HU219267B - Dna fragments coding for neisseria meningitidis transferrin receptor subunits and method for their preparation - Google Patents

Abstract

A találmány tárgya izolált DNS-fragment, amely N. meningitidistranszferrinreceptor Tbp2 alegységét és/vagy egy szignálpeptidet vagyezek bármelyikével legalább 75%-os homológiát mutatóaminosavszekvenciájú peptidet, polipeptidet vagy fehérjét kódol, ésamely fragment expressziós terméke alkalmas arra, hogy N. meningitidisIM2394-es vagy IM2169-es törzsének transzferrinreceptora elleniantiszérum felismerje. A találmány tárgya továbbá a DNS-fragmentettartalmazó expressziós kazetta, az azzal transzformált gazdasejt,eljárás a peptid, polipeptid vagy fehérje előállítására, továbbá aDNS-fragmentet tartalmazó vektort, és a peptidet, polipeptidet vagyfehérjét tartalmazó gyógyászati készítmények. A találmány szerintimegoldás Neisseria meningitidis okozta agyhártyagyulladás kezelése ésmegelőzése területén alkalmazható. ŕ

Description

A jelen találmány tárgyát a Neisseria meningitidis DNS-ffagmentjei képezik, amelyek a transzferrinreceptor alegységeit kódolják, valamint eljárás az egyes alegységek előállítására rekombináns módszerekkel.

A agyhártyagyulladások virális vagy bakteriális eredetűek. A fő bakteriális kórokozók a Neisseria meningitidis és a Haemophilus influenzáé, amelyek a bakteriális eredetű agyhártyagyulladásoknak körülbelül 40-50%-át okozzák.

Franciaországban a Neisseria meningitidis által okozott agyhártyagyulladások száma évente 600 és 800 között változik. Az Amerikai Egyesült Államokban az esetek száma évente 2500 és 3000 között van.

A Neisseria meningitidis fajt szerocsoportokra osztják, a kapszuláris poliszacharid természetétől függően. Jóllehet körülbelül tizenkét szerocsoport létezik, az agyhártyagyulladásos esetek 90%-át három szerocsoport okozza, az A, B és C.

A kapszuláris poliszacharidokon alapuló hatékony vakcinák léteznek a Neisseria meningitidis A, B és C szerocsoportjai által okozott agyhártyagyulladások megelőzésére. Ezek a poliszacharidok önmagukban egyáltalán nem, vagy csak nagyon gyengén immunogének a két év alatti gyermekekben, és nem indukálják az immunológiai memóriát. Ezek a hátrányok azonban leküzdhetők, ha ezeket a poliszacharidokat egy hordozó fehérjével konjugáljuk.

Ezzel szemben a Neisseria meningitidis B csoportjának poliszacharidja egyáltalán nem, vagy csak csekély mértékben immunogén emberben, függetlenül attól, hogy konjugált formában van-e vagy sem. Ezért nagyon kívánatosnak tűnne egy olyan vakcina kidolgozásának a B szerocsoportba tartozó Neisseria meningitidis által okozott agyhártyagyulladás fertőzés ellen, amely nem poliszacharidalapú.

Ebből a célból a Neisseria meningitidis külső membránjában levő számos fehérje felhasználását javasolták már. Ez főleg a humán transzferrin membránreceptor.

Általában a baktériumok nagy többségének vasra van szükségük a növekedésükhöz, és ezért ennek a fémnek a megszerzésére specifikus rendszereket dolgoztak ki. Különösen ami a Neisseria meningitidist illeti, amely szigorúan patogén emberre, a vas csak a humán vastranszport-fehéqékből, például a transzferrinből és a laktoferrinből származhat, mivel a szabad állapotban levő vas mennyisége az emberben elhanyagolható (10 ¹⁸ mol/1 nagyságrendben van), és ezért egy esetben sem teszi lehetővé a bakteriális növekedést.

Tehát a Neisseria meningitidisnek humán transzferrin- és humán laktoferrinreceptora van, amely lehetővé teszi számára, hogy megkösse ezeket a fémkelátképző fehérjéket, majd ezt követően a növekedéséhez szükséges vasat befogja.

A Neisseria meningitidis B16B6 törzs transzferrinreceptorát Schryvers és munkatársai izolálták és tisztítottá (WO 90/12591) egy membránkivonatból. Ez a fehérje, a tisztítást követően lényegében két típusú polipeptidet tartalmaz: egy nagy látszólagos molekulatömeggel (körülbelül 100 kDa) rendelkező polipeptidet, és egy alacsonyabb látszólagos molekulatömeggel rendelkező polipeptidet, az SDS-poli(akrilamid) gélelektroforézis alapján.

A Schryvers által azonosított tisztított terméket az önkényes meghatározás alapján és a jelen találmány céljaira transzferrinreceptomak nevezzük és az alkotóelemeit, alegységeit is. Az alább következő szövegben a nagy molekulatömegű és a kis molekulatömegű alegységek jelzése Tbpl, illetve Tbp2.

A Schryvers és munkatársai által közölt tisztítási eljárás azonban nem alkalmazható a transzferrinreceptor nagy mennyiségben való tisztítására. Ennek a receptornak tisztított formában, ipari méretekben történő előállítása szükségszerűen magában foglalja egy heterológ expressziős rendszer alkalmazását.

Ebből a célból a találmány tárgyát olyan DNS-fragmentek képezik, amelyek a Neisseria meningitidis transzferrinreceptor alegységeit kódolják.

Továbbá Schryvers és munkatársai úttörő munkája óta felfedezték, hogy valójában legalább két különböző típusú törzs létezik, amelyek a transzferrinreceptoraik összetételében különböznek. Ezt úgy igazolták, hogy több tucat, különböző eredetű Neisseria meningitidis törzs membránkivonatát vizsgálták. Ezeket a membránkivonatokat először SDS poli(akrilamid) gélelektroforézisnek vetették alá, majd nitro-cellulóz-membrán membránra vitték át elektromos áram segítségével. A nitro-cellulóz-membránokat az alábbi körülmények között inkubálták:

a) egy nyúlantiszérum jelenlétében, amely a Neisseria meningitidis B16B6 törzsből tisztított transzferrinreceptorra specifikus, jele IM2394;

b) egy nyúlantiszérum jelenlétében, amely a Neisseria meningitidis IM2169 törzsből tisztított transzferrinreceptorra specifikus;

c) peroxidázzal konjugált humán transzferrin jelenlétében.

Az a) és b) esetben a transzferrinreceptor-alegységek felismerését peroxidázhoz kapcsolt antinyúlimmunoglobulin antitest hozzáadásával, majd az ezzel az enzimmel reagáló szubsztrát hozzáadásával teszik láthatóvá.

Az alábbi I. és II. jelű táblázatok néhány jellemző törzs profilját mutatják, ahogy a 7,5%-os poli(akrilamid)-gélen az SDS gélelektroforézis után láthatók; a sávokat a kilodaltonban (kDa) kifejezett látszólagos molekulatömegük alapján jellemezzük:

HU 219 267 Β

I. táblázat Törzsek

	2394 (B;2a;P1.2:L2,3) 2228 (B;nd) 2170 (B;2a:P1.2:L3)	2234 (Y;nd) 2154 (C;nd) 2448 (B;nd)	550 (C;2a:) 179 (C;2a:P1.2)
Kimutatás anti-2394	93	93	99
receptorantiszérummal	68	69	69
Kimutatás anti-2169 receptorantiszérummal	93	93	99
Kimutatás transzferrin-peroxidázzal	68	69	69

A zárójelekben a szerocsoport, a szerotípus, a szubtípus és az immunotípus látható, ebben a sorrendben.

11. táblázat Törzsek

	2169 (B:9: Pl.9)	1000 (B:nd)	1604 (B:nd)	132 (C: 15 Pl.16)	1001 (A:4: Pl.9)	876 (B:19 Pl.6)	1951 (A:nd)	2449 (B:nd)	867 (B:2b: Pl .2)
Kimutatás anti-2394 receptorantiszérummal	96	98	98	98	98	96	94	94	93
Kimutatás anti-2169	96	98	98	98	98	96	94	94	93
receptorantiszérummal	87	85	83	81	79	88	87	85	85
Kimutatás transzferrin-peroxidáz antiszérummal	87	85	83	81	79	88	87	85	85

A zárójelekben a szerocsoport, a szerotípus, a szubtípus cs az immunotípus látható, ebben a sorrendben.

A táblázatok első két sorában látható eredmények azt mutatják, hogy kétféle típusú törzs létezik.

Az első típus (I. táblázat) olyan törzseknek felel meg, amelyeknek a receptorában levő két alegységet az alkalmazott kísérleti körülmények között az antiIM2394 receptorantiszérum felismeri, míg csak a nagy molekulatömegű alegységet ismeri fel az anti-IM2169 receptorantiszérum.

A második típus (II. táblázat) olyan törzseknek felel meg, amelyeknek a receptorában levő két alegységet az alkalmazott kísérleti körülmények között az antiIM2169 receptorantiszérum felismeri, míg csak a nagy molekulatömegű alegységet ismeri fel az anti-IM2394 receptorantiszérum.

Ennek következtében antigéndiverzitás létezik az alacsonyabb molekulatömegű alegység szintjén. Ez a diverzitás azonban korlátozott, mivel csak két fő típusa létezik, szemben azzal, amit Griffiths és munkatársai állítanak [FEMS Microbiol. Lett., 69, 31 (1990)].

Ezeknek a megfigyeléseknek az alapján azt feltételezhetjük, hogy az összes Neisseria meningitidis fertőzés ellen hatásos vakcina készíthető a megfelelő módon, a nagy molekulatömegű alegységből, függetlenül attól, hogy melyik törzsből származik a receptor, mivel az említett alegységet az antiszérum két különböző típusa is felismeri. Úgy tűnik azonban, hogy ez nem járható út, mivel a nagy molekulatömegű alegységről úgy gondolják, hogy nem képes semlegesítő típusú antitestek termelését indukálni. A két receptoralegység közül csak a kisebbről derült ki, hogy képes ellátni ezt a funkciót. Mivel ezt a kisebb molekulatömegű alegységet jelentős antigénvariáció jellemzi az egyes és kettes típusú törzsek között, ezért egyetlen típusú transzferrinreceptor nem lehet elegendő ahhoz, hogy az összes Neisseria meningitidis fertőzéssel szemben vakcináim lehessen vele. Ennek következtében egy vakcinának az egyes törzsek (az IM2394 és az IM2169) alegységei közül legalább a kisebb molekulatömegűeket vagy azok ekvivalenseit tartalmaznia kell, és optimális esetben legalább egy Neisseria meningitidis törzs nagy molekulatömegű alegységét is tartalmaznia kell.

Ennek megfelelően a találmány tárgyát egy olyan izolált DNS-fragment képezi, amely olyan peptidet, polipeptidet vagy fehérjét kódol, amelyet az IM2394 vagy az IM2169 Neisseria meningitidis törzsek receptora ellen készített antiszérum felismer.

Egy ilyen DNS-fragment speciális esetben egy olyan nukleotidszekvenciát tartalmaz, amely az alábbiakban definiált szekvenciákkal mutat homológiát:

- az egyes számú szekvenciaazonosítóval (SEQ ID NO. 1), amely az 1-es pozícióban egy ciszteincsoporttal kezdődik, és az 579-es pozícióban egy glutamincsoporttal végződik;

- a SEQ ID NO. 3-mal, amely az 1-es pozícióban glutaminsavval kezdődik, és a 884-es pozícióban fenil-alanin-csoporttal végződik;

- a SEQ ID NO. 5-tel, amely az 1-es pozícióban glutaminsavval kezdődik, és a 887-es pozícióban fenil-alanin-csoporttal végződik;

- a SEQ ID NO. 7-tel, amely az 1-es pozícióban ciszteincsoporttal kezdődik, és a 691-es pozícióban glutamincsoporttal végződik.

HU 219 267 Β

Tájékoztatás céljából specifikáljuk, hogy a jelen találmány szerinti DNS-fragment tartalmazhat még egy további nukleotidszekvenciát, amely további aminosavszekvenciákat kódol; a két nukleotidszekvenciáról azt állítjuk, hogy egy nyitott leolvasási keretet hoznak létre, és ezáltal egy hibrid fehérjét vagy egy prekurzort kódolnak.

Egy, a jelen találmány szerinti DNS-ffagmentet előnyösen az alábbi csoportból választhatunk:

i) egy első, izolált DNS-ffagment, amelynek nukleotidszekvenciája egy olyan fehérjét kódol, amelynek aminosavszekvenciája homológ a SEQ ID NO. 1-ben leírt szekvenciával, az 1-es pozícióban ciszteincsoporttal kezdődik, és az 579-es pozícióban glutamincsoporttal végződik;

ii) egy második, izolált DNS-fragment, amelynek nukleotidszekvenciája egy olyan fehérjét kódol, amelynek aminosavszekvenciája homológ a SEQ ID NO. 3-ban leírt szekvenciával, az 1-es pozícióban glutaminsavcsoporttal kezdődik, és az 884-es pozícióban fenil-alanin-csoporttal végződik;

iii) egy harmadik, izolált DNS-fragment, amelynek nukleotidszekvenciája egy olyan fehérjét kódol, amelynek aminosavszekvenciája homológ a SEQ ID NO. 5-ben leírt szekvenciával, az 1-es pozícióban glutaminsavcsoporttal kezdődik, és az 887-es pozícióban fenil-alanin-csoporttal végződik;

iv) egy negyedik, izolált DNS-ffagment, amelynek nukleotidszekvenciája egy olyan fehérjét kódol, amelynek aminosavszekvenciája homológ a SEQ ID NO. 7-ben leírt szekvenciával, az 1-es pozícióban ciszteincsoporttal kezdődik, és a 691-es pozícióban glutamincsoporttal végződik.

A „homológ aminosavszekvencia” jelentése olyan szekvencia, amely a fentiekben referenciaként említett szekvenciákkal legalább 75%-os, előnyösen legalább 80%-os, még előnyösebben legalább 90%-os, legelőnyösebben 100%-os homológiát mutat. Meg kell jegyeznünk, hogy a fentiek szerint meghatározott „homológ” kifejezés az azonosságot is magában foglalja, speciális esetként.

A homológia mértékét könnyen ki lehet számítani oly módon, hogy a szekvenciákat egymás mellé illesztjük olyan elrendezésben, hogy a maximális homológiát kapjuk; ennek eléréséhez szükséges lehet, hogy mesterséges üres helyeket szúrjunk be a szekvenciákba, amint az a 7. ábrán látható. Helyspecifrkus mutagenezis egyszer az optimális elrendezést elértük, akkor a homológia mértékét úgy határozzuk meg, hogy feljegyezzük az összes olyan pozíciót, amelyben a két szekvencia aminosavjai egybeesnek, és ezt az összes pozíció számára vonatkoztatjuk.

Nagyon terjedelmes lenne leírni a homológ szekvenciákat az általánostól eltérő módon, mivel a kombinációk száma túl nagy. A szakterületen jártas szakember azonban ismeri az általános szabályokat, amelyek lehetővé teszik, hogy az egyik aminosavat egy másikkal helyettesítsük anélkül, hogy a fehérje biológiai vagy immunológiai funkcióit tönkretennénk.

Egy izolált, legelőnyösebb tulajdonságokkal rendelkező DNS-fragment az alábbiakat kódoló nukleotidszekvenciát tartalmazza:

i) az IM2394 törzs Tbpl alegysége, amelynek az aminosavszekvenciáját a SEQ ID NO. 3-ban mutatjuk be, amely az 1-es pozícióban glutaminsawal kezdődik, és a 884-es pozícióban fenilalanin-csoporttal végződik;

ii) az IM2394 törzs Tbp2 alegysége, amelynek az aminosavszekvenciáját a SEQ ID NO. 1-ben mutatjuk be, amely az 1-es pozícióban ciszteinnel kezdődik, és az 579-es pozícióban glutamincsoporttal végződik;

iii) az IM2169 törzs Tbpl alegysége, amelynek az aminosavszekvenciáját a SEQ ID NO. 5-ben mutatjuk be, amely az 1-es pozícióban glutaminsawal kezdődik, és a 887-es pozícióban fenilalanin-csoporttal végződik;

iv) az IM2169 törzs Tbp2 alegysége, amelynek az aminosavszekvenciáját a SEQ ID NO. 7-ben mutatjuk be, amely az 1-es pozícióban ciszteinnel kezdődik, és az 691-es pozícióban glutamincsoporttal végződik.

Mivel a transzferrinreceptor egy membránfehérje, ezért mindegyik alegysége először prekurzor formájában keletkezik, amely egy szignálpeptidet tartalmaz az érett forma N-terminális pozíciójában. Ennek megfelelően, a jelen találmány tárgyát képezi egy olyan izolált DNS-egység, amely egy szignálpeptidet kódol, amelynek aminosavszekvenciája legalább 80%-os, előnyösen 100%-os homológiát mutat az alábbi szekvenciákkal:

i) SEQ ID NO. 3, amely a -24-es pozícióban metionincsoporttal kezdődik, és alanincsoporttal végződik a -1-es pozícióban;

ii) SEQ ID NO. 5, amely a -24-es pozícióban metionincsoporttal kezdődik, és alanincsoporttal végződik a -1-es pozícióban;

iii) SEQ ID NO. 7, amely a -20-as pozícióban metionincsoporttal kezdődik, és alanincsoporttal végződik a -1-es pozícióban.

Egy, a találmány szerinti DNS-fragmentet kiválaszthatunk egy ötödik, hatodik, hetedik és nyolcadik DNSfragmentet tartalmazó csoportból is, amelyek egy olyan prekurzort kódolnak, amelynek aminosavszekvenciája homológ az SEQ ID NO. 1-ben, 3-ban, 5-ben vagy 7ben bemutatott szekvenciával.

Az „izolált DNS-fragment vagy -egység” szakkifejezésjelentése olyan genomiális eredetű DNS-fragment vagy -egység, amely

i) be van építve egy virális vagy plazmidvektorba, vagy ii) egy olyan promoter szabályozása alá van helyezve, amelyre vonatkozóan heterológ.

Továbbá azt a DNS-egységet, amely a találmány szerinti szignálpeptidet kódolja, amellett még izoláltnak tekintjük, ha ez a DNS-egység egy DNS-fragmenthez van kapcsolva, amely fragment egy, a szignálpeptidhez viszonyítva heterológ fehérjét kódol oly módon, hogy egy hibrid prekurzort kódoló nyitott leolvasási keretet alkot.

HU 219 267 Β

A találmány tárgyát képezi egy fehérjét, polipeptidet, peptidet expresszáló kazetta, amely expreszsziós terméket a Neisseria meningitidis IM2169 vagy IM2394-es törzs receptora elleni antiszérum felismeri, és amely kazetta legalább egy, a találmány szerinti DNS-ffagmentet tartalmaz, olyan elemek szabályozóhatása alá helyezve, amelyek képesek végrehajtani az expresszióját egy megfelelő gazdasejtben.

Az expressziós kazettában a találmány szerinti első, második, harmadik vagy negyedik DNS-fragment, amely egy érett formát kódol, vagy kapcsolatban van vagy nincs egy olyan DNS-egységgel, amely egy szignálpeptidet kódol, attól függően, hogy a fehérje szekréciója kívánatos-e vagy sem. Előnyösen ez a szekréció kívánatos. Ebben az utóbbi esetben a DNS-egység egy olyan szignálpeptidet kódol, amely az érett formával homológ vagy heterológ, és ennek eredménye egy természetes, illetve hibrid prekurzor szintézise.

A találmány szerinti DNS-ffagment expressziójához nélkülözhetetlen elemek az alábbiak: transzkripciós promoter, transzlációs start- és stopkodon, és szükség esetén egy transzkripciós terminátor. A promoter lehet konstitutív vagy indukálható. Rá kell mutatnunk, hogy az a DNS-ffagment, amely a Neisseria meningitidis IM2394 törzs Tbp2 alegységét kódolja, toxikusnak látszik egy heterológ sejtben, főleg Escherichia coliban. Az ilyen esetben előnyös lehet egy indukálható promoter alkalmazása, például a Salmonella typhimurium araB génjének promotere.

Az elemek, például egy DNS-egység, amely egy heterológ szignálpeptidet (szignálrégió) kódol, vagy egy promoter már meglehetősen nagy számban léteznek, és a szakterületen jártas szakember számára ismertek. A szakember általános képzettsége teszi lehetővé, hogy egy szignálrégiót vagy egy specifikus promotert válasszon, amelyet ahhoz a gazdasejthez adaptál, amelyben az expressziót végre kívánja hajtani.

Pontosabban meg kell jegyeznünk, hogy a Tbp2 alegység egy lipoproteinnek tűnik, mivel prekurzora egy olyan szignálpeptidet tartalmaz, amely a lipoprotein prekurzorokra jellemző, és azért is, mivel egy ciszteint tartalmaz az N-terminális pozícióban és olyan aminosavakat, amelyeknek erős hajlamuk van arra, hogy elfogadjanak „kanyar” típusú konformációt, valamivel az Nterminális tisztein után (4 glicin) [Wu and Tokunaga, Current Top. Microb. Immunoi., 125, 127 (1986)]. A lipidált állapot fokozhatja a Tbp2 alegység immunogén hatását.

Tehát egy prokariótarendszerben kívánatos lenne, ha a Tbp2 alegységet vagy a természetes prekurzorából vagy egy olyan prekurzorból kapnánk, amely egy alkalmas heterológ szignálpeptidet tartalmaz, amely lehetővé teszi a lipidációt; azaz egy olyan lipoprotein szignálpeptidet, amely nem a Tbp2-ből származik. Egy ilyen szignálpeptid azzal a specifikus jellemzővel rendelkezik, hogy a ΙΙ-es típusú szignálpeptidázzal hasítható. A szignálpeptid hasítási helyének szekvenciája megfelel a konszenzusszekvenciának (L,V,I) (A,S,T,G) (G,A) C, azaz cisztein az első aminosav az érett szekvenciában. A heterológ szignálpeptidekre példaként említhetjük a ColEl, ColE3, Lpp, NlpA, OsmB, Pál, RlpB és Trat lipoproteineket, amelyeknek a szekvenciáját a

SEQ ID NO. 9-24-ben mutatjuk be, valamint a megfelelő nukleinsavszekvenciákat is.

Ennek következtében egy specifikus megvalósítási mód szerint egy, a találmány szerinti expressziós kazetta, amelyet azzal a céllal állítunk elő, hogy egy, az alábbi szekvenciákkal homológ fehérjét kódoljon:

- a SEQ ID NO. 1, amely az 1-es pozícióban levő ciszteincsoporttal indul, és az 579-es pozícióban levő glutamincsoporttal végződik, vagy

- a SEQ ID NO. 7, amely az 1-es pozícióban levő ciszteincsoporttal indul, és a 691-es pozícióban levő glutamincsoporttal végződik;

tartalmaz:

i) egy olyan DNS-egységet, amely a Tbp2 alegységtől eltérő lipoproteint tartalmaz, például az Rlpb szignálpeptidet és ii) egy, az említett fehérjét kódoló DNS-ffagment. Végezetül, a találmány tárgyát képezi

i) eljárás egy peptid, polipeptid vagy fehérje előállítására, amelyet a Neisseria meningitidis IM2394 vagy IM2169 törzs receptora elleni antiszérum felismer, amely eljárás szerint egy, a találmány szerinti expressziós kazettát tartalmazó gazdasejtet szaporítunk, és az említett peptidet, polipeptidet vagy fehérjét kinyerjük a tenyészetből; valamint ii) az említett eljárással készülő peptid, polipeptid vagy fehérje, és iii) a fehérjé(ke)t tartalmazó gyógyszerkészítmények, főleg vakcinák.

A jelen találmány szerinti eljárás céljaira a gazdasejt lehet emlőssejt, egy élesztő vagy egy baktérium. Ebben az esetben is, egy specifikus vonal megválasztása a szakterületen jártas szakember köteles tudásához tartozik.

Egy másik módszer szerint egy, a találmány szerinti gyógyászati készítmény aktív adalékanyagként tartalmazhat egy virális vagy bakteriális vektort, amelynek a genomjába egy, a találmány szerinti DNS-ffagment van beillesztve, az expressziójához szükséges elemek szabályozása alá helyezve. A megfelelő vektor alatt érthetünk például himlővírusokat, adenovírusokat és tejsavbaktériumokat.

Egy, a jelen találmány szerinti gyógyászati készítmény különösen hasznos egy Neisseria meningitidis fertőzés megelőzésében vagy kezelésében. A szokványos módon állítható elő. Pontosabban egy gyógyászatilag hatásos mennyiséget kombinálunk egy hordozóval vagy egy hígítóval. Bármely, a vakcinálás szakterületén ismert úton beadhatjuk, például enterálisan vagy parenterálisan. A beadás lehet egyetlen dózisban, illetve egy bizonyos időtartam után megismételhető. A beadás útja változhat különböző paraméterek függvényében, például függhet a kezelt szervezettől is (állapot, kor és hasonlók). A készítmény emellett tartalmazhat egy gyógyászatilag elfogadható komplett adjuvánst.

Abból a célból, hogy meghatározzuk a jelen találmány tárgyát, specifikálni kell, hogy a Neisseria meningitidis 1M2394 (másik neve B16B6) és 1M2169 (má5

HU 219 267 Β sik neve M982) törzsek szabadon hozzáférhetők a Collection de Institute Pasteurnél, 25 rue de Dr. Roux 75015 Párizs, a CIP79808 és a CIP7917 szám alatt.

A Neisseria meningitidis IM2394 vagy IM2169 törzs transzferrinreceptorára specifikus antiszérumot az alábbi példákban ismertetett módon állíthatjuk elő.

A találmányt az alábbi példákkal tesszük jobban érthetővé, valamint az 1-8. ábrákkal.

Az 1. ábrán a lambda ΖΑΡ II fág szerkezete látható, és sematikusan mutatja az ehhez kapcsolódó klónozási módszereket is. A lambda ΖΑΡ II egy inszerciós vektor, amelyet a plazmidrészben található többszörös klónozási hellyel láttak el (pBluescript SK). Ezt a plazmidrészt in vivő ki lehet vágni, ha egy segítőfággal együtt fertőzünk meg vele egy sejtet, majd plazmidvektorrá alakul. Ha egy kódolószekvenciát fázisban fuzionáltatunk a lacZ-vel, illetve ha egy DNS-fragment tartalmaz egy promotert, amely Escherichia coliban működik, akkor előállíthatjuk a számunkra érdekes fehérjét, és specifikus antitestekkel ki lehet mutatni.

A 2. ábrán a pTG1265 plazmid szerkezete látható. A pTG1265-ös plazmid a pGB2 plazmidból származik [Churchward et al., Gene, 31, 165 (1984)], az alábbiak szerint: a pGB2 plazmidot EcoRI és HindlII restrikciós enzimekkel emésztjük, Klenow-polimerázzal kezeljük, majd a pT7T3 184 plazmidból [Mead et al., Protein Engineering, 1, 67 (1986), Pharmacia] izolált 1 kb méretű SspI-PvuII fragmenttel ligáljuk, amely tartalmazza az fl-ori-t, a lacZ szekvenciát, a T3 és T7 promotereket, valamint többszörös klónozóhelyeket.

A 3. ábrán az IM2394 törzs DNS-régiójának genomiális térképe látható, amely a Tbpl-et és Tbp2-t kódoló szekvenciákat tartalmazza, valamint a különböző klónozott ffagmenteket. B=BamHI, E=EcoRI, H=HincII, R=EcoRV, X=XbaI, C=ClaI.

A 4. ábrán az IM2169 törzs DNS-régiójának genomiális térképe látható, amely a Tbpl-et és Tbp2-t kódoló szekvenciákat tartalmazza, valamint a különböző klónozott ffagmenteket. C=ClaI, H=HincII, M=MluI, X=XbaI, ?=pontatlan pozíció.

Az 5. ábrán a pARA13 plazmid szerkezete látható. A pARA13 plazmid képes Escherichia coliban replikálódni, és tartalmazza a Salmonella typhimurium BAD arabinóz operonját (ParaB), a TATA box szintjén módosítva, valamint az AraC gént. A ParaB promoter után többszörös hasítási helyek találhatók. A pARA plazmidsorozatot Cagnon és munkatársai írták le [Protein Engineering, 4, 843 (1991)].

A 6. ábrán a pTG3786-os expressziós vektor készítésére használt módszer látható.

A 7. ábrán az IM2394 és IM2169 törzsek Tbpl alegységek származtatott aminosavszekvenciái láthatók. A homológia mértékét körülbelül 76%-ra becsüljük.

A 8. ábrán az IM2394 és IM2169 törzsek Tbp2 alegységek származtatott aminosavszekvenciái láthatók. A homológia mértékét körülbelül 47%-ra becsüljük.

A 9. ábrán a pTG3779 expressziós vektor készítésére használt módszer leírása látható.

A 10. ábrán a pTG4710 expressziós vektor készítésére használt módszer leírása látható.

All. ábrán a pTG4764 expressziós vektor készítésére használt módszer leírása látható.

1. példa

Az IM2394 törzs transzferrinreceptora Tbpl és

Tbp2 alegységeit kódoló DNS-ffagmentek klónozása

1A)—A törzs szaporítása és a transzferrinreceptor tisztítása

A Neisseria meningitidis IM2394 törzs fagyasztva szárított sejtjeit körülbelül 1 ml Muller-Hinton-táptalajban (MHB, Difco) vesszük fel. A baktériumszuszpenziót ezután szilárd Muller-Hinton-táptalajra viszszük, amely forralt vért tartalmaz (5%).

óra hosszat 37 °C-on inkubáljuk 10% CO₂-t tartalmazó atmoszférában, majd a baktériumréteget kinyerjük azzal a céllal, hogy 150 ml MHB-táptalajt oltsunk vele (pH=7,2, 3 db 250 ml-es Erlenmeyer-lombikba elosztva). Az inkubálást 3 óra hosszat folytatjuk 37 °C-on, kevertetés közben. Az így előállított mindhárom tenyészettel oltható 400 ml MHB (pH=7,2, kiegészítve 30 pmol/l etilén-diamin-di(o-hidroxi-fenilecetsav)-val (EDDHA, Sigma), amely szabad formájában egy vaskelátot képező vegyület.

Miután 16 óra hosszat tenyésztettük kevertetés közben, a tenyészetek tisztaságát Gram-festést követően mikroszkóposán megvizsgáljuk. A szuszpenziót centrifugáljuk, majd a patogén mikroorganizmust tartalmazó üledéket leméijük és -20 °C-on tároljuk.

A tisztítást lényegében a Schryvers és munkatársai által közölt módszerrel végezzük, az alábbiak szerint.

A baktériumüledéket megolvasztjuk, majd 200 ml 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0 pufferben (A puffer) szuszpendáljuk. A szuszpenziót centrifugáljuk (20 perc, 15 000xg, 4 °C). Az üledéket kinyeqük, majd ismét az A pufferben szuszpendáljuk 150 g/1 végkoncentrációban. 150 ml-es frakciókat kezelünk 8 percig 80 Mpa nyomással egy sejtfeltáró berendezésben (Rannie, 8.30H modell). Az így kapott sejtlizátumot 15 percig centrifugáljuk 4 °C-on 15 000xg-vei. A felülúszót kinyerjük, majd 75 percig 4 °C-on 200 000 χ g-vel centrifugáljuk. A felülúszó eltávolítása után az üledéket A pufferben vesszük fel, majd Lowry-féle módszerrel végzett fehéijemérés után a szuszpenzió koncentrációját 5 mg/ml-re állítjuk.

1,4 ml membránszuszpenzióhoz 1,75 mg, Schryvers által leírt módszerrel biotinilezett humán transzferrint adunk. A membránfrakció végkoncentrációja mg/ml. Az elegyet 1 óra hosszat inkubáljuk 37 °C-on, majd 100 000 χ g-vel centrifugáljuk 75 percig 4 °C-on. A membránüledéket 0,1 mol/1 NaCl-ot tartalmazó A pufferben vesszük fel, majd 60 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk.

Miután oldatba vittük, olyan térfogatú 30%-os (tömeg/térfogat) N-lauroil-szarkozint és 500 mmol/1 EDTA-t adunk ehhez a szuszpenzióhoz úgy, hogy a szarkozil és az EDTA végkoncentrációja 0,5%, illetve mmol/1 legyen. Miután 15 percig inkubáltuk 37 °C-on kevertetés közben, 1 ml streptavidinagarózt (Pierce) adunk hozzá, amelyet előzőleg A pufferben mostunk.

HU 219 267 Β

A szuszpenziót 15 percig szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd lOOOxg-vel 10 percig centrifugáljuk. A gyantát ezután oszlopba töltjük, és a közvetlen eluátumot elöntjük.

A gyantát 3 oszloptérfogatnyi 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0 pufferrel mossuk, amely 1 mol/1 NaCl-ot, 10 mmold EDTA-t, 0,5% szarkozilt tartalmaz (B puffer), majd 1 oszloptérfogatnyi, 750 mmol/1 guanidinHCl-ot tartalmazó B pufferrel mossuk. A transzferrinreceptort ezután 2 mol/1 guanidin-HCl-ot tartalmazó B pufferrel eluáljuk. Az eluátumot frakciókban gyűjtjük, olyan csövekbe, amelyek azonos térfogatú 50 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8,0,1 mol/1 NaCl összetételű puffért tartalmaznak. Az eluátum optikai sűrűségét 280 nm-en mérjük, az oszlopból való kilépés pontjánál, UV-detektorral.

Az elúciós csíknak megfelelő frakciókat kinyeljük, 10 mmol/1 foszfátpufferrel (pH=8,0) szemben dializáljuk, amely 0,05% szarkozilt tartalmaz, majd fagyasztva szárítjuk. A fagyasztva szárított terméket vízben felvesszük, 10-szer nagyobb töménységben. Az oldatot másodszor is dializáljuk 50 mmol/1 foszfátpuffer, pH=8,0, 0,05% szarkozil (C puffer) összetételű oldattal szemben, majd az oldatot 0,22 pm-es pórusméretű membránon szűrjük át.

A fehérjetartalmat meghatározzuk, majd 1 mg/mlre állítjuk C puffer hozzáadásával, aszeptikus körülmények között. Ezt a készítményt -70 °C-on tároljuk.

IB) -A transzferrinreceptorra specifikus készítmény előállítása

New-Zealand albínó nyulaknak bőr alá és intramuszkulárisan 100 pg IM2394 receptort adunk be komplett Freund-féle adjuváns jelenlétében. Az első injekció után 21, illetve 42 nappal a nyulaknak ismét beadunk 100 pg-ot a tisztított receptorból, de ez alkalommal inkomplett Freund-féle adjuváns jelenlétében. Az utolsó injekció után 15 nappal az állatokból szérumot gyűjtünk, és komplementmentesítjük, majd 0,45 pm-es pórusméretű membránon szüljük át. A szűrletet ezt követően IM2394-es törzzsel érintkezésbe hozva kimerítjük, amely törzset ennek a műveletnek a végrehajtása céljából előzőleg szabad formájú vas jelenlétében tenyésztettünk (ilyen körülmények között a transzferrinreceptor szintézise represszálva van). Az érintkeztetés feltételei az alábbiak: 10 ml szűrletet adunk 10¹⁰ cfu-hoz (telepképző egység) az IM2394 törzs tenyészetéből. Az adszorpciót éjszakán át folytatjuk 4 °C-on, kevertetés közben. A baktériumokat ezután centrifugálással távolítjuk el. A felülúszót kinyerjük, majd két egymást követő adszorpciós műveletnek vetjük alá, a fentiek alapján.

IC) - Azoknak apeptidszekvenciáknak a meghatározása, amelyek lehetővé teszik a DNS-fragmentek azonosítását

Az 1A) pontban kapott anyag alikvot részeit megszárítjuk, majd újra oldatba visszük kétszeres töménységű Laemmli-pufferben (65 mmol/1 TRIS, 3% SDS, 10% glicerin, 5% β-merkapto-etanol). Azonos térfogatú vizet adunk hozzá.

Ultrahangos besugárzást követően az anyagot 2 percre 90 °C-ra melegítjük, poli(akrilamid) gélelektroforézisnek vetjük alá. Az ily módon elválasztott alegységeket PVDF membránra (Immobilon, Millipore) visszük át, 16 óra hosszat 400 mA áramerősség mellett 50 mmol/1 TRIS-borát pufferben (pH=8,3). Az elektrotranszferált alegységeket amido-black festékkel festjük, majd a Tbpl-nek, illetve Tbp2-nek megfelelő csíkokat kinyeqük, és az N-terminális szekvenciáját mikroszekvenálással határozzuk meg.

Ezt többször megismételjük, míg az alábbi, N-terminális konszenzusszekvenciát megkapjuk:

Tbpl IM2394: EXVQAEQAQEKQLDTIQV

Tbp2 IM2394: XLXXXXSFDLDSVEXVQXMX (X jelentése meghatározatlan aminosav).

Abból a célból, hogy a Tbp2 belső régióinak aminosavszekvenciáját is meghatározzuk, a PVDF membránon található fehéijét tripszines emésztésnek vetjük alá 0,1 mol/1 TRIS-HC1 pH=8,2 pufferben. 4 óra hoszszat 37 °C-on végezzük a reakciót, majd a peptideket 70%-os hangyasavval majd 0,1%-os trifluor-ecetsawal (TFA) extraháljuk. Ezeket a peptideket azután HPLCvel választjuk el.

Az IM2394 Tbp2-nél a meghatározott belső szekvenciák az alábbiak:

S1122: NNIVLFGPDGYLYYK

S1125: YTIQA

S”770: DGENAAGPATEXVIDAYR

S”766: XQIDSFGDVK

S1126: AAFXXXI

S”769: XNXXXMFLQGVR

S”771: TPVSDVAAR

S”767: XSPAFT

S”762: NAIEMGGSFXFPGNAPEG(K)

S1128: XQPESQQDVSENX

ID) —A genomiális DNS előállítása

Az 1A) pontban kapott baktériumüledéket körülbelül 25 ml A oldatban szuszpendáljuk (25 mmol/1 TRIS-HC1 pH=8, 50 mmol/1 glükózt és 10 mmol/1 EDTA-t tartalmaz), amelyet 10 mg proteináz K-val egészítünk ki.

Ezután 12,5 ml A oldatot adunk hozzá, amely 10 mg lizozimet tartalmaz. Az elegyet ismét hagyjuk 10 percig állni szobahőmérsékleten. Az elegyet ezután 0,5 ml 10%-os szarkozillal rétegezzük le. Az elegyet 10 percig 4 °C-on inkubáljuk.

Ezután 2 mg RNáz-t adunk hozzá, és az inkubálást 9 percig folytatjuk 37 °C-on. A DNS-t négy egymás után végzett fenolos extrakcióval tisztítjuk. A az utolsó vizes fázisban található DNS-t etanollal kicsapjuk. A nagy molekulatömegű DNS-t CSC1 gradiensen való elválasztással kapjuk.

IE) -Klónozás

Az első DNS-könyvtárat a lambda ZAP vektorban (1. ábra) állítjuk elő, az alábbiak szerint.

Egy genomiális DNS-készítményt ultrahangos kezeléssel fragmentálunk. Az így kapott ffagmentek végeit T4 polimerázzal tompa végűre alakítjuk. A fragmenteket metilezzük. A metilezés után a ffagmenteket EcoRI adapterekhez kapcsoljuk, EcoRI restrikciós enzimmel kezeljük, majd a lambda ZAP II fág (Stratagene) EcoRI hasítási helyére építjük be.

HU 219 267 Β

Az Escherichia coli XLl-blue törzsét (Stratagene) az így kapott DNS-könyvtárral fertőzzük. A fehér lízistarfoltokat (ez a rekombináns fágok jelenlétére utal) az IB) pontban leírt módon előállított IM2394 törzs receptoraira specifikus antiszérummal vizsgáljuk meg. Ily módon lehetségessé vált két lambda ΖΑΡII klón azonosítása. Az ezekben a kiónokban található pBluescript plazmidokat segítő fággal együtt fertőzve kihasítjuk, ezek jele pBMTl és pBMT2.

A pBMTl és pBMT2 plazmid is tartalmaz egy EcoRI-EcoRI fragmentet, melyeknek mérete 3,8 kb, illetve 1,3 kb. Ezeket a 3. ábrán mutatjuk be.

A pBMTl EcoRI-EcoRI inszert szekvenálását a shotgun módszerrel végezzük [Bankier and Barrell, Biochemistry, B5, 508 (1983)], az alábbiak szerint.

A pBMTl EcoRI-EcoRI inszertet tisztítjuk, majd ultrahangos kezeléssel fragmentáljuk. Az így kapott fragmentek végeit T4 polimerázos kezeléssel tompa végűre alakítjuk. Az így kezelt fragmenteket az M13TG131 fág [Kieny et al., Gene, 26, 91 (1983)] egy megfelelő pontjára beépítjük. Az ebből a preparátumból kapott körülbelül 200 kiónnak meghatározzuk a szekvenciáját. Ezeknek a szekvenciáknak a számítógépes elemzése lehetővé teszi, hogy rekonstruáljuk a pBMTl EcoRI-EcoRI inszertjének teljes szekvenciáját.

A Tbpl N-terminálisát kódoló szekvenciát a 3. ábrán látható módon lokalizáljuk. Mivel a Tbpl molekulatömege adott, ezért világos, hogy ez az inszert nem tartalmazza a Tbpl-et kódoló teljes DNS-fragmentet. Egy nyitott leolvasási keretet azonosíthatunk a tbpl gén 5’ vége előtt, de a tbp2 gén N-terminálisát kódoló régiót nem lehet tisztán azonosítani.

A Tbp2 belső régióinak mikroszekvenálásával megerősítettük az IC) pontban leírtakat. A C-terminális felé eső belső szekvenciák valóban megfelelnek a tbpl előtt található nyitott leolvasási keret 3’ részének.

Továbbá az IM2394 törzs genomiális DNS-ét, amelyet előzőleg HincII restrikciós enzimmel emésztettünk, Southem-blot-módszerrel vizsgáljuk, a pBMTl 3,8 kb méretű inszert 1,5 kb méretű HincII-HincII régiójának megfelelő radioaktív DNS-próba felhasználásával; ily módon két csík tehető láthatóvá. Ez lehetővé tette annak igazolását, hogy a pBMTl-ból származó inszert a két eltérő lokusz szekvenciáinak kombinációjából származó műtermék. Ennek következtében a tbp2 5’ szekvenciája hiányzik.

Az előzőkben leírt, lambda ZAP fágban előállított genomiális DNS-könyvtárat ismét átvizsgáljuk, ez alkalommal a pBMT2 EcoRI-EcoRI fragmentjét használva próbaként. A körülbelül 200 000 átvizsgált tarfolt közül 29 jelölt maradt. Csak a pTG2749 származékplazmidról látszott, hogy a pBMTl-hez és a pBMT2-höz viszonyítva egy új inszertet hordoz. A pTG2749 plazmidban levő inszertet a 3. ábrán mutatjuk be. Az EcoRV hasítási hely előtti inszertrégiót (EcoRV-EcoRI régió) M13TG31 plazmidba klónozzuk, majd Sanger és munkatársai módszerével szekvenáljuk [Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 74, 5463 (1977)], szintetikus indítómolekulák alkalmazásával. így kapjuk a Tbp2 N-terminálisának megfelelő szekvenciát.

Az IM2394 törzs Tbp2-jét kódoló DNS-fragment szekvenciáját rendre a SEQ ID NO. 1-ben, illetve 2-ben mutatjuk be, a megfelelő aminosavszekvenciával együtt.

Közvetlenül az érett Tbp2-t kódoló szekvencia előtt a pTG2749 egy másik lokuszból származó, eltérő genomiális régiót tartalmaz. Ebben az esetben is ez egy klónozási műtermék, a pBMTl-nél tapasztalt esethez hasonló.

A megfigyelt átrendeződések miatt, valamint azért, mert hiányzik a tbpl 3’ szekvenciája és a tbp2 5’ szekvenciája, a lambda ZAP-ban készített genomiális DNSkönyvtárat alkalmatlannak ítéljük arra, hogy a klónozást ezzel folytassuk.

Ennélfogva egy második genomiális DNS-könyvtárat készítettünk egy alacsony kópiaszámú plazmidban az alábbiak szerint: egy genomiális DNS-preparátumot részletesen emésztünk Sau3A enzimmel. A körülbelül

4-6 kb méretű DNS-fragmenteket szacharózgradiensen végzett frakcionálás után tisztítjuk, és a pTG1265 plazmid BamHI hasítási helyére építjük be. Ezt a plazmidpreparátumot használjuk az Escherichia coli 5K törzs transzformálására. Becslésünk szerint ez a könyvtár körülbelül 18 000 független kiónt tartalmaz.

A második könyvtárból körülbelül 50 000 kiónt vizsgáltunk át a pBMT2 EcoRI-EcoRI inszertjének megfelelő radioaktív próba alkalmazásával. Csak egyetlen klón volt megfigyelhető, azaz a pTG2759 jelű plazmid, amely egy 1,8 kb méretű inszertet tartalmaz. Ennek az inszertnek a méretét nem tartjuk elegendőnek ahhoz, hogy a teljes Tbpl-et kódoló gént tartalmazza.

Az előző paragrafusban leírt módszer alkalmazásával egy harmadik DNS-könyvtárat állítunk elő, azzal a különbséggel, hogy az Escherichia coli 5K törzs helyett Escherichia coli SURE törzset (Stratagene) használunk. Becslésünk szerint ez a könyvtár körülbelül 60 000 független kiónt tartalmaz.

A harmadik DNS-könyvtárból körülbelül 70 000 kiónt vizsgálunk meg, az alábbi, 2 példában leírt és a 4. ábrán bemutatott pTG2754 plazmid inszertjéből származó 2,4 kb méretű Mlui-HincII fragmentnek megfelelő radioaktív próba alkalmazásával. Két klón mutatható ki, azaz a pTG2780 és a pTG2781 jelű plazmidok, amelyeket a 3. ábrán mutatunk be.

A pTG2780 és a pTG2781 inszertek szekvenciáját a Sanger-módszerrel állapítottuk meg. A nukleotidszekvenciát, valamint a megfelelő aminosavszekvenciát rendre a SEQ ID NO. 3-on, illetve 4-en mutatjuk be.

Egy negyedik könyvtárat is készítünk. A genomiális DNS-t Sau3A restrikciós enzimmel emésztjük, majd a körülbelül 7 kb méretű fragmenteket tartalmazó frakciót szacharózgradiensen tisztítjuk. Ez a frakció tartalmaz egy olyan fragmentet, amely a tbpl,2 lokusznak felel meg, mivel a tbp2-re specifikus DNS-próba felismeri. EcoRV és Xbal enzimekkel végzett emésztés, majd Smal és Xbal enzimekkel emésztett pTG1265 plazmidba való ligálás után Escherichia coli 5K törzset transzformálunk a ligálóeleggyel. A kiónokat tbp2-re specifikus próbával vizsgáljuk át. A pozitív kiónok közül a pTG3791 plazmidot vizsgáltuk át alaposabban, és azt

HU 219 267 Β találtuk, hogy tbp2 5’ szekvenciákat tartalmaz, beleértve azt a szekvenciát is, amely a Tbp2 feltételezett szignálpeptidjét kódolja.

2. példa 5

Az IM2169 törzs transzferrinreceptorának Tbpl és

Tbp2 alegységeit kódoló DNS-ffagment klónozása

2A)-Az IM2169 törzs tenyésztését és a transzferrinreceptor tisztítását az IA) példában leírtak alapján hajtjuk végre.

2B)-Az IM2169 törzs receptora elleni antiszérumot az IB) példában leírtak alapján állítjuk elő.

2C)-A DNS-fragmentek azonosítását lehetővé tevő peptidszekvenciákat az IC) példában leírtak alapján határozzuk meg. A megállapított mikroszekvenciák az alábbiak.

A Tbpl N-terminálisának konszenzus szekvenciája:

ENVQAGQAQEKQLXXIQVX A Tbpl belső peptidek szekvenciái:

S1031: XLS(E,W)NAGXVLXPADX S1032: QLDTIQVK S1033: TAGSSGAINEEIEYENXX S1034: YVTWENVDXXXXXX A Tbp2 N-terminálisának konszenzus szekvenciája:

SLVXAXSFDLXSV A Tbp2 belső peptidjeinek szekvenciái:

S1037: XXDNLSNAX

S1035: XGDDGYIFYXGEKPX S1036: XQGXYGFAMX S1040: XQATGHENFQYVYSGXFYK

2D)-Az IM2169 törzs genomiális DNS-t az ID) példában leírtak alapján hajtjuk végre.

2E)- Klónozás

Az első genomiális DNS-könyvtárat (a DNS Sau3Aval végzett részleges emésztésével kapott fragmentek; pTG1265; Escherichia coli 5K) az 1. példában leírtak alapján készítjük. A becsléseink szerint ez a könyvtár körülbelül 40 000 független kiónt tartalmaz, amelyeknek körülbelül 70%-ban található 4-6 kb méretű inszert.

Ebből a könyvtárból 130 000 kiónt vizsgálunk át a pBMT2 EcoRI-EcoRl inszertjének megfelelő radioaktív próba felhasználásával. 42 kiónt vizsgáltunk meg alaposabban, ezek közül kettőt megtartottunk, a pTG2753 és a pTG2754 plazmidokat, amelyeket a 4. ábrán mutatunk be. A Southern biot elemzések azt mutatták, hogy a pTG2753 és a pTG2754 inszertjeinek a restrikciós térképei megfelelnek a genomiális DNS restrikciós térképének.

A nukleotidszekvenciák meghatározása, valamint az olyan régiók keresése, amelyek az N-terminálist, illetve a belső régiókat kódolják, az alábbiakat igazolta:

- a pTG2753 1,9 kb méretű inszertje tartalmazza a tbp2 gén 3’ részét és a tbpl gén 5’ részét; és

- a pTG2754 inszert tartalmazza a tbp2 gén 3’ részét, valamint a tbpl gén 5’ és 3’ részét oly módon, hogy közöttük a leolvasási fázis elromlott.

Ez az első könyvtár tehát nem tette lehetővé, hogy a Tbpl-et vagy Tbp2-t kódoló teljes DNS-fragmenteket klónozzuk.

A fentiek szerint egy második genomiális könyvtárat állítunk elő, de az Xbal restrikciós enzimmel emésztett genomiális DNS-ből. A DNS-fragmenteket szacharózgradiensen végzett frakcionálás után tisztítjuk. Mindegyik frakciót (körülbelül 500 pl) Southern blottal vizsgálunk, a tbpl 3’ végének (a pTG2754 inszert fragmentje) megfelelő radioaktív próba alkalmazásával. Azt a frakciót, amely hibridizációs reakciót mutat, és körülbelül 6 kb méretű fragmenteket tartalmaz, pTG1265 plazmidba klónozzuk. Az Escherichia coli 5K törzset transzformáljuk a ligálóeleggyel.

Ebből a könyvtárból körülbelül 2400 kiónt vizsgálunk át, a pTG2754-ből nyert 0,6 kb méretű HincIIMlul fragmentnek megfelelő radioaktív próba felhasználásával. Öt kiónt jellemeztünk, amelyek közül kettőt tartottunk meg, azaz a pTG3720-at és a pTG3721-et, amelyet a 4. ábrán mutatunk be. Mindkettő tartalmazza a tbpl és tbp2 géneket.

Abból a célból, hogy teljesen meghatározzuk a Tbpl-et kódoló nukleotidszekvenciát, a pTG3720 inszertet abban a régióban szekvenáljuk, ahol a leolvasási fázis elromlását figyeltük meg a pTG2754-ben. Ez a szekvenálás kimutatta, hogy a pTG2754 inszertben a fázis elromlását egy 22 bp méretű deléció okozta. A DNS-ffagment teljes szekvenciáját a SEQ ID NO. 5ben mutatjuk be.

A pTG3720 inszertjének szekvenciáját is meghatároztuk, azzal a céllal, hogy a tbp2 szekvenciáját megkapjuk. Az említett szekvenciát ismét sikerült azonosítani, de ebben az esetben is elromlott a leolvasási fázis.

Végezetül a tbp2 szekvenciáját a pTG3721 plazmidból határoztuk meg. Ez a SEQ ID NO. 7-en látható.

3. példa

Az IM2394 törzs Tbp2 alegységét kódoló DNSffagment expressziója 3A) A pTG3749 expressziós vektor készítése A pARA13 plazmid [5. ábra; Cagnon et al., Prot.

Eng., 4, 843 (1991)] Sphl hasítási helyét Klenow-polimerázzal kezelve elrontjuk, így kapjuk a pTG3704 plazmidot. A pTG3704 plazmidot Ncol hasítással linearizáljuk, tompa végek előállítása céljából Klenow-polimerázzal kezeljük, majd Hindin restrikciós enzimmel emésztjük.

Ezek mellett az OTG4015 és az OTG4016 jelű oligonukleotidokat is megszintetizáljuk, majd egymáshoz illesztjük őket.

OTG4015: 5’ AAATACCTATTGCCTACGGCAGCCGCTGGACTGTTATTACT

CGCTGCCCAACCAGCGATGGCATGCTTTCCCACGCGTTTTCCCA 3’

OTG4 016: 5’AGCTTGGGAAAACGCGTGGGAAAGCATGCCATCGCTGGTTGGGCA GCGAGTAATAACAGTCCAGCGGCTGCCGTAGGCAATAGGTATTT 3’

HU 219 267 Β

Az OTG4015/OTG4016 kétszálú fragmentet a fentiek szerint kezelt pARA13 plazmidba építjük be, így kapjuk a pTG3717 jelű plazmidot, amelyben az Erwinia carotovora pelB fehérjéje prekurzorának N-terminális részét kódoló szekvencia ezáltal ismét helyreáll [Lei et al., Journal of Bacteriology, 169, 4379 (1987)], azaz:

	.ATG AAA TAC CTA TTG CCT ACG GCA GCC	GCT	GGA	CTG
	Me t	Ly s	Tyr	Leu	Leu	Pro	Thr	Alá Alá	Alá	Gly	Leu
								Sphl
TTA	TTA	CTC	GCT	GCC	CAA	CCA	GCG	ATG GCA	TGCTTT
Leu	Leu	Leu	Al a	Al a	Gin	Pro	Al a	Met Alá

Miül HindlII

CCCACGCGTTTTCCCA AGCTT....................

(A pTG3704 végei alá vannak húzva)

A pTG2749 plazmidból kiindulva PCR-módszerrel, az OTG4011 és az OTG4012 indítómolekulák felhasználásával előállítunk egy fragmentet, amely kódolja a

Tbp2 N-terminális részét, egészen a belső Miül hasítási helyig (6. ábra).

OTG4011:

BamHI Sphl

5’ AAAAAGGATCC/GCA	TGC	CTG	GGT GGC	GGC	GGC	AGT	TTC 3
	Cys	Leu	Gly ...
OTG4012:
BamHI			Miül
5’ AAAAGGATCCG AAT	GGT	GTA	ACG CGT	AGT	TTT	TAT	3’

A PCR-rel előállított fragmentet BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, majd az M13TG131 fág BamHI hasítási helyére építjük be, így kapjuk az M13TG3724 fágot. Ennek a fragmentnek a szekvenciáját szekvenálással határozzuk meg.

A Tbp2 N-terminálisát kódoló régiót kinyeijük az M13TG3724-ből egy Sphl-Mlul fragment formájában, majd az előzetesen Sphl és Miül enzimekkel emésztett pTG3727 plazmidba juttatjuk be, így kapjuk a pTG3743 plazmidot. A pBMTl plazmidból kiindulva a Tbp2 Cterminálisát kódoló régiót egy Mlul-Banl fragment formájában nyeljük ki, amelynek a tapadós a Báni végét Klenow-polimerázos kezeléssel tompa végűvé alakítjuk. Ezt a fragmentet az előzetesen Hindii restrikciós enzimmel emésztett, Klenow-polimerázzal tompa végűvé alakított, majd Miül restrikciós enzimmel emésztett pTG3743 plazmidba építjük be. így kapjuk a pTG3749 plazmidot.

3B) A Tbp2 alegység előállítása

Az Escherichia coli MC1061 törzse [Casadaban and Cohen, Journal of Molecular Biology, 138, 197 (1980)] transzformáljuk a pTG3749 plazmiddal, majd 2 g/1 glicerinnel és 100 pg/ml ampicillinnel kiegészített LB-táptalajban inkubáljuk 37 °C-on. Az exponenciális fázisban levő tenyészethez 0,2 g/1 arabinózt adunk. Az inkubálást további 6 óra hosszat folytatjuk. Az expressziót az arabinóz hozzáadása után 1 órán belül észleltük.

Egy teljes sejtlizátumminta poli(akrilamid)-gélen végzett elektroforézisével ki lehet mutatni egy körülbelül 70 kDa méretű fehéije jelenlétét, amely képes a peroxidázzal jelzett humán transzferrinhez kötődni.

4. példa

Az IM2169 törzs Tbp2 alegységét kódoló DNS-fragment expressziója

4A) A pTG3779 expressziós vektor készítése

Az előzőleg egymással párosított OTG4038 és OTG4039 oligonukleotidokat tartalmazó szintetikus fragmentet építünk be a pTG3704 plazmidba, amelyet Ncol és HindlII restrikciós enzimekkel emésztettünk, így kapjuk a pTG3756 plazmidot.

OTG4038:

5’ CATGGCTGCAGGRACCACGCGTGAATTCCCCGGGTCTAGA 3’ OTG4039:

5’ AGCTTCTAGACCCGGGGAATTCACGCGTGGTACCTGCAGC 3’

A pTG2754 plazmidból PCR-módszerrel, az val állítjuk elő a Tbpl N-terminális prekurzorát kódoló OTG4037 és az OTG4014 indítómolekulák alkalmazásá- 55 régiót tartalmazó fragmentet, az Miül hasítási helyig.

OTG4037:

5’ TTTCCCGGATCCGC ATG CAA CAG CAA CAT TTG TTC CGA TTA 3’

BamHI Sphl

Me t Gin Gin Gin ...

HU 219 267 Β

OTG4014:

5’ AAAAGGATCCGGGGTCGTAACGCGTCAGGTCGCGG 3’ BamHI Miül

Ezt a PCR-fragmentet BamHI restrikciós enzim- 5 mel emésztjük, majd az M13TG131 plazmid BamHI hasítási helyére klónozzuk, így kapjuk az M13TG3738 plazmidot. Ennek a fragmentnek a szekvenciáját igazoljuk.

Az M13TG3738 plazmidot azután Sphl restrikciós enzimmel linearizáljuk, a végeket T4 DNS-polimerázzal kezeljük, hogy tompa végeket állítsunk elő, majd Miül restrikciós enzimmel emésztjük, hogy azt a fragmentet állítsuk elő, amely a Tbpl prekurzor N-terminálisát kódoló régiót hordozza. 15

Ezt a fragmentet Ncol restrikciós enzimmel emésztett, majd T4 DNS-polimerázzal tompa végűvé tett, és Miül restrikciós enzimmel emésztett pTG3756 plazmidba építjük be, így állítjuk elő a pTG3778 plazmidot Az Ncol°/Sphl° kapcsolódás szekvenciáját meg- 20 határozzuk.

A pTG3720 plazmid Mlul-Xbal fragmentjét, amely a Tbpl legnagyobb részét kódolja (3’ tbpl) a pTG3778 plazmidba építjük be. A végeredményben kapott plazmid jele pTG3779.

4B) A Tbpl alegység előállítása

Az Escherichia coli MC1061 törzset a pTG3779 plazmiddal transzformáljuk, majd 37 °C-on LB-táptalajban tenyésztjük. Az exponenciális fázisban levő tenyészethez 0,2 g/1 arabinózt adunk. Az inkubálást ιοί 0 vábbi 4 óra hosszat folytatjuk.

Egy teljes sejtlizátum poli(akrilamid) gélelektroforézisével igazolható egy körülbelül 100 kDa méretű feltétje jelenléte, amelyet az antireceptor antitestek felismernek.

5. példa

Az IM2394 törzs Tbp2 alegységét kódoló DNSfragment expressziója (előállítás a homológ szignálszekvenciával)

5A) A pTG4710 expressziós vektor készítése

A pTG3749 plazmidból PCR-eljárással, az OTG4247 és OTG4248 indítómolekulák alkalmazásával előállítjuk a Tbp2 C-terminálisát kódoló fragmentet (a belső BamHI helytől), amely egy HindlII restrikciós hasítási helyet tar25 talmaz a tbp2 transzlációs terminációs kodonja előtt.

OTG4247:

5’ GGCTTTGCGCTGGATCCGCAAAATACC 3’

BamHI

OTG4248:

5’ CCCAAAAGATCTCCAAGCTTGAAGCCTTATTCTCGATTGTTCGGCAGCC 3’ HindlII

A PCR-rel előállított fragmentet HindlII és BamHI restrikciós enzimekkel emésztjük, és a pTG3749 plaz- 35 midből származó SphI-BamHI fragmenttel együtt, amely az érett Tbp2 N-terminálisát kódolja, egyszerre beépítjük a pTG3743 vektorba, amelyet Sphl és HindlII restrikciós enzimekkel emésztettünk, így kapjuk a pTG3786 plazmidot. A PCR-rel amplifikált fragment szekvenciáját ellenőrizzük.

A pTG3791 plazmidból az OTG4491 és OTG4494 indítómolekulák segítségével PVR-módszerrel előállítunk egy fragmentet, amely a Tbp2 prekurzor N-terminális részét kódolja, az EcoRV belső hasítási helyig.

OTG4491:

BspHI , _{TTTTTTGGATCCTCATG CCA TTG GTA CAG GCT}

Met Asn Asn Pro Leu Val Asn Glu Alá

Spgl

GCT ATC GTG CTG CCT GTC TTT TTG TTG AGT GCA TGC CTG GGT

Alá Met Val Leu Pro Val Phe Leu Leu Ser Alá Cys Leu Gly

A szignálpeptid hasítási helye

OTG4494:

5’ TTTTTTGGATCCGATATCCGTCAGGTCCAAAAAGAACTATATTATTC 3’ EcoRV

A PCR-rel előállított fragmentet BspHI és EcoRV restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a pTG3704 plazmid NcoI-SstI fragmentjével együtt, amely az araC gént és az araB promotert, valamint a pTG3786 EcoRV-SstI részével együtt, amely a tbp2 gén 3’ részét és az araB terminátort tartalmazza, egyszerre ligáljuk. A keletkező pTG4710 plazmidot szekvenálással ellenőrizzük (a PCR-rel amplifikált részt).

5B) A Tbp2 alegység előállítása

Az Escherichia coli Xac-I törzset [Normanly et al.,

Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 83, 6548 (1986)] transzformáljuk a pTG4710 plazmiddal, majd 37 °C-on tenyésztjük, M9+szukcinát+ +50 pg/ml arginin+100 pg/ml ampicillin összetételű táptalajban. Az exponenciális fázisban 0,2% arabinózt adunk hozzá. Különböző indukciós idő alkalmazása

HU 219 267 Β után (1-3 óra) a sejteket kinyerjük, és kivonatot készítünk belőlük. A Westem-blottal végzett elemzéssel ki lehet mutatni, a Tbp2 transzferrin-peroxidázzal való előhívása után, hogy a Tbp2 legnagyobb része prekurzor formában található. A kivonatok SDS-PAGE-vel való elválasztása, majd Coomassie-val való elemzése után ki lehet mutatni a fehérje nagy mennyiségben való termelődését (körülbelül 5-10%-a az összfehéije mennyiségének). A triciált palmitáttal és triciált glicerinnel végzett in vivő jelzési kísérletek lehetővé tették annak igazolását, hogy csak az érett forma van lipidálva.

6. példa

Az IM2394 törzs Tbp2 alegységét kódoló DNSfragment expressziója (a konstrukció az rlpB szignálszekvenciával készül)

6A) A pTG4764 expressziós vektor készítése

A pTG3786 plazmidból PCR-módszerrel, az

OTG4494 és az OTG4651 indítómolekulák alkalmazásával előállítunk egy fragmentet, amely az RlpB szignálpeptidet kódolja [Takase et al., Journal of Bacte10 riology, 169, 5692 (1987)], valamint az érett Tbp2 szekvenciának az elejét a belső EcoRV hasítási helyig.

OTG4494:

5’ TTTTTTGGATCCGATATCCGTCAGGTCCAAAAAGAACTATATTATTC 3’

EcoRV

OTG4651:

BspHI

5’ TTTTTTTCATG AGA TAC CTG GCA ACA TTG TTG TTA TCT Met Arg Tyr Leu Ala Thr Leu Leu Leu Ser

CTG GCG GTG TTA ATC ACC GCC GGG TGC CTG GGT GGC

Leu Ala Val Leu Ile Thr Ala Gly Cys Leu Gly ...

A szignálpeptid hasítási helye

GGC GGC AGT TTC 3’

A PCR-fragmentet azután BspHI és EcoRV enzimekkel emésztjük, majd a pTG3786 plazmid EcoRVHindlII fragmentjével együtt, amely a tbp2 gén 3’ részét kódolja, egyszerre építjük be az Ncol és HindlII restrikciós enzimekkel emésztett pTG3704 plazmidba, így kapjuk a pTG4764 plazmidot. A PCR-rel ampli- 30 fikáit fragment szekvenciáját ellenőrizzük.

6B) A Tbp2 alegység előállítása

Az Escherichia coli Xac-1 törzset transzformáljuk a pTG4764 plazmiddal, majd 37 °C-on tenyésztjük M9+0,5% szukcinát+50 pg/ml arginin+100 pg/ml 35 ampicillin összetételű táptalajban. Az exponenciális fázisban 0,2% arabinózt adunk hozzá. Különböző indukciós idő alkalmazása után (1-3 óra) a sejteket kinyerjük, és kivonatot készítünk belőlük. Western blottal végzett elemzéssel a Tbp2 transzferrin-peroxidázzal való 40 előhívása után ki lehet mutatni egy fő csíkot, amely a molekulatömeg alapján tisztított, érett Tbp2-nek felel meg. A kivonatok SDS-PAGE-vel való elválasztása, majd Coomassie-val való elemzése után ki lehet mutatni a fehérje nagy mennyiségben való termelődését (kő- 45 rülbelül 2-5%-a az összfehérje mennyiségének). A triciált palmitáttal és triciált glicerinnel végzett in vivő jelzési kísérletek lehetővé tették annak igazolását, hogy csak az érett forma van lipidálva. Az Xac-I/pTG4764 gazdavektorrendszerrel előállított érett, lipidált Tbp2 mennyisége nagyobb az Xac-I/pTG4710 gazdavektorrendszerrel előállítottnál.

Szekvencialista

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 1-RŐL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 1808 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iv) EREDETE:

(A) ORGANIZMUS: a transzferrinreceptor Tbp2 alegységét kódoló DNS (B) FORRÁS: Neisseria meningitidis IM2394 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 1...60 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: érett fehéije (B) NUKLEOTIDOK: 61...1797 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 1...1797 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 1:

atc Két -20

AAC Adn

AAT Asn

CCA TTG GTA

AAT Aon

CAG Cin

CCT Ala

GCT Ala

ATG Két -10

GTG Val

CTG Leu

CCT Pro

GTG Val

TTT Phe -5

48

bro

Leu

Val -15

TTC

TTG

AGT

GCT

TCT

CTG

GGT

GGC

CGC

GGC

AGT

TTC

CAT

TTG

CAC

AGC

96

Leu

Led

Ser

Ala

Cye

Leu

Cly

cly

Cly

Gly

Ser

Phe

Aop

Leu

Anp

Ser

HU 219 267 Β

10

GTG

GAÁ

ACC

GTC

CAA

GAT

ATG

CAC

TCC

AAA

CCT AAG

TAT

GAG

CAT

CAA

144

Val

Clu

Thr

Val

Gin

Aep

Met

lile

Ser

Lye

Pro Lye

Tyr

Glu

Aep

Clu

Í5

20

25

ΛΑΛ

AGC

cAg

CCT

GAA

AGC

CAA

CAG

GAT

GTA

TCG GAA

AAC

AGC

GCC

GCG

192

Lye

Ser

Gin

t>ro

Glu

Ser

Gin

Gin

Anp

Val

Ser Clu

Aen

Ser

Cly

Ala

30

35

40

GCT

TAT

CGC

TTT

GCA

GTA

AAA

CTA

CCT

CGC

CCG AAT

GCA

CAT

TTT

AAT

240

Ala

Tyr

Ciy

Phe

Ala

Val

Lye

Leu

Pro

Arg

Arg Aen

Ala

lile

Phe

Aen

45

50

55

60

CCT

AÁA

TAT

AAG

GAA

AAG

CAC

AAA

CCA

TTG

GCT TCA

ATC

CAT

TGG

AAA

288

Pro

Lye

Tyr

ty e

clu

Lye

Hle

Lye

Pro

L e u

Cly Ser

Met

Aep

Trp

Ly e

65

70

75

ΛΛΛ

CTG

CAA

ACA

GGA

CAA

CCA

AAT

AGT

TTT

AGT GAC

AGG

CAT

GAA

TTG

336

Lye

Leu

Gin

Arg

Gly

Glu

Pro

Aen

Ser

Phe

Ser Glu

Arg

Aep

Glu

Leu

80

85

90

CAA

AAA

AAA

CGG

GGT

AGT

TCT

GAA

CTT

ATT

GAA TCA

AAA

TGG

GAA

CAT

384

Glu

Lye

Ly b

Arg

Gly

Ser

Ser

Glu

Leu

Ile

Glu Ser

Lye

Trp

Clu

Anp

95

100

105

GGG

CAA

AGT

CGT

GTA

GTT

GGT

TAT

ACA

AAT

TTC ACT

TAT

CTC

CGT

TCG

432

Gly

Gin

Ser

Arg

Val

Val

Gly

Tyr

Thr

Ann

Phe Thr

Tyr

Val

Arg

Ser

110

115

120

GCA

TAT

GTT

TAC

CTT

AAT

AAA

AAT

AAT

ATT

GAT ATT

AAG

AAT

AAT

ΛΤΛ

480

Gly

Tyr

val

Tyr

Leu

Aen

Lye

Ann

Aen

I le

Anp Ile

Lye

Ann

Ann

I le

125

130

135

140

GTT

CTT

TTT

GGA

CCT

CAC

CCA

TAT

CTT

TAC

TAT AAA

GCG

AAA

CAA

CCT

528

Val

Leu

Plie

Gly

Pro

Aep

Gly

Tyr

Leu

Tyr

Tyr Lye

Gly

Lye

Clu

Pro

145

ISO

155

TCC

AAG

GAG

CTG

CCA

TCC

GAA

AAG

ΛΤΛ

ACT

TAT AAA

GGT

ACT

TGG

GAT

576

Ser

Lys

Glu

LeU

Pro

Ser

Glu

Lye

1 Le

Thr

Tyr Lyn

ciy

Thr

Trp

Aep

160

165

1 70

TAT

CTT

ACT

GAT

GCT

ATC

GAA

AAA

CAA

AGC

TTT GAA

GCA

TTC

GGT

AGT

624

Tyr

Val

Thr

Ab(

Ala

Met

Glu

Lye

Gin

Arg

Phe Glu

Gly

Leu

Gly

Ser

175

180

185

GCA

GCA

GGA

GGA

GAT

AAA

TCG

GGG

GCG

TTG

TCT GCA

TTA

CAA

CAA

GGG

672

Ala

Alá

Gly

Gly

Aep

Lye

Ser

Gly

Ala

Leu

Ser Ala

Leu

Glu

Glu

Cly

190

195

200

CTA

TTG

CGT

AAT

CAG

CCA

GAG

GCA

TCA

TCC

GGT CAT

ACC

GAT

TTT

GGT

720

Val

Leu

Arg

Aen

Gin

Ala

Clu

Ala

Ser

Ser

Gly lile

Thr

Aep

Phe

Gly

205

210

215

220

HU 219 267 Β

atc /let

ACT AGT GAG

TTT GAC GTT GAT TTT

TCT CAT

ΛΛΛ ACA ATA AAC GCC

768

Thr

Ser Glu

Phe 225

Glu

val

Aep

Phe

Ser 230

Aep

Lye

Thr

I le

Lye Gly 235

ACA

CTT

TAT CGT

aAc

AAC

CGT

ATT

ACT

CAA

AAT

AAT

AGT

GAA

AAC AAA

816

Thr

Leu

Tyr Arg

Aen

Aen

Arg

I le

Thr

Cin

Aen

Aon

Ser

GlU

Ann Lye

240

245

250

CAA

ATA

AAA ACT

ACG

CGT

TAC

ACC

ATT

CAA

CCA

ACT

CTT

CAC

GGC AAC

864

Gin

lle

Lye Thr

Thr

Arg

Tyr

Thr

1 le

Cin

Alá

Thr

Leu

Ilin

Gly Aen

255

260

265

CGT

TTC

AAA GGT

AAG

CCC

TTC

GCG

CCA

GAT

AAA

GGT

GCA

ACA

AAT GGA

912

Arg

Phe

Lye Gly

Lye

Alá

Leu

Alá

Alá

Aep

Ly e

Cly

Alá

Thr

Aen Gly

270

275

280

ACT

CAT

CCC TTT

ATT

TCC

GAC

TCC

GAC

AGT

TTG

CAA

GGC

CGA

TTT TAC

960

Ser

Hle

t>ro Phe

Ile

Ser

Aep

Ser

Aep

Ser

Leu

Glu

cly

Gly

Phe Tyr

285

290

295

300

GGG

CCC

AAA GGC

GAC

GAA

CTT

GCC

GGT

AAA

TTC

TTC

ACC

AAC

CAC AAC

1008

Gly

Pro

Lye Cly

Clu

Clu

Leu

Alá

Gly

Lyo

Phe

Leu

Ser

Ann

Aop Aen

305

310

315

AAA

GTT

GCA CCG

GTC

TTT

GGT

GCG

AAG

CAC

AAA

GAT

AAC

AAG

GAT GCG

1056

Lye

vál

Alá λ la·

Val

Phe

Gly

A le

Lye

Gin

Lye

Aop

Lye

Lyo

Aep Gly

320

325

330

GAA

AAC

GCG GCA

GGC

CCT

GCA

ACG

CAA

ACC

GTG

ATA

CAT

CCA

TAC CGT

1104

Glu

λβη

Alá Alá

Cly

Pro

Alá

Thr

Glu

Thr

Val

Ile

Λβρ

Alá

Tyr Arg

335

340

345

ATT

ACC

GGC CAG

GAG

TTT

AAG

AAA

GAG

CAA

ATA

CAC

ACT

TTT

GGA CAT

1152

Ile

Thr

Gly GlU

clu

Phe

Lye

Lye

Glu

Gin

Ile

Aep

Sor

1’ he

Gly Anp

350

355

360

GTC

AAA

AAC CTC

CTG

GTT

GAC

CGA

GTC

GAC

CTT

TCA

CTG

CTG

CCC TCT

1200

val

Lye

Lye Leu

Leu

Val

Aep

Gly

Val

Gl«i

Leu

Ser

Leu

Leu

Pro Set

365

370

375

380

GAC

CCC

AAT AAG

CCC

CCA

TTT

CAG

CAC

GAC

ATT

GAC

CAA

AAC

CCC GTG

1248

Glu

Gly

Aen Lye

Alá

Alá

Phe

Cin

(í i e

Glu

I le

Clu

Gin

Aon

Cly Val

385

390

395

AAG

GCA

ACG GTG

TGT

TGT

TCC

AAC

TTG

GAT

TAC

ATG

AGT

TTT

GGG AAC

1296

Lye

Alá

Thr val

Cye

Cye

Ser

Ann

Leu

Aep

Tyr

Mel

Ser

Phe

Gly Lye

400

405

410

CTG

TCA

AAA GAA

AAT

AAA

GAC

CAT

ATG

TTC

CTC

CAA

CGT

CTC

CGC ACT

1344

Leu

Ser

Lye Glu

Aen

Lye

Aep

Aep

Met

Phe

Leu

Gin

Cly

Val

Arg Thr

415

420

425

CCA

GTA

TCC CAT

GTC

GCG

GCA

AGG

ACG

CAG

CCA

AAC

GCC

AAA

TAT CGC

1392

Pro

Val

Set Aep

Val

Alá

Alá

Arg

Thr

Clu

Alá

Aen

Alá

Lye

Tyr Arg

430

435

440

HU 219 267 Β

GCT Gly 445

ACT Thr

TGC Trp

TAC Tyr

GGA TAT ATT GCC AAC GGC ACA AC-C TGG ACC CCC CAA

1440

Gly

Tyr 450

Ile

Ala

Ann

Cly

Tilt 455

Sec

Trp

Ser

Cly

Clu 460

GCC

TCC

ΛΛΤ

CAG

CAA

GGT

GCT

ΑΛΤ

ACG

CCA

CAG

TTT

GAC

GTC

GAT

TTT

1488

Ala

Ser

Aen

Cin

GlU

Gly

Gly

Aen

Arg

Ala

Glu

Phe

Aep

Val

Aep

Phe

465

470

475

TCC

ACT

AAA

AAA

ATC

ACT

GGC

ACA

CTG

ACG

GCA

AAA

GAC

CGT

ACG

TCT

1536

Ser

Thr

Lys

Lyd

ile

Ser

Cly

Thr

Leu

Thr

Ala

Lye

Aep

Arg

The

Ser

480

485

490

CCT

CCC

TTT

ACT

ATT

ACT

CCC

ATC

ATT

AAG

CAC

AAC

CCT

TTT

TCA

CCT

1584

Pro

Ala

Phe

Thr

Ile

Thr

Ala

Két

He

Ly β

Aep

Aen

Cly

The

Ser

Oly

495

500

505

GTG

tíCG

AÁA

ACC

GGT

GAA

AAC

CGC

TTT

GCG

CTC

GAT

CCC

CAA

ΛΛΤ

ACC

1632

Val

Alá

Lye

Thr

Gly

Glu

Aon

Gly

Phe

Ala

Leu

Aep

Pro

Cin

Aen

Thr

510

515

520

GGA

ΛΛΤ

TCC

CAC

TAT

ACG

CAT

ATT

GAA

GCC

ACT

GTA

TCC

CCC

GGT

TTC

1680

Gly

Aen

Ser

ille

Tyr

Thr

lile

Ile

Glu

Ala

The

Val

Ser

Cly

Gly

Phe

525

530

535

540

TAC

GGC

AAA

AAC ,bcC

ATC

CAG

ATG

CCC

GCA

TCG

TTC

TCA

TTT

CCC

GGA

1728

Tyr

Cly

Lys

Áeh

Ala

iíe

Glu

Két

Gly

Cly

Ser

Phe

Ser

Phe

Pro

Cly

545

550

555

ΑΛΤ

GCA

CCA

GAG

GCA

ΛΑΛ

CAA

GAA

AAA

GCA

TCC

GTG

CTA

TTC

GCT

GCG

1776

Asn

Alá

Pro

Glu

Gly

Lye

Gin

Glu

Lye

Ala

Ser

Val

Val

Phe

Gly

Ala

560

565

570

ΛΛΛ

CCC

CAA

CAG

CTT

CTC

CAA

TAAGCACCCC

T

1808

Lye

Arg

Cin

Gin

Leu

Val

Gin

575

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 2-RŐL (C) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: 40 (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje

(A)

HOSSZ: 595

aminc

isav

(xi)A

SZÉK

VENC

IALE!

[RASA

: SEQ

' ID NO. 2

(B)

TÍPUS

: amin

losav

Hét

Aen

Aen

Pro

Leu

val

Aen

Gin

Ala

Ala

Met

Val

Leu

Pro

Val

Phe

-20

-15

-10

-5

Leu

Leu

Ser

Ala

Cye

Leu

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Phe

Aep

Leu

Aep

5er

1

5

10

Val

Glu

Thr

Val

GÍn

Aep

Met

lile

Ser

Lye

Pro

Lye

Tyr

Glu

Aep

Glu

Í5

20

25

Lys

Ser

Gin

Pro

Glu

Ser

Gin

Gin

Aep

Val

Ser

Glu

Aen

Ser

Gly

Ala

30

35

40

Ala

Tyr

Cly

Phe

Ma

Val

Lye

Leu

Pro

Arg

Arg

Aen

Ala

lile

Phe

Aeh

45

50

55

60

HU 219 267 Β

Pro

Lye

Tyr

Lye

Glu 65

Lye

lile

Lye

Pro

Leu 70

Gly

Ser

Hét Aop Trp ' 75

Ly e

Lye

Leu

Cin

Ar$ 80

Giy

Glu

Pro

Aen

Ser 85

Phe

Sec

Glu

Arg Anp Glu 90

Leu

Glu

Lys

Lye 95

Arg

Gly

Ser

Ser

Glu 100

Leu

Ile

Clu

Ser

Lye Trp Glu , 105

Aep

Gly

Gin 110

Ser

Arg

Val

Val

Gly 115

Tyr

Thr

Aen

Phe

Thr 120

Tyr Val Arg

Ser

Gly 125

Tyr

Val

Tyr

Leu

Aen 130

Lye

Aon

Aon

Un

Aep 135

Ile

Lyo Aen Aon

Ile 140

Val

Led

Phe

Gly

Pro 145

Aep

Gly

Tyr

Leu

Tyr 150

Tyr

Lys

Gly Lye Clu 155

rto

Ser

Lye

Clu

Leu 160

Pro

Ser

Clu

Lye

Ile 165

Thr

Tyr

Lye

Gly Thr Trp 170

Anp

Tyr

Val

Thr 175

Aep

Ála

Hét

Glu

Lye 180

Gin

Arg

Phe

Glu

Gly Leu Gly 185

Ser

Ma

Alá 190

Gly

Gly

Aep

Lye

Ser 195

Gly

Alá

Leu

Ser

Alá 200

Leu Glu Glu

Gly

Val 205

Leu

Arg

Aen

Gin

Alá 210

Glu

Alá

Ser

Ser

Gly 215

lile

Thr Aep Phe

Gly 220

Hét

Thr

Ser

Glu

Phe 225

Glu

val

Aep

Phe

Ser 230

Aep

Lye

Thr Ile Lyo 235

Gly

Thr

Leu

Tyr

Arg 240

Asn

Aen

Arg

He

Thr 245

Cin

Aen

Aen

Ser Glu Aon 250

Lyn

Gin

Ile

Lye 255

Thr

Thr

Arg

Tyr

Thr 260

Ile

Gin

Alá

Thr

Leu Illő Gly 265

Ann

Arg

Phe 270

Lye

Gly

Lye

Alá

Leu 275

Alá

Alá

Anp

Lye

Gly 280

Alá Thr Aon

Gly

Ser 285

lile

Pro

Phe

ile

Ser 290

Aep

Ser

Aep

Ser

Leu 295

Glu

Gly Gly Phe

Tyr 300

Gly

Pro

Lye

Oly

Glu 305

Glu

Leu

Alá

Gly

Lye 310

Phe

Leu

Ser Aen Aep 315

Ann

Lye

Val

Alá

Ma

val

Phe

Gly

Alá

Lye

Gin

Lye

Aep

Lyo Lyo Aep

Gly

320 325 330

HU 219 267 Β

Glu

Aen

Alá

Alá

Gly

Pro

Alá

Thr

Glu

Thr

Val

Ile

Aep

Aln Tyr

Arg

3Í5

340

345

Ile

thr

Cly

clu

Gld

Phe

Lye

Lye

Glu

Cin

Ile

Aep

Ser

Phe Gly

Aep

350

355

360

Val

Lye

Lys

Led

Led

Val

Aep

Gly

Val

Clu

Leu

Ser

Leu

Leu Pro

Sér

365

370

375

380

Clu

Gly

Aen

Lye

Alá

Alá

Phe

Gin

lile

Glu

Ile

Clu

Gin

Aen Cly

vál

385

390

395

Lye

Alá

Thk

Val

Cye

Cye

Ser

Aen

Leu

Aep

Tyr

Met

Ser

Phe Gly

Lye

400

405

410

Leu

Ser

Lyá

Glu

Aen

Lye

Aep

Aep

Met

Phe

Leu

Gin

Gly

Val Arg

Thr

415

420

425

Pro

val

Ser

Apd

Val

Alá

Alá

Arg

Thr

Glu

Aln

Aen

Alá

Lyn Tyr

Arg

430

435

440

Gly

Thr

Trp

Tyr

Gly

Tyr

Ile

Alá

Aen

Gly

Thr

Ser

Trp

Ser Gly

Glu

445

450

455

460

Alá

Ser

Aen

Gin

Glu

Gly

Gly

Aen

Arg

A 1<1

Clu

Phe

Anp

Val Anp

Pho

465

470

475

Ser

Thr

Lye

Lye

Ile

Ser

Gly

Thr

Leu

Thr

Alá

Lye

Aep

Arg Thr

Ser

480

405

490

Pro

Alá

Phe

Thr

Ile

Thr

Alá

Met

Ile

Lye

Agp

Aen

Gly

Phe Ser

Gly

495

500

505

val

Alá

Lye

Thr

Cly

Glu

Aen

Cly

Phe

Alá

Leu

Aep

Pro

Gin Aen

Thr

510

515

520

Cly

Aen

Ser

lile

Tyr

Thr

lile

I le

Glu

A l a

Thr

val

Ser

Gly Gly

Phe

525

530

535

540

Tyr

Gly

Lye

Aen

Alá

Ile

Glu

Met

Gly

Gly

Ser

Phe

Ser

Phe Pro

Gly

545

550

555

Aan

Alá

Pro

Glu

Cly

Lye

Gin

Glu

Lye

Alá

Ser

Val

val

Phe Cly

Alá

560

565

570

Lys

Arg

Glh

Gin

Leu

Val

Gin

575

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 3-RÓL 55 (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 2800 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris 60 (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iv) EREDETE:

(A) ORGANIZMUS: a transzferrinreceptor Tbpl alegységét kódoló DNS (B) FORRÁS: Neisseria meningitidis IM2394 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

HU 219 267 Β (A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 40...111 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: érett fehérje (B) NUKLEOTIDOK: 112...2763 5 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 40.. .2763 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 3

CTTCCGATCC CGTCtGAAAG CGAACATTAC GCAAACACT ATG CAA CAG CAA CAT 54

Met Gin Gin Gin Illő -24 -20

TTC

TTC

CCA

ΤΤΛ

AAT

ATT

ΤΤΛ

TGC

CTG

TCT ΤΤΛ

ATG

ACC

GCG

CTG

CCC

102

Leu

Phe

Arg

Led

Aeh

Ile

Leu

Cy e

Leu

Ser Leu

Met

Thr

Ala

Leu

Pro

-15

-10

-5

GTT

TAT

CCA

GAA

AAT

GTG

CAA

GCC

GAA

CAA CCA

CAC

GAA

AAA

CAG

TTG

150

Val

Tyr

Alá

Glu

Aen

Val

Gin

Ala

Glu

Gin Ala

Cin

Glu

Lyo

Gin

Leu

1

5

10

CAT

ACC

ATA

CAC

GTA

AAA

GCC

AAA

AAA

CAG AAA

ACC

CGC

CGC

GAT

AAC

198

Aep

Thr

ile

Gin

Val

Lye

Ala

Lye

Lye

Gin Lyo

Thr

Arg

Arg

Aop

Aen

15

20

25

CAA

CTA

ACC

GGG

CTG

GGC

AAG

TTG

GTC

AAG TCT

TCC

CAT

ACG

CTA

AGT

246

Clu

Val

Thr

Gly

Leu

Gly

Lye

Leu

Val

Lye Ser

Ser

Aop

Thr

Leu

Ser

30

35

40

45

ΛΛΛ

CAA

CAC

GTT

TTG

AAT

ATC

CCA

CAC

CTG ACC

CGT

TAT

CAT

CCC

CCT

294

Lye

Clu

Cin

Val

Leu

Aen

Ile

Arg

Aep

Leu Thr

Arg

Tyr

Aep

Pro

Gl y

50

55

60

ATT

CCC

GTC

GTC

GAA

CAG

CGT

CCG

GGC

GCA AGT

TCC

CGC

TAT

TCA

ATA

342

Ile

Ala

Val

Val

Glu

Gin

Cly

Arg

Cly

Ala Ser

Ser

Gly

Tyr

Ser

I le

65

70

75

CGC

GCC

ATG

GAT

AAA

AAC

CCC

CTT

TCC

ΤΤΛ ACC

GTA

CAC

CGC

GTT

TCG

390

Arg

Gly

Met

Aep

Ly b

Aen

Arg

val

Ser

Leu Thr

Val

Aep

Gly

Val

Ser

eö

85

90

CAA

ATA

cAc

TCC

TAC

ACC

GCG

CAG

GCG

GCA TTG

CGT

GGG

ACG

AGG

ACG

438

Gin

líe

Cin

5er

Tyr

Thr

Ala

Gin

Ala

Ala Leu

Cly

cly

Thr

Arg

Thr

95

100

105

GCG

GCT

AGC

Acc

GGC

CCA

ATC

AAT

CAA

ATC CAG

TAT

CAA

AAC

GTC

AAG

486

Ala

Gly

Sér

Ser

Gly

Ala

Ile

Aen

Clu

Ile Glu

Tyr

Glu

Aen

Val

Lye

110

115

120

125

GCC

GTT

GAA

ATC

AGC

AAC

GGT

TCG

AAT

TCA TCA

GAA

TAC

CGA

AAC

CGC

534

Ala

Val

Gld

Ile

Set

Lye

Gly

Ser

Aen

Ser Ser

Glu

Tyr

Gly

Aon

Gly

130

135

140

CCA

TTG

GCA

GGT

TCG

CTC

CCA

TTT

CAA

ACC ΛΛΛ

ACC

CCA

CCC

CAC

ATT

582

Ala

Leu

Ala

Gly

Ser

Val

Ala

Phe

Gin

Thr Lye

Thr

Ala

Ala

Aep

Ile

145

ISO

155

ATC

CCA

CAG

CCA

AAA

CAC

TGC

GGC

ATT

CAG ACT

AAA

ACT

GCC

TAT

TCG

630

Ile

Gly

Glu

Gly

Lye

Gin

Trp

Gly

He

Gin Ser

Lye

Thr

Ala

Tyr

Ser

160 165 170

HU 219 267 Β

CGA

AÁA

CAC

CAT

GCC

CTG

ACG '

CAA

TCC '

CTT GCG ι

CTT 1

GCG GGA ι

CCC AGC

678

Cly

Lye

Aep

BLe

Alá

Leu

Thr 1

Gin

Ser

Leu Alá

Leu

Alá ι

Cly

Arg Ser

175

180

105

GGC

GGC.

GCG

CAA

GCC

CTC

CTT

ATT

TAT

ACT AAA

CCG

CGC

CGT

CGC GAA

726

Gly

Gly

Ma

Glu

Alá

Leu

Leu

Ile

Tyr

Thr Lye

Arg

Arg

Gly

Arg Glu

190

195

200

205

ATC

CAT

GCC

CAT

ΛΛΛ

GAT

GCC

GCC

AAG

GGT GTG

CAC

AGC

TTC

AAC CGG

774

Ile

HÍe

Alá

Hle

Lye

Aep

Alá

Cly

Lye

Gly Val

Cin

Ser

Phe

Aen Arg

2Í0

215

230

CTG

GTG

TTG

GAC

GAG

GAC

AAC

AAG

GAG

CGT CGC

AGT

CAC

TAC

ACA TAT

822

LeU

val

Leu

Aep

clu

Aep

Lye

Lye

Clu

Gly Gly

Ser

Cin

Tyr

Arg Tyr

225

230

235

TTC

ATT

CTC

GAA

GAA

GAA

TGC

CAC

AAT

GCA TAT

CCC

GCC

TGT

AAA AAC

870

Phe

He

Val

GlU

GlU

Clu

Cye

lile

Ann

Gly Tyr

Alá

Alá

Cye

Lye Aen

240

24 5

250

AAG

CTG

AAA

GAA

GAT

GCC

TCC

CTC

AAA

GAT CAG

CGC

AAA

ACC

CTC ACC

918

Lye

Leu

Lye

GlU

Λβρ

Alá

Ser

Val

Lye

Anp Clu

Arg

Lye

Thr

Val Ser

25S

260

265

ACC

CAC

GAT

TAT

ACC

CGC

TCC

AAC

CCC

ΤΤΛ CTT

GCC

AAC

CCG

CTT CAG

966

Thr

Cin

Aep

Tyr

Thr

Gly

Ser

Aen

Arg

Leu Leu

Alá

Aen

Pro

Leu Glu

270

275

280

285

TAT

GGC

AGC

CAA

TCA

TGG

CTG

TTC

CGA

CCG GGT

TGC

CAT

TTC

GAC AAC

1014

Tyr

Gly

Ser

Gin

Ser

Trp

Leu

Phe

Arg

Tro Gly

Trp

lile

Leu

Aep Aen

290

295

300

CGC

CAT

TAT

GTC

GGA

GCC

GTT

CTC

GAA

CGT ACG

CAG

CAG

ACC

TTT GAT

1062

Arg

Hle

tyr

Val

Gly

Alá

Val

Leu

Clu

Arg Thr

Gin

Cin

Thr

Phe Aep

305

310

315

ACA

CGC

GAT

ATG

ACT

GTT

CCT

GCC

TAT

TTT ACC

AGT

CAA

CAT

TAT CTA

1110

Thr

Arg

Aep

Hét

Thr

Val

Pro

Alá

Tyr

Phe Thr

Ser

Glu

Anp

Tyr Val

320

325

330

CCC

CGT

TCC

CTG

AAA

GCT

CTT

GCC

AAA

TAT TCG

CCC

GAT

AAT

AAG GCA

1158

Pro

Giy

Sét

Leu

Lye

Gly

Leu

cly

Lye

Tyr Sec

Gly

Aep

Aen

Lye Alá

335

340

345

GAA

ACtí

CTC

TTT

GTT

CAG

GCA

GAG

CGC

ACT ACA

TTG

CAG

CCT

ATC CCT

1206

Glu

Arg

LeU

Phe

Vál

Gin

Gly

Glu

Gly

Ser Thr

Leu

Gin

Cly

Ile Gly

350

355

360

365

TAC

CCT

Acc

GCC

CTG

TTT

TAT

GAT

GAA

CCC CAT

ACT

ΛΛΛ

AAC

CCC ΤΛΟ

1254

Tyr

Gly

Thr

Gly

Val

Phe

Tyr

Aep

Glu

Arg lile

Tbc

Lye

Ann

heg Tyr

370

375

380

GGC

GTC

GAA

TAT

CTT

TAC

CAT

AAT

GCT

' CAT AAG

GAT

ACC

TGG

CCC CAT

1302

Gly

Val

Glu

Tyr

Vil

Tyr

Hle

Aen

Alá

ι Anp Lye

Aep

Thr

Trp

' Alá Anp

385 390 395

HU 219 267 Β

TAC

GCC

CCA

CTT

TCT

TAT

CAC

CGC

CAA

CGT

ATA

GAT

TTC

CAC

AAC

CCT

1350

Tyr

Alá

Arg

teu

Ser

Tyr

Aep

Arg

Gin

Cly

He

Aep

Leu

Aep

Ann

Arg

4oo

405

410

TTC

CAC

CAG

ACG

CAT

TCC

TCT

CAC

GAC

GCT

TCC

CAT

AAA

AAT

TGC

CCT

1398

LeU

Gin

Cin

Thr

lile

Cye

Ser

lile

Aep

Cly

Ser

Aep

Lye

Aon

Cye

Arg

415

420

425

CCC

CAC

CGC

AAT

ΑΛΑ

CCG

TAT

TCT

TTC

TAT

AAA

TCC

GAC

CCC

ATC

ATT

1446

Pro

Aep

Cly

Aen

Lye

Pro.

Tyr

Ser

Phe

Tyr

Lye

Ser

Aep

Arg

Két

I le

430

435

440

445

TAT

GAA

gAa

AGC

CG A

AAC

CTC

TTC

CAA

GCA

CTA

TTT

AAA

AAC

CCA

TTT

1494

Tyr

Glu·

clu

Ser

Arg

Aen

Leu

Phe

Gin

Alá

Val

Phe

Lye

Lye

Alá

Phe

450

455

460

CAT

ACC

CCC

AAA

ATC

CGT

CAC

AAT

TTC

ACT

ATC

AAT

CTA

GGC

TAC

GAC

1542

Asp

Thr

Alá

Lye

Ile

Arg

Hl β

Aen

Leu

Ser

Ile

Aon

Leu

Cly

Tyr

Aep

465

470

475

CCC

TTT

AAG

TCC

CAA

TTC

TCC

CAC

ACC

CAT

TAT

TAT

CTT

CAA

AAC

CCA

1590

Arg

Fhe

Lye

Ser

Cin

Leu

Ser

IIL e

Ser

Aep

Tyr

Tyr

Leu

Gin

Aen

Alá

480

485

490

GTT

CAG

CCA

TAT

CAT

TTC

ATA

ACC

CCC

ΛΛΑ

AAC

CCT

CCC

TTT

CCC

AAC

1638

val

Gin

Alá

Tyr

Αβρ

Leu

Ile

Thr

Pro

Lye

Lye

Pro

Pro

The

Pro

Aon

435

500

505

CCA

ACC

AAA

CAC

Aac

CCG

TAT

AGG

CTG

TCT

ATC

CGC

AAC

ACC

ACG

GTC

1686

Gly

Ser

Lye

Aep

Aen

Pro

Tyr

Arg

Vnl

Sec

Ile

cly

Ly n

Thr

Thr

Val

510

515

520

525

AAT

ACA

TCG

CCC

Ata

TCC

CCT

TTC

CCC

ΛΛΤ

AAC

ACC

TAT

ACA

CAC

TGC

1734

Agn

Tht

Ser

Pro

Ile

Cy e

Arg

Phe

Cly

Aon

Aen

Thr

Tyr

Thr

Aep

Cye

530

535

540

ACA

CCC

ACG

AAT

ATC

CGC

CGC

AAC

GGT

TAT

TAT

GCA

GCC

GTT

CAA

GAC

1782

Thr

Pro

Arg

Aen

íle

Cly

cly

Agn

Cly

Tyr

Tyr

Alá

Alá

val

Cin

Aep

545

550

555

AAT

CTC

CCT

TTC

CCC

ACC

TCC

CCC

CAT

CTC

CCA

CCA

CCC

ATA

CGT

TAC

1830

Agn

Vaí

Arg

Leu

Cly

Arg

Trp

Alá

Aep

Val

Cly

Alá

Cly

Ile

Arg

Tyr

560

565

570

CAT

TAC

CGC

ACC

ACC

CAT

TCG

CAA

GAT

AAC

AGT

CTC

TCT

ACC

CCC

ACT

1878

Aep

Tyr

Arg

Set

Thr

Hle

Sec

Clu

Aep

Lye

Ser

Val

Ser

Thr

Gly

Thr

575

580

58S

CAC

CCC

AÁc

CTT

TCT

TGC

AAC

CCG

GGC

CTA

ere

CTC

AAA

CCT

TTC

ACC

1926

Hle

Arg

Aen

Leu

Set

Trp

Aon

Alá

Cly

Val

Val

Leu

Lye

Pro

Phe

Thr

590

595

600

605

TCC

ATC

CAT

TTC

ACT

TAT

CCC

CCT

TCT

ACG

CGC

TTC

CCT

CTC

CCC

TCC

Í974

Trp

Hét

Aep

Led

thr

Tyr

Arg

Alá

Sec

Tbc

Cly

Phe

Arg

Leu

Pro

Ser

610 615 620

HU 219 267 Β

TTT ccc Phe Ma

CAA ATC

TAT GCC Tyr Gly

TGC Trp

AGA GCC CGG CAC TCT TTG AAA ACG TTG

2022

Cld

Hét 625

Arg

Ma Gly 630

Glu

Ser

Led

Lyo 635

Thr

Leu

GAT

CTG

ΛΛΛ

CCC

CAA

AAA

TCC

TTT

AAT

ACA

CAC

CCA

GCT

ATT

CTA

TTT

2070

Asp

Leu

Lys

Pro

clu

Lye

Ser

phe

Aen

Arg

Glu

Alá

Cly

Ile

Val

Phe

640

645

650

AAA

CCC

CAC

TTC

GCC

AAT

TTC

GAA

GCC

ACC

TAT

TTC

AAC

AAT

CCC

TAT

2118

Lye

Cly

Aep

Phe

Cly

Aen

Leu

Clu

Alá

Ser

Tyr

Phe

Aen

Aon

AJ.a

Tyr

655

660

665

CCC

CAC

CTC

ATT

CCA

TTC

CGT

TAT

CAA

ACC

CCA

ACT

CAA

AAC

CCC

CAA

2166

Arg

Aep

Leu

I le

Ma

Phe

Cly

Tyr

Clu

Thr

Acg

Thr

Cin

Aon

Cly

Cin

670

675

600

605

ACT

TCC

CCT

TCT

CCC

CAC

CCC

CCA

TAC

CCA

AAT

CCC

CAA

AAT

CCA

CCG

2214

Thr

Ser

Alá

Ser

Cly

Aep

Pro

Cly

Tyr

Arg

Aen

Ma

Cin

Aen

Me

Acg

690

695

700

ATA

CCC

GCT

ATC

Αλτ

ATT

TTG

GGT

AAA

ATC

GAT

TGG

CAC

GGC

GTA

TGG

2262

Ile

Alá

ciy

He

Aen

Ile

Leu

Gly

Ly 0

Ile

Aep

Trp

lile

Cly

Val

Trp

705

710

715

CCC

CCC

TTC

CCG

CAC

GCG

TTC

TAT

TCC

ACG

CTT

CCC

TAT

AAC

CGT

ATC

2310

Cly

Cly

Leu

Pro

Aep

Gly

Leu

Tyr

Ser

Thr

Leu

Alá

Tyr

Aön

Arg

1 le

720

725

730

AAG

Ctc

AAA

CAT

CCC

CAT

ATA

CGC

GCC

CAC

ACG

ACC

TTT

GTA

ACT

TCA

2358

Lye

val

Lye

Aep

Alá

Aep

Ile

Arg

Alá

Aep

Arg

Thr

Phe

Val

Thr

Ser

735

740

745

TAT

CTC

TTT

CAT

GCC

CTC

CAA

CCT

TCA

CGA

TAT

GTA

TTC

CGT

TTC

GGT

2406

Tyr

Leu

Phe

Aep

Alá

Val

Cin

Pro

Ser

Arg

Tyr

Val

Leu

Gly

Leu

Cly

750

755

7 60

765

TAC

CAC

CAT

CCT

CAC

CCA

ATA

TCC

CCC

ATC

AAT

ACC

ATC

TTT

ACT

TAT

2454

Tyr

Asp

Hle

Pro

Aep

Cly

Ile

Trp

Cly

He

Aen

Thr

Hét

Phe

Thr

Tyr

770

775

780

TCC

AAG

CCA

ΛΛΛ

TCT

CTT

CAC

GAA

CTC

CTC

CCC

ACC

CAG

CCC

CTG

TTC

2502

Ser

Lyb

Alá

LyÖ

Ser

Val

Aep

Clu

Leu

Leu

Gly

Ser

Gin

Alá

Leu

Leu

785

790

795

AAC

GGT

AAT

GCC

AAT

GCT

AAA

AAA

GCA

CCA

TCA

CCC

CCC

ACC

CCC

CCT

2550

Aen

Gly

Aeh

Alá

Aen

Ma

Lys

Lye

Alá

Alá

Ser

Arg

Arg

Thr

Arg

Pro

800

805

010

TGG

TAT

GtT

ACG

CAT

CTT

TCC

CGA

TAT

TAC

AAT

ATC

AAG

AAA

CAC

CTC

2598

Trp

Tyr

vái

Thr

Λβρ

Val

Ser

Cly

Tyr

Tyr

Aen

I le

Lye

Lyo

II Ln

Leu

815

820

025

ACC

CTC

CGC

CCA

CGT

GTC

TAC

AAC

CTC

CTC

AAC

TAC

CCC

TAT

GTT

ACT

2646

Thr

Led

Arg

Alá’

Cly

vál

Tyr

Aen

Leu

Leu

Aen

Tyr

Arg

Tyr

Val

Thr

830

835

840

045

HU 219 267 Β

TCG Trp

GAA ΑΛΤ GTG CGG

CAA Gin

ACT Thr

GCC Alá

GCC GCC

GCA GTC AAC CAA CAC AAA

2694

GlU

Aen

Val Arg 850

Gly

Gly 855

Alá

Val

Ann Gin lile 060

l.y 8

AAT

CTC

GCC

GTT TAC

AAC

CCA

TAT

GCC

GCC

CCC

CGC

CCA AAC TAC

ACA

2742

Aen

Val

Gly

Val Tyr

Aen

Arg

Tyr

Alá

Alá

Pro

Gly

Arg Aon Tyr

Thr

865

870

875

TTT

ACC

TTG

CAA ATC

AAG

TTT

TAAACCTCCA

AACGCCGCAA ATGCCGTCTG

2793

Phe

Ser

LeU

Glu Hét

Ly e

The

880

AAAGGCT 2800

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 4-RŐL 15 (C) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (A) HOSSZ: 908 aminosav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 4

(B) TÍPUS: aminosav

Phe

Arg

Leu

Agn -15

He

Leu

Cye

Leu

Ser -10

Leu

Hét -24

Cin Glh

Gin

lile -20

Leu

Hét

Thr

Alá

Leu

Pro

Val

Tyr

Alá

Glu

Aon

Val

Cin

Alá

Glu

Gin

Alá

-5

1

5

Gin

Glu

Lys

Glh

Leu

Aep

Thr

Ile

GJ n

Val

Lye

Ma

Lyo

Lye

Gin

Lye

10

15

20

Thr

Arg

Arg

Aep

Αβπ

Glu

val

Thr

Gly

Leu

Gly

Ly 9

Leu

Val

Lye

Ser

25

30

35

40

Ser

Aep

thr

Leu

Seí

Ly β

Glu

Cin

val

Leu

Aen

Ile

Arg

Aep

Leu

Thr

4s

50

55

Arg

Tyr

Aep

Pro

GÍy

Ile

Alá

val

Val

Glu

Gin

Cly

Arg

Gly

Aln

Ser

60

65

70

Ser

GÍy

Tyr

Ser

Ile

Arg

Gly

Hét

Anp

Lye

Aon

Arg

val

Ser

Leu

Thr

75

00

05

val

Asp

Gly

val

Ser

Cin

Ile

Gin

Ser

Tyr

Thr

Alá

Gin

Alá

Alá

Leu

90

95

100

Gly

Gly

Thr

Arg

Thr

Alá

Gly

Ser

Ser

Gly

A In

He

Ann

Glu

Ile

Glu

105

110

115

120

Tyr

Glu

Aen

Val

Lye

Alá

Val

Glu

Ile

Ser

Lye

Cly

Ser

Aon

Ser

Ser

125

130

135

Glu

Tyr

Oly

Aen

Gly

Alá

Leu

Alá

Gly

Ser

Val

Alá

Phe

Gin

Thr

Lyn

140

145

150

Thr

Alá

Ála

Aep

Ile

Ile

Gly

Glu

Gly

Lyn

Gin

Trp

Gly

I le

Gin

Ser

155

160

165

HU 219 267 Β

Lys

Thr Alá Tyr Ser Cly Lye

Agp

lile Alá Leu The 180

Cin

Ser

Leu

Alá

170

175

Leu

Alá

Gly

Arg

Sec

Cly

Gly

Alá

Glu

A la

Leu

Leu

lle

Tyr

Thr

Lye

185

Í9Q

195

200

Arg

Arg

Cly

Arg

Glu

lle

lile

Alá

ll Le

Ly 9

Λπρ

Alá

Cly

Ly n

Cly

val

205

210

215

Cin

Ser

Phe

Aen

Arg

Leu

Val

Leu

Aep

Glu

Aep

Ly a

Lye

Glu

Gly

Gly

220

225

230

Ser

Gin

Tyr

Arg

Tyr

Phe

lle

Val

Glu

Glu

Glu

Cyn

II Le

Aen

Gly

Tyr

235

240

245

Alá

Alá

Cye

Lye

Aen

Lye

Leu

Ly e

Clu

Ληρ

Alá

Ser

Val

Ly n

Ληρ

Clu

250

255

2 60

Arg

Lye

Thr

Val

Ser

Thr

Gin

Aep

Tyr

Thr

Gly

Ser

Aen

Arg

Leu

Leu

265

270

275

280

Alá

Aen

Pro

Leu

GÍu

Tyr

Gly

Ser

Gin

Ser

Trp

Leu

Phe

Arg

Pro

Gly

285

290

295

Trp

H Le

LeU

Aep

Aen

Arg

lile

Tyr

Val

Cly

Alá

Val

Leu

clu

Arg

Thr

300

305

310

Cin

Cin

Thr

Phe

Aep

Thr

Arg

Aep

Hét

The

Val

Pro

Alá

Tyr

Phe

The

315

320

325

Ser

GlU

Aep

Tyr

Váí

Pro

Cly

Ser

Leu

Lye

Gly

Leu

Gly

Ly o

Tyr

Ser

330

335

340

Cly

Aep

Aen

Lye

Ma

Clu

Arg

Leu

Phe

Val

Gin

Gly

Clu

Gly

Ser

Thr

345

350

355

360

Leu

Cin

Gly

lle

Öly

Tyr

Gly

Thr

Gly

Val

Phe

Tyr

Aep

Glu

Arg

11 JLb

365

370

375

Thr

Lye

Abn

Arg

Tyr

Cly

Val

Clu

Tyr

Val

Tyr

II le

Aen

Alá

Aep

LyB

380

385

390

Aep

Thr

Trp

hla

Aep

Tyr

Alá

Arg

Leu

Ser

Tyr

Aep

Arg

Gin

Cly

1 le

395

400

405

Aep

Leu

Aep

Aen

Arg

Leu

Cin

Cin

Thr

Hlu

Cye

Ser

Illa

Aep

Cly

Sec

410

415

420

Aep

Lye

Aen

Cye

Arg

Pro

Aep

Gly

Aen

Ly 0

Pro

Tyr

Ser

Phe

Tyr

Lye

425

430

435

440

Sec

Abp

Arg

Bet

lle

Tyr

Glu

Glu

Ser

Arg

Ann

Leu

Phe

Cin

Alá

val

445 450 455

HU 219 267 Β

Phe Lye Lye Ma

Phe

Aep

Thr

Alá

Ly9 465

lle

Arg

II le

Asn

Leu 470

Ser

1 le

460

Aen

Leu

Gly

Tyr

Aep

Arg

Phe

Ly 9

Ser

Gin

Leu

Ser

lile

Ser

Anp

Tyr

475

400

405

Tyr

Leu

Cin

Aen

Alá

val

Cin

M a

Tyr

Anp

Leu

lle

Thr

Pro

Lye

I.y n

490

495

500

Pro

Pro

Phe

Pro

Aen

Gly

Ser

Lye

Aep

Ann

Pro

Tyr

Arg

val

Ser

lle

505

5Ϊ0

515

520

Cly

Lye

Thr

Thr

Val

Aen

Thr

Ser

Pro

I le

Cye

Arg

Phe

Cly

Agn

Ann

525

530

535

The

Tyr

Thr

Aep

Cye

Thr

Pro

Arg

Aen

I le

Cly

Cly

Aen

Cly

Tyr

Tyr

540

545

550

Alá

Alá

Val

Cin

Aep

Aen

Val

Arg

Leu

Gly

Arg

Trp

Alá

Anp

Val

Gly

555

560

565

Ma

Cíy

lle

Arg

Tyr

Aep

Tyr

Arg

Ser

Thr

lile

Ser

Clu

Aep

Lye

Sec

570

575

580

val

Ser

Thr

Cly

Thr

lile

Arg

Aen

Leu

Ser

Trp

Aen

A1. a

Cly

Val

Val

585

590

595

600

Led

Lye

Pro

Phe

Thr

Trp

Met

Aep

Leu

Thr

Tyr

Arg

Alá

Ser

Thr

Cly

605

610

615

Phe

Arg

Led

Pro

Ser

Phe

Alá

Glu

Met

Tyr

Gly

Trp

Arg

Alá

Cly

Clu

620

625

630

Ser

Léu

Lye

Thr

Leit

Aep

Leu

Lye

Pro

Cl.u

Lye

Ser

The

Aen

Arg

Glu

635

640

645

Ma

Cly

1 lé

Val

Phe

Lye

Cly

Aep

Phe

Cly

Aen

Leu

Clu

Alá

Ser

Tyr

650

655

660

Phe

Aen

Aen

Alá

Tyr

Arg

Aep

Leu

lle

Alá

The

Gly

Tyr

Clu

Thr

Arg

66S

670

675

600

Thr

tíln

Aeri

Gly

Cin

Thr

Ser

Alá

Ser

Gly

Aep

Pro

Gly

Tyr

Arg

Ann

685

690

695

Ma

Gin

Arin

Alá

Átg

lle

Alá

Gly

He

Ann

I le

Leu

Cly

Lyo

lle

Anp

700

705

710

Trp

Hle

GÍy

Val

Trp

Cly

Gly

Led

Pro

Aep

Gly

Leu

Tyr

Sec

Thr

Leu

7i5

7 20

725

Ma

Tyr

Λβπ

Arg

lle

Lye

Val

Lye

Aep

Ma

Aep

lle

Arg

Alá

Anp

Arg

730 735 740

HU 219 267 Β

Thr

Phe

Val Thr Ser

Tyr

Leu

Phe

Aep

Alá

val

Cin Pro

Ser

Arg

Ty r

745

750

755

760

val

Led

Gly Leu Gly

Tyr

Aep

lile

Pro

Aep

Gly

Ile Trp

Gly

I le

Aen

765

770

775

Thr

Hét

Phe Thr Tyr

Sér

Lye

Alá

Lye

Se r

Val

Aep Glu

Len

Leu

Gly

7Θ0

705

790

Ser

Cin

Alá Leu Leu

Aen

Gly

Aen

Alá

Ann

Alá

Lyo Lye

Alá

Alá

Ser

795

800

005

Arg

Arg

Thr Arg Pro

Trp

Tyr

Val

Thr

Anp

Val

Ser Gly

Tyr

Tyr

Aon

8Í0

015

020

Ile

tye

Lye Hle Led

Thr

Leu

Arg

Alá

Gly

Val

Tyr Aen

Leu

Leu

Aen

Θ25

830

835

040

Tyr

Xrg

Tyr Val Thr

Trp

Glu

Aen

Val

Arg

Gin

Thr Alá

Gly

Gly

A la

845

050

055

val

Aen

Gin ílle Lye

Aen

Val

Gly

Val

Tyr

Aen

Arg Tyr

Alá

Alá

Tro

860

065

070

Gly

Arg

Aen Tyr Thr

Phe

Ser

Leu

Glu

Bet

Lye

Phe

075 080

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 5-RŐL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A)HOSSZ: 2809bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iv) EREDETE:

(A) ORGANIZMUS: A transzferrinreceptor Tbpl alegységét kódoló DNS (B) FORRÁS: Neisseria meningitidis IM2169 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 71...142 35 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: érett fehérje (B) NUKLEOTIDOK: 143... 2803 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A)NÉV/FUNKCIÓ: cDNS 40 (B) NUKLEOTIDOK: 71...2803 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 5

ATCAACAATA AGGCTTCAGA CGGCATCGCT CCTTCCCATA CCGTCTCAAA

GCGAAGATTA

GGGAAACATT ATG CAA CAG CAA CAT TTC TTC CGA TTA AAT ATT TTA TGC 109

Bek Gin Cin cin IlLe Leu Phe.Arg Leu Aen Ile Leu Gye -24 -20 -15

CTG LeU

TCG Set -10

CTG Leu

ATG Bet

ACT Thr

GCG CTG

CCT GCT TAT

GCA GAA Aln Glu 1

AAT GTG CAA

GCC Alá 5

157

Alá

Leu -5

Pro

Alá

Tyr

Aen

Val

Gin

GGA

CAA

GCA

CAG

gXa

ΛΛΛ

CAC

TTC

GAT

ACC

ATA

CAG

CTA

AAA

GCC

ΛΛΛ

205

Gly

Gin

Alá

Gin

Glu

Lye

Gin

Leu

Aep

The

Ile

Gin

val

Ly b

Alá

Lye

lo

15

20

AAA

CAG

AAA

ACC

CCC

CGC

CAT

AAC

GAA

CTA

ACC

GCT

CTG

GGC

AAA

TTG

253

Ly β

Glh

Lye

Thr

Arg

Arg

Asp

Aen

Glu

V.il

Thr

Cly

Leu

Gly

Ly n

Leu

30 35

HU 219 267 Β

GTC

AAA

ACC

GCC

GAC

ACC

CTC

AGC

AAG

GAA

CAG

GTA

CTC '

CAT i

ATC '

CGC

301

Val

Lye

Thr

Al a

λβρ

Thr

Leu

Ser

J.y o

Glu

Cin

val

Leu ,

Aep

Ile

Acg

40

45

50

CAC

CTG

ACC

CCT

TAC

GAC

CCC

GGC

ATC

GCC

GTG

GTC

GAA

CAG i

GGC

CGC

349

Aep

Leu

Thr

Arg

Tyr

Aep

Pro

Gly

Ile

Alá

Val

val

Glu

Gin

Gly

Arg

55

60

65

GGC

GCA

AGT

TCG

GGC

TAC

TCG

AT A

CGC

GGT

ATG

CAC

AAA

AAC

CGC

CTT

397

Gly

Alá

Sér

Ser

Gly

Tyr

Ser

I le

Arg

Gly

Két

Aep

Lye

Aen

Arg

Val

70

75

80

85

TCC

TTG

Acg

GTG

GAC

GCC

TTG

GCG

CAA

ΛΤΛ

CAG

TCC

TAC

ACC

GCC

CAG

445

Ser

Leu

Thr

val

Aep

Gly

Leu

Alá

Gin

Ile

Cin

Ser

Tyr

Thr

Alá

Cin

90

95

100

GCG

CCA

TTG

GGC

GGG

ACC

ACC

ACC

GCC

GCC

AGC

AGC

CCC

GCA

ATC

AAT

493

Alá

Alá

Leu

ciy

Oly

Thr

Arg

Thr

Alá

G J y

Ser

Ser

Cly

Aln

Ile

Aen

105

1)0

Π5

CAA

ATC

CAG

TAT

CAA

AAC

CTC

AAA

GCT

GTC

CAA

ATC

AGC

AAA

GGC

TCA

541

Glu

Ile

Glu

Tyr

Cili

Aen

Val

Lye

Alá

Va).

Glu

Ile

Ser

Lye

Gly

Ser

120

125

130

AAC

TCG

GTC

gAa

CAA

CGC

ACC

GGC

GCA

TTG

GCC

CGT

TCC

CTC

GCA

TTT

589

Aen

Ser

Vél

CluI

Gin

Gly

Ser

Cly

Aln

Leu

Alá

cly

Ser

Val

Alá

Phe

Í35

140

145

CAA

ACC

AAA

ACC

GCC

GAC

CAT

CTT

ATC

CCG

CAA

CGC

AGG

CAC

TGG

GGC

637

Gin

Thr

Lyá

thr

Alá

Aep

Aep

Val

1 le

Gly

Clu

cly

Arg

Cin

Trp

Cly

150

lss

160

16S

ATT

CAG

AGT

AaA

ACC

CCC

TAT

TCC

GGC

ΛΛΛ

AAC

CCG

GCG

CTT

ACC

CAA

685

Ile

Cin

Ser

Lye

Thr

Alá

Tyr

Ser

Gly

Lye

Aon

Arg

Cly

Leu

Thr

Gin

Í7O

175

100

TCC

ATC

GCG

CTG

GCG

GGG

CCC

ATC

GGC

CGT

GCG

CAG

GCT

TTG

CTG

AfC

733

Ser

Ile

Alá

Led

Ála

Cly

Arg

Ile

Gly

Gly

Λ1Λ

Clu

Alá

Leu

Leu

Ile

185

190

195

CAC

ACC

CGC

CCG

CCC

GCG

GGG

GAA

ATC

CCC

GCA

CAC

GAA

GAT

GCC

CCA

781

Hle

Thr

Gly

Arg

Arg

Alá

Gly

Clu

1 le

Arg

Alá

lile

Glu

Anp

Alá

Gly

200

205

210

CGC

CGC

GTT

CAG

AGC

TTT

AAC

AGC

CTG

GTG

CCG

GTT

GAA

CAC

AGC

AGC

829

Arg

Gly

Val

Gin

Ser

Phe

Aen

Arg

Leu

Val

Pro

Val

Glu

Aep

Ser

Ser

215

220

225

CAA

TAC

GCC

TAT

TTC

ATC

CTT

CAA

CAT

GAA

TGC

GAA

GCC

AAA

AAT

TAC

877

Glu

Tyr

Alá

Tyr

Phe

Ile

Val

Glu

Aep

Glu

Cy e

Glu

Gly

Lye

Aen

Tyr

230

235

240

245

GAA

ACG

TGT

ΑΛΛ

AGC

AAA

CCC

AAA

AAA

GAT

CTT

GTC

CGC

AAA

CAC

GAA

925

Glu

Thr

CyB

Lye

Ser

Lye

Pro

Lye

Lye

Aep

val

Val

Gly

Lye

Aep

Glu

250

255

260

HU 219 267 Β

CCT

CAA

ACG

GTT

TCC

ACC

CGA

CAC

TAC

ACG

GGC

CCC

AAC CGC

TTC

CTC

973

Acg

Cin

Thr

Val

Ser

Thr

Acg

Aep

Tyr

Thr

Gly

Pro

Ann Acg

Phe

Leu

265

270

275

GCC

CAT

CCG

CTT

TCA

TAC

GAA

AGC

CGA

TCG

TGG

CTG

TTC CGC

CCC

GGT

1021

Mi

Aöp

Pro

Led

Ser

Tyr

Glu

Ser

Arg

Ser

Trp

Leu

Phe Arg

Pro

Gly

280

285

290

TTT

CGT

TTT

GAA

AAC

AAA

CGG

CAC

TAC

ATC

GGC

GGC

ATA CTC

CAA

CAC

1069

Phe

Arg

Phe

Gld

Aen

Lye

Arg

Hle

Tyr

Ile

Gly

Cly

Ile Leu

Glu

lile

295

300

305

ACC

CAA

CAA

ACT

TTC

CAC

ACG

CGC

GAT

ATC

ACG

GTT

CCG CCA

TTC

CTG

1117

Tht

Gin

Glh

Tht

Phe

Aep

Thr

Arg

Aep

Met

Thr

Val

Pro Ala

Phe

Leu

310

315

320

325

ACC

AAG

GCC

GTT

TTT

GAT

CCA

AAT

TCA

AAA

CAG

CCC

GCT TCT

TTG

CCC

1165

Thr

Lys

Xla

Val

Phe

Aep

Ala

Aen

Ser

Lys

Gin

Ala

Gly Ser

Leu

Pro

330

335

340

CGC

AAC

GGC

AAA

TAC

CCC

GGC

AAC

CAC

AAA

TAC

CCC

GCA CTG

TTT

ACC

1213

Gly

Aen

Gly

Lye

Tyr

Ala

Gly

Aen

lile

Lye

Tyr

Gly

Gly Leu

Phe

Thr

345

350

355

AAC

GCC

CAA

AAC,

CGT

CCC

CTG

CTG

CGC

CCG

CAA

TAC

CGT ACC

CGC

CTG

1261

Aen

Cly

Gld

Aen

Gly

Ala

Leu

Val

Gly

Ala

Glu

Tyr

Gly Thr

Gly

Val

360

365

370

TTT

TAC

GAC

GAG

ACC

CAC

ACC

AAA

AGC

CCC

TAC

GGT

TTG CAA

TAT

CTC

1309

Phe

Tyr

Aep

Glu

The

lile

Thr

Lye

Ser

Arg

Tyr

Cly

Leu Glu

Tyr

Val

375

380

385

TAT

ACC

AAT

GCC

CAT

AAA

CAC

ACT

TGC

CCG

CAT

TAT

CCC CGC

CTC

TCT

1357

Tyr

Thr

Aen

Ala

Aep

Lye

Aep

Thr

Trp

Ala

Aep

Tyr

Ala Arg

Leu

Ser

390

395

400

405

TAC

CAC

CGG

CAG

GGC

ATC

GGT

TTG

GAC

AAT

CAT

TTT

CAG CAG

ACC

CAC

1405

Tyr

Aep

Arg

Gin

Gly

He

Gly

Leu

Aep

Aon

lile

Phe

Cin Gin

Thr

II l e

440

415

420

TGT

TCT

GCC

CAC

CGT

TCC

GAC

AAA

TAT

TGC

CGC

CCG

AGT CCC

CAC

AAG

14S3

Cye

Ser

Ala

Aep

Gly

Ser

Aep

Lye

Tyr

Cye

Arg

Pro

Ser Ala

Anp

Ly ο

425

430

435

CCG

TTT

TCC

TAT

TAC

AAA

TCC

GAC

CGC

CTC

ATT

TAC

GCG CAA

AGC

CAC

1501

Pro

Phe

Ser

Tyr

Tyr

Lye

Ser

Aep

Arg

Val

Ile

Tyr

Cly Glu

Ser

Illő

440

445

450

AGG

CTC

TTC

CAC

GCG

GCA

TTC

AAA

AAA

rcc

TTC

GAT

ACC CCC

AAA

ATC

1549

Arg

Led

Led

Gin

Ala

Ala

Phe

Lye

Ly o

Sec

The

Aop

The Ala

Ly o

I le

455

460

465

CGC

CAC

AAC

CTG

AGC

GTG

AAT

CTC

GGG

TTT

CAC

CGC

TTT GAC

TCT

AAT

1597

Arg

Mle

Aen

Led

Ser

Val

Aen

Leu

Cly

The

Aep

Arg

The Aop

ι Ser

Aen

470

475

4 00

485

HU 219 267 Β

CTC

CGC

CAT

CAC

CAT

TAT

TAT

TAT

CAA CAT CCC

AAC CGC

GCC

TAT

TCG

1645

Led

Arg

Hle

Gin

Áep

Tyr

Tyr

Tyr

Gin lile Alá

Aen Arg

Alá

tyr

Ser

490

495

500

TCC

AAA

ACG

CCC

CCT

AAA

ACC

GCC

AAC CCC AAC

GGC GAC

AAG

AGC

AAA

1693

Ser

Lys

Thr

Pro

Pro

Lye

The

Alá

Aen Tco Apn

Gly Aep

Lye

Ser

Lye

505

510

515

CCC

TAT

TGG

GTC

AGC

ATA

GGC

GGG

GCA AAT GTC

GTT ACC

GGG

CAA

ATC

1741

Pro

Tyr

Trp

Val

Set

lle

Gly

Gly

Gly Aon Val

Val Thr

Gly

Gin

I le

620

525

530

TCC

CTC

TTT

GCC

AAC

AAT

ACT

TAT

ACC CAC TCC

ACG CCC

CGC

ACC

ATC

1789

Cye

Led

Phe

Gly

Aen

Aen

The

Tyr

The Aep Cye

The Pro

Arg

Ser

he

535

540

545

MC

CGC

K.AA

ACC

TAT

TAC

GCG

GCA

CTT CGG CAC

AAT CTC

CGT

TTG

CGC

1837

Aen

Cly

Lye

Ser

Tyfc

Tyr

Alá

Alá

Val Arg Aep

Aen Val

Arg

Leu

Gly

550

555

560

565

AGG

TGG

GCG

GAT

GTC

GGC

CCG

GGG

TTG CGC TAC

GAC TAC

CGC

AGC

ACG

1885

Arg

Trp

Alá

Aep

Val

Gly

Alá

Gly

Leu Arg Tyr

Aep Tyr

Arg

Ser

Thr

57Ö

575

580

CAT

TCC

CAC

CAC

cCc

AGC

CTT

TCC

ACC CCC ACC

CAC CGC

ACC

CI'G

TCC

1933

Hie

ser

Aep

Aep Gly

Ser

val

Ser

Thr Gly Thr

Illa Arg

Thr

Leu

Ser

585

590

595

TGC

AAC

CCC

CGC

ATC

GTC

CTC

AAA

CCT GCC GAC

TGG CTG

GAT

TTG

ACT

1981

Trp

Aen

Alá

Cly

lle

Val

Leu

Lye

Pro Alii Aep

Trp Leu

Aop

Leu

Thr

600

605

610

TAC

CCC

ACT

TCA

ACC

GGC

TTC

CGC

CTG CCC TCG

TTT GCC

CAA

ATG

TAC

2029

Tyr

Arg

Τίΐζ

Ser

Thr

Cly

Phe

Arg

Leu Pro Sec

Phe Alá

Glu

Met

Tyr

615

620

625

GGC

TGG

CGG

TCG

GGT

GTT

CAA

AGC

AAG GCG CTC

AAA ATC

CAT

CCC

GAA

2077

Gly

trp

Arg

Ser

Cly

Val

Cin

Ser

Lye Alá Val

Lye lle

Aop

P co

Glu

630

635

640

64 5

AAA

TCG

TTC

AAC

AAA

GAA

CCC

GGC

ATC GTG TTT

AAA CGC

CAT

TTC

GGC

2125

Lye

Ser

Phe

Aen

Lye

Clu

Alá

Gly

lle Val Phe

Lye Cly

Aep

Phe

Gly

650

655

660

AAC

TTC

GAC

GCA

AGT

TGG

TTC

AAC

AAT CCC TAC

CGC CAT

TTG

ATT

GTC

2173

Asn

Leu

Glu

Alá

Ser

Trp

Phe

Ληη

Aen Alá Tyr

Arg Aop

Leu

lle

Val

665

670

675

CGG

CGT

TAT

GAA

CCG

CAA

ATT

AAA

AAC GCC AAA

GAA CAA

CCC

AAA

GGC

2221

Arg

Gly

tyr

Glu

Alá

Gin

He

Lye

Aen Cly Lye

Glu Glu

Alá

Lye

Gly

680

685

690

GAC

CCG

GCT

TAC

CTC

AAT

GCC

CAA

AGC CCG CGG

ATT ACC

GGC

ATC

AAT

2269

Asp

Pro

AÍa

tyr

LeU

Aen

Alá

Cin

Ser Alá Arg

lle Thr

Gly

lle

Aen

695

700

705

HU 219 267 Β 2

ATT

TTG

GGC

AAA

ATC

GAT

TCG

AAC

CCC

GTA

TGG

GAT

AAA

TTG

CCC

GAA

2317

Ile

LeU

Gly

Lye

I le

Aep

Trp

Asn

Cly

Vnl

Trp

Asp

Lys

Leu

Pro

Glu

710

715

720

725

GGT

TGG

TAT

TCT

ACA

TTT

GCC

TAT

AAT

CGT

GTC

CAT

GTC

CGC

CAC

ATC

2365

Gly

Trp

Tyr

Ser

Thr

Phe

Alá

Tyr

Aen

Arg

Vnl

lile

Val

Arg

Aep

Ile

730

735

740

AAA

AAA

CGC

CCA

GAC

CGC

ACC

CAT

ATT

CAA

TCA

CAC

CTG

TTT

CAT

GCC

2413

Lye

Lye

Arg

Alá

Aep

Arg

Thr

Aep

Ile

Gin

Ser

lile

Leu

Phe

Aep

Alá

745

750

755

ATC

CAA

CCC

TCG

CGC

TAT

GTC

GTC

CGC

TTG

CGC

TAT

CAC

CAA

CCG

GAA

2461

Ile

Cin

Pto

Ser

Arg

Tyr

Val

Val

Gly

Leu

Gly

Tyr

Aep

Gin

Pro

Glu

760

765

770

GGC

Αλα

TtíG

GGT

GTG

AAC

CCT

ATG

CTG

ACT

TAT

TCC

AAA

GCC

AAG

GAA

2509

Gly

Lye

trp

Gly

Val

Aen

Cly

Hét

Leu

Thr

Tyr

Ser

Lye

Alá

Lye

Clu

775

700

705

ATC

ACA

CAG

TTG

TTG

GGC

ACC

CCG

GCT

TTC

CTC

AAC

CCC

AAC

AGC

CGC

2557

Ile

Thr

GlU

Leu

Leu

Cly

Ser

Arg

Alá

Len

Leu

Aen

Cly

Aen

Ser

Arg

790

795

000

005

AAT

ACA

AAA

CCC

ACC

GCC

CGC

CCT

ACC

CGC

CCT

TCG

TAT

ATT

GTG

GAT

2605

Aen

Thr

Lye

Alá

Thr

Alá

Arg

Arg

Thr

Arg

Pro

Trp

Tyr

Ile

Val

Aop

810

015

020

CTG

TCC

CGT

TAT

TAC

ACC

ATT

AAA

AAA

CAC

TTC

ACC

CTC

CGT

GCC

GGC

2653

Val

Ser

Cly

Tyr

Tyr

Thr

Ile

Lye

Lye

lile

The

Thr

Leu

Arg

Alá

Gly

825

030

035

GTC

TAC

AAC

CTC

CTC

AAC

TAC

CCC

TAT

CTT

ACT

TGC

GAA

AAT

GTC

CCG

2701

Val

Tyr

Aen

Leu

Leu

Aen

Tyr

Arg

Tyr

v.il

Thr

Trp

Glu

Aen

val

Arg

840

045

050

CAA

ACT

GCC

GGC

CGC

GCA

GTC

AAC

CAA

CAC

AAA

AAT

GTC

GGC

GTT

TAC

2749

Gin

Thr

Alá

Gly

Gly

Alá

Val

Aon

Gin

lile

• Lye

Aen

Val

Gly

Val

Tyr

855

860

865

AAC

CCA

TAT

GCC

GCC

CCC

GGC

CCA

AAC

TAC

ACA

TTT

AGC

TTG

GAA

ATG

2797

Asn

Arg

Tyr

Alá

Alá

Pro

Cly

Arg

Λβπ

Tyr

Thr

Phe

Ser

Leu

Glu

Hét

870

875

800

005

AAG

TTT

TAAACG

2009

Lye Phe

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 6-RÓL 50 (C) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehéije (A) HOSSZ: 911 aminosav (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 6 (B) TÍPUS: aminosav

Kel -24

Cin

Glri

Gin

His -20

Leu

The

Arg

Leu

Ann -15

I le

Leu Cye

Leu

Ser -10

Leu

Hét

Thr

Alá

Leu

Pro

Alá

Tyr

Alá

Glu

Ann

Val

Gin Alá

Gly

Cin

Alá

-5 1 5

HU 219 267 Β

Gin Glu Lys Gin Leu Αβρ Thr

1 le

Gin Val

Lye

Alá 20

Lyo

Lye Cin

Lye

10

15

Thr

Arg

Arg

Aep

Aen

Clu

Val

Thr

Gly

Leu

Cly

Lyo

Leu

Val

Lyo

The

25

30

35

40

Alá

Aep

Thr

Leu

Ser

Lye

Glu

Gin

Val

Leu

Anp

Ile

Arg

Aop

Leu

The

45

50

55

Arg

Tyr

Aep

Pro

Gly

Ile

Alá

Val

Val

Glu

Gin

Gly

Arg

Gly

AI a

Ser

60

65

70

Ser

Gly

Tyt

Ser

Ile

Arg

Gly

Hét

Aep

Lye

Aen

Arg

Val

Ser

Leu

Thr

75

80

85

val

Αβρ

Gly

Leu

Alá

Cin

Ile

Gin

Ser

Tyr

Thr

Alá

Gin

Alá

Aln

Leu

90

95

100

Gly

Gly

Thr

Arg

Thr

Alá

Gly

Ser

Sec

Gly

Alá

Ile

Aon

Glu

Ile

GJu

105

110

1)5

120

Tyr

Glü

Aen

Val

Lye

Alá

val

Clu

Ile

Ser

Lye

Gly

Ser

Aen

Ser

Val

125

130

135

Glu

Gin

Gly

Ser

Gly

Alá

Leu

Alá

cly

Ser

val

Alá

Phe

Gin

Thr

Lyo

Í40

145

150

Thr

Alá

Aep

Aep

Val

Ile

Gly

Glu

Gly

Arg

Cin

Trp

Gly

He

Gin

Ser

1S5

160

165

Lye

Thr

Alá

Tyr

Ser

Gly

Lye

Aen

Arg

Gly

Leu

Thr

Cin

Ser

De

Alá

170

175

180

Leu

Alá

Gly

Arg

He

Gly

Gly

Alá

Glu

Aln

Leu

Leu

Ile

Illa

Thr

Gly

185

190

195

200

Arg

Arg

Alá

Cly

Glu

Ile

Arg

Alá

lile

Glu

Anp

Alá

Gly

Arg

Cly

Val

205

210

215

Gin

Ser

Phe

Α9Π

Arg

Leu

Val

Pro

Val

Glu

Aep

Ser

Ser

Glu

Tyr

Alá

220

225

230

Tyr

Phe

He

val

Glu

Aep

Glu

Cye

Clu

Gly

Lyo

Aon

Tyr

Glu

Thr

Cy a

235

240

245

Lye

Ser

Lye

Pro

Lye

Lye

Aep

val

Val

cly

Lye

Aop

Glu

Arg

Gin

Thr

250

255

260

vaí

Ser

Thr

Arg

Aep

Tyr

Thr

Cly

Pro

Aon

Arg

Phe

Leu

Alá

Agp

Pro

265

270

275

280

Leu

Ser

Tyr

Glu

Ser

Arg

Ser

Trp

Leu

Phe

Arg

Pro

ciy

Phe

Arg

The

285

290

295

clu

Aen

Lye

Arg

lile

Tyr

Ile

Gly

Gly

7 le

Leu

Glu

lile

Thr

Gin

Gin

300 305 310

HU 219 267 Β

Thr

Phe

Aep 315

Thr

Arg

Aep

Hét

Thr 320

Val Pro

Ala

Phe

Leu 325

Thr

Lye

Ala

Val

Phe

Aep

Ala

Abn

Ser

Lye

Gin

Ala Gly

Ser

Leu

Pro

Cly

Aon

Cly

j30

335

340

Lye

Tyr

Alá

Gly

Asn

lile

Lye

Tyr

Gly Gly

Leu

Phe

Thr

Ann

Gly

Glu

345

350

355

360

Aen

Gly

Ala

Leu

val

Gly

Ala

Glu

Tyr Gly

Thr

Gly

val

Phe

Tyr

Aop

365

370

375

Glu

Thr

lile

Thr

Lye

Ser

Arg

Tyr

Gly Leu

Glu

Tyr

Val

Tyr

Thr

Ann

380

305

390

Ala

Aep

Lye

Aep

Thr

Trp

Ala

Aep

Tyr Ala

Arg

Leu

Ser

Tyr

Aep

Arg

395

400

405

Gin

Gly

ile

Gly

Leu

Aep

Aen

lile

Phe Cin

Gin

Thr

lile

Cye

Ser

Ala

410

415

420

Λβρ Gly

Ser

A9p

Lye

Tyr

Cye

Arg

Pro Ser

Ala

Agp

Lye

Pro

Phe

Ser

425

430

435

440

Tyr

Tyr

Lye

Ser

Aep

Arg

val

Ile

Tyr Gly

Glu

Ser

lile

Arg

Leu

Leu

445

450

455

Gin

Ala

Ala

Phe

Lye

Ly9

Ser

Phe

Aep Thr

Ala

Lyn

Ile

Arg

Ilin

Aon

4 60

465

470

Leu

Ser

Val

Aen

Leu

Gly

Phe

Aep

Arg Phe

Anp

Ser

Aon

Leu

Arg

ille

475

480

485

Gin

Aep

Tyr

Tyr

Tyr

Gin

lile

Ala

Aen Arg

Ala

Tyr

Ser

Ser

Lyn

Thr

490

495

500

Pro

Pro

Lye

Thr

Ala

Aen

Pro

Aen

Cly Anp

Lye

Ser

Lye

Pro

Tyr

Trp

505

510

515

520

Val

Ser

Ile

Gly

Gly

Gly

Aen

Val

Val Thr

Gly

Gin

Ile

Cye

Leu

Phe

525

530

535

Gly

Aen

Aen

The

Tyr

Thr

Aep

Cye

Thr Pro

Arg

Sec

Ile

Λβη

Gly

Lyo

540

545

550

Ser

Tyr

Tyr

Ala

Ala

Val

Arg

Aep

Aen Val

Arg

Leu

Gly

Arg

Trp

Ala

555

560

565

Aep

Val

Gly

Ala

Gly

Leu

Arg

Tyr

Agp Tyr

Arg

Ser

Thr

lile

Ser

Aep

570

575

580

HU 219 267 Β

Asp

Gly

Ser

Val

Ser

Thr

Gly

Thr

lile

Arg

Thr

Leu

Ser

Trp

Agn

Alá

585

590

595

600

Gly

Ile

Vál

Leü

Lye

Pro

Alá

Aep

Trp

Leu

Aep

Leu

Thr

Tyr

Arg

Thr

605

610

615

Ser

Thr

Gly

Phe

Arg

Leu

Pro

Ser

Phe

Alá

Glu

Bet

Tyr

Gly

Trp

Arg

620

625

630

Ser

Gly

Val

Gin

Ser

Lye

Alá

Val

Lye

Ile

Anp

Pro

Glu

Lyo

Ser

Phe

635

640

645

Aen

Lye

Glu

Alá

Cly

Ile

Val

Phe

Lye

Gly

Anp

Phe

Cly

Ann

Leu

Glu

650

655

660

Alá

Ser

Trp

Éhe

Aen

Aen

Alá

Tyr

Arg

Aep

Leu

Ile

Val

Arg

Gly

Tyr

665

670

675

600

Glu

Alá

Gin

Ile

Lye

Aen

Gly

Lye

Glu

Glu

Alá

Lye

Gly

Agp

Pro

A la

685

690

695

Tyr

Leu

Aen

Alá

Gin

Ser

Alá

Arg

1 le

Thr

GJy

I le

ftnn

Ile

Leu

Gly

700

705

710

Lye

Ile

Aep

Trp

Aen

Gly

Val

Trp

Agp

Lyo

Leu

Pro

Glu

Gly

Trp

Tyr

715

720

725

Ser

Thr

Phe

Alá

Tyr

Agn

Arg

Val

Hle

v,i 1

Arg

Agp

Ile

Lyg

Lye

Arg

730

735

740

Alá

Aep

Arg

Thr

App

Ile

Gin

Ser

Ili Θ

Len

Phe

Ar.p

A1 a

11 e

Cl n

P ro

745

750

755

7 60

Ser

Arg

Tyr

Val

Val

Gly

Leu

Gly

Tyr

Aep

Gin

Pro

Glu

Gly

Lye

Trp

765

770

775

Gly

val

Aen

Gly

Hét

Leu

Thr

Tyr

Ser

Lyn

Alá

Lye

Glu

Ile

Thr

Glu

780

705

790

Leu

Leu

Cly

Ser

Arg

Alá

Leu

Leu

Agn

Cly

Agn

Ser

Arg

Ann

The

Lyo

795

800

005

Alá

Thr

Alá

Arg

Arg

Thr

Arg

Pro

Trp

Tyr

Ile

Val

Agp

Val

Ser

Gly

ölő

815

820

Tyr

tyr

Thr

Ile

Lye

Lye

Hle

Phe

Thr

Leu

Arg

Alá

cly

Val

Tyr

Aen

825

830

835

b4o

Leu

Leu

Aeh

tyr

Arg

Tyr

Val

Thr

Trp

Glu

Agn

Val

Arg

Gin

Thr

Alá

845 050 055

HU 219 267 Β

Gly GÍy

Alá Alá

Alá Val 860

Pro Gly 875

Aen Gin

Arg Aon lile Lys

Tyr The 880

Aen Val 865

Phe Ser

Gly Val

Leu Glu

Tyr Aon 870

Hét Lye 885

Arg Tyr

Phe

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 7-RŐL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 2230 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (iv) EREDETE:

(A) ORGANIZMUS: A transzferrinreceptor Tbp2 alegységét kódoló DNS (B) FORRÁS: Neisseria meningitidis IM2169 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 60...119 10 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: érett fehéije (B) NUKLEOTIDOK: 120...2192 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A)NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 60...2192 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 7

ΛΤΤ7

GTTA

ΑΛ ΑΛΤΛΛΛΤΛΛΛ AT

ΛΛΤΑ

ATCC

TTA

TCAT

TCT

ΤΤΛΛ

TTGA

AT T

CCCT

ΤΤΛΤ

59

ATC

AAC

ΛΛΤ

CCA

TTG

GTA

ΛΛΤ

CAG

GCT

GCT

ATC

CTG

CTC

CCT

CTC

TTT

107

Met

Aen

Aen

Pro

Leu

Val

Aen

Gin

Alá

Alá

Hét

Val

Leu

Pro

Val

Phe

-20

-15

-10

-5

TTG

TTG

Kgt

GCC

TGT

CTG

GGC

GGC

GCC

CCC

ACT

TTC

CAT

CTT

GAT

TCT

155

LeU

Lfeu

Ser

hla

Cye

Leu

cly

Gly

Gly

Cly

Ser

Phe

Aep

Leu

Aep

Ser

i

5

10

GTC

CAT

ACC

GAA

CCC

CCG

CCT

CCC

CCC

CCA

AAG

TAT

CAA

CAT

CTT

TCT

203

Val

Asp

Thr

GlU

Alá

Pro

Arg

Pro

Alá

Pro

Lys

Tyr

Gin

Aep

Val

Ser

15

20

25

TCC

GAA

AAA

CCG

CAA

CCC

CAA

AAA

CAC

CAA

GCC

GGA

TAC

GCT

TTT

CCC

251

Ser

GlU

Lyd

Pro

Cin

Alá

Gin

Lye

Aep

Cin

Gly

Gly

Tyr

Gly

Phe

Alá

30

35

40

ATC

AGG

TTO

AAA

CCG

AGG

AAT

TGC

TAT

CCC

GGC

CCA

GAA

CAA

ACC

CAC

299

Met

Arg

Leu

Lye

Arg

Arg

Aen

Trp

Tyr

Pro

Gly

Alá

Clu

Clu

Ser

Clu

45

50

55

60

CTT

AAA

CTG

AAC

CAG

ACT

GAT

TCG

CAG

GCC

ACG

CCA

TTC

CCC

ACA

AAA

347

val

Lye

Leu

Aen

Glu

Ser

Aep

Trp

Clu

Alá

Thr

Gly

Leu

Pro

Thr

I.y e

65

70

75

CCC

AAG

GAA

CTT

CCT

AAA

CGC

CAA

AAA

TCG

CTT

ATT

CAA

AAA

CTA

CAA

395

Pro

Lye

Gld

Leu

Pío

Lys

Arg

Gin

Lye

Ser

Val

Ile

Clu

Lye

Val

Clü

80

85

90

ACA

GAC

GGC

GAC

ACC

GAT

ATT

TAT

TCT

TCC

CCC

TAT

CTC

ACA

CCA

TCA

443

Thr

Aep

Gly

Aep

Ser

Aep

Ile

Tyr

Ser

Ser

Pro

Tyr

Leu

Thr

Pro

Ser

95

100

105

AAC

CAT

CAA

AAC

GGC

AGC

CCT

GGC

AAC

GGT

GTA

AAT

CAA

CCT

AAA

AAT

491

Aen

Hle

Cin

Aen

' Cly

Ser

Alá

Cly

Aon

Cly

Val

Aon

Cin

Pro

t.y e

Ann

110

115

120

CAG

GCA

ACA

GGT

CAC

GAA

ΛΛΤ

TTC

CAA

TAT

GTT

TAT

TCC

GGT

TCG

TTT

539

Gin

Alá

Thr

Gly

Hle

Glu

Aen

Phe

Gin

Tyr

Val

Tyr

Ser

Cly

Trp

Phe

125

130

135

140

HU 219 267 Β

TAT

AAA

CAT

GCA

GCC

AGT '

GAA

AAA

GAT

TTC

AGT

AAC

AAA

AAA

ATT

AAG

Tyr

Lye

Hle

Alá

Al»

Ser

Glu

Lye

Anp

Phe

Ser

Aon

Lye

Lyo

I le

Lye

145

J50

155

TCA

GCC

GAC

CAT

GCT

TAT

ATC

TTC

TAT

CAC

CCT

CAA

AAA

CCT

TCC

CGA

Ser

Gly

Aep

Aep

Cly

Tyr

He

rhe

Tyr

ní.e

Cly

Glu

Lye

rro

Sec

Arg

160

165

170

CAA

CTT

CCT

GCT

TCT

GGA

ΛΛΛ

GTT

ATC

TAC

AAA

GGT

GTG

TCG

CAT

TTT

Gin

Leu

Pro

Alá

Ser

Gly

Lye

val

Ile

Tyr

Lye

Gly

val

Trp

lile

Phe

175

180

185

GTA

ACC

CAT

ACA

AAA

AAG

GCT

CAA

GAT

TTT

CGT

CAA

ATT

ATC

CAG

CCT

Val

Thr

Aep

Thr

Lye

Lye

Gly

Cin

Anp

Phe

Arg

Glu

Ile

1) e

Gin

Pro

190

195

200

TCA

ΛΛΛ

AAA

CAA

GCC

CAC

AGG

TAT

AGC

GGA

TTT

TCT

GGT

GAT

CGC

ACC

Ser

Lye

Lye

Gin

Gly

Aep

Arg

Tyr

Sec

Gly

Phe

Ser

Gly

Aep

Gly

Ser

205

210

215

220

GAA

GAA

TAT

TCC

AAC

AAA

AAC

GAA

TCC

ACG

CTG

AAA

CAT

GAT

CAC

GAG

Glu

Glu

Tyr

Ser

Aen

Lye

Aen

Glu

Ser

Thr

Leu

Lye

Aep

Aep

Me

Clu

225

230

235

CGT

TAT

CGT

TTT

ACC

TCG

AAT

ΤΤΛ

CAA

CTC

CAT

TTC

CGC

AAT

AAC

AAA

Gly

Tyr

Gly

Phe

Thr

Ser

Aen

Leu

Clu

va l

Aep

The

Gly

Aen

Lye

Lye

240

245

250

TTC

ACG

GGT

AAA

ΤΤΛ

ATA

CGC

AAT

AAT

CCG

AGC

CTA

AAT

AAT

AAT

ACT

Leu

Thr

Gly

Lye

Leu

lle

Arg

Aen

Aen

Alá

Ser

Leu

Aen

Ann

Aen

Thr

255

260

265

AAT

AAT

GAC

AAA

CAT

ACC

ACC

CAA

TAC

TAC

AGC

CTT

CAT

CCA

CAA

ATA

Aen

Aen

Aep

Lye

Hle

The

Thr

Gin

Tyr

Tyr

Ser

Leu

Asp

Alá

Gin

1 le

270

275

280

ACA

GGC

AAc

CGC

TTC

AAC

GGC

ACG

CCA

ACC

GCA

ACT

CAC

AAA

AAA

GAG

Thr

Gly

Aen

Arg

t>he

Aen

Gly

The

Alá

Thr

Alá

Thr

Anp

Lye

Lye

Glu

285

290

295

300

AAT

GAA

ACC

AAA

CTA

CAT

CCC

TTT

GTT

TCC

CAC

TCC

TCT

TCT

TTC

AGC

Aen

Clu

Thr

Lye

Leu

lile

Pro

Phe

val

Ser

Aep

Ser

Ser

Ser

Leu

Ser

305

310

315

GGC

GCC

TTT

TTC

CGC

CCG

CAG

CGT

GAC

GAA

TTG

GGT

TTC

CCC

TTT

TTG

Gly

Gly

Phe

Phe

Gly

Pro

Gin

Gly

Glu

Glu

Leu

ciy

Phe

Arg

Phe

Leu

320

325

330

AGC

GAC

GAT

CAA

•AAA

CTT

CCC

GTT

GTC

GGC

ACC

CCG

AAA

ACC

AAA

CAC

Ser

Aep

Aep

Gin

Lyé

val

Alá

val

Val

Gly

Ser

Alá

Lye

The

Lye

Αθρ

335

340

345

AAA

CTG

GAA

AAT

GGC

CCG

CCG

GCT

TCA

GGC

AGC

ACA

CGT

GCC

CCA

GCA

Lye

Leu

Glu

Aen

Gly

Alá

Alá

Ma

Ser

Gly

Ser

Thr

Cly

Alá

Alá

A1 a

350 355 360

587

635

683

731

779

827

875

923

971

1019

1067

1115

1163

1211

HU 219 267 Β

TCC Ser 365

CCC Gly

GGT Gly

CCG GCA CCC

ACG Thr

TCG TCT GAA AAC AGT AAG

CTG Leu

ACC ACG Thr Thr 300

1259

Ala

Ala

Cly 370

Ser

Ser Glu Aen Ser 375

Ly9

GTT

TTG

GAT

GCG

GTT

GAA

TTC

ACA

CTA AAC GAC AAG

AAA

ATC

ΑΛΑ ΛΛΤ

1307

Val

Leu

Aep

Ala

Val

Glu

Leu

Thr

Leu Agn Aep Lye

Lye

Ile

Lye Aen

385

390

395

CTC

GAC

AAC

TTC

AGC

AAT

GCC

CCC

CAA CTG GTT CTC

GAC

CGC

ATT Arc

1355

LeU

Aep

Aen

Phe

Ser

Aen

Ala

Ala

Gin Leu Val Val

Anp

ciy

Ile Met

400

405

410

ATT

CCG

CTC

CTG

CCC

AAG

CAT

TCC

CAA ACC CGG AAC

ACT

CAC

CCA GAT

1403

Ile

Pro

Leu

Leu

Pro

Lye

Aep

Ser

Glu Ser Cly Aen

Thr

Cin

Ala Aep

415

420

425

AAA

GGT

AAA

AAC

GGC

GGA

ACA

GAA

TTT ACC CGC AAA

TTT

GAA

CAC ACG

1451

Lye

Gly

Lye

Aen

Gly

Gly

Thr

Glu

Phe Thr Arg Lyo

Phe

Glu

Ilin Thr

4 30

435

440

CCG

GAA

ACT

CAT

AAA

AAA

GAC

CCC

CAA GCA CGT ACG

CAC

ACG

AAT GGG

1499

Pro

GlU

Ser

Aep

Lye

Lye

Aep

Ala

Gin Ala Cly Thr

Gin

Thr

Aen Cly

445

450

455

460

CCG

CAA

ACC

GCT

TCA

AAT

ACG

GCA

GGT GAT ACC AAT

GGC

AAA

ACA AAA

1547

Ala

Gin

Thr

Ala

Ser

Aen

Thr

Ala

Gly Agp Thr Aen

Cly

Lye

Thr Lye

465

470

475

ACC

TAT

CAA

GTC

CAA

GTC

TGC

TGT

TCC AAC CTC AAT

TAT

CTG

AAA TAC

1595

Thr

Tyr

clu

Val

GlU

Val

Cye

Cye

Ser Aen Leu Aen

Tyr

Leu

Lye Tyr

480

485

490

CCA

AtC

TTG

ACG

CGC

AAA

AAC

AGC

AAG TCC GCG ATG

CAC

GCA

GGA GGA

1643

Cly

Bet

Leu

Thr

Arg

Lye

Aen

Ser

Lye Ser Ala Met

Gin

Ala

Cly Gly

495

500

505

AAC

ACT

ACT

CAA

GCT

CAT

CCT

AAA

ACG CAA CAA GTT

CAA

CAA

AGT ATG

1691

Aen

Ser

Ser

Gin

Ala

Aop

Ala

Lye

Thr Clu Cin Val

Glu

Cin

Ser Met

510

515

520

TTC

CTC

CAA

GGC

GAG

CGT

ACC

CAT

GAA AAA GAC ATT

CCA

ACC

GAC CAA

1739

Phe

Leu

Gin

Gly

Glu

Arg

Thr

Agp

Glu Lye Clu Ile

Pro The

Aep Gin

525

530

535

540

AAC

CTC

GTT

TAT

CCC

CCC

TCT

TGG

TAC CCC CAT ATT

CCC AAC GGC ACA

1787

Aen

Val

Val

Tyr

Arg

ciy

Ser

Trp

Tyr Gly Mlo Ile

Ala Aon Gly Thr

545

550

555

AGC

TCC

AGC

GGC

KhT

GCT

TCT

GAT

AAA GAG GGC GGC

AAC AGG GCG GAA

1835

Ser

Trp

Ser

Gly

Aen

Ala

Ser

Aep

Lye Clu Gly Gly

Asn Arg Ala GlU

560

565

570

TTT

ACT

GTC

AAT

TTT

CCC

CAT

AAA

, AAA ATT ACC CGC

: AAC TTA ACC GCT

1883

Phe

Thr

val

Aen

Phe

Ala

Aop

Lye

Lye Ile Thr Cly

Lye Leu Thr Ala

575 580 585

HU 219 267 Β

0ΛΛ AAC AGC

CAG Gin

GCC Alá

CAA ACC TTT ACC

ATT GAG GCA De Glu Gly 600

ATG Hét

ATT Ile

CAG Gin

GGC Gly

1931

Glu

Aen 590

Arg

Cin

Thr 595

Phe Thr

AAC

GGC

TTT

GAA

GGT

ACG

GCG

AAA ACT

GCT GAG TCA

GGT

TTT

CAT

CTC

1979

Aen

Gly

Phe

Glu

Gly

Thr

Alá

Lye Thr

A,a Glu Ser

Gly

Phe

Aep

Leu

605

610

615

620

GAT

CAA

AAA

AAT

ACC

ACC

CGC

ACG CCT

AAG CCA TAT

ATC

ACA

GAT

GCC

2027

Aep

Gin

Lyo

Asn

Thr

Thr

Arg

Thr Pro

Lyn Alá Tyr

I le

Thr

A«ip

Alá

625

630

635

AAG

GTA

AAG

GGC

CGT

TTT

TAC

CCG CCT

AAA GCC GAA

CAG

TTG

GCC

GGA

2075

Lye

Val

Lye

Cly

Cly

Phe

Tyr

Gly Pro

Lyn Alá Glu

Glu

Leu

Cly

Gly

640

645

650

TGG

TTT

GCC

TAT

CCG

CCC

GAT

AAA CAA

ACG CAA AAG

CCA

ACA

GCT

ACA

2123

Trp

Phe

Alá

Ty t

Pro

Cly

Aep

Lye Cin

Thr Glu Lyo

Alá

Thr

Alá

Thr

655

660

665

TCC

AGC

GAT

GGA

AAT

TCA

GCA

AGC AGC

GCG ACC GTG

GTA

TTC

GGT

GCG

2171

Ser

Ser

Aep

Gly

Aen

Ser

Alá

Ser Ser

Ma Thr Val

Val

Phe

Gly

Alá

670

675

680

AAA

CGC

CAA

CAG

CCT

GTG

CAA

TAAGCACCGT TGCCGAACAA TCAAGAATAA

2222

Lye

Arg

Gin

Gin

Pro

val

Cin

685 690

CCCTTCAC

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 8-RÓL (i) A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

(A) HOSSZ: 711 aminosav (B) TÍPUS: aminosav

Met Xen Aen Pro Leu Val Aen Gin Alá -20 -15

2230 (C)KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehéije (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 8

Alá Hét Val Leu Pro Val Phe -10 -5

Leu Leu Ser Alá Cye Leu Cly Gly Cly Gly Ser Phe 1 5

Anp

Leu Aep 10

Ser

Val Aep Thr Glu Alá 15

Pro Arg

Pro 7»la 20

Pro Lye Tyr

Cin Aep Val 25

Ser

Ser

Glu 30

Lye

Pro

Clri Ma

Gin 35

Lye

A9p

Gin Cly Gly 40

Tyr

Gly

Phe

Al a

Hét

Arg

Leu

Lye

Arg

Arg

Ann

Trp

Tyr

Pro Gly

Al A

Glu

Glu

Ser

Glu

45

50

55

60

Val

Lye

Leu

Aen

Glu

Ser

Aep

Trp

Glu

Aln

Thr

Gly

Leu

Pro

Thr Lyn

65

70

75

Pro

Lye

Glu

Leu

Pro.

Lye

Arg

Cin

Ly e

Ser

Val

Ile

Glu

Lyo

Val GLu

05 90

HU 219 267 Β

Thr Aep Cly Agp Shr 95

Aep

Ile

Tyr 100

Ser

Ser

Γιο

Tyr

Leu 105

Thr

Γγο

Ser

Agn

Hle

Gin

Aen

Gly

Ser

Alá

Gly

Aen

Cly

Val

Αδη

Gin

Pro

Lye

Aen

110

115

120

Cin

Alá

Tht

Gly

Híg

Glu

Agn

Phe

Cin

Tyr

val

Tyr

Ser

Gly

Trp

Phe

125

130

135

140

Tyr

Lye

Hle

Alá

Alá

Ser

Clu

Ly o

Agp

The

Ser

Aen

Ly n

Lye

Ile

Ly o

145

150

155

Ser

Gly

Aep

Aep

Gly

Tyr

Ile

Phe

Tyr

11» 3

Cly

Clu

Lye

Pro

Ser

Arg

Í60

165

170

Gin

Leu

Pro

Alá

Ser

Gly

Lys

Val

1 le

Tyr

Lye

Cly

Val

Trp

lile

Phe

175

180

105

Val

Thr

Aep

Thr

Lye

Lye

Cly

Gin

Asp

Phe

Arg

Clu

Ile

Ile

Cin

Pro

190

195

200

Ser

Lye

Lye

Gin

Gly

Aep

Arg

Tyr

Ser

Gly

Phe

Ser

Gly

Agp

Cly

Ser

205

210

215

220

Glü

Glu

Tyr

Ser

Aen

Lye

Aen

Glu

Ser

Thr

Leu

Lye

Aep

Aep

111b

Glu

225

230

235

Cly

Tyr

Cly

Phe

Thr

Ser

Aen

Leu

Clu

Val

Aep

Phe

Gly

Aen

Lye

Lye

240

245

250

Leu

Thr

Cly

Lys

Leu

Ile

Arg

Aen

Agn

Ma

Ser

Leu

Aen

Aen

Aen

Thr

255

260

265

Aen

Aen

Aep

Lye

H1b

Thr

Thr

Cin

Tyr

Tyr

Ser

Leu

Aep

Alá

Gin

Ile

270

2 75

200

Thr

Cly

Aon

Arg

Phe

Aen

Cly

Thr

Alá

Thr

A1 a

Thr

Anp

Lye

Ly n

Cl»»

28S

290

295

300

Aen

Clu

Thr

Lye

Leu

IIIb

Pro

Phe

Val

Ser

Aep

Ser

Ser

Ser

Leu

Ser

305

310

315

Gly

Gly

Phe

Phe

Gly

Pro

Gin

Gly

Clu

Cin

Leu

Gly

Phe

Arg

Pho

Leu

320

325

330

Ser

Aep

Agp

Cin

Lye

val

Alá

Val

Val

Gly

Ser

Alá

Lye

Thr

Lye

Anp

335

340

345

Lye

Leu

Clu

Agn

Gly

Alá

Alá

Alá

Ser

Gly

Ser

Thr

Cly

Alá

Alá

A1 a

350 355 360

HU 219 267 Β

Ser 365

Gly

Gly

Alá

Alá

Gly 370

Thr

Ser

Ser

Glu

Aon 375

Ser

l.y e

Leu

Thr

Thr 300

val

Leu

Aep

Alá

Val 385

Glu

Leu

Thr

Leu

Agn 390

Anp

Ly n

Lye

T le

Lye 395

Ann

Leu

Aep

Agn

Phe 400

Ser

Aen

Alá

Alá

Gin 405

Leu

Vg l

val

Aep

Gly 410

lle

Heh

lle

Pro

Leu 415

Leu

Pro

Lye

Agp

Ser 420

Glu

Ser

Gly

Aen

Thr 425

Gin

Alá

Aep

Lys

Gly 430

Lye

Aen

Gly

Gly

Thr 435

Glu

Phe

Thr

Arg

Lye 440

Phe

Glu

il Le

Thr

Pro 445

Glu

Ser

Aep

Lye

Lye 450

Agp

Alá

Gin

Alá

Gly 455

Thr

Cin

Thr

Ann

Gly 4 60

Ma

Gin

Thr

Alá

Ser 465

Agn

Thr

Alá

Gly

Agp 4 70

Thr

Aon

Gly

Lye

Thr 475

Lye

Thr

Tyr

Clu

Val 480

Glu

Val

Cye

CyB

Ser 405

Aon

Leu

Aen

Tyr

Leu 490

Lye

Tyr

Gly

Hét

Leu 495

Thr

hrg

Lye

Aen

Ser 500

Lyn

Ser

Alá

Hét

Cin 505

Alá

Gly

ciy

Aen

Ser

Ser

Gin

Alá

Aep

Alá

Lye

Thr

Glu

Gin

val

Glu

Gin

Ser

Hét

510 515 520

The

LeU

Gin

Gly

Glu

Arg

Thr

Aep

Glu

Lye

Glu

He

Pro

Thr

Aep

Gin

525

530

535

540

Aen

Val

Val

Tyr

Xrg

Gly

Ser

Trp

Tyr

Gly

lile

lle

Alá

Ann

Cly

Thr

54S

550

555

Ser

Trp

Ser

Cly

Asn

Alá

Ser

Anp

Lys

Glu

Gly

Cly

Aen

Arg

Alá

Glu

560

56S

570

Phe

Thr

Val

Aen

Phe

Alá

Aep

Lyn

Lyp

I le

Thr

Cly

Lye

Leu

Thr

Al η

575

500

5 05

Glu

Aen

Arg

Cin

Alá

Gin

Thr

Phe

Thr

I le

Glu

Gly

Hét

He

Gin

Gly

590

595

600

Aen

Cly

Phe

Glű

Gly

Thr

Ma

Lye

Thr

Alá

Clu

Ser

Cly

Pite

Anp

Leu

605

610

615

r,2o

HU 219 267 Β

625

630

635

Lye

val

Lye

Gly

Cly

Phe

Tyr

Gly

Tro

Lyn

Ma

Glu

Glu

Leu

Gly

Gly

640

645

650

Trp

Phe

Alá

Tyr

Pro

Gly

Aep

Lye

Gin

Thr

Glu

Lye

Alá

Thr

Alá

Thr

655

660

665

Ser

Ser

Aep

Gly

Aen

Ser

Ma

Ser

Ser

Alá

Thr

Val·

Val

Pho

Gly

Alá

670

675

680

Lye

Arg

Gin

Gin

Pro

Val

Gin

685 ego

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 9-RŐL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A)HOSSZ: 51 bázispár 20 (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális)

ATC ACC AAA ACA TTT TTT CTC CCA ATA TTC Hét Arg Lye Arg phe Phe Val Cly Ile Phe

Ϊ 5 10 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A)NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 1...51 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 9

CCC ATA AAC CTC CTT CTT 48

Alá Ile Aon I.eu Leu Val

CCA

Gly

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 10-RŐL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 17bázispár (B) TÍPUS: aminosav

Met Arg Lys Arg Phe Phe Val Gly Ile 1 5 (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ IDNO. 10

Phe Alá Ile Ann Leu Leu Val 10 15

Gly

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 11-RŐL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 57 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 1...57 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 1...57 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 11

ATG AAA AAA ATA ACA GCG ATT ATT TTA TTG CTT CTT CCA GTC ATT ATT Met Lye Lye Ile Thr Gly Ile Ile Leu Leu Leu Leu Alá Val Ile Ile

10 15

CTC TCT GCA

Leu Ser Alá

HU 219 267 Β

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 12-RŐL (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (1) A szekvencia jellemzői: (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (i) (A) HOSSZ: 19 bázispár (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 12 (B) TÍPUS: aminosav

Met Lye Lye lle Thr Gly lle lle Leu Leu Leu Leu Ma Vnl lle lle 1 5 10 1Γ»

Leu Ser Alá

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 13-RÓL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A)HOSSZ: 60bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 1... 60 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 1...60 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 13

ATG ΑΛΑ GCT ACT AAA CTG CTA CTG GGC CCG GTA ATC CTG GCT TCT ACT Met Lye Alá Thr Lye Leu Val Leu Gly Alá Vnl lle Leu Gly Ser Thr	49
1	5	JO	15
CTG CTG GCA Led Leu Alá	GCT Gly 20				60
INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 14-RŐL (1) A szekvencia jellemzői: (i) (A) HOSSZ: 20 bázispár (B) TÍPUS: aminosav	30	(D)KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 14

Met Lye Ma Thr Lye Leu val Leu 1 5

Leu Leu Alá Gly 20

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 15-RŐL (1) A szekvencia jellemzői: 40 (i) (A)HOSSZ: 69bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) 45

Gly Alá Val lle Leu Gly Ser Th 10 15 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK :1...69 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 1...69 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 15

ATC AAA CTC

ACA Thr

ACA Thr 5

CAT CAT CTA

CCG Arg

ACA Thr 10

GGG cly

GCC Alá

GCA Alá

ΤΤΛ Leu

TTC Leu 15

GTC Val

49

Hét 1

Lye

Leu

Me

lile

Leu

GCC

GCA

ATT

CTG

CTC

GCA

GGT

69

Alá

GÍy

lle

Led

Leu

Alá

Gly

20

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 16-RÓL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A)HOSSZ: 23 bázispár (B) TÍPUS: aminosav (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ IDNO. 16

HU 219 267 Β

Hét Lye Leu Thr Thr Hie lile Leu Arg Thr Gly Alá Alá Leu Leu v,al 15 10 15

Alá Gly Ile Leu Leu Alá Gly

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 17-RŐL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 69bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 1.. .69 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 1...69 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 17

ATC Hét 1

TTT Phe

GTA Val

ACG Thr

AGC Ser 5

AAA LyB

AAA Lye

ATC Hét

ACC CCG

GCT CTT

CTC Leu

CCA Alá

ATT Ile 15

ACT Thr

48

Thr

Alá 10

A), a

Val

TTC

CCA

ATC

TCT

CTG

AGT

GCA

69

Leu

Alá

Met

Ser

Leu

Ser

Alá

20

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 18-RÓL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 23 bázispár (B)TÍPUS: aminosav

Met Phe Val Thr Ser Lye Lye 1 5 (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehéije (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 18

Met Thr Alá Alá Val Leu Alá Ile Thr 10 15

Leu Alá Met Ser Leu Ser Alá 20

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 19-RŐL (1) A szekvencia jellemzői: 35 (i) (A)HOSSZ: 63 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) 40 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 1.. .63 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 1.. .63 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 19

ATC Met 1	CAA Cin	CTC Leu	AAC Aen	AAA Lye 5	CTC val	CTC ΛΛΛ Leu Lye
ATG	CCA	ATT	GCC	GCA
Met	Alá	Ile	Alá	Alá
			20

GGG CTG ATC ATT GCT CTG CCT CTT 48

Gly Leu Hét· Ile Alá Leu Tro Val

15

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 20-RÓL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 21 bázispár (B) TÍPUS: aminosav

Hét Gin Leu Aen Lye Val Leu 1 5

Hét Alá Ile Alá Alá 20 (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 20

LyP Cly Leu Hét Ile Alá Leu Pro Val 10 15

HU 219 267 Β

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 21-ROL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 54 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 1...54 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 1...54 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 21

ATC Met 1	AGA Arg	TAC Tyr	CTG Leu	GCA Ala 5	ACA Thr	TTG Leu	TTG TTA Leu Le»
GCC	GGG
Ala	Cly

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 22-RŐL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 18bázispár (B)TÍPUS: aminosav

Met Arg Tyr Leu Λ1» Thr Leu Le 1 5

TCT CTC CCC CTC TTA ATC ACC 4Θ

Ser I.pu Ala Val Len Ile Thr

15 (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehérje (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 22:

» Leu Ser Leu Ms Val Leu Ile Thr )0 J5

Ála Cly

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 23-RÓL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 66 bázispár (B) TÍPUS: nukleinsav (C) SZÁLAK SZÁMA: egyszálú (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: DNS (genomiális) (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: cDNS (B) NUKLEOTIDOK: 1...66 (ix) TOVÁBBI JELLEMZŐK:

(A) NÉV/FUNKCIÓ: szignálpeptid (B) NUKLEOTIDOK: 1...66 (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 23

ATG ΛΛΛ CAT AAC	GTT Val 5	AAC Lyo	CTG Leu	ATC Met
Met 1	Lys	illa	Aen
GTC	CTC	GTG	CTC	TCC	GCC
Val	Leu	Val	Leu	Ser	Cly
			20

CCA ATC ACT GCC GTT TTA TCC TCT 48

Ma Met Thr Ma Val Leu Ser Snr

JO 15

INFORMÁCIÓ A SEQ ID NO. 24-RŐL (1) A szekvencia jellemzői:

(i) (A) HOSSZ: 22 bázispár (B)TÍPUS: aminosav

Met Lye illa Aan Val Lye Le 1 5 val Leu val Leu Ser Gly 20 (D) KONFIGURÁCIÓ: lineáris (ii) A MOLEKULA TÍPUSA: fehéije (xi) A SZEKVENCIA LEÍRÁSA: SEQ ID NO. 24:

Met AJ.a Met The Ala Val Leu Ser Ser

15

Claims (20)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Izolált DNS-fragment, azzal jellemezve, hogy nukleotidszekvenciája az alábbi aminosavszekvenciák bármelyikével legalább 75%-os homológiát mutató aminosavszekvenciájú fehérjét kódol:

   55 - 1. azonosítószámon megadott, az 1. ciszteinnel kezdődő és az 579. glutaminnal végződő szekvencia,

   - 7. azonosítószámon megadott, az 1. ciszteinnel kezdődő és a 691. glutaminnal végződő szekvencia, és amely fragment expressziós terméke alkal60 más arra, hogy az N. meningitidis IM2394-es vagy

   HU 219 267 Β

   IM2169-es törzsének transzferrinreceptora elleni antiszérum felismerje.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti DNS-fragment, azzal jellemezve, hogy nukleotidszekvenciája

   i) az IM2394-es törzs 1. azonosítószámon megadott, 1. ciszteinnel kezdődő és 579. glutaminnal végződő aminosavszekvenciájú Tbp2 alegységét vagy ii) az IM2169-es törzs 7. azonosítószámon megadott, 1. ciszteinnel kezdődő és 691. glutaminnal végződő aminosavszekvenciájú Tbp2 alegységét kódolja.
3. 3. Az 1. igénypont szerinti DNS-fragment, azzal jellemezve, hogy nukleotidszekvenciája az alábbi aminosavszekvenciák bármelyikével legalább 75%-os homológiát mutató aminosavszekvenciájú prekurzort kódol

   i) az 1. azonosítószámon megadott, -20. metioninnal kezdődő és 579. glutaminnal végződő szekvencia vagy ii) az 7. azonosítószámon megadott, -20. metioninnal kezdődő és 691. glutaminnal végződő szekvencia, és amely prekurzor alkalmas arra, hogy az N. meningitidis IM2394-es vagy IM2169-es törzsének transzferrinreceptora elleni antiszérum felismerje.
4. 4. Az 1. igénypont szerinti DNS-fragment, azzal jellemezve, hogy nukleotidszekvenciája

   i) az IM2394-es törzs 1. azonosítószámon megadott, -20. metioninnal kezdődő és 579. glutaminnal végződő aminosavszekvenciájú Tbp2 alegységének prekurzorát vagy ii) az IM2169-es törzs 7. azonosítószámon megadott, -20. metioninnal kezdődő és 691. glutaminnal végződő aminosavszekvenciájú Tbp2 alegységének prekurzorát kódolja.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNSfragment, azzal jellemezve, hogy aminosavszekvenciája legalább 80%-os homológiát mutat a megfelelő vonatkoztatási szekvenciával.
6. 6. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti DNSfragment, azzal jellemezve, hogy aminosavszekvenciája legalább 90%-os homológiát mutat a megfelelő vonatkoztatási szekvenciával.
7. 7. Expressziós kazetta N. meningitidis IM2394-es vagy IM2169-es törzsének transzferrinreceptora elleni antiszérum által történő felismerésre alkalmas peptid, polipeptid vagy fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNSfragmentet tartalmaz annak expressziójához szükséges elemek szabályozóhatása alatt.
8. 8. A 7. igénypont szerinti expressziós kazetta, azzal jellemezve, hogy a DNS-fragment S. typhimurium araB-promoterét tartalmazó elemek szabályozóhatása alatt áll.
9. 9. A 7. vagy 8. igénypont szerinti expressziós kazetta, azzal jellemezve, hogy a 7. azonosítószámon megadott, -20. metioninnal kezdődő és 691. glutaminnal végződő aminosavszekvenciával legalább 75%-os homológiát mutató aminosavszekvenciájú fehérje előállítására szolgál, és

   i) RlpB-szignálpeptidet kódoló DNS-egységet és ii) a fehérjét kódoló DNS-fragmentet tartalmaz.
10. 10. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti expressziós kazetta, azzal jellemezve, hogy a megfelelő vonatkoztatási szekvenciával legalább 80%-os homológiát mutató aminosavszekvenciájú fehérje előállítására szolgál.
11. 11. A 7-9. igénypontok bármelyike szerinti expreszsziós kazetta, azzal jellemezve, hogy a megfelelő vonatkoztatási szekvenciával legalább 90%-os homológiát mutató aminosavszekvenciájú fehéije előállítására szolgál.
12. 12. A 9. igénypont szerinti expressziós kazetta, azzal jellemezve, hogy N. meningitidis IM2394-es vagy IM2169-es törzse Tbp2 alegységének előállítására szolgál, és

    i) RlpB-szignálpeptidet kódoló DNS-egységet és ii) az alegységet kódoló DNS-fragmentet tartalmaz.
13. 13. A 7-12. igénypontok bármelyike szerinti expressziós kazettával transzformált gazdasejt.
14. 14. Eljárás N. meningitidis IM2394-es vagy IM2169-es törzsének transzferrinreceptora elleni antiszérum által történő felismerésre alkalmas peptid, polipeptid vagy fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy 13. igénypont szerinti gazdasejtet tenyésztünk, és a pepiidet, a polipeptidet vagy a fehérjét kinyerjük a tenyészetből.
15. 15. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként a 14. igénypont szerinti eljárással előállított, N. meningitidis IM2394-es vagy IM2169-es törzsének transzferrinreceptora elleni antiszérum által történő felismerésre alkalmas peptidet, polipeptidet vagy fehérjét tartalmaz.
16. 16. Gyógyászati készítmény, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként olyan virális vagy bakteriális vektort tartalmaz, amely genomjában, inszertálva, az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti DNS-fragmentet tartalmaz, annak expressziójához szükséges elemek szabályozóhatása alatt.
17. 17. Izolált DNS-egység, azzal jellemezve, hogy a 7. azonosítószámon megadott, -20. metioninnal kezdődő és -1. alaninnal végződő aminosavszekvenciával legalább 75%-os homológiát mutató aminosavszekvenciájú szignálpeptidet kódol, amely szignálpeptid alkalmas arra, hogy a A. meningitidis IM2394-es vagy IM2169-es törzsének transzferrinreceptora elleni antiszérum felismeqe.
18. 18. Izolált DNS-egység, azzal jellemezve, hogy a 7. azonosítószámon megadott, -20. metioninnal kezdődő és -1. alaninnal végződő aminosavszekvenciájú szignálpeptidet kódol.
19. 19. A 17. igénypont szerinti DNS-egység, azzal jellemezve, hogy a megfelelő vonatkoztatási szekvenciával legalább 80%-os homológiát mutató aminosavszekvenciájú szignálpeptidet kódol.
20. 20. A 17. igénypont szerinti DNS-egység, azzal jellemezve, hogy a megfelelő vonatkoztatási szekvenciával legalább 90%-os homológiát mutató aminosavszekvenciájú szignálpeptidet kódol.