CN102755631B - 预防和治疗脑膜炎球菌性疾病的新型免疫原性组合物 - Google Patents

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Abstract

一种预防和治疗脑膜炎球菌性疾病的新型免疫原性组合物。本发明涉及奈瑟球菌属ORF2086蛋白、交叉反应免疫原性蛋白，可从奈瑟氏球菌属菌株分离或用重组方法制备，包括其免疫原性部分、其生物学等价物、免疫特异性结合上述蛋白质的抗体以及编码上述蛋白质的核酸序列，以及在有效对抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B感染的免疫原性组合物中的应用。

Description

预防和治疗脑膜炎球菌性疾病的新型免疫原性组合物
本发明专利申请是国际申请号为PCT/US02/32369，国际申请日为2002年10月11日，进入中国国家阶段的申请号为02823330.1，名称为“预防和治疗脑膜炎球菌性疾病的新型免疫原性组合物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及奈瑟氏球菌属ORF2086蛋白(亚科A和亚科B)，它可从奈瑟氏球菌属的菌株以及免疫原性部分和/或所述蛋白的生物学等价物分离，所述菌株包括脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)(血清组A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseriagonorrhoeae)和乳糖奈瑟氏球菌(Neisserialactamica)菌株。本发明还涉及免疫特异性结合所述蛋白质、免疫原性蛋白和/或生物学等价物的抗体。此外，本发明涉及分离含有编码任何上述蛋白质、免疫原性部分、生物学等价物和/或抗体的核酸序列的多核苷酸。此外，本发明涉及免疫原性组合物及其在预防、治疗和/或诊断由脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌感染，尤其是由脑膜炎奈瑟氏球菌血清组b引起的脑膜炎球菌性疾病中的应用，以及制备所述组合物的方法。本发明涉及重组形式和分离自天然来源的形式，以及脂质化和非脂质化的形式。
背景技术
尽管可利用抗生素，但脑膜炎球菌性脑膜炎仍是一种可以使儿童和青少年在数小时内死亡的疾病。Pizza等，2000，Science287:1816-1820。脑膜炎以脑膜发炎为特征，这会导致剧烈头痛、发烧、丧失食欲、对光和声不耐受、肌肉僵硬，尤其是颈部肌肉僵硬，严重时会导致抽搐、呕吐和谵妄，从而导致死亡。脑膜炎球菌性脑膜炎症状突然出现，最终将导致脑膜炎球菌性败血症，其特征为出血性皮疹。如果有任何存活机会都要紧急进行快速诊断和用大剂量抗生素立即治疗。《Bantam医学词典》（BantamMedicalDictionary)，第三版，302，200。
脑膜炎球菌性脑膜炎是由脑膜炎奈瑟氏球菌(脑膜炎球菌)引起的，这是一种革兰氏阴性、有荚膜的细菌，被分成几个病原血清组，包括A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E。脑膜炎奈瑟氏球菌的血清组B菌株是全世界脑膜炎球菌性疾病的主要原因。例如医学文献中报道，在美国和欧洲，婴儿和儿童的细菌性脑膜炎约50%是由血清组b引起的。目前还没有预防由脑膜炎奈瑟氏球菌血清组b引起的脑膜炎球菌性疾病的疫苗。
自从Goldschneider等的工作以来，30多年前，开发预防血清组B脑膜炎球菌性疾病的免疫原性组合物对于研究人员是一种挑战。Goldschneider等，1969,J.Exp.Med129(6):1307-26；Goldschneider等，1969，J.Exp.Med129(6):1327-48；Gotschlich等，1969，J.Exp.Med.129(6):1385-95；和Gotschlich等，1969，J.Exp.Med.129(6):1367-84。与血清组A疾病不同，二战后，这种疾病在北美洲实际上已经消失，Achtman，M.，1995，TrendsinMicrobiology3(5):186-92，由血清组B和C生物引起的疾病在很多经济发达国家仍旧是一种地方病。疾病的发病率<1/100,000，而在流行时，高危人群中地方病的发病率200/100,000是罕见的。
已经开发了抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A和C的基于多糖结合物的疫苗，这种疫苗似乎有效预防疾病。目前已经有用血清组A、C、Y和W-135荚膜多糖制造的免疫原性组合物。Ambrosch等，1983,“一种新型四价的免疫原性和副作用”，BulletinoftheWorldHealthOrganization61(2):317-23。然而，这种免疫原性组合物引发一种不依赖T-细胞的免疫应答，这在儿童中无效，且不能对付造成50%以上脑膜炎球菌性疾病的血清组B菌株。
其它人也试图用荚膜多糖开发免疫原性组合物。最近，将血清组C荚膜物质与蛋白质结合制成的血清组C疾病的免疫原性组合物在欧洲已被许可使用。然而，血清组B荚膜不适合作为疫苗候选物，因为这种荚膜多糖是由聚唾液酸构成的，它与发育中的人神经组织上的碳水化合物部分类似。这种糖部分被识别为自身抗原，因此对人的免疫原性弱。
外膜蛋白(OMP)被开发作为血清组B疾病疫苗抗原的替代品。与PorA两个可变区结合的单克隆抗体确定了脑膜炎球菌的血清亚分类方案。PorA蛋白因此作为脑膜炎球菌菌株的血清亚分类抗原(Abdillahi等，1988，MicrobialPathogenesis4(1):27-32)，并被作为血清组B免疫原性组合物的组分而被广泛研究(Poolman，1996，Adv.Exp.Med.Biol.397:73-7)，因为它们可引发杀菌抗体(Saukkonen，1987，MicrobialPathogenesis3(4):261-7)。杀菌抗体被认为是保护作用的指示剂，任何新的免疫原性组合物候选物都应该能够引发这些功能性抗体。
人和动物研究表明，血清亚分类抗原PorA引发杀菌抗体。然而，对PorA的免疫应答通常是血清亚型特异的。特别地，血清亚分类数据表明，由PorA制得的免疫原性组合物需要各个血清亚型的PorA都被这样一种免疫原性组合物覆盖，可能多达6-9个。因此，将需要6-9个PorA来覆盖70-80%血清组B菌株。因此，这种蛋白质的可变特性需要一种多价疫苗组合物来抵抗足量的脑膜炎球菌血清亚型临床隔离群。
开发血清组B脑膜炎球菌的免疫原性组合物非常困难，最近，一些研究小组测序了代表血清组A和B菌株的基因组以帮助鉴定新型免疫原性组合物的候选物。Tettelin，2000，Science，287(5459):1809-15；Pizza等，2000，Science287:1816-1820。即便了解了奈瑟氏球菌的基因组，鉴定新型免疫原性组合物候选物也是一种挑战过程，因为现在还没有合适的数学算法。实际上，一项最近的报道声称，尽管已经鉴定了数百个包含理论跨膜区的开放阅读框(“ORFs”)，与表达、纯化、诱导表面反应和功能活性抗体有关的问题使研究者只发现了七种血清组B脑膜炎球菌性免疫原性组合物的候选物。参见同前。其中一种已知。
因此，需要一种免疫原性组合物，这种组合物可以(1)引发多种奈瑟氏球菌菌株的杀菌抗体；(2)与多个菌株的表面反应；(3)赋予抗生物攻击(livechallenge)的被动保护；和/或(4)防止集落形成。
发明内容
为满足这些要求和其它要求，本发明提供了奈瑟氏球菌ORF2086蛋白(“2086蛋白”)，包括2086亚科A蛋白和2086亚科B蛋白。各个2086蛋白都是可以分离自天然奈瑟氏球菌菌株的蛋白，包括脑膜炎奈瑟氏球菌(血清组A、B、C、D、W-135、X、Y、Z和29E)，淋病奈瑟氏球菌和乳糖奈瑟氏球菌菌株。2086蛋白也可用重组技术制备。
特别地，本发明提供了2086蛋白、其免疫原性部分和/或其生物学等价物，与上述任一免疫特异性结合的抗体，以及包含编码上述任一的核酸序列的多核苷酸。本发明包括组合物、免疫原性组合物及其在预防、治疗和/或诊断脑膜炎球菌感染，尤其是脑膜炎奈瑟氏球菌引起的脑膜炎球菌性疾病中的应用，以及制备所述组合物的方法。这里所述2086蛋白包括重组形式和分离自天然来源的形式以及脂质化和非脂质化的形式。
本发明意外地且有利地提供了组合物，所述组合物(1)引发多种奈瑟氏球菌菌株的杀菌抗体，所述菌株如脑膜炎奈瑟氏球菌、淋病奈瑟氏球菌和/或乳糖奈瑟氏球菌菌株；(2)与多个菌株的表面反应；(3)赋予抗生物攻击的被动保护；和/或(4)防止集落形成，以及使用所述组合物的方法和制备所述组合物的方法。下面描述了本发明的各种实施方案。
附图说明
图1a描述了SDS-PAGE凝胶，它描述了实验获得的蛋白质组分的两种主要蛋白，该实验是为了鉴定奈瑟氏菌的膜蛋白提取物能够引发抗异源菌株的杀菌抗体。
图1B描述了通过蛋白酶消化和反相N-末端测序分析TMAE流过组分鉴定两种主要蛋白的实验结果。
图2描述了纯化方案和用SDS-PAGE确定rLP2086的均一性。
图3描述了通过LC-MS/MS和相应的SDS-PAGE分析TMAE流过组分鉴定两种主要蛋白和一种次要蛋白的实验结果。
图4是2086蛋白重组表达的SDS-PAGE凝胶。
图5是质粒pPX7340的示意图，如这里的实施例所述。
图6是质粒pPX7328的示意图，如这里的实施例所述。
图7是质粒pPX7343示意图，如这里的实施例所述。
图8描述了各种菌株2086基因的N-末端区域。
图9A是鉴定奈瑟氏球菌菌株中免疫原性组分最初步骤的流程图。
图9B是鉴定奈瑟氏球菌菌株中免疫原性组分最终步骤的流程图。
图10A是pBAD阿拉伯糖可诱导启动子的示意图，它驱动P4信号/ORF2086融合蛋白的表达以表达rP2086的脂质化形式，如这里的实施例所述。
图10B是用于重组表达ORF2086的非脂质化形式的pET9a-T7载体的示意图。
图11A是代表表达rLP2086蛋白的大肠杆菌B全细胞裂解物的照片。
图11B是代表表达rP2086蛋白的大肠杆菌B全细胞裂解物的照片。
图12是显示ORF2086蛋白亚科和类别的结构的系统树。
图13是rLP2086亚科A抗血清的全细胞ELISA数据的图示。
图14是rLP2086亚科B抗血清的全细胞ELISA数据的图示。。
图15是rLP2086混合研究(mixingstudy)-WCE效价结果的图示。
图16是rLP2086/rPorA混合研究-WCE效价结果的图示。
图17是显示rLP2086鼠抗血清对P2086亚科B脑膜炎奈瑟氏球菌全细胞裂解物反应性的Western印迹。
图18是显示rLP2086鼠抗血清对P2086亚科A脑膜炎奈瑟氏球菌和乳糖奈瑟氏球菌全细胞裂解物反应性的Western印迹。
序列概述
用于研究的序列的SEQIDNOS.:
SEQIDNO:1当与天然前导序列结合时，编码L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:2用天然前导序列制备的L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:3当与P4前导序列结合时，编码L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:4用P4前导序列制备的L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:5编码L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:6L36275菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:7当与天然前导序列结合时，编码CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:8用天然前导序列制备的CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:9当与P4前导序列结合时，编码CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:10用P4前导序列制备的CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:11编码CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:12CDC2369菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:13当与天然前导序列结合时，编码CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:14用天然前导序列制备的CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:15当与P4前导序列结合时，编码CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:16用P4前导序列制备的CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:17编码CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:18CDC1034菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:19当与天然前导序列结合时，编码L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:20用天然前导序列制备的L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:21当与P4前导序列结合时，编码L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:22用P4前导序列制备的L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:23编码L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:24L4891菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:25当与天然前导序列结合时，编码B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:26用天然前导序列制备的B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:27当与P4前导序列结合时，编码B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:28用P4前导序列制备的B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:29编码B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:30B16B6菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:31当与天然前导序列结合时，编码W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:32用天然前导序列制备的W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:33当与P4前导序列结合时，编码W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:34用P4前导序列制备的W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:35编码W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:36W135(ATCC35559)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:37当与天然前导序列结合时，编码C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:38用天然前导序列制备的C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:39当与P4前导序列结合时，编码C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:40用P4前导序列制备的C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:41编码C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:42C11菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:43当与天然前导序列结合时，编码Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:44用天然前导序列制备的Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:45当与P4前导序列结合时，编码Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:46用P4前导序列制备的Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:47编码Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:48Y(ATCC35561)菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:49当与天然前导序列结合时，编码M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:50用天然前导序列制备的M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:51当与P4前导序列结合时，编码M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:52用P4前导序列制备的M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:53编码M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:54M98250732菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:55当与天然前导序列结合时，编码M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:56用天然前导序列制备的M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:57当与P4前导序列结合时，编码M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:58用P4前导序列制备的M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:59编码M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:60M98250771菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:61当与天然前导序列结合时，编码CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:62用天然前导序列制备的CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:63当与P4前导序列结合时，编码CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:64用P4前导序列制备的CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:65编码CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:66CDC1135菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:67当与天然前导序列结合时，编码M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:68用天然前导序列制备的M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:69当与P4前导序列结合时，编码M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:70用P4前导序列制备的M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:71编码M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:72M97252153菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:73当与天然前导序列结合时，编码CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:74用天然前导序列制备的CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:75当与P4前导序列结合时，编码CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:76用P4前导序列制备的CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:77编码CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:78CDC1610菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:79当与天然前导序列结合时，编码CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:80用天然前导序列制备的CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:81当与P4前导序列结合时，编码CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:82用P4前导序列制备的CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:83编码CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:84CDC1492菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:85当与天然前导序列结合时，编码L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:86用天然前导序列制备的L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:87当与P4前导序列结合时，编码L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:88用P4前导序列制备的L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:89编码L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:90L8M978菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:91当与天然前导序列结合时，编码M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:92用天然前导序列制备的M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:93当与P4前导序列结合时，编码M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:94用P4前导序列制备的M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:95编码M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:96M97252988菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:97当与天然前导序列结合时，编码M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:98用天然前导序列制备的M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:99当与P4前导序列结合时，编码M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:100用P4前导序列制备的M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:101编码M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:102M97252697菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:103当与天然前导序列结合时，编码6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:104用天然前导序列制备的6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:105当与P4前导序列结合时，编码6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:106用P4前导序列制备的6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:107编码6557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:1086557菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:109当与天然前导序列结合时，编码2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:110用天然前导序列制备的2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:111当与P4前导序列结合时，编码2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:112用P4前导序列制备的2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:113编码2996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:1142996菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:115当与天然前导序列结合时，编码M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:116用天然前导序列制备的M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:117当与P4前导序列结合时，编码M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:118用P4前导序列制备的M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:119编码M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:120M97252976菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:121当与天然前导序列结合时，编码M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:122用天然前导序列制备的M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:123当与P4前导序列结合时，编码M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:124用P4前导序列制备的M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:125编码M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:126M97251854菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:127当与天然前导序列结合时，编码CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:128用天然前导序列制备的CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:129当与P4前导序列结合时，编码CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:130用P4前导序列制备的CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:131编码CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:132CDC1521菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:133当与天然前导序列结合时，编码M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:134用天然前导序列制备的M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:135当与P4前导序列结合时，编码M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:136用P4前导序列制备的M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:137编码M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:138M98250622菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:139当与天然前导序列结合时，编码870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:140用天然前导序列制备的870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:141当与P4前导序列结合时，编码870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:142用P4前导序列制备的870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:143编码870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:144870446菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:145当与天然前导序列结合时，编码M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:146用天然前导序列制备的M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:147当与P4前导序列结合时，编码M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:148用P4前导序列制备的M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:149编码M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:150M97253248菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:151当与天然前导序列结合时，编码M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:152用天然前导序列制备的M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:153当与P4前导序列结合时，编码M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:154用P4前导序列制备的M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:155编码M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:156M98250809菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:157当与天然前导序列结合时，编码L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:158用天然前导序列制备的L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:159当与P4前导序列结合时，编码L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:160用P4前导序列制备的L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:161编码L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:162L5M981菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:163当与天然前导序列结合时，编码NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:164用天然前导序列制备的NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:165当与P4前导序列结合时，编码NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:166用P4前导序列制备的NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:167编码NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:168NMB菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:169当与天然前导序列结合时，编码M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:170用天然前导序列制备的M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:171当与P4前导序列结合时，编码M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:172用P4前导序列制备的M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:173编码M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:174M98250572菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:175当与天然前导序列结合时，编码A4Sanford；M97251836PART；M97251957；M97251985；M97252060；M97251870；M97251994；M98250024；M97251905；M97251876；M97251898；或M97251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:176用天然前导序列制备的A4Sanford；M97251836PART；M97251957；M97251985；M97252060；M97251870；M97251994；M98250024；M97251905；M97251876；M97251898；或M97251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:177当与P4前导序列结合时，编码A4Sanford；M97251836PART；M97251957；M97251985；M97252060；M97251870；M97251994；M98250024；M97251905；M97251876；M97251898；或M97251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:178用P4前导序列制备的A4Sanford；M97251836PART；M97251957；M97251985；M97252060；M97251870；M97251994；M98250024；M97251905；M97251876；M97251898；或M97251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:179编码A4Sanford；M97251836PART；M97251957；M97251985；M97252060；M97251870；M97251994；M98250024；M97251905；M97251876；M97251898；或M97251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:180A4Sanford；M97251836PART；M97251957；M97251985；M97252060；M97251870；M97251994；M98250024；M97251905；M97251876；M97251898；或M97251830菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:181当与天然前导序列结合时，编码CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:182用天然前导序列制备的CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:183当与P4前导序列结合时，编码CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:184用P4前导序列制备的CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:185编码CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:186CDC937菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:187当与天然前导序列结合时，编码M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:188用天然前导序列制备的M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:189当与P4前导序列结合时，编码M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:190用P4前导序列制备的M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:191编码M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:192M97252097菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:193当与天然前导序列结合时，编码870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:194用天然前导序列制备的870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:195当与P4前导序列结合时，编码870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:196用P4前导序列制备的870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:197编码870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:198870227菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:199当与天然前导序列结合时，编码H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:200用天然前导序列制备的H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:201当与P4前导序列结合时，编码H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:202用P4前导序列制备的H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:203编码H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:204H355菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:205当与天然前导序列结合时，编码H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:206用天然前导序列制备的H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:207用P4前导序列制备的H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:208编码H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:209当与P4前导序列结合时，编码H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:210H44_76菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:211当与天然前导序列结合时，编码8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:212用天然前导序列制备的8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:213当与P4前导序列结合时，编码8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:214用P4前导序列制备的8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:215编码8529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:2168529菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:217当与天然前导序列结合时，编码6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:218用天然前导序列制备的6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:219当与P4前导序列结合时，编码6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:220用P4前导序列制备的6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:221编码6940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:2226940菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:223当与天然前导序列结合时，编码M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:224用天然前导序列制备的M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:225当与P4前导序列结合时，编码M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:226用P4前导序列制备的M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:227编码M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:228M982菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:229当与天然前导序列结合时，编码880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:230用天然前导序列制备的880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:231当与P4前导序列结合时，编码880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:232用P4前导序列制备的880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:233编码880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:234880049菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:235当与天然前导序列结合时，编码M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:236用天然前导序列制备的M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:237当与P4前导序列结合时，编码M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列
SEQIDNO:238用P4前导序列制备的M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:239编码M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:240M97253524、M97251885和M97251926菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:241当与天然前导序列结合时，编码M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:242用天然前导序列制备的M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:243当与P4前导序列结合时，编码M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:244用P4前导序列制备的M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:245编码M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:246M98250670菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:247当与天然前导序列结合时，编码CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:248用天然前导序列制备的CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:249当与P4前导序列结合时，编码CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:250用P4前导序列制备的CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:251编码CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列的核酸序列。
SEQIDNO:252CDC1573菌株的成熟2086蛋白的氨基酸序列。
SEQIDNO:253编码乳酰胺奈瑟氏球菌菌株的2086蛋白的氨基酸序列的部分核酸序列。
SEQIDNOS:254-259与蛋白质的2086家族的蛋白结合的氨基酸序列。
SEQIDNOS:260-278与2086亚科A的蛋白结合的氨基酸序列。
SEQIDNOS:279-299与2086亚科B的蛋白结合的氨基酸序列。
SEQIDNO:300是与本发明实施方案所述2086蛋白家族(“2086蛋白”)相应的氨基酸共有序列。
SEQIDNO:301是与本发明实施方案所述2086蛋白亚科A相应的氨基酸共有序列。
SEQIDNO:302是与本发明实施方案所述2086蛋白亚科B相应的氨基酸共有序列。
SEQIDNO:303带有BamHI限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号:4623)。
SEQIDNO:304带有NdeI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号:4624)。
SEQIDNO:305正向引物的核酸序列(化合物编号:4625)。
SEQIDNO:306正向引物的核酸序列(化合物编号:5005)。
SEQIDNO:307反向引物的核酸序列(化合物编号:5007)。
SEQIDNO:308带有BglII限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号:5135)。
SEQIDNO:309带有BamHI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号:5658)。
SEQIDNO:310带有SphI限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号:5660)。
SEQIDNO:311带有BamHI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号:6385)。
SEQIDNO:312带有BglII和NdeI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号:6406)。
SEQIDNO:313正向引物的核酸序列(化合物编号:6470)。
SEQIDNO:314反向引物的核酸序列(化合物编号:6472)。
SEQIDNO:315带有BamHI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号6473)。
SEQIDNO:316带有BglII和NdeI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号:6474)。
SEQIDNO:317正向引物的核酸序列(化合物编号:6495)。
SEQIDNO:318反向引物的核酸序列(化合物编号:6496)。
SEQIDNO:319带有SphI限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号:6543)。
SEQIDNO:320带有BglII限制位点的反向引物的核酸序列(化合物编号:6605)。
SEQIDNO:321带有BglII和NdeI限制位点的正向引物的核酸序列(化合物编号:6721)。
SEQIDNO:322P4前导序列的核酸序列。
SEQIDNO:323天然2086前导序列变体1的核酸序列。
SEQIDNO:324天然2086前导序列变体2的核酸序列。
SEQIDNO:325天然2086前导序列变体3的核酸序列。
SEQIDNO:326天然2086前导序列变体4的核酸序列。
SEQIDNO:327P4431的氨基酸序列。
SEQIDNO:328P5163的氨基酸序列。
SEQIDNO:329是本发明实施方案的氨基酸序列。
具体实施方式
一类新的具有抗脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的交叉功能杀菌活性的抗原可避免对多价PorA的需求以进行抗感染免疫。这种抗原被意外识别并在这里被描述和要求权利。首先在脑膜炎球菌菌株的可溶性外膜蛋白(sOMP)的复杂混合物中观察到这种抗原。通过一系列分级和蛋白质纯化步骤直到感兴趣的蛋白质混合物仅含有少数蛋白而发现这种抗原的杀菌活性。通过N-末端氨基酸测序和肽作图鉴定了这种混合物中的主要蛋白质。具有杀菌活性的感兴趣的蛋白质被鉴定为ORF2086蛋白，这是一种脂质化蛋白质(也被称为LP2086)。“ORF2086蛋白”是指一种由奈瑟氏球菌属的开放阅读框2086(ORF2086)编码的蛋白质。
新的免疫原性组合物在这里是指分离自脑膜炎奈瑟氏球菌的基于奈瑟氏球菌属ORF2086蛋白(也称为“2086蛋白”或“ORF2086”蛋白质，在这里可替换使用，或P2086(指非脂质化蛋白)和LP2086(指蛋白的脂质化形式))的候选物，它通过合并细胞分级分离，不同洗涤剂提取、蛋白质纯化，以及制备抗血清并用多种菌株进行杀菌活性测定而鉴定。作为潜在的免疫原性组合物和上述参考资料中所述诊断方法的替代品，本发明涉及组合物以及通过使用蛋白质、其免疫原性部分和其生物学等价物，及编码所述多肽、蛋白质和等价物的基因以及与其免疫特异性结合的抗体治疗和/或预防脑膜炎球菌感染的方法。
根据本发明的实施方案，基于上述试剂显示的交叉反应性或非菌株特异性，包括分离的多肽、其免疫原性部分和/或其生物学等价物的基于2086蛋白的免疫原性试剂被意外确定为免疫原性候选物。特别地，所述候选物出乎意料地被鉴定出具有以下能力：(1)引发多种奈瑟氏球菌和/或淋球菌菌株的杀菌抗体；(2)与多个菌株的表面反应；(3)赋予抗生物攻击的被动保护；和/或(4)防止集落形成。因此，本发明提供了包含所述免疫原性试剂的免疫原性组合物，包括分离的多肽、其免疫原性部分和/或其生物学等价物，以及使用它们抵抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的方法。(参见这里的实施例1用于鉴定2086蛋白的方法。)
术语“非菌株特异”在这里指抗原引发抗一种以上脑膜炎奈瑟氏球菌菌株(例如异源脑膜炎球菌菌株)的免疫应答效应的特性。术语“交叉反应”在这里可与术语“非菌株特异”互换使用。术语“免疫原性非菌株特异性脑膜炎奈瑟氏球菌抗原”在这里描述可分离自脑膜炎奈瑟氏球菌的抗原，尽管它也可分离自其它细菌(例如其它奈瑟氏球菌菌株，如淋球菌菌株)，或用重组技术制备。
本发明的2086蛋白包括脂质化和非脂质化的蛋白。此外，本发明还试图将与各个蛋白质相应的不成熟蛋白或前蛋白用作中间化合物/组合物。
根据本发明的实施，本发明还提供了与上述免疫原性试剂免疫特异结合的抗体。此外，本发明涉及包含编码上述任一的核酸序列的分离的多核苷酸。因此，本发明提供了组合物和/或免疫原性组合物以及它们在预防、治疗和/或诊断脑膜炎球菌性脑膜炎，尤其是血清组B脑膜炎球菌性疾病中的应用，以及制备所述组合物的方法。
本发明的组合物具有高免疫原性并能够引发杀菌抗体的产生。这些抗体与异源血清组、血清型和血清亚型的脑膜炎球菌菌株交叉反应。因此，本发明的组合物克服了以前脑膜炎奈瑟氏球菌疫苗的不足，它具有对异源奈瑟氏球菌菌株引发杀菌抗体的能力。因此，本发明提供了可与较少组分结合而产生保护作用的免疫原性组合物，这种保护作用可与先前使用的试剂相比，这是本发明的其它优点。所述组合物或免疫原性试剂(例如多肽、免疫原性部分或片段和生物学等价物等，但不限于此)可单独使用或与其它抗原或试剂一起使用以引发对脑膜炎球菌感染和疾病的免疫保护，以及引发对其它病原体引起的感染和/或疾病的免疫保护。由于减少了抗多种菌株所需的抗原的数量，这样就简化了用来抗脑膜炎球菌感染的免疫原性组合物的设计。实际上，纯化的2086蛋白将显著地并出乎意料地减少提供足够的引起脑膜炎球菌性疾病的菌株的免疫原性所需的蛋白数量。所述2086蛋白可在大肠杆菌中作为脂蛋白重组表达，这是蛋白质的野生形式，其表达水平远高于天然脑膜炎球菌。
由于发现来自一种菌株的抗2086蛋白的抗体可杀死不相关的(即异源的)菌株，我们试图表征大量异源菌株以确定存在“2086同源物”，并确定序列保守的水平。尽管用PCR测得约70%的菌株具有2086同源物，这种同源物可用扩增起始2086基因的引物从菌株8529扩增，但其余约30%对这种测试呈阴性。余下的约30%被发现含有与来自2086基因的起始8529仅有约60%氨基酸序列同源性的2086同源物。其它引物被确定可从这些约30%的菌株扩增2086同源物。所测脑膜炎奈瑟氏球菌菌株属于亚科A或亚科B，这取决于可扩增2086同源物的引物。这些实验的细节描述在下面的实施例5中。
2086蛋白在各种血清亚型中的存在情况
为确定脑膜炎奈瑟氏球菌菌株之间2086基因的序列保守水平，克隆了亚科A和B的一些代表的全长基因并进行了DNA序列分析。用这里所述的引物，例如参见表IV，鉴定了24种表达不同血清亚型抗原且也表达共享蛋白P2086的血清组B脑膜炎球菌菌株。这些序列的例子在这里提供并作为成熟DNA序列显示(即在半胱氨酸残基切除所有脂蛋白信号序列)。例如参见偶数编号的SEQIDNOS:2-252的氨基酸序列，但不限于此。
由于2086蛋白不大量出现在野生型菌株中，它是杀菌抗体的靶。这些抗体不同于响应PorA产生的抗体，能够杀死表达异源血清亚型的菌株。
2086蛋白的抗体还可被动保护幼鼠免遭脑膜炎球菌攻击(见表VII)。2086蛋白的重组表达使得可用2086蛋白作为免疫原性组合物以预防脑膜炎球菌性疾病。临床实验中所有新近的脑膜炎球菌性免疫原性组合物的候选物都是含有许多不同蛋白的复杂混合物或外膜蛋白制品。提供血清亚型特异性的PorA蛋白质需要一种免疫原性组合物中含有6-9种变异体以覆盖约70-80%疾病相关的血清亚型。相反，这里清楚证明，一种2086蛋白的抗血清能够杀死6种血清亚型的代表，在西欧和美国它们引起约65%的疾病隔离群。因此，纯化的2086蛋白具有减少提供足够覆盖引起脑膜炎球菌性疾病的血清亚型的免疫原性组合物所需的蛋白数量的潜力。
蛋白质、免疫原性蛋白和生物学等价物
本发明提供的2086蛋白是分离的蛋白质。术语“分离的”是指用人手从天然状态改变。如果“分离的”组合物或物质在自然界存在，则它已经被改变或从其原始环境除去，或者两者同时发生。例如天然出现在活动物中的多肽或多核苷酸不是“分离的”，但相同的分离自其天然状态共存物质的相同多肽或多核苷酸是“分离的”，如这里所用的术语。因此，术语“分离的蛋白质”在这里包括分离自天然来源的蛋白和用重组技术制备的蛋白，以及与其它抗原和/或添加剂组合的蛋白，添加剂如药学上可接受的载体、缓冲剂、佐剂等。
根据本发明的实施方案，2086蛋白、其免疫原性部分和/或其生物学等价物包含以下任何氨基酸序列:
ADIGxGLADA(SEQIDNO:254)，其中，x是任何氨基酸；
IGxGLADALT(SEQIDNO:255)，其中，x是任何氨基酸；
SLNTGKLKND(SEQIDNO:256)；
SLNTGKLKNDKxSRFDF(SEQIDNO:257，其中，x是任何氨基酸)；
SGEFQxYKQ(SEQIDNO:258)，其中，x是任何氨基酸；或
IEHLKxPE(SEQIDNO:259)，其中，x是任何氨基酸。
根据本发明的实施方案，2086亚科A蛋白质，其免疫原性部分和/或其生物学等价物包含以下任何氨基酸序列:
GGGVAADIGx(SEQIDNO:260)，其中，x是任何氨基酸；
SGEFQIYKQ(SEQIDNO:261)；
HSAVVALQIE(SEQIDNO:262)；
EKINNPDKID(SEQIDNO:263)；
SLINQRSFLV(SEQIDNO:264)；
SGLGGEHTAF(SEQIDNO:265)；
GEHTAFNQLP(SEQIDNO:266)；
SFLVSGLGGEH(SEQIDNO:267)；
EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLP(SEQIDNO:268)；
GKAEYHGKAF(SEQIDNO:269)；
YHGKAFSSDD(SEQIDNO:270)；
GKAEYHGKAFSSDD(SEQIDNO:271)；
IEHLKTPEQN(SEQIDNO:272)；
KTPEQNVELA(SEQIDNO:273)；
IEHLKTPEQNVELA(SEQIDNO:274)；
AELKADEKSH(SEQIDNO:275)；
AVILGDTRYG(SEQIDNO:276)；
AELKADEKSHAVILGDTRYG(SEQIDNO:277)；或
EEKGTYHLAL(SEQIDNO:278)。
2086亚科B蛋白质、其免疫原性部分和/或其生物学等价物，包含以下任何如本发明实施方案所述的氨基酸序列:
LITLESGEFQ(SEQIDNO:279)；
SALTALQTEQ(SEQIDNO:280)；
FQVYKQSHSA(SEQIDNO:281)；
LITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQ(SEQIDNO:282)；
IGDIAGEHTS(SEQIDNO:283)；
EHTSFDKLPK(SEQIDNO:284)；
IGDIAGEHTSFDKLPK(SEQIDNO:285)；
ATYRGTAFGS(SEQIDNO:286)；
DDAGGKLTYT(SEQIDNO:287)；
IDFAAKQGHG(SEQIDNO:288)；
KIEHLKSPEL(SEQIDNO:289)；
ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNV(SEQIDNO:290)；
HAVISGSVLY(SEQIDNO:291)；
KGSYSLGIFG(SEQIDNO:292)；
VLYNQDEKGS(SEQIDNO:293)；
HAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFG(SEQIDNO:294)；
AQEVAGSAEV(SEQIDNO:295)；
IHHIGLAAKQ(SEQIDNO:296)；
VETANGIHHI(SEQIDNO:297)；
AQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQIDNO:298)；或
VAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ(SEQIDNO:299)。
所述2086蛋白包括以下如本发明实施方案所述的共有序列和/或其免疫原性部分。
2086蛋白共有序列(SEQIDNO:300):
CSSG-----GGGVxADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGA
EKTxxxGD---SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGxxITLxSGEFQxYKQxHSAxx
ALQxExxxxxxxxxxxxxxRxFxxxxxxGEHTxFxxLPxx-xAxYxGxAFxSDDxxGxLxYx
IDFxxKQGxGxIEHLKxPExNVxLAxxxxKxDEKxHAVIxGxxxYxxxEKGxYxLxxxGxxAQExAGxAxVxxxxxxHxIxxAxKQ
在上述共有序列中，“x”表示任何氨基酸，氨基酸位置5-9的区域是任何0-5个氨基酸，氨基酸位置67-69的区域是任何0-3个氨基酸，同时氨基酸位置156是任何0-1个氨基酸。氨基酸位置5-9的区域优选包含0、4或5个氨基酸。氨基酸位置67-69的区域优选包含0或3个氨基酸。特别值得一提的是，这种共有序列说明了2086蛋白的高变异性。根据理论，但不局限于此，这种高变异性被认为提供了有利且未预料的交叉反应性。
根据本发明的一个实施方案，所述2086蛋白以免疫原性、非病原的和非菌株特异为特征。此外，根据本发明再一个实施方案，这些蛋白意外地具有免疫原性，尽管约2%-约40%是非保守的。
术语“非保守的”在这里指可以发生插入、取代和/或缺失的氨基酸数目占蛋白质中总氨基酸数目的百分比。例如，如果蛋白质有40%是非保守的并有例如263个氨基酸，则蛋白质中有105个氨基酸位置上的氨基酸可以发生取代。同样，如果蛋白质有10%是非保守的并有例如约280个氨基酸，则有28个氨基酸位置上的氨基酸可发生取代。所述2086蛋白不包含蛋白质免疫原性的氨基酸残基也可发生缺失。
此外，可基于不同区域的同源性将所述2086蛋白分成亚科。例如，下面提供了共有序列的两个亚科，亚科A和亚科B，但不局限于此:
2086亚科A序列(SEQID301)
CSSG----GGGVAADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGA
EKTxxxGD---SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGQxITLxSGEFQIYKQxHSAVV
ALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPxGKAEYHGKAFSSDDxxGxLxYxIDFxxKQGxGxIEHLKTPEQNVELAxAELKADEKSHAVILGDTRYGxEEKGTYHLALxGDRAQEIAGxATVKIxEKVHEIxIAxKQ
“x”是任何氨基酸。
氨基酸位置5-8的区域是任何0-4个氨基酸。
氨基酸位置66-68的区域是任何0-3个氨基酸。
氨基酸位置5-8的区域优选包含0或4个氨基酸。氨基酸位置66-68的区域优选包含0或3个氨基酸。
2086亚科B(SEQID302)
CSSGGGG-----VxADIGxGLADALTAPLDHKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQ
GAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGxLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQxQDxExSxKMVAKRxFxIGDIAGEHTSFDKLPKxxxATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVxLAxxYIKPDEKxHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGxxAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ
“x”是任何氨基酸。
氨基酸位置8-12的区域是任何0-5个氨基酸。
氨基酸位置8-12的区域优选包含0或5个氨基酸。
根据本发明的实施方案，2086蛋白亚科可再分成簇(cluster)。例如根据本发明的一个实施方案，提供了以下以下簇:偶数编号的SEQIDNOS:2-12；偶数编号的SEQIDNOS:14-24；偶数编号的SEQIDNOS:26-42；偶数编号的SEQIDNOS:50-60；偶数编号的SEQIDNOS:62-108；偶数编号的SEQIDNOS:110-138；偶数编号的SEQIDNOS:140-156；偶数编号的SEQIDNOS:158-174和偶数编号的SEQIDNOS:224-252。
本发明的多肽序列可与偶数编号的SEQIDNOS:2-252的参考序列相同，即100%相同，或与参考序列相比有一定数目的氨基酸改变，即同一性百分比小于100%。这种改变包括至少一种氨基酸缺失、取代(包括保守性和非保守性取代)或插入。这种改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或那些末端位置之间的任何地方，分散在参考氨基酸序列的各个氨基酸中间或在参考氨基酸序列内的一个或多个毗连基团中。
因此，本发明还提供了含有与序列表中所含氨基酸序列(即偶数编号的SEQIDNOS:2-252)相同序列的蛋白质。根据特定的序列，序列的同一性程度优选大于60%(例如60%，70%，80%，90%，95%，97%，99%，99.9%或更高)。这些同源蛋白包括突变体和等位基因变异体。
在本发明优选的实施方案中，所述2086蛋白或其它2086多肽(例如免疫学部分或生物学等价物)产生对同源和至少一种异源脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体。特别地，2086多肽的抗体被动保护幼鼠免遭脑膜炎球菌的侵袭，例如鼻内的。在更加优选的实施方案中，所述2086多肽可使幼鼠抵抗同源菌株和至少一种异源菌株。所述多肽可选自上述序列，如偶数编号的SEQIDNOS:2-252，或者所述多肽可以是所列多肽的任何免疫学片段或生物学等价物。优选地，所述多肽选自上述序列中任何偶数编号的SEQIDNOS:2-252。
本发明还涉及所述2086多肽的等位基因变体或其它变异体，这是生物学等价物。合适的生物学等价物能够(1)引发对同源菌株和至少一种异源奈瑟氏球菌菌株和/或淋球菌菌株的杀菌抗体；(2)与同源菌株和至少一种异源奈瑟氏球菌菌株和/或淋球菌菌株的表面反应；(3)赋予抗生物攻击的被动保护；和/或(4)防止集落形成。
合适的生物学等价物与这里所述2086多肽之一(即偶数编号的SEQIDNOS:2-252)至少有约60%，优选至少约70%，更优选至少约75%，再优选约80%，再优选约85%，再优选约90%，再优选约95%或再优选约98%，或再优选约99%类似，这使得所述等价物能够引发与本发明的2086蛋白实质上相同的免疫原性特性。
或者，所述生物学等价物与偶数编号的SEQIDNOS:2-252中的2086蛋白之一有实质上相同的免疫原性特性。更加本发明的一个实施方案，所述生物学等价物与偶数编号的SEQIDNOS2-252的有相同的免疫原性特性。
通过产生本发明蛋白质的变异体和修饰物得到了生物学等价物。这些蛋白质的变异体和修饰物是通过插入、缺失或取代一个或多个氨基酸来改变氨基酸序列而获得的。氨基酸序列被修饰，例如通过取代以产生实质上相同质量或改进质量的多肽。优选的引入变化的方法包括通过定点诱变产生多肽的核酸序列的预定突变。
修饰和变化可发生在本发明多肽的结构中，这样获得的的分子仍具有脑膜炎奈瑟氏球菌的免疫原性。例如，但不限于此，在未丧失免疫原性的序列中，某些氨基酸可被其它氨基酸取代(包括非保守性取代和保守性取代)。由于多肽的相互作用能力和性质确定了多肽的生物学功能活性，多肽序列(或者，当然，其指定的DNA编码序列)中可发生许多氨基酸序列的取代，然而，所得多肽具有类似特性。本发明包括这里所述多肽结构以及编码所述多肽的核酸序列的任何变化，其中，所述多肽保持免疫原性。根据这里提供的指导，精通此领域的技术人员能够很容易地修饰所述多肽和多核苷酸。
例如某些可变区被确定可允许有取代或缺失。如上所述，根据本发明的一个实施方案，所述2086共有序列显示了2086蛋白家族的保守和非保守性区域。
在作出这些变化时，可采用精通此领域的技术人员已知的任何技术。例如，但不限于此，可考虑氨基酸的亲水指数。在对多肽赋予生物活性功能时，亲水氨基酸指数的重要性在此领域中通常被理解。Kyte等，1982.J.Mol.Bio.157:105-132。
基于亲水性，也可进行类似氨基酸的取代，尤其是生物功能等价多肽或如此产生的肽要用于免疫学实施方案时。美国专利4,554,101描述了多肽的最大局部平均亲水性，这由其毗邻氨基酸的亲水性控制，与其免疫原性相关，即与多肽的生物学特性相关，在此将此专利并入以供参考。
所述多肽的生物学等价物也可通过定点诱变制备。定点诱变是通过特定诱变指定的DNA来制备第二代多肽或来自其序列的生物功能等价多肽或肽的有用技术。这种改变可发生在需要氨基酸取代的地方。这种技术还提供制备和测试序列变异体的能力，例如结合上述一种或多种想法，在DNA中引入一个或多个核苷酸序列变化。定点诱变可通过使用特定的寡核苷酸序列产生突变体，所述序列编码所需突变的DNA序列和足够数量的毗邻核苷酸，以提供足够大小的引物序列和序列复杂性从而在横贯缺失连接的两侧上形成稳定的双链体。通常，长度约为17-25个核苷酸的引物是优选的，序列连接的两侧约有5-10个残基被改变。
通常，定点诱变技术是本领域熟知的。应该意识到的是，该技术通常采用噬菌体载体，它可以以单链和双链形式存在。通常，这里所述的定点诱变是通过首先获得单链载体而进行的，该载体的序列中包含编码所有或部分所选脑膜炎奈瑟氏球菌多肽序列的DNA序列。制备了带有所需突变序列的寡核苷酸引物(例如合成的)。然后将该引物退火形成单链载体，并用酶如大肠杆菌聚合酶IKlenow片段延伸，以完全合成带有突变的链。因此形成了杂双链体，其中第一条链编码最初的非突变序列，第二条链带有所需突变。然后用这种杂双链体载体来转化合适的细胞，如大肠杆菌细胞，并选择包含带有该突变的重组载体的克隆。市售的试剂盒可提供需要的所有试剂，除但寡核苷酸引物外。
所述2086多肽包括任何与具有偶数编号的SEQIDNOS2-252之一的氨基酸序列的2086蛋白有足够的序列相似性和/或生物学等价的蛋白或多肽。此外，本发明的2086多肽不限于特定来源。因此，本发明提供一般检测和从各种来源分离多肽。同样，基于本文提供的指导，所述2086多肽可用重组方法制备，这是本领域技术人员熟知的，或用此领域已知的任何其它合成方法制备。
本发明预料，将所述2086多肽切割成片段将有利于进一步用于结构或功能分析或用于产生如2086相关多肽和2086特异性抗体的试剂。这可通过用肽酶如如内切蛋白酶glu-C(Boehringer，Indianapolis，IN)处理纯化或未纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌多肽而实现。另一种方法是用CNBr处理，这样可以从天然脑膜炎奈瑟氏球菌2086多肽中产生肽片段。也可用重组技术来产生2086蛋白的特定片段。
术语“变异体”在这里分别是指不同于参考多核苷酸或多肽但保留实质特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型变异体的核苷酸序列与参考多核苷酸不同。变异体核苷酸序列的变化可以改变或不改变参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸变化可导致参考序列编码的多肽中的氨基酸取代、添加、缺失、融合和截短，如下所述。多肽的典型变异体的氨基酸序列不同于参考多肽。通常，差异是有限的，因此参考多肽和变异体的序列总体而言非常类似，且在许多区域是相同的(即生物学等价物)。变异体和参考多肽的氨基酸序列可以不同，这包括一种或多种任何组合的取代、添加、缺失。取代或插入的氨基酸残基可由或不可由遗传密码编码。多核苷酸或多肽的变异体可以是天然存在的如等位基因变异体，或者可以是非天然存在的变异体。非天然存在的多核苷酸和多肽的变异体可通过诱变技术或通过直接合成制备。
“同一性”是本领域已知的，它是指通过序列比较确定的两个或多个多肽序列或两个或多个多核苷酸序列之间的关系。在此领域中，“同一性”还指多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度，这可通过在所述序列的链之间进行配对而确定。“同一性”和“相似性”可用已知的方法计算，这些方法包括但不限于以下文献中描述的方法：《计算分子生物学》(ComputationalMolecularBiology)，Lesk,A.M.编，牛津大学出版社，纽约，1988；《生物计算:信息学和基因组计划》(Biocomputing:InformaticsandGenomeProjects)，Smith,D.W.编，学术出版社，纽约，1993；《序列数据的计算机分析》(ComputerAnalysisofSequenceData)，第I部分，Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编，HumanaPress，新泽西州，1994；《分子生物学中的序列分析》(SequenceAnalysisinMolecularBiology)，vonHeinje,G.，学术出版社，1987；和《序列分析引物》(SequenceAnalysisPrimer)，Gribskov,M.和Devereux,J.编，MStocktonPress，纽约，1991；和Carillo,H.和Lipman,D.,SIAMJ.AppliedMath.，48:1073(1988)。优选的确定同一性的方法是要得到测试序列之间的最大匹配。确定同一性和相似性的方法被编成公众可获得的计算机程序。优选的确定两个序列之间同一性和相似性的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.等，1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul，S.F.等，1990)。BLASTX程序可从NCBI以及其它来源(BLAST手册，Altschul,S.等，NCBINLMNIHBethesda，Md.20894；Altschul，S.等，1990)获得。也可用熟知的SmithWaterman算法来确定同一性。
例如，但不局限于此，本发明的氨基酸序列可与参考序列—偶数编号的SEQIDNOS:2-252相同，即100%相同，或者与参考序列相比可包含一些氨基酸改变，这样同一性百分比就小于100%。这种改变选自至少一种氨基酸缺失、取代(包括保守性和非保守性取代)或插入，其中，所述改变可发生在参考多肽序列的氨基或羧基末端位置，或这些末端位置之间的任何地方，独立地分散在参考序列的氨基酸中间或在参考序列内的一个或多个毗连基团中。将SEQIDNOS:2-252的氨基酸总数乘以各自的同一性百分比的分数(除以100)，然后将所述SEQIDNOS:2-252中任一氨基酸总数减去该结果就可得到给定的同一性百分比的氨基酸改变的数目，或:
na=xa-(xa·y),
其中，na是氨基酸改变的数目，xa是SEQIDNOS:2-252中的氨基酸总数，y是，例如用0.70表示70%，0.80表示80%，0.85表示85%，等等，且其中任何非整数的xa·y的结果在从xa中减去之前都被减小成最接近的整数。
在优选的实施方案中，上述多肽选自偶数编号的SEQIDNOS2-252所列出的蛋白质，如2086蛋白的成熟形式。2086蛋白或等价物等可以是脂质化或非脂质化的。
ORF2086可在带有天然ORF2086信号序列的大肠杆菌中表达。然而，需要找到改进蛋白质表达的方法。根据本发明的实施方案，前导序列产生蛋白质的脂质化形式。例如，下面描述了使用非典型流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)P4蛋白的信号序列以提高表达。
细菌脂蛋白的加工以含有信号序列的前体或脂蛋白质(prolipoprotein)的合成开始，该信号序列依次含有共有序列脂蛋白加工/修饰位点。这种脂蛋白质最初通过常规的Sec系统位于革兰氏阴性菌的内膜或革兰氏阳性菌的膜上。一旦通过Sec系统位于膜，所述脂蛋白质就在共有序列位点被信号肽酶II切割，暴露的N-末端半胱氨酸残基被甘油酸化(glycerated)和酰化。Hayashi等，1990，“细菌中的脂蛋白”，J.Bioenerg.Biomembr.Jun；22(3):451-71；Oudega等，1993，“一种小的脂蛋白—细菌素释放蛋白的表达和膜插入所需的大肠杆菌SecB、SecA和SecY蛋白”，J.Bacteriol.Mar；175(5):1543-7；Sankaran等，1995，“细菌脂蛋白的修饰”，MethodsEnzymol.250:683-97。
在革兰氏阴性菌中，脂质化蛋白质转运到外膜是由独特的具有膜特异性的ABC转运蛋白系统介导的，这种特异性取决于脂蛋白位置2上的分选信号。Yakushi等，2000，“一种新的ABC转运蛋白介导从膜中分离脂质修饰的蛋白质”，NatCellBiol.Apr；2(4):212-8。
与细菌脂蛋白及其信号序列融合已被用于在细菌表面展示重组蛋白。美国专利号5,583,038和6,130,085。交换脂蛋白信号序列可增加脂蛋白的产生。De等，2000，“在大肠杆菌中表达的肺炎链球菌棕榈酰化的肺炎球菌性非表面粘附素A的纯化和鉴定”，Vaccine，Mar6；18(17):1811-21。
已知蛋白质的细菌脂质化可增加或改变对蛋白质的免疫应答。Erdile等，1993，“附加的脂质在布氏疏螺旋体OspA免疫原性中的作用”，Infect.Immun.Jan；61(1):81-90；Snapper等，1995，“在对T细胞依赖型II抗原的体液免疫应答中细菌脂蛋白可替代细胞因子”，J.Immunol.Dec15；155(12):5582-9。然而，细菌脂蛋白的表达可因加工的严格而复杂化。Pollitt等，1986，“大肠杆菌主要外膜脂蛋白的信号肽切割位点氨基酸取代的效果”，J.Biol.Chem.Feb5；261(4):1835-7；Lunn等，1987，“脂蛋白质信号肽突变对大肠杆菌中杂交体前脂-β-内酰胺酶分泌的作用”，J.Biol.Chem.Jun15；262(17):8318-24；Klein等，1988，“细菌脂蛋白信号序列的特殊性质”，ProteinEng.Apr；2(1):15-20。细菌脂蛋白的表达也可因其它问题而复杂化，如毒性和低表达水平。Gomez等，1994，“当在大肠杆菌中表达时枯草芽孢杆菌脂蛋白LplA核苷酸使细胞裂解”，Microbiology.Aug；140(Pt8):1839-45；Hansson等，1995，“截短和全长形式的莱姆病疏螺旋体外表面蛋白A在大肠杆菌中的表达”，ProteinExpr.Purif.Feb；6(1):15-24；Yakushi等，1997，“错误定位的主要外膜脂蛋白和大肠杆菌的肽聚糖之间共价连接的致死率”，J.Bacteriol.May；179(9):2857-62。
非可分型流感嗜血杆菌表达称为P4的脂蛋白(也称为蛋白质“e”)。采用天然P4信号序列P4蛋白的重组形式在大肠杆菌中高度表达。美国专利号5,955,580。当用天然P4信号序列取代大肠杆菌表达载体中的天然ORF2086信号序列时，ORF2086的表达水平增加。
用异源P4信号序列增加表达的概念可延伸到其它细菌脂蛋白。特别地，分析细菌基因组能够鉴定许多可能感兴趣的ORF试图。在异源宿主细胞如大肠杆菌中表达各个带有其天然信号序列的ORF将产生各种使用多种信号序列固有的问题，包括稳定性、相容性等等。为使这些问题最小化，P4信号序列被用来表达各个感兴趣的ORF。如上所述，P4信号序列可改进异源2086ORF的表达。通过删除感兴趣的ORF的天然信号序列并将P4信号序列连接到ORF构建了表达载体。然后用表达载体转化、转染或感染合适的宿主细胞，与使用ORF的天然信号序列进行表达相比，ORF的表达增加了。
用缺少原始前导序列的蛋白质或是用未指定宿主细胞中脂肪酸酰化位点的部分序列代替的前导序列产生了非脂质化的形式。
除非另有说明，本发明2086蛋白的各种形式在这里被称为“2086”蛋白。同样，除非另有说明，“2086多肽”是指2086蛋白以及上述免疫原性部分或其生物学等价物。
用10%-20%梯度SDS聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)测得全长分离和纯化的脑膜炎奈瑟氏球菌2086蛋白的表观分子量约为28-35kDa。更具体的，用质谱测得这种蛋白质的分子量约为26,000-30,000道尔顿。
优选地，所述2086多肽和编码这种多肽的核酸被用于预防或减轻脑膜炎奈瑟氏球菌和/或其它菌种引起的感染。
抗体
本发明的蛋白质，包括氨基酸序列SEQIDNOS:2-252，其片段及其类似物或表达它们的细胞，也被用作免疫原以产生对本发明的多肽免疫特异的抗体。本发明包括免疫特异性多肽的抗体以及使用所述抗体来检测脑膜炎奈瑟氏球菌的存在情况，提供被动保护或测量细胞、细胞或组织提取物、或生物液体中多肽的量或浓度。
本发明的抗体包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体和抗独特型抗体。多克隆抗体是来自用抗原免疫的动物血清的不同群体的抗体分子。单克隆抗体是特定抗原的大体均一群体的抗体。单克隆抗体可用精通此领域的技术人员已知的方法获得，例如Kohler和Milstein，1975，Nature256:495-497和美国专利号4，376，110。这种抗体可以是任何免疫球蛋白类别，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何亚类。
嵌合抗体是一种分子，其不同部分来自不同的动物种类，例如那些具有鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。嵌合抗体及其生产方法在本领域已知(Cabilly等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:3273-3277；Morrison等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855；Boulianne等，1984，Nature312:643-646；Cabilly等，欧洲专利申请125023(1984年11月14日公开)；Taniguchi等，欧洲专利申请171496(1985年2月19日公开)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Neuberger等，PCT申请WO86/01533(1986年3月13日公开)；Kudo等，欧洲专利申请184187(1986年6月11日公开)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Sahagan等，1986，J.Immunol.137:1066-1074；Robinson等，PCT/US86/02269(1987年5月7日公开)；Liu等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:3439-3443；Sun等，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA84:214-218；Better等，1988，Science240:1041-1043)。在此将其全文并入以供参考。
抗独特型(抗-Id)抗体是识别通常与抗体的抗原结合位点结合的独特决定子的抗体。抗-Id抗体通过用已制备抗-Id的单克隆抗体免疫作为单克隆抗体来源的相同种类和基因型的动物(如小鼠品系)来制备。被免疫的动物将通过产生这些同种型决定子的抗体(抗-Id抗体)识别并响应免疫抗体的独特型决定子。
因此，所产生的抗本发明多肽的单克隆抗体可用于在合适的动物中诱导抗-Id抗体。来自这种免疫小鼠的脾细胞可用于产生分泌抗-Id单克隆抗体的抗-Id杂交瘤。此外，所述抗-Id抗体可与载体如匙孔血蓝蛋白(KLH)结合以及用于免疫其它BALB/c小鼠。这些小鼠的血清将含有抗-抗-Id抗体，它具有最终对R-PTP酶表位特异的mAb的结合特性。因此可评价这种抗-Id抗体的独特型表位，或与表位结构类似的一些“独特型表位”，如酿脓链球菌(Streptococcuspyogene功多肽。
术语“抗体”还包括完整的分子以及片段，如能够结合抗原的Fab片段。Fab片段缺乏完整抗体的Fc片段，能够更迅速地从循环中清除，且与完整抗体相比有更小的非特异性组织结合(Wahl等，1983，J.Nucl.始d24:316-325)。按照用于完整抗体分子的方法，Fab和用于本发明的其它抗体片段也可用来检测和定量脑膜炎奈瑟氏球菌多肽。
本发明的抗体，如抗独特型(“抗-Id”)抗体，可用于在哺乳动物宿主中治疗或预防奈瑟氏球菌属感染的方法，包括给予免疫有效量的抗体，如上所述对多肽特异的抗体。所述抗-Id抗体也可用作“免疫原”以诱导另一动物中的免疫应答，产生所谓抗-抗-Id抗体。抗-抗-Id可与诱导抗-Id的原始mAb有相同的表位。因此，通过使用mAb的独特型决定子的抗体就可以鉴定表达相同特异性的抗体的其它克隆。
抗体被用于多种方法，例如用来确定蛋白质被表达，或用来确定蛋白质在哪里被表达。例如，可将标记的抗体(例如FACS的荧光标记)与完整的细菌一起培养，细菌表面上标记的存在确定了蛋白质的位置。
可采用常规方法将多肽或带有表位的片段、类似物或细胞用于动物以获得所产生的抗本发明多肽的抗体。为制备单克隆抗体，可使用任何技术，这些技术可提供由连续细胞系培养物产生的抗体。
多核苷酸
和本发明的蛋白质一样，本发明的多核苷酸可包含与任何奇数编号的SEQIDNOS:1-253的参考序列相同，即100%同一的核酸序列，或者，与参考序列相比，它可包含许多核苷酸改变。这种改变选自至少一种核苷酸缺失、取代(包括转换和颠换)或插入，其中，所述改变可发生在参考核苷酸序列的5'或3’末端位置，或那些末端位置之间的任何地方，独立地分散在参考序列的核苷酸中间或在参考序列的一个或多个毗连基团中。核苷酸改变的数目可将任何奇数编号的SEQIDNOS:1-253的核苷酸总数乘以各自的百分比同一性的数字百分比(除以100)来确定，并从所述序列中的所述核苷酸总数减去该乘积。
例如，但不限于此，分离的脑膜炎奈瑟氏球菌多核苷酸包含与SEQIDNOS:1-253的任何核酸序列、其简并变异体或其片段有至少70%同一性的多核苷酸序列，其中，所述多核苷酸序列在核酸序列SEQIDNOS:1-253的整个多核苷酸区域最多可包含nn个核酸变化，其中nn是最大变化数，它通过以下公式计算:
nn=xn-(xn·y),
其中，xn是SEQIDNOS:1-253中的核酸总数，y的值为0.70，其中任何非整数的xn·y的乘积在从xn中减去之前都被减小到最接近的整数。当然，y也可以是0.80(表示80%)、0.85(表示85%)、0.90(表示90%)、0.95(表示95%)等等。编码包含SEQIDNOS:2-252中任何氨基酸序列的多肽的多核苷酸序列的改变可在此编码序列中产生无义、错义或移码突变，从而改变由经过这种变化的多核苷酸编码的多肽。
本发明的一些实施方案涉及编码2086蛋白和抗2086蛋白的抗体的多核苷酸(这里称为“2086多核苷酸”或“ORF2086多核苷酸”)。在优选的实施方案中，本发明的分离的多核苷酸包含与选自奇数编号的SEQIDNO:1-SEQIDNOS:253之一的核苷酸序列有至少95%同一性的核苷酸序列，其简并变异体或其片段。“简并变异体”在这里指由于遗传密码的简并而与奇数编号的SEQIDNOS:1-SEQIDNOS:253(及其片段)的核苷酸序列不同的多核苷酸，但它仍编码与奇数编号的SEQIDNOS:1-253的核苷酸序列编码的相同的2086蛋白(即偶数编号的SEQIDNOS:2-252)。
在其它实施方案中，所述多核苷酸与选自奇数编号的SEQIDNOS:1-253之一的核苷酸序列、其简并变异体或其片段互补。在另一个实施方案中，所述多核苷酸选自DNA、染色体DNA、cDNA和RNA，还可包含异源核苷酸。在另一个实施方案中，分离的多核苷酸在高严格杂交条件下与选自SEQIDNOS:1-253之一、其补体、其简并变异体或其片段的核苷酸序列杂交。再在其它实施方案中，所述多核苷酸在中等严格杂交条件下发生杂交。
所述2086多核苷酸可获自天然、合成或半合成来源；此外，所述核苷酸序列可以是天然产生的序列，或者可以通过突变与这种天然产生的序列发生关系，包括单个或多个碱基取代、缺失、插入和倒位，只要所述核酸分子包含能够作为上述2086免疫原性多肽进行表达的序列。所述核酸分子可以是单链或双链、线性或共价闭合环状形式的RNA、DNA。所述核苷酸序列可包含位于其附近的表达控制序列，这种控制序列通常来自异源来源。通常，本发明核酸序列的重组表达将在所述核酸序列末端使用终止密码子序列，如TAA。
本发明还包括能够在降低的严格条件下，更优选在严格条件下，最优选在高严格条件下与这里所述多核苷酸杂交的多核苷酸。严格条件的例子显示在下面的严格条件表中:高严格条件是至少和例如条件A-F一样严格的条件；严格条件是至少和例如条件G-L一样严格的条件；降低的严格条件是至少和例如条件M-R一样严格的条件。
严格条件—表I
bpI:杂交体长度是对杂交多核苷酸的杂交区域的预计。当多核苷酸与未知序列的靶多核苷酸杂交时，杂交体长度假定为杂交多核苷酸的长度。当与已知序列的多核苷酸杂交时，杂交体长度可通过对比多核苷酸序列以及识别区域或最佳序列互补性的区域来确定。
缓冲液H:可用SSPE(1xSSPE是0.15MNaCl、10mMNaH2PO4和1.25mMEDTA，pH7.4)代替杂交和洗涤缓冲液中的SSC(1xSSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后洗涤15分钟。
TB-TR:预计长度小于50个碱基对的杂交体的杂交温度应比杂交体的熔化温度(Tm)低5-10EC，其中Tm用以下公式确定。对于长度小于18个碱基对的杂交体，Tm(EC)=2(碱基A+碱基T的数目)+4(碱基G+碱基C的数目)。对于长度在18和49个碱基对之间的杂交体，Tm(EC)=81.5+16.6(log10[Na+])+0.41(%G+C)-(600/N)，N是杂交体中碱基的数目，[Na+]是杂交缓冲液中钠离子的浓度(1xSSC的[Na+]=0.165M)。
多核苷酸杂交的严格条件的其它例子提供在Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，“分子克隆实验手册”(MolecularClone:ALaboratoryManual)，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，第9和11章，以及“新编分子生物学实验指南”(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，1995，F.M.Ausubel等编，JohnWiley&Sons，Inc.，2.10和6.3-6.4节，在此并入以供参考。
本发明还提供了与这些多核苷酸完全互补的多核苷酸，同时还提供了反义序列。本发明的反义序列，也称为反义寡核苷酸，包括阻断编码本发明多肽的多核苷酸表达的内部产生和外部施用的序列。本发明的反义序列包含例如约15-20个碱基对。例如，所述反义序列可设计成通过防止启动子结合上游未翻译序列或通过防止核酶结合而防止编码本发明多肽的转录物翻译来抑制转录。
本发明的多核苷酸可用许多方法制备(例如通过化学合成，从DNA文库、从生物自身制备)并可有各种形式(例如单链、双链、载体、探针、引物)。术语“多核苷酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有经过修饰的主链的那些。
根据本发明进一步的实施方案，本发明的多核苷酸包括DNA文库，如cDNA文库。
融合蛋白
本发明还涉及融合蛋白。“融合蛋白”指由两个通常无关的融合基因或其片段编码的蛋白质。例如融合蛋白包含免疫球蛋白分子恒定区的不同部分和其它免疫原性蛋白质或其部分。许多情况下，将免疫球蛋白Fc区作为融合蛋白的一部分对用于治疗和诊断是有利的，这会导致例如改进的药物动力学特性(参见例如EP0232262A1)。另一方面，在一些应用中，需要能在融合蛋白表达、检测和纯化后除去Fc部分。本发明的2086多核苷酸可用于重组生产本发明的多肽，所述多核苷酸的阅读框中可包括成熟多肽的编码序列本身，或成熟多肽的编码序列和其它编码序列，如编码前导序列或分泌序列、前-或原-或前蛋白原序列的编码序列，或其它融合肽部分。例如可编码便于纯化2086多肽或融合多肽的标记序列(参见Gentz等，1989，在此全文并入以供参考)。因此，在本发明的实施方案中制备了编码融合多肽的多核苷酸，所述融合多肽允许表达产物的His-tag纯化。所述多核苷酸还可含有非编码5'和3’序列，如转录的非翻译序列，剪接和聚腺苷酸化信号。这种融合的多肽可用下述重组DNA克隆载体转化/转染或感染宿主细胞来产生，它随后可分离自宿主细胞以得到大体上不含其它宿主细胞蛋白的融合多肽。
免疫原性组合物
本发明一方面提供了包含至少一种2086蛋白或编码所述蛋白的核酸的免疫原性组合物。上述物质能够(1)引发多种菌株的杀菌抗体；(2)与多个菌株的表面反应；(3)赋予抗生物攻击的被动保护；和/或(4)防止集落形成。
这种免疫原性组合物的制剂是精通此领域的技术人员熟知的。本发明的免疫原性组合物优选包括药学上可接受的载体。合适的药学上可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有常规的溶剂、分散介质、填充剂、固体载体、含水溶液、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。合适的药学上可接受的载体包括以下一种或多种，例如水、盐水、磷酸缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。药学上可接受的载体还可包括少量助剂，如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们可提高抗体的储存期或效用。药学上可接受的载体的制备和使用是此领域熟知的。除了与活性成分不相容的任何常规介质或试剂外，可将它们用于本发明的免疫原性组合物。
这种免疫原性组合物可胃肠外施用，例如通过注射，皮下注射或肌肉内注射，以及口服或鼻内给予。Wolff等和Sedegah等描述了肌肉内免疫接种的方法。其它给药方式采用了例如口服制剂、肺部制剂、栓剂和经皮应用，但不限于此。口服制剂，例如包括通常使用的赋形剂，如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等，但不限于此。
本发明的免疫原性组合物可包括一种或多种佐剂，包括但不限于氢氧化铝、磷酸铝、STIMULONTMQS-21(Aquila生物制药公司，Framingham，MA)；MPLTM(3-O-脱酰化单磷酰脂A；Corixa，Hamilton，MT)，529(一种氨基烷基葡糖胺磷酸盐化合物，Corixa，Hamilton，MT)，IL-12(GeneticsInstitute，Cambridge，MA)；GM-CSF(Immunex公司，西雅图，华盛顿)；N-乙酰-胞壁酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP11637，也称为正-MDP)；N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’-2’-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧基-乙胺)(CGP19835A，称为MTP-PE)和霍乱毒素。其它可使用的是霍乱毒素的无毒衍生物，包括其A亚基和/或结合物或遗传工程构建的脑膜炎奈瑟氏球菌多肽和霍乱毒素的融合体或其B亚基(“CTB”)，类霍乱原(procholeragenoid)、真菌多糖，包括裂裥菌素、胞壁酰二肽、胞壁酰二肽(“MDP”)衍生物、佛波酯、大肠杆菌的不耐热毒素、嵌段聚合物或皂苷。
在一些优选的实施方案中，本发明的蛋白质被用于供口服施用的免疫原性组合物，所述组合物包括粘膜佐剂，用来治疗或预防人类宿主的脑膜炎奈瑟氏球菌感染。粘膜佐剂可以是霍乱毒素；但优选可用于本发明的霍乱毒素外的粘膜佐剂包括霍乱全毒素的无毒衍生物，其中，所述A亚基是诱变的、化学修饰的霍乱毒素，或通过修饰霍乱毒素氨基酸序列产生的相关蛋白质。欲了解特别适合用于制备本发明的免疫原性组合物的特定霍乱毒素可参见突变型霍乱全毒素E29H，如公开的国际申请WO00/18434所述，在此将其全文并入以供参考。它们可加到本发明的多肽中或与本发明的多肽结合。可对其它具有粘膜佐剂或具有输递特性的分子，如大肠杆菌的不耐热毒素(LT)，采用同样的技术。可以使用的其它具有粘膜佐剂或具有输递特性的化合物如胆汁；聚阳离子如DEAE-葡聚糖和聚鸟氨酸；洗涤剂如十二烷基苯磺酸钠；脂质结合物质；抗生素如链霉素；维生素A和其它可改变粘膜表面结构或功能完整性的化合物。其它粘膜活性化合物包括微生物组织的衍生物如MDP；吖啶和甲腈咪胍。如上所述，也可使用STIMULONTMQS-21、MPL和IL-12。
本发明的免疫原性组合物可以ISCOMS(免疫刺激复合物)、含有ISCOMS的CTB、脂质体的形式输递，或包囊在丙烯酸酯或聚(DL-丙交酯-共-糖苷)等化合物中以形成大小适合吸附的微球体。本发明的蛋白质也可掺入油性乳剂中。
多抗原
所述免疫原性试剂，包括本发明的蛋白质、多核苷酸和等价物，可作为免疫原性组合物的唯一活性免疫原施用，或者所述组合物可包括其它活性免疫原，包括其它奈瑟氏球菌属免疫原性多肽，或一种或多种其它微生物病原体(例如病毒、朊病毒、细菌或真菌，但不限于此)的免疫活性蛋白质或荚膜多糖。所述组合物可包含一种或多种所需蛋白质、片段或所选适应症所需的药物化合物。同样，本发明的组合物在所述免疫原性组合物中使用了一种或多种核酸，还可包括编码上述蛋白质相同的多种类的核酸。
本发明包括任何多抗原或多价免疫原性组合物。例如，本发明的组合物可包含两种或多种2086蛋白的组合物，2086蛋白和一种或多种PorA蛋白的组合物，2086蛋白和脑膜炎球菌血清组A、C、Y和W135多糖和/或多糖结合物的组合物，2086蛋白和脑膜炎球菌与肺炎球菌组合的组合物，或任何上述适合粘膜输送形式的组合。精通此领域的技术人员能够配制这种多抗原或多价免疫组合物。
本发明还涉及多免疫方案(multi-immunizationregimen)，其中，任何可有效抗病原体的组合物都可用于其中或与本发明的组合物结合。例如，但不限于此，作为多免疫方案的一部分，可给予患者本发明的免疫原性组合物和其它免疫组合物以使其对肺炎链球菌(S.Pneumoniae)免疫。精通此领域的技术人员能够选择可与本发明的免疫原性组合物联合使用的免疫原性组合物以制定和实施多免疫方案。
本发明的特定实施方案涉及将一种或多种本发明的多肽，或编码多肽的核酸用于组合物，或作为预防或减轻肺炎链球菌感染的治疗方法的一部分。可以将2086多肽或2086多核苷酸与任何抗肺炎链球菌感染的免疫原性组合物联合。也可将2086多肽或2086多核苷酸与任何其它基于蛋白质或多糖的脑膜炎球菌疫苗联合。
所述2086多肽、片段和等价物可用作结合的免疫原性组合物的一部分；其中一种或多种蛋白质或多肽可与载体结合以产生具有抗几种血清型和/或抗一些疾病的免疫原性特性的组合物。或者，所述2086多肽之一还可用作其它免疫原性多肽的载体蛋白。
本发明还涉及在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述哺乳动物提供本发明的免疫原性组合物的步骤。所述免疫原性组合物对被处理的动物或人呈抗原性，这样，这种组合物中所含的免疫有效量的多肽就可产生所需的抗脑膜炎奈瑟氏球菌感染的免疫应答。涉及治疗方法(包括减轻或防止人类的脑膜炎奈瑟氏球菌感染)的优选实施方案包含给予人类免疫有效量的组合物。
术语“免疫有效量”在这里是指哺乳类宿主(优选人)的给药量，以单剂量或部分系列剂量的形式，足以至少使被治疗个体的免疫系统产生减轻细菌感染的临床表现的应答。这可使细菌负载的程度最小降低到预防感染。理想的是，被治疗个体不出现更严重的细菌感染的临床表现。所述剂量可根据个体的特定症状而改变。该量可用常规方法或用精通此领域的技术人员已知的方法确定。
本发明另一特别方面涉及使用免疫原性组合物作为表达本发明蛋白质的载体或质粒或其免疫原性蛋白。因此，本发明再一方面提供了在哺乳动物中诱导免疫应答的方法，所述方法包括为哺乳动物提供表达至少一种分离的2086多肽的载体或质粒。可用活的载体，尤其是活的重组细菌、病毒或其它活的试剂，将本发明的蛋白质输送到哺乳动物，所述载体含有作为外源多肽的多肽或免疫原性蛋白表达必需的遗传物质。
根据本发明的其它实施方案，提供了在哺乳动物中诊断细菌性脑膜炎的方法，包括:检测所述哺乳动物或所述哺乳动物组织样品中免疫复合物的存在情况，所述哺乳动物或组织样品与含有抗体的抗体组合物接触，所述抗体免疫特异性结合至少一种包含SEQIDNOS:2-252中任何偶数编号的氨基酸序列的多肽；其中，所述哺乳动物或组织样品在适合形成免疫复合物的条件下与抗体组合物接触。
病毒和非病毒载体
优选的载体，尤其是用于体外和体内细胞测定的载体，是病毒载体，如慢病毒、反转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、腺伴随病毒、牛痘病毒、杆状病毒和其它具有所需细胞向性的重组病毒。因此，可用病毒载体或通过直接引入DNA将编码2086蛋白或其免疫原性片段的核酸引入体内先体外后体内或体外。靶组织中的表达可受到转基因载体靶向特定细胞的影响，如用病毒载体或受体配体，或使用组织特异性启动子，或这两者。定向基因送递描述在PCT出版物WO95/28494中，在此将其全文并入以供参考。
通常用于体内或先体外后体内寻靶和治疗过程的病毒载体是基于DNA的载体和反转录病毒载体。构建和使用病毒载体的方法是本领域已知的(例如Miller和Rosman，BioTechnology，1992，7:980-990)。优选的是，所述病毒载体是复制缺陷的，即它们不能在靶细胞中自主复制。优选的是，所述复制缺陷型病毒是最小病毒，即仅保留包裹基因组以产生病毒颗粒所必需的其基因组序列。
DNA病毒载体包括减毒或缺陷的DNA病毒，例如但不限于单纯疱疹病毒(HSV)、乳头瘤病毒、EB病毒(EBV)、腺病毒、腺伴随病毒(AAV)等。完全或几乎完全缺乏病毒基因的缺陷型病毒是优选的。缺陷型病毒在引入细胞后不会传染。使用缺陷型病毒载体可以将细胞施用于特定的局部区域而不担心载体可感染其它细胞。因此，特异性组织可被特定地寻靶。特定载体的例子包括但不限于缺陷型疱疹病毒1(HSV1)载体(Kaplitt等，Molec.Cell.Neurosci.，1991，2:320-330)、缺乏糖蛋白L基因的缺陷型疱疹病毒载体或其它缺陷型疱疹病毒载体(PCT出版物WO94/21807和WO92/05263)；减毒的腺病毒载体，如Stratford-Perricaudet等描述的载体(J.Clin.Invest.，1992，90:626-630；也可参见LaSalle等，Science，1993，259:988-990)；和缺陷型腺伴随病毒载体(Samulski等，J.Virol.，1987，61:3096-3101；Samulski等，J.Virol.，1989，63:3822-3828；Lebkowski等，Mol.Cell.Biol.，1988，8:3988-3996)，在此将它们全文并入以供参考。
许多公司大批生产病毒载体，包括但不限于Avigen公司(Alameda，CA；AAV载体)，CellGenesys(FosterCity，CA；反转录病毒、腺病毒、AAV载体和慢病毒载体)，Clontech(反转录病毒和杆状病毒载体)，Genovo公司(SharonHill，PA；腺病毒和AAV载体)，Genvec(腺病毒载体)，IntroGene(荷兰莱顿；腺病毒载体)，MolecularMedicine(反转录病毒、腺病毒、AAV和疱疹病毒载体)，Norgen(腺病毒载体)，OxfordBioMedica(英国牛津；慢病毒载体)，以及Transgene(法国斯特拉斯堡；腺病毒、牛痘病毒、反转录病毒和慢病毒载体)，在此将其全文并入以供参考。
腺病毒载体.腺病毒是真核DNA病毒，它可被修饰以有效传递本发明的核酸到各种细胞类型。腺病毒有各种血清型。在这些血清型中，本发明优选2型或5型人腺病毒(Ad2或Ad5)或动物来源的腺病毒(参见PCT出版物WO94/26914)。可用于本发明的那些动物来源的腺病毒包括来自犬、牛、鼠(例如:Mav1，Beard等，Virology，1990，75-81)、羊、猪、鸟和猿(例如:SAV)的腺病毒。优选的是，所述动物来源的腺病毒是犬腺病毒，更优选的是CAV2腺病毒(例如Manhattan或A26/61菌株，ATCCVR-800，例如)。描述了各种复制缺陷型腺病毒和最小腺病毒载体(PCT出版物WO94/26914、WO95/02697、WO94/28938、WO94/28152、WO94/12649、WO95/02697、WO96/22378)。本发明所述的复制缺陷型重组腺病毒可用本领域的技术人员已知的任何方法制备(Levrero等，Gene，1991，101:195；欧洲出版物EP185573；Graham，EMBOJ.，1984，3:2917；Graham等，J.Gen.Virol.，1977，36:59)。重组腺病毒用标准分子生物学技术回收和纯化，这些技术是精通此领域的技术人员熟知的。
腺伴随病毒.腺伴随病毒(AAV)是相对较小的DNA病毒，它可以稳定和位点于一的方式整合到被感染的细胞基因组中。它们能够感染多种细胞而不会对细胞的生长、形态和分化造成任何影响，且它们似乎与人类病理学无关。AAV基因组已被克隆、测序和鉴定。已经描述使用来自AAV的载体在体外和体内转移基因(参见PCT出版物WO91/18088和WO93/09239；美国专利号4,797,368和5,139,941；欧洲出版物EP488528)。本发明所述的复制缺陷型重组AAV可通过将质粒共转染到被人辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系来制备，所述质粒含有侧翼有两个AVV末端反向重复(ITR)区域的感兴趣的核酸序列，并带有AVV衣壳化基因(rep和cap基因)。产生的AAV重组体然后用标准技术纯化。
反转录病毒载体.在本发明的其它实施方案中，所述核酸可被引入反转录病毒载体，如美国专利号5,399,346；Mann等，Cell.，1983，33:153；美国专利号4,650,764和4,980,289；Markowitz等，J.Virol.，1988，62:1120；美国专利号5,124,263；欧洲出版物EP453242和EP178220；Bernstein等，Genet.Eng.,1985，7:235；McCormick，BioTechnology，1985，3:689；PCT出版物WO95/07358；以及Kuo等，Blood，1993，82:845中所述，在此将它们全文并入以供参考。所述反转录病毒是感染分化细胞的整合病毒。所述反转录病毒基因组包括两个LTR，一个衣壳化序列和三个编码区(gag、pol和env)。在重组反转录病毒载体中，gag、pol和env基因通常被完全或部分删除，并被感兴趣的异源核酸序列替代。这些载体可从不同类型的反转录病毒构建，比如HIV、MoMuLV(“Moloney鼠白血病病毒”)、MSV(“Moloney鼠肉瘤病毒”)、HaSV(“Harvey肉瘤病毒”)；SNV(“脾坏死病毒”)；RSV(“Rous肉瘤病毒”)和Friend病毒。合适的包装细胞系已在现有技术中描述，尤其是细胞系PA317(美国专利号4,861,719)；PsiCRIP细胞系(PCT出版物WO90/02806)和GP+envAm-12细胞系(PCT出版物WO89/07150)。此外，重组反转录病毒载体可在LTR中包含修饰以抑制转录活性，以及延伸的衣壳化序列(encapsidationsequence)，它可包含部分gag基因(Bender等，J.Virol.，1987，61:1639)。重组反转录病毒载体用此领域的一般技术人员已知的标准技术纯化。
可构建反转录病毒载体以作为感染性颗粒或进行单轮转染。第一种情况下，病毒被修饰以保留除引起致癌转化特性外其所有的基因，并表达异源基因。操作非感染性病毒载体以破坏病毒包装信号，但保留包装构建的共引入病毒所需的结构基因含有异源基因和包装信号。因此，所产生的病毒颗粒不能产生其它病毒。
也可通过DNA病毒引入反转录病毒载体，这可复制一次反转录病毒并增强转染效率(参见PCT出版物WO95/22617，WO95/26411，WO96/39036和WO97/19182)。
慢病毒载体.在本发明另一个实施方案中，可将慢病毒载体用作在一些组织类型中直接传递和持续表达转基因的试剂，这些组织包括脑、视网膜、肌肉、肝脏和血液。载体可有效转导这些组织中分化和未分化的细胞，并影响感兴趣的基因的长期表达。综述可参见Naldini，Curr.Opin.Biotechnol.，1998，9:457-63；也可参见Zufferey等，J.Virol.，1998，72:9873-80)。慢病毒包装细胞系是可以获得的且通常在此领域中已知。它们有助于生产用于基因治疗的高效价慢病毒载体。一个例子是四环素可诱导的VSV-G假型慢病毒包装细胞系，这种细胞系可产生使效价大于106IU/mL至少3-4天的病毒颗粒(Kafri等，J.Virol.，1999，73:576-584)。为在体外和体内有效转导未分化的细胞，需浓缩由可诱导细胞系产生的载体。
非病毒载体.在本发明的另一个实施方案中，所述载体可通过脂转染作为裸DNA引入体内，或者和其它有助于转染的试剂(肽、聚合物等)。合成的阳离子脂质可用来制备供体内转染编码标记的基因的脂质体(Felgner等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1987，84:7413-7417；Felgner和Ringold，Science，1989，337:387-388；见Mackey等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，1988，85:8027-8031；Ulmer等，Science，1993，259:1745-1748)。用来转移核酸的有用的脂类化合物和组合物描述在PCT专利出版物WO95/18863和WO96/17823，以及美国专利号5,459,127中。为进行寻靶，脂类可以与其它分子化学结合(参见Mackey等，同上)。寻靶肽，例如激素或神经递质，以及蛋白质如抗体，或非肽分子可与脂质体化学结合。
其它分子也有助于体内转染核酸，例如阳离子寡肽(例如PCT专利出版物WO95/21931)，衍生自DNA结合蛋白的肽(例如PCT专利出版物WO96/25508)，或阳离子聚合物(例如PCT专利出版物WO95/21931)。
可以将载体作为裸DNA质粒引入体内。可用此领域已知的方法将用于疫苗目的或基因治疗的裸DNA载体引入所需的宿主细胞，这些方法如电穿孔、微注射、细胞融合、DEAE葡聚糖、磷酸钙沉淀、使用基因枪或使用DNA载体转运蛋白(例如Wu等，J.Biol.Chem.，1992，267:963-967；Wu和Wu，J.Biol.Chem.，1988，263:14621-14624；加拿大专利申请2,012,311号；Williams等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1991，88:2726-2730)。也可采用受体介导的DNA传递法(Curiel等，Hum.GeneTher.，1992，3:147-154；Wu和Wu，J.Biol.Chem.，1987，262:4429-4432)。美国专利号5,580,859和5,589,466揭示了在哺乳动物中传递外源DNA序列，未使用有助于转染的试剂。最近，描述了一种相对电压低、效率高的体内DNA转移技术，称为电转移(electrotransfer)(Mir等，C.P.Acad.Sci.，1988，321:893；PCT出版物WO99/01157；WO99/01158；WO99/01175)。因此，本发明的其它实施方案涉及在人类中诱导免疫应答的方法，所述方法包括给予所述人类一定量的编码本发明2086多肽的DNA分子，任选用有助于转染的试剂，其中所述多肽在表达时保留了免疫原性，因此将其掺入免疫原性组合物并给予人类时能提供保护，而不会因人类被奈瑟氏球菌属病原体，如脑膜炎奈瑟氏球菌，再次感染而加重疾病。有助于转染的试剂是此领域已知的，包括布比卡因和其它局部麻醉剂(例如参见美国专利号5,739,118)和阳离子聚胺(如国际专利申请WO96/10038所述)，在此将其并入以供参考。
本发明还涉及抗体，可以是单抗体克隆或多克隆抗体，具体是上述2086多肽。这种抗体可用精通此领域的技术人员熟知的方法产生。
细菌表达系统和质粒
本发明还提供了重组DNA分子，如载体或质粒，它包括具有启动子序列和起始密码子序列的表达控制序列以及编码本发明多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于3’至启动子和起始密码子序列。另一方面，本发明提供了能够表达2086多肽的重组DNA克隆载体，包括具有启动子序列和起始密码子序列的表达控制序列以及编码2086多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于3’至启动子和起始密码子序列。再一方面，本发明提供了含有上述重组DNA克隆载体和/或重组DNA分子的宿主细胞。合适的表达控制序列和宿主细胞/克隆载体的组合是此领域熟知的，并通过例子在Sambrook等(1989)中描述。
一旦通过用含有相应2086多核苷酸的质粒转化、转染或感染克隆载体或宿主细胞构建了表达所需的本发明多肽的重组DNA克隆载体和/或宿主细胞，就可在使多肽表达的条件下培养克隆载体或宿主细胞。然后用精通此领域的技术人员熟知的技术分离得到大体上没有污染的宿主细胞组分的多肽。
以下实施例是为了证实本发明的优选实施方案。精通此领域的技术人员应该知道，实施例中公开的技术在实施本发明时发挥了较好的作用，因此可认为是优选的实施方式。然而，在阅读此说明书后，在不背离本发明精神或范围的情况下，那些精通此领域的技术人员能够对所述特定实施方案做出许多改变而仍能得到一样或类似的结果。
实施例
实施例1
鉴定能够引发抗异源菌株杀菌抗体的奈瑟氏球菌膜蛋白提取物:
参考下面的表II，耗竭LOS的外膜蛋白制品显示可引发杀菌抗体。这些抗体通常针对各个菌株的PorA。来自血清组B脑膜炎球菌菌株8529(B:15:P1.7b,3)的耗竭LOS的外膜蛋白制品在这种方式中是独特的，因为它们出乎意料地对几种异源菌株引发杀菌抗体。
表II
对脑膜炎奈瑟氏球菌不同菌株的抗-sOMPS的BC活性
为便于分离和鉴定可引发异源杀菌抗体的抗原，我们试图确定哪种洗涤剂对于提取抗原最佳。
菌株和培养条件
将冷冻管中的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株8529在GC平板上划线。(所述脑膜炎球菌菌株8529来自RIVM，Bilthoven，荷兰)。将平板在36℃/5%CO2下培养7.5h。将一些菌落接种到含有50mL改进的Frantz培养基+GC添加物的烧瓶。36℃下将烧瓶在空气摇床中以200RPM振荡培养4.5h。用5ml接种到含有450mL改进的Frantz培养基+GC添加物的Fernbach烧瓶中。36℃下将烧瓶在空气摇床中以100RPM振荡培养11h。将所有450mL接种到含有8.5L改进的Frantz培养基+GC添加物的10L发酵罐中。
改进的Frantz培养基的成分:
(25%YE溶液，用5体积蒸馏水透析过夜，然后高压灭菌)
GC添加物100X，无菌过滤
在发酵时控制以下参数:温度=36℃；pH=7.4；溶解氧=20%。加入几滴P-2000消泡剂以控制泡沫产生。使培养物生长到稳定期。在OD650=5.25离心收获细胞。从约8.5L培养物中通常收集到总数为100-300克湿细胞浆。
从可引发异源杀菌抗体的脑膜炎球菌中部分纯化外膜蛋白组分:
将100克湿重细胞悬浮于湿重5倍体积10mMHEPES-NaOH，pH7.4，1mMNa2EDTA中，并通过装有约18,000psi室的110Y微流化器进行细胞裂解。将细胞裂解物澄清并在10℃以300,000xg离心分离细胞包膜。用匀浆器悬浮然后按上述离心，用相同的缓冲液洗涤细胞包膜两次。然后用320mL加有10mMHEPES-NaOH，pH7.4，1mMMgCl2的320mL1%(w/v)TritonX-100提取细胞包膜。参考下表III，用TritonX-100和两性洗涤剂3-14顺序示差洗涤剂提取，然后免疫小鼠，我们就可以确定Triton提取物能最佳提取感兴趣的候选物。然后在BioRadRotophor装置中通过制备型等电聚焦(IEF)分离这种TritonX-100提取物，它对表III所列五种菌株中的四种菌株可引发杀菌抗体应答。两性电解质浓度是1%pH3-10与1%pH4-6混合。如表III所示，发现一些组分能够引发异源杀菌反应。通过杀菌测定可知，获自IEF的组分，其pH范围集中在5.5-7.8，可引发对大多数菌株的异源应答。将收集的IEF组分浓缩并通过乙醇沉淀除去两性电解质。在阴离子交换柱上以约5.5-7.8的pH范围吸附一些所得蛋白质以获得进一步的纯化，并比较用吸附和未吸附的蛋白质免疫小鼠后所得的杀菌活性。再参考表II，尽管许多蛋白被吸附到阴离子交换树脂，但未被柱吸附的蛋白可引发更多的异源杀菌抗体。
表III
NT:未测试
临床分离物539是8529的同源菌株，分离自同一次爆发流行。
如图1A所示，通过SDS-PAGE确定未吸附的组分中有两种主要蛋白。为鉴定这些蛋白，进行了两种类型的分析。一种分析是进行有限蛋白酶解降解(参见图1A和图1B)然后分离肽并直接蛋白质测序。另一种分析是进行SDS-PAGE然后进行凝胶切除、蛋白酶解消化和LC-MS/MS(液相层析串联质谱)(参见图3)以获得感兴趣的制品组分的质谱信息。(参见该部分下面所描述的肽作图和测序法)
用Zagursky和Russell在Biotechnology，2001，31:636-659中描述的方法和算法分析脑膜炎奈瑟氏球菌ASanger基因组序列。这种分析产生了12,000多个可能的开放阅读框(ORF)。直接的序列数据和上述质谱数据都说明未吸附组分的主要成分相当于Sanger数据库分析中存在的一些ORF的产物。用这种方法鉴定的三种主要蛋白质相当于ORF4431、5163和2086(参见图1B和3)。
虽然ORF4431是在所述组分中鉴定的最主要蛋白质，但在动物模型中，对重组脂质化的4431的小鼠抗体并不能杀菌和提供保护性应答。其它对ORF5163的分析正在进行。
上述制品的第二种最主要的成分相当于ORF2086的产物。
免疫原性方法:
制备抗血清:
除了提到的方法，用25μg总蛋白并用20μgQS-21作为佐剂配制了蛋白质组合物/疫苗。通过皮下（臂部）注射在第0和4周给6-8周龄的雌性Swiss-Webster小鼠施用0.2mL剂量。在第0和4周收集血液并在第6周进行最终的放血。
杀菌测定:
基本按以下描述进行杀菌测定(参见Mountzouros和Howell,2000,J.Clin.Microbiol.38(8):2878-2884)。SBA的补体介导的抗体依赖型杀菌效价表示为测定中杀死≥50%靶细胞的测试血清的最高稀释度的倒数(BC50效价)。
用来鉴定2086蛋白的方法:
溴化氰切割和片段的直接测序:
阴离子交换未吸附组分(AEUF)的溴化氰切割。用90%冷乙醇沉淀AEUF并用10mg/mL加有70%甲酸的溴化氰稀释至蛋白质浓度为1mg/mL。反应在室温下，黑暗中进行过夜。用真空离心蒸发浓缩器干燥切割的产物，测定用HE/0.1%还原的TX-100溶解。用SDS-PAGE然后通过N-末端氨基酸测序来鉴定该组分的成分。
蛋白酶消化/反相/N-末端测序以鉴定组分:
用GluC(V8)、LysC或ArgC消化AEUF。蛋白质与酶的比例是30μg蛋白质比1μg酶。消化在37℃进行过夜。消化的蛋白质混合物(30μg)通过7微米的AquaporeRF-300柱并用加有0.1%三氟乙酸的10-95%乙腈梯度洗脱，手工收集洗脱峰。同时进行没有蛋白质的空白，并从样品色谱图中除去空白的峰。用质谱仪分析只在样品中出现的峰，并对那些给出清晰质谱的样品进行N-末端氨基酸测序。
N-末端氨基酸测序:
从印迹上切下条带，将蛋白质样品从SDS凝胶转移到PVDF膜，用酰胺黑(10%乙酸、0.1%酰胺黑溶于去离子水)染色并用10%乙酸脱色。然后用甲醇清洁的解剖刀或小型Exacto刀从所有十个泳道切下所需的蛋白质条带，并置于AppliedBiosystems477A型蛋白质测序仪的反应管中。为直接测序溶液中的样品，需装上Prosorb管并用60μL甲醇润湿PVDF。用50μL去离子水冲洗PVDF并将样品(50μL)加到PVDF上。用50μL去离子水冲洗样品后，取出ProsorbPVDF，干燥并置于AppliedBiosystems477A蛋白质测序仪的反应管中。对于这两种方法，然后都在最佳印迹条件下运行AppliedBiosystemsN-末端测序仪12轮或更多循环(1轮空白，1轮标准物，对需要鉴定的残基进行10轮或更多循环)并在AppliedBiosystems120APTH分析器上进行PTH-氨基酸检测。在模拟图表记录仪上收集循环并用工具软件计算数据。通过比较PTH-氨基酸的标准设置和它们在分析仪上各自的保留时间用类似物和数字数据进行氨基酸排布(半胱氨酸残基在转化时被破坏且没有检测)。用一个残基可获得多个序列信息，基于信号强度作出主要和次要排布。
LC-MS/MS
用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步分析通过IEF纯化的蛋白质样品。用考马斯蓝染色显现蛋白质，并手工切除感兴趣的条带，然后还原、烷基化并用自动的凝胶内胰蛋白酶消化器(1)以胰蛋白酶原位消化(Promega，Madison，WI)。消化后，用SavantSpeedVac浓缩器(ThermoQuest，Holdbrook，NY)将肽提取物浓缩至最终体积为10-20μL。
用自动微量电喷雾反相HPLC分析肽提取物。简言之，微量电喷雾界面由50cm长，内径75um，喷嘴直径8um的熔融硅喷雾针(NewObjective，CambridgeMA)构成，喷雾针中装有长度为10cm的10umC18反相珠(YMC，Wilmington，NC)。Picofrit针安装于光导纤维支架(MellesGriot，Irvine，CA)，固定在位于质谱仪检测器前面的自制基座上。柱的后部垂直通过钛接头为电喷雾界面提供电连接。所述接头与一定长度的与FAMOS自动取样器(LC-Packings，SanFrancisco，CA)相通的熔融硅毛细管(FSC)连接，所述取样器连接HPLC溶剂泵(ABI140C，Perkin-Elmer，Norwalk，CT)。所述HPLC溶剂泵以50μL/min流量输送，用PEEK微紧固分离T形管(microtightsplittingtee)(UpchurchScientific，OakHarbor，WA)将流量降至250nL/min，然后用FSC转换线输送到自动取样器。所述LC泵和自动取样器分别用其内部使用者程序控制。将样品插入塑料的自动取样器小管，密闭并用5μL加样环注射。
微细管HPLC-质谱:
通过微量电喷雾HPLC系统用50分钟0-50%溶剂B(A:0.1MHoAc，B:90%MeCN/0.1MHoAc)梯度分离来自凝胶内消化液的提取的肽。在FinniganLCQ离子阱质谱仪(ThermoQuest，SanJose，CA)上进行肽分析，喷雾电压为1.5kV，加热的毛细管温度为150℃。用设备提供的数据获取软件以自动MS/MS模式获得数据。获取方法包括1MS扫描(375-1200m/z)，然后MS/MS扫描MS扫描中含量最丰富的三种离子。采用动态排除(dynamicexclusion)和同位素排除(isotopeexclusion)功能来增加被分析的肽离子数量(设定:3amu=排除宽度，3min=排除持续时间，30secs=预排除持续时间，3amu=同位素排除宽度)。采用来自脑膜炎奈瑟氏球菌(获自Sanger)完整基因组的蛋白质数据库，用FinniganBioworks数据分析软件包(ThermoQuest，SanJose，CA)包括的SEQUEST计算机算法进行自动分析MS/MS数据。研究结果在图3中说明。
实施例2
重组脂质化P2086(rLP2086)的克隆:
A.)天然前导序列:
原料:
通过PCR从血清组B脑膜炎奈瑟氏球菌菌株8529的临床分离物扩增ORF2086基因。该菌株的血清组、血清型和血清亚型显示在括号内；8529(B:15，P1:7b,3)。这种脑膜炎球菌菌株获自RIVM，Bilthoven，荷兰。脑膜炎球菌菌株8529的成熟2086蛋白基因序列如SEQID.NO:212所提供。
PCR扩增和克隆策略:
ORF2086的可视检测说明，这种基因有一个潜在的脂蛋白信号序列。用专利的隐蔽马尓科夫模型(HiddenMarkovModel)脂蛋白算法分析证实ORF2086含有脂蛋白信号序列。为以更像天然的构象重组表达P2086，设计了扩增具有完整脂蛋白信号序列的全长基因的寡核苷酸引物，该引物基于对脑膜炎奈瑟氏球菌AORF2086的Sanger序列分析(5'引物—CTATTCTGCATATGACTAGGAGC；3’引物—GCGCGGATCCTTACTGCTTGGCGGCAAGACC)，它们分别是SEQIDNO:304(化合物编号:4624)和SEQIDNO:303(化合物编号:4623)(也可参见这里的表IV)。通过聚合酶链式反应(PCR)[ABI2400热循环仪，AppliedBiosystems，FosterCity，CA]从脑膜炎奈瑟氏球菌菌株8529扩增2086基因。将正确大小的扩增产物连接并克隆入pCR2.1-TOPO(Invitrogen)。质粒DNA用NdeI和BamHI限制性消化，凝胶纯化并连接入pET-27b(+)载体(Novagen)。
采用β-氰乙基亚磷酰胺(AppliedBiosystems，FosterCityCA)，在PerSeptiveBiosystems寡核苷酸合成仪(AppliedBiosystems，FosterCityCA)上合成上述寡核苷酸引物。用于PCR扩增ORF2086基因家族的引物列于表IV，它显示了本发明引物的非限制性例子。
表IV:引物
利用天然前导序列表达rLP2086脂蛋白:
参考图5，将质粒pPX7340转化/转染或感染入BLR(DE3)pLysS宿主细胞(LifeSciences)。选择一个转化体并接种到50mL含有2%葡萄糖、卡那霉素(30μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)和四环素(12μg/mL)的Terrific肉汤中。过夜培养物的OD600为6.0。将过夜培养物稀释到1升含有1%甘油和相同抗生素的Terrific肉汤中。起始OD600为0.4。2小时后OD600为1.6，取出先诱导的样品。将OD600=1的细胞离心并除去上清。将全细胞团重悬于150μLTris-EDTA缓冲液和150μL2xSDS-PAGE样品缓冲液。加入IPTG至最终浓度为1mM。3.5小时后按所述取出后诱导的样品并用SDS-PAGE分析(参见图4)。
rLP2086的纯化:
差示洗涤剂提取后从大肠杆菌溶解rLP2086。与天然环境中的P2086不同，rLP2086不被TritonX-100或两性洗涤剂3-12显著溶解。rLP2086可被十二烷基肌氨酸钠溶解，表明它与大肠杆菌外膜组分的相互作用不同于它在脑膜炎奈瑟氏球菌中的相互作用。一旦用与天然蛋白质类似的方法纯化溶解的rLP2086，可通过在pH8用阴离子交换树脂吸附除去许多污染的大肠杆菌蛋白。尽管比其理论pI大了半个pH单位，rLP2086在pH8仍未被吸附。在pH4.5用阳离子交换树脂吸附rLP2086获得了进一步纯化。
SDS-PAGE后rLP2086的均一性显示在图2中。通过MALDI-TOF质谱分析确定rLP2086的质量为27,836。该质量与理论质量27,100相差736，这接近细菌脂蛋白常见的N-末端脂质修饰的质量。天然2086和rLP2086似乎都有外膜脂蛋白。试图阻断N-末端测序，这与末端修饰相一致。
纯化方法:
将表达P2086的BLRDE3pLysS细胞的冷冻颗粒重悬于10mMHEPES-NaOH/1mMEDTA/1μg/mLPefablocSC蛋白酶抑制剂(Roche)pH7.4(HEP)，每克湿细胞重量用20mL，并用微流化器(Microfluidics公司，110Y型)裂解细胞。细胞裂解物在150,000xg离心1小时。颗粒用HEP洗涤两次并离心两次，所得膜颗粒冷冻过夜。所述颗粒用10mMHEPES-NaOH/1mMMgCl2/1%TX-100pH7.4溶解30分钟，接着在150,000xg离心30分钟。该过程重复三次。膜颗粒如上述用50mMTris-HCl/5mMEDTA/1%两性洗涤剂3-12pH8洗涤两次，接着用50mMTris-HCl/5mMEDTA/1%两性洗涤剂3-14pH8和50mMTris-HCl/5mMEDTA/1%两性洗涤剂3-14/0.5MNaClpH8各洗涤两次。
然后rLP2086用50mMTris-HCl/5mMEDTA/1%十二烷基肌氨酸钠pH8溶解。这种十二烷基肌氨酸钠提取物被调至1%两性洗涤剂3-14(Z3-14)，并用过量30倍的50mMTris-HCl/5mMEDTA/1%Z3-14透析两次。经过透析的rLP2086提取物用90%乙醇沉淀以除去残余的十二烷基肌氨酸钠，并用50mMTris-HCl/5mMEDTA/1%Z3-14pH8(TEZ)溶解。离心除去不溶物，将上清液通过阴离子交换层析柱，rLP2086被收集在未结合的组分中。然后未结合物用过量30倍的25mMNaAc/1%Z3-14pH4.5透析两次并通过阳离子交换层析柱。rLP2086用0-0.3MNaCl梯度洗脱并通过SDS-PAGE分析(考马斯染色)。通过激光光密度测定法确定rLP2086库为84%纯。
抗血清对rLP2086亚科B的表面反应性和杀菌活性
参考表VII，通过全细胞ELISA测试了来自亚科B菌株8529的纯化的rLP2086的抗血清对所有10种2086亚科B菌株的表面反应性。检测了10种中9种表达异源血清亚型抗原－PorA的2086亚科B菌株的杀菌活性。这些菌株是引起整个西欧、美国、澳大利亚和新西兰血清组B脑膜炎球菌性疾病的代表性菌株。通过全细胞ELISA，在杀菌测定中唯一一种未被杀死的菌株870227与抗-rLP2086(亚科B)血清强烈反应，说明这种菌株表达一种带有P2086中常见表位的蛋白质。
还通过全细胞ELISA测试了表VII所列2086亚科A菌株的表面反应性。这三种菌株中的两种似乎有非常低的反应性，说明一些2086亚科A菌株可能不与rLP2086亚科B产生的抗体交叉反应。还对菌株870446、NMB和6557进行PCR扩增以鉴定菌株8529的2086亚科B基因。未检测到2086亚科B的PCR扩增产物。
免疫原性方法:
制备抗血清:
如上述实施例1中所述制备疫苗。但使用剂量为10μg。
全细胞酶联免疫吸附测定(ELISA):
用无菌0.01M磷酸盐、0.137MNaCl、0.002MKCl(PBS)将脑膜炎奈瑟氏球菌全细胞悬液稀释至620nm的光密度为0.1。在NuncBacT96孔板(Cat#2-69620)的每个孔中加入0.1mL该悬液。室温下使细胞在平板上干燥3天，然后覆盖、倒转并储存在4°C。平板用洗涤缓冲液(0.01MTris-HCl,0.139MNaCl/KCl,0.1%十二烷基聚(氧乙烯二醇醚)n，n=23(购自ICIAmericas，Inc.,Wilmington，Delaware)，pH7.0-7.4)洗涤三次。在PBS，0.05%Tween-20/叠氮化物中制备抗血清的稀释液并将0.1mL转移到涂布的平板中。平板在37℃培育2小时。平板用洗涤缓冲液洗涤三次。羊-抗-鼠IgGAP(SouthernBiotech)以1:1500稀释在PBS/0.05%Tween-20中，在每个孔中加入0.1mL，并将平板在37°C培育2小时。洗涤平板(如上所述)。通过将对-硝基苯基磷酸盐(Sigma)在1M二乙醇胺/0.5mMMgCl2中稀释至1mg/mL制备底物溶液。在平板的每个孔中加入0.1mL底物并在室温下培育1小时。用50μL/孔3NNaOH终止反应并在405nm以690nm作为参照阅读平板。
B.)P4前导序列:
PCR扩增和克隆策略:
为最优化rLP2086的表达，2086基因从非可分型(nontypable)流感嗜血杆菌的P4信号序列之后克隆(Green等，1991)。用于脂蛋白克隆的引物列在表IV中并用化合物编号:5658、5660、6473、6543和6385鉴别。ORF2086从脑膜炎奈瑟氏球菌B菌株8529扩增，用编号为5658和5660的化合物作为引物。ORF2086从脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株CDC1573扩增，用编号为6385和5660的化合物作为引物。ORF2086从脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B菌株2996扩增，用编号为6473和6543的化合物作为引物。N-末端(5')引物设计成与2086基因的成熟区域同源(从恰好位于半胱氨酸下游氨基酸位置3上的丝氨酸残基开始)。将限制位点BamHI(GGATTC)引入每个N-末端引物的5'末端，导致在成熟蛋白质的氨基酸位置2上插入甘氨酸残基。C-末端(3’)引物设计成与2086基因的C-末端同源，且为了克隆的目的，包括终止密码子以及SphI位点。来自各个脑膜炎奈瑟氏球菌B菌株的扩增片段被克隆入中间载体并通过序列分析筛选。
用BamHI和SphI限制性酶(NewEnglandBiolabs，(NEB))消化正确克隆的质粒DNA。选择载体pLP339(由申请人的受让人提供)作为表达载体。这种载体采用pBAD18-Cm骨架(Beckwith等，1995)并含有非可分型流感嗜血杆菌的P4脂蛋白信号序列和P4基因(Green等，1991)。所述pLP339载体用限制性酶BamHI部分消化然后用SphI消化。扩增的2086片段(BamHI/SphI)分别连接入pLP339载体(部分BamHI/SphI)。这种克隆策略将成熟2086基因置于P4脂蛋白信号序列之后。仍BamHI位点留在所P4信号序列和2086基因之间的克隆连接中(参见图7所示的质粒构建物)。以下是BamHI克隆连接处序列的例子:
[P4信号序列]-TGTGGATCC-[保留的2086成熟核酸序列]
[P4信号序列]-CysGlySer-[保留的2086成熟氨基酸序列]
参考图7，各个扩增的片段被克隆入含有P4前导序列的经过修饰的pBAD18-Cm载体。对表达rP4LP2086(重组P4脂质化2086)的重组大肠杆菌BLRpPX7343进行发酵以试图通过添加额外的葡萄糖增加细胞密度。发酵罐中装满如Sambrook所述的10L完全M9基本培养基，补充1%葡萄糖。
发酵罐中葡萄糖的最初浓度为45g/L。在发酵罐中接种至起始OD约为0.25。在约OD25时加入20g/L葡萄糖。在OD63.4葡萄糖耗尽时用1%阿拉伯糖诱导培养物。诱导后继续发酵3小时。在诱导后t=0、1、2、3时保留样品并用BSA测定蛋白质的量。在t=3时，蛋白质产量约为0.35g/L，和7%的总细胞蛋白质。从约10L培养物中共收获895克湿细胞浆。
用上述实施例2的A部分中同样的方法进行rP4LP2086的纯化。
实施例3
非脂质化的成熟2086蛋白的发育遗传学:
为进一步评价2086蛋白的免疫原性，进行了P2086的非脂质化形式的克隆和表达。
ORF2086的PCR基因扩增:
用于PCR扩增非脂质化的2086基因的寡核苷酸列在引物表表IV中。来自菌株8529的2086基因可用化合物编号5135和6406(SEQIDNO分别为308和312)鉴别的引物扩增，如该表所述。来自菌株CDC1573的2086基因可用化合物编号5135和6474(SEQIDNO分别为308和316)鉴别的引物扩增。来自菌株2996的2086基因可用化合物编号6406和6605(SEQIDNO分别为312和320)鉴别的引物扩增。
这些引物的特征包括，每个引物中有一个合成的BglII限制位点，化合物编号6406和6474中有一个合成的NdeI限制位点，且化合物编号5135和6605中存在的所有三个阅读框中都有终止密码子。引物编号6406和6474扩增在第二个氨基酸终止密码子(ACG)上融合了一个ATG(Met)的2086基因，它代表成熟2086多肽的单个氨基酸取代(代替TGCCys)。
所述PCR克隆载体是TOPO-PCR2.1，Invitrogen，Valencia，CA。
用于表达非脂质化的2086蛋白的载体是来自Novagen，Madison，WI的pET9a。
所述大肠杆菌克隆菌株是Top10，Invitrogen，Carlsbad，CA。
所述大肠杆菌表达菌株是BLR(DE3)pLysS，Novagen，Madison，WI。
用于克隆目的的培养基是Sambrook等所述的Terrific肉汤液体或琼脂培养基，用1%无菌葡萄糖代替甘油，并加有合适的抗生素(氨苄青霉素或卡那霉素)。
质粒纯化采用QiagenSpinMiniprep试剂盒(Valencia，CA)。
制备供非脂质化的2086表达的生产菌株或细胞系:
所述2086基因通过聚合酶链式反应(PCR)[AmpliTaq和ABI2400热循环仪，AppliedBiosystems，FosterCity，CA]从来源于脑膜炎球菌菌株8529的染色体DNA扩增。2086基因的PCR扩增每个反应中采用的两种寡核苷酸引物由化合物编号6474和5135(SEQIDNO分别是316和308)鉴别。扩增的2086PCR产物直接克隆入TOPO-PCR2.1克隆载体，并在补充有100μg/ml氨苄青霉素和20μg/mlX-Gal的Terrific肉汤琼脂上选择。选择白色集落并使其生长。用Qiagen微制备试剂盒制备质粒DNA并筛选用于PCR片段插入的质粒。对PCR插入质粒进行DNA测序(BigDye化学在ABI377测序仪上进行，AppliedBiosystems，FosterCity，CA)。
用BglII限制性酶消化显示正确DNA序列的质粒，并用GeneCleanII纯化试剂盒(Bio101，Carlsbad，CA)凝胶纯化BglII片段。将纯化的BglII片段克隆入表达载体pET9a的BamHI位点。在添加有30μg/ml卡那霉素的Terrific肉汤平板上选择pET9a/2086克隆。使卡那霉素抗性克隆生长并制备微制备质粒DNA。筛选BamHI位点中的2086基因的合适取向的质粒。正确取向的质粒代表T7-抗原融合到2086基因的氨基末端(rP2086T7)。这些rP2086T7基因融合体被转化入BLR(DE3)pLysS，在Terrific肉汤/Kan平板上选择，在Terrific肉汤中生长并用1mMIPTG(异丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷)诱导以表达rP2086T7融合蛋白。所述rP2086T7融合蛋白以高水平表达。
然后对这些融合质粒进行NdeI限制性消化，这样可删除T7-抗原并通过载体将成熟2086基因直接连接到ATG起始密码子上。将这些NdeI删除的质粒转化入Top10细胞并在Terrific肉汤/Kan平板上选择。使备选克隆生长并制备微制备质粒DNA。对质粒DNA进行DNA测序以确定缺失和2086基因序列的完整性。通过质粒图谱展示的这些质粒被称为pPX7328(图6)。将显示正确DNA序列的质粒转化入BLR(DE3)pLysS，在Terrific肉汤/Kan平板上选择，在Terrific肉汤中生长并用IPTG诱导以表达2086蛋白。当除去T7-Tag时，pET9载体在菌株BLR(DE3)pLysS中不表达成熟2086蛋白。
生产非脂质化的2086蛋白:
用纯化的质粒DNA来转化表达菌株BLR(DE3)pLysS。携带该质粒的BLR(DE3)pLysS细胞对卡那霉素有抗性并可通过加入1mMIPTG来诱导表达高水平的PorA蛋白。rP2086T7融合蛋白可作为不溶性包涵体在大肠杆菌细胞系BLR(DE3)pLysS中表达，表达量约占总蛋白质的40%。这种纯化的融合蛋白被用来免疫小鼠和产生显著水平的抗异源脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体(参见表V)。
2086非脂质化基因的诱变:
在2086基因的5'末端进行PCR引物诱变。进行中的表达研究以确定当成熟的rP2086T7显示高表达水平时是否可除去T7-Tag。
非脂质化rP2086T7的纯化:
用微流化器在10mMHepes-NaOH/5mMEDTA/1mMPefablocSCpH7.4中裂解表达非脂质化rP2086T7的大肠杆菌BLR(DE3)pLysS细胞。细胞溶解物在18,000xg离心30分钟。包涵体颗粒用50mMTris-HCl/5mMEDTA/1%TritonX-100pH8洗涤三次，每次洗涤后在24,000xg离心30分钟。包涵体颗粒然后用50mMTris-HCl/5mMEDTA/1%两性洗涤剂3-14pH8洗涤两次，每次洗涤后在24,000xg离心15分钟。包涵体颗粒然后用50mMTris-HCl/5mMEDTA/4M尿素pH8溶解2小时，接着通过离心除去不溶物。将上清(溶解的rP2086T7)分成四个等分样品。用储备溶液将一份样品调至50mMTris-HCl/5mMEDTA/250mMNaCl/2M尿素pH8(无洗涤剂)，一份调至50mMTris-HCl/5mMEDTA/250mMNaCl/2M尿素/1%氢化的TritonX-100pH8(TX-100)，一份调至50mMTris-HCl/5mMEDTA/250mMNaCl/2M尿素/1%两性洗涤剂3-12pH8(Z3-12)，一份调至50mMTris-HCl/5mMEDTA/250mMNaCl/2M尿素/1%两性洗涤剂3-14pH8(Z3-14)。为除去尿素，将样品透析以使各自的缓冲液均不含尿素。然后将样品透析以使各自的缓冲液均不含尿素并使NaCl浓度降至60mMNaCl。在2,000xg离心15分钟除去不溶物，所得上清(重折叠的rP2086T7)被用于进一步的实验。用考马斯染色SDS-PAGE和激光光密度测定发现rP2086T7的均一性为91-95%。
免疫原性过程—如实施例2所述
这种纯化的融合蛋白被用来免疫小鼠和产生显著水平的抗异源脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体。(见下表V):
表V:产生P2086T7的鼠抗体的杀菌效价
小鼠血清 描述 异源菌株/H44/76
AF780第6周 r2086T7，10μg 3200
第0周收集 Pre-免疫血清 10
AE203第6周 rLP2086，10μg(阳性对照)* 6400
(*用rLP2086免疫小鼠产生的阳性对照血清)
实施例4
ORF2086的嵌合克隆的开发
菌株CDC-1573的2086基因的N-末端区域含有一个在菌株8529和2996的2086基因中不存在的重复区段(参见图8)。说明这种重复区段负责提高重组2086蛋白从两种基于大肠杆菌的表达系统(pET和pBAD)的表达水平。与采用相同系统的菌株8529和2996的2086基因的重组表达水平相比，CDC-15732086基因的重组蛋白表达水平明显超过在pET和pBAD表达系统中的表达水平。除了这种重复区段，所有三种菌株的2086基因的N-末端区域都是相对同源的。因此，可以合理地设想将CDC-1573N-末端融合到菌株8529和2996的2086基因，当使用pET和pBAD系统时从这些基因表达的重组2086蛋白的水平将增加。
材料和方法:
菌株8529和2996的染色体DNA被纯化并被用作嵌合2086基因的PCR扩增的模板。化合物编号为6721和5135的PCR引物(SEQIDNO分别为321和308)被用来从菌株8529扩增嵌合2086基因，化合物编号为6721和6605的PCR引物(SEQIDNO分别为321和320)被用来从菌株2996扩增嵌合2086基因。将PCR产物直接克隆入PCR2.1TOPO载体(Invitrogen)，然后通过DNA序列分析筛选以鉴别完整的嵌合2086基因。然后用BglII从PCR2.1载体切除该基因并将所述BglII片段插入质粒pET9a的BamHI位点。筛选具有合适取向的质粒插入物然后对其进行NdeI消化。在pET9a载体的协助下，线性NdeI片段自身连接(self-ligated)以实现含有T7-tag序列的小NdeI片段的缺失。这种缺失使T7启动子直接连接嵌合2086基因的5’末端。将NdeI删除的质粒转化入大肠杆菌菌株BL21(DE3)并利用IPTG诱导筛选表达嵌合2086蛋白的卡那霉素抗性集落。
最初的研究表明，当在pET9a系统表达时，菌株2996的嵌合2086基因表达的重组蛋白约为天然2996/2086基因的两倍。尚未测试pBAD系统。
尽管只进行了一项实验，但数据表明提高了嵌合2086基因的功效。菌株8529和2996的2086基因产生的CDC-1573N-末端融合体提高重组2086蛋白的表达。
实施例5
2086PCR筛选脑膜炎奈瑟氏球菌菌株:
为确定2086基因在临床分离物中的保守性，对88种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株进行PCR扩增。
ORF2086的最初PCR鉴定采用表IV所列的引物(参见上述实施例2)，由化合物编号:4623、4624和4625(SEQIDNO分别为303、304和305)鉴别。这些引物是基于Sanger氏的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A序列设计的。为便于筛选大量的菌株，设计了2086基因的内部引物。用新设计的由化合物编号5005和5007(SEQIDNOS.306和307)鉴别的内部2086引物通过PCR筛选总共88种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株。这些引物使申请人能够从88种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中的63种鉴定2086基因(约70%)，(参见表VI-A)。
Sanger氏的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组A序列和TIGR氏的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B序列中2086基因周围的扩展区被检测和排列。设计的引物与2086基因的上游和下游区域相符合。目的是用这些引物从多种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株来扩增大于全长2086基因的序列以进行序列比较。用化合物编号6470和6472(SEQIDNO分别为313和314)PCR扩增一种菌株(6557)，得到低产量的产物。菌株6557扩增的产物被克隆并对质粒DNA进行序列分析。结果表明一种新型2086基因具有的序列变异性比以前所见的大。菌株6557的2086基因在氨基酸水平上与其它菌株序列约75%相同一。有趣的是，菌株6557是先前通过上述2086PCR筛选被测试为阴性的30%的菌株之一。
设计了对菌株6557内的C-末端可变区特异的内部引物。这些引物被用于在先前通过2086PCR筛选被测试为阴性的约30%的菌株中筛选更加可变的2086基因。用这些新鉴定的内部2086引物(由化合物编号6495和6496；SEQIDNO分别为159和160鉴别)通过PCR筛选所有脑膜炎奈瑟氏球菌菌株(n=88)。只有约30%先前通过2086PCR被测试为阴性的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株在此筛选中呈PCR阳性。一组从上述PCR阴性(约30%)菌株扩增的基因代表了一种新型2086基因或2086基因的第二家族，这里称为2086亚科A。用8529衍生引物从约70%的菌株扩增的一组2086基因在这里被称为亚科B。
2086基因的亚科A用奇数编号的SEQIDNOS:1-173为例证，但不限于此。2086基因的亚科B用奇数编号的SEQIDNOS:175-251为例证，但不限于此。
用于PCR扩增研究的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株选自下面的表VI-A和表VI-B。表中所列菌株被作为脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的例子，但不限于此。表VI-A所列菌株归入2086蛋白亚科A，表VI-B所列菌株归入2086蛋白亚科B。各表所列菌株是通过血清亚型分类的。如表中所述，这些菌株获自以下四种来源:MPHL-曼彻斯特公众健康实验室(ManchesterPublicHealthLaboratory)，曼彻斯特英国；RIVM，比尔特霍芬，荷兰；衣阿华大学(UniversityofIowa)医学院微生物系，衣阿华城，衣阿华州；和沃尔特里德陆军研究院(WalterReedArmyInstituteofResearch)，华盛顿特区。
表VI-A
菌株 血清亚型 来源
M97251854 B:4z，PI:4 MPHL
M98250622 B:2b，PI:10 MPHL
M98250572 B:2b，PI:10 MPHL
M98250771 B:4z，PI.22,14 MPHL
M98250732 B:4z，PI.22,14a MPHL
M98250809 B:15，PI:7,16 MPHL
M97252697 B:1，PI:6，P1.18,25 MPHL
M97252988 B:4，PI:6，P1.18,25,6 MPHL
M97252976 B:4，PI:6，P1.18,25 MPHL
M97252153 B:4，PI:6，P1.18,25 MPHL
M97253248 B:15,PI:7，NT，16 MPHL
CDC1610 P1:NT 4(15)，P1.18-7,16-14 CDC
CDC1521 P1.6,32b(4) CDC
菌株 血清亚型 来源
CDC1034 P1.74(15) CDC
L8 P1.7,115(4) Walter Reed
CDC1492 P1.7,14(15) CDC
870446 P1.12a,13 RIVM
CDC2369 P1.(9),14 CDC
6557 P1.(9),14，P1.22a,14a RIVM
2996 P1.5,2，P1.5a,2c RIVM
NmB P1.5,2，P1.5a,2c UIOWA
L3 P1.5,2 Walter Reed
B16B6 P1.5,2 RIVM
CDC1135 CDC
L5 P1.NT，P1.21-6,1 Walter Reed
L4 P1.21,16 Walter Reed
W135 Walter Reed
C11 C:16,P1.7,1 CDC
Y Walter Reed
表VI-B
菌株 血清亚型 来源
M98250670 B:1，PI:4 MPHL
M98250024 B:1，PI:4 MPHL
M97253524 B:1，PI:4 MPHL
M97252060 B:1，PI:4 MPHL
M97251870 B:4z，PI:4 MPHL
M97251836 B:4z，PI:4 MPHL
M97251830 B:4z，PI:4 MPHL
M97251905 B:4z，PI:4 MPHL
M97251898 B:4z，PI:4 MPHL
M97251885 B:4z，PI:4 MPHL
菌株 血清亚型 来源
M97251876 B:4z，PI:4 MPHL
M97251994 B:4z，PI:4 MPHL
M97251985 B:4z，PI:4 MPHL
M97251957 B:4z，PI:4 MPHL
M97251926 B:4z，PI:4 MPHL
M97252045 B:4z，PI:4 MPHL
M97252038 B:4z，PI:4 MPHL
M97252026 B:4z，PI:4 MPHL
M97252010 B:4z，PI:4 MPHL
M97252098 B:4z，PI:4 MPHL
M97252083 B:4z，PI:4 MPHL
M97252078 B:4z，PI:4 MPHL
M98250735 B:4z，PI:15 MPHL
M98250797 B:4z，PI:15 MPHL
M98250768 B:4z，PI:15 MPHL
M98250716 B:2b，PI:10 MPHL
M98250699 B:4z,PI:10 MPHL
M98250393 B:4z,PI:10 MPHL
M98250173 B:4z,PI:10 MPHL
M97253462 B:4z，PI:14 MPHL
M98250762 B:15，PI:7,16 MPHL
M98250610 B:15，PI:7,16 MPHL
M98250626 B:15，PI:7,16 MPHL
M97250571 B:15，PI:16 MPHL
M97252097 B:15，PI:16，P1.7b,16 MPHL
M97253092 B:1，PI:6 MPHL
M97252029 B:15,PI:7，NT MPHL
M97251875 B:15,PI:7，NT MPHL
CDC1127 PI.7,164(15) CDC
菌株 血清亚型 来源
CDC982 PI.7,164(15) CDC
CDC1359 PI.7,164(15) CDC
CDC798 PI.7,1615(4) CDC
CDC1078 PI.7,1615(4) CDC
CDC1614 PI.7,1615(4) CDC
CDC1658 PI.7,1615(4) CDC
H44/76 PI.7,1615(4) RIVM
CDC1985 P1.7,134(15) CDC
L6 P1.7,1?(4) Walter Reed
CDC1573 P1.7,14(15) CDC
L7 P1.7,(9),1 Walter Reed
CDC937 P1.7,3，P1.7b,3 CDC
8529 P1.7,3，P1.7b,3 RIVM
880049 P1.7b,4 RIVM
CDC2367 P1.154(15) CDC
H355 P1.19,15 RIVM
CDC1343 P1.144(15) CDC
M982 P1.22,9 RIVM
870227 P1.5c,10 RIVM
B40 P1.5c,10 RIVM
5315 P1.5c,10 RIVM
CDC983 P1.5,2 CDC
CDC852 P1.5,2 CDC
6940 P1.18,25(6) RIVM
A4
其它菌株可以容易地作为来自受感染个体的分离物获得。
实施例6
rLP2086-8529抗血清抗脑膜炎球菌菌株的反应性
下表VII显示了上述rLP2086的交叉反应和交叉保护能力。如下表所述，rLP2086用包括全细胞ELISA(WCE)效价、杀菌测定(BCA)和幼鼠(IR)测定在内的各种技术处理并分析以确定多克隆抗体抗2086蛋白的细菌细胞表面反应性。
表VII
rLP2086-8529抗血清抗多种脑膜炎球菌菌株的反应性
+在菌血症中降低大于10倍
-在菌血症中降低小于10倍
实施例7
制备了表达ORF2086蛋白的各种构建物。下表VIII是为了显示本发明实施例和阐明本发明实施方案的目的提供的r2086构建物的表，但不限于此。
表VIII
r2086构建物概述
实施例8
用LSO耗竭外膜蛋白进行的进一步研究鉴定了产生ProA以外的外膜蛋白的其它菌株，这些外膜蛋白能够引发表达异源血清亚型菌株的杀菌抗体。以下描述了进一步的研究以鉴定如本发明一个实施方案所述的其它蛋白，尤其是外膜脂蛋白，这种蛋白可减少脑膜炎球菌性免疫原性组合物中所需的蛋白质的数量。这些进一步的研究可补充上述实施例中所述的研究。
亚细胞分级、差示洗涤剂提取、等电聚焦和离子交换层析与免疫和抗多种菌株的杀菌测定结合使用以鉴定感兴趣的一小组蛋白质。主要组分的直接测序表明N-末端被阻断。通过直接测序化学消化和蛋白酶解消化所得的多肽获得了内部蛋白质序列。脑膜炎球菌菌株组A的基因组序列下载自Sanger中心并由我们的生物信息学小组用现有和有专利权的算法进行分析以产生可查询的数据库。肽序列数据表明ORF2086是感兴趣的。基于这种orf的引物被用于从菌株8529中PCRP2086基因。基因序列分析，事实是N-末端被阻断，及其亚细胞定位表明，P2086是脂质化的外膜蛋白(LP2086)。采用流感嗜血杆菌(H.influenzaeP4)信号序列，rLP2086-8529和其它脑膜炎球菌菌株的变异体被作为脂蛋白在大肠杆菌中重组表达。这些重组蛋白是通过差示洗涤剂提取分离自大肠杆菌细胞膜的，用离子交换层析纯化并被用于免疫小鼠。鼠抗-LP2086血清能够促进抗脑膜炎奈瑟氏球菌几种不同血清亚型菌株的杀菌活性。对许多脑膜炎奈瑟氏球菌菌株的P2086基因进一步分析显示，这些序列分成称为亚科A和亚科B的两组(参见图12)。抗亚科B蛋白的抗血清是对九种表达亚科B蛋白的菌株和一种表达亚科A蛋白的菌株杀菌的。亚科A抗血清是对亚科A的菌株杀菌的。一种rPorA和一种rLP2086的混合物引发的互补抗体使疫苗扩展超出单由蛋白质诱导的范围。
通过这些观察可得到以下结论。rLP2086抗原能够引发对表达异源PorA和异源P2086蛋白的脑膜炎球菌菌株的杀菌抗体。无论是单独施用或与其它奈瑟氏球菌属抗原结合，抗原的P2086家族都可能是有效的疫苗或免疫原性物质。
以下详细描述了上述研究。发现一种可溶性外膜蛋白(sOMPs)的复杂混合物可引发对表达异源PorA蛋白的菌株的PorA非依赖性杀菌抗体。对免疫活性组分采用差示洗涤剂提取、等电聚焦和离子交换层析然后免疫小鼠的方法。
在每个步骤中，测定血清的表面反应性和抗不同菌株的杀菌活性，这些菌株含有代表全世界脑膜炎球菌性疾病流行病学的血清亚型抗原。
分离和免疫步骤被用来鉴定用于脑膜炎奈瑟氏球菌组b的新型交叉反应免疫原性候选物。
产生PorA缺陷型菌株—将porA染色体基因座克隆入菌株2996的质粒pPX7016。在此质粒内，porA启动子、S/D盒和前38个N-末端密码子被删除并被自身所含的KanR表达盒代替。质粒用限制性酶线性化并自然转化入血清亚型菌株PI:5,2；PI:9；PI:7,16；PI:15；PI:4；PI:3和PI:10。选择卡那霉素抗性转化体并在ELISA中通过血清亚型特异性单克隆筛选PorA的丧失。
杀菌测定:见Mountzourous，K.T.和Howell，A.P.《在对脑膜炎奈瑟氏球菌组B进行的基于荧光的血清杀菌测定中检测补体介导的抗体依赖的杀菌活性》(DetectionofComplement-MediatedAntibody-DependentBactericidalActivityinaFlourescence-BasedSerumBactericidalAssayforGroupBNeisseriameningitidis).JClinMicrobiol.2000；38:2878-2884。
全细胞酶联免疫吸附测定(ELISA):
用无菌0.01M磷酸盐、0.137MNaCl、0.002MKCl(PBS)将脑膜炎奈瑟氏球菌全细胞悬液稀释至620nm的光密度为0.1。在NuncBacT96孔板(Cat#2-69620)的每个孔中加入0.1mL该悬液。37℃下使细胞在平板上干燥过夜，然后覆盖、倒转并储存在4°C。平板用洗涤缓冲液(0.01MTris-HCl,0.139MNaCl/KCl,0.1%Brij-35，pH7.0-7.4)洗涤三次。在PBS，0.05%Tween-20/叠氮化合物中制备抗血清的稀释液并将0.1mL转移到涂布的平板中，平板在37℃培育2小时。平板用洗涤缓冲液洗涤三次。羊-抗-鼠IgGAP(SouthernBiotech)以1:1500稀释在PBS/0.05%Tween-20，在每个孔中加入0.1mL，并将平板在37°C培育2小时。洗涤平板(如上所述)。通过将对-硝基苯基磷酸盐(Sigma)在二乙醇胺中稀释至1mg/ml制备底物溶液。在平板的每个孔中加入0.1mL底物并在室温下培育1小时。用50μL/孔3NNaOH终止反应并在405nm处以690nm作为参照阅读平板。
重组PorA的诱导:BLR(DE3)/pET9a菌株于37℃在补充有Kan-30和2%葡萄糖的HySoy肉汤(SheffieldProducts)中生长过夜。早上，O/N培养物以1/20稀释在HySoy肉汤(补充有Kan-30和1%甘油)并在37°C生长1小时。加入最终浓度为1mM的IPTG诱导这些培养物。使培养物再生长2-3小时然后收获。
重组PorA的纯化:rPorA用8M尿素溶解自大肠杆菌包涵体，并用不含尿素的缓冲液透析以使其重折叠。然后通过渗滤浓缩重折叠的rPorA并用G25柱将缓冲液交换成NaPO4pH6。然后将经过透析的rPorA加到阳离子交换柱(SFractogel)并用1MNaCl洗脱。
菌株8529(P1.7-2,3)的sOMPs在小鼠中引发对表达异源血清亚型的菌株的PorA非依赖性杀菌活性。下表IX显示了所研究菌株中的杀菌活性。
表IX
制备sOMPs:用TX-100、两性洗涤剂3-14和两性洗涤剂3-14+0.5MNaCl提取脑膜炎奈瑟氏球菌细胞膜。将上述sOMPs溶解在两性洗涤剂3-14/0.5MNaCl提取物中。用精通此领域的技术人员熟知的技术进行提取，例如参见美国专利号6,355,253，在此将其并入以供参考。
免疫原性:在第0周和4周用辅助有20μgQS-21的25μg总蛋白免疫雌性Swiss-Webster小鼠。在第6周放血并进行数据分析。
1杀菌(BC50)效价表示为可使活细胞计数减少50%的抗血清稀释度的倒数。第0周正常小鼠血清的BC50效价<25。
2NST=非血清亚型可分(Serosubtypable)
下表X总结了亚科A和亚科B的重组脂质化P2086(rLP2086)的纯化和特性鉴定。
亚科ArLP2086的纯化
表X
rLP2086变异体 A.A.同源性(%)1 理论pI 纯度(%)2
870446 75 6.1 80
2996 71 5.9 95
M97252988 71 6.3 96
C11 68 6.4 82
M98250771 62 6.1 83
亚科BrLP2086的纯化
表XI
rLP2086变异体 A.A.同源性(%)1 理论pI 纯度(%)2
8529 100 7.5 96
M982 94 6.3 96
88049 92 6.2 90
CDC1573 87 5.6 93
纯化方法:用TX-100(除rLP2086-8529用十二烷基肌氨酸钠或尿素溶解)从大肠杆菌细胞膜溶解所有变异体。在Tris-HCl或NaPO4缓冲液中结合阴离子交换(TMAE)、大小排阻和/或阳离子交换(SFractogel)色谱获得进一步纯化。
1与菌株8529的P2086比较所得的氨基酸同源性
2通过SDS-PAGE和胶体考马斯染色带(SimplyBlue染色)的激光光密度测定法确定纯度
亚科B成员rLP2086-8529对同源和异源菌株测试的免疫原性
下表XII显示了亚科B成员rLP2086-8529对同源和异源菌株测试的免疫原性
表XII
疫苗接种步骤:在第0周和第4周用10μgrLP2086-8529+20μgQS-21免疫6-8周龄雌性Swiss-Webster小鼠。在第6周放血并进行数据分析。
a与rLP2086-8529相比P2086的氨基酸同源性
b终点效价表示为吸收值＝0.1时稀释度的倒数
cBC50效价表示为可使活细胞计数减少50%的抗血清稀释度的倒数。第0周正常小鼠血清的BC50效价<10
表XIII显示了亚科B成员rLP2086-2996对同源和异源菌株测试的免疫原性。
表XIII
疫苗接种步骤:在第0周和第4周用10μgrLP2086-2996+20μgQS-21免疫6-8周龄雌性Swiss-Webster小鼠。在第6周放血并进行数据分析。
a与rLP2086-2996相比P2086的氨基酸同源性
b终点效价表示为吸收值＝0.1时稀释度的倒数
c杀菌(BC50)效价表示为可使活细胞计数减少50%的抗血清稀释度的倒数。第0周正常小鼠血清的BC50效价<10
下表XIV显示，当混合并测定杀菌活性时对rLP2086和rPorA的抗血清是互补的。
表XIV
疫苗接种步骤:在第0周和第4周用10μgrLP2086-8529/20μgQS-21或15μgrPorA/100μgMPL免疫6-8周龄雌性Swiss-Webster小鼠。在第6周放血并进行数据分析。
a杀菌(BC50)效价表示为可使活细胞计数减少50%的抗血清稀释度的倒数。第0周正常小鼠血清的BC50效价<10
下表XV显示rLP2086亚科和两种rPorAs的混合物在小鼠中引发杀菌抗体。
表XV
疫苗接种步骤:在第0周和第4周用10μg各蛋白质+20μgQS-21免疫6-8周龄雌性Swiss-Webster小鼠。在第6周放血并进行数据分析。
a杀菌(BC50)效价表示为可使活细胞计数减少50%的抗血清稀释度的倒数。第0周正常小鼠血清的BC50效价<10
bSfA-亚科A，SfB-亚科B
c相关单价对照:rLP2086-8529、rLP2086-2996、rP1.5-1,2-2或rP1.22-1,14-1抗血清
下面总结了上述研究的结果。抗-rLP2086抗血清对13/16测试菌株是杀菌的。11种表达不同血清亚型的菌株被抗-P2086血清杀死。抗-rLP2086血清的杀菌活性与抗-rPorA血清互补。P2086和PorA的混合物在小鼠中引发互补的杀菌抗体。差示洗涤剂吸取、纯化和免疫与抗许多菌株的功能抗体测定结合可用来鉴定新的疫苗候选物。P2086被鉴定为可引发抗P2086和rPorA异源菌株的杀菌抗体。因此，蛋白质的2086家族在单独或与其它奈瑟氏球菌属抗原联合时都是有用的疫苗。
实施例9
根据上述实施例。通过PCR筛选了不同血清组的其它脑膜炎球菌菌株以了解ORF2086基因的存在情况。最后筛选出100种脑膜炎球菌菌株。下面描述了该研究和所有的结果。这些结果补充了上述实施例的数据。
两组对C-末端可变区特异的内部PCR引物被用来区别亚科A和B的基因序列。存在约350bp的PCR扩增产物说明2086基因序列在染色体中存在。所有菌株产生预期大小的单一PCR产物。55种全长ORF2086基因的核苷酸序列被测定、对比(DNAStarMegAlign)并用来产生系统树(参见图12)。
这些2086基因中的9种作为rLP2086脂蛋白在pBAD阿拉伯糖可诱导启动子系统中重组表达，这些基因中的3种作为rP2086非脂质化的蛋白质在IPTG可诱导的pET系统中重组表达。在大肠杆菌B中表达这些重组蛋白。纯化的重组蛋白被用来免疫小鼠，并测定小鼠抗血清的血清IgG效价和它对多种异源脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。
从完整脑膜炎球菌性细胞、纯化的染色体DNA或质粒DNA模板之一的PCR扩增ORF2086。
将9种ORF2086基因克隆入pLP339载体，该载体将嗜血杆菌P4前导序列融合到ORF2086基因的5'末端。大肠杆菌菌株BLR被用作宿主菌株以从pBAD/ORF2086克隆重组表达rP2086的脂质化形式(参见图10A)。pBAD阿拉伯糖可诱导启动子驱动P4信号/ORF2086融合蛋白表达rP2086的脂质化形式。三种缺乏信号序列的P2086基因被克隆入pET9载体在高度活化的T7噬菌体启动子的后面。大肠杆菌菌株BL21(DE3)被用作宿主菌株以从pET9a/ORF2086克隆重组表达ORF2086的非脂质化形式(参见图10B)。在加入IPTG控制lacUV5启动子的情况下大肠杆菌菌株BL21中的DE3溶源体可被诱导表达T7RNA聚合酶。参见WCE；FEMSMicro.Lett.，48(1987)367-371和BCA；J.Clin.Microbiol.，38(2000)2878-2884。
基因ORF2086从55种不同的脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中被克隆和测序。其核苷酸序列被对比(DNAStarMegAlign)并用来产生系统树(参见图12)。该系统树揭示了ORF2086基因核苷酸序列的两个不同的亚科。基因的这两个亚科在其5'末端是类似的，但在其3'末端附近变化很大。尽管似乎有显著的变异性，但该基因的某些关键区域在不同菌株中是高度同源的。这些保守性区域可为蛋白质提供功能连续性并可能有待开发作为疫苗靶点的交叉保护性表位的征兆。
从一些血清组B脑膜炎球菌菌株克隆2086基因并在有和没有脂质化信号序列时表达。参考图11A和11B，凝胶照片显示了表达r2086蛋白的大肠杆菌B的全细胞裂解物。与T7-Tag融合的非脂质化形式以最高水平表达。T7-Tag序列可为mRNA提供稳定性并显著提高翻译的多肽水平。这种融合蛋白似乎沉积在包涵体中并可用已知的方法简单地纯化和重折叠。P2086的脂质化和非脂质化形式以约占总细胞蛋白质的5-8%的水平表达，T7-Tag融合体除外，它以约50%总蛋白质的水平表达rP2086。蛋白质的非脂质化形式似乎是可溶的并定位在胞质中。蛋白质的脂质化形式似乎与膜组分有关并被洗涤剂溶解。
脑膜炎奈瑟氏球菌B菌株8529的重组脂质化的2086蛋白一贯地引发大于非脂质化形式的血清IgG效价(参见下表XVI)，这与增强的对同源和异源脑膜炎球菌菌株的杀菌活性水平有关(参见下表XVII)。天然脂质化形式的蛋白质可有高级的三级结构以进行抗原呈递和/或附着的脂质可作为刺激较大免疫原性应答的佐剂。
表XVI
第6周由WCE引发的免疫应答，采用8529rP2086(非脂质化)和
8529rLP2086(脂质化)进行比较
表XVII
8529rP2086引发的杀菌活性弱于8529rLP2086
下面总结了研究结果。所有被测脑膜炎奈瑟氏球菌B菌株似乎都含有一种2086样的基因。至少代表2086基因的两个家族:亚科A—约占菌株的30%和亚科B—约占菌株的70%。2086基因从55种脑膜炎奈瑟氏球菌菌株中被克隆和测序。亚科A的序列在DNA水平上约86-100%相同。亚科B的序列在DNA水平上约89.5-100%相同。亚科a内的序列与亚科b比较在DNA水平上约60.9%-74%相同。通过PCR筛选鉴定了以下菌株中的2086同源物:
脑膜炎奈瑟氏球菌A、B、C、W135、Y
乳糖奈瑟氏球菌
淋病奈瑟氏球菌FA1090
一些ORF2086基因被克隆和重组表达
从9种脑膜炎球菌菌株表达P2086的脂质化形式。
这些重组蛋白已纯化并用来接种小鼠。
所得抗血清是杀菌的。
从上述9种菌株中的3种表达了P2086的非脂质化形式。
rLP2086一贯地引发大于rP2086的免疫应答。
rLP2086还可增强对同源和异源脑膜炎球菌菌株的杀菌活性。
实施例10
下表XVIII和XIX显示了这两个亚科成员的变异体的特性鉴定。
表XVIII
亚科ArLP2086变异体—特性鉴定
表XIX
亚科BrLP2086变异体—特性鉴定
下表XX提供了2086亚科a的荧光血清杀菌测定的结果。
表XX
备注:
*百分比说明1:800稀释时％BC活性。
**阳性对照不存在。
-未测试的血清
实施例11
下面进一步证实P2086在奈瑟氏球菌属菌株中表达，并提供了P2086在一些菌株中表达的特定例子。
将用平板培养物的细胞制备的细胞裂解物重悬于SDS样品缓冲液并在98°C加热4分钟。在10-20%预制凝胶(ICN)上加样，每个孔中约有30-50μg总蛋白质，并在175V跑电泳。将凝胶转移到硝基纤维素膜，然后在Tris-缓冲盐水(Blotto)中加入5%奶粉，用它将膜封阻30分钟。采用的第一抗体是在小鼠中抗单个rLP2086变异体的多克隆抗血清库。
参考图17和18，Western印迹显示了rLP2086鼠抗血清对P2086亚科A和B的全细胞裂解物的反应性。对于亚科A的细胞裂解物印迹，用rLP2086-250771将抗rLP2086-2996、-870446和-250771的抗血清以1/500稀释在Blotto中，其它抗血清以1/1000稀释在Blotto中。对于亚科B的细胞裂解物印迹，所用抗血清抗rLP2086-8529(以1/1000稀释在Blotto中)、-CDC1573、-M982和-880049(这三种以1/500稀释在Blotto中)。将第一抗血清和印迹在4°C培养过夜。洗涤印迹，羊-抗-鼠AP2第二以1/500加入Blotto，并将印迹在室温培育30分钟。洗涤后，用BCIP/NBT膜磷酸酶底物系统(KPL)显现印迹。
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本文以上引用的参考文献在下面列出，并全文纳入以供参考：
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Claims (28)

1.一种组合物，该组合物含有至少一种蛋白质，其中，所述至少一种蛋白质由SEQIDNO:248、250和252中任一所示的氨基酸序列组成。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质由SEQIDNO：247、249和251中任一所示的多核苷酸序列编码。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质由SEQIDNO:248所示的氨基酸序列组成。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质由SEQIDNO:250所示的氨基酸序列组成。
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质由SEQIDNO:252所示的氨基酸序列组成。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质是脂质化的或非脂质化的。
7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质是重组蛋白质。
8.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质是非病原的。
9.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述至少一种蛋白质分离自天然的奈瑟氏球菌。
10.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还包含药学上可接受的缓冲剂、稀释剂、佐剂或载体。
11.如权利要求10所述的组合物，其特征在于，所述佐剂是氢氧化铝或磷酸铝。
12.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有磷酸铝佐剂。
13.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有其它活性免疫原。
14.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有其它奈瑟氏球菌属免疫原性多肽。
15.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有至少一种氨基酸序列选自SEQIDNO:56、58或60的蛋白质。
16.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有至少一种氨基酸序列为任一偶数编号的SEQIDNOS:176-246的蛋白质。
17.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述组合物还含有多糖。
18.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸编码SEQIDNO:248、250和252中任一所示的氨基酸序列。
19.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸由SEQIDNO:247、249或251所示的核苷酸序列组成。
20.一种组合物，该组合物含有至少一种权利要求18所述的多核苷酸。
21.如权利要求20所述的组合物，其特征在于，所述至少一种多核苷酸由SEQIDNO:247、249和251中任一所示的核酸序列组成。
22.一种组合物，该组合物含有至少一种抗体，所述抗体与由SEQIDNO:248、250和252中的任一所示的氨基酸序列组成的蛋白质免疫特异性结合。
23.一种载体，该载体含有具有启动子序列和起始密码子序列的表达控制序列以及编码SEQIDNO:248、250和252中的任一多肽的核苷酸序列，所述核苷酸序列位于3’至启动子和起始密码子序列。
24.一种宿主细胞，该细胞含有权利要求23所述的载体。
25.一种转化的、转染的或感染的细胞系，含有表达一种核酸序列的重组细胞，所述核酸序列编码至少一种由SEQIDNO:248、250和252中的任一所示的氨基酸序列组成的多肽。
26.一种制备组合物的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达编码至少一种蛋白质的核酸序列，所述至少一种蛋白质由SEQIDNO:248、250和252中的任一所示的氨基酸序列组成。
27.权利要求1－17和20-22中任一项所述的组合物或权利要求18或19所述的多核苷酸，用作药物。
28.权利要求1－17和20-22中任一项所述的组合物或权利要求18或19所述的多核苷酸在制备在哺乳动物中诱导免疫应答或减轻或预防人中脑膜炎奈瑟氏球菌引起的感染的药物中的用途。
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