ES2603532T3

ES2603532T3 - Nuevas composiciones inmunogénicas para la prevención y tratamiento de enfermedad meningocócica

Info

Publication number: ES2603532T3
Application number: ES10182544.6T
Authority: ES
Inventors: W. Zlotnick Gary; Leah D. Fletcher; John Farley; Liesel A. Bernfield; J Zagursky Robert; Benjamin J. Metcalf
Original assignee: Wyeth Holdings LLC
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2017-02-28
Anticipated expiration: 2022-10-11
Also published as: EP2332961A2; CA2849427C; KR20040066793A; AU2009213040A1; EP2332961A3; EP2351767A3; CN102755631B; PT2371836T; KR20100121699A; US20120034261A1; JP2014012002A; BRPI0212999B8; CA2939781C; EP2332961B1; US20120294880A1; EP2348036A2; CA2918207C; US20110076299A1; EP2348034A3; EP2371836A1

Abstract

Una composición que comprende: (a) al menos una proteína recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia mayor de 80 % con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 226, 224 y 228, que comprende adicionalmente (b) al menos una proteína que tiene identidad de secuencia mayor de 80 % con la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NO: 2-174 de números pares, teniendo dicha composición la capacidad de inducir anticuerpos bactericidas para múltiples cepas de Neisseria.

Description

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SEQ ID NO 58: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771 preparada

usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 59: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de M98 250771.

SEQ ID NO 60: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250771.

SEQ ID NO 61: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de CDC1135 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 62: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando

una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 63: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de CDC1135 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 64: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando

una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 65: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa de CDC1135. SEQ ID NO 66: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135. SEQ ID NO 67: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa de M97 252153 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 68: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 69: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 252153 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 70: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 71: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252153. SEQ ID NO 72: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153. SEQ ID NO 73: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC1610 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 74: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 75: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de CDC1610 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 76: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 77: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC 1610. SEQ ID NO 78: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610. SEQ ID NO 79: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa CDC 1492 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 80: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 81: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de CDC 1492 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ NO 82: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492 preparada usando una secuencia líder P4.

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SEQ ID NO 83: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC 1492.

SEQ ID NO 84: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492. SEQ ID NO 85: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 86: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando

una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 87: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de L8 M978 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 88: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando

una secuencia líder P4. SEQ ID NO 89: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978.

SEQ ID NO 90: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L8 M978.

SEQ ID NO 91: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 92: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 93: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M97 252988 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 94: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 95: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO 96: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO 97: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252697 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 98: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252697 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 99: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M97 252697 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 100: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252697 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 101: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M97 252697. SEQ ID NO 102: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252697. SEQ ID NO 103: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 6557 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 104: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 105: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de 6557 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 106: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 107: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa 6557.

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SEQ ID NO 133: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M98 250622 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 134: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 135: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M98 250622 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 136: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 137: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622.

SEQ ID NO 138: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250622. SEQ ID NO 139: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 140: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando

una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 141: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de 870446 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 142: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando

una secuencia líder P4. SEQ ID NO 143: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446.

SEQ ID NO 144: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870446.

SEQ ID NO 145: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 cuando se combina con una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 146: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada

usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 147: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M97 253248 cuando se combina con una secuencia líder P4. SEQ ID NO 148: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada

usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 149: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248. SEQ ID NO 150: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 253248. SEQ ID NO 151: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M98 250809 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 152: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada usando una secuencia líder nativa. SEQ ID NO 153: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de M98 250809 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 154: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada usando una secuencia líder P4. SEQ ID NO 155: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa M98 250809. SEQ ID NO 156: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250809. SEQ ID NO 157: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086

madura de la cepa L5 M981 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

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SEQ ID NO 158: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 159: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de L5 M981 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 160: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 161: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981.

SEQ NO 162: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L5 M981.

SEQ ID NO 163: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 164: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 165: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de NMB cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 166: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ NO 167: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB.

SEQ NO 168: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa NMB.

SEQ ID NO 169: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 170: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 171: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de M98 250572 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 172: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 173: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572.

SEQ ID NO 174: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250572.

SEQ ID NO 175: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combina con una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 176: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 preparada usando una secuencia líder nativa.

SEQ ID NO 177: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combina con una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 178: secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 preparada usando una secuencia líder P4.

SEQ ID NO 179: secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830.

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SEQ ID NO 253: secuencia de ácido nucleico parcial que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 de una cepa de Neisseria lactamica. SEQ ID NO 254 a 259: secuencias de aminoácidos asociadas con las proteínas de la familia de proteínas 2086. SEQ ID NO 260 a 278: secuencias de aminoácidos asociadas con las proteínas de la Subfamilia A de 2086.

SEQ ID NO 279 a 299: secuencias de aminoácidos asociadas con las proteínas de la Subfamilia B de 2086. SEQ ID NO 300: es la secuencia consenso de aminoácidos correspondiente a la familia de proteínas 2086 (“proteínas 2086”) de acuerdo con una realización de la presente invención.

SEQ ID NO 301: es la secuencia consenso de aminoácidos correspondiente a la Subfamilia A de proteínas 2086

de acuerdo con una realización de la presente invención. SEQ ID NO 302: es la secuencia consenso de aminoácidos correspondiente a la Subfamilia B de proteínas 2086 de acuerdo con una realización de la presente invención.

SEQ ID NO 303: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción BamHI

(Compuesto Nº 4623). SEQ ID NO 304: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción NdeI (Compuesto Nº 4624).

SEQ ID NO 305: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 4625). SEQ ID NO 306: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 5005). SEQ ID NO 307: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso (Compuesto Nº 5007). SEQ ID NO 308: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción BglII

(Compuesto Nº 5135).

SEQ ID NO 309: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción BamHI (Compuesto Nº 5658). SEQ ID NO 310: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción SphI

(Compuesto Nº 5660).

SEQ ID NO 311: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción BamHI (Compuesto Nº 6385). SEQ NO 312: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con sitios de restricción BamHI y NdeI

(Compuesto Nº 6406). SEQ ID NO 313: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 6470). SEQ ID NO 314: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso (Compuesto Nº 6472). SEQ ID NO 315: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con un sitio de restricción BamHI

(Compuesto Nº 6473).

SEQ ID NO 316: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con sitios de restricción BglII y NdeI (Compuesto Nº 6474). SEQ ID NO 317: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo (Compuesto Nº 6495). SEQ ID NO 318: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso (Compuesto Nº 6496). SEQ ID NO 319: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción SphI

(Compuesto Nº 6543).

SEQ ID NO 320: secuencia de ácido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restricción BglII (Compuesto Nº 6605). SEQ ID NO 321: secuencia de ácido nucleico para un cebador directo con sitios de restricción BglII y NdeI

(Compuesto Nº 6721). SEQ ID NO 322: secuencia de ácido nucleico para la secuencia líder P4. SEQ ID NO 323: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 1.

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SEQ ID NO 324: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 2.

SEQ ID NO 325: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 3.

SEQ ID NO 326: secuencia de ácido nucleico para la variante de líder 2086 nativa 4.

SEQ ID NO 327: es la secuencia de aminoácidos de P4431.

SEQ ID NO 328: es la secuencia de aminoácidos de P5136.

SEQ ID NO 329: es una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una realización de la presente invención.

Descripción detallada de la invención

Una nueva clase de antígenos con actividad bactericida con funcionalidad cruzada con el serogrupo B de Neisseria meningitidis evitaría la necesidad de un enfoque de PorA multivalente para la inmunización contra la infección. Dicho antígeno se ha identificado inesperadamente y se describe y reivindica en el presente documento. La presencia de dicho antígeno se observó por primera vez en una mezcla compleja de proteínas de membrana externa solubles (sOMP) de una cepa meningocócica. La actividad bactericida de este antígeno se siguió mediante una serie de etapas de fraccionamiento y purificación de proteínas hasta que la mezcla de proteínas de interés contenía solamente algunas proteínas. Las proteínas principales de esta mezcla se identificaron por secuenciación de aminoácidos N terminal y mapeo de péptidos. La proteína de interés que mostraba actividad bactericida se identificó como proteína ORF2086, una proteína lipidada (también denominada más específicamente LP2086). La “proteína ORF2086” se refiere a una proteína codificada por la fase abierta lectura 2086 (ORF2086) de una especie de

Neisseria.

Como se describe en el presente documento, se han identificado nuevos candidatos a composición inmunogénica basándose en la proteína ORF2086 de una especie de Neisseria (también denominada “proteína 2086” o proteína “ORF2086” usados de forma intercambiable en el presente documento, o P2086 para las proteínas no lipidadas y LP2086 para versión lipidada de las proteínas) aisladas de N. meningitidis combinando fraccionamiento celular, la extracción de detergente diferencial, la purificación de proteínas con la preparación de antisueros, y un ensayo de actividad bactericida utilizando múltiples cepas. Como alternativa a las composiciones inmunogénicas potenciales y diagnósticos desvelados en las referencias citadas anteriormente, la presente divulgación se refiere a composiciones y procedimientos para tratar y/o prevenir la infección meningocócica mediante el uso de proteínas, partes inmunogénicas de las mismas y equivalentes biológicos de las mismas, así como genes que codifican dichos polipéptidos, partes equivalentes, anticuerpos que se unen inmunoespecíficamente a las mismas.

De acuerdo con una realización de la presente invención, se identificaron inesperadamente agentes inmunogénicos basados en una proteína 2086 como se define en las reivindicaciones adjuntas, incluyendo polipéptidos aislados, como candidatos inmunogénicos basándose en la capacidad de dichos agentes para mostrar reactividad cruzada o ausencia de especificidad de cepa. En particular, se identificaron candidatos que demostraron inesperadamente la capacidad de (1) inducir anticuerpos bactericidas para múltiples cepas de Neisseria y/o gonocócicas; (2) reaccionar con la superficie de múltiples cepas; (3) conferir protección pasiva contra una exposición en vivo; y/o (4) evitar la colonización. En consecuencia, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden dichos agentes inmunogénicos, incluyendo polipéptidos aislados, y/o equivalentes biológicos de los mismos, así como procedimientos para usarlos contra la infección por N. meningitidis. (Véase, Ejemplo 1 en el presente documento para la metodología usada en la identificación de la proteína 2086).

Como se usa en el presente documento, la expresión “no específico de cepa” se refiere a la característica de un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra más de una cepa de N. meningitidis, (por ejemplo, cepas meningocócicas heterólogas). La expresión de “reactividad cruzada” como se usa en el presente documento se usa de forma intercambiable con la expresión “no específico de cepa”. La expresión “antígeno de N. meningitidis no específico de cepa inmunogénico” como se usa en el presente documento, describe un antígeno que puede aislarse de N. meningitidis, aunque también puede aislarse de otra bacteria (por ejemplo, otras cepas de Neisseria, tales como cepas gonocócicas, por ejemplo), o prepararse usando tecnología recombinante.

Las proteínas 2086 de la presente invención incluyen proteínas lipidadas y no lipidadas. Además, la presente divulgación también contempla del uso de las proteínas inmaduras o preproteínas que corresponden a cada proteína como compuestos/composiciones intermedios.

La presente invención también proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespecífica a los agentes inmunogénicos anteriores, de acuerdo con implementaciones de la invención. Adicionalmente, la presente invención proporciona composiciones y/o composiciones inmunogénicas y su uso en la prevención, el tratamiento de meningitis meningocócica, en particular enfermedad meningocócica de serogrupo B, así como procedimientos para preparar dichas composiciones.

Se ha mostrado que las composiciones de la presente invención son altamente inmunogénicas y capaces de inducir la producción de anticuerpos bactericidas. Estos anticuerpos tienen reactividad cruzada para las cepas

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ATYRGTAFGS (SEQ ID NO: 286); DDAGGKLTYT (SEQ ID NO: 287); IDFAAKQGHG (SEQ ID NO: 288); KIEHLKSPEL (SEQ ID NO: 289);

5 ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNV (SEQ ID NO: 290); HAVISGSVLY (SEQ ID NO: 291); KGSYSLGIFG (SEQ ID NO: 292); VLYNQDEKGS (SEQ ID NO: 293); HAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFG (SEQ ID NO: 294);

10 AQEVAGSAEV (SEQ ID NO: 295); IHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 296); VETANGIHHI (SEQ ID NO: 297); AQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 298); o VAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ ID NO: 299).

15 La proteína 2086 comprende la siguiente secuencia consenso y/o partes inmunogénicas de la misma desveladas en el presente documento. Secuencia Consenso de Proteína 2086 (SEQ ID NO: 300):

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En la secuencia consenso anterior, la “x” representa cualquier aminoácido, la región de la posición del aminoácido 5

20 a la posición de aminoácido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos, la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos, y la posición del aminoácido 156 es cualquiera de 0 a 1 aminoácidos. La región de la posición del aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 preferentemente comprende 0, 4 o 5 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 preferentemente comprende 0 o 3 aminoácidos. Debería observarse particularmente que esta secuencia consenso

25 ilustra la alta variabilidad de las proteínas 2086. Como teoría, sin pretender quedado ligado a la misma, se cree que esta alta variabilidad proporciona la reactividad cruzada ventajosa e inesperada.

De acuerdo con una implementación de la presente invención, las proteínas 2086 se caracterizan como inmunogénicas, no patógenas y no específicas de cepa. Estas proteínas muestran inesperadamente inmunogenicidad mientras que son de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 40 % no conservadas.

30 Como se usa en el presente documento, la expresión “no conservada” se refiere al número de aminoácidos que pueden experimentar inserciones, sustituciones y/o deleciones como un porcentaje del número total de aminoácidos en una proteína. Por ejemplo, si una proteína es 40 % no conservada y tiene, por ejemplo, 263 aminoácidos, entonces hay 105 posiciones de aminoácidos en la proteína en las que los aminoácidos pueden experimentar sustitución. De forma similar, si la proteína es 10 % no conservada y tiene, por ejemplo, aproximadamente 280

35 aminoácidos, entonces hay 28 posiciones de aminoácidos en las que los aminoácidos pueden experimentar sustitución. Las proteínas 2086 también pueden experimentar deleción de restos de aminoácidos sin comprometer la inmunogenicidad de las proteínas.

Además, las proteínas 2086 pueden dividirse en subfamilias basándose en la homología en diversas regiones. Por ejemplo, sin pretender quedar ligada a lo mismo, las secuencias consenso para dichas dos subfamilias, Subfamilia A

40 y Subfamilia B, se proporcionan a continuación:

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Secuencia de Subfamilia A de 2086 (SEC ID 301)

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La referencia “x” es cualquier aminoácido. La región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8 es cualquiera de 0 a 4 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8 preferentemente comprende 0 o 4

aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 preferentemente comprende 0 o 3 aminoácidos. Subfamilia B de 2086 (SEC ID 302)

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La referencia “x” es cualquier aminoácido.

La región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos.

La región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 preferentemente comprende 0 o 5 aminoácidos.

De acuerdo con implementaciones de la presente invención, las subfamilias de proteína 2086 pueden subdividirse adicionalmente en grupos. Por ejemplo, se desvelan los siguientes grupos en el presente documento: SEQ ID NO: 212 de números pares; SEQ ID NO: 14-24 de números pares; SEQ ID NO: 26-42 de números pares; SEQ ID NO: 5060; SEQ ID NO: 62-108 de números pares; SEQ ID NO: 110-138 de números pares; SEQ ID NO: 140-156 de números pares; SEQ ID NO: 158-174 de números pares; y SEQ ID NO: 224-252 de números pares.

Una secuencia polipeptídica de la invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de las SEQ ID NO: 2252 de números pares es decir, 100 % idéntica, o puede incluir varias alteraciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de referencia de modo que el % de identidad sea menor del 100 %. Dichas alteraciones incluyen al menos una deleción, sustitución, incluyendo sustitución conservativa y no conservativa, o inserción de aminoácido. Las alteraciones pueden suceder en las posiciones amino o carboxilo-terminal de la secuencia polipeptídica de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de aminoácidos de referencia.

Por lo tanto, la invención también proporciona proteínas que tienen identidad de secuencia con las secuencias de aminoácidos contenidas en la Lista de Secuencia (es decir, SEQ ID NO: 2-252 de números pares). Dependiendo de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencia es preferentemente mayor del 80 % (por ejemplo, 80 %, 90 %, 95 %, 97 %, 99 %, 99,9 % o más). Estas proteínas homólogas incluyen mutantes y variantes alélicas.

En realizaciones preferidas de la invención, las proteínas 2086 u otros polipéptidos 2086 (por ejemplo, partes inmunológicas y equivalentes biológicos como se define en las reivindicaciones adjuntas) generan anticuerpos bactericidas para cepas homólogas y al menos una heteróloga de meningococos. Específicamente, los anticuerpos para los polipéptidos 2086 protegen de forma pasiva las crías de rata de la exposición, tal como intranasal, a meningococos. En realizaciones preferidas adicionales, los polipéptidos 2086 muestran dicha protección para crías de rata para cepas homólogas y al menos una cepa heteróloga. El polipéptido puede seleccionarse del Sumario de

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La bacteria Heamophilus influenzae no tipificable expresa una lipoproteína designada P4 (también conocida como proteína “e”). La forma recombinante de la proteína P4 se expresa en gran medida en E. coli usando la secuencia señal de P4 nativa. Patente de Estados Unidos Nº 5.955.580. Cuando la secuencia señal de P4 se sustituye por la secuencia señal de ORF 2086 nativa en un vector de expresión en E. coli, se aumenta el nivel de expresión de ORF2086.

Este concepto de usar la secuencia señal de P4 heteróloga para aumentar la expresión puede extenderse a otras lipoproteínas bacterianas. En particular, el análisis de genomas bacterianos conduce a la identificación de muchas ORF que son de posible interés. El intento de expresar cada ORF con su secuencia señal nativa en una célula huésped heteróloga, tal como E. coli, da lugar a una diversidad de problemas inherentes en el uso de una diversidad de secuencias señal, incluyendo estabilidad, compatibilidad y así sucesivamente. Para minimizar estos problemas, la secuencia señal de P4 se usa para expresar cada ORF de interés. Como se ha descrito anteriormente, la secuencia señal de P4 mejora la expresión de la ORF 2086 heteróloga. Un vector de expresión se construye suprimiendo la secuencia señal nativa de la ORF de interés, y ligando la secuencia señal de P4 a la ORF. Después una célula huésped adecuada se transforma, transfecta o infecta con el vector de expresión, y se aumenta la expresión de la ORF en comparación con la expresión usando la secuencia señal nativa de la ORF.

La forma no lipidada se produce por una proteína que carece de la secuencia líder original o por una secuencia líder que se reemplaza con una parte de secuencia que no especifica un sitio para acilación de ácidos grasos en una célula huésped.

Las diversas formas de las proteínas 2086 de la presente divulgación se denominan en el presente documento proteína “2086”, a menos que se indique específicamente de otro modo. Además, “polipéptido 2086” se refiere a las proteínas 2086 así como partes inmunogénicas o equivalentes biológicos de las mismas como se ha indicado anteriormente, a no ser que se indique de otro modo.

La proteína 2086 de N. meningitidis purificada y aislada de longitud completa tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 28 a 35 kDa como se mide en un gel de poliacrilamida SDS de gradiente del 10 % al 20 % (SDS-PAGE). Más específicamente, esta proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 26.000 a 30.000 daltons como se mide por espectrometría de masas.

Preferentemente, los polipéptidos 2086 y ácidos nucleicos que codifican dichos polipéptidos se usan para prevenir o mejorar la infección provocada por N. meningitidis y/u otras especies.

Anticuerpos

Las proteínas de la invención, incluyendo las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 2-252 sus fragmentos y análogos de las mismas, o células que las expresan, también se usan como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecíficos para los polipéptidos de la invención. La invención incluye anticuerpos para polipéptidos inmunoespecíficos y el uso de dichos anticuerpos para detectar la presencia de N. meningitidis, proporciona protección pasiva o mide la cantidad o concentración de los polipéptidos en una célula, un extracto celular o tisular o un fluido biológico.

Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos anti-idiotípicos. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antígeno. Los anticuerpos monoclonales son una población sustancialmente homogénea de anticuerpos para antígenos específicos. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales por procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, Kohler y Milstein, 1975, Nature 256: 495-497 y Patente de Estados Unidos Número 4.376.110. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas.

Los anticuerpos quiméricos son moléculas, partes diferentes de las cuales derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Se conocen en la técnica anticuerpos quiméricos y procedimientos para su producción (Cabilly y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277; Morrison y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Boulianne y col., 1984, Nature 312:643-646; Cabilly y col., Solicitud de Patente Europea 125023 (publicada el 14 de noviembre de1984); Taniguchi y col., Solicitud de Patente Europea 171496 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neuberger y col., Solicitud de PCT WO 86/01533 (publicada el 13 de marzo de 1986); Kudo y col., Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 11 de junio de 1986); Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Sahagan y col., 1986, J. Immunol. 137:1066-1074; Robinson y col., documento PCT/US86/02269 (publicado el 7 de mayo de 1987); Liu y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Sun y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Better y col., 1988, Science 240: 1041-1043).

Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-Id se prepara inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, cepa de ratón) que la fuente del anticuerpo monoclonal con el anticuerpo monoclonal para el que se prepara un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los

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determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizador produciendo un anticuerpo para estos determinantes isotópicos (el anticuerpo anti-Id).

En consecuencia, pueden usarse anticuerpos monoclonales generados contra los polipéptidos de la presente invención para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados. Pueden usarse células del bazo de dichos ratones inmunizados para producir hibridomas anti-Id que secretan anticuerpos anti-Id monoclonales. Además, los anticuerpos anti-Id pueden acoplarse con un vehículo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) y usarse para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del mAb final específico para un epítopo de R-PTPasa. Los anticuerpos anti-Id tienen por tanto sus epítopos idiotípicos, o “idiotopos” estructuralmente similares al epítopo que se evalúa, tal como polipéptidos de Streptococcus pyogenes.

También se entiende que el término “anticuerpo” incluye tanto moléculas intactas como fragmentos tales como Fab que son capaces de unirse con el antígeno. Los fragmentos Fab carecen del fragmento Fc de anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación, y pueden tener menos unión tisular no específica que un anticuerpo intacto (Wahl y col., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316-325). Se apreciará que Fab y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención pueden usarse para la detección y cuantificación de polipéptidos de N. meningitidis de acuerdo con los procedimientos para moléculas de anticuerpo intactas.

Los anticuerpos de la presente invención, tales como anticuerpos anti-idiotípicos (“anti-Id”), pueden emplearse en un procedimiento para el tratamiento o prevención de infección por Neisseria en huéspedes mamíferos, que comprende administración de una cantidad inmunológicamente eficaz de anticuerpo, específica para un polipéptido como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo anti-Id también puede usarse como un “inmunógeno” para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal más, produciendo un anticuerpo denominado anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo el anti-Id. Por lo tanto, usando anticuerpos para los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.

Los anticuerpos se usan de una diversidad de maneras, por ejemplo, para confirmación de que una proteína se expresa, o para confirmar cuándo una proteína se expresa. Puede incubarse anticuerpo marcado (por ejemplo, marcaje fluorescente para FACS) con bacterias intactas y la presencia del marcador en la superficie bacteriana confirma la localización de la proteína, por ejemplo.

Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipéptidos de la invención administrando los polipéptidos o fragmentos portadores de epítopos, análogos o células a un animal usando protocolos rutinarios. Para preparar anticuerpos monoclonales, se usa cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de línea celular continuos.

Polinucleótidos

Como con las proteínas de la presente invención, un polinucleótido de la presente divulgación puede comprender una secuencia de ácido nucleico que es idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia de las SEQ ID NO: 1253, de números impares, es decir, es 100 % idéntica o puede incluir hasta un número de alteraciones de nucleótidos en comparación con la secuencia de referencia. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al menos una deleción, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción de nucleótidos, y en el que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones 5’ o 3’ terminal de la secuencia de nucleótidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de nucleótidos se determina multiplicando el número total de nucleótidos en cualquiera de las SEQ ID NO: 1-253 de números impares por el porcentaje numérico del porcentaje de identidad respectivo (dividido por 100) y restando ese producto de dicho número total de nucleótidos en dicha secuencia.

Como ejemplo, sin pretender limitarse al mismo, un polinucleótido de N. meningitidis aislado que comprende una secuencia polinucleotídica que tiene al menos 70 % de identidad con cualquier secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1-253; una variante degradada de la misma o un fragmento de la misma, en la que la secuencia polinucleotídica puede incluir hasta nn alteraciones de ácido nucleico sobre la región polinucleotídica completa de la secuencia de ácido nucleico SEQ ID NO: 1-253; en la que nn es el máximo número de alteraciones y se calcula por la fórmula:

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en la que xn es el número total de ácidos nucleicos de cualquiera de SEQ ID NO: 1-253 e y tiene un valor de 0,70, en la que cualquier producto no entero de xn e y se redondea hacia abajo hasta el número entero más cercano antes de restar dicho producto de xn. Por supuesto, y también tener un valor de 0,80 para 80 %, 0,85 para 85 %, 0,90 para 90 %, 0,95 para 95 % etc. Las alteraciones de una secuencia polinucleotídica que codifica los polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos de cualquiera de SEQ ID NO: 2-252 pueden crear mutaciones sin sentido, de sentido erróneo o de desplazamiento de fase en esta secuencia codificante y de este modo alterar el polipéptido

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codificado por el polinucleótido después de dichas alteraciones.

También se desvelan en el presente documento polinucleótidos (denominados en el presente documento los “polinucleótidos 2086” o “polinucleótidos de ORF2086”) que codifican las proteínas 2086 y anticuerpos preparados contra las proteínas 2086. También se desvela en el presente documento un polinucleótido que comprende una 5 secuencia de nucleótidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % de identidad con una secuencia de nucleótidos seleccionada de una de las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 253 de números impares, una variante degradada de las mismas, o un fragmento de las mismas. Como se define en el presente documento, una “variante degradada” se define como un polinucleótido que difiere de la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 253 de números impares (y fragmentos de las mismas) debido a la degeneración del código

10 genético, pero aún codifica la misma proteína 2086 (es decir, las SEQ ID NO: 2-252 de números pares) que la codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en las SEQ ID NO: 1-253 de números impares.

Se apreciará que los polinucleótidos de 2086 pueden obtenerse de fuentes naturales, sintéticas o semisintéticas; además, la secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia de origen natural, o puede estar relacionada por mutación, incluyendo sustituciones, deleciones, inserciones e inversiones de una o múltiples bases, con dicha 15 secuencia de origen natural, a condición de que la molécula de ácido nucleico que comprende dicha secuencia pueda expresarse como un polipéptido inmunogénico 2086 como se ha descrito anteriormente. La molécula de ácido nucleico puede ser ARN, ADN, monocatenaria o bicatenaria, lineal o de forma circular cerrada covalentemente. La secuencia de nucleótidos puede tener secuencias de control de la expresión situadas adyacentes a ella, derivando dichas secuencias de control habitualmente de una fuente heteróloga. En general, la expresión recombinante de la

20 secuencia de ácido nucleico usará una secuencia de codón de parada, tal como TAA, en el extremo de la secuencia de ácido nucleico.

También se desvelan en el presente documento polinucleótidos capaces de hibridar en condiciones de rigurosidad reducida, más preferentemente condiciones rigurosas, y más preferentemente condiciones altamente rigurosas, con polinucleótidos descritos en el presente documento. Se muestran ejemplos de condiciones de rigurosidad en la

25 Tabla de Condiciones de Rigurosidad a continuación: las condiciones altamente rigurosas son las que son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones A-F; las condiciones rigurosas son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones G-L; y las condiciones de rigurosidad reducida son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones M-R.

CONDICIONES DE RIGUROSIDAD – TABLA I

Condición de rigurosidad: Híbrido polinucleotídico Longitud del híbrido (pb)I Temperatura de hibridación y tampónH Temperatura de lavado y tampónH

A: ADN:ADN > 50 65EC; SSC1x -o42EC; SSC1x, formamida al 50 % 65EC; SSC0,3x

B: ADN:ADN < 50 TB; 1xSSC TB; SSC1x

C: ADN:ARN > 50 67EC; SSC1x -o45EC; SSC1x, formamida al 50 % 67EC; SSC0,3x

D: ADN:ARN < 50 TD; SSC1x TD; SSC1x

E: ARN: ARN > 50 70EC; SSC1x -o50EC; SSC1x, formamida al 50 % 70EC; SSC0,3x

F: ARN: ARN < 50 TF; SSC1x Tf; SSC1x

G: ADN:ADN > 50 65EC; SSC4x -o42EC; SSC4x, formamida al 50 % 65EC; SSC1x

H: ADN:ADN < 50 TH; 4xSSC TH; SSC4x

I: ADN:ARN > 50 67EC; SSC4x -o45EC; SSC4x, formamida al 50 % 67EC; SSC1x

J: ADN:ARN < 50 TJ; SSC4x TJ; SSC4x

K: ARN: ARN > 50 70EC; SSC4x -o50EC; SSC4x, formamida al 50 % 67EC; SSC1x

L: ARN: ARN < 50 TL; 2xSSC TL; SSC2x

M: ADN:ADN > 50 50EC; SSC4x -o40EC; SSC6x, formamida al 50 % 50EC; SSC2x

N: ADN:ADN <50 TN; SSC6x TN; SSC6x

O: ADN:ARN > 50 55EC; SSC4x -o42EC; SSC6x, formamida al 50 % 55EC; SSC2x

P: ADN:ARN < 50 TP; SSC6x TP; SSC6x

Q: ARN: ARN > 50 60EC; SSC4x -o-45EC; SSC6x, formamida al 50 % 60EC; SSC2x

R: ARN: ARN < 50 TR; SSC4x TR; SSC4x

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(continuación)

Condición: Híbrido Longitud Temperatura de hibridación y Temperatura de lavado y

de: polinucleotídico del tampónH tampónH

rigurosidad: híbrido (pb)I

pbI: La longitud del híbrido es la anticipada para la región o regiones hibridadas de los polinucléotidos que hibridan. Cuando se hibrida un polinucleótido con un polinucleótido diana de secuencia desconocida, se supone que la longitud del híbrido es la del polinucleótido que hibrida. Cuando se hibridan polinucleótidos de secuencia conocida, la longitud del híbrido puede determinarse alineando las secuencias de los polinucleótidos e identificando la región o las regiones de complementariedades de secuencia óptimas. tampónH: SSPE (SSPE1x es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituir a SSC (SSC1x es NaCl 15 M y citrato sódico 15 M) en los tampones de hibridación y lavado; se realizan lavados durante 15 minutos después de completarse la hibridación. TB hasta TR: La temperatura de hibridación para híbridos que se anticipa que son de menos de 50 pares de bases de longitud debería ser de 5-10EC menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, cuando Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 2(nº de bases A + T) + 4(nº de bases G +C). Para híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 81,5 + 16,6 (log10[Na+]) + 0,41(% G+C) – (600/N), en la que N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na+]) para SSC1x = 0,165 M).

Se proporcionan ejemplos adicionales de condiciones de rigurosidad para la hibridación de polinucleótidos en Sambrook, J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 y 11, y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4.

También se desvelan en el presente documento polinucleótidos que son completamente complementarios de estos polinucleótidos que también proporcionan secuencias antisentido.

Los polinucleótidos desvelados en el presente documento se preparan de muchas maneras (por ejemplo, por síntesis química, de bibliotecas de ADN, del organismo en sí mismo) y pueden tomar diversas formas (por ejemplo, monocatenarias, bicatenarias, vectores, sondas, cebadores). El término “polinucleótido” incluye ADN y ARN y también sus análogos, tales como los que contienen cadenas principales modificadas.

Proteínas de fusión

También se desvelan en el presente documento proteínas de fusión. Una “proteína de fusión” se refiere a una proteína codificada por dos genes fusionados, con frecuencia no relacionados, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, proteínas de fusión que comprenden diversas partes de región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína inmunogénica o parte de la misma. En muchos casos, el empleo de una región Fc de inmunoglobulina como parte de una proteína de fusión es ventajoso para su uso en terapia y diagnóstico dando como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (véase, por ejemplo, documento EP 0 232 262 A1). Por otro lado, para algunos usos sería deseable poder suprimir la parte Fc después de que la proteína de fusión se haya expresado, detectado y purificado. Los polinucleótidos 2086 desvelados en el presente documento se usan para la producción recombinante de polipéptidos de la presente invención, el polinucleótido puede incluir la secuencia codificante del polipéptido maduro, por sí sola, o la secuencia codificante del polipéptido maduro en fase de lectura con otras secuencias codificantes, tales como las que codifican una secuencia líder o secretora, una secuencia de pre, o pro o prepro-proteína, u otras partes de péptidos de fusión. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificación de un polipéptido 2086 o polipéptido fusionado (véase Gentz y col., 1989). Por lo tanto, se contempla en una implementación de la presente divulgación la preparación de polinucleótidos que codifican polipéptidos de fusión que permiten la purificación de marcador His de productos de expresión. El polinucleótido también puede contener secuencias 5’ y 3’ no codificantes, tales como secuencias transcritas, no traducidas, señales de corte y empalme y de poliadenilación. Dicho polipéptido fusionado puede producirse por una célula huésped transformada/transfectada o infectada o infectada con un vehículo de clonación de ADN recombinante como se describe posteriormente y puede aislarse posteriormente de la célula huésped para proporcionar el polipéptido fusionado sustancialmente sin otras proteínas de células huésped.

Composiciones inmunogénicas

Un aspecto de la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas como se define en las reivindicaciones adjuntas. Las anteriores tienen la capacidad de (1) inducir anticuerpos bactericidas para múltiples cepas;

La formulación de dichas composiciones inmunogénicas se conoce bien por los expertos en este campo. Las composiciones inmunogénicas de la invención preferentemente incluyen un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen todos y cada uno de disolventes convencionales, medios de dispersión, cargas, vehículos sólidos, soluciones acuosas, revestimientos, agentes

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(continuación)

CB50 de la cepa diana

Procedimiento: Fracción H44/76 880049 H355 539* M982

IEF Preparatorio: Fracciones 1-3 (pH 2,3-3,9) 50 NT NT NT NT

Fracción 4 (pH 4,1): >800 <25 100 <25 NT

Fracción 5 (pH 4,3): >800 <25 100 200 NT

Fracción 6 (pH 4,5): 400 NT NT NT NT

Fracción 7 (pH 4,8): <25 NT NT NT NT

Fracciones 8-9 (pH 5,0-5,3): <25 NT NT NT NT

Fracciones 10-17 (pH 5,5-7,8): >800 200 <800 <800 NT

Intercambio aniónico: Adsorbida 400 NT 100 100 NT

No adsorbida: >6.400 NT <800 <800 NT

NT: no ensayado *El aislado clínico 539 es una cepa homóloga de 8529, aislada del mismo brote

Como se muestra en la FIG. 1A, estaban presentes dos proteínas principales en la fracción no adsorbida como se determinó por SDS-PAGE. Para identificar estas proteínas, se realizaron dos tipos de análisis. Un análisis fue

5 realizar degradación proteolítica limitada (Véase FIG. 1A y FIG. 1B) seguido de aislamiento de péptidos y secuenciación de proteínas directa. El otro análisis fue realizar SDS-PAGE seguido de escisión en gel, digestión proteolítica y EM-CL/EM (Espectrometría de Masas en Tándem con Cromatografía Líquida), (véase FIG. 3) para obtener información espectral de masas sobre los componentes de las preparaciones de interés. (Véase procedimientos de mapeo y secuenciación de péptidos descritos posteriormente en esta sección).

10 La secuencia genómica de N. meningitidis A Sanger usando los procedimientos y algoritmos descritos en Zagursky y Russell, 2001, BioTechniques, 31:636-659. Este análisis de extracción produjo más de 12.000 posibles Marcos Abiertos de Lectura (ORF). Tanto los datos de secuenciación directa como los datos espectrales de masas descritos anteriormente indicaron que los componentes principales de la fracción no adsorbida fueron los productos de varias ORF presentes en un análisis de la base de datos de Sanger. Las tres proteínas predominantes identificadas por

15 esta metodología corresponden a las ORF 4431, 5163 y 2086 (véase FIGS. 1B y 3).

Aunque la ORF 4431 fue la proteína más predominante identificada en las fracciones, los anticuerpos de ratón para 4431 lipidado recombinante no fueron bactericidas y no proporcionaron una respuesta protectora en un modelo animal. El análisis adicional de ORF 5136 está en progreso.

El segundo componente más predominante de las preparaciones descritas en el presente documento corresponde al 20 producto de ORF 2086.

Procedimientos de inmunogenicidad:

Preparación de antisueros:

Excepto donde se indique, se formularon composiciones/vacunas de proteínas con 25 g de proteína total y se añadieron 20 g de QS-21 como adyuvante. Se administró una dosis de 0,2 ml por inyección subcutánea (cadera) a

25 ratones Swiss-Webster hembra de 6-8 semanas de edad en la semana 0 y 4. Se recogieron muestras de sangre en la semana 0 y 4, y se realizó un sangrado de exsanguinación final en la semana 6.

Ensayo bactericida:

Se realizaron ensayos bactericidas esencialmente como se ha descrito (Véase Mountzouros y Howell, 2000, J. Clin. Microbiol. 38(8)2878-2884). Los títulos bactericidas dependientes de anticuerpo mediados por complemento para el

30 SBA se expresaron como el recíproco de la mayor dilución del suero de ensayo que destruyó  50 % de las células diana introducidas en los ensayos (título CB50).

34

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(continuación)

SEQ ID NO. (CompuestoNº): Cebador Secuencia Sitios de restricción

309 (5658): Directo GCGGATCCAGCGGAGGGGGTGGTGTCGCC BamHI

310 (5660): Inverso SphI

311 (6385): Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGAAGC BamHI

312 (6406): Directo BglII y NdeI

313 (6470): Directo CTATTCTGCGTATGACTAG

314 (6472): Inverso GTCCGAACGGTAAATTATCGTG

315 (6473): Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGTGTCGCC BamHI

316 (6474): Directo BglII y NdeI

317 (6495): Directo GACAGCCTGATAAACC

318 (6496): Inverso GATGCCGATTTCGTGAACC

319 (6543): Inverso GCGCATGCCTACTGTTTGCCGGCGATG SphI

320 (6605): Inverso imagen27 BglII

321 (6721): Directo BglII y NdeI

Expresión de lipoproteínas de rLP2086 utilizando secuencia líder nativa:

En referencia a la FIG. 5, se transformó/transfectó o infectó con el plásmido pPX7340 células huésped BLR(DE3) pLysS (Life Sciences). Se seleccionó un transformante y se inoculó en 50 ml de Caldo de Cultivo Terrific que 5 contenía glucosa al 2 %, kanamicina (30 g/ml), cloranfenicol (30 g/ml) y tetraciclina (12 g/ml). La DO600 para el cultivo de una noche fue de 6,0. El cultivo de una noche se diluyó en 1 litro de Caldo de Cultivo Terrific con glicerol 1 % y los mismos antibióticos. La DO600 de partida fue de 0,4. Después de 2 horas la DO600 fue de 1,6 y se tomó una muestra pre-inducida. Se centrifugaron células equivalentes a una DO600 = 1 y se retiró el sobrenadante. El sedimento de células completas se resuspendió en 150 g de tampón Tris-EDTA y 150 l de tampón de muestras

10 SDS-PAGE 2x. Se añadió IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de 3,5 horas se tomó una muestra post-inducida como se describe y se analiza en SDS-PAGE (Véase FIG. 4).

Purificación de rLP2086:

El rLP2086 se solubilizó de E. coli después de extracción con detergente diferencial. A diferencia del P2086 en su ambiente nativo, el rLP2086 no se solubilizó significativamente por Triton X-100 o Zwittergent 3-12. El grueso del 15 rLP2086 se solubilizó con sarcosilo, lo que indica que interacciona con los componentes de membrana externa de E. coli de forma diferente a como lo hace en N. meningitidis. Una vez solubilizado el rLP2086 se purificó de forma similar a la proteína nativa porque muchas de las proteínas de E. coli contaminantes pudieron retirarse por adsorción en una resina de intercambio aniónico a pH 8. A pesar de estar más de media unidad de pH por encima de su pI teórico, el rLP2086 permanece no adsorbido a pH 8. Se consiguió purificación adicional por adsorción del rLP2086

20 en una resina de intercambio catiónico a pH 4,5.

La homogeneidad del rLP2086 se muestra en la FIG. 2 después de SDS-PAGE. Se determinó por análisis espectral de masas MALDI-TOF que la masa de rLP2086 era 27.836. Esta masa difiere de la masa teórica de 27.100 por 736,

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(continuación)

Cepa: Serosubtipo Fuente

M97 252988: B:4, PI:6, P1.18,25,6 MPHL

M97 252976: B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 252153: B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL

M97 253248: B:15,PI:7, NT, 16 MPHL

CDC1610: P1:NT 4(15), P1.18-7,16-14 CDC

CDC1521: P1.6,3 2b(4) CDC

CDC1034: P1.7 4(15) CDC

L8: P1.7,1 15(4) Walter Reed

CDC1492: P1.7,1 4(15) CDC

870446: P1.12a,13 RIVM

CDC2369: P1.(9),14 CDC

6557: P1.(9),14, P1.22a,14a RIVM

2996: P1.5,2, P1.5a,2c RIVM

NmB: P1.5,2, P1.5a,2c UIOWA

L3: P1.5,2 Walter Reed

B16B6: P1.5,2 RIVM

CDC1135: CDC

L5: P1.NT, P1.21-6,1 Walter Reed

L4: P1.21,16 Walter Reed

W135: Walter Reed

C11: C:16, P1.7,1 CDC

Y: Walter Reed

TABLA VI-B

Cepa: Serosubtipo Fuente

M98 250670: B:1, PI:4 MPHL

M98 250024: B:1, PI:4 MPHL

M97 253524: B:1, PI:4 MPHL

M97 252060: B:1, PI:4 MPHL

M97 251870: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251836: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251830: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251905: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251898: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251885: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251876: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251994: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251985: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251957: B:4z, PI:4 MPHL

M97 251926: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252045: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252038: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252026: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252010: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252098: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252083: B:4z, PI:4 MPHL

M97 252078: B:4z, PI:4 MPHL

43

(continuación)

Cepa: Serosubtipo Fuente

M98 250735: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250797: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250768: B:4z, PI:15 MPHL

M98 250716: B:2b, PI:10 MPHL

M98 250699: B:4z,PI:10 MPHL

M98 250393: B:4z,PI:10 MPHL

M98 250173: B:4z,PI:10 MPHL

M97 253462: B:4z, PI:14 MPHL

M98 250762: B:15, PI:7,16 MPHL

M98 250610: B:15, PI:7,16 MPHL

M98 250626: B:15, PI:7,16 MPHL

M97 250571: B:15, PI:16 MPHL

M97 252097: B:15, PI:16, PI.7b,16 MPHL

M97 253092: B:1, PI:6 MPHL

M97 252029: B:15,PI:7, NT MPHL

M97 251875: B:15,PI:7, NT MPHL

CDC1127: PI.7,16 4(15) CDC

CDC982: PI.7,16 4(15) CDC

CDC1359: PI.7,16 4(15) CDC

CDC798: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1078: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1614: PI.7,16 15(4) CDC

CDC1658: PI.7,16 15(4) CDC

H44/76: PI.7,16 15(4) RIVM

CDC1985: P1.7,13 4(15) CDC

L6: P1.7,1 ?(4) Walter Reed

CDC1573: P1.7,1 4(15) CDC

L7: P1.7,(9),1 Walter Reed

CDC937: P1.7,3, P1.7b,3 CDC

8529: P1.7,3, P1.7b,3 RIVM

880049: P1.7b,4 RIVM

CDC2367: P1.15 4(15) CDC

H355: P1.19,15 RIVM

CDC1343: P1.14 4(15) CDC

M982: P1.22,9 RIVM

870227: P1.5c,10 RIVM

B40: P1.5c,10 RIVM

5315: P1.5c,10 RIVM

CDC983: P1.5,2 CDC

CDC852: P1.5,2 CDC

6940: P1.18,25 (6) RIVM

A4

Otras cepas están fácilmente disponibles como aislados de individuos infectados.

Ejemplo 6 Reactividad de antisuero rLP2086 contra cepas meningocócicas:

La siguiente tabla, Tabla VII, muestra la reactividad cruzada y capacidad de protección cruzada del rLP2086 como se ha descrito anteriormente. Como se indica en la tabla, el rLP2086 se procesó y analizó usando una diversidad de

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TABLA XI

Variante de rLP2086: Homología de A.A. (%)1 pI teórico Pureza (%)2

8529: 100 7,5 96

M982: 94 6,3 96

88049: 92 6,2 90

CDC1573: 87 5,6 93

Procedimiento de Purificación: Todas las variantes se solubilizaron de membranas de E. coli con TX-100 (excepción rLP2086-8529 que se solubilizó con Sarcosilo o Urea). Se consiguió purificación adicional con una combinación de 5 intercambio aniónico (TMAE), exclusión por tamaño y/o cromatografía de intercambio catiónico (Fractogel S) en un tampón Tris-HCl o NaPO4.

1 Homología de aminoácidos en comparación con P2086 de la cepa 8529.

2 Pureza como se determinada por SDS-PAGE y densitometría por láser de banda teñida por Coomassie coloidal (tinción Simply Blue).

10 Inmunogenicidad de un miembro de Subfamilia B, rLP2086-8529, ensayado frente a cepas homólogas y heterólogas.

La Tabla XII a continuación muestra la inmunogenicidad de un miembro de Subfamilia B, rLP2086-8529, ensayado frente a cepas homólogas y heterólogas.

TABLA XII

Cepa diana: Subfamilia de P2086 Serosubtipo de la cepa diana Homología de A.A.a Título de ELISA de células completasb Título de CB50c

539: B P1.7-2,3 100 >1.458.000 3.200

H44/76: B P1.7,16 100 >1.458.000 3.200

H355: B P1.19,15 100 >1.458.000 3.200

CDC937: B P1.7-2,3-4 100 >1.458.000 >800

M97252097: B P1.7-2,16 100 >1.458.000 >800

870227: B P1.5-2,10 100 >1.458.000 <25

6940: B P1.18,25,6 97 900.162 >800

M982: B P1.22,9 94 435.909 200

880049: B P1.7-2,4 92 349.912 400

CDC1573: B P1.7-1,1 87 102.508 25

870446: A P1.12-1,13 71 389.829 800

M98250771: A P1.22,14 62 139.397 <25

NmB: A P1.5-1,2-2 71 <2.000 <25

15 Procedimiento de vacunación: se inmunizaron ratones Swiss-Webster hembra de 6-8 semanas de edad con 10 ug de rLP2086-8529+20 ug de QS-21 en la semana 0 y la semana 4. Se realizaron análisis de datos en el sangrado de exsanguinación de la semana 6. a Homología de aminoácidos de P2086 en comparación con rLP2086-8529. 20 b Títulos de puntos finales expresados como el recíproco de la dilución a absorbancia = 0,1

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TABLA XIX

Variantes de rLP2086 de Subfamilia -Caracterización

rLP2086-8529: rLP2086-M982 rLP2086-80049 rLP2086-CDC1573

Medio de cultivo: Apollon (Sanford) Apollon HySoy HySoy

Solubilidad: Urea 4 M ⇒Z3-12 rTX-100 ⇒Z3-12 rTX-100 ⇒Z3-12 rTX-100

Etapas de purificación: TMAE S Fractogel TMAE S Fractogel TMAE S Fractogel TMAE SEC

Pureza (%): 96 96 90 93

Rendimiento (mg/g de sedimento celular): 0,2 (fermentador) 1,6 (fermentador) 0,4 1,0

Tamaño: SEC (Z3-12) 95.000 110.000 150.000 100.000 120.000

EM: 27.785 (822 lípido) 27.719 (711 lipid) 28.044 (819 lípido) 28.385 (823 lípido)

Punto medio de transición de desnaturalización térmica (TM) ºC: 70 °C 75 °C 62 °C NT

Proteína disponible (mg): Urea – 34 mg Sarc – 36 mg Grupo 1 – 47 mg Grupo 2 – 17 mg 3,6 mg 4,9 mg

Homología de secuencia de 8529 (%): 100 94 92 87

La Tabla XX a continuación proporciona los resultados de ensayos bactericidas en suero fluorescentes para la Subfamilia A de 2086.

TABLA XX

Descripción: 250771 870446 6557 NMB M98 250732 M97 252697

rLP2086-252988, 10 g: >800 (99 %)* >800 (99 %)* <25 - >800 (99 %)* >800 (93 %)*

rLP2086-C11, 10 g: 200 >880 (91 %)* <25 - 200 400

rLP2086-250771, 10 g: >800 (92 %)* >800 (99 %)* <25 - >800 (96 %)* >800 (84 %)*

rLP2086-870446, 10 g: 400 >800 (99 %)* <25 - 400 400

rLP2086-2996, 10 g: 800 >800 (99 %)* <25 - >800 (93 %)* >800 (72 %)*

rLP2086-8529 + rLP2086-2996, 10 g: 800 >800 (99 %)* <25 - >800 (80 %)* >800 (72 %)*

rLP2086-8529 + rP1,22a,14a + rP1,5a,2c, 10 g: - 800 200 >800 (98 %)* - -

rLP2086-8529 +rLP2086-2996 + rP1,22a,14a +rP1,5a,2c, 10 g: 400 >800 (99 %)* 200 >800 (99 %)* 400 >800 (88 %)*

Vesículas de NMB/rLP2086-8529, 20 g: - 100 - 400 - -

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Claims

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