주에 의해 생산된 아글리코실 hu5c8(인간화되고 아글리코실화된 항-CD154 항체)인 것인 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 단편.
  9. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 항체 또는 항체 단편은 치료제, 영상화제 또는 검출가능한 마커에 접합되는 것인 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 단편.
  10. 피험체의 염증 반응, 이식 거부 반응, 이식편 대 숙주 질환, 자가면역 반응, HTLV I 바이러스에 의한 T 세포의 바이러스성 감염, T 세포 종양 세포의 증식, 건초열, 약물 유도성 폐 섬유증, 특발성 폐 섬유증, 과민성 폐렴, C형 간염, B형 간염, 간경화, 독성 손상에 의한 간경화, 약물에 의한 간경화, 바이러스 감염에 의한 간경화, 자가면역 질환에 의한 간경화, 염증성 장 질환, 공피증 또는 재관류 손상을 억제하기 위한 제1항의 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 면역억제 화합물, 면역조절 화합물 또는 추가 치료제를 더 포함하는 약학 조성물.
  12. 제1항 또는 제3항에 따른 아글리코실 항-CD154 항체 또는 항체 단편을 생산하는 세포주.
  13. 제12항에 있어서, 세포주는 아글리코실 hu5c8(인간화되고 아글리코실화된 항-CD154 항체)(ATCC 수탁 번호 PTA-4931)을 생산하는 것인 세포주.
  14. 제10항에 있어서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 단편 또는 약학 조성물은 CD40에 대한 CD154의 결합을 억제하는 것인 약학 조성물.
  15. 제10항에 있어서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 단편 또는 약학 조성물은 아글리코실 hu5c8(인간화되고 아글리코실화된 항-CD154 항체)(ATCC 수탁 번호 PTA-4931)이 특이적으로 결합하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인 약학 조성물.
  16. 제10항에 있어서, 염증 반응은 관절염, 접촉 피부염, 과다-IgE 증후군, 염증성 장 질환, 알레르기성 천식, 건선 및 전신 홍반성 낭창으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 관절염은 류마티스성 관절염, 비류마티스성 염증성 관절염, 라임병과 관련된 관절염 및 염증성 골관절염으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  18. 삭제
  19. 제10항에 있어서, 이식 거부반응은 이식된 심장, 신장, 간, 피부, 췌도 세포 또는 골수와 관련된 것인 약학 조성물.
  20. 삭제
  21. 제10항에 있어서, 자가면역 반응은 감염성 질환, 라이터 증후군, 척추관절염, 라임 병, HIV 감염, 매독 또는 결핵에서 유래하는 것인 약학 조성물.
  22. 제10항에 있어서, 자가면역 반응은 류마티스성 관절염, 중증근무력증, 전신성 홍반성 낭창, 그레이브스 병, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 용혈성 빈혈, 당뇨병, 염증성 장 질환, 크론병, 다발성 경화증, 건선, 약물-유도성 자가면역 질환 및 약물-유도성 낭창으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  23. 삭제
  24. 삭제
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 제10항, 제11항, 제14항 내지 제17항, 제19항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 아글리코실 항-CD154 항체는 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 뮤린 항체, 키메라 항체, 영장류화 항체, 인간화 항체 및 완전한 인간 항체로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  29. 제10항, 제11항, 제14항 내지 제17항, 제19항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 아글리코실 항-CD154 항체는 다량체 항체, 헤테로이량체 항체, 반이량체 항체, 4가 항체 및 이특이성 항체로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  30. 제10항, 제11항, 제14항 내지 제17항, 제19항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 아글리코실 항-CD154 항체 또는 이의 항체 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 약학 조성물은 정맥내, 피하, 복강내, 근내, 수질내, 심실내, 경막외내, 동맥내, 혈관내, 관절내, 활액낭내, 흉골내, 포막내, 간장내, 척추골내, 종양내, 두개내 주사 투여; 장내, 폐내, 점막내, 자궁내, 설하, 경구, 비강, 안, 직장 또는 국소적 경로 투여; 또는 염증 또는 종양 성장의 부위에서 국소적으로 피험체에 투여하기 위해 제제화되는 약학 조성물.
  31. 제10항, 제11항, 제14항 내지 제17항, 제19항, 제21항 및 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 아글리코실 항-CD154 항체, 항체 단편, 또는 상기 항체 또는 항체 단편을 포함하는 약학 조성물은 서방성 투여로 피험체에 투여하기 위해 제제화되는 약학 조성물.
  32. 제11항에 있어서, 면역조절 화합물 또는 면역억제 화합물은
    (a) CD28을 통한 T 세포 공동자극 신호 전달을 방해하는 제제;
    (b) 칼시네우린(calcineurin) 신호 전달을 방해하는 제제;
    (c) 코르티코스테로이드,
    (d) 항-증식제;
    (e) 비제한적으로 CD45, CD2, IL2R, CD4, CD8 및 RANK FcR, B7, CTLA4, TNF, LTβ 및 VLA-4를 비롯하여, 면역 세포의 표면에 발현된 단백질에 특이 적으로 결합하는 항체;
    (f) 타크로리무스;
    (g) 시로리무스; 마이코페놀레이트 모페틸;
    (h) 미조루빈;
    (i) 데옥시스퍼구아린;
    (j) 브레퀴나 소듐(brequinar sodium);
    (k) 레플루노미드;
    (l) 라파마이신; 및
    (m) 아자스피란
    으로 구성된 군에서 선택되는 것인 약학 조성물.
  33. ATCC 수탁 번호가 PTA-4931인 세포주에 의해 생산된 아글리코실 hu5c8 (인간화되고 아글리코실화된 항-CD 154 항체)에 의해 특이적으로 인지되는 단백질을 발현하는, 피험체 중 종양 세포 또는 신생물 세포를 영상화하는 키트로서,
    (a) 종양 세포 또는 신생물 세포의 표면상에 항체 또는 항체 단편과 단백질간의 복합체를 형성하는 조건에 대한 지시서, 및 제1항 또는 제3항에 따른 아글리코실 항 CD154 항체 또는 이의 항체 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 약학 조성물; 및
    (b) 피험체에 형성된 임의의 항체/단백질 복합체 또는 항체 단편/복합체를 영상화하는 지시서
    를 포함하는 키트.
  34. ATCC 수탁 번호가 PTA-4931인 세포주에 의해 생산된 아글리코실 hu5c8(인간화되고 아글리코실화된 항-CD 154 항체)에 의해 특이적으로 인지되는 단백질을 발현하는, 피험체 중 종양 세포 또는 신생물 세포의 존재를 검출하는 키트로서,
    (a) 제1항 또는 제3항에 따른 아글리코실 항 CD154 항체 또는 이의 항체 단편, 또는 상기 항체 또는 이의 항체 단편을 포함하는 약학 조성물 및 상기 단백질;
    (b) 피험체로부터 임의의 비결합 영상화제를 제거하는 지시서; 및
    (c) 형성된 임의의 항체/단백질 복합체 또는 항체 단편/복합체의 존재를 검출하는 지시서로서, 이러한 복합체의 존재는 피험체 중 종양 세포 또는 신생물 세포의 존재를 나타내는 것인 지시서
    를 포함하는 키트.
  35. 삭제
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KR1020057023868A 2003-06-13 2005-12-12 아글리코실 항-ｃｄ154(ｃｄ40 리간드) 항체 및 이의 용도 KR101262374B1 (ko)

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