MXPA04003356A

MXPA04003356A - Composiciones inmunogenicas novedosas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica.

Info

Publication number: MXPA04003356A
Application number: MXPA04003356A
Authority: MX
Inventors: J Metcalf Benjamin
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2001-10-11
Filing date: 2002-10-11
Publication date: 2004-11-29
Also published as: EP2371838B1; LU92786I2; AU2009213040C1; DK2351767T3; LUC00041I2; DK2371838T3; CN102755631B; US20190151431A1; EP2343308A3; JP5923070B2; JP5404441B2; EP2343308B1; KR20110117726A; PT2341062T; US20110076299A1; IL245955A0; FR17C1042I2; US11116829B2; US9107873B2; JP5997400B2

Abstract

La presente invencion se relaciona a proteinas ORF2086 de Neisseria, proteinas inmunogenicas reactivas cruzadas que pueden ser aisladas de cepas nesseriales o preparadas recombinantemente, incluyendo porciones inmunogenicas de las mismas, equivalentes biologicos de las mismas, anticuerpos que inmunoespecificamente enlazan a lo anterior y secuencias de acidos nucleicos que codifican cada uno de lo anterior, asi como el uso de las mismas en composiciones inmunogenicas que son efectivas contra la infeccion causada por el serogrupo B de Neisseria meningitidis.

Description

COMPOSICIONES INMUNOGENICAS NOVEDOSAS PARA LA PREVENCION Y TRATAMIENTO DE ENFERMEDAD MENINGOCOCICA Campo de la Invención La presente invención se relaciona a proteinas ORF2086 de Neisseria (Subfamilia A y Subfamilia B) , que pueden ser aisladas de cepas bacterianas tales como aquellas de Neisseria species, incluyendo cepas de Neisseria meningitídis (serogrupos A, B, C, D, -135, X, Y, Z y 29E), Neisseria gonorrhoeae y Neisseria lactamica, asi como porciones inmunogénicas y/o equivalentes biológicos de las proteínas. La presente invención también se relaciona a anticuerpos que enlazan 'inmunoespecificamente a las proteínas, porciones inmunogénicas y/o equivalentes biológicos. Además, la presente invención se relaciona a polinucleótidos aislados que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de las proteínas anteriores, porciones inmunogénicas, equivalentes biológicos y/o anticuerpos. Adicionalmente, la presente invención se relaciona a composiciones inmunogénicas y a su uso en la prevención, tratamiento y/o diagnosis de la infección meningocócica causada por N. meningitídis, y en .particular la enfermedad meningocócica causada por el serogrupo B de N. meningitídis, así como métodos para preparar las composiciones. Esta invención se relaciona a tanto formas recombinantes como formas aisladas de una fuente natural, asi como formas tanto lipidadas como no lipidadas . Antecedentes de la Invención La meningitis meningocócica es una enfermedad devastadora que puede matar niños y adultos jóvenes dentro de horas a pesar de la disponibilidad de antibióticos. Pizza y colaboradores, 2000, Science 287:1816-1820. La meningitis es caracterizada como una inflamación de las meninges que da por resultado un dolor de cabeza intenso, fiebre, pérdida de apetito, intolerancia a la luz y al sonido, rigidez de los músculos, especialmente en el cuello y en varios casos convulsiones, vómito y delirio que conduce a la muerte. Los síntomas de la meningitis meningocócica aparecen repentinamente y culminan en la septicemia meningocócica con su supuración hemorrágica característica. Una diagnosis rápida y tratamiento inmediato con dosis grandes de antibióticos es critico si eso es de alguna oportunidad de supervivencia. 2000. Bantam Medical Dictionary. Third Edition 302. La meningitis meningocócica es causada por Neisseria meningitidis (el meningococo) , una bacteria encapsulada, Gram-negativa que se ha clasificado en varios serogrupos patogénicos incluyendo A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E. Las cepas del serogrupo B de N. meningitidis son una causa mayor de la enfermedad meningocócica por todo el mundo.

Por ejemplo, se reporta en la literatura médica que el serogrupo B es responsable por aproximadamente 50% de la meningitis bacteriana en infantes y en niños que residen en los Estados Unidos y Europa. Ninguna vacuna actualmente existe para prevenir la enfermedad meningocócica causada por el serogrupo B de N. meningitídis. El desarrollo de una composición inmunogénica pare, la prevención de la enfermedad meningocócica del serogrupo B ha sido un reto para los investigadores desde el trabajo de Goldschneider y colaboradores de hace aproximadamente treinta años. Goldschneider y colaboradores, 1969, J. Exp. Med 129 (6) : 1307-26; Goldschneider y colaboradores, 1969, J. Exp. Med 129 (6) :1327-48; Gotschlich y colaboradores, 1969, J. Exp. Med. 129 (6) :1385-95; y Gotschlich y colaboradores, 1969, J. Exp. Med 129 (6) :1367-84. Distinta a la enfermedad del serogrupo A, que virtualmente desapareció de Norteamérica después de la II Guerra Mundial, Achtman, M. , 1995, Trends in Microbiology 3(5):186-92, la enfermedad causada por los organismos del serogrupo B y C permanece endémica por la gran mayoría del mundo económicamente desarrollado. La incidencia de la enfermedad varia de <1/100,000 donde la enfermedad endémica es rara a 200/100,000 en poblaciones de alto riesgo durante epidemia. Las vacunas basadas en conjugados de polisacárido han sido desarrolladas contra los serogrupos A y C de N. meningi tidis y aparecen para ser efectivas en la prevención de la enfermedad. Actualmente, una composición inmunogénica hecha de polisacárido capsular de los serogrupos A, C, Y, & W-135 está disponible. Ambrosch y colaboradores, 1983, Immunogenicity and side-effects of a new tetravalent. Bulletin of the World Health Organization 61 (2) :317-23. Sin embargo, esta composición inmunogénica produce una respuesta inmune independiente de las células T, no es efectiva en jóvenes y no proporciona cobertura para las cepas del serogrupo B, que causan más de 50% de la enfermedad meningocócica . Otros también han intentado desarrollar composiciones inmunogénicas usando polisacáridos capsulares. Recientemente, las composiciones inmunogénicas para la enfermedad del serogrupo C, preparadas al conjugar el material capsular de serogrupo C con proteínas, han sido autorizadas para el uso en Europa. Sin embargo, la cápsula del serogrupo B puede ser inadecuada como un candidato de vacuna debido a que el polisacárido capsular está compuesto de ácido polisiálico que lleva una similitud a las porciones de carbohidrato en los tejidos neurales humanos en desarrollo. Esta porción de azúcar es reconocida como un autoantigeno y asi es pobremente inmunogénica en humanos. Las proteínas de membrana externa (OMP's) han sido desarrolladas como antigenos de vacuna alternativos para la enfermedad del serogrupo B. El anticuerpo monoclonal que enlaza a las dos regiones variables de PorA define el esquema de serosubtipo para los meningococos . Las proteinas PorA asi sirven como los antigenos de serosubtipo (Abdillahi y colaboradores, 1988, Microbial Pathogenesis 4(l):27-32) para las cepas meningocócicas y están siendo activamente investigados como componentes de una composición inmunogénica del serogrupo B (Poolman, 1996, Acfv. Exp. Med. Bíol. 397:73-7), puesto que ellas pueden producir anticuerpos bactericidas (Saukkonen, 1987, Microbial Pathogenesis 3(4):261-7). Los anticuerpos bactericidas se piensa que son un indicador "de la protección y cualquier nueva composición inmunogénica candidata debe producir estos anticuerpos funcionales. Los estudios en humanos asi como en animales indican que el antigeno de serosubtipo, PorA, produce anticuerpos bactericidas. Sin embargo, la respuesta inmune a PorA es generalmente especifica del serosubtipo. En particular, los datos del serosubtipo indican que una composición inmunogénica hecha de PorAs puede requerir una PorA para cada serosubtipo para ser cubierta por tal composición inmunogénica, quizás tantos como seis a nueve. Por lo tanto, 6-9 PorAs serán necesarios para cubrir 70-80% de las cepas del serogrupo B. Asi, la naturaleza variable de esta proteina requiere una composición de vacuna multivalente para proteger contra un número suficiente de aislados clínicos de serosubtipo meningocócico . El desarrollo de una composición inmunogénica para meningococos del serogrupo B ha sido tan difícil que recientemente varios grupos han secuenciado los genomas de las cepas que representan ambos serogrupos A y B para ayudar a identificar nuevos candidatos de composición inmunogénica. Tettelin, 2000, Science, 287 (5459) :1809-15; Pizza y colaboradores, 2000, Science 287:1816-1820. La identificación de nuevos candidatos de composición inmunogénica, aún con el conocimiento del genoma neisserial, es un proceso desafiante para el cual actualmente no existen algoritmos matemáticos adecuados. De hecho, un reporte reciente indica que a pesar de la identificación de cientos de estructuras de lectura abierta ("ORFs") que contienen dominios de extensión de membrana teóricos, los problemas con la expresión, purificación y la inducción reactiva de superficie y los anticuerpos funcionalmente activos han conducido a los investigadores a solamente siete candidatos para una composición inmunogénica meningocócica del serogrupo B. Ver Id. Una de estas fue previamente conocida. Por consiguiente, aun permanece una necesidad por composiciones inmunogénicas que (1) produzcan anticuerpos bactericidas para múltiples cepas neisseriales; (2) reaccionen con la superficie de múltiples cepas; (3) confieran protección pasiva contra una estimulación viva y/o (4) prevengan la colonización. Breve Descripción da la Invención Para cumplir con estas y otras necesidades, y en vista de sus propósitos, la presente invención proporciona proteínas ORF2086 de Neisseria ("proteínas 2086"), incluyendo proteínas 2086 de la Subfamilia A y proteínas 2086 de la Subfamilia B. Cada una de las proteínas 2086 son proteínas que pueden ser aisladas de cepas neisseriales nativas, incluyendo cepas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E), Neisseria gonorrhoeae y Neisseria lacta ica. Las proteínas 2086 también se pueden preparar usando la tecnología recombinante . En particular, la presente invención proporciona las proteínas 2086, porciones inmunogénicas de las mismas, y/o equivalentes biológicos de las mismas, anticuerpos que inmunoespecíficamente enlazan a cualquiera de lo anterior y polinucleótidos que comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de lo anterior. La presente invención incluye composiciones, composiciones inmunogénicas y su uso en la prevención, tratamiento y/o diagnosis de la infección meningocócica, y en particular la enfermedad meningocócica causada por N. meningitidis, así como métodos para preparar las composiciones. Las proteínas 2086 en la presente incluyen formas recombinantes y formas aisladas de una fuente natural, así como formas tanto lipidadas como no lipidadas . La presente invención inesperadamente y de manera ventajosa proporciona composiciones que (1) producen anticuerpos bactericidas a múltiples cepas neisseriales, tales como las cepas de N. meningitidis, N. Gonorrhoeae y/o N. lacta ica; (2) reaccionan con la superficie de múltiple.-cepas; (3) confieren protección pasiva contra una estimulación viva; y/o (4) previenen la colonización, así como métodos para usar las composiciones y métodos para preparar las composiciones. Varias modalidades de la invención se describen en lo siguiente. Breve Descripción de los Di-bujos La FIG. 1A representa un gel SDS-PAGE que representa las dos proteínas mayores de las fracciones de proteína obtenidas de los experimentos para identificar el extracto de proteína de membrana neisserial que es capaz de producir anticuerpos bactericidas contra cepas heterólogas. La FIG. IB representa los resultados de los experimentos de la identificación de las dos proteínas mayores mediante el análisis de los componentes TMAE Flow Through mediante la digestión de proteasa y la secuenciación N-terminal de Fase inversa. La FIG. 2 representa el esquema de purificación y la homogeneidad como es determinado por SDS-PAGE de rLP2086.

La FIG. 3 representa los resultados de los experimentos de la identificación de las dos proteínas mayores y una proteina menor mediante el análisis de los componentes de TMAE Flow Through mediante LC-MS/MS y el SDS-PAGE correspondiente. La FIG. 4 es un gel SDS-PAGE de la expresión recombinante de la proteina 2086. La FIG. 5 es un diagrama esquemático del plásmido pPX73 0, como es descrito en los ejemplos en la presente La FIG. 6 es un diagrama esquemático del plásmido PPX7328, como es descrito en los ejemplos en la presente La FIG. 7 es un diagrama esquemático del plásmido PPX743, como es descrito en los ejemplos en la presente La FIG. 8 ilustra regiones N-terminales del gen 2086 de varias cepas. La FIG. 9A es un diagrama de flujo que muestra las etapas preliminares en la identificación de un componente inmunogénico en una cepa nesserial. La FIG. 9B es un diagrama de flujo que muestra las etapas finales en la identificación de un componente inmunogénico en una cepa nesserial. La FIG. 10A es un diagrama esquemático del promotor inducible de arabinosa pBAD que induce la expresión de la señal P4/proteina de fusión ORF2086 para expresar una forma lipidada de rP2086 como es descrito en los ejemplos en la presente . La FIG. 10B es un diagrama esquemático del vector pET9a-T7 para la expresión recombinante de la forma no lipidada de ORF2086. La FIG. 11A es una fotografía que representa los Usados de célula completa de E. coli B que expresan la proteina rLP2086. La FIG. 11B es una fotografía que representa los lisados de célula completa de E. coli B que expresan la proteina rP2086. La FIG. 12 es un árbol filogenético que muestra la organización de las subfamilias y grupos de proteínas ORF2086. La FIG. 13 es una ilustración gráfica de los datos de ELISA de célula completa para los antisueros de la Subfamilia A de rLP2086. La FIG. 14 es una ilustración gráfica de los datos de ELISA de célula completa para los antisueros de la Subfamilia B de rLP2086. La FIG. 15 es una ilustración gráfica de los resultados del estudio de mezclado de rLP2086 - WCE Titers.

La FIG. 16 es una ilustración gráfica de los resultados del estudio de mezclado de rLP2086/rPorA - WCE Titers . La FIG. 17 es una Mancha de Western que muestra la reactividad de los antisueros de ratón rLP2086 a los Usados de célula completa de N. meningitidis de la Subfamilia B de P2086. La FIG. 18 es una Mancha de Western que muestra la reactividad en los antisueros de ratón rLP2086 a los lisados de célula completa de N. meningitidis y N. lactamica de la Subfamilia A de P2086. Breve Descripción de las Secuencias SEQ ID NOS. Para Secuencias Estudiadas: SEQ ID NO:l secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L3 6275 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 2 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L3 6275 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 3 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de L3 6275 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 4 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L3 6275 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 5 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L3 6275. SEQ ID NO: 6 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L3 6275. SEQ ID NO: 7 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC2369 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 8 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC2369 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 9 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de CDC2369 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 10 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC2369 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 11 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC2369. SEQ ID NO: 12 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC2369. SEQ ID NO: 13 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1034 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 14 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1034 preparada usando una secuencia gui¿ nativa . SEQ ID NO: 15 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de CDC1034 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 16 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1034 preparada usando una secuencia guía P4. SEQ ID NO: 17 secuencia de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1034. SEQ ID NO: 18 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1034. SEQ ID NO: 19 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L4891 cuando se combina con una secuencia guía nativa . SEQ ID NO: 20 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa L4 891 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 21 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de L4 891 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 22 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L4 891 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO:23 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L4 891. SEQ ID NO: 24 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L4 891. SEQ ID NO:25 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa B16B6 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO:26 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa B16B6 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO:27 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de B16B6 cuando se combina con una secuencia guia P4.

SEQ ID NO: 28 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa B16B6 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 29 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa B16B6. SEQ ID NO: 30 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa B16B6. SEQ ID NO: 31 secuencia de ácidos nucleicos que modifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa W135 (ATCC35559) cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 32 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa W135 {ATCC35559) preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 33 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de W135 (ATCC35559) cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 34 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa W135 (ATCC35559) preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 35 secuencia de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa W135 (ATCC35559) .

SEQ ID NO: 36 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 135 (ATCC35559) . SEQ ID NO: 37 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa Cll cuando se combina con una secuencia guia nativa.

SEQ ID NO: 38 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa Cll preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 39 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de Cll cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 0 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa Cll preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 41 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa Cll. SEQ ID NO: 42 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa Cll. SEQ ID NO: 43 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa (ATCC3556) cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 44 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa Y (ATCC35561) preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 5 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de Y (ATCC35561) cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 6 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa Y (ATCC35561) preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 47 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa Y (ATCC35561) . SEQ ID NO: 8 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa Y (ATCC35561) . SEQ ID NO: 49 secuencia de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250732 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 50 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250732 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 51 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la M98 250732 cuando se combina con una secuencia guia P .

SEQ ID NO: 52 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250732 preparada usando una secuencia guia P . SEQ ID NO: 53 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250732. SEQ ID NO: 54 secuencia de aminoácidos para la proteina 208( madura de la cepa M98 250732. SEQ ID NO: 55 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250771 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 56 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98250771 preparada usando una secuencic guia nativa. SEQ ID NO: 57 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de M98 250771 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 58 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250771 preparada usando una secuencia guia P . SEQ ID NO: 59 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 98 250771.

SEQ ID NO: 60 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250771. SEQ ID NO: 61 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 cuando se combina con una secuencia guía nativa. SEQ ID NO: 62 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando una secuencia guía nativa. SEQ ID NO: 63 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de CDC1135 cuando se combina con una secuencia guía P4. SEQ ID NO: 64 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando una secuencia guía P4. SEQ ID NO: 65 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135. SEQ ID NO: 66 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1135. SEQ ID NO: 67 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M97 252153 cuando se combina con una secuencia guía nativa .

SEQ ID NO: 68 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 69 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de M97 252153 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 70 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97252153 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 71 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252153. SEQ ID NO: 72 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252153. SEQ ID NO: 73 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1610 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 74 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 75 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la CDC1610 cuando se combina con una secuencia guia P4.

SEQ ID NO: 76 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 77 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1610 SEQ ID NO: 78 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1610. SEQ ID NO: 79 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492 cuando se combina con una secuencia guía nativa . SEQ ID NO: 80 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492 preparada usando una secuencia guía nativa. SEQ ID NO: 81 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la CDC1492 cuando se combina con una secuencia guía P . SEQ ID NO:82 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492 preparada usando una secuencia guía P4. SEQ ID NO: 83 secuencia de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1492.

SEQ ID NO: 84 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1492. SEQ ID NO: 85 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L8 M978 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 86 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 87 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la L8 M978 cuando se combina con una secuencia guia P . SEQ ID NO: 88 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 89 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L8 M978. SEQ ID NO: 90 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L8 M978. SEQ ID NO: 91 secuencia de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252988 cuando se combina con una secuencia guia nativa .

SEQ ID NO: 92 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 93 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la M97 252988 cuando se combina con una secuencia nativa P . SEQ ID NO: 94 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada usando una secuencia guia 24. SEQ ID NO: 95 secuencia de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO: 96 secuencia de aminoácidos para la proteina 208(^ madura de la cepa M97 252988. SEQ ID NO: 97 secuencia de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252697 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 98 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252697 preparado usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 99 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252697 cuando se combina con una secuencia guia P . SEQ ID NO: 100 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252697 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 101 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252697 SEQ ID NO: 102 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252697. SEQ ID NO: 103 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6557 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 104 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 105 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la 6557 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 106 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 107 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6557.

SEQ ID NO: 108 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6557. SEQ ID NO: 109 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 2996 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 110 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 2996 preparara usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 111 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la 2996 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 112 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura d<; la cepa 2996 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 113 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 2996. SEQ ID NO: 114 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 2996. SEQ ID NO: 115 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 97 252976 cuando se combina con una secuencia guia nativa .

SEQ ID NO: 116 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252976 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 117 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la M97 252976 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 118 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252976 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 119 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252976. SEQ ID NO: 120 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 252976. SEQ ID NO: 121 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 251854 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 122 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 251854 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 123 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la M97 251854 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 124 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 251854 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 125 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 251854. SEQ ID NO: 126 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 251854. SEQ ID NO: 127 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1521 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 128 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1521 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 129 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la CDC1521 cuando se combina con una secuencia guia P . SEQ ID NO: 130 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1521 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 131 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1521.

SEQ ID NO: 132 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1521. SEQ ID NO: 133 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250622 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 134 secuencia de aminoácidos para la proteina 208ó madura de la cepa M98 250622 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 135 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la M98 250622 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 136 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 137 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250622. SEQ ID NO: 138 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250622. SEQ ID NO: 139 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 870446 cuando se combina con una secuencia guia nativa .

SEQ ID NO: 140 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 1 1 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la 870446 cuando se combina con una secuencia guia P . SEQ ID NO: 142 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 143 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 870446. SEQ ID NO: 144 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 870446. SEQ ID NO: 145 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97253248 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 146 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada usando una secuencia guía nativa. SEQ ID NO: 147 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la M97 253248 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 148 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada usando una secuencia guia P . SEQ ID NO: 149 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 253248. SEQ ID NO: 150 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 253248. SEQ ID NO: 151 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250809 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 152 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 153 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la M98 250809 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 154 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 155 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250809. SEQ ID NO: 156 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250809. SEQ ID NO: 157 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L5 M981 cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 158 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 159 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la L5 M981 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 160 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 161 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L5 M981. SEQ ID NO: 162 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa L5 M981. SEQ ID NO: 163 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa NMB cuando se combina con una secuencia guia nativa.

SEQ ID NO: 164 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 165 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la NMB cuando se. combina con una secuencia guia P . SEQ ID NO: 166 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 167 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa NMB. SEQ ID NO: 168 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa NMB. SEQ ID NO: 169 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250572 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 170 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 171 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la M98 250572 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 172 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 173 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250572. SEQ ID NO: 174 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M98 250572. SEQ ID NO: 175 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas A4 Sanford; M97 251836 PART, M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; 97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combinan con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO:176 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas A4 Sanford; M97 251836 PART, M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; 97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830, preparadas usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 177 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas A4 Sanford; M97 251836 PART, M97 251957; 97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830, cuando se combinan con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 178 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas A4 Sanford; M97 251836 PART, M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830, preparadas usando una secuencia guia P . SEQ ID NO: 179 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas A4 Sanford; M97 251836 PART, M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830. SEQ ID NO: 180 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas A4 Sanford; M97 251836 PART, M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830. SEQ ID NO: 181 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteina 2086 madura de la cepa CDC937, cuando se combina con una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 182 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC937, preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 183 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos parcial para la proteina 2086 madura de la CDC937 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 184 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC937 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 185 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteina 2086 madura de la cepa CDC937. SEQ ID NO: 186 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC937. SEQ ID NO: 187 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteina 2086 madura de la cepa M97 25297 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 188 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 25297 preparada usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 189 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos parcial para la proteina 2086 madura de la M97 25297 cuando se combina con una secuencia guia P . SEQ ID NO: 190 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 25297 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 191 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos parcial para la proteina 2086 madura de la cepa 97 25297. SEQ ID NO: 192 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M97 25297. SEQ ID NO: 193 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 870227 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 194 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 195 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la 870227 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 196 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 197 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227. SEQ ID NO:198 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 870227. SEQ ID NO: 199 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 cuando se combina con una secuencia guía nativa. SEQ ID NO: 200 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 preparada usando una secuencia guía nativa . SEQ ID NO: 201 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la H355 cuando se combina con una secuencia guía P4. SEQ ID NO: 202 secuencia de aminoácidos para la proteína 208 S madura de la cepa H355 preparada usando una secuencia guía P4. SEQ ID NO: 203 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355. SEQ ID NO: 204 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H355 SEQ ID NO: 205 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H44_76 cuando se combina con una secuencia guía nativa . SEQ ID NO: 206 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H44_76 preparada usando una secuencia guía nativa. SEQ ID NO: 207 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa H44_76 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 208 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa H44_76. SEQ ID NO: 09 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la H44_76 cuando se combina con una secuencia guia P . SEQ ID NO:210 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa H44_76. SEQ ID NO: 211 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 8529 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 212 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 8529 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO:213 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la 8529 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO:214 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 8529 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO:215 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 8529. SEQ ID NO: 216 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 8529. SEQ ID NO: 217 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6940 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 218 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6940 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 219 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la 6940 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 220 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6940 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 221 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6940. SEQ ID NO: 222 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 6940. SEQ ID NO: 223 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M982 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO.-224 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M982 preparada usando una secuencia guia nativa .

SEQ ID NO: 225 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la M982 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 226 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M982 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 227 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa M982. SEQ ID NO: 228 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 982. SEQ ID NO: 229 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 880049 cuando se combina con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO:230 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 880049 preparada usando una secuencia guia nativa . SEQ ID NO: 231 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la 880049 cuando se combina con una secuencia guia P . SEQ ID NO:232 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 880049 preparada usando una secuencia guia P .

SEQ ID NO: 233 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 880049. SEQ ID NO: 234 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa 880049. SEQ ID NO: 235 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 cuando se combinan con una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 236 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 preparadas usando una secuencia guia nativa. SEQ ID NO: 237 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 cuando se combinan con una secuencia guia P4. SEQ ID NO:238 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 preparadas usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO:239 secuencia de ácidos nucleicos que codifican la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926. SEQ ID NO: 240 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926.

SEQ ID NO: 241 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250670 cuando se combina con una secuencia guía nativa . SEQ ID NO: 242 secuencia de aminoácidos para la proteína 2036 madura de la cepa M98 250670 preparada usando una secuencia guía nativa. SEQ ID NO: 243 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la M98 250670 cuando se combina con una secuencia guía P4. SEQ ID NO: 244 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250670 preparada usando una secuencia guía P . SEQ ID NO: 245 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa 98 250670. SEQ ID NO:246 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa M98 250670. SEQ ID NO: 247 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1573 cuando se combina con una secuencia guía nativa. SEQ ID NO:248 secuencia de aminoácidos para la proteína 2086 madura de la cepa CDC1573 preparada usando una secuencia guía nativa .

SEQ ID NO: 249 secuencia de ácidos nucleicos para la codificación de la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la CDC1573 cuando se combina con una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 250 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1573 preparada usando una secuencia guia P4. SEQ ID NO: 251 secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1573. SEQ ID NO:252 secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 madura de la cepa CDC1573. SEQ ID NO: 253 secuencia de ácido nucleico parcial que codifica la secuencia de aminoácidos para la proteina 2086 de una cepa de Neisseria lectamica. SEQ ID NOS:254 a 259 secuencias de aminoácidos asociadas con las proteinas de la familia de proteínas 2086. SEQ ID NOS:260 a 278 secuencias de aminoácidos asociadas con las proteinas de la Subfamilia A 2086. SEQ ID NOS:279 a 299 secuencias de aminoácidos asociadas con las proteinas de la Subfamilia B 2086. SEQ ID NO: 300 es la secuencia consensual de aminoácidos correspondiente a la familia de proteinas 2086 ("proteinas 2086") de acuerdo con una modalidad de la presente invención.

SEQ ID NO: 301 es la secuencia consensual de aminoácidos correspondiente a la Subfamilia A de proteina 2086 de acuerdo con una modalidad de la presente invención. SEQ ID NO: 302 es la secuencia consensual de aminoácidos correspondiente a la Subfamilia B de proteina 2086 de acuerdo con una modalidad de la presente invención. SEQ ID NO: 303 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador trasero con el sitio de restricción BamHI (Compuesto No. 4623) . SEQ ID NO: 304 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero con el sitio de restricción Ndel (Compuesto No. 4624) . SEQ ID NO: 305 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero (Compuesto No. 4625) . SEQ ID NO: 306 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero (Compuesto No. 5005) . SEQ ID NO: 307 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador trasero (Compuesto No. 5007) . SEQ ID NO: 308 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador trasero con el sitio de restricción BglII (Compuesto No. 5135) . SEQ ID NO: 309 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero con el sitio de restricción BamHI (Compuesto No. 5658) . SEQ ID NO: 310 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador trasero con el sitio de restricción Sphl (Compuesto No. 5660) . SEQ ID NO: 311 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero con el sitio de restricción BamHI (Compuesto No. 6385). SEQ ID NO: 312 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero con los sitios de restricción BglII y Ndel (Compuesto No. 6406) . SEQ ID NO: 313 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero (Compuesto No. 6470) . SEQ ID NO: 314 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador trasero (Compuesto No. 6472) . SEQ ID NO: 315 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero con el sitio de restricción BamHI (Compuesto No. 6473). SEQ ID NO: 316 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero con los sitios de restricción BglII y Ndel (Compuesto No. 6474). SEQ ID NO: 317 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero (Compuesto No. 6495) . SEQ ID NO: 318 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador trasero (Compuesto No. 6496) . SEQ ID NO: 319 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador trasero con el sitio de restricción Sphl (Compuesto No. 6543).

SEQ ID NO: 320 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador trasero con el sitio de restricción BglII (Compuesto No. 6605) . SEQ ID NO: 321 secuencia de ácidos nucleicos para un cebador delantero con los sitios de restricción BglII y Ndel (Compuesto No. 6721) . SEQ ID NO: 322 secuencia de ácidos nucleicos para la secuencia guia P4. · SEQ ID NO: 323 secuencia de ácidos nucleicos para la variante 1 guia 2086 nativa. SEQ ID NO: 324 secuencia de ácidos nucleicos para la variante 2 guía 2086 nativa. SEQ ID NO: 325 secuencia de ácidos nucleicos para la variante 3 guia 2086 nativa. SEQ ID NO: 326 secuencia de ácidos nucleicos para la variante 4 guía 2086 nativa. SEQ ID NO: 327 es la secuencia de aminoácidos de P4431. SEQ ID NO: 328 es la secuencia de aminoácidos de P5163. SEQ ID NO: 329 es una secuencia de aminoácidos de acuerdo con una modalidad de la presente invención Descripción Detallada de la Invención Una nueva clase de antígenos con actividad bactericida funcional cruzada contra el serogrupo B de Neisseria meníngítidis evitaría la necesidad por un procedimiento PorA multivalente para la inmunización contra la infección. Tal antigeno inesperadamente ha sido identificado y es descrito y reivindicado en la presente. La presencia de un antigeno de tal clase primero se observó en una mezcla compleja de proteinas de membrana externa solubles (sOPMs) de una cepa meningocócica . La actividad bactericida de este antigeno fue seguida a través de una serie de etapas de fraccionamiento y purificación de proteina hasta que la mezcla de proteina de interés contuvo solo unas cuantas proteinas. Las proteinas mayores en esta mezcla se identificaron por la secuenciación de aminoácidos N-terminal y el mapeo de péptido. La proteina de interés que muestra actividad bactericida se identificó como la proteina ORF2086, una proteina lipidada (también más específicamente referida como LP2086) . "Proteina ORF2086" se refiere a una proteina codificada por la estructura de lectura abierta 2086 (ORF2086) de Neísseria species. Como es descrito en la presente, los nuevos candidatos de composición inmunogénica basados en la proteina ORF2086 de Neisseria species (también referida como "proteina 2086" u "ORF2086", usados intercambiablemente en la presente, o P2086 para las proteinas no lipidadas y LP2086 para la versión lipidada de las proteinas) aislados de N. meningitidís se identificaron al combinar el fraccionamiento celular, la extracción con detergente diferencial, la purificación de proteina, con la preparación de antisueros, y un ensayo de actividad bactericida utilizando múltiples cepas. Como una alternativa a las composiciones inmunogénicas potenciales y a los diagnósticos descritos en las referencias citadas en lo anterior, esta invención se relaciona a composiciones y métodos para tratar y/o prevenir la infección meningocócica a través del uso de proteínas, porciones inmunogénicas de las mismas y equivalentes biológicos de las mismas, asi como genes que codifican los polipéptidos, porciones y equivalentes, y anticuerpos que inmunoespecificamente enlazan a las mismas - De acuerdo con una modalidad de la presente invención, los agentes inmunogénicos basados en la proteina 2086, incluyendo polipéptidos aislados, porciones inmunogénicas de los mismos y/o equivalentes biológicos de los mismos fueron inesperadamente identificados como candidatos inmunogénicos basados en la habilidad de los agentes para mostrar reactividad cruzada o especificidad no de la cepa. En particular, se identificaron candidatos que inesperadamente demuestran la habilidad para (1) producir anticuerpos bactericidas a múltiples cepas neisseriales y/o gonocócicas; (2) reaccionar con la superficie de múltiples cepas; (3) conferir protección pasiva contra una estimulación viva: y/o (4) prevenir la colonización. Por consiguiente, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden los agentes inmunogénicos, incluyendo polipéptidos aislados, porciones inmunogénicas de los mismos y/o equivalentes biológicos de los mismos, asi como métodos para usar los mismos contra la infección por N. meningitidis . (Ver el Ejemplo 1 en la presente para la metodología usada en la identificación de la proteina 2086) . Como se utiliza en la presente, el término "especifico no de la cepa" se refiere a la característica de un antigeno para producir una respuesta inmune efectiva contra más de una cepa de N. meningitidis (por ejemplo, cepas meningocócicas heterólogas) . El término "reactivo cruzado" como se utiliza en la presente se usa intercambiablemente con el término "especifico no de la cepa". El término "antigeno de N. meningitidis especifico no de la cepa inmunogénico" como se utiliza en la presente, describe un antigeno que puede ser aislado de N. meningitidis, aunque también puede ser aislado de otra bacteria (por ejemplo, otras cepas neisseriales, tales como cepas gonocócicas, por ejemplo) o preparado usando tecnología recombinante . Las proteínas 2086 de la presente invención incluyen proteínas lipidadas y no lipidadas. Además, la presente invención también contempla el uso de las proteínas inmaduras o preproteínas que corresponden a cada proteína como compuestos/composiciones intermediarias. La presente invención también proporciona anticuerpos que enlazan inmunoespecíficamente a los agentes inmunogénicos anteriores, de acuerdo con las implementaciones de la invención. Además, la presente invención se relaciona a polinucleótidos aislados que comprenden secuencia de ácidos nucleicos que codifican cualquiera de lo anterior. Adicionalmente, la presente invención proporciona composiciones y/o composiciones inmunogénicas y su uso en la prevención, tratamiento y/o diagnosis de la meningitis meningocócica, en particular la enfermedad meningocócica del serogrupo B, asi como métodos para preparar las composiciones. Las composiciones de la presente invención se han mostrado que son altamente inmunogénicas y capaces de inducir la producción de anticuerpos bactericidas. Estos anticuerpos son reactivos cruzados a la cepas meningocócicas heterólogas del serogrupo, serotipo y serosubtipo. Por consiguiente, las presentes composiciones superan las deficiencias de los intentos previos de vacuna de N. meningitidis al mostrar la capacidad para producir anticuerpos bactericidas para las cepas neisseriales heterólogas. Asi, entre otras ventajas, la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que pueden ser compuestas con menos componentes para producir protección comparable con los agentes previamente usados. Las composiciones o agentes inmunogénicos en las mismas (por ejemplo, polipéptidos, porciones inmunogénicas o fragmentos, y equivalentes biológicos, etc. sin limitación) pueden ser usadas solas o en combinación con otros antigenos o agentes que producen protección inmunológica de la infección y enfermedad meningocócica, asi como para producir protección inmunológica de la infección y/o enfermedad causada por otros patógenos. Esto simplifica el diseño de una composición inmunogénica para el uso contra la infección meningocócica al reducir el número de antigenos requeridos para la protección contra múltiples cepas. De hecho, la proteina 2086 purificada notablemente e inesperadamente reducirá el número de proteínas requeridas para proporcionar cobertura inmunogénica adecuada de las cepas responsables de la enfermedad meningocócica. La proteina 2086 puede ser recombinantemente expresada en E. coli como una lipoproteina, que es la forma de tipo silvestre de la proteina, a niveles mucho más altos que en los meningococos nativos. Debido a que los anticuerpos dirigidos contra la proteina 2086 de una sola cepa se encontraron que matan las cepas no relacionadas (es decir, heterólogas) , se hizo el intento para caracterizar un número grande de cepas heterólogas para la presencia de un "homólogo 2086", y para determinar el nivel de la conservación de secuencia. Mientras que aproximadamente 70% de las cepas probadas por PCR tuvieron homólogos 2086 que podrían ser amplificados usando los cebadores que amplificaron el gen 2086 original de la cepa 8529, el restante aproximadamente 30% fueron negativos por esta prueba. Estos restantes aproximadamente 30% se encontraron que contienen un homólogo 2086 que tiene sólo aproximadamente 60% de homología de secuencia de aminoácidos al gen 2086 derivado de 8529 original. Se identificaron otros cebadores que podrían amplificar un homólogo 2086 de estas aproximadamente 30% de cepas. Las cepas de N. meningitidis probadas se han designado qus pertenecen a la Subfamilia A o Subfamilia B dependiendo de qué conjunto cebador puede amplificar un homólogo 2086. Los detalles de estos experimentos se resumen en el Ejemplo 5 después . La presencia de Tina protelna 2086 en numerosos serosubtipos Para determinar el nivel de conservación de secuencia del gen 2086 entre las cepas N. meningitidis, varios representativos de las Subfamilias A y B se clonaron como genes de longitud completa y se enviaron para el análisis de secuencia de D A. Usando cebadores como es descrito en la presente, ver, por ejemplo, Tabla IV, veinticuatro cepas meningocócicas del serogrupo B se identificaron, lo cual expresa diferentes antigenos de serosubtipo y también expresa una proteina compartida, P2086. Ejemplos de estas secuencias se proporcionan en la presente y se muestran como secuencia de DNA maduras (es decir, todas las secuencias de señal de lipoproteinas se han segmentado en el residuo de cisteina) . Ver, por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par, sin limitación . Aunque la proteína 2086 no está presente en cantidades grandes en las cepas de tipo silvestre, ésta es un objetivo para los anticuerpos bactericidas. Estos anticuerpos, distintos a aquellos producidos en respuesta a las PorAs, son capaces de matar cepas que expresan serosubtipos heterólogos. Los anticuerpos para la proteína 2086 también protegen pasivamente las ratas pequeñas de la estimulación con meningococos . (ver la Tabla VII) . La expresión recombinante de la proteína 2086 permite el uso de la proteína 2086 como una composición inmunogénica para la prevención de la enfermedad meningocócica . Todos los candidatos de composición inmunogénica meningocócica recientes en experimentos químicos han sido mezclas complejas o preparaciones de proteína de membrana externa que contienen muchas proteínas diferentes. La proteína PorA, que proporciona especificidad de serosubtipo, requerirá la inclusión de 6 a 9 variantes en una composición inmunogénica para proporcionar aproximadamente 70-80% de cobertura de serosubtipo relacionados con la enfermedad. En contraste, claramente se demuestra en la presente que los antisueros a una proteína 2086 única, solamente es capaz de matar representativos de seis serosubtipos responsables por aproximadamente 65% de los aislados de enfermedad en Europa Occidental y los Estados Unidos. Por lo tanto, la proteina 2086 purificada tiene el potencial para reducir el número de proteínas requeridas para proporcionar cobertura de la composición inmunogénica adecuada de los serosubtipos responsables para la enfermedad meningocócica. Proteínas, Porciones Inmunogénicas y Equivalentea Biológicos Las proteínas 2086 proporcionadas por la presente invención, son proteínas aisladas. El término "aislado" significa alterado por la mano del hombre del estado natural. Si una composición o sustancia "aislada" surge en la naturaleza, ésta se ha cambiado o retirado de su medio ambiente original, o ambos. Por ejemplo, un polipéptido o un polinucleótido naturalmente presente en un animal vivo, no es "aislado", pero el mismo polipéptido o polinucleótido separado de los materiales coexistentes de su estado natural es "aislado", como el término es empleado en la presente. Por consiguiente, como se utiliza en la presente, el término "proteína aislada" comprende proteínas aisladas de una fuente natural y proteínas preparadas usando la tecnología recombinante, así como tales proteínas cuando se combinan con otros antígenos y/o aditivos, tales como portadores, soluciones reguladoras, adyuvantes farmacéuticamente aceptables, etc., por ejemplo.

Una proteina 2086, porción inmunogénica de la misma y/o un equivalente biológico de la misma, de acuerdo con una modalidad de la invención, comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos : ADIGxGLADA (SEQ ID NO: 254), donde x es cualquier aminoácido; IGxGLADALT (SEQ ID. NO: 255) donde x es cualquier aminoácido; SLNTGKLKND (SEQ ID NO: 256) ; SLNTGKLKNDKxSRFDF (SEQ ID NO: 257 donde x es cualquier aminoácido) ; SGEFQxYKQ (SEQ ID NO:258), donde x es cualquier aminoácido; o IEHLKxPE (SEQ ID NO: 259) donde x es cualquier aminoácido; Una proteina de la Subfamilia A 2086, porción inmunogénica de la misma y/o equivalente biológico de la misma comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos, de acuerdo con una modalidad de la presente invención . GGGVAADIG ( SEQ ID NO:260) , en donde es x es cualquier aminoácido; SGEFQIYKQ (SEQ ID NO:261); HSAWALQIE (SEQ ID NO: 262); EKINNPDKIDÍSEQ ID NO:263); SLINQRSFLV(SEQ ID ??:264) SGLGGEHTAF (SEQ ID NO : 265); GEHTAFNQLP (SEQ ID NO: 266); SFLVSGLGGEH (SEQ ID NO:267); EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLP (SEQ ID NO : 268); GKAEYHGKAF (SEQ ID NO:269); YHGKAFSSDD (SEQ ID NO : 270); GKAEYHGKAFSSDD (SEQ ID NO:271); IEHLKTPEQN (SEQ ID NO: 272); K PEQNVELA. (SEQ ID NO:273); IEHLKTPEQNVELA (SEQ ID NO: 274); AELKADEKSH (SEQ ID NO:275); AVILGDTRYG (SEQ ID NO:276); AELKADEKSHAVILGDTRYG (SEQ ID NO:277); o EEKGTYHLAL (SEQ ID NO:278); Una proteina de la Subfamilia B 2086, porción inmunogénica de la misma y/o equivalente biológico de la misma comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoácidos, de acuerdo con una modalidad de la presente invención: LITLESGEFQ (SEQ ID NO:279); SALTALQTEQ (SEQ ID NO: 280) ; FQVYKQSHSA (SEQ ID NO : 281 ) ; LITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQ (SEQ ID NO:282); IGDIAGEHTS (SEQ ID NO:283); EHTSFDKLPK (SEQ ID NO:284); IGDIAGEHTSFDKLPK {SEQ ID NO:285) ; ATYRGFTAFGS {SEQ ID NO:286); DDAGGKLTYT (SEQ ID NO : 287 ) ; IDFAAKQGHG (SEQ ID NO:288) KIEHLKSPEL (SEQ ID NO:289); ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNV (SEQ ID NO:290) HAVISGSVLY (SEQ ID NO:291); KGSYSIiGIFG (SEQ ID NO:292); VLYNQDEKGS (SEQ ID NO:293); HAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFG (SEQ ID NO:294); AQEVAGSAEV (SEQ ID NO:295); IHHIGLAAKQ (SEQ ID NO:296) VETANGIHHI (SEQ ID NO:297); AQEVAGSAEVETANGIGGIGLAAKQ (SEQ ID NO:298); VAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEQ ID NO:299); La proteina 2086 comprende la siguiente secuencia consensual y/o porciones inmunogénicas de la misma de acuerdo con una modalidad de la presente invención. Secuencia Consensual de Proteina 2086 (SEQ ID NO: 300) CSSG GGGVxADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxIiXAQG AEKTxxxGD SLNTGKLKND SRFDFxx IxVDGx ITLxSGEFQxYKQxHSA xxALQxExxxxxxxxxxxxxxRxFxGEHTxFxxLPxxxAxYxGxAFxSDDxxGxLxYxIDF xxKQGxGxIEHLKxPExNVxl_AxxxxKxDEKxHAVIxGxxxYxxxEKGxYxLxxxGxxAQE xAGxAxVxxxxxHxIXxAxKQ En la secuencia consensual anterior, la "x" representa cualquier aminoácido, la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos, la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácidos 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos, y la posición de aminoácido 156 es cualquiera de 0 a 1 aminoácido. La región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 de preferencia comprende 0, 4 o 5 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 de preferencia comprende 0 a 3 aminoácidos. Se debe notar particularmente que esta secuencia consensual ilustra la alta variabilidad de las proteínas 2086. A manera de teoría, sin que se proponga que sea enlazada a la misma, se cree que su alta variabilidad proporciona la reactividad cruzada ventajosa e inesperada. De acuerdo con una implementación de la presente invención, las proteínas 2086 son caracterizadas por ser inmunogénicas, no patogénicas y especificas no de la cepa. Además, de acuerdo con una implementación adicional de la presente invención, estas proteínas inesperadamente muestran inmunogenicidad mientras que son aproximadamente 2% a aproximadamente 40% no conservadas.

Como se utiliza en la presente, el término "no conservado" se refiere al número de aminoácidos que pueden ser sometidos a inserciones, sustitución y/o supresiones como un porcentaje del número total de aminoácidos en una proteina. Por ejemplo, si una proteina es 40% no conservada y tiene, por ejemplo, 263 aminoácidos, entonces hay 105 posiciones de aminoácidos en la proteina en la cual los aminoácidos pueden someterse a sustitución. Del mismo modo, si una proteina es 10% no conservada y tiene, por ejemplo, aproximadamente 280 aminoácidos, entonces hay 28 posiciones de aminoácido en las cuales los aminoácidos pueden someterse a sustitución. Las proteínas 2086 también pueden someterse a la supresión de residuos de aminoácidos sin comprometer la inmunogenicidad de las proteínas. Además, las proteínas 2086 pueden ser divididas en subfamilias basadas en la homología en varias regiones. Por ejemplo, sin proponer que sea limitado al mismo, las secuencias consensúales para dos de tales familias. Subfamilia A y Subfamilia B, se proporcionan enseguida: Secuencia de la Subfamilia A 2086 (SEQ ID 301 ) CSSG GGGVAADIGxGIADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxA QGAEKTxxxGD SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGQxITLxSGEFQIYKQxHSAWA LQIEKINNPD IDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPxGKAEYHGKAFSSDDxxGxLxYxI DFxxKQGxGxIEHLKTPEQNVELAxAELKADEKSHAVTLGDTRYGxEEKGTYHLALxGDRA QEIAGxATVKIxEKVHEIxIAxKQ La referencia "x" es cualquier aminoácido. La región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8 es cualquiera de 0 a 4 aminoácidos.

La región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos.

La región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8. de preferencia comprende 0 o 4 aminoácidos. La región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 de preferencia comprende 0 o 3 aminoácidos . Subfamilia B 2086 (SEQ ID 302) CSSGGGG VxADIGxGLADALTAPLDHKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGAEKTY GNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGxLITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQxQDxE xSxKMVA RxFxIGDIAGEHTS DKLPKxxxATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHG KIEHLKSPEINGxLAxxYIKPDEKxHAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFGxxAQEVAGSAEV ETANGIHHIGLAAKQ La referencia "x" es cualquier aminoácido. La región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos.

La región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 de preferencia comprende 0 a 5 aminoácidos . De acuerdo con implementaciones de la presente invención, las subfamilias de proteina 2086 pueden ser además subdivididas en agrupamientos . Por ejemplo, de acuerdo con una implementación de la presente invención, se proporcionan los siguientes agrupamientos : SEQ ID NOS:2-12 de número par; SEQ ID NOS: 14-24 de número par; SEQ ID NOS: 26-42 de número par; SEQ ID NOS : 50-60 de número par; SEQ ID NOS: 62-108 de número par; SEQ ID NOS : 110-138 de número par; SEQ ID NOS: 140-156 de numero par; SEQ ID NOS: 158-174 de número par; SEQ ID NOS: 224-252 de número par. Una secuencia de polipéptido de la invención puede ser idéntica a la secuencia de referencia de las SEQ ID NOS:2-252 de número par, esto es, 100% idéntica, o pueden incluir un número de alteraciones de aminoácido comparada con la secuencia de referencia tal que el % de identidad es de menos de 100% . Tales alteraciones incluyen por lo menos una supresión de aminoácido, sustitución, incluyendo la sustitución conservativa y no conservativa, o inserción. Las alteraciones pueden ocurrir en las posiciones amino o carboxi terminales de la secuencia de polipéptido de referencia o donde quiera entre estas posiciones terminales, interdispersadas, ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos de referencia o en un o más grupos contiguos dentro de la secuencia de aminoácidos de referencia. Asi, la invención también proporciona proteínas que tienen identidad de secuencia a las secuencias de aminoácidos contenidas en el Listado de Secuencias (es decir, SEQ ID NO: 2-252 de número par) . Dependiendo de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencia es de preferencia más grande que 60% (por ejemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%, 99.9% o mayor). Estas proteínas homologas incluyen mutantes y variantes alélicas. En modalidades preferidas de la invención, las proteínas 2086 u otros · polipéptidos 2086 (por ejemplo, porciones inmunológicas y equivalentes biológicos) generan anticuerpos bactericidas a homólogos y por lo menos una cepa heteróloga de meningococos . Específicamente, los anticuerpos para los polipéptidos 2086 pasivamente protegen las ratas pequeñas de la estimulación, tal como intranasal, con meningococos. En modalidades preferidas adicionales, los polipéptidos 2086 muestran tal protección para las ratas pequeñas para cepas homólogas y por lo menos una cepa heteróloga. El polipéptido puede ser seleccionado de la Breve Descripción de Secuencias anterior como es expuesto en la SEQ ID NOS: 2-252 de número par, o el polipéptido puede ser cualquier fragmento inmunológico o equivalente biológico del polipéptido listado. De preferencia, el polipéptido es seleccionado de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par en la sección de Breve Descripción de Secuencias anterior. Esta invención también se relaciona a variantes alélicas u otras variantes de los polipéptidos 2086, que son equivalentes biológicos . Los equivalentes biológicos adecuados mostrarán la habilidad para (1) producir anticuerpos bactericidas a cepas homólogas y por lo menos una cepa neisserial heteróloga y/o cepa gonocócica; (2) reaccionar con la superficie de las cepas homólogas y por lo menos una cepa neisserial y/o gonocócica heteróloga; (3) conferir protección pasiva contra una estimulación viva y/o (4) prevenir la colonización. Los equivalentes biológicos adecuados tienen por lo menos aproximadamente 60%, de preferencia por lo menos aproximadamente 70%, más de preferencia por lo menos aproximadamente 75%, aún más de preferencia aproximadamente 80%, más de preferencia aproximadamente 85%, aún más de preferencia aproximadamente 90%, aún más de preferencia 95% o aún más de preferencia 98%, o aún más de preferencia 99% de similitud a uno de los polipéptidos 2086 especificados en la presente (es decir, la SEQ ID NOS:2-252 de número par), con la condición de que el equivalente sea capaz de producir sustancialmente las mismas propiedades inmunogénicas como una de las proteínas 2086 de esta invención. Alternativamente, los equivalentes biológicos tienen sustancialmente las mismas propiedades inmunogénicas de una de las proteínas 2086 de las SEQ ID NOS:2-252 de número par. De acuerdo con modalidades de la presente invención, los equivalentes biológicos tienen las mismas propiedades inmunogénicas como las SEQ ID NOS: 2-252 de número par. Los equivalentes biológicos se obtienen al generar variantes y modificaciones para las proteínas de esta invención. Estas variantes y modificaciones para las proteínas se obtienen al alterar las secuencias de aminoácidos por inserción, supresión o sustitución de uno ~¡ más aminoácidos. La secuencia de aminoácidos es modificada, por ejemplo mediante la sustitución para crear un polipéptido que tiene sustancialmente las mismas cualidades mejoradas. Un medio preferido para introducir alteraciones comprende hacer mutaciones predeterminadas de la secuencia de ácidos nucleicos del polipéptido mediante la mutagénesis dirigida al sitio. Las modificaciones y cambios se pueden hacer en la estructura de un polipéptido de la presente invención y aún obtener una molécula que tiene inmunogenicidad de N. meningitídis. Por ejemplo, sin limitación, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos, incluyendo la sustitución no conservada y conservada, en una secuencia sin pérdida apreciable de la inmunogenicidad. Debido a que es la capacidad interactiva y la naturaleza de un polipéptido que define esa actividad funcional biológica del polipéptido, un número de sustituciones de la secuencia de aminoácidos se pueden hacer en una secuencia de polipéptido (o, por supuesto, su secuencia de codificación de DNA implícita) y no obstante obtener un polipéptido con propiedades similares . La presente invención contempla cualquiera de los cambios a la estructura de los polipéptidos en la presente, asi como la secuencia de ácidos nucleicos que codifican los polipéptidos, en donde el polipéptido retiene la inmunogenicidad . Una persona de habilidad ordinaria en la técnica será fácilmente capaz de modificar los polipéptidos y polinucleótidos descritos por consiguiente basados en la guia proporcionada en la presente. Por ejemplo, se han identificado ciertas regiones variables donde la sustitución o supresión es permisible. La secuencia consensual 2086, como se discutió previamente, muestra regiones conservadas y no conservadas de la familia de proteínas 2086 de acuerdo con una implementación de la presente invención. En la elaboración de tales cambios, se pueden utilizar cualquiera de las técnicas conocidas para personas expertas en la técnica. Por ejemplo, sin que se proponga a ser limitado a lo mismo, el Índice hidropático de los aminoácidos puede ser considerado. La importancia del índice hidropático de los aminoácidos en conferir función biológica interactiva sobre un polipéptido es generalmente entendido en la técnica. Kyte y colaboradores. 1982. J. Mol. Bio. 157:105-132.

La sustitución de aminoácidos similares también se puede hacer en la base de la hidrofilicidad, particularmente donde el polipéptido o péptido equivalente biológicamente funcional de esta manera creado, se propone para el uso en modalidades inmunológicas . La patente norteamericana No. 4,554,101, incorporada en la presente por referencia, menciona que la hidrofilicidad promedio local más grande de un polipéptido, como es gobernado por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad, es decir, una propiedad biológica del polipéptido . Los equivalentes biológicos de un polipéptido también se pueden preparar usando la mutagénesis especifica del sitio. La mutagénesis especifica del sitio es una técnica útil en la preparación de polipéptidos de segunda generación, o polipéptidos o péptidos equivalentes biológicamente funcionales, derivados de las secuencias de los mismos, a través de la mutagénesis especifica del DNA implícito. Tales cambios pueden ser deseables donde son deseables sustituciones de aminoácidos. La técnica además proporciona una habilidad fácil para preparar y probar variantes de secuencia, por ejemplo, la incorporación de una o más consideraciones anteriores, al introducir uno o más cambios de la secuencia de nucleótidos en el DNA. La mutagénesis especifica del sitio permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias de oligonucleótido especificas que codifican la secuencia de DNA de la mutación deseada, asi como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebador de tamaño suficiente y complejidad de secuencia para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de supresión que es atravesada. Tipicamente, un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos en longitud es preferido, con aproximadamente 5 a 10 residuos en ambos lados de la unión de la secuencia que es alterada. En general, la técnica de la mutagénesis especifica del sitio es bien conocida en la técnica. Como será apreciado, la técnica tipicamente emplea un vector de fago que puede existir en la forma tanto de una sola hebra como de doble hebra. Tipicamente, la mutagénesis dirigida al sitio de acuerdo con la presente es realizada al primero obtener un vector de una sola hebra que incluye dentro de., su secuencia una secuencia de DNA que codifica toda una porción de la secuencia de polipéptido de N. meningitidis seleccionada. Un cebador de oligonucleótido que lleva la secuencia mutada deseada es preparado (por ejemplo, sintéticamente) . Este cebador luego es templado al vector de una sola hebra, y extendido mediante el uso de enzimas tal como el fragmento lenow de polimerasa I E. coli, para completar la sintesis de la hebra que lleva la mutación. Asi, un heterodúplex es formado en donde una hebra codifica la secuencia no mutada original de la segunda hebra lleva la mutación deseada. Este vector heterodúplex luego es usado para transformar células apropiadas tales como células de E. coli y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que llevan la mutación. Los kits comercialmente disponibles vienen con todos los reactivos necesarios, excepto los cebadores de oligonucleótido . Los polipéptidos 2086 incluyen cualquier proteina o polipéptido que comprende similitud de secuencia sustancial y/o equivalencia biológica a una proteina 2086 que tiene una secuencia de aminoácidos de una de las SEQ ID NOS : 2-252 de número par. Además, un polipéptido 2086 de la invención no está limitado a una fuente particular. Asi, la invención proporciona la detección y aislamiento general de los polipéptidos a partir de una variedad de fuentes. También, los polipéptidos 2086 pueden ser preparados recombinantemente, como está bien dentro de la habilidad en la técnica, basado en la guia proporcionada en la presente, o en cualquier otra manera sintética, como es conocido en la técnica . Se contempla en la presente invención, que un polipéptido 2086 puede ser venta osamente segmentado en fragmentos para el uso en el análisis estructural o funcional adicional, o en la generación de reactivos, tales como polipéptidos relacionados con 2086 y anticuerpos específicos 2086. Esto se puede realizar al tratar polipéptidos de N. meníngitidis purificados o no purificados con una peptidasa tal como la endoproteinasa glu-C (Boehringer, Indianapolis, IN) . El tratamiento con CNBr es otro método mediante el cual los fragmentos de péptido pueden ser producidos a partir de polipéptidos 2086 N. meníngitidis naturales. Las técnica.' recombinantes también pueden ser usadas para producir fragmentos específicos de una proteina 2086. "Variante" como el término se utiliza en la presente, es un polinucleótido o polipéptido que difiere de un polinucleótido o polipéptido de referencia respectivamente, pero retienen las propiedades esenciales. Una variante típica de un polinucleótido difiere la secuencie de nucleótidos de otro polinucleótido de referencia Los cambios en la secuencia de nucleótidos de la variante pueden o no pueden alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia Los cambios de nucleótidos pueden dar por resultado sustituciones, adiciones, supresiones, fusiones y truncamientos de aminoácidos en el polipéptido codificado por la secuencia de referencia, como es discutido después. Una variante tipica de un polipéptido difiere en la secuencia de aminoácidos de otro polipéptido de referencia. Generalmente, las diferencias son limitadas de modo que las secuencias del polipéptido de referencia y la variante son estrechamente similares en conjunto y, en muchas regiones, idénticas (es decir, biológicamente equivalentes) . Una variante y polipéptido de referencia puede diferir en la secuencia de aminoácidos por una o más sustituciones, adiciones, supresiones en cualquier combinación. Un residuo de aminoácidos sustituido o insertado puede o no puede ser uno codificado por el código genético. Una variante de un polinucleótido o polipéptido puede ser una que surge de manera natural tal como una variante alélica, o puede ser una variante que no se conoce que surja de manera natural. Las variantes que no surgen de manera natural de los polinucleótidos y polipéptidos se pueden hacer mediante técnicas de mutagénesis o mediante la síntesis directa. "Identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias de polipéptido o dos o más secuencias de polinucleótido, como es determinado al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre las secuencias de polipéptido o polinucleótido, como puede ser el caso, como es determinado por la igualación entre las cadenas de tales secuencias. "Identidad" y "similitud" se pueden calcular fácilmente por métodos conocidos, incluyendo pero no limitado a aquellos descritos en Computational Molecular Bilogy, Lesk, A.M. , ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing; Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part. I, Griffin, A.M., and Friffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 2994; Sequence Analysus in Molecular Billogy, von Heinje, G.( Academic Press, 2987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991; y carillo, H. , y Lipman, D. , SIAM J. Appiied Math., 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar la identidad son diseñados para dar la igualación más grande entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad y su similitud son codificados en los programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no están limitados a, el paquete de programas GCG (Devereux, J-, y colaboradores 1984), BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S.F., y colaboradores, 1990) . El programa BLASTX está públicamente disponible de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y colaboradores, NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., y colaboradores, 1990). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido también puede ser usado para determinar la identidad. A manera de ejemplo, sin proponer que sea limitado al mismo, una secuencia de aminoácidos de la presente invención puede ser idéntica a las secuencias de referencia, las SEQ ID NOS: 2-252 de número par; que es 100% idéntica, o puede incluir un número de alteraciones de aminoácidos como es comparado con la secuencia de referencia tal que el % de identidad es de menos de 100%. Tales alteraciones son seleccionadas del grupo que consiste de por lo menos una supresión de aminoácido, sustitución, incluyendo la sustitución conservativa y no conservativa o inserción, y en donde las alteraciones pueden surgir en las posiciones amino-o carboxi-terminales de la secuencias de polipéptido de referencia o donde quiera entre esas posiciones terminales, interdispersados ya sea individualmente entre los aminoácidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de aminoácidos para un % de identidad dado es determinado al multiplicar el número total de aminoácidos en la SEQ ID NOS: 2-252 por el por ciento numérico del por ciento de identidad respectivo (dividido entre 100) y luego al sustraer ese producto del número total de aminoácidos en cualquiera de las SEQ ID NOS : 2-252, o: a=?a- (xa«y) , donde rio, es el número de alteraciones de aminoácidos, ?„ es el número total de aminoácidos en las SEQ ID NOS: 2-252, y y es, por ejemplo 0.70 para 70%, 0.80 para 80%, 0.85 para 85% etc. y en donde cualquier producto no de número entero de x.sub.a y y es redondeada hacia abajo al número entero más cercano antes de sustraerlo de xa. En modalidades preferidas, el polipéptido anterior es seleccionado a las proteínas expuestas en la SEQ ID NOS:2-252 de número par, tal como la forma procesada madura de una proteína 2086. Las proteínas 2086 o equivalentes, etc. pueden ser lipidadas o no lipidadas . ORF2086 es expresable en E. colí con la secuencia de señal ORF2086 nativa. Sin embargo, es deseable encontrar medios para mejorar la expresión de las proteínas. De acuerdo con una modalidad de la presente invención, una secuencia guía produce una forma lipidada de la proteína. Por ejemplo, lo siguiente describe el uso de la secuencia de señal de la proteína P4 de Haemophilus iníluenzae no de un tipo para mejorar la expresión. El procesamiento de las lipoproteínas bacterianas comienza con la síntesis de un precursor o poliproteina que contiene una secuencia de señal, que a su vez contiene un sitio de procesamiento/modificación de lipoproteina consensual. Esta lipoproteina inicialmente pasa a través del sistema Sec común en la membrana interna de las bacterias Gram Negativas o sobre la membrana en las bacterias Gram positivas. Una vez colocado en la membrana por el sistema Sec, la poliproteina es segmentada por la peptidasa de señal II en el sitio consensual y el residuo de cisteína N- terminales puesto es glicerado y acilado. Hayashi y colaboradores, 1990. Lipoproteins in bacteria, J. Bíoenerg. Bíomembr. Jun; 22 ( 3) : 451-71; Oudega y colaboradores. 1993. Escherichia eolia SecB, SecA, and SecY proteins are required for expression and membrane insertion of the bacteriocin reléase protein, a small lipoprotein. J. Bacteriol. Mar; 175 (5) : 1543-7; Sankaran y colaboradores 1995. Modification of bacterial lipoproteins. Methods Enzymol. 250:683-97. En las bacterias Gram negativas, el transporte de la proteina lipidada a la membrana externa es mediada mediante un sistema transportador ABC único con la especificidad de membrana dependiendo de una señal de clasificación en la posición 2 de la lipoproteina. Yakushi y colaboradores 2000. A New ABC transporter med ating the detachment of lipid modified proteins from membranes. Wat CeIJ Bíol. Apr,2 (4) :212-8. La fusión con lipoproteinas bacterianas y su secuencias de señal se ha usado para mostrar proteínas recombinantes en la superficie de las bacterias. Patentes norteamericanas Nos. 5,583,038 y 6,130,085. Las secuencias de señal de lipoproteina de intercambio pueden incrementar la producción de la lipoproteina. De y colaboradores 2000. Purification and characterization of Streptococcus pneumoniae palmitoylated pneumococcal surface adhesin A expressed in Escherichia coli. Vaccine. Mar 6; 18 (17) : 1811-21.

La lipidación bacteriana de las proteínas se conoce que incrementa o modifica la respuesta inmunológica a las proteínas. Erdile y colaboradores. 1993. Función de lipido unido en la inmunogenicidad de OspA de Borrelia burgdorferi. Infect. Immun. Jan; 61(l):81-90; Snapper y colaboradores. 1995. Las lipoproteinas bacterianas pueden sustituir para citocinas en la respuesta inmune humoral a los antigenos del tipo II independientes de las células T. J. Immunol. Dec 15; 155 (12) : 5582-9. Sin embargo, la expresión de lipoproteina bacteriana puede ser complicada por la severidad del procesamiento. Pollitt y colaboradores. 1986. Efecto de las sustituciones de aminoácidos en el sitio de segmentación de péptido de señal de la lipoproteina de membrana externa mayor de Escherichis coli. J. Biol. Chem. Feb 5; 261 (4 ): 1835-7; Lunn y colaboradores; 1987. Efectos de las mutaciones de péptido de señal de prolipoproteina en la secreción del híbrido prolipo-beta-lactamasa en Escherichia coli. J. Biol. Chem. Jun 15; 262 (17) :8318-24; Klein y colaboradores. 1988. Propiedades distintivas de las secuencias de señal de las lipoproteinas bacterianas. Protein Eng. Apr. 2(l):15-20. La expresión de la lipoproteina bacteriana también es complicada por otros problemas tales como la toxicidad y los niveles de baja expresión. Gómez y colaboradores. 1994. Nucleotide. La lipoproteina LplA de SacilJus subtilis ocasiona la lisis de las células cuando se expresa en Escherichia coli.

Microbiology. Aug:140(Pt 8):1839-45; Hansson y colaboradores 1995. La expresión de las formas de longitud completa y troncadas de la proteina A de superficie externa de Borrelia de la enfermedad Lyme en Escherichia coli. Protein Expr. Purif. Feb; 6(l):15-24; Yakishi y colaboradores. 1997. Letalidad del enlace covalente entre la lipoproteina de membrana externa mayor mal localizada y el péptido glicano de Escherichia coli. Protein J. Bacteríol. May; 179 (9) :2857-62.

La bacteria Haemophilus influenzae no de un tipo expresa una lipoproteina designada P4 (también conocida como proteina "e") . La forma recombinante de la proteina P4 es altamente expresada en E. coli usando la secuencia de señal P4 nativa. Patente norteamericana No. 5,955,580. Cuando la secuencia de señal P4 nativa es sustituida por la secuencia de señal ORF2086 nativa en un vector de expresión en E. coli, el nivel de expresión de ORF2086 es incrementado. Este concepto de usar la secuencia de señal P4 heteróloga para incrementar la expresión es extensible a otras lipoproteinas bacterianas. En particular, el análisis de los genomas bacterianos conduce a la identificación de muchos ORFs por ser de posible interés. El intento para expresar cada ORF con secuencia de señal nativa en una célula huésped heteróloga, tal como E. coli, da origen a una variedad de problemas inherentes en el uso de una variedad de secuencias de señal, incluyendo estabilidad, compatibilidad y asi sucesivamente. Para minimizar estos problemas. La secuencia de señal P4 es usada para expresar cada ORF de interés. Como es descrito en lo anterior, la secuencia de señal P4 mejora la expresión del 2860RF heterólogo. Un vector de expresión es construido al suprimir la secuencia de señal nativa del ORF de interés, y al ligar la secuencia de señal P4 a la ORF. Una célula huésped adecuada luego es transformada, transfectada o infectada con el vector de expresión, y la expresión de la ORF es incrementada en comparación a la expresión usando la secuencia de señal nativa de la ORF. La forma no lipidada es producida mediante una proteina que carece de la secuencia guia original o mediante una secuencia guia que es reemplazada con una porción de secuencia que no especifica un sitio para la acilación del ácido graso en una célula huésped. La diversas formas de la proteina 2086 de esta invención son referidas en la presente como proteínas "2086", a menos que se mencione específicamente de otra manera. También "polipéptido 2086" se refiere a las proteínas 2086 asi como porciones inmunogénicas o equivalentes biológicas de las mismas como se mencionan en lo anterior, a menos que se haga mención de otra manera. La proteína 2086 de N. meningitidis aislada y purificada de longitud completa, tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 28 a 35 kDa como es medido es un gel SDS poliacrilamida de gradiente del 10% al 20% (SDS-PAGE) . Más específicamente, esta proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a 30,000 daltons como es medido mediante la espectrometria de masas. De preferencia, los polipéptidos 2086 y los ácidos nucleicos que codifican tales polipéptidos son usados para prevenir o aminorar la infección ocasionada por N. meningitídis y/o otras especies. Anticuerpos Las proteínas de la invención, incluyendo las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 2-252, sus fragmentos, y análogos de las mismas, o células que las expresan, también son usadas como inmunógenos para producir anticuerpos inmunoespecificos para los polipéptidos de la invención. La invención incluye anticuerpos para polipéptidos inmunoespecifieos y el uso de tales anticuerpos para detectar la presencia de N. meningitidis, para proporcionar protección pasiva o medir la calidad o concentración de los polipéptidos en una célula, un extracto de célula o tejido o un fluido biológico. Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos y anticuerpos anti-idiotipicos . Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivados de los sueros de animales inmunizados con un antigeno. Los anticuerpos monoclonales son un población sustancialmente homogénea de anticuerpos para antigenos específicos . Los anticuerpos monoclonales pueden ser obtenidos por métodos conocidos para aquellos expertos en la técnica, por ejemplo Kohler y Milstei, 1975, Nature 256:495-497 y patente norteamericana No. 4,376,110. Tales anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Los anticuerpos quiméricos son moléculas, porciones diferentes de las cuales son derivadas de especies de animales diferentes, tales como aquellos que tienen región variable derivado de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos y métodos para su producción son conocidos en la técnica (Cabilly y colaboradores, 1984, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 81:3273-3277; Morrison y colaboradores, 1984, Proc. Nati . Acad. Sci . USA 81:6851-6855; Boulianne y colaboradores, 1984, Nature 312:643-646; Cabilly y colaboradores, solicitud de patente europea No. 125023 (publicada el 14 de Noviembre de 1984); Taniguchi y colaboradores, solicitud de patente europea No. 171496 (publicada el 19 de Febrero de 1985); Morrison y colaboradores, solicitud de patente europea No. 174494 (publicada el 5 de Marzo de 1986; Neuberger y colaboradores, solicitud de PCT WO 86/01533 (publicada el 13 de Marzo de 1986); Kudo y colaboradores, solicitud de patente europea No. 184187 (publicada el 11 de Junio de 1986); Morrison y colaboradores, solicitud de patente europea No. 173494 (publicada el 5 de Marzo de 1986); Sahagan y colaboradores, 1986, J. Imunol. 137:1066-1074; Robinson y colaboradores, PCT/US86/02269 (publicada el 7 de Mayo de 1987); Liu y colaboradores, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Sun y colaboradores, 1987, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:214-218; Better y colaboradores, 1988, Science 240:1041-1043). Estas referencias son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. Un anticuerpo anti-idiotipico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos generalmente asociados con el sitio de enlace del antigeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-Id se prepara al inmunizar un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, raza de ratón) como la fuente del anticuerpo monoclonal con el anticuerpo monoclonal para el cual es preparado el anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a las determinantes idiotipicas del anticuerpo inmunizante al producir un anticuerpo para estas determinantes isotipicas (el anticuerpo anti-Id) . Por consiguiente, los anticuerpos monoclonales generados contra los polipéptidos de la presente invención se pueden usar para inducir anticuerpos anti-ID en anticuerpos animales. Las células del bazo de tal razón inmunizado pueden ser usadas para producir hibridomas anti-Id secretan anticuerpos monoclonales anti-Id. Además, los anticuerpos anti-Id pueden ser acoplados a un portador tal como una hemocianina de lapa de punta (KLH) y usados para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de enlace del mAb final especifico para un epitope de R-PTPasa. Los anticuerpos anti-Id tienen sus epitopes idiotipicos o "idiotopes" estructuralmente similares al epitope que es evaluado, tales como los polipéptidos de Streptococcus pyogenes . El término "anticuerpo" también se entiende que incluye moléculas tanto intactas asi como fragmentos tales como Fab que son capaces de enlazar antigeno. Los fragmentos Fab carecen del fragmento Fe del anticuerpo intacto, se evacúan más rápidamente a la circulación, y pueden tener menos enlace del tejido no especifico que un anticuerpo intacto ( ahl y colaboradores, 1983, J. Nucí. Med. 24:316-325) . Será apreciado que Fab y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención pueden ser usados para la detección y cuantificación de polipéptidos de N. meningiti is de acuerdo con los métodos para moléculas de anticuerpo intactas .

Los anticuerpos de esta invención, tales como los anticuerpos anti-idiotipicos ("anti-Id"), pueden ser empleados en un método para el tratamiento o la prevención de la infección de Neisseria en huéspedes mamíferos, que comprende la administración de una cantidad de anticuerpo inmunológicamente efectiva, especifica para un polipéptido como es descrito en lo anterior. El anticuerpo anti-Id también puede ser usado como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en todavía otro animal, produciendo un llamado anticuerpo anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo el anti-ID. Así, al usar anticuerpos para las determinantes idiotípicas de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica. Los anticuerpos se usan de una variedad de maneras, por ejemplo, para confirmación de que una proteina es expresada, o para confirmar donde una proteína es expresada. El anticuerpo marcado (por ejemplo, marcación fluorescente para FACS) puede ser incubado con bacterias intactas y la presencia de la marca en la superficie bacteriana confirma la localización de la proteína, por ejemplo. Los anticuerpos generados contra los polipéptidos de la invención pueden ser obtenidos al administrar los polipéptidos o fragmentos que llevan epítope, análogos, o células a un animal usando protocolos de rutina. Para la preparación de anticuerpos monoclonales, se usa cualquier técnica que proporcione anticuerpos producidos por los cultivos de lineas celulares continuas. Polinucleótidos Como con las proteínas de la presente invención, un polinucleótido de la presente invención puede comprender una secuencia de ácidos nucleicos que es idéntica a cualquiera de las secuencias de referencia de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar, que es 100% idéntica, o puede incluir hasta un número de alteraciones de nucleótidos comparada con la secuencia de referencia. Tales alteraciones se seleccionan del grupo que consiste de por lo menos una supresión de nucleótido, sustitución, incluyendo transición y transversión, o inserción, y en donde las alteraciones pueden ocurrir en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia o donde quiera entre esas posiciones terminales, interdispersados ya sea individualmente entre los nucleótidos de la secuencia de referencia en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El número de alteraciones de nucleótidos se determina al multiplicar el número total de nucleótidos en cualquiera de la SEQ ID NOS: 1-253 de número impar por el por ciento numérico del por ciento de identidad respectivo (dividido entre 100) y al sustraer ese producto del número total de nucleótidos en la secuencia.

A manera de e emplo, sin proponer que sea limitado al mismo, un polinucleótido de N. meningitidis aislado que comprende una secuencia de polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad a cualquier secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID NOS: 1-253; una variante degenerada de las misma o un fragmento de la misma, en donde la secuencia de nucleótidos puede incluir hasta ?^ alteraciones de ácido nucleico sobre la región de polinucleótido completa de la secuencia de ácidos nucleicos de las SEQ ID NOS: 1-253, en donde nn es el número máximo de alteraciones y es calculado por la fórmula: nn=xn-(xn«y) , en la cual x„ es el número total de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 e y tiene un valor de 0.70, en donde cualquier producto que no es número entero de x„ e y es redondeado hacia abajo hacia el número entero más cercano antes de sustraer tal producto de x„. Por supuesto, y también puede tener un valor de 0.80 para 80%, 0.85 para 85%, 0.90 para 90%, 0.95 para 95%, etc. Las alteraciones de una secuencia de polinucleótido que codifica los polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 pueden crear mutaciones en no sentido, mal sentido o cambio de estructura en esta secuencia de codificación y de esta manera alterar al polipéptido modificado por el polinucleótido siguiendo tales alteraciones . Ciertas modalidades de la presente invención se relacionan a polinucleótidos (en la presente referidos como los "polinucleótidos 2086" o "polinucleótidos ORF2086") que codifican las proteinas 2086 y anticuerpos hechos contra las proteinas 2086. En modalidades preferidas, un polinucleótido aislado de la presente invención es un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 95% de identidad de una secuencia de nucleótidos seleccionada de una de la SEQ ID NO:l y SEQ ID NOS: 253 de número impar, una variante degenerada de la misma, o un fragmento de la misma. Como se define en la presente, una "variante degenerada" se define como un polinucleótido que difiere de la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NOS:l y SEQ ID NOS : 253 de número impar (y fragmentos de las mismas) debido a la degeneración del código genético, pero aún codifica la misma proteina 2086 (es decir, la SEQ ID NOS: 2-252 de número par) como aquella codificada por la secuencia de nucleótidos mostrada en la SEQ ID NOS: 2-253 de número impar. En otras modalidades, el polinucleótido es un complemento a una secuencia de nucleótidos seleccionada de una de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar, una variante degenerada de la misma, o un fragmento de la misma. Todavia en otras modalidades, el polinucleótido es seleccionado del grupo que consiste de DNA, DNA cromosómico, cDNA y RNA y además puede comprender nucleótidos heterólogos. En otra modalidad, un nucleótido aislado híbrida una secuencia de nucleótidos seleccionada de una de las SEQ ID NOS: 1-253, un complemento de la misma, una variante degenerada de la misma o un fragmento de la misma, bajo condiciones de hibridación de alta severidad. Todavía en otras modalidades, el polinucleótido se híbrida bajo condiciones de hibridación de severidad intermedia . Será apreciado que los polinucleótidos 2086 pueden ser obtenidos de fuentes naturales, sintéticas o semisintéticas; además, la secuencia de nucleótidos puede ser una secuencia que surge de manera natural, o puede ser relacionada mediante mutación, incluyendo sustituciones de base individuales o múltiples, supresiones, inserciones e inversiones para tal secuencia que surge de manera natural, con la condición de que siempre la molécula de ácidos nucleicos que comprende tal secuencia es capaz de ser expresada como un polipéptido inmunogénico 2086 como es descrito en lo anterior. La molécula de ácido nucleico puede ser RNA, DNA, de una sola hebra o de doble hebra, lineal o forma circular covalentemente cerrada. La secuencia de nucleótidos puede tener secuencias de control de expresión posicionadas adyacentes a esta, tales secuencias de control usualmente son derivadas de una fuente heteróloga. Generalmente, la expresión recombinante de la secuencia de ácidos nucleicos de esta invención usará una secuencia de codón de detención, tal como TAA, al final de la secuencia de ácidos nucleicos. La invención también incluye polinucleótidos capaces de hibridar bajo condiciones de severidad reducida, más de preferencia condiciones de severidad, y mucho más de preferencia condiciones altamente severas a polinucleótidos descritos en la presente. Ejemplos de condiciones de severidad son mostrados en la Tabla de Condiciones de Severidad después: las condiciones altamente severas son aquellas que son por lo menos tan severas como, por ejemplo, las condiciones A-D; condiciones severas son por lo menos tan severas como, por ejemplo, las condiciones G-L; y las condiciones de severidad reducida son por lo menos tan severas como, por ejemplo, las condiciones M- . CONDICIONES DE SEVERIDAD-TABLA I Condición Híbrido del Longitud Temperatura de Temperatura de Polinucleótido del Hibridación y de Lavado y Severidad Híbrido Solución Solución (bp)1 ReguladoraH Reguladora" A DNA:DNA >50 65EC;lxSSC -o- 65EC; 42EC;lxSSC, 0.3XSSC formamida al 50% B 0NA: DNA <50 ?ß,-lxSSC TB;lXssc C DNA: R A >50 67EC;lxSSC -o- 67EC; 45EC;lxSSC, 0.3xSSC formamida al 50% D DNA:RNA <50 TVlxSSC TD;lxSSC E NA:R A >50 70EC;lxSSC -o- 70EC 50EC lxSSC, " 0.3xSSC formamida al 50% F NA:RNA <50 Tif/lxSSC Tf; lxSSC G DNA:DNA >50 65EC;4xSSC -o- 65EC;lxSSC 42EC;4xSSC, formamida al 50% H DNA:DNA <50 t?; 4xssc TH; 4xssc I DNA: RNA >50 67EC;4xSSC -o- 67EC;lxSSC 45EC;4xSSC, formamida al 50% J DNA: RNA <50 Tj; xSSC T,,; 4xSSC K R A:RNA >50 70EC 4xSSC -o- 67EC; 50EC;4xSSC, lxSSC formamida al 50% L RNA:RNA <50 TL;2xSSC Tj,;2xSSC M DNA:DNA >50 50EC;4xSSC -o- 50EC 2xSSC 40EC;6xSSC, formamlda al 50% N DNA.-DNA <50 TN; 6xssc TN; 6xSSC 0 DNA:R A >50 55EC;4xSSC -o- 55EC; 42EC;6xSSC, 2xSSC formamida al 50% P DNA:RNA <50 TP; 6xSSC TP 6xSSC Q RNA:RNA >50 60EC;4xSSC -o- 60EC; 45EC;6xSSC, 2xSSC formamida al 50% R RNA:R A <50 TR; 4xSSC TR xSSC longitud del híbrido es aquella anticipada para la(s) región (es) hibridada de los polinucleótidos hibridantes. Cuando se híbrida un polinucleótido a un polinucleótido objetivo de secuencia no conocida, la longitud del híbrido se asume que es aquella del polinucleótido hibridante. Cuando polinucleótidos de secuencia conocida son hibridados, la longitud del híbrido puede ser determinada al alinear la secuencia de los polinucleótidos y al identificar la región o las regiones de complementos de secuencia óptima.

Solución reguladora": SSPE (lxSSPE es NaCl 0.15 M, NaH2P04 10 mM, y EDTA 1.25 mM, pH 7.4) puede ser sustituido por SSC (lxSSC es NaCl 0.15 y citrato de sodio 15 mM) en las soluciones reguladoras de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos después de que se completa la hibridación. TB hasta TR: La temperatura de hibridación para los híbridos anticipados que son menos que 50 pares de bases en longitud debe ser 5-10EC menor que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde la Tm es determinada de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para híbridos de menos de 18 pares de bases en longitud, Tm (EC)=2(# de A+T bases)+4(# of G+C bases) . Para híbridos entre 18 y 49 pares de bases en longitud, Tm(EC)=81, 5+16.6 (logio [Na+] ) +0.41 (%G+C) - (600/N) , donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na+] es la concentración de iones sodio en la solución reguladora de hibridación (Na+] para lxSSC=0.165 M) . Ejemplos adicionales de condiciones de severidad para la hibridación de polinucleótido se proporcionan en Sambrook, J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Labaratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 y 11, y Current Protocols in Molecular Bil.ogy, 1995, F.M. Ausubel y colaboradores, eds, John iley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4, incorporada en la presente por referencia. La invención también proporciona polinucleótidos que son completamente complementarios a estos polinucleótidos y también proporciona secuencias antisentido. Las secuencias antisentido de la invención, también referidas como oligonucleótidos antisentido, incluyen secuencias tanto internamente generadas y externamente administradas que bloquean la expresión de los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de la invención. Las secuencias antisentido de la invención comprende, por ejemplo, aproximadamente 15-20 pares de bases. Las secuencias antisentido pueden ser diseñadas por ejemplo, para inhibir transcripción al prevenir el enlace del promotor a una secuencia no traducida corriente arriba o al prevenir la traducción de un transcripto que codifica un polipéptido de la invención al prevenir al ribosoma del enlace. Los polinucleótidos de la invención se preparan de muchas maneras (por ejemplo, mediante síntesis química, de bibliotecas de DNA, del organismo mismo) y puede tomar varias formas (por ejemplo, una sola hebra, doble hebra, vectores, sondas, cebadores) . El término "polinucleótido" incluye DNA y RNA, y también sus análogos, tales como aquellos que contienen cadenas principales modificadas.

De acuerdo con implementaciones adicionales de la presente invención, los polinucleótidos de la presente invención comprende una biblioteca de DNA, tal como una biblioteca de cD A. Proteínas de Fusión La presente invención también se relaciona a proteínas de fusión. Una ¦ "proteína de fusión" se refiere a una proteina codificada por dos genes fusionados, frecuentemente no relacionados o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, las proteínas de fusión que comprenden varias porciones de la región constante de moléculas de inmunoglobulina junto con otra proteína inmunogénica de la misma. En muchos casos, empleando una región Fe inmunoglobulina como una parte de una proteína de fusión es ventajoso para uso en la terapia de diagnosis que da por resultado, por ejemplo, propiedades farmacocinéticas mejoradas (ver, por ejemplo, EP 0 232 261 Al) . Por otra parte, para algunos casos seria deseable ser capas de suprimir la parte Fe después de que la proteína de fusión se ha expresado, detectado y purificado. Los polinucleótidos 2086 de la invención se usan para la producción recombinante de polipéptidos de la presente invención, el polinucleótido puede incluir las secuencias de codificación para el polipéptido maduro, por sí mismo, o la secuencia de codificación para el polipéptido maduro en la estructura de lectura con otras secuencias' de codificación, tales como aquellas que codifican una secuencia guia o secretoria, una secuencia pre-, o pro- o prepro-proteina u otras porciones de péptido de fusión. Por ejemplo, una secuencia de marcador que facilita la purificación de un polipéptido 2086 o polipéptido fusionado puede ser codificado (ver Gentz y colaboradores, 1989, incorporado en la presente por referencia en su totalidad) . Asi, contemplada en una implementación de la presente invención está la preparación de polinucleótidos que codifican polipéptidos de fusión que permiten la purificación de His-tag de productos de expresión. El polinucleótido también puede contener secuencias de no codificación 5' y 3' , como las secuencias no traducidas, transcritas, señales de división y poliadenilación. Tal polipéptido fusionado puede ser producido por una célula huésped transformada/transfectada o infectada con un vehículo de clonación de DNA recombinante como es descrito después o puede ser subsecuentemente aislado de la célula huésped para proporcionar el polipéptido fusionado sustancialmente libre de otras proteínas de la célula huésped. Composiciones Inraunogénicas Un aspecto de la presente invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden por lo menos proteínas 2086 o un ácido nucleico que codifica las proteínas. Lo anterior tiene la habilidad para (1) producir anticuerpos bactericidas para múltiples cepas; (2) reaccionar con la superficie de múltiples cepas; (3) conferir protección pasiva contra una estimulación viva y/o (4) prevenir la colonización. La formulación de tales composiciones inmunogénicas es bien conocida para personas expertas en este campo. Las composiciones inmunogénicas de la invención de preferencia incluyen un portador f rmacéuticamente aceptable. Los portadores y/o diluyentes farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen cualquiera y todos los solventes convencionales, medios de dispersión, rellenadores, portadores, soluciones acuosas, recubrimientos, agentes antibactérianos y antifungales, agentes de retardo de absorción isotónicos, y similares. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina regulada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asi como combinaciones de los mismos. Los portadores farmacéuticamente aceptables además pueden contener cantidades menores de sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservadores o soluciones reguladoras, que mejoran la vida en anaquel o la efectividad del anticuerpo. La preparación y uso de los portadores farmacéuticamente aceptables es bien conocido en la técnica. Excepto hasta donde cualquier medio o agente convencional sea compatible con el ingrediente activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones xnmunogénicas de la presente invención. Tales composiciones inmunogénicas pueden ser administradas parenteralmente, por ejemplo, por inyección, ya sea subcutáneamente o intramuscularmente, asi como oralmente o intranasalmente . Los métodos para la inmunización intramuscular son descritos por Wolff y colaboradores y por Sedegah y colaboradores. Otros modos de administración emplean formulaciones orales, formulaciones pulmonares, supositorios y aplicaciones transdérmicas, por ejemplo, sin limitación. Las formulaciones orales, por ejemplo, excipientes normalmente empleados tal, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares, sin limitación. Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden incluir uno o más adyuvantes, incluyendo, pero no limitado a hidróxido de aluminio; fosfato de aluminio; STIMULO " QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA) ; MPLMR (lipido A de monofosforilo 3-O-desacilado; Corixa, Hamilton, MT) , 529 (un compuesto de amino alquil glucosamina fosfato, Corixa, Hamilton, MT), IL-12 (Genética Institute, Cambridge, MA) ; GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Washigton) ; N-acetil-muramil—L-teronil-D-isoglutamina (thr-MDP); N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP) ; N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-alanina-2-1' -2' -dipalmitoíl-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi-etilamina) (CGP 19835A, referido como MTP-PE) ; y toxina de cólera. Otros que pueden ser usados son los derivados no tóxicos de la toxina de cólera, incluyendo su subnidad A, y/o conjugados o fusiones genéticamente diseñadas del polipéptido de N. meningitidis con la toxina de cólera o su subunidad B ("CTB"), procoleragenoide, polisacáridos fúngales, incluyendo esquizofilano, muramil dipéptido, derivados de muramil dipéptido ( "MDP") , ésteres de forbol, la toxina estable al calor de E. coli, polímeros de bloque o saponinas . En ciertas modalidades preferidas, las proteínas de esta invención se usan en una composición inmunogénica para la administración oral, que incluye un adyuvante mucosal y usado para el tratamiento en la prevención de la infección por N. meningiditis en un huésped humano. El adyuvante mucosal puede ser una toxina de cólera; sin embargo, de preferencia, los adyuvantes mucosales diferentes a la toxina de cólera que pueden ser usados de acuerdo con la presente invención incluyen derivados no tóxicos de una holotoxina, en donde la subunidad A es toxina de cólera químicamente modificada, mutagenizada o proteínas relacionadas producidas por la modificación de la secuencia de aminoácidos de la toxina de cólera. Para una toxina de cólera específica que puede ser particularmente útil en la preparación de composiciones inmunogénicas de esta invención, ver la holotoxina de cólera mutante E29H, como es descrito en la solicitud internacional publicada WO 00/18434, que es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Estos se pueden adicionar a, o conjugar con, los polipéptidos de esta invención. Las mismas técnicas se pueden aplicar a otras moléculas con propiedades adyuvantes de suministro mucosales tales como la toxina estable al calor (LT) de Escheric ia coli. Otros compuestos con actividad adyuvante o de suministro mucosal pueden ser usados tal como la bilis; policationes tal como DEAE-dextrano y poliornitina; detergentes tales como dodecil bencensulfato de sodio; materiales conjugados con lipido; antibióticos tal como estreptomicina; vitamina A, y otros compuestos que alteran la integridad estructural o funcional de las superficies mucosales. otros compuestos mucosalmente activos incluyen derivados de estructuras microbianas tales como MDP; acridina y cimetidina. También se puede usar STIMULON™ QS-21, MPL, y IL-12, como es descrito en lo anterior. Las composiciones inmunogénicas de esta invención pueden ser suministradas en la forma de ISCOMS (complejos estimulantes inmunes), ISCOMS que contiene CTB, liposomas o encapsulados en compuestos tales como acrilatos o poli(DL-láctido-co-glucósido) para formar microesferas de un tamaño adecuado para la adsorción. Las proteínas de esta invención también pueden ser incorporadas en emulsiones aceitosas . Antigenos Múltiples Los agentes inmunogénicos, incluyendo proteínas, polinucleótidos y equivalentes de la presente invención, se pueden administrar como el inmunógeno activo solo en una composición inmunogénica, o alternativamente, la composición puede incluir otros inmunógenos activos, incluyendo otros polipéptidos inmunogénicos de Neisseria sp. o proteínas inmunológicamente activas de uno o más de otros patógenos microbianos (por ejemplo, virus, prión, bacteria u hongo, sin limitación) o polisacárido capsular. Las composiciones pueden comprender una o más proteínas deseadas, fragmentos o compuestos farmacéuticos como sea deseado para una indicación elegida. De la misma manera, las composiciones de esta invención que emplean uno o más ácidos _nucleicos en la composición inmunogénica también pueden incluir ácidos nucleicos que codifican el mismo grupo diverso de proteínas, como es mencionado en lo anterior. Cualquier composición inmunogénica multiantigénica o multivalente es contemplada por la presente invención. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden comprender combinaciones de dos o más proteínas 2086, una combinación de proteína 2086 con una o más proteínas Por A, una combinación de proteína 2086 con polisacáridos del serogrupo A, C, Y y W135 meningocócico y/o conjugados de polisacárido, una combinación de proteina 2086 con combinaciones de meningococo y neumococo, o una combinación de cualquiera de lo anterior en una forma adecuada para el suministro mucosal. Las personas de habilidad en la técnica serán fácilmente capaces de formular tales composiciones inmunológicas multiantigénicas o multivalentes . La presente invención también contempla regimener de multiinmunización en donde cualquier composición útil contra un patógeno puede ser combinada en los mismos o con las mismas composiciones de la presente invención. Por ejemplo, sin limitación, a un paciente se le puede administrar la composición inmunogénica de la presente invención y otra composición inmunológica para la inmunización contra S. Pneumoniae, como parte de un régimen de multiinmunización. Las personas de habilidad en la técnica serán fácilmente capaces de seleccionar composiciones inmunogénicas para el uso en conjunción con las composiciones inmunogénicas de la presente invención para los propósitos de desarrollo e implementación de regímenes de multiinmunización . Las modalidades específicas de esta invención se relacionan al uso de uno o más polipéptidos de esta invención, o ácidos nucleicos que los codifican, en una composición o como parte de un régimen de tratamiento para la prevención o alivio de la infección por S. pneumoniae. Se pueden combinar los polipéptidos 2086 o polinucleótidos 2086 con cualquier composición inmunogénica para el uso contra la infección por S. pneumonaie. También se pueden combinar los polipéptidos 2086 o polinucleótidos 2086 con cualquier otra proteina o vacuna meningocócica basada en polisacárido. Los polipéptidos 2086, fragmentos y equivalentes se pueden usar como parte de una composición inmunogénica conjugada; en donde una o más proteínas o polipéptidos son conjugados con un portador para generar una composición que tiene propiedades inmunogénicas contra varios serotipos y/o contra varias enfermedades. Alternativamente, uno de los polipéptidos 2086 se puede usar como una proteina portadora para otros polipéptidos inmunogénicos . La presente invención también se relaciona a un método para inducir respuestas inmunes en un mamífero, que comprende la etapa de proporcionar al mamífero una composición inmunogénica de esta invención. La composición inmunogénica es una composición que es antigénica en el animal o humano tratado tal que la cantidad inmunológicamente efectiva del (los) polipéptido { s ) contenida en tales composiciones origina la respuesta inmune deseada contra la infección por N. meningitidis . Las modalidades preferidas se relacionan a un método para el tratamiento, incluyendo el alivio, o la prevención de la infección por N. meningitidis en un humano, que comprende administrar a un humano una cantidad inmunológicamente efectiva de la composición. La frase "cantidad inmunológicamente efectiva", como se utiliza en la presente, se refiere a la administración de esa cantidad a un huésped mamifero (de preferencia hombre), ya sea en una dosis individual o como parte de una serie de dosis, suficiente para al menos causar que el sistema inmune del individuo tratado genere una respuesta que reduzca el impacto clínico de la infección bacteriana. Este puede variar de una disminución minima en la carga bacteriana a la prevención de la infección. Idealmente, el individuo tratado no mostrará las manifestaciones clínicas más severas de la infección bacteriana. La cantidad de dosificación puede variar de las condiciones especificas del individuo. Esta cantidad puede ser determinada en experimentos de rutina o de otro modo por medios conocidos por aquellos expertos en la técnica. Otro aspecto especifico de la presente invención se relaciona al uso como la composición inmunogénica de un vector o plásmido que expresa una proteina de esa invención como una porción inmunogénica de la misma. Por consiguiente, en un aspecto adicional esta invención proporciona un método para inducir una respuesta inmune en un mamifero, que comprende proporcionar a un mamifero un vector o plásmido que expresa por lo menos un polipéptido 2086 aislado. La proteina de la presente invención puede ser suministrada al mamífero usando un vector vivo, en particular usando bacterias recombinantes vivas, virus u otros agentes vivos, que contienen el material genético necesario para la expresión del polipéptido o porción inmunogénica como un polipéptido extraño . De acuerdo con una implementación adicional de la presente invención, se proporciona un método para diagnosticar meningitis bacteriana en un mamífero que comprende: detectar la presencia de complejos inmunes en el mamífero o una muestra de tejido del mamífero, el mamífero o muestra de tejido que se pone en contacto con una composición de anticuerpo que comprende anticuerpos que enlazan inmunoespecificamente con por lo menos un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS:2-252 de número par; en donde el mamífero o muestra de tejido se pone en contacto con la composición de anticuerpo bajo condiciones adecuadas para la formación de los complejos inmunes. Vectoras Virales y No Virales Los vectores preferidos, particularmente para ensayos celulares in vitro e in vivo, son vectores virales, tales como lentivirus, retrovirus, virus de herpes, adenovirus, adenovirus asociados, virus de vaccinia, baculovirus y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. Así, un ácido nucleico que codifica una proteína 2086 o fragmento inmunogénico de la misma puede ser introducido ín vivo, ex vivo o in vitro usando un vector viral o a través de la introducción directa del DNA. La expresión en tejidos dirigidos puede ser afectada al dirigir el vector transgénico a células específicas, tal como con un vector viral o un ligando de receptor o al usar un promotor específico de tejido, o ambos. El suministro de gen dirigido es descrito en la publicación de PCT No. WO 95/28494, la cual es incorporada en la presente por referencia en su totalidad. Los vectores virales comúnmente usados para la dirección in vivo o ex vivo y los procedimientos de terapia son vectores basados en DNA y vectores retrovirales . Los métodos para construir y usar vectores virales son conocidos en la técnica (por ejemplo, Miller y Rosman, BioTechniques, 1992, 7:980-990). De preferencia, los vectores virales son defectivos de replicación, es decir, ellos son incapaces de replicarse autónomamente en la célula objetivo. De preferencia, el virus defectivo de replicación es un virus mínimo, es decir, retienen solamente las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsular el genoma para producir partículas virales. Los vectores virales de DNA incluyen un virus de DNA atenuado o defectivo, tal como pero no limitado al virus de herpes simple (HSV) , papilomavirus, virus de Epstein Barr (EBV), adenovirus, adenovirus asociado (AAV) y similares. Los virus defectivos, que completamente o casi completamente carecen de genes virales, son preferidos. El virus defectivo no es infeccioso después de la introducción a una célula. El uso de vectores virales defectivos permite la administración de células en un área localizada, especifica, sin preocuparse de que el vector pueda infectar a otras células. Asi, un tejido especifico puede ser específicamente dirigido. Ejemplos de vectores particulares incluyen, pero no están limitados a, un vector de virus de herpes defectivo 1 (HSV1) (Kaplitt y colaboradores, Molec. Cell. Neurosci., 1991, 2:320-330, vector de virus de herpes defectivo que carece de un gen L de glucoproteina, u otros vectores de virus de herpes defectivo (publicaciones de PCT Nos. WO 94/21807 y WO 92/05263); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito por Strarford-Perricaudet y colaboradores (J. Clin. Invest., 1992, 90:626-630; ver también La Salle y colaboradores, Science, 1993, 259:988-990); y un vector de adenovirus asociado defectivo (Samulski y colaboradores, J. Virol., 1987, 61:3096-3101; Samulski y colaboradores, J. Virol., 1989, 63:3822-3828; Lebko ski y colaboradores, Mol. Cell. Biol., 1988, 8:3988-3996), cada una de las cuales es incorporada en la presente por referencia en su totalidad.

Varias compañias producen vectores virales comercialmente, incluyendo, pero no limitadas a, Avigen, Inc. (Alameda, CA; vectores AAV) , Cell Genesys (Foster City, CA; vectores retrovirales, adenovirales, AAV y vectores lentivirales) , Clontech (vectores retrovirales y baculovirales) , Genovo, Inc. (Sharon Hill, Pa; vectores adenovirales y AAV), Genvec (vectores adenovirales), IntroGene (Leinden, Netherlands; vectores adenovirales), Molecular Medicine (vectores retrovirales, adenovirales, AAV y virales de herpes), Norgen (vectores aenovirales) , Oxford BioMedica (Oxford, United Kingdom; vectores lentivirales) y Transgene (Strasbourg, Francia; vectores adenovirales, de vacinia, retrovirales y lentivirales), incorporadas por referencia en la presente en su totalidad. Vectores da Adenovirus. Los adenovirus son virus de DNA eucarióticos que pueden ser modificados para suministrar eficientemente un ácido nucleico de esta invención a una variedad de tipos de células. Existen varios serotipos de adenovirus. De estos serotipos, se da preferencia, dentro del alcance de la presente invención, a la utilización de los adenovirus humanos de tipo 2 o tipo 5 (Ad2 o Ad5) o adenovirus de origen animal (ver la publicación de PCT No. WO 94/26914) . Esos adenovirus de origen animal que pueden ser usados dentro del alcance de la presente invención incluyen adenovirus de origen canino, bovino, murino (Por ejemplo: Mavl, Beard y colaboradores, Virology, 1990, 75-81), ovino, porcino, de aves y de simios (ejemplo: SAV) . De preferencia, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, más de preferencia un adenovirus CAV2 (por ejemplo, cepa Manhattan o A26/61), ATCC VR-800, por ejemplo). Varios adenovirus defectivos de replicación y vectores de adenovirus mínimos han sido descritos (publicaciones de PCT Nos. WO 94/26914, WO 95/02697, WO 94/28938, WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697, WO 96/22378) . Los adenovirus recombinantes defectivos de replicación de acuerdo con la invención se pueden preparar mediante cualquier técnica conocida para la persona experta en la técnica (Levrero y colaboradores, Gene, 1991, 191:195; publicación europea No. EP 185 573; Graham, EmBO J., 1984, 3:2917; Graham y colaboradores, J. Gen. Vírol., 1977, 36:59). Los adenovirus recombinantes son recuperados y purificados usando técnicas biológicas moleculares estándares, que son bien conocidas para personas de habilidad ordinaria en la técnica. Adenovirus asociados. Los adenovirus asociados (AAV) son virus de DNA de tamaño relativamente pequeño que puede integrarse, de una manera estable y especifica del sitio, en el genoma de las células que ellos infectan. Ellos son capaces de infectar un amplio espectro de células sin inducir algunos de los efectos en el crecimiento celular, morfología o diferenciación y no aparecen para estar implicados en patologías humanas. El genoma de AAV ha sido clonado, secuenciado y caracterizado. El uso de vectores derivados de los AAVs para la transferencia de genes ín vitro e in vivo ha sido descrito (ver, las publicaciones de PCT Nos. WO 91/18088 y WO 93/09239; las patentes norteamericanas Nos. 4,797,368 y 5,139,941; la publicación europea No. EP 488 528) . Los AAVs recombinantes defectivos recombinantes de replicación de acuerdo con la invención se pueden preparar al cotransfectar un plásmido que contiene la secuencia de ácidos nucleicos de interés flanqueada por dos regiones de repetición terminales invertidas (ITR) de AAV, y un plásmido que lleva los genes de encapsidación de AAV (genes rep y cap) en una linea de células que es infectada con un virus ayudante humano (por ejemplo un adenovirus) . Los AAV recombinantes que son producidos luego son purificados mediante técnicas estándares. Vectores de retrovirus. En otra implementación de la presente invención, el ácido nucleico puede ser introducido en un vector retroviral, por ejemplo, como es descrito en la patente norteamericana No. 5,399,346; Mann y colaboradores, Cell, 1983, 33:153; patentes norteamericanas Nos. 4,650,764 y 4,980,289; Markowitz y colaboradores, J. Virol., 1988, 62:1120; patente norteamericana No. 5,124,263; publicaciones europeas Nos. EP 453 242 y EP178 220; Bernstein y colaboradores, Genet. Eng. , 1985, 7:235; McCormick, BioTechnology, 1985, 3:689; publicación de PCT No. WO 95/07358; y Kuo y colaboradores, Blood, 1993, 82:845, cada una de las cuales es incorporada por referencia en su totalidad. Los retrovirus son virus de integración que infectan células divisorias. El genoma de retrovirus incluye dos LTRs, un secuencia de encapsidación y tres regiones de codificación (gag, pol y env) . En vectores retrovirales recombinantes, los genes gag, pol y env son generalmente suprimidos, por completo o en parte, y reemplazados con una secuencia de ácidos nucleico heteróloga de interés. Estos vectores pueden ser construidos de diferentes tipos de retrovirus tales como HIV, MoMuLV ("virus de leucemia Moloney murino") MSV ("virus de sarcoma Moloney murino") , HaSV ("virus de sarcoma Harvey"); S V ("virus de necrosis de bazo"); RSV ("virus de sarcoma Rous") y virus Friend. Las lineas de célula empacadas adecuadas se han descrito en la técnica previa, en particular la linea de células PA317 (patente norteamericana No. 4,861,719); la linea de células PsiCRIP (publicación de PCT No. WO 90/02806) y la linea de células GP+envAm-12 (publicación de PCT No. WO 89/07159). Además, los vectores retrovirales recombinantes pueden contener modificaciones de los LTRs para suprimir la actividad de transcripción asi como las secuencias de encapsidación extensivas que pueden incluir una parte del gen gag (Bender y colaboradores, J. Virol., 1987, 61:1639). Los vectores retrovirales recombinantes son purificados mediante técnicas estándares conocidas para aquellos que tienen habilidad ordinaria en la técnica. Los vectores retrovirales pueden ser construidos para funcionar como particulas infecciosas o para someterse a una sola ronda de transfección. En el primer caso, el virus es modificado para retener todos sus genes excepto para aquellos responsables para las propiedades de transformación oncogénicas, y para expresar el gen heterólogo. Los vectores virales no infecciosos son manipulados para destruir la señal de empaque viral, pero requieren los genes estructurales requeridos para empacar el virus cointroducido diseñado para contener el gen heterólogo y las señales de empaque. Asi, las particulas virales que son producidas no son capaces de producir virus adicional. Los vectores de retrovirus también pueden ser introducidos mediante los virus de DNA, que permiten un sitio de replicación retroviral y amplifica la eficiencia de transcripción (ver las publicaciones de PCT Nos. WO 95/22617, WO 95/26411, WO 96/39036 y WO 97/19182). Vectores da Lenti irus. En otra implementación de la presente invención, los vectores lentivirales pueden ser usados como agentes para el suministro directo y la expresión sostenida de un transgen en diversos tipos de tejido incluyendo cerebro, retina, músculo, hígado y sangre. Los vectores eficientemente pueden transducir células divisorias y no divisorias en estos tejidos, y efectuar la expresión a largo plazo del gen de interés. Para una revisión, ver, Naldini, Curr. Opin. Biotechnol., 1998, 9:457-63; ver también Zufferey y colaboradores, J. Virol., 1998, 72:9873-80). Las lineas de células de empaque lentiviral están disponibles y generalmente conocidas en la técnica. Ellas facilitan la producción de vectores de lentivirus de alto titulo para la terapia génica. Un ejemplo es una linea de células de empaque de lentovirus de seudotipo VSV-G inducible con tetraciclina que puede generar partículas de virus en títulos mayores que 106 IU/mL por al menos 3 a 4 días (Kafri y colaboradores, J. Virol., 1999, 73:576-584). El vector producido por la línea de células inducible puede ser concentrada como sea necesario para transducir eficientemente las células no divisorias in vítro o in vivo. Vectores no vírales. En otra implementación de la presente invención, el vector puede ser introducido in vivo por lipofección, como DNA desnudo, o con otros agentes que facilitan la transfección (péptidos, polímeros, etc.). Los lípidos catiónicos sintéticos pueden ser usados para preparar liposomas para la transfección in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A-, 1987) 84:7413-7417; Felgner y Ringold, Science, 1989, 337:387-388; ver Mackey y colaboradores, Proc. Nati. Acad.

Sci. U.S. A., 1988, 85:8027:8031; Ulmer y colaboradores, Science, 1993, 259:1745-1748) . Los compuestos de lipido útiles y composiciones para la transferencia de ácidos nucleicos son descritos en las publicaciones de patentes de Pct Nos. WO 95/18863 y WO 96/17823 y patente norteamericana No. 5,459,127. Los lipidos pueden ser químicamente acoplados a otras moléculas para el propósito de dirección (ver Mackey y colaboradores, supra) . Los péptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y proteínas tales como anticuerpos, o moléculas no de péptido podrían ser acoplados a los liposomas químicamente. Otras moléculas también son útiles para facilitar la transfección de un ácido nucleico in vivo, tal como un oligopéptido catiónico (por ejemplo, publicación de patente de PCT No. WO 95/21931), péptidos derivados de proteínas de enlace de DNA (por ejemplo, publicación de patente de PCT No. WO 96/25508), o un polímero catiónico (por ejemplo, publicación de patente de PCT No. WO 95/21931). También es posible introducir el vector in vivo como un plásmido de DNA desnudo. Los vectores de DNA desnudo para propósitos de vacuna o terapia génica pueden ser introducidos en las células huésped deseadas por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, electroporación, microinyección, fusión de células, DEAE dextrano, precipitación con fosfato de calcio, uso de una pistola génica, o uso de un transportador de vector de DNA (por ejemplo, u y colaboradores, J. Biol. Chem. , 1992, 267:963-967; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 1988, 263:14621-14624; solicitud de patente canadiense No. 2,012,311; Williams y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 1991, 88:2726-2739) . También se pueden usar procedimientos de suministro de DNA mediado por receptor (Curiel y colaboradores, Kum. Gene Ther., 1992, 3:147-154; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 1987, 262:4429-4432). Las patentes norteamericanas Nos. 5,580,859 y 5,589,466 describen el suministro de secuencias de DNA exógenas, libres de agentes que facilitan la transfección, en un mamífero. Recientemente, una técnica de transferencia de DNA in vivo de alta eficiencia, de voltaje relativamente bajo llamada electrotransferencia, ha sido descrita (Mir y colaboradores, CP. Acad. Sci., 1988, 321:893; publicaciones de PCT Nos. WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175). Por consiguiente, modalidades adicionales de la presente invención se relacionan a un método para inducir una respuesta inmune en un humano, que comprende administrar al humano una cantidad de una molécula de DNA que codifica un polipéptido 2086 de esta invención, opcionalmente con un agente que facilita la transfección, donde el polipéptido, cuando es expresado retiene la inmunogenicidad y, cuando es incorporado en una composición inmunogénica y administrado a un humano, proporciona protección sin inducir enfermedad aumentada en la infección subsecuente del humano con el patógeno Neisseria sp., tal como N. menxngítidis . Los agentes que facilitan la transfección son conocidos en la técnica e incluyen un bupivicaina, y otros anestésicos locales (por ejemplo ver la patente norteamericana No. 5,739,118) y poliaminas catiónicas (como es publicado en la solicitud de patente internacional No. O 96/10038), que son incorporadas en la presente por referencia. La presente invención también se relaciona a un anticuerpo, que puede ser ya sea un anticuerpo monoclonal o policlonal, especifico para polipéptidos 2086 como es descrito en lo anterior. Tales anticuerpos pueden ser producidos por métodos que son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Sistemas de Expresión Bacterianos y Plásmidos Esta invención también proporciona una molécula de DNA recombinante, tal como un vector o plásmido, que comprende una secuencia de control de expresión que tiene secuencias de promotor y secuencias de iniciador y una secuencia de nucleótxdos que codifica para un polipéptido de esta invención, la secuencia de nucleótidos que está localizada 3' a las secuencias de promotor y de iniciador. Todavia en otro aspecto, la invención proporciona un vehículo de clonación de DNA recombinante capaz de expresar un polipéptido 2086 que comprende una secuencia de control de expresión que tiene secuencias de promotor y secuencias de iniciador, y una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido 2086, la secuencia de nucleótidos que está localizada 3' a las secuencias de promotor y de iniciador. En un aspecto adicional, se proporciona una célula huésped que contiene un vehículo de clonación de DNA recombinante y/o una molécula de DNA recombinante como es descrito en lo anterior . Las secuencias de control de expresión adecuadas y las combinaciones de célula huésped/vehiculo de clonación son bien conocidas en la técnica, y son descritas a manera de ejemplo, en Sambrook y colaboradores (1989) . Una vez que los vehículos de clonación de DNA recombinantes y/o células huésped que expresan un polipéptido a deseado de esta invención se ha construido al transformar, transfectar e infectar tales vehículos de clonación o células huéspedes con plásmidos que contienen el polinucleótido 2086 correspondiente, los vehículos de clonación o células huésped son cultivadas bajo condiciones tal que son expresados los polipéptidos . El polipéptido luego es aislado sustancialmente libre de componentes de célula huésped contaminantes por técnicas bien conocidas para aquellos expertos en la técnica.

Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar modalidades preferidas de la invención. Se debe apreciar por aquellos expertos en la técnica que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención, y asi se pueden considerar que constituyen modos preferidos para su práctica. Sin embargo, aquellos expertos en la técnica, en vista de la presente descripción, deben apreciar que se pueden hacer muchos cambios en las modalidades especificas que son descritas y aun obtener un resultado parecido similar sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. EJEMPLOS Ejemplo 1 Identificación de un extracto de proteina de membrana neisserial capaz de producir anticuerpos bactericidas contra cepas heterólogas. Con referencia a la Tabla II enseguida, las preparaciones de proteina de membrana externa agotadas de LOS se han mostrado que producen anticuerpos bactericidas. Estos anticuerpos son frecuentemente dirigidos hacia la PorA de la cepa respectiva. Las preparaciones de membrana externa agotada de LOS de la cepa 8529 meningocócica del serogrupo B (B:15:P1.7b, 3) son inusuales de esta manera debido a que inesperadamente producen anticuerpos bactericidas para varias cepas heterólogas. TABLA II Actividad de BC del Anti-sCMPS Contra Diferentes Cepas de N. meninfi.tídis Para facilitar el aislamiento y la caracterización del (los) antigeno (s) responsables para producir anticuerpos bactericidas heterólogos, los solicitantes buscaron U7 identificar que detergente óptimamente extrajo el (los) antigeno (s ) . Cepas y condiciones de cultivo La cepa 8529 de N. meningitidis de un frasquito congelado se depositó en rayas sobre una placa GC. (La cepa 8529 meningocócica se recibió del RIVM, Bilt oven, The Netherlands) . La placa . se incubó a 36eC/5% de C02 durante 7.5 h. Varias colonias se usaron para inocular un matraz que contiene 50 mL de medio Frantz modificado + suplemento GC. El matraz se incubó en un agitador de aire a 36°C y se agitó a 200 RPM durante 4.5 h. 5 mL se usaron para inocular un matraz Fernbach que contiene 450 mL de medio Frantz modificado + suplemento GC. El matraz de incubó en un agitador de aire a 36°C y se agitó a 100 RPM durante 11 h. Los 450 mL completos se usaron para inocular 8.5 L del medio Frantz modificado + suplemento GC en un termentador de 10 L. Composición del Medio Frantz Modificado: Acido glutámico 1.3 g/L Cisteina 0.02 Fosfato de sodio, dibásico, 7 hidrato 10 Cloruro de potasio 0.09 Cloruro de sodio 6 Cloruro de amonio 1.25 Extracto de levadura dializado (YE) 40 mi (Solución de YE al 25% dializada contra 5 volúmenes de dH20 durante la noche, luego esterilizada en autoclave) . Suplemento GC 100X, esterilización en filtro Dextrosa 400 g/1 Acido glutámico 10 Cocarboxilasa 0.02 Nitrato férrico 0.5 Los siguientes parámetros se controlaron durante la fermentación: Temperatura=36°C; pH=7.4; Oxigeno Disuelto=20%. Varias gotas de antiespumante P-2000 se adicionaron para controlar la espumación. El cultivo se desarrolló a la fase estacionaria. Las células de cosecharon por centrifugación a OD650=5.25. Un total de 100-300 gramos de pasta de célula húmeda es típicamente cosechada de ~8.5 L de cultivo. Purificación parcial de las fracciones de proteína de membrana externa de meningococos que producen anticuerpos bactericidas heterólogos: 100 gramos en peso húmedo de células se suspendieron, a un volumen cinco veces el peso húmedo, con HEPES-NaoH 10 mM, pH 7.4, Na2EDTA 1 mM y se lisaron mediante el pasaje a través de un microfluidizador HOY equipado con una cámara a -18,000 psi. El lisado de células se clarificó y la envoltura de célula se aisló por centrifugación a 300,000 x g durante 1 hora a 10°C. Las envolturas de células se lavaron 2X con la misma solución reguladora mediante la suspensión con un homogenizador seguido por la centrifugación como antes. Las envolturas de célula luego se extrajeron con 320 mL de Tritón X-100 al 1% (p/v) en HEPES-NaOH 10 mM, pH 7.4, MgCl2 1 mM. Con referencia a la Tabla III enseguida, los resultados de la extracción con detergente diferencial secuencial usando Tritón X-100 y Zwittergent 3-14 seguido por la inmunización de los ratones, permitió determinar que los extractos con Tritón óptimamente extrajeron el (los) candidato (s) de interés. Este extracto con Tritón X-100, que produce la respuesta de anticuerpo bactericida contra 4 de cada cinco cepas listadas en la tabla III, luego se fraccionó mediante el enfocamiento isoeléctrico preparativo (IEF) en una unidad BioRad Rotophor. Las concentraciones de anfolito fueron de 1% pH 3-10 mezclado con 1% pH 4-6. Como es mostrado en la Tabla III, varias fracciones se encontraron que produce una respuesta bactericida heteróloga. Las fracciones obtenidas de IEF, que se enfocaron en el rango de pH de 5.5-7.8, produjeron una respuesta heteróloga a la mayoría de las cepas como es determinado por el ensayo bactericida. Las fracciones de IEF acumuladas se concentraron y los anfolitos se retiraron mediante la precipitación con etanol. Una purificación adicional se llevó a cabo al absorber algunas de las proteinas obtenidas en el rango de pH de aproximadamente 5.5-7.8 en una columna de intercambio aniónico y al comparar la actividad bactericida obtenida después de inmunizar ratones con las proteinas absorbidas y no absorbidas. Con referencia nuevamente a la Tabla III/ mientras que muchas proteinas se absorbieron a la resina de intercambio aniónico, las proteinas que no se absorbieron por la columna mostraron más anticuerpos bactericidas heterólogos. TABLA III BC5o Cepa Objetivo Método Fracción H44/76 880049 H355 539* M982 Agotado de LOS- sOMPs 1,000 215 450 NC 50 Extractos con Extracto Citoplásraico 200 NT NT NT NT De erqente TX-100 >aoo >800 >800 í-800 <25 2witterqent 3-12 400 >25 100 400 <25 2wittergent 3-14 <25 NT NT NT NT Zw. 3-14 + NaCl <25 NT NT NT NT Sarcosilo <25 NT NT NT NT Zw, 3-14 + calor <25 NT NT NT NT IE Preparativo Fracciones 1-3 (pH 50 NT NT NT NT 2.3-3.9! Fracción 4 (pH 4.1) >800 <25 100 25 NT Fracción 5 (pH 4.3) >800 <25 100 200 NT Fracción 6 (pH 4.5) 400 NT NT NT NT Fracción 7 (pH 4.8) <25 NT NT NT NT Fracciones 8-9 (pH <25 NT NT NT NT 5.0-5.3) Fracciones 10-17 (pH >800 200 <800 <800 NT 5.5-7.8 Inteccaiobio Absorbido 400 NT 100 100 NT Aniónico No absorbido >6,400 NT <800 ¦-800 NT NT: no probado *El aislado clínico 539 es una cepa homologa a 8529, aislada del mismo brote de enfermedad. Como es mostrado en la FIG. 1A, dos proteínas mayores estuvieron presentes en la fracción no absorbida como es determinado por SDS-PAGE. Para identificar estas proteínas, se realizaron dos tipos de análisis. Un análisis fue realizar la degradación proteolitica limitada (Ver la FIG. 1A y FIG. IB) seguido por el aislamiento de los péptidos y la secuenciación de proteina directa. El otro análisis fue realizar SDS-PAGE seguido por la excisión en gel, digestión proteolitica y LC-MS/MS (Espectrometría de Masas en tándem con Cromatografía Liquida), (Ver la FIG. 3) para obtener la información espectral de masas sobre los componentes de las preparaciones de interés) . (Ver el mapeo de péptido y los métodos de secuenciación descritos después en esta sección) La secuencia genómica de A Sanger de N. meningitidis se analizó usando los métodos y algoritmos en Zagursky y Russel, 2001, BioTechniques, 31:636-559. Este análisis de sembrado produjo arriba de 12,000 posibles Estructuras de Lectura Abierta (ORFs) . Tanto los datos de la secuencia directa como los datos espectrales de masa descritos en lo anterior indicaron que los componentes mayores de la fracción no absorbida fueron los productos de varias ORFs presente en un análisis de la base de datos de Sanger. Las tres proteínas predominantes identificadas por esta metodología corresponden a ORFs 4431, 5163 y 2086, (ver las FIGS. IB y 3) . Aunque la ORF4 31 fue la proteina más predominante identificada en las fracciones, los anticuerpos de ratón para la 4431 lipidada recombinante no fueron bactericidas y no proporcionaron una respuesta protectora en un modelo de animal. El análisis adicional de la ORF 5163 está en progreso. El segundo componente más predominante de las preparaciones descritas en la presente corresponde al producto de ORF 2086. Métodos de ZnmunogenjLc dad: Preparación de a ti suero : Excepto donde es mencionado, las composiciones de proteína/vacunas se formularon con 25 \ig de proteína total y fueron preparadas con adyuvante con 20 pg de QS-21. Una dosis de 0.2 mL se administró mediante la inyección subcutánea (rump) a ratones Swiss-Webster hembras de 6-8 semanas de edad en la semana 0 y . Los sangrados se colectaron en la semana 0 y 4, y un sangrado exsangüíneo final se realizó en la semana 6. Ensayo bactericida: Los ensayos bactericidas se realizaron esencialmente como es descrito (Ver Afountzouros y Howell, 2000, J. Clin. Microbiol. 38 (8) :2878-2884) . Los títulos bactericidas dependientes del anticuerpo mediado con complemento para el SBA se expresaron como el reciproco de la dilución más alta del suero de prueba que mató =50 de las células objetivo introducidas en los ensayos (titulo BC¾o) · Métodos usados para identificar la proteina 2086: Segmentación con Bromuro de Cianógeno y secuenciación directa de los fragmentos. Segmentación con Bromuro de Cianógeno de la Fracción no Absorbida de Intercambio Aniónico (AEUF) . La AEUF se precipitó con etanol frió al 90% y se solubilizó con bromuro de cianógeno 10 mg/ml en ácido fórmico al 70% a una concentración de proteina de 1 mg/mL. La reacción se realizó durante la noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Los productos sedimentados se secaron mediante el vacio rápido, y la pelotilla se solubilizó con HE/TX-100 reducido al 0.1%. El SDS-PAGE seguido por la secuenciación de aminoácido N-terminal se usaron para identificar los componentes de esta fracción.

Digestión de proteasa/fase inversa/sec enciación N-terminal para identificar componentes: La AEUF se digirió con ya sea GluC (V8), LysC o ArgC. La relación de proteina a enzima fue de 30 ]ig de proteina 1 de enzima. La digestión se llevó a cabo 37°C durante la noche. La mezcla de proteina digerida (30 pg) se pasó sobre una columna Aquapore RF-300 de 7 mieras y se eluyó con un gradiente de acetonitrilo al 10-95% en ácide trifluoroacético al 0.1%, y los picos se recolectaron manualmente. Un blanco no de proteina también se corrió, y los picos de éste se sustrajeron del cromatograma de muestras. Los picos que surgen solamente en la muestra corrida se analizaron mediante el espectrómetro de masas y aquellas muestras que dan una masa clara se analizaron para la secuenciación de aminoácido N-terminal. Secuenciación de aminoácidos N-terminal Para bandas cortadas de una mancha, la muestra de proteina es transferida de un gel de SDS a una membrana de PVDF, manchado con Amido Black (ácido acético al 10%, amido black al 0.1% en agua desionizada) y desmanchada en ácido acético al 10%. La banda de proteina de seda luego es cortada de todas las diez franjas y usando un escalpelo limpiado con metanol o cuchilla mini-Exacto y colocada en el cartucho de reacción del secuenciador de proteina Applied Biosystems 477A. Para la secuenciación directa de las muestras en solución, el cartucho Prosorb es ensamblado y la PVDF humectada con 60 µ? de metanol. La PVDF es enjuagada con 50 µ? de agua desionizada y la muestra (50 µ?) es cargada a la PVDF. Después 50 µ? de agua desionizada son utilizados para enjuagar la muestra, la PVDF de Prosobr es perforada, secada y colocada en el cartucho de reacción del secuenciador de proteina Applied Biosystems 477A. Para ambos métodos, el Secuenciador N-terminal Applied Biosystems luego es corrido bajo condiciones de manchado óptimo para 12 o más ciclos (1 ciclo Blanco, 1 ciclo Estándar y 10 o mas para la identificación del residuo deseado) y la detección de PTH-aminoácidos se hace en el Analizador Applied Biosystems 120A PTH. Los ciclos son colectados ambos en un registrador de carta analógica y digitalmente por medio del software del instrumento. La asignación de aminoácidos se hace usando los datos analógicos y digitales en comparación de un conjunto estándar de PTH-aminoácidos y sus tiempos de retención respectivos sobre el analizador (los residuos de cisteina son destruidos durante la conversión y no son detectados) . La información de la secuencia múltiple puede ser obtenida de un solo residuo y las asignaciones primarias contra secundarias se hacen basadas en la intensidad de señal. LC-MS/MS Las muestras de proteina purificadas por IEF se analizaron adicionalmente mediante la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida . Las proteinas se visualizaron mediante el manchado con azul de Commasie y las bandas de interés se cortaron manualmente, luego se redujeron, se alquilaron y se digirieron por tripsina (Promega, Madison, WI) in situ usando un robot de digestión triptica en gel automatizado (1) . Después de la digestión, los extractos de péptido se concentraron a un volumen final de 10-20 µ? usando un Concentrador Savant Speed Vac (ThermoQuest, Holdbrook, NY) . Los extractos de péptido se analizaron en una HPLC de fase inversa de microelectrorrocio automatizada. En resumen, la interfase de microelectrorrocio consistió de una aguja de roció de silice fusionado Picofrit, 50 cm de longitud por 75 um de ID, 8 um de diámetro de orificio (New Objective, Cambridge MA) empacada con cuentas de fase inversa C18 10 um (YMC, Wilmington, NC) a una longitud de 10 cm. La aguja Picofrit se montó en un sostenedor de fibra óptica (Melles Friot, Irvine, CA) mantenido en una base de construcción casera posicionada en el frente del detector de espectómetro de masas. La parte trasera de la columna se sondeó a través de una unión de titanio para suministrar una conexión eléctrica para la interfase de electrorocio. La unión se conectó con una longitud de tubería capilar de silice fusionado (FSC) a un automuestreador FAMOS (LC-Paclings, San Francisco, CA) que se conectó a un bomba de solvente de HPLC (ABI 140C, Perkin-Elmer, NorwalJc, CT) . La bomba de solvente de HPLC suministró un flujo de 50 µ?/min que se redujo a 250 nL/min usando una te de división microhermética PEEK (Upchurch Scientific, Oak Harbor, A) y luego se suministró al automuestreador usando una linea de transferencia FSC. La bomba LC y el automuestreador fueron cada uno controlado usando sus programas de usuario interno. Las muestras se insertaron en frasquitos muestreadores de plástico, se sellaron y se inyectaron usando una vuelta de muestra de 5 µL. HPLC microcapilar-espectrometría de masas Los péptidos extraidos de las digestiones en gel se separaron mediante el sistema de HPLC de microelectrorrocio usando un gradiente de 50 minutos de solvente B al 0-50% (A:HoAc 0.1 M, B: MeCN al 90%/HoAc 0.1 M) . Los análisis de péptido se hicieron en un espectrómetro de masas de trampa de iones Finnigan LCQ (ThermoQuest, San José, CA) operando a un voltaje de roció de 1.5 kV, y usando una temperatura de capilar calentado de 150°C. Los datos se adquirieron en el modo MS/MS automatizado usando el software de adquisición de datos proporcionado con el instrumento. El método de adquisición incluyó una exploración 1 MS (375-1200 m/z) seguido por exploraciones MS/MS de la parte superior 3 más abundante de iones en la exploración MS. La exclusión dinámica y las funciones de exclusión de isótopo se emplearon para incrementar el número de iones de péptido que se analizaron (ajuste: 3 amu=anch"o de exclusión, 3 min=duración de exclusión, 30 segs= duración de preexclusión, 3 amu=ancho de exclusión de isótopo) . El análisis automatizado de los datos de MS/MS se realizó usando el algoritmo de computadoras SEQUEST incorporado en el paquete de análisis de datos Finnigan Bioworks (ThermoQuest, San José, CA) usando la base de datos de proteínas derivadas del genoma completo de N. meningítidis (de Sanger) . Los resultados del Estudio son ilustrados en la FIG. 3. Ejemplo 2 Clonación de P2086 Lipidada Hecombinante (rLP2086) : A) . Secuencia Guia Nativa: Materiales fuente: El gen ORF 2086 se amplificó mediante PCR a partir de un aislado clínico de una cepa de Neisseria meningitidis serogrupo B designado 8529. El serogrupo, serotipo y serosubtipo de esta cepa se muestran entre paréntesis; 8529 (B:15, PI:7b,3). Esta cepa meningocócica se recibió de RIVM, Bilthoven, The Netherlands. La secuencia de gen de proteína 2086 madura de la cepa meningocócica 8529 se proporciona en la presente como la SEQ ID NO:212. Amplificación por PCR y Estrategia de Clonación: Una inspección visual de la ORF2086 indicó que este gen tiene una secuencia de señal de lipoproteína potencial. El análisis adicional usando un algoritmo de Lipoproteína Modelo Hidden Markov patentado confirmó que la ORF2086 contiene una secuencia de señal de lipoproteina. Para expresar recombinantemente la P2086 en una conformación más similar a la nativa, se diseñaron cebadores de oligonucleótido para amplificar el gen de longitud completa con la secuencia de lipoproteina intacta y se basaron en un análisis de la secuencia de Sanger para ORF2086 de N. meníngitidís (5' cebador-CT ATT CTG CAT ATG ACT AGG AGC y 3' cebador-GCGC GGATCCTTA CTG CTT GGC GGC AAG ACC) , que son la SEQ OD NO:304 (Compuesto No. 4624) y SEQ ID NO:303 (Compuesto No. 4623), respectivamente (Ver también la Tabla IV en la presente) . El gen 2086 se amplificó mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) [ciclador térmico ABI 2400, Applied Biosystem, Foster City, CA] de la cepa 8529 de N. meníngitidís. El producto amplificado de tamaño correcto se ligó y se clonó en pCR2.1-TOPO (Invitrogen) . El DNA del plásmido se digirió con restricción con Ndel y BamHI, se purificó en gel y se ligó en el vector pET-27b(+) (Novagen) .

Los cebadores de oligonucleótido descritos en la presente, se sintetizaron en un sintetizador de oligonucleótido PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, Foster City CA, usando la quimica de ß-Cianoetilfosforamidita, Applied Biosystems, Foster City CA. Los cebadores usados para la amplificación por PCR de las familias de genes ORF2086 son listados en la Tabla IV, que muestra ejemplos no limitativos de cebadores de la presente invención. TABLA IV: CEBADORES SEQ 10 NO. Cebador Secuencia Sitios d» (Ccznpueato Restricción No.) 303 Trasero GCGCGGATCCTTACTGCTTGGCGGCAAGACC BamHi (4623) 304 Delantero CTATTCTGCATATGACTAGGAGC Ndel (4624) 305 Delantero AGCAGCGGAGGCGGCGGTGTC (4625) 306 Delantero TGCCGATGCACTAACCGCACC (5005) 307 Trasero CGTTTCGCAACCATCTTCCCG ¡5007) 308 Trasero GAGATCTCACTCACTCATTACTGCTTGGCGGCAAGACCGATATG BglII (51351 309 Delantero GCGGATCCAGCGGAGGGGGTGGTGTCGCC Ba, HI (5658) 310 Trasero GCGCATGCTTACTGCTTGGCGGCAAGACCGATATG SpHI (5660) 311 Delantero GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGAAGC BamHi (6385) 312 Delantero GCGCAGATCTCATATGAGCAGCGGAGGGGGTGGTGTCGCCGCCGAyA BglII y (6406) TMGGTGCGGGGCTTGCCG Ndel 313 Delantero CTATTCTGCGTATGACTAG (6470) 314 Trasero GTCCGAACGGTAAATTATCGTG (6472) 315 Delantero GC GGATCC AGCGGAGGCGGCGGTGTCGCC BamHI (6473) 316 Delantero G AGATCTCATATG AGCAGCGGAGGCGGCGGAAGC BglII y (6474) Ndel 317 Delantero GACAGCCTGATAAACC (6495) 318 Trasero GATGCCGATTTCGTGAACC (6496) 319 Trasero GCGCATGCCTACTGT TGCCGGCGATC ?C Sphl (6543) 320 Trasero GAGATCTCACTCACTCACTACTGTTTGCCGGCGATGCCGATTTC BglII (6605) 321 Delantero GCGCAGATCTCATATGAGCAGTCGGAGGCGGCGGAAGCGGAGGCGGC BglII y (6721) GGTGTCACCGCCGACATAGGCACG Ndel Expresión da lipoproteina rLP2086 utilizando la secuencia guia nativa: Con referencia a la FIG. 5, el plásmido pPX7340 se transformó/transfectó o infectó en las células huéspedes BLR (DE3) pLysS (Life Sciences) . Se seleccionó un transformante y se inoculó en 50 mL de Terrific Broth que contiene glucosa al 2%, canamicina (30 µg/mL, cloranfenicol (30 g/mL) y tetraciclina (12 pg/mL) . La OD600 para el cultivo durante la noche con el 6.0. El cultivo durante la noche se dividió en 1 litro de Terrific Broth con glicerol al 1% y los mismos antibióticos. La OD600 de partida puede ser 0.4. Después de 2 horas la OD600 fue de 1.6. y se tomó una prueba preinducida . Las células equivalentes a OD600=1 se centrifugaron y el sobrenadante se retiró. La pelotilla de células completas se resuspendió en 150 L de solución reguladora Tris-EDTA y 150 iL de solución reguladora de muestra de SDS-PAGE 2x. Se adicionó IPTG a una concentración final de 1 mM. Después de 3.5 horas se tomó una muestra posinducida como es descrita y analizado en SDS-PAGE (Ver la Fig. 4) . Purificación de rLP2086: La rLP2086 se solubilizó de E. coli después de la extracción con detergente diferencial. Distinta a la P2086 en su medio ambiente nativo, la rLP2086 no se solubilizó significantemente por el Tritón X-100 o Zwittergent 3-12. El volumen de la rLP2086 se solubilizó con sarcosilo, indicando que interactúa con los componentes de membrana externa de E. coli diferentemente como lo hace en N. meningitidis . Una vez solubilizada, la rLP2086 se purificó de manera similar a la proteina nativa en que muchas de las proteínas de E. coli contaminantes podrían ser removidas mediante absorción a una resina de intercambio aniónicc a pH 8. A pesar de ser mayor que una mitad de una unidad de pH arriba de su pl teórico, la rLP2086 permaneció no absorbida a pH 8. La purificación adicional se logró mediante la absorción de la rLP2086 con una resina de intercambio catiónico pH 4.5 La homogeneidad de la rLP2086 se muestra en la FIG. 2 después de SDS-PAGE. La masa de rLP2086 se determinó mediante el análisis espectral de masas MALDI-TOG que es de 27,836. Esta masa difiere de la masa teórica de 27,100 por 736, que se aproxima a la masa de la modificación de lipido de N-terminal como unas lipoproteinas bacterianas. Tanto la nativa como la rLP2086 aparecen para ser lipoproteinas de membrana externa. Los intentos con la secuenciación N-terminal se bloquearon y esto está consistente con la modificación terminal. Métodos de Purificación: Pelotillas congeladas de células BLR DE3 pLysS que expresan P2086 se suspendieron en HEPES-NaOH 10 mM/EDTA lmM/1 g/mL de inhibidor de proteasa Pfefabloc SC (Roche) pH 7.4 (HEP) a 20 ml/g de peso de célula húmeda y se lisaron mediante el microfluidizador (Microfluidics Corporation Model HOY). El lisado de célula se centrifugó a 150,000 x g durante una hora. La pelotilla se lavó dos veces con HEP y se centrifugó dos veces, y la pelotilla de membrana resultante se congeló durante la noche. La pelotilla se solubilizó con HEPES-NaoH 10 mM/MgCl2 1 mM/TX-100 al 1% pH 7.4 durante 30 minutos, seguido por la centrifugación a 150,000 x g durante 30 minutos. Esto se repitió tres veces. La pelotilla de membrana se lavó arriba de dos veces con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent 3-12 al 1% pH 8, seguido por dos lavados cada uno de Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent 3-14 al 1% pH 8 y Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent 3-14 al 1%/NaCl 0.5 M pH8. La rLP2086 luego se solubilizó con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/sarcosilo al 1% pH 8. Este extracto de sarcosilo se ajustó a Zwittergent 3-14 (Z3-14) al 1% y se dializó dos veces contra un exceso de 30 veces de Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Z3-14 al 1%. El extracto de rLP2086 dializado se precipitó con etanol al 90% para retirar el sarcosilo restante y se solubilizó con _Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Z3-14 al 1% pH 8 (TEZ) . El material insoluble se retiró por centrifugación, el sobrenadante se pasó sobre una columna de cromatografía de intercambio aniónico, y la rLP2086 se colectó en la fracción no enlazada. El material no enlazado luego se dializó dos veces contra un exceso de 30 veces de NaAc 25 mM/Ze-14 al 1% pH 4.5 y se pasó sobre una columna de cromatografía de intercambio catiónico. La rLP2086 se eluyó con un gradiente de NaCl 0-0.3 M y se analizó mediante SDS-PAGE (manchado de Coomassie) . La acumulación de rLP2086 se determinó que es 84% pura mediante la densitometria de láser.

Reactividad de Superficie de Actividad Bactericida del Antisuero para la Subfamilia B de rLP2086 Con referencia a la Tabla VII, el antisuero al rLP2086 purificada de la cepa 8529 de la Subfamilia B, demostró reactividad de superficie para todas las diez cepas de la Subfamilia B 2086 probadas mediante ELISA de célula completa. La actividad bactericida se detectó contra nueve de diez cepas de Subfamilia B 2086 que expresan antigenos de serosubtipo heterólogos, PorAs. Estas cepas son representativas de cepas que causan enfermedad meningocócica del serogrupo B en toda la Europa occidental, las Américas, Australia y Nueva Zelanda. La única cepa que no fue matada en el ensayo bactericida, 870227, reaccionó fuertemente con el suero anti-rLP2086 (Subfamilia B) mediante ELISA de célula completa, indicando que esta cepa expresa una proteina con epitopes en común a P2086. Las cepas de la Subfamilia A 2086 listadas en la Tabla VII, también se probaron para la reactividad de superficie mediante ELISA de célula completa. Dos de cada tres de estas cepas aparecieron para tener un nivel muy bajo de reactividad, indicando que algunas cepas de la Subfamilia A 2086 no pueden ser reactivas cruzadas con los anticuerpos resaltados a la Subfamilia B de rLP2086. El procedimiento de amplificación por PCR usado para identificar el gen de la Subfamilia B 2086 de la cepa 8529 también se llevó a cabo en las cepas 870446, NMB y 6557. No se detectó producto amplificado por PCR de la Subfamilia B 2086. Métodos de Inmunogenicidad: Preparación de antisueros:_ Se formularon vacunas como es descrito previamente en el Ejemplo 1. Sin embargo, se usó una dosis de 10 g. Ensayo Innunosorbente enlazado con enzima (ELISA) de c lula completa: Las suspensiones de células completas de N. meningitidis se diluyeron a una densidad óptica de 0.1 a 620 nm en fosfato 0.01 M estéril, NaCL 0.137 M, KC1 0.002 M (PBS). A partir de esta suspensión, se adicionaron 0.1 mL a cada cavidad de placas de 96 cavidades Nunc Bac T (Cat# 2-69620) . Las células se secaron sobre las placas a temperatura ambiente durante tres días, luego se cubrieron. Se invirtieron y se almacenaron a 4°c. Las placas se lavaron tres veces con solución reguladora de lavado (Tris-HCL 0.01 M, NaCL 0.139 M/KC1, dodecilpoli (oxietilerenglicoléter) n al 0.1% n=23 (Brij-35®, disponible de ICI Americas, Inc., Wilmington, Dela are), pH 7.0-7.4). Se prepararon diluciones de antisueros en PBS, Twenn-20 al 0.05%/Azida y 0.1 mL se transfirió a las placas recubiertas. Las placas se incubaron durante dos horas a 37°C. Las placas se lavaron tres veces en solución reguladora de lavado. El IgG AP antirratón de cabra (Southern Biotech) se diluyó a 1:1500 en PBS/Tween-20 al 0.5%, 0.1 mL se adicionó a cada cavidad, y las placas se incubaron a 3 °C durante dos horas. Las placas se lavaron (como en lo anterior) . La solución de sustrato se trató al diluir fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) en dietanolamina a 0.1 mL/MgCl? 0.5 mM a 1 mg/mL. Se adicionó el sustrato a la placa 0.1 mL por cavidad y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La reacción se detuvo con 50 L cavidad de NaOH 3N y las placas se leyeron a 405 nm con la referencia de 690 nm. B) . Secuencia Guia P4: Amplificación por PCR y Estrategia de Clonación: Para optimizar la expresión de rLP2086, el gen 2086 se clonó detrás de la secuencia de señal P4 de la Haemophilus influenzae no simbolizable (Green y colaboradores, 1991) . Los cebadores utilizados para la clonación de lipoproteina son listados en la Tabla IV y son identificados por los números de compuesto: 5658, 5660, 6473, 6543 y 6385. La ORF 2086 se amplificó de la cepa 8529 de N. meningitidis B usando cebadores con los siguientes números de compuesto 5658 y 5660. La ORF 2086 se amplificó de las cepas CDC1573 de N. meningitidis serogrupo B usando cebadores con los siguientes números de compuesto 6385 y 5660. La ORF2086 se amplificó de la cepa 2996 de N. meningitidis del serogrupo B usando los cebadores con los siguientes números de compuesto 6473 y 6543. Los cebadores N. terminal (5' ) se diseñaron para ser homólogos a la región madura 'del gen 2086 (iniciando en el residuo de serina en la posición 3 de aminoácido justo corriente abajo de la cisteina) . El sitio de restricción BamHi (GGATTC) se incorporó en el extremo 5' de cada cebador N-terminal y dio por resultado la inserción de un residuo de glicina y la proteina madura en la posición de aminoácidos 2. Los cebadores C-terminal (3') se diseñaron para ser homólogos al extremo C-terminal del gen 2086 e incluyeron el codón de Detención asi como un sitio SpHI para propósitos de clonación. El fragmento amplificado de cada cepa de N. meningitidis B se clonó en un vector intermediario y se clasificó mediante el análisis de secuencia. El DNA de plásmido de clones correctos se digirió con las enzimas de restricción de BamHi y Sphl (New England Biolabs, (NEB) ) . Un vector designado pLP339 (suministrado por el cesionario de los solicitantes) se seleccionó como el vector de expresión. Este vector utiliza la cadena principal pBAD18-Cm (Beckwith y colaboradores, 1995) y contiene la secuencia de señal de lipoproteina P4 y el gen P4 de Hemophilus influenzae no simbolizable (Green y colaboradores, 1991). El vector pLP339 se digirió parcialmente con enzima de restricción BamHi y luego se sometió a la digestión con SpHI. Los fragmentos 2086 amplificados (BamHI/Sphl) cada uno se ligaron por separado en el vector pLP339 (BamHi/Sphl parcial) . Esta estrategia de clonación coloca el gen 2086 detrás de la secuencia de señal de lipoproteína P4. El sitio BamHI permanece en la unión de clonación entre las secuencias de señal P4 y el gen 2086 (Ver la construcción de plásmido mostrada en la FIG. 7) . Lo siguiente es un ejemplo de la secuencia en la subunión de clonación BamHI: [secuencia de señal P4J-TGT GGA TCC- [secuencia de ácidos nucleidos madura 2086 restante] [secuencia de señal P4]-Cys Gly Ser- [secuencia de aminoácidos madura 2086 restante] Con referencia a la FIG. 7, cada fragmento amplificado se clonó en un vector pBAD18-Cm modificado que contiene la secuencia guia P . La fermentación se realizó en BL pPX7343 de E. coli recombinante que expresa rPrLP2086 (2086 lipidada P4 recombinante) para tratar de incrementar la densidad celular al adicionar glucosa adicional. El termentador se rellenó con 10 L de medio Minimo M9, de acuerdo con Sambrook, suplementado con glucosa al 1%. La concentración de la glucosa en el termentador fue de 45 g/L. El fermentador se inoculó al OD inicial de -0.25. A ~OD 0.25, se adicionó 20 g/L de glucosa adicional. El cultivo se indujo con arabinosa al 1% en agotamiento de glucosa a OD 63.4. La fermentación continuó hasta 3 horas después de la inducción. Las muestras se salvaron en el t=0, 1, 2, 3 después de la inducción y la proteina se cuantificó usando BSA. En t=3, el rendimiento de proteina es -0.35 g/L, y 7% de próteina celular total. Un total de 895 gramos de pasta celular húmeda se cosechó de ~10 L de cultivo. La purificación de la rP4LP2086 se reali2Ó usando los mismos métodos como es descrito en lo anterior en el Ejemplo 2, Sección A. Bjeniplo 3 Genética de Desarrollo para la Proteina 2086 Madura No Lipidada: Para evaluar adicionalmente la inmunogenicidad de la proteina 2086, se realizaron la clonación y la expresión de la forma no lipidada de P2086. Amplificación del gen por PCH. de la ORÍ" 2086: Los oligonucleótidos usados para la amplificación por PCR del gen 2086 no lipidado son listados en la tabla de cebadores Tabla IV. El gen 2086 de la cepa 8529 se puede amplificar con los cebadores identificados por los números de compuesto 5135 y 6406 (SEQ ID NOS. 308 y 312, respectivamente), como es indicado en la tabla. El gen 2086 de las cepas CDC1573 se puede amplificar con los cebadores identificados por los números de compuesto 5135 y 6474 (SEQ ID NOS. 308 y 316, respectivamente) . El gen 2086 de la cepa 2996 se puede amplificar con los cebadores identificados con los números de compuesto 6406 y 6605 (SEQ ID NOS. 312 y 320, respectivamente) .

Las características de estos cebadores incluyen un sitio de restricción de BglII sintético en cada cebador, un sitio de restricción Ndel sintético en los números de compuesto 6406 y 6474 y codones de terminación en todas las tres estructuras de lectura están presentes en los números de compuesto 5135 y 6605. Los números de cebadores 6406 y 6474 amplifican el gen 2086 con un ATG (Met) fusionado al segundo codón amino terminal (ACG) que representa una sola sustitución de aminoácidos (reemplazan TGC Cys) del polipéptido 2086 maduro. El vector de clonación por PCR fue TOPO-PCR2.1, Invitrogen, Valencia, Ca. El vector usado para expresar la proteina 2086 no lipidada fue pET9a de Novagen, Madison, WI . La cepa de clonación de E. coli ToplO, Invitrogen, Carlsbad, CA. La cepa de expresión de E. coli fue BLR(DE3)pLysS, Novagen, Madison, WI . El medio de cultivo para propósitos de clonación fue liquido agar Terrific Broth, de acuerdo con Sambrook y colaboradores, con glucosa estéril al 1% sustituida por glicerol, y el antibiótico apropiado (amplicilina o canamicina) . La purificación del plásmido fue con Qiagen Spin Miniprep Kit (Valencia, CA) .

Preparación de la cepa de producción o linea de células para la expresión 2086 no lipidada : El gen 2086 se amplificó mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) [AmpliTaq y ciclador térmico ABI 2400, Applied Biosystems, Foster City, CA] del DNA cromosómico derivado de la cepa miningocócica 8529. La amplificación por PCR del- gen 2086 utilizó dos cebadores de oligonucleótido en cada reacción identificada por los números de compuesto 6474 y 5135 (SEQ ID NOS. 316 y 308, respectivamente) . El producto por PCR de 2086 amplificado se clonó directamente en el vector de clonación TOPO-PCR2.1 y se seleccionó en el agar Terrific Broth suplementado con 100 g/mL de ampicilina y 20 ug/ml de X-Gal. Las colonias blancas se seleccionaron y se cultivaron. El DNA del plásmido se preparó usando un kit Qiagen miniprep y los plásmidos se clasificaron para el inserto del fragmento por PCR. Los plásmidos del inserto por PCR se sometieron a la secuenciación de DNA (química de Big Dye en un secuenciador ABI377, Applied Biosystems, Foster City, CA) . Los plásmidos que muestran la secuencia de DNA se digirieron con la enzima de restricción BglII y el fragmento BglII se purificó usando un kit de purificación GeneClean II (BiolOl, Carlsbad, CA) . El fragmento BglII purificado se clonó en el sitio BamHI en el vector de expresión pET9a. Los clones pET9a/2086 se seleccionaron en las placas Terrific Broth suplementadas con 30 pg/ml de camanicina. Los clones resistentes a la canamicina se cultivaron y se preparó el DNA de plásmido miniprep. Los plásmidos se clasificaron para la orientación apropiada del gen 2086 en el sitio BamHI. Los plásmicos correctamente orientados representan una fusión del antigeno T7 al aminoterminal del gen 2086 (rP2086T7) . Estas fusiones de gen rP2086T7 se transformaron en BLR (DE3) pLysS, se seleccionaron en placas de Terrific Broth/Kan, se cultivaron en Terrific Broth y se indujeron para expresar la proteina de fusión Rp2086T7 con IPTG 1 mM (isopropil ß-D-tiogalactopiranósido) . La proteina de fusión rP2086T7 se expresó a altos niveles. Estos plásmidos de fusión luego se sometieron a la digestión de digestión de restricción Ndel, que suprime el antígeno T7 y enlaza el gen 2086 maduro directamente al inicio ATG proporcionado por el vector. Estos plásmidos suprimidos de Ndel se transformaron en células ToplO y se seleccionaron en placas Terrific Broth/Kan. Los clones candidatos se cultivaron y se preparó el DNA de plásmido miniprep. El DNA de plásmido se sometió a la secuenciación de DNA para confirmar la supresión y la integridad de la secuencia de gen 2086. Estos plásmidos son representados por el mapa de plásmido designado pPX7328 (FIG. 6) . Los plásmidos que representan la secuencia de DNA correcta se transformaron en BLR{DE3)pLysS, se seleccionaron en placas Terrific Broth/Kan, se cultivaron en Terrific Broth y se indujeron para expresar la proteina 2086 con IPTG. El vector pET9a no logró expresar la proteina 2086 madura, en la cepa BLR (DE3 ) LysS cuando el T7-Tag se retiró. Producción de proteina 2086 No lipidada: El DNA de plásmido purificado se usó para transformar la cepa de expresión BLR(DE3)pLysS. Las células BLR(DE3)pLysS que llevan los plásmidos son resistentes a la canamicina y se pueden inducir para expresar altos niveles de proteina PorA mediante la adición de IPTG 1 mM. La proteina de fusión rP2086T7 puede ser expresada como cuerpos de inclusión insolubles en la linea de células de E. coli BLR (DE3 ) LysS a ~40% de proteina total. Esta proteina de fusión purificada se usó para inmunizar ratones y generó niveles significantes de anticuerpos bactericidas contra una cepa meningocócica heteróloga. (Ver la Tabla V) . Mutagénesis del gen No lipidado 2086: La mutagénesis del cebador por PCR se realizó en el extremo 5' del gen 2086. Los estudios de expresión están en marcha para determinar si el T7-Tag puede ser retirado mientras que muestre los altos niveles de expresión de rP2086T7 madura. Purificación de rP2086T7 no lipidado: Células de BLR (DE3 ) pLysS de E. colí que expresan rP2086T7 no lipidada se lisaron mediante el microfluidizador en Hepes-NaOH 10 mM/EDTA 5 mM/Pefabloc SC 1 mM pH 7.4. El lisado de célula luego se centrifugó a 18,000 xg durante 30 minutos . La pelotilla de cuerpo de inclusión se lavó tres veces con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/TritonX-100 al 1% pH 8 seguido por la centrifugación cada tiempo a 24,000xg durante 30 min. La pelotilla de cuerpo de inclusión luego se lavó dos veces con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Z ittergent 3-14 al 1% pH 8 seguido por la centrifugación cada tiempo a 24,000 xg durante 15 min. La pelotilla de cuerpo de inclusión luego se solubilizó con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5mM/Urea 4 M pH8 durante dos horas seguido por la centrifugación para retirar el material insoluole. El sobrenadante (rP2086T7 solubilizada) se dividió en cuatro muestras iguales. Una muestra se ajustó a Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 250 mM/Urea 2M pH 8 (sin detergente) una se ajustó a Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 250 mM/Urea 2M/Triton X-100 hidrogenado al 1% pH 8 (TX-100), una se ajustó a Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 250 mM/Urea 2M/Zwittergent 3-12 al 1% pH 8 (Z3-12) y una se ajustó a Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 250 mM/Urea 2M/Zwittergent 3-14 al 1% pH 8 (Z3-14) usando soluciones base. Para retirar la urea, las muestras se dializaron hasta la consumación contra la solución reguladora respectiva que no contiene urea. Las muestras luego se dializaron hasta la consumación contra la solución reguladora respectiva que no contiene urea y NaCl 60 mM para reducir la concentración de NaCl. El material insoluble se retiró por centrifugación a 2,000xg durante 15 minutos, y el sobrenadante resultante (rP2086T7 replegado) se usó para experimentos adicionales. La homogeneidad de rP2086T7 se encontró que es de 91-95% como es determinada usando SDS-PAGE con manchado de Coomassie y la densitometria de láser. Procedimiento de Inmunogenicidad - Como es descrito en el Ejemplo 2. Esta prote na de fusión purificada se usó para inmunizar ratones y generó niveles significantes de anticuerpos bactericidas contra una cepa meningocócica heteróloga. (Ver la Tabla V enseguida) : TABLA V: Titulos bactericidas del anticuerpo de ratón cultivado a rP2086T7 (*suero de control positivo generado por la inmunización los ratones con rlP2086) Ejemplo 4 Desarrollo de Clones Quiméricos de ORF 2086 La región N-terminal del gen 2086 de la cepa CDC-1573 contiene un segmento repetido no presente en el gen 2086 de las cepas 8529 y 2996 (ver la F1G. 8) . Aparece que este segmento repetido es responsable por los niveles incrementados de la expresión de proteina 2086 recombinante de los sistemas de expresión basados en E. coli (pET y pBAD) . El nivel de expresión de proteínas recombinante del gen CDC-1573 2086 fue significativamente mejor en los sistemas de expresión pET y pBAD comparado con los niveles de expresión recombinantes del gen 2086 con las cepas 8529 y 2996 usando los mismos sistemas. La región N-terminal del gen 2086 de todas las tres cepas es relativamente homólogo, excepto por este segmento repetido. Por lo tanto, es razonable asumir que al fusionar la CDC-1573 N-terminal a los genes 2086 de las cepas 8529 y 2996, que los niveles de proteina 2086 recombinante expresado de estos genes se incrementará cuando se usan los sistemas pET y pBAD. Materiales y Métodos : DNA cromosómico de las cepas 8529 y 2996 se purificó y se usó como un patrón para la publicación por PCR del gen 2086 quimérico. Los cebadores de PCR con los números de compuesto 6721 y 5135 (SEQ ID NOS:321 y 308, respectivamente) se usaron para amplificar el gen 2086 quimérico de la cepa 8529 y los cebadores de PCR con los números de compuestos 6721 y 6605 (SEQ ID NOS:321 y 320, respectivamente) se usaron para amplificar el gen 2086 quimérico de la cepa 2996. Los productos de PCR se clonaron directamente en el vector PCR2.1 TOPO de Invitrogen y luego se precipitaron mediante el análisis de secuencia de DNA para identificar un gen 2086 quimérico intacto. Ese gen luego se segmento del vector PCR2.1 con BglII y el fragmento BglII se insertó en el sitio BamHI del plásmido pET9a. Los insertos de plásmido se clasificaron para la orientación apropiada y luego se sometieron a la digestión con Ndel. Los fragmentos de Ndel lineales se autoligaron para alcanzar la supresión de un fragmento Ndel pequeño que contiene la secuencia P7-tag contribuida por el vector pET9a. Esta supresión directamente enlaza el promotor P7 al extremo 5' del gen 2086 quimérico. El plásmido suprimido de Ndel se transformó en la cepa BL21(DE3) de E. cali y colonias resistentes a canamicina se clasificaron para la expresión de proteina 2086 quimérica con la inducción de IPTG. Estudios iniciales indican que el gen 2086 quimérico de la cepa 2996 expresa aproximadamente dos veces tanta proteina recombinante comparada con el gen 2996/2086 nativo cuando se expresa en el sistema pET9a. El sistema pBAD todavía no ha sido probado . Aunque solamente un experimento ha sido realizado, los datos indican que hay una utilidad aumentada del gen 2086 quimérico. La generación de fusiones N-terminal de CDC-1573 a los genes 2086 de la cepa 8529 y 2996 proporciona expresión de proteina 2086 recombinante aumentada . Ejemplo 5 Clasificación por PCR de 2086 de cepas de N. meningltídxa: Para determinar la conservación del gen 2086 entre los aislados clínicos, se realizó la amplificación por PCR sobre 88 cepas de N. meningitidis . La identificación por PCR inicial de la ORF 208 fc utilizó cebadores listados en la Tabla IV (ver el Ejemplo 2 anterior) identificado por los números de compuestos : 623, 4624 y 4625 (SEQ ID NOS: 303, 304 y 305, respectivamente). Estos cebadores se diseñaron basados en la secuencia del serogrupo A de N. meningitidis de Sanger. Para facilitar la clasificción de un número grande de cepas, se diseñaron cebadores internos para el gen 2086. Un total de 88 cepas de N. meningitidis se clasificación con PCR con los cebadores de 2086 interno recientemente diseñados identificados por los números de compuestos 5005 y 5007 (SEQ ID NOS:306 y 307). Con estos cebadores los soliciantes fueron capaces de identificar el gen 2086 de 63 de las 88 (~70%) cepas de N. meningitidis (ver la Tabla VI-A) . Las regiones expandidas que circundan el gen 2086 en la secuencia del serogrupo A de N. meningitidis de Sanger y la secuencia del serogrupo B de N. meningitidis de TIGR se examinaron y se alinearon. Los cebadores se diseñaron para corresponder a las regiones corriente arriba y corriente abajo del gel 2086. El propósito fue utilizar estos cebadores para amplificar genes 2086 más grandes que la longitud completa de una variedad de cepas de N. meningitidis para la comparación de secuencia. La amplificación por PCR de una cepa (6557), usando los Nos. de compuestos 6470 y 6472 (SEQ ID NOS:313 y 314, respectivamente), dio por resultado un bajo rendimiento del producto. El producto amplificado de la cepa 6557 se clonó y el DNA del plásmido se envió para el análisis de secuencia. Los resultados indicaron un nuevo tipo de gen 2086 con más grande variabilidad de secuencia que la que se ha observado previamente. El gen 2086 de la cepa 6557 fue ~75% idéntica al nivel de aminoácidos a las otras cepas secuenciadas . De manera interesante la cepa 6557 fue una de las 30% de cepas que se han probado previamente negativas por la clasificación de PCR de 2086 descrita en lo anterior, Se diseñaron cebadores internos específicos a las regiones variables C-terminales dentro de la cepa 6557. Estos cebadores se usaron para clasificar el gen 2086 más variable en el ~30% de cepas que se han probado previamente negativas por la clasificación por PCR de 2086. Todas las cepas de N. meningitidis disponibles (n=88) se clasificaron con PCR con estos cebadores de 2086 internos recientemente identificados (identificados por los números de compuesto 6495 y 6496; SEQ ID NOS: 159 y 160, respectivamente). Solamente el -30% de cepas de N. meningitidis que se han probado previamente negativas por PCR para 2086 fueron positivas por PCR en esta clasificación. El conjunto de genes amplificados de las cepas negativas de PCR previamente (~30%) debe representar un nuevo tipo de gen 2086 o una segunda familia de genes 2086 y en la presente son designados Subfamilia A de 2086. El conjunto de genes 2086 amplificados del ~70% de cepas con los cebadores derivados del 8529 son designados en la presente Subfamilia B. La Subfamilia A de los genes 2086 está ejemplificada por la SEQ ID NOS: 1-173 de número impar sin limitación. La Subfamilia B de los genes 2086 está e emplificada, sin limitación por la SEQ ID NOS: 175-251 de número impar. Las cepas de N. meningitidis usadas para los estudios de amplificación por PCR se seleccionaron de las siguientes tablas, Tabla VI-A y Tabla VI-B. Las cepas listadas en las tablas se proporcionan como ejemplos de las cepas de N. meningitidis, sin limitación. Las cepas listadas en la Tabla VI-A son clasificadas en la Subfamilia A de proteina 2086 de las cepas listadas en la Tabla VI-B son clasificadas en la Subfamilia B de proteina 2086. Las cepas listadas en cada tabla son agrupadas por serosubtipo. Las cepas están disponibles de las siguientes cuatro fuentes como es indicado en la tabla: MPHL-Manchester Public Health Laboratory, Manchester, UK; RIVM, Bilthoven, The Netherlands; University of Iowa, College of Medicine, Departament of Microbiology, Iowa City, IA; y Walter Recd Army Institute of Research, Washington, D.C. TABLA VI-A 6557 Pl. (9),14,'P1.22a,14a RIVM 2996 Pl.5,2,P1.5a,2c RIVM NmB P1.5,2,P1.5a,2c UIOWA L3 Pl.5,2 Walter Reed B16B6 P1.5, 2 RIVM CDC 1135 CDC L5 ??.??,??.21-6,1 Walter Reed L4 P1.21, 16 Walter Reed W135 Walter Reed Cll C:16,P1.7,1 CDC Y Walter Reed TABLA VX-B Cepa Serosubtipo Fuente M98 250670 B:l, PI:4 MPHL M98 250024 B:l, PI:4 MPHL M97 253524 B:l, PI:4 MPHL M97 252060 B:l, PI:4 MPHL M97 251870 B:4z, PI:4 MPHL M97 251836 B:4z, PI:4 MPHL M97 251830 B:4z, PI:4 MPHL M97 251905 B:4z, PI:4 MPHL M97 251898 B:4z, PI:4 MPHL M97 251885 B:4z, PI:4 MPHL M97 251876 B:4z, PI:4 MPHL M97 251994 B:4z, PI:4 MPHL M97 251985 B:4z, PI:4 MPHL M97 251957 B:4z, PI:4 MPHL M97 251926 B:4z, PI:4 MPHL M97 252045 B:4z, PI:4 MPHL M97 252038 B:4z, Pl:4 MPHL M97 252026 B:4z, Pl:4 MPHL M97 252010 B:4z, Pl:4 MPHL M97 252098 B:4z, Pl:4 MPHL M97 252083 B:4z, PI:4 MPHL M97 252078 B:4z, PI:4 MPHL M98 250735 B:4z, PI:15 MPHL M98 250797 B:4z, PI:15 MPHL M98 250768 B:4z, Pl:15 MPHL M98 250716 B:2b, PI.-10 MPHL M98 250699 B:4z, PI:10 MPHL M98 250393 B:4z, PI:10 MPHL M98 250173 B:4z, PI:10 MPHL M97 253462 B:4z, PI:14 MPHL M98 250762 B:15, PI:7,16 MPHL M98 250610 B:15, PI:7,16 MPHI M98 250626 B:415, PI:7,16 PHL M97 250571 B:15, PI:16 MPHL M97 252097 B:15, PI :16, P1.7b, 16 MPHL M97 253092 B:l, PI:6 MPHL M97 252029 B:15, Pl:7, NT MPHL M97 251875 B:15, PI:7, NT MPHL CDC 1127 Pl.7,16 4(15) CDC CDC 982 Pl.7,16 4 (15) CDC CDC 1359 Pl.7,16 4(15) CDC CDC 798 Pl.7,16 15(4) CDC CDC 1078 Pl.7,16 15(4) CDC CDC 1614 Pl.7,16 15(4) CDC CDC 1658 Pl.7,16 15(4) CDC H44/76 Pl.7,16 15(4) RIV CDC 1985 Pl.7,13 4(15) CDC L6 Pl.7,1 ?(4) alter Reed CDC 1573 Pl.7,1 4(15) CDC L7 Pl-7, (9),1 Walter Reed CDC 937 P1.1.7,3,P1.7b,3 CDC 8529 P1.7,3,P1.7b,3 RIVM 880049 Pl.7b,4 RIVM CDC2367 P1.15 4(15) CDC H355 P1.19, 15 RIVM CDC 1343 P1.14 4(15) CDC M982 P1.22, 9 RIVM 870227 P1.5c, 10 RIVM B40 P1.5c, 10 RIVM 5315 P1.5c, 10 RIVM CDC 983 Pl.5,2 CDC CDC 852 Pl.5,2 CDC 6940 Pl.18, 25(6) RIVM A4 Otras cepas están fácilmente disponibles como aislados individuos infectados. Ejemplo 6 Reactividad de antisueros rl>P2086 contra cepas meningocócicas . La siguiente tabla, Tabla VII, muestra la capacidad de protección cruzada y reactividad cruzada de la rLP2086 como es descrito en lo anterior. Como es indicado en la tabla, la rLP2086 se procesó y se analizó usando una variedad de técnicas incluyendo los títulos de ELISA de célula completa (WCE), ensayo bactericida (BCA) y ensayos en Rata Pequeña (IR) para determinar la reactividad de superficie celular bacteriana de un anticuerpo policlonal cultivado contra la proteina 2086. TABLA VII Reactividad de antisuero rLP2086-8529 contra múltiples cepas meningecócicas Cepa Serosubtipo wcz BC IR Subfamilia A de 2086 870446 P1.12a,13 808, 615 >800 NmB P1.5a, 2c 47, 954 <100 6557 P1.22a, 14a 169, 479 <25 - Subfamilia B de 2086 880049 P1.7b,4 1.402.767 100 + H44/76 P1.7, 16 8, 009, 507 >6400 H355 P1.19, 15 10,258,475 3.200 + 6940 P1.18, 25 (6) 5, 625, 10 800 870227 P1.5c, 10 4,213, 324 <25 + 252097 01.7b, 16 10, 354, 512 >800 539/8529 P1.7b, 3 1?, 635,737 3, 200 M982 P1.22, 9 1, 896, 800 800 CDC-1573 P1.7a, 1 208, 259 25 CDC-937 P1.7b, (3) 9,151.863 >800 +mayor que 10 veces la reducción en bacteremia -menor que 10 veces la reducción en bacteremia Ejemplo 7 Se preparon varias construcciones para expresar la proteina ORF2086. La siguiente tabla, Tabla VIII, es un tabla de construcción de r2086 que se proporciona para el propósito de mostrar ejemplos e ilustrar una eraplementación de la presente invención, sin limitación a la misma. TABLA VIII Resumen de la Construcción r2086 Construcción Promotor Guia Expresión Extracción Vector % de Proteina. total pPX7340 17 Nativa Coomassie sarcosilo pET27b 2.5* de soluble lipoproteína procesada pPX7341 17 94 Cooitassie sarcosilo pET27b 5* de soluble lipoproteina procesada pPX7343 Arabinosa P4 Coomaasie sarcoeilo pEADia 7-10% de soluble cm lipoproteina procesada pPX7325 17 Fusión T7- Coomassie Cuerpos de pET9a 40-50* de tag/madura incl sión proteína madura pPX7328 17 madura Coomassie Soluble pET9a 10% de proteína madura Ejemplo 8 Estudios adicionales con las proteínas de membrana externa agotada de LOS identificaron cepas adicionales que producen proteína (s) de membrana externa diferente a PorA que fueron capaces de producir anticuerpos bactericidas a cepas que expresan serosubtipos heterólogos. Lo siguiente describe estudios adicionales para identificar proteínas adicionales de acuerdo con una modalidad de la presente invención, y específicamente lipoproteinas de membrana externa, que puede reducir el número de proteínas requeridas en una composición inmunogénica meningocócica . Estos estudios adicionales complementan los estudios descritos en los ejemplos previos.

El fraccionamiento subcelular, la extracción con detergente diferencial, el enfocamiento isoeléctrico y la cromatografía de intercambio iónico se usaron en conjunción con los ensayos de inmunización y bactericidas contra múltiples cepas para identificar grupos pequeños de proteínas de interés. La secuenciación directa de los componentes principales indicó que se bloquearon los N-terminales . Las secuencias de proteina interna se obtuvieron med ante la secuenciación directa de polipéptido derivados de las digestiones químicas y proteoliticas. La secuencia genómica de una cepa maningocócica del grupo A se descargó del Sanger Center " y se analizó por el grupo de Bioinformática de los solicitantes usando algoritmos existentes y patentados para crear una base de datos investigable. Los datos de la secuencia de péptido indicaron que la ORF2086 fue de interés. Los cebadores basados en este orf se usaron para la PC del gen P2086 de la cepa 8529. El análisis de la secuencia de gen, el hecho de que se bloquearon los N-terminales y su localización subcelular indicaron que la P2086 es una proteina de membrana externa lipidada (LP2086) . rLP2086-8529 y variantes de otras cepas meningocócicas se expresaron recombinantemente como lipoproteinas en E. coli usando la secuencia de señal P4 de H. influenzae. Estas proteínas recombinantes se aislaron de membranas de E. coli mediante la extracción con detergente diferencial, se purificaron usando la cromatografía de intercambio iónico y se usaron para inmunizar ratones. Los sueros anti-LP2086 de ratón fueron capaces de facilitar la actividad bactericida contra varias cepas de serosubtipo diferentes de N. meníngitídis . El análisis adicional de los genes P2086 de muchas cepas de N. meningitidis mostró que estas secuencias caen en dos grupos designados Subfamilia A y Subfamilia B. (Ver la FIG. 12). Los antisueros cultivados contra las proteínas de la Subfamilia B fueron bactericinas contra las nueve cepas que expresan proteínas de Subfamilia B, y una cepa que expresa proteína de Subfamilia A. Los antisueros de Subfamilia A fueron bactericidas contra las cepas de la Subfamilia A. Una mezcla de una rPorA y una rLP2086 produjo anticuerpos complementarios que extiende la cobertura de la vacuna más allá de aquella inducida por cualquier proteína sola. Estas observaciones conducen a las siguientes conclusiones. Los antígenos rLP2086 son capaces de producir anticuerpos bacericidas contra cepas meningocócicas que expresan proteínas PorAs heterólogas y P2086 heterólogas. La familia P2086 de antígenos puede ser una vacuna útil o inmunogénica ya sea sola o en combinación con otros agentes neisseriales . Lo siguiente describe el estudio anterior en detalle. Una mezcla compleja de proteínas de membrana externa soluble (sOMPs) se encontró que produce anticuerpo bactericida independiente de PorA contra cepas que expresan proteínas PorA heterólogas. Un proceso de extracción con detergente diferencial, enfocamiento isoeléctrico y cromatografía de intercambio iónico seguido por la inmunización del ratón se usó para seguir los componentes inmunológicos inmunológicamente activos. En cada etapa, el suero se analizó para la reactividad de superficie y la actividad bactericida contra varias cepas que contienen antigeno de serosubtipo que son representativos de la epidemiología mundial de la enfermedad meningocócica. Este proceso de separación e inmunización se usó para identificar un candidato inmunogénico reactivo cruzado novedoso para el Grupo B de N. meningitidis. Generación de cepas deficientes de PorA - El sitio cromosómico de porA se clonó en el plásmido pPX7016 de la cepa 2996. Dentro del plásmido el promotor porA, el cuadro S/D y los primeros 38 codones N-terminal se han suprimido o reemplazado con un cásete que expresa KanR autocontenido. Los plásmidos se linearizaron con enzimas de restricción y se transformaron naturalmente en las cepas de serosubtipo PI:5,2; PI:9; PL7,16; PI:15; PI:14; PI:3 & PI:10. Los transformantes resistentes a la canamicina se seleccionaron y se clasificaron para la pérdida de PorA mediante monoclones específicos de serosubtipo en una ELISA.

Ensayo bactericida: Ver Mountzourous, K.T. y Howell, A.P. Detection of Complement-Mediated Antibody-Dependent Bactericidal Activity in a Fluorescence-Based Serum Bactericidal Assay for Group B Neissería meningitídís . J. Clin Microbiol. 200; 38 :2878-2884. Ensayo Inmunosorbente Enlazado de Enzima (ELISA) de Célula Completa: suspensiones de células completas de N. meningitídís se diluyeron en una densidad óptica de 0.1 a 620 nm en fosfato 0.01 M estéril, NaCl 0.137 M, KCl 0.002 M (PBS) . A partir de esta suspensión, se adicionó 0.1 mL a cada cavidad de las placas de 96 cavidades Nunc Bac T (Cat#2-69620) . Las células se secaron sobre las placas a 37 °C durante la noche, luego se cubrieron, se invirtieron y se almacenaron a 4°C. Las placas se lavaron tres veces con solución reguladora de lavado (Tris-HCL 0.01 M, NaCl/KCl 0.139 M, Brij-35 al 0.1%, pH 7.0-7.4). Las diluciones de antisuero se prepararon en PBS, Tween-20 al 0.05%/acida y 0.1 mL se transfirió a las placas recubiertas y se incubó durante dos horas a 37 °C. Las placas se lavaron tres veces en solución reguladora de lavado. El antiratón de cabra IgG AP (Southern Biotech) se diluyó a 1:1500 en PBS/Tween-20 al 0.5%, 0.1 mL se adicionó a cada cavidad, y las placas se incubaron a 37 °C durante dos horas. Las placas se lavaron (como antes) . La solución de sustrato se preparó al diluir fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) en dietanolamina a 1 mg/ml.

Se adicionó sustrato a la placa 0.1 mL por cavidad y se incubó a temperatura ambiente durante una hora. La reacción se detuvo con 50 ul/cavidad de NaOH 3N y las placas se leyeron a 405 nm con la referencia de 690 nm. Inducción de PorA Recombinante : las cepas BLR (DE3)/pET9a se cultivaron durante la noche a 37 °C en HySoy Broth (Sheffield Products) sumplementado con Kan-30 y glucosa al 2%. En la mañana los cultivos O/N se diluyeron 1/20 en HySoy Broth Kan-30 y glicerol al 1% y se cultivaron a 3 °C durante 1 hora. Estos cultivos se indujeron mediante la adición de IPTG a una concentración final de ImM. Los cultivos se cultivaron durante 2-3 horas adicionales y luego se cosecharon. Purificación de PorA Recombinante: La rPorA se solubilizó de los cuerpos de inclusión de E. col! con urea 8 M, y se replegaron mediante diálisis contra solución reguladora que no contiene urea. La rPorA replegada luego se concentró por diafiltración y se intercambió con solución reguladora mediante la columna G25 en NaP04 pH 6. La rPorA dializada luego se corrió sobre una columna de intercambio catiónico (S Fractogel) y se eluyó con NaCl 1 M. Las sOMPs de la cepa 8529 (PI.7-2,3) producen actividad bactericida independiente de PorA en ratones contra cepas que expresan serosubtipos heterólogos. La siguiente tabla, Tabla IX, muestra la actividad bactericida en las cepas estudiadas. TABLA IX Preparación de sOMPs: membranas de N. meningitidis se extrajeron con TX-100, Zwittergent 3-14 y Zwittergent 3- 14+NaCl 0.5 M. Las sOMPs referidas en lo anterior se solubilizaron en el extracto de Zwittergent 3-1 /NaCl 0.5 M. La extracción es realizada usando técnicas bien conocidas para las personas expertas en la técnica, por ejemplo, ver la patente norteamericana No. 6,355,253 la cual es incorporada en la presente por referencia. Inmunogenicidad: Ratones Swiss-Webster hembra se inmunizaron con 25 ]ig de proteina total mezclada con adyuvante con 20 pg de QS-21 en la semana 0 y . Un sangrado de exanguinación y los análisis de datos se hicieron en la semana 6. 1 Titulo Bactericida (BC5o) representados como el reciproco de la dilución de antisuero que reduce el conteo de células viable por 50%. Los sueros de ratones normales en la semana 0 tuvieron titulos de BC50 de <25 2 NST=No serosubtipable. La siguiente tabla, Tabla X, muestra el resumen de purificación y caracterización para P2086 (rLP2086) lipidada recombinante (rLP2086) para tanto la Subfamilia A como la Subfamilia B. Purificación de rLP2086 de la Subfamilia A ????? X Variante Homologia de pl Teórico Pureza (%)2 rLP2086 A.A. (%)L 870446 75 6.1 80 2996 71 5.9 95 M97 252988 71 6.3 96 CU 68 6.4 82 M98 250771 62 6.1 83 Purificación rLP2086 de la Subfamilia B TABLA XI Variante Homologia de pl Teórico Pureza (%)2 rLP2086 A.A. (%): 8529 100 7.5 96 M982 94 6.3 96 88049 92 6.2 90 CDC1573 87 5.6 93 Método de Purificación: Todas las variantes se solubilizaron de las membranas de E. coli con TX-100 (con exceptión de rLP2086-8529 que se solubilizó con Sarcosilo o Urea) . La purificación adicional se llevó a cabo con una combinación de cromatografia de cambio aniónico (TMAE) , exclusión de tamaño y/o intercambio catiónico (S Fractogel) en una solución reguladora de Tris-HCl o NaP04. 1 Homología de aminoácido como es comparada con P2086 de la cepa 8529. 2 Pureza como es determinada mediante SDS-PAGE y la densitometria de láser de la banda manchada con Coomassie colodial (mancha Simplemente Azul) Inmunogenicidad de un miembro de la Subfamilia B, rLP2086-8529, probada contra cepas homólogas y heterologas. La Tabla XII enseguida muestra la inmunogenicidad de un miembro de la Subfamilia B, rLP2086-8529, probado contra cepas homólogas y heterólogas . TABLA XXI Cepa Subfamilia Serosubtipo Homología Titulo de Tituloc Obj etivo P2086 de la Cepa de A.A.a ELISA de de BC50 Obj etivo Célula Completa13 539 B PI.7-2, 3 100 >1, 58, 000 3,200 H44/76 B PI.7,16 100 >1, 58,000 3,200 H355 B PI.19, 15 100 >1, 58, 000 3, 200 CDC937 B PI.7-2, 3-4 100 >1, 458, 000 >800 M97 B PI1.7-2,16. 100 >1, 458,000 >800 252097 870227 B PI.1.5-2, 10 100 >1, 458, 000 <25 6940 B PI.18,25, 6 97 900,162 >800 M982 B PI.22, 9 94 435,909 200 880049 B PI.7-1, 1 92 349, 912 400 CDC1573 B PI.12-1,13 87 102,508 25 870446 A PI.22,14 71 389,829 800 M98 A PI.5-1, 2-2 62 139, 397 <25 250771 NmB A PI.5-1, 2-2 71 <2,000 <25 Procedimiento de Vacunación: Ratones S iss-Webster hembras de 6-8 semanas de edad se inmunizaron con 10 g de rLP2086-8529+20 g QS-21 en la semana 0 y semana 4. El análisis de dato se realizó en el sangrado de exanguinación en la semana 6. a Homología de aminoácido de P2086 como es comparado con rLP2086-8529 b Titulo de punto final expresados como el reciproco de la dilución en la absorvencia=0.1 c Titulos de BC50 presentados como el reciproco de la dilución del antisuero que reduce el conteo de células viable por 50% . Los sueros de ratón normal en la semana 0 tuvieron titulos de BC50 de <10 La Tabla XIII muestra la inmunogenicidad de un miembro de la Subfamilia B, rLP2086-2996, probado contra cepas homólogas y heterólogas. TABLA. XXII Cepa Subfamilia Serosubtipo Homología Titulo de Titulo0 Obj etivo P2086 de la Cepa A.A.a ELISA de BC50 ¦ Objetivo Célula Completab NmB A PI.5-1, 2-2 99.6 8, 979 <25 870446 A PI12-1,13. 99 <1, 458, 000 >800 M97 A PI.18,25, 6 98 320, 732 >800 252697 6557 A PI.22-1, 14- 98 17,319 <25 1 M98 A PI.22, 14-1 89 241,510 >800 250732 M98 A PI.22,14 89 447,867 800 250771 H44/76 B PI.7, 16 72 56, 386 <25 Procedimiento de Vacunación: Ratas Swiss-Webster hembras de 6-8 semanas de edad se inmunizaron con 10 \ig de rLP2086-2996+20 g QS-21 en la semana 0 y la semana 4. El análisis de datos se analizó en el sangrado de exanguinacíón en la semana 6. a Homología de aminoácido de P2086 como es comparado con rLP2086-2996 b Títulos de punto final expresados como el recíproco de la dilución en la absorvencia=0.1 c Títulos bactericidas BC50 presentados como el recíproco de la dilución de antisueros que reduce el conteo de células viable por 50%. Los sueros de ratón normal de la semana 0 tuvieron títulos de BC50 de <10 La Tabla XIV enseguida muestra que los antisueros rLP2086 y rPorA son complementarios cuando son mezclados y analizados para la actividad bactericida. TABLA XIV Antisueros H44/76 NMB 880049 H355 870227 6557 (PI.7,16) (PI.5- (PI.7- PI.19,15) (PI.5- (PI.22- 1,2-2) 2,4) 2,10) 1,14-1) Anti-rLP2086+tres >3,200 >800 200 >800 200 200 antisueros rPorA Controles anti-rLP2086 6, 400 <25 100 3,200 <25 <25 Antisuero rPorA 1, 600 200 400 monovalentes corrrespondientes Procedimiento de Vacunación: Ratones Swiss-Webster hembras de 6-8 semanas de edad se inmunizaron con ya sea 10 µg de rLE>2086-8529/20 g de QS-21, o 15 µg de rPorA/100 µg de MPL en la semana 0 y la semana 4. El análisis de dato se realizó en el sangrado de ensanguinación en la semana 6. a títulos bactericidas (BC50) representados como el reciproco de la dilución de antisuero que reduce el conteo de células viable por 50%. Los sueros de ratón normal en la semana 0 tuvieron títulos de BC50 de <10. La siguiente tabla, Tabla XV, muestra que las mezclas de las Subfamilias de rLP2086 y dos rPorAs producen anticuerpo bactericida en ratones. TABLA XV H44/76 6940 880049 M982 M98 M98 M97 870446 nMb 6557 250771 250732 252697 SfB' SfB SfB SfB SfAs SfA SfA SfA SfA S£A PI.7,16 PI.18 PI.7- PI.22 PI.22,1 PI.22,1 Pl.18,2 PI.1Z- PI.5- PI.22- 25,6 2,4 ,9 4 4-1 5,6 1.13 1,2-2 1,14-1 Antigeno rLP2086- S00 >800 200 400 800 >800 >800 >800 <25 8529+rLP2086- 2996 rLP2086- >800 800 100 200 400 400 >800 >800 >800 200 35£9+rlP2086- 2996 l,2-2+rP1.22- 1,14-1 Controles :>800 >800 200 400 800 >800 >800 800 >800 800 Monovalentes0 Procedimiento de Vacunación: Ratones Swiss-Webster hembras de 6-8 semanas de edad se inmunizaron con 10 µg de cada proteina+20 g QS-21, en la semana 0 y la semana 4. El análisis de dato se realizó en el sangrado de ensanguinación en la semana 6. a Títulos bactericidas (BC50) representados como el reciproco de la dilución de antisuero que reduce el conteo de células viable por 50% . Los sueros de ratón normal en la semana 0 tuvieron títulos de BC50 de <10. b Sfa - Subfamilia A, SfB - Subfamilia B c Control monovalente relevante: rLP2086-8529, rLP2086-2996, rPI.5-1,2-2 o antisueros rPI .22-1, 14-1. Lo siguiente resume los resultados de los estudios descritos en lo anterior. El antisuero Anti-rLP2086 es bactericida contra 13/16 cepas de prueba. Siete cepas que expresan diferentes serosubtipos son matadas por los sueros anti-P2086. La actividad bactericida de suero anti-rLP2086 es complementaria al suero anti-rPorA. Mezclas de P2086 y PorA producen anticuerpos bactericidas complementarios en los ratones. La extracción con detergente diferencial, purificación e inmunización en conjunción con un ensayo de anticuerpo funcional contra muchas cepas se puede usar para identificar nuevos candidatos de vacuna. P2086 se ha identificado como un candidato de vacuna que produce anticuerpo bactericicida contra cepas heterólogas en P2086 y rPorA. Asi, la familia 2086 de proteínas puede ser una vacuna útil ya sea sola o en combinación con otros antigenos neisseriales . E emplo 9 De acuerdo con los ejemplos previos, las cepas meningocócicas adicionales, de serogrupos variantes, se clasificaron por PCR para la presencia del gen ORF2086. Finalmente, se clasificaron 100 cepas meningocócidas . Lo siguiente describe el estudio y sus resultados en conjunto. Estos resultados complementan los datos de los ejemplos previos . Dos conjuntos de cebadores de PCR internos específicos para las regiones variables C-terminales se utilizaron para descriminar entre las secuencias de genes de Subfamilia A y B. La presencia de un producto amplificado de PCR de aproximadamente 350 bp indicó que la secuencia de gen 2086 estuvo presente en el cromosoma. Todas las cepas produjeron un producto de PCR individual del tamaño esperado. Las secuencias de nucleótidos de cincuenta y cinco genes ORF2086 de longitud completa se determinaron, se alinearon (DNAStar MegAlign) y se usaron para generar un árbol filogenético (Ver la FIG. 12). Nueve de estos genes 2086 se expresaron, recombinantemente como una lipoproteina rLP2086 en un sistema de promotor inducible de arabinosa pBAD y tres de estos genes se expresaron recombinantemente como una proteina no lipidada rP2086 en un sistema pET inducible por IPTG. Estas proteínas recombinantes se expresaron en JS- coli B. La proteina recombinante purificada se usó para inmunizar ratones y el antisuero de ratón se analizó para sus títulos IgG de suero y su actividad bactericida contra una variedad de cepas meningocócicas heterólogas. La ORF2086 se amplificó por PCR de uno de los siguientes, células meningocócidas completas, DNA cromosómico purificado o patrones de DNA de plásmido. Nueve genes ORF2086 se clonaron en el vector pLP339, que fusiona la secuencia guia P4 de Haemophílus al extremo 5' de los genes ORF2086. La cepa BLR de E. coli se usó como la cepa huésped para la expresión recombinante de la forma lipidada de la rP2086 de los clones pBAD/ORF 2086. (Ver la FIG. 10A) . El promotor inducible arabinosa pBAD induce la expresión de la señal P4/proteina de fusión ORF2086 para expresar una forma lipidada de rP2086. Tres genes P2086, que carecen de una secuencia de señal, se clonaron en un vector pET9a detrás del promotor de fago T7 altamente activo. La cepa BL21 (DE3) de E. coli se usó como la cepa huésped para la expresión recombinante de una forma no lipidada de ORF2086 de los clones pET9a/ORF2086. (Ver la FIG. 10B) . El lisógeno DE3 en la cepa BL21 de E. coXi puede ser inducido para expresar la polimerasa RNA de T7 bajo el control del promotor lacUV5 mediante la adición de IPTG. Ver, WCE; FEMS Micro. Lett., 48 (1987) 367-371 y BCA; J. Clin. Microbiol., 38(2000)2878-2884.

El gen, ORF2086, se clonó y se secuenció de cincuenta y cinco cepas de N. meníngitídis diferentes. Las secuencias de nucleótidos se alinearon (DNAStar MegAlign) y se usaron para generar un árbol filogenético. (Ver la FIG. 12) . Este árbol revela dos subfamilias distintas de la secuencia de nucleótidos de ORF2086. Las dos subfamilias de genes son similares en sus extremos 5', pero contienen variación considerable cerca de sus extremos 3' . Aunque esto aparece para ser variabilidad significante, ciertas regiones claves del gen son altamente homólogas entre las diferentes cepas. Estas regiones conservadas pueden proporcionar continuidad funcional para la proteina y pueden ser indicativas de epitopes protectores cruzados que son explotados como objetivo de vacuna.

El gen 2086 se clonó de varias cepas meningocócicas del serogrupo B y se expresó con o sin la secuencia de señal de lipidación. Con referencia a las FIGS. 11A y 11B, fotografías en gel muestran los lisados de célula completa de E. coli B que expresa la proteina r2086. La forma no lipidada fusionada al T7-Tag se expresó al más alto nivel. La secuencia T7-Tag puede proporcionar estabilidad al mRNa y significativamente aumenta el nivel de polipéptido traducido. Esta proteina de fusión aparece para depositarse en cuerpos de inclusión y puede ser purificada y replegada fácilmente con protocolos conocidos. Las formas lipidadas y no lipidadas de P2086 son expresadas a aproximadamente 5 a 8% de la proteina celular total, con excepción de las fusiones T7-Tag que expresa rP2086 como aproximadamente 50% de la proteina total. La forma no lipidada de la proteina aparece para ser soluble y localizada en el citoplasma. La forma lipidada de la proteina aparece para ser asociada con las fracciones de membrana y es solubilizada con detergente. La proteina 2086 lipidada recombinante de la cepa 8529 de N. meningítidis B consistentemente produce más grandes títulos de IgG de suero que la forma no lipidada (ver la Tabla XVI enseguida) que se correlaciona bien con el nivel aumentado de actividad bactericida contra las cepas meningocócicas tanto homólogas como heterólogas (ver la Tabla XVII enseguida) . La proteina en su forma lipidada nativa puede tener estructura terciaria superior para la presentación de antigeno y/o el lipido unido puede actuar como un adyuvante que estimula una respuesta inmunogénica más tarde . TABLA. XVI Respuesta Inmune producida en la Semana 6 por WCE usando 8529 rP2086 (no lipidada) contra 8529 rLP2086 (lipidada) .

TABLA XVII 8529 Rp2086 Produce Actividad Bactericida más Débil que 8529 rLP2086 Lo siguiente es un resumen de los resultados del estudio.

Todas las cepas de N.meningitidis B probadas aparecen para tener un gen similar a 2086. Por lo menos dos familias del gen 2086 son representadas: Subfamilia A - aproximadamente 30% de las cepas y Subfamilia B - aproximadamente 70% de las cepas. El gen 2086 ha sido clonado y secuenciado de 55 cepas de N. meningitidis. Las secuencias dentro de la Subfamilia A son ~86-100% al nivel de DNA. Las secuencias dentro de la Subfamilia B son -89.5-100% idéntico al nivel de DNA. La secuencia dentro de la Subfamilia A contra la Subfamilia B ~60.9%-74% idéntica al nivel de DNA. Los homólogos 2086 ha sido identificado mediante la clasificación por PCR en lo siguiente : N. meningitidis A, B, C, W135, Y N. lactamica N. gonorrhoeae FA 1090 Varios genes ORF2086 han sido clonados y recombinantemente expresados Las versiones lipidadas de P2086 se expresaron de nueve cepas meningocócicas . Estas proteínas recombinantes han sido purificadas y usadas para vacunas ratones. El antisuero resultante es bactericida. Las versiones no lipidadas de P2086 se expresaron de tres de las nueve cepas anteriores. rLP2086 consistentemente produce una respuesta inmune más grande que rP2086. rLP2086 también muestra actividad bactericida aumentada contra las cepas meningocócicas tanto homologas como heterólogas .. Ejemplo 10 Las siguientes tablas, Tablas XVIII y XIX, muestran la caracterización de variantes de miembros de las dos subfamilias . TABLA. XVIII Variantes rLP2086 de la Subfamilia A - Caracterización rLP2086- ?.?2086- rLP2086- rLP2086- rLP2086 252988 250771 870446 2996 -Cll Medio de HySoy HySoy HySoy HySoy HySoy Crecimiento Solubilidad rTX-100 TX-100 TX-100 rTX- rTX- 100=>Z3- 100=Z3- 12 12 Etapas de TMAE HQ Poros HQ Poros TMAE TMAE purificaS SEC SEC SEC S ción Fractoge Fractog 1 el SEC Pureza (%) 96 83 80 95 82 Hendimiento 0.2 0.7 0.8 0.5 0.1 (mg/g ( fermen- pelotilla tador) de célula TamaSEC 134,000 155, 000 132, 000 163,000 126, 000 ño (Z3- 12) MS 27, 897 27,878 28, 139 (lipido (lipido (liodo 712) 750) 682) Punto Medio 66°C - NT 65°C 63°C de Transición de Desnaturalización Térmica <TM) °C Proteina 2.7 mg 1 mg (z3- 5.0 mg 44 mg 1.1 mg Disponible 12) (mg) Homología 71 62 - 71 72 68 de Secuencia 8529 (%) TABLA XIX Variantes ??2086 de la Subfamilia B - Caracterización rLP2086- rLP2086- rLP2086- rLP2086- 8529 M982 880049 CDC1573 Medio de Apollon Apollon HySoy HySoy Crecimiento (Sanford) Solubilidad 4M rTX- rTX-100=Z3- rTX-100 Urea=fZ3-12 100=Z3-12 12 Etapas de TMAE TMAE TMAE TMAE purificación S S S Fractogel SEC Fractogel Fractogel Pureza (%) 96 96 90 93 Rendimiento 0.2 1.6 0.4 1.0 (mg/g ( fermen- ( fermen-pelotilla de tador) tador) célula Taman SZC 95,000 110, 000 100, 000 120,000 o <Z3- 150, 000 12) MS 27,785 27,719 28,044 28, 385 lipido (lipido (lipido (lipido 822) 711) 819) 823) Punto Medio 70°C 75°C 62°C NT de Transición de Desnaturaliz ación T rmica (¾) °C Proteina Urea-34mg Pool 1- 3.6 mg 4.9mg Disponible Sarc-36 mg 47 mg (mg) Pool 2- 17 mg Homología de 100 94 92 87 Secuencia 8529 (%) La Tabla XX enseguida proporciona los resultados de los ensayos bactericidas de suero fluorescentes para la Subfamilia A de 2086. TABLA XX Descripción 250771 870446 6557 NMB M98 M97 250732 252697 rLP2086-252988, >800 >800 <25 - >800 >800 10 µ9 (99%) * (99%) * (99%)* (93%)* CLP2086-C11, 200 >800 <25 - 200 400 10 µ9 (91%) * rLP2086-25O771 >800 >800 <25 - >800 >800 10 µ? (92%)* (99%) * (96) » (84%) * rLP2086-87044É 400 >800 <25 400 400 10 µ5 (99%) * rLP2086-2996, 800 >800 <25 >800 >800 10 µ<} (99%) * (93%) * (72%) * rLP2086-8529+ 800 >800 <25 >800 >800 rLP2086-2996, 10 pg -LP2086- 800 200 >800 S29*rPI.22a, 14a+ (98%) * rPI.5a,2c, 10 ?.?2086-8529+ 400 800 200 >800 400 >800 rLP2086-2996+ (99%) * (99%) * (88%)* rPI.22a,14a+ rPI.5a,2c, 10 µ? NMB/rLP2086- 100 400 8529 vesículas, 20 pg rPI.22a,14a, 10 25 - 800 - 100 - rPI.5a,2c, 1Q Vig - - - >800 - - (99*) ' rLP2086-8529, - 800 - - - - 10 pg rPI.22a,14a, 200 - - - 800 - 25 g rPI.18,25.6, - - - - - - 5 ig nPI.22,9 (M982I, - - 100 - - - 25 µ·} Suero de ratón <10 <10 <10 <10 <10 <10 preinmune (control negativo) 800 400 800 1600 *# *# Notas : * El porcentaje indica el % de actividad BC en la dilución de 1:800. ** Control positivo no disponible. - suero no probado Ejemplo 11 Lo siguiente demuestra adicionalmente que P2086 es expresada en cepas neisseriales y proporciona ejemplos específicos adicionales de la expresión P2086 en varias cepas.

Se prepararon Usados de células con células de cultivos en placa resuspendidos en la solución reguladora de muestra SDS y se calentaron a 98 °C durante cuatro minutos. Las muestras se cargaron a ~30-50 µg de proteina total por cavidad en geles premoldeados al 10-20% (ICN) y se corrieron a 175V. Los geles se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, que luego se bloqueó durante 30 minutos con leche en polvo al 5% en solución salina Tris-regulada (Blotto) . El anticuerpo primario usado con una acumulación de antisuero policlonal cultivado contra variantes rLP2086 individuales en ratones. Con referencia a las FIGS. 17 y 18, una Mancha de Western muestra la reactividad del antisuero de ratón rLP2086 a los lisados de células completas de la Subfamilia A y B de P2086. Para la mancha de lisado de células de la Subfamilia A, los antisueros usados fueron cultivados contra rLP2086-2996, -870446 y -250771 con rLP2086-250771 diluido a 1/500 en Blotto y los otros diluidos a 1/1000 en Blotto. Para la mancha de lisado de células de la Subfamilia B, los antisueros usados fueron cultivados contra rLP2086-8529 (diluido 1/1000 en Blotto), -CDC1573. -M982 y -880049 (estos tres diluidos 1/500 en Blotto) . Los antisueros primarios y la mancha se incubaron a 4°C durante la noche. La mancha se lavó, un antirratón de cabra AP secundario se adicionó a 1/500 en Blotto, y la mancha se incubó durante 30 min. a temperatura ambiente. Después del lavado, la mancha se reveló usando el Sistema de Sustrato de Fosfatasa de Membrana BCIP/NBT (KPL) . BIBLIOGRAFIA Las referencias referidas anteriormente en la presente se mencionan enseguida y son incorporadas en la presente por referencia en su totalidad: 1. 1997. Case definitions for Infectious Conditions Under Public Health Surveillance. CDC. 2. 1995 Sambrook, J. and D.W. Russell. 1995.

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Santini, S. Savino, M. Scarselli, e. Storni, P. Zuo, M. Broeker, E. Hundt, B. Knapp, E. Blair, T. Masón, H. Tettelin, D.W. Hood, a.C. Jeffies, N.J. Saunders, D.M. Granoff, J.c. Venter, E.R. Moxon, G . Grandi, and R. Pappuoli. 2000. Idenification of vaccine candidates against serogroup B meningococcus by whole-genome sequencing. Science 287 (5459) :1816-20. 72. Podbielski. A., A. Flosdorff, and J. Weber-Heynemann. 1995. The group A. streptococcal virR49 gene controls expression of four structural vir regulon genes. Infecí I mun. 63:9-20. 73. Poolman, J.T. 1996. Bacterial outer membrane protein vaccines. The meningococcal example. -Advances in Experimental Medicine & Biology 397:73-7. 74. Proft, T., S. Luise Moffatt, C.J. Berkahn, and J.D. Fraser. 1999. Identification and Characterizacion of Novel Superantxgens from streptococcus pyogenes. J. Esp. Med. 189:89-102. 75. Pugsley, A.P. 1993. The complete general secretory pathway in gram-negative bacteria. Mícrobiol Rev. 57:50-108. 76. Quinn, A., K. Ward, V.A. Fischetti, M. Hemric, and M.W. Cunningham. 1998. Immunological relationship bet enn the class I epitope of streptococcal M protein and myosin. Infect Immun. 66:4418-24. 77. Reda, K.B., V. Kapur, D. Goela, J.G. Lamphear, J.M. Musser, and R. R. Rich. 1996. Phylogenetic distribution of streptococcal superantigen SSA allelic variants provides evidence for horizontal transfer of ssa within Streptococcus pyogenes. Infect. Immun. 64:1161-5. 78. Sambrook, J., and D.W. Russell. 2001. Molecular cloning a laboratory manual, Third ed, vol. 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. 79. Salzberg, S.L., A.L. Delcher, S. Kasif, and 0. White. 1998. Microbial gene identification using interpolated Markov models. Nucleic Acids Res. 26:544-8. 80. Saukkonen, K. , H. Abdillahi, J.T. Poolaman, and M. leinonen. 1987. Protective efficacy of monoclonal antibodies to class I and class 3 outer membrane proteins of Neisseria meningitidid B:15:PI.16 in infant rat infection model; new prospects for vaccine development . Microbial Pathogenesis 3 (4) :261-7. 81. Sedegah y colaboradores 1994. Immunology. 91, 9866-9870. 82. Sonnenberg, M.G., and J.T. Eelisle. 1997. Definition of Mycobacterium tuberculosis culture fíltrate proteins by two. dimensional polyacrilamida gel electrophoresis, N-terminal amino acid sequencing, and electrospray mass spectrometry. Infect Immun. 65:4515-24. 83. Sonnhammer, e.L., s.R. Eddy, and R. Durbin. 1997. Pfam: a comprehensive datábase of protein domain families based on seed alignments. Proteins. 28:405-20. 84. Stevens, D.L.1995. Streptococcal toxic-shock syndrome : spectrum of disease, pathogenesis, and new concepts in treatment. Emerg Infect Dis .1 : 69-78. 85. Stockbauer, K.E., L. Magoun, M. Liu, e.H. Burns, Jr., S. Gubba, S. Renish, x. Pan, s.C. Bodary, E.

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La invención estando ahora complementamente descrita, será evidente para un experto ordinario en la técnica que muchos cambios y modificaciones se pueden hacer a la misma sin apartarse del espíritu o alcance de la invención como es expuesto en la presente. Lo anterior describe las modalidades preferidas de la presente invención junto con un número de posibles alternativas. Estas modalidades, sin embargo, son simplemente para ejemplo y la invención no está restringida a las mismas.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una composición, caracterizada porque comprende: (a) por lo menos una proteina codificada por una estructura de lectura abierta de Neisseria species (ORF2086), la estructura de lectura abierta que codifica un antigeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antigeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neisseria meningitidis en un sujeto; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a) ; o (c) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o fragmento inmunogénico descrito en (b) . 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 254 a 259. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la por lo menos una proteina es codificada por ORF2086 en cualquiera de las cepas nesseriales L3 6275, CDC2369, CDC1034, L4 891, B16B6, W 135 (ATCC35559), CU, Y (ATCC35561 ) , M98 250732, M98 250771, CDC1135, M97 252153, CDC1610, CDC1492, L8 M978; M97 252988, M97 252697, 6557, 2996, M97 252976, M97 251854, CDC1521, M98 250622, 870446, M97 253248, 98 250809, L5 M981, NMB o M98 250572. . La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 260 a 278 o 279 a 299. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la por lo menos una proteina es codificada por ORF2086 en cualquiera de las cepas nesseriales 880049, M982, CDC1573, M97 253524 o M98 250670. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS : 2-174 de número par. 7. La composición de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque adicionalmente comprende por lo menos una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 176-252 de número par. 8. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 224-252 de número de par. 9. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la por lo menos una proteina, porción inmunogénica o equivalente biológico es no patogénica y sustancialmente libre de cualquiera de las impurezas infecciosas. 10. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la por lo menos una proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a aproximadamente 30,000 daltons como es medido mediante la espectroscopia de masas. 11. La composición de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la por lo menos una proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido en un gel de SDS poliacrilamida al 10%-20%. 12. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 13. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador . 14. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 15. La composición de conformidad . con la reivindicación 14, caracterizada porque el adyuvante comprende un líquido. 16. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina es una proteina recombinante . 17. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina es aislada de la Neisseria species nativa. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina es una lipoproteina. 19. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la proteina es no lipidada . 20. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende por lo menos una PorA, PorB, proteina de enlace de transferrina o proteina de opacidad (Opc) . 21. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende por lo menos un antigeno de superficie adicional de Neisseria species, el antigeno de superficie adicional que es una proteina no de ORF2086. 22. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un polisacárido. 23. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende un péptido, polipéptido o proteina adicional, la composición que forma un conjugado que induce una respuesta inmune a dos o más bacterias en un mamífero. 2 . Una composición, caracterizada porque comprende : por lo menos una proteina inmunogénica o polipéptido que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-259. 25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000-30,000 daltons como es medido mediante la espectroscopia d<: masas. 26. La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido en un gel de SDS poliacrilamida al 10%-20%. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 28. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 29. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 30. La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el adyuvante comprende un liquido. 31. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la proteína es no lipidada. 32. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la proteina es una proteína recombinante. 33. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la proteína o polipéptido es aislado de Neisseria species nativa. 34. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la proteína es una lipoproteína . 35. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende por lo menos una PorA, PorB, proteína de enlace de transferrina o proteína de opacidad (Opc) . 36. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende por lo menos un antigeno de superficie adicional de Neisseria species, el antigeno de superficie adicional que es una proteina no de ORF2086. 3 . La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un polisacárido . 38. La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada porque la composición comprende un péptido, polipéptido o proteina adicional, la composición que forma un conjugado que induce una respuesta inmune a dos o más bacterias en un mamífero. 39. Una composición, caracterizada porque comprende: por lo menos una proteina inmunogénica o polipéptido que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 260 a 278. 40. La composición de conformidad con la reivindicación 39, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 41. Una composición, caracterizada porque comprende : por lo menos una proteina inmunogénica o polipéptido que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 279 a 299. 42. La composición de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 43. Una composición, caracterizada porque comprende: por lo menos una proteina aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300; en donde x es cualquier aminoácido; en donde la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos; en donde la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos; y en donde la posición de aminoácido 156 es cualquiera de 0 a 1 aminoácido. 44. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 comprende 0, 4 o 5 aminoácidos. 45. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 comprende 0 o 3 aminoácidos. 46. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a 30, 000 daltons como es medido mediante la espectroscopia de masas. 47. La composición de conformidad con la reivindicación 46, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido en un gel de SDS poliacrilamida al 10%-20% . 48. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 49. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 50. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 51. La composición de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque el adyuvante comprende un liquido. 52. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la proteina es no lipidada. 53. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la proteina es una proteina recombinante . 54. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la proteina es aislada de la ífeísseria species nativa. 55. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la proteina es una lipoproteina . 56. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende por lo menos una PorA, PorB, proteina de enlace de transferrina o proteina de opacidad (Opc) . 57. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende por lo menos un antigeno de superficie adicional de Neisseria species, el antigeno de superficie adicional que es una proteina no de ORF2086. 58. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un polisacárido . 59. La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada porque la composición comprende un péptido, polipéptido o proteina adicional, la composición que forma un conjugado que induce una respuesta inmune a dos o más bacterias en un mamífero. 60. Una composición, caracterizada porque comprende : (a) por lo menos una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número de par; (b) por lo menos una proteina codificada por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar; (c) por lo menos una porción nmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a) o (b) ; o (d) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o (b) o fragmento inmunogénico descrito en (c) . 61. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-174 de número par. 62. La composición de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada porque adicionalmente comprende por lo menos una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS : 176-252 de numero par. 63. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-12 de número par. 64. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 14-24 de número par. 65. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 26-42 de número par. 66. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 50-60 de número par. 67. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 62-108 de número par. 68. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 110-138 de número par. 69. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 140-156 de número par. 70. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 158-174 de número par. 71. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 224-252 de número par. 72. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende por lo menos una PorA, PorB, proteina de enlace de transíerrina o proteina de opacidad (Opc) . 73. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende por lo menos un antigeno de superficie adicional de Neisseria species, el antigeno de superficie adicional que es una proteina no de ORF2086. 74. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a aproximadamente 30,000 daltons como es medido mediante la espectroscopia de masas. 75. La composición de conformidad con la reivindicación 74, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido en un gel de SDS poliacrilamida al 10%-20%. 76. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 77. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 78. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 79. La composición de conformidad con la reivindicación 78, caracterizada porque el adyuvante comprende un liquido. 80. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la proteina es no lipidada. 81. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la proteina es una proteina recombinante . 82. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la proteina es aislada de la Neisseria species nativa. 83. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la proteina es una lipoproteina . 84. La composición de conformidad con 1<~ reivindicación 60, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un polisacárido. 85. La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada porque la composición comprende un péptido, polipéptido o proteina adicional, la composición que forma un conjugado que induce una respuesta inmune a dos o más bacterias en un mamífero. 86. Una composición, caracterizada porque comprende : por lo menos un antigeno de una primera cepa bacteriana de Neisseria species que proporciona inmunogenicidad contra la infección de un sujeto por una segunda cepa bacteriana de Neisseria species. 87. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la primera cepa es una cepa de Neisseria species y la segunda cepa es una cepa del serogrupo B de Neisseria meningitidis. 88. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la primera cepa es cualquiera de las cepas L3 6275, CDC2369, CDC1034, L4 891, B16B6, W 135 (ATCC35559) , Cll, Y (ATCC35561) , M98 250732, 98 250771, CDC1135, M97 252153, CDC1610, CDC1492, L8 M978; M97 252988, M97 252697, 6557, 2996, M97 252976, M97 251854, CDC1521, 98 250622, 870446, M97 253248, M98 250809, L5 M981, NMB o M98 250572. 89. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la primera cepa es cualquiera de las cepas 880049, M982, CDC1573, M97 253524 o M98 250670. 90. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la proteina es una proteína recombinante. 91. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la proteína es aislada de la Neisseria species nativa. 92. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la proteína es una lipoproteína . 93. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 94. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 95. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 96. La composición de conformidad con la reivindicación 95, caracterizada porque el adyuvante comprende un liquido. 97. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la proteina es no lipidad . 98. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un polisacárido. 99. La composición de conformidad con la reivindicación 86, caracterizada porque la composición comprende un péptido, polipéptido o proteina adicional, la composición que forma un conjugado que induce una respuesta inmune a dos o más patógenos en un mamífero. 100. Una composición, caracterizada porque comprende : por lo menos una proteina aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 301; en donde x es cualquier aminoácido; en donde la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8 es cualquiera de 0 a 4 aminoácidos; en donde la región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos. 101. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a aproximadamente 30,000 daltons como es medido mediante la espectroscopia de masas. 102. La composición de conformidad con la reivindicación 101, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido en un gel de SDS poliacrilami da al 10%-20%. 103. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porgue la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 104. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 105. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 106. La composición de conformidad con la reivindicación 105, caracterizada porque el adyuvante comprende un líquido. 107. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la proteína es no lapidada. 108. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la proteína es una proteína recombinante . 109. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la proteína es aislada de la Neisseria species nativa. 110. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la proteína es una lipoproteína . 111. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un polisacárido . 112. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la composición comprende un péptido, polipéptido o proteína adicional, la composición que forma un conjugado que induce una respuesta inmune a dos o más bacterias en un mamífero. 113. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 8 comprende 0 a 4 aminoácidos. 114. La composición de conformidad con la reivindicación 100, caracterizada porque la región de la posición de aminoácido 66 a la posición de aminoácido 68 comprende 0 a 3 aminoácidos. 115. Una composición, caracterizada porque comprende: por lo menos una proteina aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 302; en donde x es cualquier aminoácido; en donde la región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos . 116. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la región de la posición de aminoácido 8 a la posición de aminoácido 12 comprende 0 a 5 aminoácidos. 117. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a aproximadamente 30,000 daltons como es medido mediante la espectroscopia de masas. 118. La composición de conformidad con la reivindicación 117, caracterizada porque la por lo menos una proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido en un gel de SDS poliacrilamida al 10 -20%. 119. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 120. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 121. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 122. La composición de conformidad con la reivindicación 121, caracterizada porque el adyuvante comprende un liquido. 123. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la proteina es no lipidada. 124. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la proteina es un polipéptido recombinante. 125. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la proteina es aislada de una fuente natural. 126. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un polisacárido . 127. La composición de conformidad con la reivindicación 115, caracterizada porque la composición comprende un péptido, polipéptido o proteina adicional, la composición que forma un conjugado que induce una respuesta inmune a dos o más bacterias en un mamífero. 128. Una composición, caracterizada porque comprende: por lo menos un anticuerpo que se enlaza inmunoespecificamente con cualquiera de: (a) por lo menos una proteina codificada por una estructura de lectura abierta de Neisseria species (ORF2086), la estructura de lectura abierta que codifica un antigeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antigeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neisseria meningitidis en un sujeto; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a) ; o (c) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o un fragmento inmunogénico descrito en (b) . 129. La composición de conformidad con la reivindicación 128, caracterizada porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 130. La composición de conformidad con la reivindicación 128, caracterizada porque adicionalmente comprende un portador farmacéuticamente aceptable. 131. Una composición, caracterizada porque comprende : por lo menos un anticuerpo que se enlaza xnmunoespecificamente con cualquiera de: (a) por lo menos una proteina comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 254 a 259; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a); o (c) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o un fragmento inmunogénico descrito en {b) . 132. La composición de conformidad con la reivindicación 131, caracterizada porque la por lo menos una proteina, porción inmunogénica de la misma o equivalente biológico de la misma comprende cualquiera de las SEQ ID NOS : 260-299. 133. La composición de conformidad con la reivindicación 131, caracterizada porque el por lo menos un anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 134. Una composición, caracterizada porque comprende : por lo menos un anticuerpo que se enlaza inmunoespecificamente con por 'lo menos una proteina aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300; en donde x es cualquier aminoácido; en donde la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos; en donde la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos; y en donde la posición de aminoácido 156 es cualquiera de 0 a 1 aminoácido. 135. La composición de conformidad con la reivindicación 134, caracterizada porque el por lo menos un anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. 136. Una composición, caracterizada porque comprende: por lo menos un anticuerpo que se enlaza inmunoespecificamente con cualquiera de: (a) por lo menos una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par; o (b) por lo menos una proteina codificada por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar; (c) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a) o (b) ; o (d) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o (b) o un fragmento inmunogénico descrito en (c) . 13 . Una composición, caracterizada porque comprende : por lo menos un polinucleótido que (a) codifica por lo menos una proteina codificada por una estructura de lectura abierta de Neissería species (ORF2086) o por lo menos una porción inmunogénica o equivalente biológico de la por lo menos una proteina, la estructura de lectura abierta que codifica un antigeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antigeno inmunogénico- reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neisseria meningitidis en un sujeto; o (b) híbrida bajo condiciones severas a cualquiera de los polinucleótidos descritos en (a) . 138. La composición de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque adicionalmente comprende una secuencia guía P4 (SEQ ID NO. 322) . 139. La composición de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque la composición comprende un vector. 140. La composición de conformidad con la reivindicación 139, caracterizada porque el vector es un plásmido. 141. La composición de conformidad con la reivindicación 139, caracterizada porque el vector es un fago . 142. La composición de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque las condiciones severas son condiciones de hibridación de southern de alta severidad. 143. La composición de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque además comprende una secuencia guia P4 (SEQ ID NO. 322). 144. La composición de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque el polinucleótido es un polinucleótido recombinante . 145. La composición de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque el polinucleótido es aislado de una fuente natural. 146. La composición de conformidad con la reivindicación 137, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un péptido, polipéptido o proteina adicional . 147. Una composición, caracterizada porque comprende : por lo menos un polinucleótido que (a) codifica por lo menos una proteina aislada que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-259, 260-278 o 279-299, o (b) híbrida bajo condiciones severas a cualquiera de los polinucleótidos descritos en (a) . 148. La composición de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque adicionalmente comprende una secuencia guia P4 (SEQ ID NO. 322) . 149. La composición de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque la composición comprende un vector . 150. La composición de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque las condiciones severas son condiciones de hibridación de southern de alta severidad. 151. La composición de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque además comprende una secuencia guia E>4 (SEQ ID NO. 322). 152. La composición de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque el polinucleótido es un polinucleótido recombinante . 153. La composición de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque el polinucleótido es aislado de una fuente natural. 154. La composición de conformidad con la reivindicación 147, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un péptido, polipéptido o proteína adicional. 155. Una composición, caracterizada porque comprende : por lo menos un polinucleótido que (a) codifica por lo menos una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300, x que es cualquier aminoácido, la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 que es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos, la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos; y la posición de aminoácido 156 que es cualquiera de 0 a 1 aminoácido, o (b) híbrida bajo condiciones severas a cualquiera de los polinucleótidos descritos en (a) . 156. La composición de conformidad con la reivindicación 155, caracterizada porque adicionalmente comprende una secuencia guía P4 (SEQ ID NO. 322) . 157. Una composición, caracterizada porque comprende : (a) por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos uno de: (i) por lo menos una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par; o (ii)' por lo menos una proteina codificada por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas aun polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar, (iii) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (i) o (ií) ; o (iv) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (i) o (ii) o fragmento inmunogénico descrito en (iii) o (b) por lo menos un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a cualquiera de los polinucleótidos descritos en (a) . 158. La composición de conformidad con la reivindicación 157, caracterizada porque el por lo menos un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar. 159. La composición de conformidad con la reivindicación 157, caracterizada porque la composición comprende un vector. 160. La composición de conformidad con la reivindicación 157, caracterizada porque las condiciones severas son condiciones de hibridación de southern de alta severidad. 161. La composición de conformidad con la reivindicación 157, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un péptido, polipéptido o proteina adicional. 162. Una composición, caracterizada porque comprende : (a) por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos un antigeno de una primera cepa bacteriana de Neisseria species que proporciona inmunogenicidad contra la infección de un sujeto por una segunda cepa bacteriana de Neisseria species; o (b) por lo menos un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a por lo menos un polinucleótido de (a) . 163. La composición de conformidad con la reivindicación 162, caracterizada porque el por lo menos un polinucleótido aislado comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ. ID NOS: 1-253 de número impar. 164. La composición de conformidad con la reivindicación 162, caracterizada porque adicionalmente comprende una secuencia guia P4 (SEQ ID NO. 322) . 165. La composición de conformidad con la reivindicación 162, caracterizada porque la composición comprende un vector. 166. La composición de conformidad con la reivindicación 162, caracterizada porque las condiciones severas son condiciones de hibridación de southern de alta severidad. 167. La composición de conformidad con la reivindicación 162, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica para un péptido, polipéptido o proteina adicional . 168. Una composición, caracterizada porque comprende : un vector que comprende cualquiera de: (a) por lo menos una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-259, 260-278 o 279-299; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a); o (c) por lo menos un equivalentes biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o fragmento inmunogénico descrito en (b) . 169. La composición de conformidad con la reivindicación 168, caracterizada porque el vector es un plásmido. 170. La composición de conformidad con la reivindicación 168, caracterizada porque el vector es un fago . 171. La composición de conformidad con la reivindicación 168, caracterizada porque el vector es un bacteriófago. 172. La composición de conformidad con la reivindicación 168, caracterizada porque el vector es un fago moderado. 173. Una composición, caracterizada porque comprende: un vector que comprende por lo menos un polinucleótido que codifica una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300; en donde x es cualquier aminoácido; en donde la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos; en donde la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos; y en donde la posición de aminoácido 156 es cualquiera de 0 a l aminoácido. 174. La composición de conformidad con la reivindicación 173, caracterizada porque el vector es un plásmido. 175. La composición de conformidad con la reivindicación 173, caracterizada porque el vector es un fago . 176. Una composición, caracterizada porque comprende : un vector que comprende cualquiera de: (a) por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos uno de los polipéptidos de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par; o (b) por lo menos un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a por lo menos un polinucleótido de (a) . 177. La composición de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el vector comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-153. 178. La composición de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el vector es un plásmido . 179. La composición de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el vector es un fago. 180. La composición de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el vector es un bacteriófago . 181. La composición de conformidad con la reivindicación 176, caracterizada porque el vector es un fago moderado . 182. Una composición, caracterizada porque comprende : una célula huésped transformada/transfectada o infectada con un vector, el vector que comprende cualquiera de: (a) por lo menos una proteina codificada con una estructura de lectura abierta de Neisseria specíes (ORF2086) , la estructura de lectura abierta que codifica un antigeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antigeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neisseria meningitidis en un sujeto; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a); o (c) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteína descrita en (a) o fragmento inmunogénico descrito en (b) . 183. Una composición, caracterizada porque comprende : una célula huésped transformada/transfectada o infectada con un vector, el vector que comprende cualquiera de: (a) por lo menos una proteína que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-259, 260-278 o 279-299; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a) ; o (c) por lo menos un equivalentes biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o fragmento inmunogénico descrito en (b) . 184. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: expresar en una célula huésped una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de: (a) por lo menos una proteina codificada por una estructura de lectura abierta de Neisseria species (ORF2086) , la estructura de lectura abierta que codifica un antigeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antigeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neisseria meningitidis en un sujeto; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a) ; o (c) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o fragmento inmunogénico descrito en (b) . 185. La composición de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque la secuencia de ácidos nucleicos es cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar. 186. La composición de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteina que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par. 187. La composición de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque la secuencia de ácidos nucleicos codifica una proteína que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-174 de número par. 188. La composición de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque la proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a aproximadamente 30,000 como es medido mediante la espectroscopia de masas. 189. La composición de conformidad con la reivindicación 187, caracterizada porque la proteina tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido sobre un gel de SDS poliacrilamida al 10%-20%. 190. La composición de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 191. La composición de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 192. La composición de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 193. La composición de conformidad con la reivindicación 191, caracterizada porque el adyuvante es un liquido. 194. La composición de conformidad con la reivindicación 183, caracterizada porque la proteina es una proteina lipidada. 195. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: aislar y purificar de la Neisseria species cualquiera de: (a) por lo menos una proteína codificada por una estructura de lectura abierta de Neisseria species (ORF2086) , la estructura de lectura abierta que codifica un antígeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antígeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neisseria meningitidis en un sujeto; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteína descrita en (a) ; o (c) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteína descrita en (a) o fragmento inmunogénico descrito en (b) . 196. La composición de conformidad con la reivindicación 194, caracterizada porque el por lo menos un polinucleótido comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar. 197. La composición de conformidad con la reivindicación 194, caracterizada porque el proceso además comprende introducir una secuencia de guía no nativa al por lo menos un polinucleótido aislado. 198. La composición de conformidad con la reivindicación 196, caracterizada porque la secuencia guía no nativa es una secuencia guía P4 {SEQ ID NO. 322) . 199. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: aislar y purificar de la Neisseria specíes cualquiera de: (a) por lo menos una proteína que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-259, 260-278 o 279-299; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteína descrita en (a) ; o (c) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteína descrita en (a) o fragmento inmunogénico descrito en (b) . 200. La composición de conformidad con la reivindicación 198, caracterizada porque el polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a aproximadamente 30,000 como es medido mediante la espectroscopia de masas. 201. La composición de conformidad con la reivindicación 199, caracterizada porque el polipéptido tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido sobre un gel de SDS poliacrilamida al 10%-20%. 202. La composición de conformidad con la reivindicación 198, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 203. La composición de conformidad con la reivindicación 198, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 204. La composición de conformidad con la reivindicación 198, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 205. La composición de conformidad con la reivindicación 203, caracterizada porque el adyuvante comprende un liquido. 206. La composición de conformidad con la reivindicación 198, caracterizada porque la proteina es una proteína lipidada. 207. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: insertar en un vector por lo menos una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300; en donde x es cualquier aminoácido; en donde la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos ; en donde la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos; y en donde la posición de aminoácido 156 es cualquiera de 0 a 1 aminoácido. 208. La composición de conformidad con la reivindicación 206, caracterizada porque el vector es un plásmido . 209. La composición de conformidad con la reivindicación 206, caracterizada porque el vector es un fago . 210. La composición de conformidad con la reivindicación 206, caracterizada porque el vector es un bacteriófago . 211. La composición de conformidad con la reivindicación 206, caracterizada porque el vector es un fago moderado. 212. La composición de conformidad con la reivindicación 206, caracterizada porque además comprende una secuencia guia no nativa. 213. La composición de conformidad con la reivindicación 211, caracterizada porque la secuencia guia no nativa es una secuencia guia P4 (S3Q ID NO. 322) . 214. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: expresar en una célula huésped (a) por lo menos un polinucleótido aislado que codifica por lo menos una proteina codificada por una estructura de lectura abierta de Neísseria species (ORF2086), o por lo menos una porción inmunogénica o equivalente biológico de la por lo menos una proteína, la estructura de lectura abierta que codifica un antígeno inmunogénico reactivo cruzado y el antigeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neísseria meningitidis en un sujeto; y (b) una secuencia guía no nativa asociada con el por lo menos un polinucleótido aislado. 215. La composición de conformidad con la reivindicación 213, caracterizada porque la secuencia guía no nativa es una secuencia guía P4 (SEQ ID NO. 322) . 216. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: expresar en una célula huésped una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de: (a) por lo menos una proteína codificada por una estructura de lectura abierta de Neísseria species (ORF2086) , la estructura de lectura abierta que codifica un antígeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antígeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neissería meningitidis en un sujeto; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a) ; o (c) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o fragmento inmunogénico descrito en (b) ; o expresar en una célula huésped una secuencia de ácidos nucleicos que híbrida bajo condiciones severas a la secuencia de ácidos nucleicos anterior. 217. La composición de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque la secuencia de ácidos nucleicos es cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar. 218. La composición de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque la secuencia de ácidos nucleicos codifica cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par. 219. La composición de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque la proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a aproximadamente 30,000' como es medido mediante la espectroscopia de masas. 220. La composición de conformidad con la reivindicación 218, caracterizada porque la proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido sobre un gel de SDS poliacrilamida al 10%-20%. 221. La composición de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 222. La composición de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 223. La composición de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 224. La composición de conformidad con la reivindicación 222, caracterizada porque el adyuvante comprende un líquido. 225. La composición de conformidad con la reivindicación 215, caracterizada porque las condiciones severas son condiciones de hibridación de southern de alta severidad. 226. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: aislar y purificar de la Neisseria species cualquiera de: (a) por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos uno de los polipéptidos que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par; o (b) por lo menos un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a por lo menos un polinucleótido de (a) . 227. La composición de conformidad con la reivindicación 225, caracterizada porque el por lo menos un polinucleótido comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar. 228. La composición de conformidad con la reivindicación 225, caracterizada porque el proceso además comprende introducir una secuencia guia no nativa al por lo menos un polinucleótido. 229. La composición de conformidad con la reivindicación 227, caracterizada porque la secuencia guía no nativa es una secuencia guía P4 (SEQ ID NO. 322) . 230. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: aislar y purificar de la Neisseria species cualquiera de: (a) por lo menos una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par; (b) por lo menos una proteína codificada por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar; (c) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteína descrita en (a) o (b) ; o (d) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteína descrita en (a) o (b) o fragmento inmunogénico descrito en (c) . 231. La composición de conformidad con la reivindicación 229, caracterizada porque la proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 26,000 a aproximadamente 30,000 como es medido mediante la espectroscopia de masas. 232. La composición de conformidad con la reivindicación 230, caracterizada porque la proteína tiene un peso molecular de aproximadamente 28-35 kDa como es medido sobre un gel de SDS poliacrilamida al 10%-20%. 233. La composición de conformidad con la reivindicación 229, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende una solución reguladora, diluyente, adyuvante o portador farmacéuticamente aceptable. 234. La composición de conformidad con la reivindicación 229, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un portador. 235. La composición de conformidad con la reivindicación 229, caracterizada porque la composición adicionalmente comprende un adyuvante. 236. La composición de conformidad con la reivindicación 234, caracterizada porque el adyuvante comprende un liquido. 237. La composición de conformidad con la reivindicación 229, caracterizada porque las condiciones severas son condiciones de hibridación de southern de alta severidad . 238. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: insertar en un vector cualquiera de: (a) por lo menos una polinucleótido aislado que codifica por lo menos uno de los polipéptidos que comprenden cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par; o (b) por lo menos un polinucleótido aislado que híbrida bajo condiciones severas a por lo menos un menos un polinucleótido de (a) . 239. La composición de conformidad con la reivindicación 237, caracterizada porque el vector es un plásmido . 240. La composición de conformidad con la reivindicación 237, caracterizada porque el vector es un fago . 241. La composición de conformidad con la reivindicación 237, caracterizada porque el vector es un bacteriófago. 242. La composición de conformidad con la reivindicación 237, caracterizada porque el vector es un fago moderado. 243. La composición de conformidad con la reivindicación 237, caracterizada porque además comprende una secuencia guia no nativa. 244. La composición de conformidad con la reivindicación 242, caracterizada porque la secuencia guia no nativa es una secuencia guía P4 (SEQ ID NO. 322). 245. Una composición, caracterizada porque se prepara mediante un proceso que comprende: expresar en una célula huésped por lo menos un polinucleótido que (a) codifica por lo menos una proteína codificada por una estructura de lectura abierta de Neisseria species (ORF2086) , o por lo menos una porción inmunogénica o equivalente biológico de la por lo menos una proteína, la estructura de lectura abierta que codifica un antígeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antígeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neisseria meningitidis en un sujeto; o (b) híbrida bajo condiciones severas a cualquiera de los polinucleótidos descritos en (a). 246. La composición de conformidad con la reivindicación 244, caracterizada porque adicionalmente comprende una secuencia guía no nativa asociada con el por lo menos un polinucleótido . 247. La composición de conformidad con la reivindicación 245, caracterizada porque la secuencia guia no nativa es una secuencia guia P4 (SEQ ID NO. 322) . 248. Una composición, caracterizada porque comprende : por le menos un antigeno de Neisseria me.ningitidis especifico no de la cepa, inmunogénico, el antigeno que es no patogénico y sustancialmente libre de cualquiera de las impurezas infecciosas. 249. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-6 de número par. 250. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 8-12 de número par. 251. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 14-18 de número par. 252. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 20-24 de número par. 253. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 26-30 de número par. 254. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 32-36 de número par. 255. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 3S-42 de número par. 256. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 44-48 de número par. 257. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 50-54 de número par. 258. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 56-60 de número par. 259. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 62-66 de número par. 260. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 68-72 de número par. 261. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 74-78 de número par. 262. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 80-84 de número par. 263. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 86-90 de número par. 264. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 92-96 de número par. 265. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 98-102 de número par. 266. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 104-108 de número par. 267. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 110-114 de número par. 268. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 116-120 de número par. 269. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 122-126 de número par. 270. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 128-132 de número par. 271. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 134-138 de número par. 272. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 140-144 de número par. 273. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 146-150 de número par. 274. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 152-156 de número par. 275. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 158-162 de número par. 276. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 164-168 de número par. 277. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que niene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 170-140 de número par. 278. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 176-180 de número par. 279. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 182-186 de número par. 280. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 188-192 de número par. 281. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 701 de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 194-198 de número par. 282. El antígeno de conformidad . con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 203-204 de número par. 283. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 206-210 de número par. 284. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 212-216 de número par. 285. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 218-222 de número par. 286. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 224-228 de número par. 287. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antigeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 230-234 de número par. 288. El antigeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 236-240 de número par. 289. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 242-246 de número par. 290. El antígeno de conformidad con la reivindicación 247, caracterizado porque el antígeno comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia de aminoácidos a cualquiera de las SEQ ID NOS: 248-252 de número par. 291. Uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-289, caracterizado porque es para la preparación de un medicamento para inducir una respuesta inmune en un mamífero. 292. El uso de conformidad con la reivindicación 290, caracterizado porque la composición es administrada parenteralmente . 293. El uso de conformidad con la reivindicación 290, caracterizado porque la composición es administrada mucosalmente . 294. El uso de la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1-289, caracterizado porque es en un medicamento efectivo contra la meningitis bacteriana en un mamífero . 295. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 293, caracterizado porque la composición es administrada parenteralmente. 296. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 293, caracterizado porque la composición es administrada mucosalmente. 297. El uso de la composición de conformidad con la reivindicación 293, caracterizado porque la composición es administrada mediante la inyección subcutánea o intramuscular . 298. Un método para preparar una composición, caracterizado porque comprende: expresar en una célula huésped una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de: (a) por lo menos una proteína codificada por una estructura de lectura abierta de Neisseria species (ORF2086), la estructura de lectura abierta que codifica un antigeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antigeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neisseria meningitidis en un sujeto; o (b) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteína descrita en (a); o (c) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o fragmento inmunogénico descrito en (b) . 299. El método de conformidad con la reivindicación 297, caracterizado porque la secuencia de ácidos nucleicos es expresada in vivo. 300. El método de conformidad con la reivindicación 297, caracterizado porque la secuencia de ácidos nucleicos es expresada in vítro. 301. El método de conformidad con la reivindicación 297, caracterizado porque además comprende asociar una secuencia guia P4 (SEQ ID NO. 322) . 302. El método de conformidad con la reivindicación 297, caracterizado porque la por lo menos una proteína comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-299. 303. Un método para preparar una composición, caracterizado porque comprende: aislar y purificar de N. meningitidis por lo menos un polinucleótido que (a) codifica por lo menos una proteína codificada por una estructura de lectura abierta de Neisseria species (ORF2086) o por lo menos una porción inmunogénica o equivalente biológico de la por lo menos una proteína, la estructura de lectura abierta que codifica un antígeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antígeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neisseria meningitidis en un sujeto; o (b) híbrida bajo condiciones severas a cualquiera de los polinucleótidos descritos en (a) . 304. El método de conformidad con la reivindicación 302, caracterizado porque las condiciones severas son condiciones de hibridación de southern de alta severidad. 305. Un método para preparar una composición, caracterizado porque comprende: aislar y purificar de la Neisseria species cualquiera de las proteínas, porciones inmunogénicas o equivalentes biológicos descritos en la presente. 306. Un método para preparar una composición de anticuerpo, caracterizado porque comprende: recuperar anticuerpos de un animal después de introducir en el animal una composición que comprende cualquiera de las proteínas, porciones inmunogénicas o equivalentes biológicos descritos en la presente. 307. Un método para inducir una respuesta inmune en un mamífero, caracterizado porque comprende: administrar al mamífero una cantidad efectiva de una o más de las composiciones de las reivindicaciones 1-289. 308. El método de conformidad con la reivindicación 306, caracterizado porque la composición es administrada parenteralmente . 309. El método de conformidad con la reivindicación 306, caracterizado porque la composición es administrada mucosalmente . 310. Un método para prevenir o tratar la meningitis bacteriana en un mamífero, caracterizado porque comprende: administrar al mamífero una cantidad efectiva de una o más de las composiciones de las reivindicaciones 1-289. 311. El método de conformidad con la reivindicación 309, caracterizado porque la composición es administrada parenteralmente . 312. El método de conformidad con la reivindicación 309, caracterizado porque la composición es administrada mucosalmente . 313. El método de conformidad con la reivindicación 309, caracterizado porque la composición es administrada mediante la inyección subcutánea o intramuscular. 314. On método para prevenir o tratar la meningitis bacteriana en un mamífero, caracterizado porque comprende: administrar al mamífero una cantidad efectiva de una composición de anticuerpo que comprende anticuerpos que enlazan inmunoespecificamente con una proteina, porción inmunogénica o equivalente biológico que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par o cualquiera de las SEQ ID NO: 254-299. 315. El método de conformidad con la reivindicación 312, caracterizado porque la composición de anticuerpo es administrada parenteralmente . 316. El método de conformidad con la reivindicación 312, caracterizado porque la composición de anticuerpo es administrada mucosalmente . 317. El método de conformidad con la reivindicación 312, caracterizado porque la composición de anticuerpo es administrada mediante la inyección subcutánea o intramuscular. 318. Un método para preparar una composición, caracterizado porque comprende: expresar en una célula huésped una secuencia de ácidos nucleicos que codifica cualquiera de: (a) por lo menos una proteina que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par o cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-299; (b) por lo menos una proteina codificada por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar; (c) por lo menos una porción inmunogénica de por lo menos una proteina descrita en (a) o (b) ; o (d) por lo menos un equivalente biológico de por lo menos una proteina descrita en (a) o (b) o fragmento inmunogénico descrito en (c) . 319. El método de conformidad con la reivindicación 316, caracterizado porque la secuencia de ácidos nucleicos es expresada in vivo. 320. El método de conformidad con la reivindicación 316, caracterizado porque la secuencia de ácidos nucleicos es expresada in vitro. 321. El método de conformidad con la reivindicación 316, caracterizado porque el vector es un plásmido. 322. El método de conformidad con la reivindicación 316, caracterizado porque el vector es un fago. 323. El método de conformidad con la reivindicación 316, caracterizado porque además comprende asociar una secuencia guia no nativa con el por lo menos un polinucleótido aislado. 324. El método de conformidad con la reivindicación 316, caracterizado porque la secuencia guia no nativa es la secuencia guía P4 (SEQ ID NO. 267). 325. Un método para preparar una composición, caracterizado porque comprende: aislar y purificar de la Neísseria species por lo menos una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 300; en donde x es cualquier aminoácido; en donde la región de la posición de aminoácido 5 a la posición de aminoácido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoácidos ; en donde la región de la posición de aminoácido 67 a la posición de aminoácido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoácidos; y en donde la posición de aminoácido 156 es cualquiera de 0 a 1 aminoácido. 326. El método de conformidad con la reivindicación 323, caracterizado porque además comprende introducir una secuencia guía no nativa al por lo menos un polinucleótido aislado . 327. El método de conformidad con la reivindicación 323, caracterizado porque la secuencia guía no nativa es la secuencia guía P4 (SEQ ID NO. 322) . 328. Un método para preparar una composición, caracterizado porque comprende: aislar y purificar de la Neísseria species cualquiera de: (a) por lo menos una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2- 252 de número par o la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-259, 260-278 o 279-299; o (b) por lo menos una proteina codificada por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar. 329. El método de conformidad con la reivindicación 326, caracterizado porque las condiciones severas son condiciones de hibridación de southern de alta severidad. 330. Un método para preparar una composición de anticuerpo, caracterizado porque comprende: recuperar anticuerpos de un animal después de introducir al animal una composición que comprende: (a) por lo menos una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2- 252 de número par o la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-259, 260-278 o 279-299; o (b) por lo menos una proteína codificada por un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas al polinucleótido de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar. 331. El método de conformidad con la reivindicación 328, caracterizado porque las condiciones severas son condiciones de hibridación de southern de alta severidad. 332. Una línea de células trasformadas/- transfectadas o infectadas, caracterizada porque comprende: una célula recombinante que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que (a) codifica por lo menos una proteína aislada que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 254-259, 260-278 o 279-299, o (b) híbrida bajo condiciones severas a cualquiera de los polinucleótidos descritos en (a) . 333. Una línea de células trasformadas/-transfectadas o infectadas, caracterizada porque comprende: una célula recombinante que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que (a) codifica por lo menos una proteína codificada por una estructura de lectura abierta de Neisseria species (ORF2086) o por lo menos una porción inmunogénica o equivalente biológico de la por lo menos una proteína, la estructura de lectura abierta que codifica un antígeno inmunogénico reactivo cruzado, y el antígeno inmunogénico reactivo cruzado que proporciona inmunogenicidad contra la infección por el serogrupo B de Neissería meningitidis en un sujeto o (b) híbrida bajo condiciones severas a cualquiera de los polinucleótidos de (a) ; o una célula recombinante que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica: (c) por lo menos un polipéptido codificado por cualquiera de (a) o (b) ; o (d) por lo menos un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par . 334. La línea de células trasformadas/transfectadas o infectadas de conformidad con la reivindicación 331, caracterizada porque el polipéptido es un anticuerpo monoclonal. 335. La linea de células trasformadas/transfectadas o infectadas de conformidad con la reivindicación 331, caracterizada porque la célula recombinante es un hibridoma. 336. La línea de células trasformadas/transfectadas o infectadas de conformidad con la reivindicación 331, caracterizada porque la célula recombinante es un trioma. 337. Una línea de células trasformadas/-transfectadas o infectadas, caracterizada porque comprende: una célula recombinante que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que comprende: (a) por lo menos un polinucleótido que codifica una proteína que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par; (b) por lo menos un polinucleótido que comprende la secuencia de ácidos nucleicos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 1-253 de número impar; (c) por lo menos un polinucleótido que híbrida bajo condiciones severas a cualquiera de (a) o (b) ; o una célula recombinante que expresa una secuencia de ácidos nucleicos que codifica: (d) por lo menos un polipéptido codificado por cualquiera de (a), (b) o (c) ; o (e) por lo menos un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 2-252 de número par. 338. La línea de células trasformadas/transfectadas o infectadas de conformidad con la reivindicación 335, caracterizada porque el polipéptido es un anticuerpo monoclonal . 339. La línea de células trasformadas/transfectadas o infectadas de conformidad con la reivindicación 335, caracterizada porque la célula recombinante es un hibridoma. 340. La linea de células trasformadas/transfectadas o infectadas de conformidad con la reivindicación 335, caracterizada porque la célula recombinante es un trioma. 341. Un método para identificar una proteína inmunogénica, caracterizado porque comprende: detectar actividad bactericida en una muestra probada contra un antisuero ORF2086. 342. Un método para identificar una proteina inmunogénica, caracterizado porque comprende: detectar un pclinucleótido en una muestra probada contra una sonda de ácidos nucleicos ORF2086. 343. Una composición, caracterizada porque es sustancialmente como se describe anteriormente en la presente . 344. Un uso, caracterizado por sustancialmente como se describe anteriormente presente .