ES2562811T3 - Nuevas composiciones inmunogénicas para la prevención y tratamiento de enfermedad meningocócica - Google Patents
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Abstract
1. Una composición que comprende al menos una proteína que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene identidad de secuencia mayor del 99 % con la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEC ID Nº: 182, 184 y 186 en la que la composición comprende adicionalmente al menos una proteína PorA.
Description
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Nuevas composiciones inmunogenicas para la prevencion y tratamiento de enfermedad meningococica Campo de la invencion
La presente divulgacion se refiere a protemas ORF2086 de Neisseria (Subfamilia A y Subfamilia B), que pueden aislarse de cepas bacterianas tales como las de especies de Neisseria, incluyendo cepas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E), Neisseria gonorrhoeae y Neisseria lactamica, asf como partes inmunogenicas y/o equivalentes biologicos de dichas protemas. La presente divulgacion tambien se refiere a anticuerpos que se unen de forma inmunoespedfica con dichas protemas, partes inmunogenicas y/o equivalentes biologicos. Ademas, la presente divulgacion se refiere a polinucleotidos aislados que comprenden secuencias de acido nucleico que codifican cualquiera de las anteriores protemas, partes inmunogenicas, equivalentes biologicos y/o anticuerpos. Adicionalmente, la presente divulgacion se refiere a composiciones inmunogenicas y a su uso para prevenir, tratar y/o diagnosticar infeccion meningococica causada por N. meningitidis, y en particular enfermedad meningococica causada por N. meningitidis serogrupo B, asf como a procedimientos para preparar dichas composiciones. La presente divulgacion se refiere tanto a formas recombinantes como a formas aisladas de una fuente natural, asf como formas tanto lipidadas como no lipidadas.
Antecedentes de la invencion
La meningitis meningococica es una enfermedad devastadora que puede matar a ninos y jovenes adultos en un periodo de horas a pesar de la disponibilidad de antibioticos. Pizza y col., 2000, Science 287: 1816-1820. La meningitis se caracteriza como una inflamacion de las meninges que da como resultado una cefalea intensa, fiebre, perdida de apetito, intolerancia a la luz y al sonido, rigidez de los musculos, especialmente en el cuello, y en casos graves convulsiones, vomitos y delirios que conducen a la muerte. Los smtomas de la meningitis meningococica aparecen repentinamente y culminan en la septicemia meningococica con su erupcion hemorragica caractenstica. Un diagnostico rapido y tratamiento inmediato con grandes dosis de antibioticos son cnticos si se pretende que haya alguna probabilidad de supervivencia. 2000. Bantam Medical Dictionary, Tercera Edicion 302.
La meningitis meningococica esta provocada por Neisseria meningitidis (el meningococo), una bacteria capsulada que se ha clasificado en varios serogrupos patogenos incluyendo A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E. Las cepas de serogrupo B de N. meningitidis son una causa importante de la enfermedad meningococica en todo el mundo. Por ejemplo, se ha indicado en la bibliograffa medica que el serogrupo B es responsable de aproximadamente el 50 % de las meningitis bacterianas en bebes y ninos residentes en los Estados Unidos y Europa. No existe en la actualidad ninguna vacuna para evitar la enfermedad meningococica provocada por N. meningitidis Serogrupo B.
Desarrollar una composicion inmunogenica para la prevencion de la enfermedad meningococica del serogrupo B ha sido un reto para los investigadores desde el trabajo de Goldschneider y col. hace mas de 30 anos. Goldschneider y col., 1969, J. Exp. Med 129(6): 1307-26; Goldschneider y col, 1969, J. Exp. Med 129(6): 1327-48; Gotschlich y col., 1969, J. Exp. Med. 129(6): 1385-95; y Gotschlich y col., 1969, J. Exp. Med. 129(6): 1367-84. A diferencia de la enfermedad del serogrupo A, que practicamente ha desaparecido de Norteamerica despues de la II Guerra Mundial Achtman, M., 1995, Trends in Microbiology 3(5): 186-92, la enfermedad provocada por los organismos del serogrupo B y C sigue siendo endemica en gran parte del mundo economicamente desarrollado. La incidencia de la enfermedad vana de <1/100.000 cuando la enfermedad es poco habitual hasta 200/100.000 en poblaciones de alto riesgo durante epidemias.
Se han desarrollado vacunas basandose en conjugados de polisacaridos frente a N. meningitidis serogrupos Ay C y parecen ser eficaces en la prevencion de la enfermedad. En la actualidad, esta disponible una composicion inmunogenica compuesta de polisacarido capsular de los serogrupos A, C, Y, y W-135. Ambrosch y col., 1983, Immunogenicity and side-effects of a new tetravalent. Bulletin of the World Health Organization 61(2): 317-23. Sin embargo, esta composicion inmunogenica induce una respuesta inmunitaria independiente de linfocitos T, no es eficaz en ninos pequenos y no proporciona cobertura para cepas de serogrupo B, que provocan mas del 50 % de la enfermedad meningococica.
Otros han intentado tambien desarrollar composiciones inmunogenicas usando polisacaridos capsulares. Recientemente, se han licenciado para su uso en Europa composiciones inmunogenicas para enfermedad de serogrupo C preparadas conjugando el material capsular de serogrupo C con protemas. Sin embargo, la capsula del serogrupo B puede no ser adecuada como un candidato a vacuna porque el polisacarido de la capsula esta compuesto de acido polisialico que tiene similitud con restos de carbohidratos en tejidos neurales humanos en desarrollo. Este resto de azucar se reconoce como un autoantfgeno y es por lo tanto poco inmunogenico en seres humanos.
Se han desarrollado protemas de membrana (OMP) como antfgenos de vacuna alternativos para enfermedad de serogrupo B. La union de anticuerpo monoclonal con las dos regiones variables de PorA define el esquema de serosubtipacion para meningococos. Las protemas PorA actua por lo tanto como los antfgenos de serosubtipacion (Abdillahi y col., 1988, Microbial Pathogenesis 4(1): 27-32) para cepas meningococicas y se estan investigando activamente como componentes de una composicion inmunogenica del serogrupo B (Poolman, 1996, Adv. Exp.
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Med. Biol. 397: 73-7), ya que pueden inducir anticuerpos bactericidas (Saukkonen, 1987, Microbial Pathogenesis 3(4): 261-7). Se cree que los anticuerpos bactericidas son un indicador de proteccion y cualquier nueva composicion inmunogenica candidata debena inducir estos anticuerpos funcionales.
Los estudios en seres humanos asf como animales indican que el antigeno de serosubtipacion, PorA, induce anticuerpos bactericidas. Sin embargo, la respuesta inmunitaria a Por A es en general espedfica de serosubtipo. En particular, los datos de serosubtipacion indican que una composicion inmunogenica hecha de PorA puede requerir un PorA para cada serosubtipo para cubrir por dicha composicion inmunogenica, quizas hasta de seis a nueve. Por lo tanto, seran necesarios 6-9 PorA para cubrir el 70-80 % de las cepas de serogrupo B. Por lo tanto, la naturaleza variable de esta protema requiere una composicion de vacuna multivalente para proteger frente a un numero suficiente de aislados clmicos de serosubtipo meningococicos.
El desarrollo de una composicion inmunogenica para meningococos del serogrupo B ha sido tan difmil que recientemente varios grupos han secuenciado los genomas de cepas que representan ambos serogrupos A y B para ayudar a identificar nuevos candidatos a composiciones inmunogenicas. Tettelin, 2000, Science, 287(5459): 180915; Pizza y col., 2000, Science 287: 1816-1820. La identificacion de nuevos candidatos a composicion inmunogenica, incluso con el conocimiento del genoma de Neisseria, es un procedimiento diffcil para el que no existen en la actualidad algoritmos matematicos adecuados. De hecho, un informe reciente indica que a pesar de identificar cientos de fases abiertas de lectura (“ORF”) que contienen dominios transmembrana teoricos, los problemas con la expresion, purificacion e induccion de anticuerpos tensioactivos y funcionalmente activos han conducido a los investigadores a solamente siete candidatos para una composicion inmunogenica meningococica de serogrupo B. Vease misma referencia. Uno de estos se conoda previamente.
El documento WO01/64922 desvela la expresion heterologa de numerosas protemas de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Se desvela la secuencia de protema 741 (tambien denominada NMB1870) de la cepa MC58.
El documento WO01/64920 desvela la expresion heterologa de hnbridos de Neisseria meningitidis y Neisseria gonorrhoeae. Se desvela la secuencia de protema 741 (tambien denominada NMB1870) de la cepa MC58 e tnbridos de la misma.
El n° de referencia Q9JXV4 de la base de datos UniProt desvela la secuencia de protema hipotetica NMB1870 de la cepa MC58 de serogrupo B de N. meningitidis.
Martin D y col. (J Exp Med. 1997; 185(7):1173-83) desvela una protema de superficie, denominada NspA, con una masa molecular aproximada de 22.000 y evalua el potencial protector de la protema NspA recombinante en ratones.
En consecuencia, sigue existiendo la necesidad de composiciones inmunogenicas que (1) induzcan anticuerpos bactericidas para multiples cepas de Neisseria; (2) reaccionen con la superficie de multiples cepas; (3) confieran proteccion pasiva contra una exposicion en vivo; y/o (4) eviten la colonizacion.
Sumario de la invencion
Para cumplir estas y otras necesidades, y a la vista de sus fines, la presente divulgacion proporciona protemas ORF2086 de Neisseria (“protemas 2086”), incluyendo protemas de la Subfamilia A 2086 y protemas de la Subfamilia B 2086. Cada una de las protemas 2086 son protemas que pueden aislarse de cepas de Neisseria nativas, incluyendo cepas de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B, C, D, W-135, X, Y, Z y 29E), Neisseria gonorrhoeae, y Neisseria lactamica. Las protemas 2086 pueden prepararse tambien usando tecnologfa recombinante.
La presente invencion incluye composiciones, composiciones inmunogenicas y su uso en la prevencion, tratamiento de infeccion meningococica y, en particular, enfermedad meningococica provocada por N. meningitidis, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Las protemas 2086 del presente documento incluyen formas recombinantes y formas aisladas de una fuente natural, asf como formas tanto lipidadas como no lipidadas.
La presente invencion proporciona inesperada y provechosamente composiciones que (1) inducen anticuerpos bactericidas para multiples cepas de Neisseria, tales como cepas de N. meningitidis, N. gonorrhoeae y/o N. lactamica; (2) reaccionan con la superficie de multiples cepas; (3) confieren proteccion pasiva contra una exposicion en vivo; y/o (4) evitan la colonizacion, asf como procedimientos para usar dichas composiciones y procedimientos para preparar dichas composiciones. Se describen a continuacion diversas realizaciones de la invencion.
Breve descripcion de los dibujos
La FIG 1A representa un gel de SDS-PAGE que representa las dos protemas principales de las fracciones proteicas obtenidas de los experimentos para identificar extracto de protemas de membrana de Neisseria que es capaz de inducir anticuerpos bactericidas contra cepas heterologas.
La FIG. 1B representa los resultados de los experimentos de la identificacion de las dos protemas principales por analisis de componentes de Flujo Continuo TMAE por digestion por proteasa y secuenciacion N-terminal de fase
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inversa.
La FIG. 2 representa el esquema de purificacion y la homogeneidad como se determina por SDS-PAGE de rLP2086.
La FIG. 3 representa los resultados de los experimentos de la identificacion de las dos protemas principales y de una protema menor por analisis de componentes de Flujo Continuo TMAE por EM-LC/EM y el SDS-PAGE correspondiente.
La FIG. 4 es un gel de SDS-PAGE de la expresion recombinante de protema 2086.
La FIG. 5 es un diagrama esquematico del plasmido pPX7340, como se describe en los documento.
La FIG. 6 es un diagrama esquematico del plasmido pPX7328, como se describe en los documento.
La FIG. 7 es un diagrama esquematico del plasmido pPX7343, como se describe en los documento.
La FIG. 8 ilustra regiones N terminales del gen 2086 de diversas cepas.
La FIG. 9A es un diagrama de flujo que muestra las etapas preliminares en la identificacion de un componente inmunogenico en una cepa de Neisseria.
La FIG. 9B es un diagrama de flujo que muestra las etapas finales en la identificacion de un componente inmunogenico en una cepa de Neisseria.
La FIG. 10A es un diagrama esquematico del promotor inducible por arabinosa pBAD que conduce a la expresion de la protema de fusion ORF2086/senal P4 para expresar una forma lipidada de rP2086 como se describe en los ejemplos del presente documento.
La FIG. 10B es un diagrama esquematico del vector pET9a-T7 para expresion recombinante de la forma no lipidada de ORF2086.
La FIG. 11A es una fotograffa que representa lisados celulares completos de E. coli B que expresan la protema rLP2086.
La FIG. 11B es una fotograffa que representa lisados celulares completos de E. coli B que expresan la protema rP2086.
La FIG. 12 es un arbol filogenetico que muestra la organizacion de las subfamilias y grupos de protemas ORF2086.
La FIG. 13 es una ilustracion grafica de los datos de ELISA de celulas completas para los antisueros de Subfamilia A de rLP2086.
La FIG. 14 es una ilustracion grafica de datos de ELISA de celulas completas para los antisueros de Subfamilia B de rLP2086.
La FIG. 15 es una ilustracion grafica de los resultados del estudio de mezcla de rLP2086 - Tftulos de WCE.
La FIG. 16 es una ilustracion grafica de los resultados del estudio de mezcla de rLP2086/rPorA - Tftulos de WCE.
La FIG. 17 es una Transferencia de Western que muestra reactividad de antisueros de raton de rLP2086 para lisados celulares completos de N. meningitidis de Subfamilia B P2086.
La FIG. 18 es una Transferencia de Western que muestra reactividad de antisueros de raton de rLP2086 para lisados celulares completos de N. lactamica y N. meningitidis de Subfamilia A P2086.
Sumario de secuencias
SEC ID N° para secuencias estudiadas:
SEC ID N° 1: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L3 6275 cuando se combina con una secuencia ftder nativa.
ejemplos del presente ejemplos del presente ejemplos del presente
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SEC ID N° 4: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L3 6275 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 5: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L3 6275.
SEC ID N° 6: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L3 6275.
SEC ID N° 7: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC2369 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 8: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC2369 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 9: secuencia de acido nucleico para codificar la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de CDC2369 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 10: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC2369 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 11: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC2369.
SEC ID N° 12: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC2369.
SEC ID N° 13: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1034 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 14: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1034 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 15: secuencia de acido nucleico para codificar la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de CDC1034 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 16: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1034 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 17: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1034.
SEC ID N° 18: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1034.
SEC ID N° 19: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L4 891 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 20: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L4 891 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 21: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos de la protema 2086 madura de L4 891 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N°: 22: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L4 891 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 23: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L4 891.
SEC ID N° 24: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L4 891.
SEC ID N° 25: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa B16B6 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 26: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa B16B6 preparada usando una secuencia lfder nativa.
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SEC ID N° 29: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa B16B6.
SEC ID N° 30: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa B16B6.
SEC ID N° 31: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa W135 (ATCC35559) cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 32: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa W135 (ATCC35559) preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 33: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de W135 (ATCC35559) cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 34: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa W135 (ATCC35559) preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 35: secuencia de acido nucleico que codifica una secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa W135 (ATCC35559).
SEC ID N° 36: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa W135 (ATCC35559).
SEC ID N° 37: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa C11 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 38: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa C11 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 39: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de C11 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 40: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa C11 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 41: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa C11.
SEC ID N° 42: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa C11.
SEC ID N° 43: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa Y (ATCC35561) cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 44: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa Y (ATCC35561) preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 45: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa de Y (ATCC35561) cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 46: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa Y (ATCC35561) preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 47: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa de Y (ATCC35561).
SEC ID N° 48: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa Y (ATCC35561).
SEC ID N° 49: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250732 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 50: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250732 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 51: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa de M98 250732 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
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SEC ID N° 54: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250732.
SEC ID N° 55: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa de M98 250771 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 56: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250771 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 57: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de M98 250771 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 58: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250771 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 59: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa de M98 250771.
SEC ID N° 60: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250771.
SEC ID N° 61: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa de CDC1135 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 62: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 63: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de CDC1135 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 64: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1135 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 65: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa de CDC 1135.
SEC ID N° 66: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC 1135.
SEC ID N° 67: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa de M97 252153 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 68: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 69: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de M97 252153 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 70: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252153 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 71: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252153.
SEC ID N° 72: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252153.
SEC ID N° 73: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1610 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 74: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 75: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de CDC1610 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 76: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1610 preparada usando una secuencia lfder P4.
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SEC ID N° 79: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC 1492 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 80: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC 1492 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 81: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de CDC1492 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 82: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC 1492 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 83: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC 1492.
SEC ID N° 84: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC 1492.
SEC ID N° 85: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L8 M978 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 86: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 87: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de L8 M978 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 88: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L8 M978 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 89: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L8 M978.
SEC ID N° 90: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L8 M978.
SEC ID N° 91: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252988 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 92: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 93: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de M97 252988 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 94: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252988 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 95: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252988.
SEC ID N° 96: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252988.
SEC ID N° 97: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252697 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 98: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252697 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 99: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de M97 252697 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 100: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252697 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 101: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252697.
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SEC ID N° 104: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 105: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de 6557 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 106: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 6557 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 107: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 6557.
SEC ID N° 108: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 6557.
SEC ID N° 109: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 2996 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 110: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 2996 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 111: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de 2996 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 112: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 2996 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 113: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 2996.
SEC ID N° 114: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 2996.
SEC ID N° 115: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252976 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 116: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252976 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 117: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos de la protema 2086 madura de M97 252976 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N°: 118: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252976 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 119: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252976.
SEC ID N° 120: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252976.
SEC ID N° 121: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 251854 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 122: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 251854 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 123: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de M97 251854 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 124: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 251854 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 125: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 251854.
SEC ID N° 126: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 251854.
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SEC ID N° 129: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de CDC1521 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 130: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1521 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 131: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1521.
SEC ID N°: 132: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1521.
SEC ID N° 133: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250622 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 134: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 135: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de M98 250622 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 136: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250622 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 137: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250622.
SEC ID N° 138: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250622.
SEC ID N° 139: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870446 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 140: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 141: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de 870446 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 142: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870446 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 143: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870446.
SEC ID N° 144: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870446.
SEC ID N° 145: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 253248 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 146: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 147: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de M97 253248 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 148: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 253248 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 149: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 253248.
SEC ID N° 150: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 253248.
SEC ID N° 151: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250809 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
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SEC ID N° 154: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250809 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 155: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250809.
SEC ID N° 156: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250809.
SEC ID N° 157: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L5 M981 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 158: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 159: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de L5 M981 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 160: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L5 M981 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 161: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L5 M981.
SEC ID N° 162: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa L5 M981.
SEC ID N° 163: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa NMB cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 164: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 165: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de NMB cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 166: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa NMB preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 167: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa NMB.
SEC ID N° 168: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa NMB.
SEC ID N° 169: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250572 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 170: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 171: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de M98 250572 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 172: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250572 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 173: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250572.
SEC ID N° 174: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250572.
SEC ID N° 175: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 176: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 preparada usando una secuencia lfder nativa.
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SEC ID N° 177: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 cuando se combina con una secuencia Ifder P4.
SEC ID N° 178: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 179: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830.
SEC ID N° 180: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa A4 Sanford; M97 251836 PARTE; M97 251957; M97 251985; M97 252060; M97 251870; M97 251994; M98 250024; M97 251905; M97 251876; M97 251898; o M97 251830.
SEC ID N° 181: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos parcial para la protema 2086 madura de la cepa CDC937 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 182: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC937 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 183: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos parcial para la protema 2086 madura de CDC937 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 184: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC937 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 185: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos parcial para la protema 2086 madura de la cepa CDC937.
SEC ID N° 186: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC937.
SEC ID N° 187: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos parcial para la protema 2086 madura de la cepa M97 252097 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 188: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252097 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 189: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos parcial para la protema 2086 madura de M97 252097 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 190: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252097 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 191: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos parcial para la protema 2086 madura de la cepa M97 252097.
SEC ID N° 192: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M97 252097.
SEC ID N° 193: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870227 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 194: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 195: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de 870227 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 196: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870227 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 197: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870227.
SEC ID N° 198: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 870227.
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SEC ID N° 200: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa H355 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 201: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de H355 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 202: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa H355 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 203: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa H355.
SEC ID N° 204: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa H355.
SEC ID N° 205: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa H44_76 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 206: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa H44_76 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 207: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa H44_76 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 208: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa H44_76.
SEC ID N° 209: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de H44_76 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N°: 210: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 de la cepa H44_76.
SEC ID N° 211: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086
madura de la cepa 8529 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 212: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 8529 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 213: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de 8529 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 214: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 8529 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 215: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 8529.
SEC ID N°: 216: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 8529.
SEC ID N° 217: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086
madura de la cepa 6940 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 218: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 6940 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 219: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de 6940 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 220: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 6940 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 221: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 6940.
SEC ID N° 222: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 6940.
SEC ID N° 223: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M982 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
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10
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SEC ID N° 226: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M982 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 227: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M982.
SEC ID N° 228: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M982.
SEC ID N° 229: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 880049 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 230: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 880049 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 231: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de 880049 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 232: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 880049 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 233: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 880049.
SEC ID N° 234: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa 880049.
SEC ID N° 235: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 236: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 237: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 238: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 239: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926.
SEC ID N° 240: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de las cepas M97 253524, M97 251885 y M97 251926.
SEC ID N° 241: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250670 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 242: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250670 preparada usando una secuencia lfder nativa.
SEC ID N° 243: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de M98 250670 cuando se combina con una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 244: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250670 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 245: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250670.
SEC ID N° 246: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa M98 250670.
SEC ID N° 247: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1573 cuando se combina con una secuencia lfder nativa.
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SEC ID N° 250: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1573 preparada usando una secuencia lfder P4.
SEC ID N° 251: secuencia de acido nucleico que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC 1573.
SEC ID N° 252: secuencia de aminoacidos para la protema 2086 madura de la cepa CDC1573.
SEC ID N° 253: secuencia de acido nucleico parcial que codifica la secuencia de aminoacidos para la protema 2086 de una cepa de Neisseria lactamica.
SEC ID N° 254 a 259: secuencias de aminoacidos asociadas con las protemas de la familia de protemas 2086.
SEC ID N° 260 a 278: secuencias de aminoacidos asociadas con las protemas de la Subfamilia A de 2086.
SEC ID N° 279 a 299: secuencias de aminoacidos asociadas con las protemas de la Subfamilia B de 2086.
SEC ID N° 300: es la secuencia consenso de aminoacidos correspondiente a la familia de protemas 2086
(“protemas 2086”) de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
SEC ID N° 301: es la secuencia consenso de aminoacidos correspondiente a la Subfamilia A de protemas 2086 de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
SEC ID N° 302: es la secuencia consenso de aminoacidos correspondiente a la Subfamilia B de protemas 2086 de acuerdo con una realizacion de la presente invencion.
SEC ID N° 303: secuencia de acido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restriccion BamHI (Compuesto N° 4623).
SEC ID N° 304: secuencia de acido nucleico para un cebador directo con un sitio de restriccion NdeI (Compuesto N° 4624).
SEC ID N° 305: secuencia de acido nucleico para un cebador directo (Compuesto N° 4625).
SEC ID N° 306: secuencia de acido nucleico para un cebador directo (Compuesto N° 5005).
SEC ID N° 307: secuencia de acido nucleico para un cebador inverso (Compuesto N° 5007).
SEC ID N° 308: secuencia de acido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restriccion BglII (Compuesto N° 5135).
SEC ID N° 309: secuencia de acido nucleico para un cebador directo con un sitio de restriccion BamHI (Compuesto N° 5658).
SEC ID N° 310: secuencia de acido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restriccion SphI (Compuesto N° 5660).
SEC ID N° 311: secuencia de acido nucleico para un cebador directo con un sitio de restriccion BamHI (Compuesto N° 6385).
SEC N° 312: secuencia de acido nucleico para un cebador directo con sitios de restriccion BamHI y NdeI (Compuesto N° 6406).
SEC ID N° 313: secuencia de acido nucleico para un cebador directo (Compuesto N° 6470).
SEC ID N° 314: secuencia de acido nucleico para un cebador inverso (Compuesto N° 6472).
SEC ID N° 315: secuencia de acido nucleico para un cebador directo con un sitio de restriccion BamHI (Compuesto N° 6473).
SEC ID N° 316: secuencia de acido nucleico para un cebador directo con sitios de restriccion BglII y NdeI (Compuesto N° 6474).
SEC ID N° 317: secuencia de acido nucleico para un cebador directo (Compuesto N° 6495).
SEC ID N° 318: secuencia de acido nucleico para un cebador inverso (Compuesto N° 6496).
SEC ID N° 319: secuencia de acido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restriccion SphI
(Compuesto N° 6543).
SEC ID N° 320: secuencia de acido nucleico para un cebador inverso con un sitio de restriccion BglII (Compuesto
N° 6605).
SEC ID N° 321: secuencia de acido nucleico para un cebador directo con sitios de restriccion BglII y Ndel 5 (Compuesto N° 6721).
SEC ID N° 322: secuencia de acido nucleico para la secuencia Ifder P4.
SEC ID N° 323: secuencia de acido nucleico para la variante de lfder 2086 nativa 1.
SEC ID N° 324: secuencia de acido nucleico para la variante de lfder 2086 nativa 2.
SEC ID N° 325: secuencia de acido nucleico para la variante de lfder 2086 nativa 3.
10 SEC ID N° 326: secuencia de acido nucleico para la variante de lfder 2086 nativa 4.
SEC ID N° 327: es la secuencia de aminoacidos de P4431.
SEC ID N° 328: es la secuencia de aminoacidos de P5136.
SEC ID N° 329: es una secuencia de aminoacidos de acuerdo con una realizacion de la presente invencion. Descripcion detallada de la invencion
15 Una nueva clase de antigenos con actividad bactericida con funcionalidad cruzada con el serogrupo B de Neisseria meningitidis evitana la necesidad de un enfoque de PorA multivalente para la inmunizacion contra la infeccion. Dicho antigeno se ha identificado inesperadamente y se describe y reivindica en el presente documento. La presencia de dicho antigeno se observo por primera vez en una mezcla compleja de protemas de membrana externa solubles (sOMP) de una cepa meningococica. La actividad bactericida de este antigeno se siguio mediante una serie de 20 etapas de fraccionamiento y purificacion de protemas hasta que la mezcla de protemas de interes contema solamente algunas protemas. Las protemas principales de esta mezcla se identificaron por secuenciacion de aminoacidos N terminal y mapeo de peptidos. La protema de interes que mostraba actividad bactericida se identifico como protema ORF2086, una protema lipidada (tambien denominada mas espedficamente LP2086). La “protema ORF2086” se refiere a una protema codificada por la fase abierta lectura 2086 (ORF2086) de una especie de 25 Neisseria.
Como se describe en el presente documento, se han identificado nuevos candidatos a composicion inmunogenica basandose en la protema ORF2086 de una especie de Neisseria (tambien denominada “protema 2086” o protema “ORF2086” usados de forma intercambiable en el presente documento, o P2086 para las protemas no lipidadas y LP2086 para version lipidada de las protemas) aisladas de N. meningitidis combinando fraccionamiento celular, la 30 extraccion de detergente diferencial, la purificacion de protemas con la preparacion de antisueros, y un ensayo de actividad bactericida utilizando multiples cepas. Como alternativa a las composiciones inmunogenicas potenciales y diagnosticos desvelados en las referencias citadas anteriormente, la presente divulgacion se refiere a composiciones y procedimientos para tratar y/o prevenir la infeccion meningococica mediante el uso de protemas, partes inmunogenicas de las mismas y equivalentes biologicos de las mismas, asf como genes que codifican dichos 35 polipeptidos, partes equivalentes, anticuerpos que se unen inmunoespedficamente a las mismas.
De acuerdo con la presente divulgacion, se identificaron inesperadamente agentes inmunogenicos basados en una protema 2086, incluyendo polipeptidos aislados, partes inmunogenicas de los mismos y/o equivalentes biologicos de los mismos como candidatos inmunogenicos basandose en la capacidad de dichos agentes para mostrar reactividad cruzada o ausencia de especificidad de cepa. En particular, se identificaron candidatos que demostraron 40 inesperadamente la capacidad de (1) inducir anticuerpos bactericidas para multiples cepas de Neisseria y/o gonococicas; (2) reaccionar con la superficie de multiples cepas; (3) conferir proteccion pasiva contra una exposicion en vivo; y/o (4) evitar la colonizacion. En consecuencia, la presente divulgacion proporciona composiciones inmunogenicas que comprenden dichos agentes inmunogenicos, incluyendo polipeptidos aislados, partes inmunogenicas de los mismos y/o equivalentes biologicos de los mismos, asf como procedimientos para usarlos 45 contra la infeccion por N. meningitidis. (Vease, Ejemplo 1 en el presente documento para la metodologfa usada en la identificacion de la protema 2086).
Como se usa en el presente documento, la expresion “no espedfico de cepa” se refiere a la caractenstica de un antfgeno para inducir una respuesta inmunitaria eficaz contra mas de una cepa de N. meningitidis, (por ejemplo, cepas meningococicas heterologas). La expresion de “reactividad cruzada” como se usa en el presente documento 50 se usa de forma intercambiable con la expresion “no espedfico de cepa”. La expresion “antigeno de N. meningitidis no espedfico de cepa inmunogenico” como se usa en el presente documento, describe un antfgeno que puede aislarse de N. meningitidis, aunque tambien puede aislarse de otra bacteria (por ejemplo, otras cepas de Neisseria, tales como cepas gonococicas, por ejemplo), o prepararse usando tecnologfa recombinante.
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Las protemas 2086 de la presente invencion incluyen protemas lipidadas y no lipidadas. Ademas, la presente divulgacion tambien contempla del uso de las protemas inmaduras o preprotemas que corresponden a cada protema como compuestos/composiciones intermedios.
La presente divulgacion tambien proporciona anticuerpos que se unen de forma inmunoespedfica a los agentes inmunogenicos anteriores, de acuerdo con implementaciones de la divulgacion. Adicionalmente, la presente invencion proporciona composiciones y/o composiciones inmunogenicas y su uso en la prevencion, el tratamiento de meningitis meningococica, en particular enfermedad meningococica de serogrupo B, como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Se ha mostrado que las composiciones de la presente invencion son altamente inmunogenicas y capaces de inducir la produccion de anticuerpos bactericidas. Estos anticuerpos tienen reactividad cruzada para las cepas menigococicas heterologas de serogrupo, serotipo y serosubtipo. En consecuencia, las presentes composiciones superan las deficiencias de intentos de vacuna de N. meningitidis anteriores mostrando la capacidad para inducir anticuerpos bactericidas a cepas de Neisseria heterologas. Por lo tanto, entre otras ventajas, la presente invencion proporciona composiciones inmunogenicas que pueden componerse con menos componentes para inducir proteccion comparable a agentes previamente usados. Las composiciones o agentes inmunogenicos de las mismas (por ejemplo, polipeptidos, partes inmunogenicas o fragmentos y equivalentes biologicos) pueden usarse solos o en combinacion con otros antfgenos o agentes para inducir proteccion inmunologica de infeccion meningococica y enfermedad, asf como para inducir proteccion inmunologica de infeccion y/o enfermedad provocada por otros patogenos. Esto simplifica el diseno de una composicion inmunogenica para su uso contra infeccion meningococica reduciendo el numero de antfgenos requeridos para proteccion contra multiples cepas. De hecho, la protema 2086 purificada reducira drastica e inesperadamente el numero de protemas requeridas para proporcionar una cobertura inmunogenica adecuada de las cepas responsables de la enfermedad meningococica. La protema 2086 puede expresarse de forma recombinante en E. coli como una lipoprotema, que es la forma de tipo silvestre de la protema, a niveles mucho mayores que en los meningococos nativos.
Debido a que se descubrio que los anticuerpos dirigidos contra la protema 2086 de una unica cepa destrrnan cepas no relacionadas (es decir, heterologas), se realizo un intento de caracterizar un gran numero de cepas heterologas con respecto a la presencia de un “homologo de 2086” y determinar el nivel de conservacion de secuencia. Aunque aproximadamente el 70 % de las cepas ensayadas por PCR tuvieron homologos de 2086 que podnan amplificarse usando los cebadores que amplificaron el gen de 2086 original de la cepa 8529, el aproximadamente 30 % restante fueron negativas por este ensayo. Se descubrio que este aproximadamente 30 % restante contema un homologo de 2086 que terna solamente aproximadamente el 60 % de homologfa de secuencia de aminoacidos con el gen de 2086 derivado de 8529 original. Se identificaron otros cebadores que podnan amplificar un homologo de 2086 de este aproximadamente 30 % de cepas. Se han designado las cepas N. meningitidis ensayadas como pertenecientes a la Subfamilia A o Subfamilia B dependiendo de que conjunto de cebadores pueda amplificar un homologo de 2086. Los detalles de estos experimentos se resumen en el Ejemplo 5 posterior.
La presencia de una protema 2086 en numerosos serosubtipos
Para determinar el nivel de conservacion de secuencia del gen 2086 entre cepas de N. meningitidis, se han clonado varios representantes de Subfamilias A y B como genes de longitud completa y se han presentado para analisis de secuencia de ADN. Usando cebadores como se desvela en el presente documento, vease, por ejemplo, Tabla IV, se han identificado veinticuatro cuatro cepas menigococicas del serogrupo B que expresan antfgenos de diferentes serosubtipos y tambien expresan una protema compartida, P2086. Se proporcionan ejemplos de estas secuencias en el presente documento y se muestran como secuencias de ADN maduras (es decir, se han escindido todas las secuencias senal de lipoprotema en el resto de cistema). Vease, por ejemplo, las secuencias de aminoacidos de las SEC ID N°: 2-252 pares, sin limitacion.
Aunque la protema 2086 no esta presente en grandes cantidades en cepas de tipo de silvestre, es una diana para anticuerpos bactericidas. Estos anticuerpos, a diferencia de los producidos en respuesta a las PorA, son capaces de destruir cepas que expresan serosubtipos heterologos.
Los anticuerpos para la protema 2086 tambien protegen de forma pasiva a cnas de rata de la exposicion a meningococos (vease Tabla VII). La expresion recombinante de la protema 2086 permite el uso de la protema 2086 como una composicion inmunogenica para la prevencion de la enfermedad meningococica. Todos los candidatos a composicion inmunogenica meningococica recientes en ensayos clmicos han sido mezclas complejas o preparaciones de protema de membrana externa que conteman muchas protemas diferentes. La protema PorA, que proporciona especificidad de serosubtipo, requerira la inclusion de 6 a 9 variantes en una composicion inmunogenica para proporcionar aproximadamente 70-80 % de cobertura de serosubtipos relacionados con enfermedad. Por el contrario, se ha demostrado claramente en el presente documento que los antisueros para una unica protema 2086 sola son capaces de destruir representativos de seis serosubtipos responsables de aproximadamente el 65 % de los aislados de enfermedad en Europa occidental y los Estados Unidos. Por lo tanto, la protema 2086 purificada tiene el potencial de reducir el numero de protemas requeridas para proporcionar una cobertura de composicion inmunogenica adecuada de los serosubtipos responsables de la enfermedad meningococica.
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Protemas, partes inmunogenicas y equivalentes biologicos
Las protemas 2086 proporcionadas por la presente invencion son protemas aisladas. El termino “aislado” significa alterado por la mando del hombre del estado natural. Si una composicion o sustancia “aislada” aparece en la naturaleza, se ha cambiado o retirado de su ambiente original, o ambas. Por ejemplo, un polipeptido o un polinucleotido presente de forma natural en un animal vivo no esta “aislado”, pero el mismo polipeptido o polinucleotido separado de los materiales coexistentes de su estado natural esta “aislado”, como se emplea el termino en el presente documento. En consecuencia, como se usa en el presente documento, la expresion “protema aislada” abarca protemas aisladas de una fuerte natural y protemas preparadas usando tecnologfa recombinante, asf como dichas protemas cuando se combinan con otros antigenos y/o aditivos, tales como vehmulos, tampones, adyuvantes, etc. farmaceuticamente aceptables, por ejemplo.
Una protema 2086, parte inmunogenica de la misma y/o un equivalente biologico de la misma, desvelada en el presente documento comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoacidos:
ADIGxGLADA (SEC ID N°: 254), en la que x es cualquier aminoacido;
IGxGLADALT (SEC ID N°: 255), en la que x es cualquier aminoacido;
SLNTGKLKND (SEC ID N°: 256);
SLNTGKLKNDKxSRFDF (SEC ID N°: 257, en la que x es cualquier aminoacido);
SGEFQxYKQ (SEC ID N°: 258), en la que x es cualquier aminoacido; o
IEHLKxPE (SEC ID N°: 259), en la que x es cualquier aminoacido.
Una protema de Subfamilia A de 2086, parte inmunogenica de la misma y/o un equivalente biologico de la misma, comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoacidos, desveladas en el presente documento:
GGGVAADIGx (SEC ID N°: 260), en la que x es cualquier aminoacido;
SGEFQIYKQ (SEC ID N°: 261);
HSAVVALQIE (SEC ID N°: 262);
EKINNPDKID (SEC ID N°: 263);
SLINQRSFLV (SEC ID N°: 264);
SGLGGEHTAF (SEC ID N°: 265);
GEHTAFNQLP (SEC ID N°: 266);
SFLVSGLGGEH (SEC ID N°: 267);
EKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLP (SEC ID N°: 268);
GKAEYHGKAF (SEC ID N°: 269);
YHGKAFSSDD (SEC ID N°: 270);
GKAEYHGKAFSSDD (SEC ID N°: 271);
IEHLKTPEQN (SEC ID N°: 272);
KTPEQNVELA (SEC ID N°: 273);
IEHLKTPEQNVELA (SEC ID N°: 274);
AELKADEKSH (SEC ID N°: 275);
AVILGDTRYG (SEC ID N°: 276);
AELKADEKSHAVILGDTRYG (SEC ID N°: 277); o EEKGTYHLAL (SEC ID N°: 278).
Una protema de Subfamilia B de 2086, parte inmunogenica de la misma y/o equivalente biologico de la misma, comprende cualquiera de las siguientes secuencias de aminoacidos, desveladas en el presente documento:
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LITLESGEFQ (SEC ID N°: 279);
SALTALQTEQ (SEC ID N°: 280);
FQVYKQSHSA (SEC ID N°: 281);
LITLESGEFQVYKQSHSALTALQTEQ (SEC ID N°: 282);
IGDIAGEHTS (SEC ID N°: 283);
EHTSFDKLPK (SEC ID N°: 284);
IGDIAGEHTSFDKLPK (SEC ID N°: 285);
ATYRGTAFGS (SEC ID N°: 286);
DDAGGKLTYT (SEC ID N°: 287);
IDFAAKQGHG (SEC ID N°: 288);
KIEHLKSPEL (SEC ID N°: 289);
ATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNV (SEC ID N°: 290);
HAVISGSVLY (SEC ID N°: 291);
KGSYSLGIFG (SEC ID N°: 292);
VLYNQDEKGS (SEC ID N°: 293);
HAVISGSVLYNQDEKGSYSLGIFG (SEC ID N°: 294);
AQEVAGSAEV (SEC ID N°: 295);
IHHIGLAAKQ (SEC ID N°: 296);
VETANGIHHI (SEC ID N°: 297);
AQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEC ID N°: 298); o VAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ (SEC ID N°: 299).
La protema 2086 comprende la siguiente secuencia consenso y/o partes inmunogenicas de la misma desveladas en el presente documento.
Secuencia Consenso de Protema 2086 (SEC ID N°: 300):
CSSG-----GGGVxADIGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGA
EKTxxxGD—SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGxxITLxSGEFQxYKQxHSAxx ALQxExxxxxxxxxxxxxxRxFxxxxxxGEHTxFxxLPxx-xAxYxGxAFxSDDxxGxLxYx IDFxxKQGxGxIEHLKxPExNVxLAxxxxKxDEKxHAVIxGxxxYxxxEKGxYxLxxx GxxAQExAGxAxVxxxxxxHxIxxAxKQ
En la secuencia consenso anterior, la “x” representa cualquier aminoacido, la region de la posicion del aminoacido 5 a la posicion de aminoacido 9 es cualquiera de 0 a 5 aminoacidos, la region de la posicion de aminoacido 67 a la posicion de aminoacido 69 es cualquiera de 0 a 3 aminoacidos, y la posicion del aminoacido 156 es cualquiera de 0 a 1 aminoacidos. La region de la posicion del aminoacido 5 a la posicion de aminoacido 9 preferentemente comprende 0, 4 o 5 aminoacidos. La region de la posicion de aminoacido 67 a la posicion de aminoacido 69 preferentemente comprende 0 o 3 aminoacidos. Debena observarse particularmente que esta secuencia consenso ilustra la alta variabilidad de las protemas 2086. Como teona, sin pretender quedado ligado a la misma, se cree que esta alta variabilidad proporciona la reactividad cruzada ventajosa e inesperada.
De acuerdo con una implementacion de la presente invencion, las protemas 2086 se caracterizan como inmunogenicas, no patogenas y no espedficas de cepa. Estas protemas muestran inesperadamente inmunogenicidad mientras que son de aproximadamente el 2 % a aproximadamente el 40 % no conservadas.
Como se usa en el presente documento, la expresion “no conservada” se refiere al numero de aminoacidos que pueden experimentar inserciones, sustituciones y/o deleciones como un porcentaje del numero total de aminoacidos en una protema. Por ejemplo, si una protema es 40 % no conservada y tiene, por ejemplo, 263 aminoacidos, entonces hay 105 posiciones de aminoacidos en la protema en las que los aminoacidos pueden experimentar 5 sustitucion. De forma similar, si la protema es 10 % no conservada y tiene, por ejemplo, aproximadamente 280 aminoacidos, entonces hay 28 posiciones de aminoacidos en las que los aminoacidos pueden experimentar sustitucion. Las protemas 2086 tambien pueden experimentar delecion de restos de aminoacidos sin comprometer la inmunogenicidad de las protemas.
Ademas, las protemas 2086 pueden dividirse en subfamilias basandose en la homologfa en diversas regiones. Por 10 ejemplo, sin pretender quedar ligada a lo mismo, las secuencias consenso para dichas dos subfamilias, Subfamilia A y Subfamilia B, se proporcionan a continuacion:
Secuencia de Subfamilia A de 2086 (SEC ID 301)
CSSG—GGGVAADTGxGLADALTxPxDxKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQGA EKTxxxGD—SLNTGKLKNDKxSRFDFxxxIxVDGQxITLxSGEFQIYKQxHSAVV ALQffiKINNPDKTOSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPxGKAEYHGKAFSSDDx xGxLxYxIDFxxKQGxGxffiHLKTPEQNVELAxAELKADEKSHAVILGDTRYGxE EKGTYHLALxGDRAQEIAGxATVKIxEKVHEIxIAxKQ
La referencia “x” es cualquier aminoacido.
15 La region de la posicion de aminoacido 5 a la posicion de aminoacido 8 es cualquiera de 0 a 4 aminoacidos.
La region de la posicion de aminoacido 66 a la posicion de aminoacido 68 es cualquiera de 0 a 3 aminoacidos.
La region de la posicion de aminoacido 5 a la posicion de aminoacido 8 preferentemente comprende 0 o 4 aminoacidos. La region de la posicion de aminoacido 66 a la posicion de aminoacido 68 preferentemente comprende 0 o 3 aminoacidos.
20 Subfamilia B de 2086 (SEC ID 302)
CSSGGGG-—VxADIGxGLADALTAPLDHKDKxLxSLTLxxSxxxNxxLxLxAQ
GAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGxLITLESGEFQVYKQSHS
ALTALQTEQxQDxExSxKMVAKRxFxIGDIAGEHTSFDKLPKxxxATYRGTAFGS
DDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKSPELNVxLAxxYIKPDEKxHAVISGSVL
YNQDEKGSYSLGIFGxxAQEVAGSAEVETANGIHHIGLAAKQ
La referencia “x” es cualquier aminoacido.
La region de la posicion de aminoacido 8 a la posicion de aminoacido 12 es cualquiera de 0 a 5 aminoacidos.
La region de la posicion de aminoacido 8 a la posicion de aminoacido 12 preferentemente comprende 0 o 5 25 aminoacidos.
De acuerdo con implementaciones de la presente invencion, las subfamilias de protema 2086 pueden subdividirse adicionalmente en grupos. Por ejemplo, se desvelan los siguientes grupos en el presente documento: SEC ID N°: 212 de numeros pares; SEC ID N°: 14-24 de numeros pares; SEC ID N°: 26-42 de numeros pares; SEC ID N°: 50-60; SEC ID N°: 62-108 de numeros pares; SEC ID N°: 110-138 de numeros pares; SEC ID N°: 140-156 de numeros 30 pares; SEC ID N°: 158-174 de numeros pares; y SEC ID N°: 224-252 de numeros pares.
Una secuencia polipeptidica de la invencion puede ser identica a la secuencia de referencia de las SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198 de numeros pares es decir, 100 % identica, o puede incluir varias alteraciones de aminoacidos en comparacion con la secuencia de referencia de modo que el % de identidad sea menor del 100 %. Dichas alteraciones incluyen al menos una delecion, sustitucion, incluyendo sustitucion conservativa y no 35 conservativa, o insercion de aminoacido. Las alteraciones pueden suceder en las posiciones amino o carboxilo- terminal de la secuencia polipeptidica de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoacidos en la secuencia de aminoacidos de referencia o en uno o mas
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grupos contiguos dentro de la secuencia de aminoacidos de referencia.
Por lo tanto, la invencion tambien proporciona protemas que tienen identidad de secuencia con las secuencias de aminoacidos contenidas en la Lista de Secuencia (es decir, SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198 de numeros pares). Dependiendo de la secuencia particular, el grado de identidad de secuencia es preferentemente mayor del 99 % (por ejemplo, 99 %, 99,9 % o mas). Estas protemas homologas incluyen mutantes y variantes alelicas.
En realizaciones preferidas de la invencion, las protemas 2086 u otros polipeptidos 2086 (por ejemplo, partes inmunologicas y equivalentes biologicos como se define en las reivindicaciones adjuntas) generan anticuerpos bactericidas para cepas homologas y al menos una heterologa de meningococos. Espedficamente, los anticuerpos para los polipeptidos 2086 protegen de forma pasiva las cnas de rata de la exposicion, tal como intranasal, a meningococos. En realizaciones preferidas adicionales, los polipeptidos 2086 muestran dicha proteccion para cnas de rata para cepas homologas y al menos una cepa heterologa. El polipeptido puede seleccionarse del Sumario de Secuencia anterior, como se expone en las SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198 de numeros pares, o el polipeptido puede ser cualquier fragmento inmunologico o equivalente biologico de los polipeptidos enumerados. Preferentemente, el polipeptido se selecciona de cualquiera de las SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198 de numeros pares en el Sumario de Secuencias anterior.
Tambien se desvelan en el presente documento variantes alelicas u otras de los polipeptidos 2086 que son equivalentes biologicos. Los equivalentes biologicos desvelados en el presente documento mostraran la capacidad para (1) inducir anticuerpos bactericidas para cepas homologas y al menos una cepa heterologa de Neisseria y/o cepa gonococica; (2) reaccionar con la superficie de cepas homologas y al menos una cepa de Neisseria y/o gonococica heterologa; (3) conferir proteccion pasiva contra una exposicion en vivo; y/o (4) evitar la colonizacion.
Los equivalentes biologicos desvelados en el presente documento tienen al menos aproximadamente 60 %, preferentemente al menos aproximadamente 70 %, mas preferentemente al menos aproximadamente 75 %, aun mas preferentemente aproximadamente 85 %, aun mas preferentemente aproximadamente 85 %, aun mas preferentemente aproximadamente 90 %, aun mas preferentemente 95 % o aun mas preferentemente 98 %, o aun mas preferentemente 99 % de similitud con uno de los polipeptidos 2086 especificados en el presente documento (es decir, las SEC ID N°: 2-252 de numeros pares), a condicion de que el equivalente sea capaz de inducir sustancialmente las mismas propiedades inmunogenicas que una de las protemas 2086 de la presente invencion.
Como alternativa, los equivalentes biologicos desvelados en el presente documento tienen sustancialmente las mismas propiedades inmunogenicas de una de las protemas 2086 en las SEC ID N°: 2-252 de numeros pares. De acuerdo con realizaciones de la presente invencion, los equivalentes biologicos tienen las mismas propiedades inmunogenicas que las SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198 de numeros pares.
Los equivalentes biologicos desvelados en el presente documento se obtienen generando variantes y modificaciones de las protemas de la presente invencion. Estas variantes y modificaciones de las protemas se obtienen alterando las secuencias de aminoacidos por insercion, delecion o sustitucion de uno o mas aminoacidos. La secuencia de aminoacidos se modifica, por ejemplo, sustituyendo para crear un polipeptido que tenga sustancialmente las mismas cualidades o cualidades mejoradas. Un medio preferido para introducir alteraciones comprende realizar mutaciones predeterminadas de la secuencia de acido nucleico del polipeptido por mutagenesis dirigida.
Pueden realizarse modificaciones y cambios en la estructura de un polipeptido de la presente invencion y aun obtener una molecula que tenga inmunogenicidad de N. meningitidis. Por ejemplo, sin limitacion, ciertos aminoacidos pueden sustituir a otros aminoacidos, incluyendo sustitucion no conservada y conservada, en una secuencia sin perdida apreciable de inmunogenicidad. Debido a que es la capacidad interactiva y naturaleza de un polipeptido lo que define la actividad funcional biologica de ese polipeptido, pueden realizarse varias sustituciones de secuencia de aminoacidos en una secuencia polipeptfdica (o, por supuesto, su secuencia codificante de ADN subyacente) y no obstante obtener un polipeptido con propiedades similares. La presente invencion como se define en las reivindicaciones adjuntas, contempla cualquier cambio a la estructura de los polipeptidos del presente documento, asf como la secuencias de acido nucleico que codifican dichos polipeptidos, en los que el polipeptido conserva la inmunogenicidad. Un experto habitual en la materia sena capaz facilmente de modificar los polipeptidos y polinucleotidos desvelados en consecuencia, basandose en las directrices proporcionadas en el presente documento.
Por ejemplo, se han identificado ciertas regiones variables en las que es permisible la sustitucion o delecion. La secuencia consenso de 2086, como se ha analizado previamente, muestra regiones conservadas y no conservadas de la familia de protemas 2086 de acuerdo con una implementacion de la presente invencion.
En la realizacion de dichos cambios, puede utilizarse cualquier tecnica conocida por los expertos en la materia. Por ejemplo, sin pretender limitarse a lo mismo, puede considerarse el mdice hidropatico de los aminoacidos. La importancia del mdice hidropatico de los aminoacidos para conferir funcion biologica interactiva a un polipeptido se entiende en general en la tecnica. Kyte y col. 1982. J. Mol. Bio. 157:105-132.
Tambien puede realizarse sustitucion de aminoacidos similares basandose en la hidrofilia, particularmente cuando se pretende usar el polipeptido o peptido equivalente funcional biologico creado de este modo en realizaciones
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inmunologicas: la Patente de Estados Unidos N° 4.554.101, indica que el mayor promedio local de hidrofilia de un polipeptido, como se gobierna por la hidrofilia de sus aminoacidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad, es decir, con una propiedad biologica del polipeptido.
Tambien pueden prepararse equivalentes biologicos de un polipeptido usando mutagenesis espedfica. La mutagenesis espedfica es una tecnica util en la preparacion de polipeptidos de segunda generacion, o polipeptidos o peptidos equivalentes biologicamente funcionales, derivados de las secuencias de los mismos, mediante mutagenesis espedfica del ADN subyacente. Dichos cambios pueden ser deseables cuando sean deseables sustituciones de aminoacidos. La tecnica proporciona ademas una capacidad sencilla para preparar y ensayar variantes de secuencia, por ejemplo, incorporando una o mas de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o mas cambios de secuencia de nucleotidos en el ADN. La mutagenesis espedfica permite la produccion de mutantes mediante el uso de secuencias oligonucleotfdicas espedficas que codifican la secuencia de ADN de la mutacion deseada, asf como un numero suficiente de nucleotidos adyacentes, para proporcionar una secuencia de cebadores de suficiente tamano y complejidad de secuencia para formar una doble cadena estable en ambos lados del punto de union de delecion que se atraviesa. Tfpicamente, se prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleotidos de longitud, con de aproximadamente 5 a 10 restos en ambos lados del punto de union de la secuencia que se altera.
En general, la tecnica de mutagenesis espedfica se conoce bien en este campo. Como se apreciara, la tecnica emplea tfpicamente un vector de fago que puede existir en una forma tanto monocatenaria como bicatenaria. Tfpicamente, la mutagenesis dirigida de acuerdo con la presente se realiza obteniendo en primer lugar un vector monocatenario que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica toda o una parte de la secuencia polipeptfdica de N. meningitidis seleccionada. Se prepara un cebador oligonucleotfdico que porta la secuencia mutada deseada (por ejemplo, de forma sintetica). Este cebador se hibrida despues con el vector monocatenario, y se extiende mediante el uso de enzimas tales como fragmentos de Klenow de polimerasa I de E. coli, para completar la smtesis de la cadena que porta la mutacion. Por lo tanto, se forma un heteroduplex en el que una cadena codifica la secuencia no mutada original y la segunda cadena porta la mutacion deseada. Este vector de heteroduplex se usa despues para transformar celulas apropiadas tales como celulas E. coli y se seleccionan clones que incluyen vectores recombinantes que portan la mutacion. Los kits disponibles en el mercado vienen con todos los reactivos necesarios, excepto los cebadores oligonucleotidicos.
Los polipeptidos 2086 desvelados en el presente documento incluyen cualquier protema o polipeptido que comprenda similitud de secuencia sustancial y/o equivalencia biologica a una protema 2086 que tenga una secuencia de aminoacidos de una de las SEC iD N°: 2-252 de numeros pares. Ademas, un polipeptido 2086 como se define en las reivindicaciones adjuntas no se limita a una fuente particular. Por lo tanto, se desvela en el presente documento la deteccion general y el aislamiento de los polipeptidos de una diversidad de fuentes. Ademas, los polipeptidos 2086 pueden prepararse de forma recombinante, como se conoce bien en la tecnica, basandose en las directrices proporcionadas en el presente documento, o de cualquier otra manera sintetica, como se conocen en la tecnica.
Un polipeptido 2086 puede escindirse provechosamente en fragmentos para su uso en analisis estructural o funcional adicional, o en la generacion de reactivos tales como los polipeptidos relacionados con 2086 y anticuerpos espedficos de 2086. Esto puede conseguirse tratando polipeptidos de N. meningitidis purificados o no purificados con una peptidasa tal como endoproteinasa glu-C (Boehringer, Indianapolis, IN). El tratamiento con CNBr es otro procedimiento por el que los fragmentos peptfdicos pueden producirse a partir de polipeptidos 2086 de N. meningitidis naturales. Tambien pueden usarse tecnicas recombinantes para producir fragmentos espedficos de una protema 2086.
“Variante” como se usa el termino en el presente documento, es un polinucleotido o polipeptido que difiere de un polinucleotido o polipeptido de referencia respectivamente, pero conserva propiedades esenciales. Una variante tfpica de un polinucleotido difiere en su secuencia de nucleotidos de otro polinucleotido de referencia. Los cambios en la secuencia de nucleotidos de la variante pueden alterar o no la secuencia de aminoacidos de un polipeptido codificado por el polinucleotido de referencia. Los cambios de los nucleotidos pueden dar como resultado sustituciones, adiciones, deleciones, fusiones y truncamientos de aminoacidos en el polipeptido codificado por la secuencia de referencia, como se analiza posteriormente. Una variante tfpica de un polipeptido difiere en su secuencia de aminoacidos de otro polipeptido de referencia. En general, las diferencias se limitan de modo que la secuencias del polipeptido de referencia y la variante sean estrechamente similares en general y, en muchas regiones, identicas (es decir, biologicamente equivalentes). Un polipeptido variante y de referencia pueden diferir en su secuencia de aminoacidos en una o mas sustituciones, adiciones, deleciones en cualquier combinacion. Un resto de aminoacido sustituido o insertado puede estar o no codificado por el codigo genetico. Una variante de un polinucleotido o polipeptido puede ser de origen natural tal como una variante alelica, o puede ser una variante que no se conoce que se produzca de forma natural. Pueden prepararse variantes de origen no natural de polinucleotidos y polipeptidos por tecnicas de mutagenesis o por smtesis directa.
La “identidad” como se conoce en la tecnica, es una relacion entre dos o mas secuencias polipeptfdicas o dos o mas secuencias polinucleotfdicas, como se determina comparando las secuencias. En la tecnica, “identidad” tambien significa el grado de relacion de secuencia entre las secuencias polipeptfdicas o polinucleotfdicas, segun sea el
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caso, como se determina por la coincidencia entre tramos de dichas secuencias. La “Identidad” y la “similitud” pueden calcularse facilmente por procedimientos conocidos, incluyendo pero sin limitacion los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nueva York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nueva York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A. M., y Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; y Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo, H., y Lipman, D., SiAm J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los procedimientos preferidos para determinar la identidad se disenan para proporcionar la mayor coincidencia entre las secuencias ensayadas. Los procedimientos para determinar la identidad y similitud estan codificados en programas informaticos disponibles publicamente. Los procedimientos de programas informaticos preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, pero sin limitacion, el paquete de programas GCG (Devereux, J., y col 1984), BLASTP, BLASTN, y FASTA (Altschul, S. F., y col., 1990). El programa BLASTX esta disponible publicamente de NCBI y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S., y col., NCBI NlM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S., y col., 1990). El algoritmo de Smith Waterman bien conocido puede usarse tambien para determinar la identidad.
Como ejemplo, sin pretender quedar limitado a lo mismo, un aminoacido de la presente invencion pueden ser identica a la secuencia de referencia, las SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198 de numeros pares; es decir ser 100 % identica, o puede incluir varias alteraciones de aminoacidos en comparacion con la secuencia de referencia de modo que el % de identidad sea menor del 100 %. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al menos una delecion, sustitucion, incluyendo sustitucion conservativa y no conservativa, o insercion de aminoacido, y en el que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones amino o carboxilo terminal de la secuencia polipeptfdica de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas individualmente entre los aminoacidos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos continuos dentro de la secuencia de referencia. El numero de alteraciones de aminoacidos para un % de identidad dado se determina multiplicando el numero total de aminoacidos en SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198 por el porcentaje numerico del % de identidad respectivo (dividido por 100) y restando despues ese producto de dicho numero total de aminoacidos en cualquiera de las SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198, o:
nfl = (xc*y),
en la que na es el numero de alteraciones de aminoacidos, xa es el numero total de aminoacidos en las SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198 e y es, por ejemplo 0,70 para 70 %, 0,80 para 80 %, 0,85 para 85 %, etc., y en la que cualquier producto no entero de x.sub.a e y se redondea hacia abajo hasta el numero entero mas cercano antes de restarlo de xa.
En realizaciones referidas, el polipeptido anterior se selecciona de las protemas expuestas en las SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196, 198 de numeros pares, tal como la forma procesada madura de una protema 2086. Las protemas 2086 como se define en las reivindicaciones adjuntas pueden estar lipidadas o no lipidadas.
ORF 2086 es expresable en E. coli con la secuencia sena de ORF 2806 nativa. Sin embargo, es deseable encontrar medios para mejorar la expresion de protemas. De acuerdo con una realizacion de la presente invencion, una secuencia lfder produce una forma lipidada de la protema. Por ejemplo, lo siguiente describe el uso de la secuencia senal de la protema P4 de Haemophilus influenzae no tipificable para potenciar la expresion.
El procesamiento de lipoprotemas bacterianas comienza con la smtesis de un precursor o prolipoprotema que contiene una secuencia senal, que a su vez contiene un sitio de procesamiento/modificacion de lipoprotema consenso. Esta prolipoprotema pasa inicialmente a traves del sistema de Sec comun en la membrana interna de bacterias Gram negativas o en la membrana en bacterias Gram positivas. Una vez colocada en la membrana por el sistema Sec, la prolipoprotema se escinde por peptidasa senal II en el sitio consenso y el resto de cistema N terminal expuesto se glicera y acila. Hayashi y col. 1990. Lipoproteins in bacteria. J. Bioenerg. Biomembr. Jun; 22(3): 451-71; Oudega y col. 1993. Escherichia coli SecB, SecA, and SecY proteins are required for expression and membrane insertion of the bacteriocin release protein, a small lipoprotein. J. Bacteriol. Mar; 175(5): 1543-7; Sankaran y col. 1995. Modification of bacterial lipoproteins. Methods Enzymol. 250: 683-97.
En bacterias Gram negativas, el transporte de la protema lipidada a la membrana externa esta mediado por un sistema transportador ABC unico con especificidad de membrana dependiendo de una senal de clasificacion en la posicion 2 de la lipoprotema. Yakushi y col. 2000. A new ABC transporter mediating the detachment of lipid modified proteins from membranes. Nat Cell Biol. Abr; 2(4): 212-8.
Se ha usado la fusion con lipoprotemas bacterianas y sus secuencias senal para presentar protemas recombinantes en la superficie de bacterias. Patentes de Estados Unidos N° 5.583.038 y 6.130.085. El intercambio de secuencias senal de lipoprotemas puede aumentar la produccion de la lipoprotema. De y col. 2000. Purification and characterization of Streptococcus pneumoniae palmitoylated pneumococcal surface adhesin A expressed in Escherichia coli. Vaccine. 6 mar; 18(17): 1811-21.
Se sabe que la lipidacion bacteriana de protemas aumenta o modifica la respuesta inmunologica a protemas. Erdile
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La bacteria Heamophilus influenzae no tipificable expresa una lipoprotema designada P4 (tambien conocida como protema “e”). La forma recombinante de la protema P4 se expresa en gran medida en E. coli usando la secuencia serial de P4 nativa. Patente de Estados Unidos N° 5.955.580. Cuando la secuencia serial de P4 se sustituye por la secuencia serial de ORF 2086 nativa en un vector de expresion en E. coli, se aumenta el nivel de expresion de ORF2086.
Este concepto de usar la secuencia serial de P4 heterologa para aumentar la expresion puede extenderse a otras lipoprotemas bacterianas. En particular, el analisis de genomas bacterianos conduce a la identificacion de muchas ORF que son de posible interes. El intento de expresar cada ORF con su secuencia serial nativa en una celula huesped heterologa, tal como E. coli, da lugar a una diversidad de problemas inherentes en el uso de una diversidad de secuencias serial, incluyendo estabilidad, compatibilidad y asf sucesivamente. Para minimizar estos problemas, la secuencia serial de P4 se usa para expresar cada ORF de interes. Como se ha descrito anteriormente, la secuencia serial de P4 mejora la expresion de la ORF 2086 heterologa. Un vector de expresion se construye suprimiendo la secuencia serial nativa de la ORF de interes, y ligando la secuencia serial de P4 a la ORF. Despues una celula huesped adecuada se transforma, transfecta o infecta con el vector de expresion, y se aumenta la expresion de la ORF en comparacion con la expresion usando la secuencia serial nativa de la ORF.
La forma no lipidada se produce por una protema que carece de la secuencia lfder original o por una secuencia lfder que se reemplaza con una parte de secuencia que no especifica un sitio para acilacion de acidos grasos en una celula huesped.
Las diversas formas de las protemas 2086 de la presente divulgacion se denominan en el presente documento protema “2086”, a menos que se indique espedficamente de otro modo. Ademas, “polipeptido 2086” se refiere a las protemas 2086 asf como partes inmunogenicas o equivalentes biologicos de las mismas como se ha indicado anteriormente, a no ser que se indique de otro modo.
La protema 2086 de N. meningitidis purificada y aislada de longitud completa tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 28 a 35 kDa como se mide en un gel de poliacrilamida SDS de gradiente del 10 % al 20 % (SDS- PAGE). Mas espedficamente, esta protema tiene un peso molecular de aproximadamente 26.000 a 30.000 daltons como se mide por espectrometna de masas.
Preferentemente, los polipeptidos 2086 y acidos nucleicos que codifican dichos polipeptidos se usan para prevenir o mejorar la infeccion provocada por N. meningitidis y/u otras especies.
Anticuerpos
Las protemas de la divulgacion, incluyendo las secuencias de aminoacidos de SEC ID N°: 2-252 sus fragmentos y analogos de las mismas, o celulas que las expresan, tambien se usan como inmunogenos para producir anticuerpos inmunoespedficos para los polipeptidos de la divulgacion.
Los anticuerpos de la divulgacion incluyen anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos quimericos y anticuerpos anti-idiotfpicos. Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogeneas de moleculas de anticuerpo derivadas de los sueros de animales inmunizados con un antfgeno. Los anticuerpos monoclonales son una poblacion sustancialmente homogenea de anticuerpos para antfgenos espedficos. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales por procedimientos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, Kohler y Milstein, 1975, Nature 256: 495-497 y Patente de Estados Unidos Numero 4.376.110. Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas.
Los anticuerpos quimericos son moleculas, partes diferentes de las cuales derivan de diferentes especies animales, tales como las que tienen una region variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una region constante de inmunoglobulina humana. Se conocen en la tecnica anticuerpos quimericos y procedimientos para su produccion (Cabilly y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273-3277; Morrison y col., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855; Boulianne y col., 1984, Nature 312:643-646; Cabilly y col., Solicitud de Patente Europea 125023
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(publicada el 14 de noviembre de1984); Taniguchi y col., Solicitud de Patente Europea 171496 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neuberger y col., Solicitud de PCT WO 86/01533 (publicada el 13 de marzo de 1986); Kudo y col., Solicitud de Patente Europea 184187 (publicada el 11 de junio de 1986); Morrison y col., Solicitud de Patente Europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Sahagan y col., 1986, J. Immunol. 137:1066-1074; Robinson y col., documento PCT/US86/02269 (publicado el 7 de mayo de 1987); Liu y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Sun y col., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214-218; Better y col., 1988, Science 240: 1041-1043).
Un anticuerpo anti-idiotfpico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinates unicos generalmente asociados con el sitio de union a antigeno de un anticuerpo. Un anticuerpo anti-Id se prepara inmunizando un animal de la misma especie y tipo genetico (por ejemplo, cepa de raton) que la fuente del anticuerpo monoclonal con el anticuerpo monoclonal para el que se prepara un anti-Id. El animal inmunizado reconocera y respondera a los determinantes idiotfpicos del anticuerpo inmunizador produciendo un anticuerpo para estos determinantes isotopicos (el anticuerpo anti-Id).
En consecuencia, pueden usarse anticuerpos monoclonales generados contra los polipeptidos de la presente divulgacion para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados. Pueden usarse celulas del bazo de dichos ratones inmunizados para producir hibridomas anti-Id que secretan anticuerpos anti-Id monoclonales. Ademas, los anticuerpos anti-Id pueden acoplarse con un vehmulo tal como hemocianina de lapa californiana (KLH) y usarse para inmunizar ratones BALB/c adicionales. Los sueros de estos ratones contendran anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de union del mAb final espedfico para un epftopo de R-PTPasa. Los anticuerpos anti-Id tienen por tanto sus epftopos idiotfpicos, o “idiotopos” estructuralmente similares al epftopo que se evalua, tal como polipeptidos de Streptococcus pyogenes.
Tambien se entiende que el termino “anticuerpo” incluye tanto moleculas intactas como fragmentos tales como Fab que son capaces de unirse con el antfgeno. Los fragmentos Fab carecen del fragmento Fc de anticuerpo intacto, se eliminan mas rapidamente de la circulacion, y pueden tener menos union tisular no espedfica que un anticuerpo intacto (Wahl y col., 1983, J. Nucl. Med. 24: 316-325). Se apreciara que Fab y otros fragmentos de los anticuerpos utiles en la presente invencion pueden usarse para la deteccion y cuantificacion de polipeptidos de N. meningitidis de acuerdo con los procedimientos para moleculas de anticuerpo intactas.
Los anticuerpos de la presente divulgacion, tales como anticuerpos anti-idiotfpicos (“anti-Id”), pueden emplearse en un procedimiento para el tratamiento o prevencion de infeccion por Neisseria en huespedes mairftferos, que comprende administracion de una cantidad inmunologicamente eficaz de anticuerpo, espedfica para un polipeptido como se ha descrito anteriormente. El anticuerpo anti-Id tambien puede usarse como un “inmunogeno” para inducir una respuesta inmunitaria en otro animal mas, produciendo un anticuerpo denominado anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitopicamente identico al mAb original que indujo el anti-Id. Por lo tanto, usando anticuerpos para los determinantes idiotfpicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad identica.
Los anticuerpos se usan de una diversidad de maneras, por ejemplo, para confirmacion de que una protema se expresa, o para confirmar cuando una protema se expresa. Puede incubarse anticuerpo marcado (por ejemplo, marcaje fluorescente para FACS) con bacterias intactas y la presencia del marcador en la superficie bacteriana confirma la localizacion de la protema, por ejemplo.
Pueden obtenerse anticuerpos generados contra los polipeptidos de la invencion administrando los polipeptidos o fragmentos portadores de epftopos, analogos o celulas a un animal usando protocolos rutinarios. Para preparar anticuerpos monoclonales, se usa cualquier tecnica que proporcione anticuerpos producidos por cultivos de lmea celular continuos.
Polinucleotidos
Como con las protemas de la presente divulgacion, un polinucleotido de la presente divulgacion puede comprender una secuencia de acido nucleico que es identica a cualquiera de las secuencias de referencia de las SEC ID N°: 1253, de numeros impares, es decir, es 100 % identica o puede incluir hasta un numero de alteraciones de nucleotidos en comparacion con la secuencia de referencia. Dichas alteraciones se seleccionan del grupo que consiste en al menos una delecion, sustitucion, incluyendo transicion y transversion, o insercion de nucleotidos, y en el que dichas alteraciones pueden producirse en las posiciones 5' o 3' terminal de la secuencia de nucleotidos de referencia o en cualquier parte entre esas posiciones terminales, intercaladas bien individualmente entre los nucleotidos en la secuencia de referencia o en uno o mas grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia. El numero de alteraciones de nucleotidos se determina multiplicando el numero total de nucleotidos en cualquiera de las SEC ID N°: 1-253 de numeros impares por el porcentaje numerico del porcentaje de identidad respectivo (dividido por 100) y restando ese producto de dicho numero total de nucleotidos en dicha secuencia.
Como ejemplo, sin pretender limitarse al mismo, un polinucleotido de N. meningitidis aislado que comprende una secuencia polinucleotfdica que tiene al menos 70 % de identidad con cualquier secuencia de acido nucleico de SEC ID N°: 1-253; una variante degradada de la misma o un fragmento de la misma, en la que la secuencia
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polinucleot^dica puede incluir hasta nn alteraciones de acido nucleico sobre la region polinucleotfdica completa de la secuencia de acido nucleico SEC ID N°: 1-253; en la que nn es el maximo numero de alteraciones y se calcula por la formula:
n„ = x^-Cx^y),
en la que Xn es el numero total de acidos nucleicos de cualquiera de SEC ID N°: 1-253 e y tiene un valor de 0,70, en la que cualquier producto no entero de Xn e y se redondea hacia abajo hasta el numero entero mas cercano antes de restar dicho producto de Xn. Por supuesto, y tambien tener un valor de 0,80 para 80 %, 0,85 para 85 %, 0,90 para 90 %, 0,95 para 95 % etc. Las alteraciones de una secuencia polinucleotfdica que codifica los polipeptidos que comprenden secuencias de aminoacidos de cualquiera de SEC ID N°: 2-252 pueden crear mutaciones sin sentido, de sentido erroneo o de desplazamiento de fase en esta secuencia codificante y de este modo alterar el polipeptido codificado por el polinucleotido despues de dichas alteraciones.
Tambien se desvelan en el presente documento polinucleotidos (denominados en el presente documento los “polinucleotidos 2086”) que codifican las protemas 2086 y anticuerpos preparados contra las protemas 2086. Tambien se desvela en el presente documento un polinucleotido que comprende una secuencia de nucleotidos que tiene al menos aproximadamente el 95 % de identidad con una secuencia de nucleotidos seleccionada de una de las SEC ID N°: 1 y SEC ID N°: 253 de numeros impares, una variante degradada de las mismas, o un fragmento de las mismas. Como se define en el presente documento, una “variante degradada” se define como un polinucleotido que difiere de la secuencia de nucleotidos mostrada en las SEC ID N°: 1 y SEC ID N°: 253 de numeros impares (y fragmentos de las mismas) debido a la degeneracion del codigo genetico, pero aun codifica la misma protema 2086 (es decir, las SEC ID N°: 2-252 de numeros pares) que la codificada por la secuencia de nucleotidos mostrada en las SEC ID N°: 1-253 de numeros impares.
Se apreciara que los polinucleotidos de 2086 pueden obtenerse de fuentes naturales, sinteticas o semisinteticas; ademas, la secuencia de nucleotidos puede ser una secuencia de origen natural, o puede estar relacionada por mutacion, incluyendo sustituciones, deleciones, inserciones e inversiones de una o multiples bases, con dicha secuencia de origen natural, a condicion de que la molecula de acido nucleico que comprende dicha secuencia pueda expresarse como un polipeptido inmunogenico 2086 como se ha descrito anteriormente. La molecula de acido nucleico puede ser ARN, aDn, monocatenaria o bicatenaria, lineal o de forma circular cerrada covalentemente. La secuencia de nucleotidos puede tener secuencias de control de la expresion situadas adyacentes a ella, derivando dichas secuencias de control habitualmente de una fuente heterologa. En general, la expresion recombinante de la secuencia de acido nucleico usara una secuencia de codon de parada, tal como TAA, en el extremo de la secuencia de acido nucleico.
Tambien se desvelan en el presente documento polinucleotidos capaces de hibridar en condiciones de rigurosidad reducida, mas preferentemente condiciones rigurosas, y mas preferentemente condiciones altamente rigurosas, con polinucleotidos descritos en el presente documento. Se muestran ejemplos de condiciones de rigurosidad en la Tabla de Condiciones de Rigurosidad a continuacion: las condiciones altamente rigurosas son las que son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones A-F; las condiciones rigurosas son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones G-L; y las condiciones de rigurosidad reducida son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las condiciones M-R.
CONDICIONES DE RIGUROSIDAD - TABLA I
- Condicion de rigurosidad
- Hfbrido polinucleotfdico Longitud del hforido (pbV Temperatura de hibridacion y tamponH Temperatura de lavado y tamponH
- A
- ADN:ADN > 50 65EC; SSC1x -o- 42EC; SSC1x, formamida al 50 % 65EC; SSC0,3x
- B
- ADN:ADN < 50 Tb; 1xSSC Tb; SSC1x
- C
- ADN:ARN > 50 67EC; SSC1x -o- 45EC; SSC1x, formamida al 50 % 67EC; SSC0,3x
- D
- ADN:ARN < 50 Td; SSC1x Td; SSC1x
- E
- ARN: ARN > 50 70EC; SSC1x -o- 50EC; SSC1x, formamida al 50 % 70EC; SSC0,3x
- F
- ARN: ARN < 50 Tf; SSC1x Tf; SSC1x
- G
- ADN:ADN > 50 65EC; SSC4x -o- 42EC; SSC4x, formamida al 50 % 65EC; SSC1x
- H
- ADN:ADN < 50 Th; 4xSSC Th; SSC4x
- I
- ADN:ARN > 50 67EC; SSC4x -o- 45EC; SSC4x, formamida al 50 % 67EC; SSC1x
- J
- ADN:ARN < 50 Tj; SSC4x Tj; SSC4x
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(continuacion)
- Condicion de rigurosidad
- Hfbrido polinucleotfdico Longitud del hnbrido (pb)I Temperatura de hibridacion y tamponH Temperatura de lavado y tamponH
- K
- ARN: ARN > 50 70EC; SSC4x -o- 50EC; SSC4x, formamida al 50 % 67EC; SSC1x
- L
- ARN: ARN < 50 Tl; 2xSSC Tl; SSC2x
- M
- ADN:ADN > 50 50EC; SSC4x -o- 40EC; SSC6x, formamida al 50 % 50EC; SSC2x
- N
- ADN:ADN <50 Tn; SSC6x Tn; SSC6x
- O
- ADN:ARN > 50 55EC; SSC4x -o- 42EC; SSC6x, formamida al 50 % 55EC; SSC2x
- P
- ADN:ARN < 50 TP; SSC6x TP; SSC6x
- Q
- ARN: ARN > 50 60EC; SSC4x -o-45EC; SSC6x, formamida al 50 % 60EC; SSC2x
- R
- ARN: ARN < 50 Tr; SSC4x Tr; SSC4x
- pb1: La longitud del hnbrido es la anticipada para la region o regiones hibridadas de los polinucleotidos que hibridan. Cuando se hibrida un polinucleotido con un polinucleotido diana de secuencia desconocida, se supone que la longitud del hnbrido es la del polinucleotido que hibrida. Cuando se hibridan polinucleotidos de secuencia conocida, la longitud del hnbrido puede determinarse alineando las secuencias de los polinucleotidos e identificando la region o las regiones de complementariedades de secuencia optimas. tamponH: SSPE (SSPE1x es NaCl 0,15 M, NaH2PO4 10 mM y EDTA 1,25 mM, pH 7,4) puede sustituir a SSC (SSC1x es NaCl 15 M y citrato sodico 15 M) en los tampones de hibridacion y lavado; se realizan lavados durante 15 minutos despues de completarse la hibridacion. Tb hasta Tr: La temperatura de hibridacion para hnbridos que se anticipa que son de menos de 50 pares de bases de longitud debena ser de 5-10EC menos que la temperatura de fusion (Tm) del hnbrido, cuando Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para hnbridos de menos de 18 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 2(n° de bases A + T) + 4(n° de bases G +C). Para hnbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm(EC) = 81,5 + 16,6 (log-i0[Na+]) + 0,41(% G+C) - (600/N), en la que N es el numero de bases en el hnbrido, y [Na+] es la concentracion de iones de sodio en el tampon de hibridacion ([Na+]) para SSC1x = 0,165 M).
Se proporcionan ejemplos adicionales de condiciones de rigurosidad para la hibridacion de polinucleotidos en Sambrook, J., E.F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capftulos 9 y 11, y Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M. Ausubel y col., eds., John Wiley & Sons, Inc., secciones 2.10 y 6.3-6.4.
Tambien se desvelan en el presente documento polinucleotidos que son completamente complementarios de estos polinucleotidos que tambien proporcionan secuencias antisentido.
Los polinucleotidos desvelados en el presente documento se preparan de muchas maneras (por ejemplo, por smtesis qmmica, de bibliotecas de ADN, del organismo en sf mismo) y pueden tomar diversas formas (por ejemplo, monocatenarias, bicatenarias, vectores, sondas, cebadores). El termino “polinucleotido” incluye ADN y ARN y tambien sus analogos, tales como los que contienen cadenas principales modificadas.
Proteinas de fusion
Tambien se desvelan en el presente documento proteinas de fusion. Una “protema de fusion” se refiere a una protema codificada por dos genes fusionados, con frecuencia no relacionados, o fragmentos de los mismos. Por ejemplo, proteinas de fusion que comprenden diversas partes de region constante de moleculas de inmunoglobulina junto con otra protema inmunogenica o parte de la misma. En muchos casos, el empleo de una region Fc de inmunoglobulina como parte de una protema de fusion es ventajoso para su uso en terapia y diagnostico dando como resultado, por ejemplo, propiedades farmacocineticas mejoradas (vease, por ejemplo, documento EP 0 232 262 A1). Por otro lado, para algunos usos sena deseable poder suprimir la parte Fc despues de que la protema de fusion se haya expresado, detectado y purificado. Los polinucleotidos 2086 desvelados en el presente documento se usan para la produccion recombinante de polipeptidos de la presente invencion, el polinucleotido puede incluir la secuencia codificante del polipeptido maduro, por sf sola, o la secuencia codificante del polipeptido maduro en fase de lectura con otras secuencias codificantes, tales como las que codifican una secuencia lfder o secretora, una secuencia de pre, o pro o prepro-protema, u otras partes de peptidos de fusion. Por ejemplo, puede codificarse una secuencia marcadora que facilita la purificacion de un polipeptido 2086 o polipeptido fusionado (vease Gentz y col., 1989). Por lo tanto, se contempla en una implementacion de la presente divulgacion la preparacion de polinucleotidos que codifican polipeptidos de fusion que permiten la purificacion de marcador His de productos de expresion. El polinucleotido tambien puede contener secuencias 5' y 3' no codificantes, tales como secuencias transcritas, no traducidas, senales de corte y empalme y de poliadenilacion. Dicho polipeptido fusionado puede producirse por una celula huesped transformada/transfectada o infectada o infectada con un vehnculo de clonacion de ADN recombinante como se describe posteriormente y puede aislarse posteriormente de la celula huesped para
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proporcionar el polipeptido fusionado sustancialmente sin otras protemas de celulas huesped.
Composiciones inmunogenicas
Un aspecto de la presente invencion proporciona composiciones inmunogenicas que comprenden al menos una protema 2086 como se define en las reivindicaciones adjuntas. Las anteriores tienen la capacidad de (1) inducir anticuerpos bactericidas para multiples cepas; (2) reaccionar con la superficie de multiples cepas; (3) conferir proteccion pasiva contra una exposicion en vivo; y/o (4) prevenir la colonizacion.
La formulacion de dichas composiciones inmunogenicas se conoce bien por los expertos en este campo. Las composiciones inmunogenicas de la invencion preferentemente incluyen un vehmulo farmaceuticamente aceptable. Los vehmulos y/o diluyentes farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen todos y cada uno de disolventes convencionales, medios de dispersion, cargas, vehmulos solidos, soluciones acuosas, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungicos, agentes isotonicos y retardantes de la absorcion y similares. Los vehmulos farmaceuticamente aceptables adecuados incluyen, por ejemplo, uno o mas de agua, solucion salina, solucion salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, asf como combinaciones de los mismos. Los vehmulos farmaceuticamente aceptables pueden comprender ademas cantidades menores de sustancias adyuvantes tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian el periodo de caducidad o eficacia del anticuerpo. La preparacion y uso de vehmulos farmaceuticamente aceptables se conocen bien en la tecnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el principio activo, se contempla el uso del mismo en las composiciones inmunogenicas de la presente invencion.
Dichas composiciones inmunogenicas pueden administrarse por via parenteral, por ejemplo, por inyeccion, bien por via subcutanea o bien por via intramuscular, asf como por via oral o por via intranasal. Se describen procedimientos para inmunizacion intramuscular en Wolff y col. y en Sedegah y col. Otros modos de administracion emplean formulaciones orales, formulaciones pulmonares, supositorios y aplicaciones transdermicas, por ejemplo, sin limitacion. Las formulaciones orales, por ejemplo, incluyen excipientes empleados normalmente tales como, por ejemplo, usos farmaceuticos de manitol, lactosa, almidon, estearato de magnesio, sacarina sodica, celulosa, carbonato de magnesio y similares, sin limitacion.
Las composiciones inmunogenicas de la invencion pueden incluir uno o mas adyuvantes, incluyendo, pero sin limitacion hidroxido de aluminio; fosfato de aluminio; STIMULON™ QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, MA); MPL™ (monofosforil lfpido A 3-O-desacilado; Corixa, Hamilton, MT), 529 (un compuesto de amino alquil glucosamina fosfato, Corixa, Hamilton, MT), IL-12 (Genetics Institute, Cambridge, MA); GM-CSF (Immunex Corp., Seattle, Washington); N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP); N-acetil-nor-muramil-L- alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, denominada nor-MDP); N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1’- 2’-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifos-foriloxi-etilamina) (CGP 19835A, denominado MTP-PE); y toxina del colera. Otros que pueden usarse son derivados no toxicos de la toxina del colera, incluyendo su subunidad A, y/o conjugados o fusiones modificadas por ingeniena genetica del polipeptido de N. meningitidis con toxina del colera o su subunidad B (“CTB”), procoleragenoide, polisacaridos fungicos, incluyendo esquizofilano, dipeptido de muramilo, derivados de dipeptido de muramilo (“MDP”), forbol esteres, la toxina termolabil de E. coli, polfmeros en bloque o saponinas.
En ciertas realizaciones preferidas, las protemas de la presente invencion se usan en una composicion inmunogenica para administracion oral que incluye un adyuvante mucoso y se usa para el tratamiento o prevencion de la infeccion por N. meningitidis en un huesped humano. El adyuvante mucoso puede ser una toxina del colera; sin embargo, preferentemente los adyuvantes mucosos distintos de la toxina del colera que pueden usarse de acuerdo con la presente invencion incluyen derivados no toxicos de una holotoxina del colera, en los que la subunidad A esta mutada, toxina del colera modificada qmmicamente o protemas relacionadas producidas por la modificacion de la secuencia de aminoacidos de la toxina del colera. Para una toxina del colera espedfica que puede ser particularmente util en la preparacion de composiciones inmunogenicas de la presente invencion, vease la holotoxina del colera mutante E29H, como se desvela en la Solicitud Internacional Publicada WO 00/18434. Estas pueden anadirse a, o conjugarse con, los polipeptidos de la presente invencion. Las mismas tecnicas pueden aplicarse a otras moleculas con adyuvante mucoso o propiedades de suministro tales como toxina termolabil de Escherichia coli (LT). Pueden usarse otros compuestos con actividad de suministro o adyuvante mucoso tales como la bilis; policationes tales como DEAE-dextrano y poliornitina; detergentes tales como el dodecil benceno sulfato sodico; materiales conjugados con lfpidos; antibioticos tales como estreptomicina; vitamina A; y otros compuestos que alteran la integridad estructural o funcional de las superficies de la mucosa. Tambien pueden usarse otros compuestos activos en mucosa incluyen derivados de estructuras microbianas tales como MDP; acridina y cimetidina. STIMULON™ QS-21, MPL e IL-12, como se ha descrito anteriormente.
Las composiciones inmunogenicas de la presente invencion pueden suministrarse en forma de ISCOM (complejos inmunoestimulantes), ISCOM que contienen CTB, liposomas o encapsulados en compuestos tales como acrilatos o poli(DL-lactida-co-glucosido) para formar microesferas de un tamano adecuado para la adsorcion. Las protemas de la presente invencion tambien pueden incorporarse en emulsiones oleosas.
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Antigenos multiples
La composicion puede incluir otros inmunogenos activos, incluyendo otros polipeptidos inmunogenicos de Neisseria sp. o protemas inmunologicamente activas de uno o mas patogenos microbianos distintos (por ejemplo, virus, prion, bacteria u hongo, sin limitacion) o polisacarido capsular. Las composiciones pueden comprender una o mas protemas deseadas, fragmentos o compuestos farmaceuticos segun se desee para una indicacion seleccionada.
Se contempla cualquier composicion inmunogenica multi-antfgeno o multi-valente por la presente invencion. Por ejemplo, las composiciones como se definen en las reivindicaciones adjuntas pueden comprender combinaciones de dos o mas protemas 2086, una combinacion de protema 2086 con una o mas protemas Por A, una combinacion de protema 2086 con polisacaridos del serogrupo de meningococo A, C, Y y W135 y/o conjugados de polisacaridos, una combinacion de protema 2086 con combinaciones de meningococo y neumococo, o una combinacion de cualquiera de los anteriores en una forma adecuada para suministro mucoso. Los expertos en la materia senan capaces de formular facilmente dichas composiciones inmunologicas multi-antigeno o multi-valentes.
La presente invencion tambien completa regfmenes de multi-inmunizacion en los que cualquier composicion util contra un patogeno puede combinarse en los mismos o con las composiciones de la presente invencion. Por ejemplo, sin limitacion, puede administrarse a un paciente la composicion inmunogenica de la presente invencion y otra composicion inmunologica para inmunizar contra S. pneumoniae, como parte de un regimen de multi- inmunizacion. Los expertos en la materia senan capaces facilmente de seleccionar composiciones inmunogenicas para su uso junto con las composiciones inmunogenicas de la presente invencion para los fines de desarrollar e implementar regfmenes multi-inmunizacion.
Tambien se desvela en el presente documento el uso de uno o mas polipeptidos de la presente divulgacion, o acidos nucleicos que los codifican, en una composicion o como parte de un regimen de tratamiento para la prevencion o mejora de infeccion por S. pneumoniae. Se pueden combinar los polipeptidos 2086 o polinucleotidos de 2086 con cualquier composicion inmunogenica para su uso contra infeccion por S. pneumoniae. Tambien se pueden combinar los polipeptidos 2086 o polinucleotidos 2086 con cualquier otra protema o vacuna meningococica basada en polisacaridos.
Los polipeptidos 2086, fragmentos y equivalentes pueden usarse como parte de una composicion inmunogenica conjugada; en la que una o mas protemas o polipeptidos se conjugan con un vehroulo para generar una composicion que tiene propiedades inmunogenicas contra varios serotipos y/o contra varias enfermedades. Como alternativa, uno de los polipeptidos 2086 puede usarse como una protema vehroulo para otros polipeptidos inmunogenicos.
La presente invencion tambien se refiere a un procedimiento para inducir respuestas inmunitarias en un mairnfero que comprende la etapa de proporcionar a dicho mam^era una composicion inmunogenica de la presente invencion. La composicion inmunogenica es una composicion que es antigenica en el animal o ser humano tratado de modo que la cantidad inmunologicamente eficaz del polipeptido o los polipeptidos contenidos en dicha composicion proporciona la respuesta inmunitaria deseada contra infeccion por N. meningitidis. Las realizaciones preferidas se refieren a un procedimiento para el tratamiento, incluyendo mejora, o prevencion de infeccion por N. meningitidis en un ser humano que comprende administrar a un ser humano una cantidad inmunologicamente eficaz de la composicion.
La expresion “cantidad inmunologicamente eficaz” como se usa en el presente documento, se refiere a la administracion de la cantidad a un huesped marnffero (preferentemente humano), bien en una unica dosis o bien como parte de una serie de dosis, suficiente para provocar al menos que el sistema inmunitario del individuo tratado genere una respuesta que reduzca el impacto clmico de la infeccion bacteriana. Esto puede variar de una reduccion minima en carga bacteriana a prevencion de la infeccion. Idealmente, el individuo tratado no mostrara las manifestaciones clmicas mas graves de la infeccion bacteriana. La cantidad de dosificacion puede variar dependiendo de las condiciones espedficas del individuo. Esta cantidad puede determinarse en ensayos rutinarios o de otro modo por medios conocidos para los expertos en la materia.
Otro aspecto espedfico de la presente divulgacion se refiere a usar como la composicion inmunogenica un vector o plasmido que exprese una protema de la presente divulgacion, o una parte inmunogenica de la misma. En consecuencia, un aspecto adicional de la presente divulgacion proporciona un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria en un mai^ero, que comprende proporcionar a un mamffero un vector o plasmido que expresa al menos un polipeptido 2086 aislado. La protema de la presente divulgacion puede suministrarse al mamffero usando un vector vivo, en particular usando bacterias recombinantes vivas, virus u otros agentes vivos, que contienen el material genetico necesario para la expresion del polipeptido o parte inmunogenica como un polipeptido ajeno.
Vectores virales y no virales
Los vectores preferidos, particularmente para ensayos celulares in vitro e in vivo, son vectores virales, tales como lentivirus, retrovirus, virus del herpes, adenovirus, virus adenoasociados, virus vaccinia, baculovirus y otros virus recombinantes con tropismo celular deseable. Por lo tanto, un acido nucleico que codifica una protema 2086 o fragmento inmunogenico de la misma puede introducirse in vivo, ex vivo o in vitro usando un vector viral o mediante
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introduccion directa de ADN. La expresion en tejidos diana puede efectuarse dirigiendo el vector transgenico a celulas espedficas, tal como con un vector viral o un ligando receptor, o usando un promotor espedfico de tejido, o ambos. Se describe el suministro genico dirigido en la Publicacion PCT N° WO 95/28494.
Los vectores virales habitualmente usados para direccion in vivo o ex vivo y procedimientos de terapia son vectores basados en ADN y vectores retrovirales. Se conocen en la tecnica procedimientos para construir y usar vectores virales (por ejemplo, Miller y Rosman, BioTechniques, 1992, 7: 980-990). Preferentemente, los vectores virales son defectuosos en replicacion, es decir, son incapaces de replicarse de forma autonoma en la celula diana. Preferentemente, el virus defectuoso para replicacion es un virus mmimo, es decir, conserva solamente las secuencias de su genoma que son necesarias para encapsular el genoma para producir partfculas virales.
Los vectores virales de ADN incluyen un virus de ADN atenuado o defectuoso, tal como pero sin limitacion, virus del herpes simple (VHS), papilomavirus, virus de Epstein Barr (VEB), adenovirus, virus adenoasociado (VAA), y similares. Se prefieren virus defectuosos, que carecen completa o casi completamente de genes virales. El virus defectuoso no es infeccioso despues de su introduccion en una celula. El uso de vectores virales defectuosos permite la administracion a celulas en un area espedfica, localizada, sin preocuparse de que el vector pueda infectar otras celulas. Por lo tanto, puede dirigirse espedficamente a un tejido espedfico. Los ejemplos de vectores particulares incluyen, pero sin limitacion, un vector de virus del herpes defectuoso 1 (VHS1) (Kaplitt y col., Molec. Cell. Neurosci., 1991, 2: 320-330), vector de virus del herpes defectuoso que carece de un gen de glucoprotema L, u otros vectores de virus del herpes defectuosos (Publicaciones de PCT N° WO 94/21807 y WO 92/05263); un vector de adenovirus atenuado, tal como el vector descrito en Stratford-Perricaudet y col. (J. Clin. Invest., 1992, 90: 626630; vease tambien La Salle y col., Science, 1993, 259: 988-990); y un vector de virus adenoasociado defectuoso (Samulski y col., J. Virol., 1987, 61: 3096-3101; Samulski y col., J. Virol., 1989, 63: 3822-3828; Lebkowski y col., Mol. Cell. Biol., 1988, 8: 3988-3996).
Diversas compares producen vectores virales comercialmente, incluyendo, pero sin limitacion, Avigen, Inc. (Alameda, CA; vectores de VAA), Cell Genesys (Foster City, CA; vectores retrovirales, adenovirales, de VAA y vectores lentivirales), Clontech (vectores retrovirales y baculovirales), Genovo, Inc. (Sharon Hill, PA; vectores adenovirales y VAA), Genvec (vectores adenovirales), IntroGene (Leiden, Pafses Bajos; vectores adenovirales), Molecular Medicine (vectores retrovirales, adenovirales, VAA y de virus del herpes), Norgen (vectores adenovirales), Oxford BioMedica (Oxford, Reino Unido; vectores lentivirales) y Transgene (Estrasburgo; Francia; vectores adenovirales, vaccinia, retrovirales y lentivirales).
Vectores de adenovirus. Los adenovirus son virus de ADN eucariota que pueden modificarse para suministrar eficazmente un acido nucleico de la presente invencion a una diversidad de tipos celulares. Existen diversos serotipos de adenovirus. De estos serotipos, se da preferencia, dentro del alcance de la presente invencion, al uso de adenovirus humanos de tipo 2 o tipo 5 (Ad 2 o Ad 5) o adenovirus de origen animal (vease Publicacion de PCT N° WO 94/26914). Los adenovirus de origen animal que pueden usarse dentro del alcance de la presente invencion incluyen adenovirus de origen canino, bovino, murino (ejemplo: Mavl, Beard y col., Virology, 1990, 75-81), ovino, porcino, aviar y de simio (por ejemplo: SAV). Preferentemente, el adenovirus de origen animal es un adenovirus canino, mas preferentemente un adenovirus CAV2 (por ejemplo, cepa Manhattan o A26/61, ATCC VR-800, por ejemplo). Se han descrito diversos adenovirus defectuosos para replicacion y vectores de adenovirus mmimos (Publicaciones de PCT N° WO 94/26914, WO 95/02697, WO 94/28938, WO 94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697, WO 96/22378). Se recuperan adenovirus recombinantes y se purifican usando tecnicas de biologfa molecular convencionales, que se conocen bien por los expertos habituales en la materia.
Virus adenoasociados. Los virus adenoasociados (VAA) son virus de ADN de tamano relativamente pequeno que pueden integrarse, de una manera estable y espedfica de sitio, en el genoma de las celulas que infectan. Son capaces de infectar un amplio espectro de celulas sin inducir ningun efecto en el crecimiento, morfologfa o diferenciacion celular, y no parecen estar implicados en patologfas humanas. El genoma de VAA se ha clonado, secuenciado y caracterizado. El uso de vectores derivados de VAA para transferir genes in vitro e in vivo se ha descrito (vease, Publicacion de PCT N° WO 91/18088 y WO 93/09239; Patente de Estados Unidos N° 4.797.368 y 5.139.941; Publicacion Europea N° EP 488 528).
Vectores retrovirales. En otra implementacion de la presente divulgacion, el acido nucleico puede introducirse en un vector retroviral, por ejemplo, como se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.399.346; Mann y col., Cell, 1983, 33: 153; Patente de Estados Unidos N° 4.650.764 y 4.980.289; Markowitz y col., J. Virol., 1988, 62: 1120; Patente de Estados Unidos N° 5.124.263; Publicacion Europea N° EP 453 242 y EP 178 220; Bernstein y col., Genet. Eng.,1985, 7: 235; McCormick, BioTechnology, 1985, 3: 689; Publicacion de PCT N° WO 95/07358; y Kuo y col., Blood, 1993, 82: 845. Los retrovirus son virus integrantes que infectan a celulas en division. El genoma del retrovirus incluye dos LTR, una secuencia de encapsidacion y tres regiones codificantes (gag, pol y env). En vectores retrovirales recombinantes, los genes gag, pol y env estan generalmente suprimidos, completamente o en parte, y se reemplazan con una secuencia de acido nucleico heterologa de interes. Estos vectores pueden construirse a partir de tipos diferentes de retrovirus, tales como VIH, MoMuLV (“virus de leucemia murina de Moloney”), MSV (“virus del sarcoma murino de Moloney”), HaSV (“virus del sarcoma de Harvey”); SNV (“virus de necrosis del bazo”); RSV (“virus del sarcoma de Rous”) y virus de Friend. Se han descrito en la tecnica anterior lmeas celulares de envasado adecuadas, en particular la lmea celular PA317 (Patente de Estados Unidos N°
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4.861.719); la lmea celular PsiCRIP (Publicacion de PCT N° WO 90/02806) y la lmea celular GP+envAm-12 (Publicacion de PCT N° WO 89/07150). Ademas, los vectores retrovirales recombinantes pueden contener modificaciones dentro de las LTR para suprimir la actividad transcripcional asf como secuencias de encapsidacion extensivas que pueden incluir una parte del gen gag (Bender y col., J. Virol., 1987, 61: 1639). Se purifican vectores retrovirales recombinantes por tecnicas convencionales conocidas por los expertos habituales en la materia.
Pueden construirse vectores retrovirales para actuar como partmulas infecciosas o para experimentar un unico ciclo de transfeccion. En el primer caso, el virus se modifica para conservar todos sus genes excepto por los responsables de las propiedades de transformacion oncogenicas, y para expresar el gen heterologo. Se manipulan vectores virales no infecciosos para destruir la senal de empaquetamiento viral, pero conservan los genes estructurales requeridos para empaquetar el virus co-introducido modificado por ingeniena genetica para contener el gen heterologo y las senales de empaquetamiento. Por lo tanto, las partmulas virales que se producen no son capaces de producir virus adicionales.
Tambien pueden introducirse vectores retrovirales por virus de ADN, lo que permite un ciclo de replicacion retroviral y amplifica la eficacia de transfeccion (vease Publicaciones de PCT N° WO 95/22617, WO 95/26411, WO 96/39036 y WO 97/19182).
Vectores lentivirales. En otra implementacion de la presente divulgacion, pueden usarse vectores lentivirales como agentes para el suministro directo y expresion sostenida de un transgen en varios tipos tisulares, incluyendo cerebro, retina, musculo, tugado y sangre. Los vectores pueden transducir eficazmente celulas en division y no en division en estos tejidos, y efectuar expresion a largo plazo del gen de interes. Para una revision, vease, Naldini, Curr. Opin. Biotechnol., 1998, 9: 457-63; vease tambien Zufferey, y col., J. Virol., 1998, 72: 9873-80. Estan disponibles lmeas celulares de empaquetamiento lentiviral y se conocen en general en la tecnica. Facilita la produccion de vectores lentivirales de alto tftulo para la terapia genica. Un ejemplo es una lmea celular de empaquetamiento de lentivirus pseudotipificado VSV-G inducible por tetraciclina que puede generar partmulas virales a tftulos mayores de 106 Ul/ml durante al menos 3 a 4 dfas (Kafri, y col., J. Virol., 1999, 73: 576-584). El vector producido por la lmea celular inducible puede concentrarse segun sea necesario para transducir eficazmente celulas no en division in vitro e in vivo.
Vectores no virales. En otra implementacion de la presente divulgacion, el vector puede introducirse in vivo por lipofeccion, como ADN desnudo, o con otros agentes facilitadores de la transfeccion (peptidos, polfmeros, etc.). Pueden usarse lfpidos cationicos sinteticos para preparar liposomas para transfeccion in vivo de un gen que codifica un marcador (Felgner, y col, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1987, 84: 7413-7417; Felgner y Ringold, Science, 1989, 337: 387-388; vease Mackey, y col., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1988, 85: 8027-8031; Ulmer y col., Science, 1993, 259: 1745-1748). Se describen compuestos y composiciones lipfdicos utiles para transferencia de acidos nucleicos en las Publicaciones de Patente de PCT N° WO 95/18863 y Wo 96/17823, y en la Patente de Estados Unidos N° No. 5.459.127. Los lfpidos pueden acoplarse qmmicamente a otras moleculas para el fin de dirigir (vease Mackey, y col., mencionado anteriormente). Los peptidos dirigidos, por ejemplo, hormonas o neurotransmisores, y protemas tales como anticuerpos, o moleculas no peptfdicas podnan acoplarse a liposomas qmmicamente.
Otras moleculas tambien son utiles para facilitar la transfeccion de un acido nucleico in vivo, tales como un oligopeptido cationico (por ejemplo, la Publicacion de Patente de PCT N° WO 95/21931), peptidos derivados de protemas de union a aDn (por ejemplo, Publicacion de Patente de PCT N° WO 96/25508) o un polfmero cationico (por ejemplo, Publicacion de Patente de PCT N° WO 95/21931).
Tambien es posible introducir el vector in vivo como un plasmido de ADN desnudo. Pueden introducirse vectores de ADN desnudo para fines de vacuna o terapia genica en las celulas huesped deseadas por procedimientos conocidos en la tecnica, por ejemplo, electroporacion, microinyeccion, fusion celular, DEAE dextrano, precipitacion con fosfato calcico, uso de una pistola genica, o uso de un transportador de vector de ADN (por ejemplo, Wu y col., J. Biol. Chem., 1992, 267: 963-967; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 1988, 263: 14621-14624; Solicitud de Patente Canadiense N° 2.012.311; Williams y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991, 88: 2726-2730). Tambien pueden usarse enfoques de suministro de ADN mediado por receptor (Curiel y col., Hum. Gene Ther., 1992, 3: 147-154; Wu y Wu, J. Biol. Chem., 1987, 262: 4429-4432). Las Patentes de Estados Unidos N° 5.580.859 y 5.589.466 desvelan suministro de secuencias de ADN exogenas, libres de agentes facilitadores de la transfeccion, en un mairnfero. Recientemente, se ha descrito una tecnica de transferencia de ADN in vivo de alta eficacia, de tension relativamente baja, denominada electrotransferencia (Mir y col. C.P. Acad. Sci., 1988, 321: 893; Publicaciones de PCT N° WO 99/01157; WO 99/01158; WO 99/01175). Se conocen en la tecnica agentes facilitadores de la transfeccion e incluyen bupivicama y otros anestesicos locales (por ejemplo, vease Patente de Estados Unidos N° 5.739.118) y poliaminas cationicas (como se ha publicado en la Solicitud de Patente Internacional WO 96/10038).
Sistemas de expresion bacteriana y plasmidos
La presente divulgacion tambien proporciona una molecula de ADN recombinante, tal como un vector o plasmido, que comprende una secuencia de control de la expresion que tiene secuencias promotoras y secuencias iniciadoras y una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido de la presente invencion, localizandose la secuencia de nucleotidos 3' de las secuencias promotora e iniciadora. En otro aspecto mas, la divulgacion proporciona un vehmulo
de clonacion de ADN recombinante capaz de expresar un polipeptido 2086 que comprende una secuencia de control de la expresion que tiene secuencias promotoras y secuencias iniciadoras, y una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido 2086, localizandose la secuencia de nucleotidos 3' de las secuencias promotora e iniciadora. En un aspecto adicional, se proporciona una celula huesped que contiene un vehnculo de clonacion de ADN 5 recombinante y/o una molecula de ADN recombinante como se ha descrito anteriormente. Se conocen bien en la tecnica secuencias de control de la expresion adecuadas y combinaciones de vehnculo de clonacion/celula huesped, y se describen como ejemplo, en Sambrook y col. (1989).
Una vez que se han construido vehnculos de clonacion de ADN recombinante y/o celulas huesped que expresan un polipeptido deseado de la presente invencion transformando, transfectando e infectando dichos vehnculos de 10 clonacion o celulas huesped con plasmidos que contienen el polinucleotido 2086 correspondiente, se cultivan vehnculos de clonacion o celulas huesped en condiciones tales que se expresen los polipeptidos. El polipeptido se afsla despues sustancialmente libre de componentes de la celula huesped contaminantes por tecnicas bien conocidas por los expertos en la materia.
Los siguientes ejemplos se incluyen para demostrar realizaciones preferidas de la invencion. Debena apreciarse por 15 los expertos en la materia que las tecnicas desveladas en los ejemplos a continuacion representan tecnicas que se ha descubierto por los inventores que funcionan bien en la practica de la invencion, y por lo tanto pueden considerarse que constituyen modos preferidos para su practica. Sin embargo, los expertos en la materia debenan apreciar, a la vista de la presente divulgacion, que pueden realizarse muchos cambios en las realizaciones espedficas que se desvelan y obtener aun un resultado parecido o similar.
20 Ejemplos
Ejemplo 1
Identificacion de un extracto de proteina de membrana de Neisseria capaz de inducir anticuerpos bactericidas contra cepas heterologas:
Haciendo referencia a la Tabla II posterior, se ha mostrado que las preparaciones de proteina de membrana externa 25 sin LOS inducen anticuerpos bactericidas. Estos anticuerpos se dirigen con frecuencia hacia la PorA de la cepa respectiva. Las preparaciones de membrana externa sin LOS de la cepa meningococica del serogrupo B 8529 (B:l5:P1.7b.3) son poco habituales de esta manera porque inducen inesperadamente anticuerpos bactericidas para varias cepas heterologas.
TABLA II
- Actividad BC de anti-sOMP contra diferentes cepas de N. meningitidis
- Anti-suero Semana 6
- H44/76 5315 H355 M982 880049 8529* NMB
- Serosubtipo
- P1.7,16 P1.5 P1.15 P1.9 P1.4 P1.3 P1.5,2
- sOMP H44/76 25 p,g QS-21 20 p,g
- 1.000 < 50 < 50 < 50 < 50 980 < 50
- sOMP 5315 25 p,g QS-21 20 p,g
- 50 < 50 <50 < 50 < 50 2170 < 50
- sOMP H355 25 p,g QS-21 20 p,g
- < 50 < 50 450 < 50 < 50 860 < 50
- sOMP M982 25 p,g QS-21 20 p,g
- 92 < 50 < 50 300 < 50 1100 < 50
- sOMP 880049 25 p,g QS-21 20 p,g
- 50 < 50 < 50 < 50 < 50 1190 < 50
- sOMP 8529 25 p,g QS-21 20 p,g
- 1.000 < 50 450 50 215 >4050 (81,7) < 50
- sOMP 2996 25 p,g QS-21 20 p,g
- < 50 < 50 < 50 < 50 < 50 790 148
- Suero de control de celula completa 25 ^g 3DMPL 25 ^g
- 450 50 100 500 150 ■gx O (ft O 952
30
Para facilitar el aislamiento y caracterizacion del antigeno o los antigenos responsables de la induccion de anticuerpos bactericidas heterologos, los inventores intentaron identificar que detergente extrafa de forma optima el antigeno o los antfgenos.
Cepas y condiciones de cultivo
35 Se sembro en estnas la cepa 8529 N. meningitidis de un frasco congelado en una placa GC. (La cepa meningococica 8529 se recibio de The RIVM, Bilthoven, Pafses Bajos). La placa se incubo a 36 C/CO2 5 % durante 7,5 h. Se usaron varias colonias para inocular un matraz que contema 50 ml de medio de Frantz modificado + complemento de GC. El matraz se incubo en un agitador al aire a 36 °C y se agito a 200 RPM durante 4,5 h. Se
usaron 5 ml para inocular un matraz de Fernbach que contema 450 ml de medio Frantz modificado + complemento de GC. El matraz se incubo en un agitador al aire a 36 °C y se agito a 100 RPM durante 11 h. Se usaron los 450 ml para inocular 8,5 l de medio de Franz modificado + complemento de GC en un fermentador de 10 l.
Composicion del medio de Franz modificado:
- Acido glutamico
- 1,3 g/l
- Cistema
- 0,02
- Fosfato sodico, dibasico, 7 hidrato
- 10
- Cloruro potasico
- 0,09
- Cloruro sodico
- 6
- Cloruro de amonio
- 1,25
- Extracto de levadura dializado (YE)
- 40 ml
5 (YE soln. 25 % dializado frente a 5 volumenes de dH2O durante una noche, despues esterilizado por autoclave) Complemento de GC 100X, esterilizacion por filtrado
- Dextrosa
- 400 g/l
- Acido glutamico
- 10
- Cocarboxilasa
- 0,02
- Nitrato ferrico
- 0,5
Los siguientes parametros se controlaron durante la fermentacion: Temperatura = 36 °C; pH = 7,4; Oxfgeno Disuelto = 20 %. Se anadieron varias gotas de antiespumante P-2000 para controlar la formacion de espuma. El cultivo se 10 dejo crecer hasta la fase estacionaria. Se recogieron celulas por centrifugacion a DO650 = 5,25. Se recogen tfpicamente un total de 100-300 gramos de pasta de celulas humeda de ~8,5 l de cultivo.
Purificacion parcial de fracciones de proteinas de membrana externa de meningococos que inducen anticuerpos bactericidas heterologos:
Se suspendieron 100 g de peso humedo de las celulas, hasta un volumen cinco veces el peso humedo, con HEPES- 15 NaOH 10 mM, pH 7,4, Na2EDTA 1 mM y se lisaron por pase a traves de un microfluidificador 110Y equipado con una camara a ~124,07 Mpa. El lisado celular se clasifico y la envoltura celular se aislo por centrifugacion a 300.000 x g durante 1 hora a 10 °C. Las envolturas celulares se lavaron 2X con el mismo tampon por suspension con un homogeneizador seguido de centrifugacion como anteriormente. Las envolturas celulares se extrajeron despues con 320 ml de Triton X-100 1 % (p/v) en HEPES-NaOH 10 mM, pH 7,4, MgCh 1 mM. En referencia a la Tabla III 20 posterior, los resultados de la extraccion con detergente diferencial secuencial usando Triton X-100 y Zwittergent 314 seguido de inmunizacion de ratones, permitio a los inventores determinar que los extractos de Triton extrafan optimamente el candidato o los candidatos de interes. Este extracto de Triton X-100, que induda respuestas de anticuerpos bactericidas contra 4 de las cinco cepas enumeradas en la tabla III, se fracciono despues por isoelectroenfoque preparatorio (IEF) en una unidad BioRad Rotophor. Las concentraciones de anfolito fueron del 1 25 %, pH 3-10, mezclado con 1 %, pH 4-6. Como se muestra en la Tabla III, se ha descubierto que varias fracciones
inducen una respuesta bactericida heterologa. Las fracciones obtenidas de IEF, que se centraron en el intervalo de pH 5,5-7,0, indujeron una respuesta heterologa a la mayona de las cepas como se determina por el ensayo bactericida. Las fracciones de IEF agrupadas se concentraron y se retiraron los anfolitos por precipitacion con etanol. Se consiguio una purificacion adicional adsorbiendo algunas de las proteinas obtenidas en el intervalo de pH 30 de aproximadamente 5,5-7,8 en una columna de intercambio anionico y comparando la actividad bactericida obtenida de inmunizar a los ratones con las proteinas adsorbidas y no adsorbidas. En referencia de nuevo a la Tabla II, aunque muchas proteinas se adsorbieron en la resina de intercambio anionico, las proteinas que no se adsorbieron por la columna indujeron mas anticuerpos bactericidas heterologos.
TABLA III
- CB™ de la cepa diana
- Procedimiento
- Fraccion H44/76 880049 H355 539* M982
- sOMP sin LOS
- 1.000 215 450 NC 50
(continuacion)
- CB™ de la cepa diana
- Procedimiento
- Fraccion H44/76 880049 H355 539* M982
- Detergente Extracciones
- Extracto citoplasmatico 200 NT NT NT NT
- TX-100
- >800 >800 >800 >800 <25
- Zwittergent 3-12
- 400 >25 100 400 <25
- Zwittergent 3-14
- <25 NT NT NT NT
- Zw.3-14 + NaCl
- <25 NT NT NT NT
- Sarcosilo
- <25 NT NT NT NT
- Zw.3-14 + calor
- <25 NT NT NT NT
- IEF Preparatorio
- Fracciones 1-3 (pH 2,3-3,9) 50 NT NT NT NT
- Fraccion 4 (pH 4,1)
- >800 <25 100 <25 NT
- Fraccion 5 (pH 4,3)
- >800 <25 100 200 NT
- Fraccion 6 (pH 4,5)
- 400 NT NT NT NT
- Fraccion 7 (pH 4,8)
- <25 NT NT NT NT
- Fracciones 8-9 (pH 5,0-5,3)
- <25 NT NT NT NT
- Fracciones 10-17 (pH 5,5-7,8)
- >800 200 <800 <800 NT
- Intercambio anionico
- Adsorbida 400 NT 100 100 NT
- No adsorbida
- >6.400 NT <800 <800 NT
- NT: no ensayado *El aislado cimico 539 es una cepa homologa de 8529, aislada del mismo brote
Como se muestra en la FIG. 1A, estaban presentes dos protemas principales en la fraccion no adsorbida como se determino por SDS-PAGE. Para identificar estas protemas, se realizaron dos tipos de analisis. Un analisis fue 5 realizar degradacion proteolftica limitada (Vease FIG. 1A y FIG. 1B) seguido de aislamiento de peptidos y secuenciacion de protemas directa. El otro analisis fue realizar SDS-PAGE seguido de escision en gel, digestion proteolftica y EM-Cl/EM (Espectrometna de Masas en Tandem con Cromatograffa Lfquida), (vease FIG. 3) para obtener informacion espectral de masas sobre los componentes de las preparaciones de interes. (Vease procedimientos de mapeo y secuenciacion de peptidos descritos posteriormente en esta seccion).
10 La secuencia genomica de N. meningitidis A Sanger usando los procedimientos y algoritmos descritos en Zagursky y Russell, 2001, BioTechniques, 31:636-659. Este analisis de extraccion produjo mas de 12.000 posibles Marcos Abiertos de Lectura (ORF). Tanto los datos de secuenciacion directa como los datos espectrales de masas descritos anteriormente indicaron que los componentes principales de la fraccion no adsorbida fueron los productos de varias ORF presentes en un analisis de la base de datos de Sanger. Las tres protemas predominantes identificadas por 15 esta metodologfa corresponden a las ORF 4431, 5163 y 2086 (vease FIGS. 1B y 3).
Aunque la ORF 4431 fue la protema mas predominante identificada en las fracciones, los anticuerpos de raton para 4431 lipidado recombinante no fueron bactericidas y no proporcionaron una respuesta protectora en un modelo animal. El analisis adicional de ORF 5136 esta en progreso.
El segundo componente mas predominante de las preparaciones descritas en el presente documento corresponde al 20 producto de OrF 2086.
Procedimientos de inmunogenicidad:
Preparacion de antisueros:
Excepto donde se indique, se formularon composiciones/vacunas de protemas con 25 |ig de protema total y se anadieron 20 |ig de QS-21 como adyuvante. Se administro una dosis de 0,2 ml por inyeccion subcutanea (cadera) a
5
10
15
20
25
30
35
40
45
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55
ratones Swiss-Webster hembra de 6-8 semanas de edad en la semana 0 y 4. Se recogieron muestras de sangre en la semana 0 y 4, y se realizo un sangrado de exsanguinacion final en la semana 6.
Ensayo bactericida:
Se realizaron ensayos bactericidas esencialmente como se ha descrito (Vease Mountzouros y Howell, 2000, J. Clin. Microbiol. 38(8)2878-2884). Los tttulos bactericidas dependientes de anticuerpo mediados por complemento para el SBA se expresaron como el redproco de la mayor dilucion del suero de ensayo que destruyo > 50 % de las celulas diana introducidas en los ensayos (tftulo CB50).
Procedimientos usados para identificar la protema 2086:
Escision de bromuro de cianogeno y secuenciacion directa de fragmentos:
Escision con bromuro de cianogeno de la Fraccion No adsorbida por Intercambio Anionico (AEUF). La AEUF se precipito con etanol fno al 90 % y se solubilizo con bromuro de cianogeno 10 mg/ml en acido formico al 70 % hasta una concentracion de protemas de 1 mg/ml. La reaccion se realizo durante una noche a temperatura ambiente en la oscuridad. Los productos escindidos se secaron por vacm rapido, y el sedimento se solubilizo con HE/TX-100 reducido al 0,1 %. Se uso SDS-PAGE seguido de secuenciacion de aminoacidos N terminal para identificar los componentes de esta fraccion.
Digestion con proteasa/fase inversa/secuenciacion N terminal para identificar componentes:
La AEUF se digirio con GluC (V8), LysC o ArgC. La relacion de protema y enzima fue de 30 |ig de protema frente a 1 |ig de enzima. La digestion se llevo a cabo a 37 °C durante una noche. La mezcla de protemas digerida (30 |ig) se paso sobre una columna de Aquapore RF-300 de siete micrometres y se eluyo con un gradiente de acetonitrilo 1095 % en acido trifluoroacetico 0,1 %, y los picos se recogieron manualmente. Tambien se proceso un blanco sin protemas, y los picos de este se restaron del cromatograma de muestras. Los picos que aparedan solamente en el procesamiento de muestras se analizaron por espectrometro de masas, y las muestras que proporcionan una masa transparente se analizaron con respecto a secuenciacion de aminoacidos N terminal.
Secuenciacion de aminoacidos N terminal:
Para bandas escindidas de una mancha de transferencia, la muestra de protemas se transfiere de un gel de SDS a una membrana de PVDF, se tine con Negro Amido (acido acetico 10 %, negro amido 0,1 % en agua desionizada) y se destine en acido acetico al 10 %. La banda proteica deseada se escinde despues de los diez carriles usando un escalpelo limpiado con metanol o cuchillo mini-Exacto y se coloca en el cartucho de reaccion del Secuenciador de Protemas Applied Biosystems 477A. Para secuenciacion directa de muestras en solucion, se ensambla el cartucho Prosorb y el PVDF se humecta con 60 |il de metanol. El PVDF se aclara con 50 |il de agua desionizada y la muestra (50 |il) se carga en el PVDF. Despues se usan 50 |il de agua desionizada para aclarar la muestra, se perfora el PVDF Prosorb, se seca, y se coloca en el cartucho de reaccion del Secuenciador de Protemas Applied Biosystems 447A. Para ambos procedimientos, el Secuenciador N terminal Applied Biosystems se procesa despues en condiciones de transferencia optimas durante 12 o mas ciclos (1 ciclo de Blanco, 1 ciclo de Patron y 10 o mas ciclos para la identificacion de restos deseados) y se realiza deteccion de aminoacidos-PTH en el Analizador de PTH Applied Biosystems 120A. Los ciclos se recogen tanto en un grabador de diagrama analogico como digitalmente mediante el programa informatico instrumental. Se realiza asignacion de aminoacidos usando los datos analogicos y digitales por comparacion de un conjunto de patrones de aminoacidos-PTH y sus tiempos de retencion respectivos en el analizador (los restos de cistema se destruyen durante la conversion y no se detectan). Puede obtenerse informacion de multiples secuencias de un unico resto y se realizan asignaciones de primario frente a secundario basandose en la intensidad de senal.
EM-CL/EM
Las muestras de protemas purificadas por IEF se analizaron por electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS. Las protemas se visualizaron por tincion con azul de Coomaasie, y las bandas de interes se escindieron manualmente, despues se redujeron, se alquilaron y se digirieron con tripsina (Promega, Madison, WI) in situ usando un robot de digestion tnptica en gel automatico (1). Despues de la digestion, los extractos peptfdicos se concentraron hasta un volumen final de 10-20 |il usando un Concentrador Savant Speed Vac (ThermoQuest, Holdbrook, NY).
Se analizaron extractos peptfdicos en una HPLC de fase inversa de microelectropulverizacion automatica. Brevemente, la interfaz de microelectropulverizacion consistio en una aguja de pulverizacion de sflice fusionada con Picofrit, de 50 cm de longitud por 75 |im DI, 8 |im de diametro de orificio (New Objective, Cambridge MA) envasada con perlas de fase inversa C18 de 10 |im (YMC, Wilmington, NC) hasta una longitud de 10 cm. La aguja Picofrit se monto en un soporte de fibra optica (Melles Griot, Irvine, CA) sostenido en una base construida internamente situada en el frontal del detector de espectrometro de masas. La parte de atras de la columna se conecto a traves de una union de titanio para proporcionar una conexion electrica para la interfaz de electropulverizacion. La union se conecto con un tramo de tubos capilares de sflice fusionados (FSC) con un aparato de automuestreo FAMOS (LC- Packings, San Francisco, CA) que se conecto con una bomba de disolvente HPLC (ABI 140C, Perkin-Elmer,
Norwalk, CT). La bomba de disolvente de HPLC suministro un flujo de 50 |il/min que se redujo a 250 nl/min usando una te de division microestrecha PEEK (Upchurch Scientific, Oak Harbor, WA), y despues se suministro al aparato de automuestreo usando una lmea de transferencia de FSC. La bomba de LC y el aparato de automuestreo se controlaron cada uno usando sus programas de usuario internos. Se insertaron muestras en frascos de 5 automuestreo de plastico, se sellaron y se inyectaron usando un asa de muestras de 5 |il.
Espectrometria de masas-HPLC microcapilar:
Se separaron peptidos extrafdos de productos de digestion en gel por el sistema de HPLC de microelectropulverizacion usando un gradiente de 50 minutos de disolvente B 0-50 % (A: HOAC 0,1 M, B: MeCN al 90 %/HOAC 0,1 M). Se realizaron analisis de peptidos en un espectrometro de masas de trampa ionica Finnigan 10 LCQ (ThermoQuest, San Jose, CA) actuando a una tension de pulverizacion de 1,5 kV, y usando una temperatura de capilar caliente de 150 °C. Los datos se adquirieron en modo EM/EM automatico usando el programa informatico de adquisicion de datos proporcionado con el instrumento. El procedimiento de adquisicion inclrna 1 exploracion de EM (375-1200 m/z) seguido de exploracion EM/EM de los tres iones mas abundantes en la exploracion de EM. Se emplearon las funciones de exclusion dinamica y exclusion de isotopos para aumentar el numero de iones 15 peptfdicos que se analizaban (ajustes: 4 uma = anchura de exclusion, 3 min = duracion de la exclusion, 30 s = duracion pre-exclusion, 3 uma = anchura de exclusion de isotopos). Se realizo analisis automatico de los datos EM/EM usando el algoritmo informatico SEQUEST incorporado en el paquete de analisis de datos Finnigan Bioworks (ThermoQuest, San Jose, CA) usando la base de datos de protemas derivada del genoma completa de N. meningitidis (de Sanger). Los resultados del estudio se ilustran en la FIG. 3.
20 Ejemplo 2
Clonacion de P2086 lipidado recombinante (rLP2086):
A.) Secuencia lider nativa:
Materiales de partida:
El gen de ORF 2086 se amplifico por PCR de un aislado clmico de una cepa de Neisseria meningitidis de serogrupo 25 B designada 8529. El serogrupo, serotipo y serosubtipo de esta cepa se muestran entre parentesis; 8529 (B:15, P1:7b,3). Esta cepa meningococica se recibio del RIVM, Bilthoven, Pafses Bajos. La secuencia genica de la protema 2086 madura de la cepa meningococica 8529 se proporciona en el presente documento como SEC ID N°: 212.
Amplificacion por PCR y estrategia de clonacion:
Una inspeccion visual de ORF 2086 indico que este gen tema una secuencia senal de lipoprotema potencial. El 30 analisis adicional usando un algoritmo de Lipoprotema de Modelo de Markov oculto patentado confirmo que ORF 2086 contema una secuencia senal de lipoprotemas. Para expresar de forma recombinante P2086 en una conformacion mas de tipo nativo, se disenaron cebadores oligonucleotfdicos para amplificar el gen de longitud completa con la secuencia senal de lipoprotema intacta y se basaron en un analisis de la secuencia de Sanger para N. meningitidis A ORF 2086, (cebador 5' CT ATT CTG CAT ATG ACT AGG AGC y cebador 3' - GCGC GGATCC 35 TTA CTG CTT GGC GGC AAG ACC), que son SEC ID N° 304 (Compuesto N° 4624) y SEC ID N° 303 (Compuesto N° 4623), respectivamente (vease tambien Tabla IV en el presente documento). El gen 2086 gene se amplifico por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) [termociclador ABI 2400, Applied Biosystems, Foster City, CA] de la cepa N. meningitidis 8529. El producto amplificado de tamano correcto se ligo y clono en pCR2.1-TOPO (Invitrogen). El ADN plasmfdico se digirio por restriccion con Ndel y BamHI, se purifico en gel y se ligo en el vector pET-27b(+) 40 (Novagen).
Se sintetizaron cebadores oligonucleotfdicos descritos en el presente documento en un sintetizador de oligonucleotidos PerSeptive Biosystems, Applied Biosystems, Foster City CA, usando qrnmica de p- cianoetilfosforamidita, Applied Biosystems, Foster City CA. Los cebadores usados para amplificacion por PCR de las familias genicas de ORF 2086 se enumeran en la Tabla IV, que muestra ejemplos no limitantes de cebadores de la 45 presente invencion.
TABLA IV: CEBADORES
- SEC ID N°. (Compuesto N°)
- Cebado r Secuencia Sitios de restriccion
- 303 (4623)
- Inverso GCGCGGATCCTTACTGCTTGGCGGCAAGA CC BamHI
- 304 (4624)
- Directo CTATTCTGCATATGACTAGGAGC NdeI
(continuacion)
- 305 (4625)
- Directo AGCAGCGGAGGCGGCGGTGTC
- 306 (5005)
- Directo TGCCGATGCACTAACCGCACC
- 307 (5007)
- Inverso CGTTTCGCAACCATCTTCCCG
- 308 (5135)
- Inverso GAGATCTCACTCACTCATTACTGCTTGGC GGCAAGACCGATATG BglII
- 309 (5658)
- Directo GCGGATCCAGCGGAGGGGGTGGTGTCGCC BamHI
- 310 (5660)
- Inverso GCGCATGCTTACTGCTTGGCGGCAAGACC GATATG SphI
- 311 (6385)
- Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGAAGC BamHI
- 312 (6406)
- Directo GCGCAGATCTCATATGAGCAGCGGAGGGG GTGGTGTCGCCGCCGAYATWGGTGCGGGG CTTGCCG BglII y NdeI
- 313 (6470)
- Directo CTATTCTGCGTATGACTAG
- 314 (6472)
- Inverso GTCCGAACGGTAAATTATCGTG
- 315 (6473)
- Directo GCGGATCCAGCGGAGGCGGCGGTGTCGCC BamHI
- 316 (6474)
- Directo GAGATCTCATATGAGCAGCGGAGGCGGCG GAAGC BglII y NdeI
- 317 (6495)
- Directo GACAGCCTGATAAACC
- 318 (6496)
- Inverso GATGCCGATTTCGTGAACC
- 319 (6543)
- Inverso GCGCATGCCTACTGTTTGCCGGCGATG SphI
- 320 (6605)
- Inverso GAGATCTCACTCACTCACTACTGTTTGCC GGCGATGCCGATTTC BglII
- 321 (6721)
- Directo GCGCAGATCTCATATGAGCAGCGGAGGCG GCGGAAGCGGAGGCGGCGGTGTCACCGCC GACATAGGCACG BglII y NdeI
Expresion de lipoproteinas de rLP2086 utilizando secuencia lider nativa:
En referencia a la FIG. 5, se transformo/transfecto o infecto con el plasmido pPX7340 celulas huesped BLR(DE3) pLysS (Life Sciences). Se selecciono un transformante y se inoculo en 50 ml de Caldo de Cultivo Terrific que 5 contema glucosa al 2 %, kanamicina (30 |ig/ml), cloranfenicol (30 |ig/ml) y tetraciclina (12 |ig/ml). La DO600 para el
cultivo de una noche fue de 6,0. El cultivo de una noche se diluyo en 1 litro de Caldo de Cultivo Terrific con glicerol 1 % y los mismos antibioticos. La DO600 de partida fue de 0,4. Despues de 2 horas la DO600 fue de 1,6 y se tomo una muestra pre-inducida. Se centrifugaron celulas equivalentes a una DO600 = 1 y se retiro el sobrenadante. El sedimento de celulas completas se resuspendio en 150 |ig de tampon Tris-EDTA y 150 |il de tampon de muestras 10 SDS-PAGE 2x. Se anadio IPTG a una concentracion final de 1 mM. Despues de 3,5 horas se tomo una muestra post-inducida como se describe y se analiza en SDS-PAGE (Vease FIG. 4).
Purificacion de rLP2086:
El rLP2086 se solubilizo de E. coli despues de extraccion con detergente diferencial. A diferencia del P2086 en su ambiente nativo, el rLP2086 no se solubilizo significativamente por Triton X-100 o Zwittergent 3-12. El grueso del 15 rLP2086 se solubilizo con sarcosilo, lo que indica que interacciona con los componentes de membrana externa de E.
coli de forma diferente a como lo hace en N. meningitidis. Una vez solubilizado el rLP2086 se purifico de forma similar a la protema nativa porque muchas de las protemas de E. coli contaminantes pudieron retirarse por adsorcion en una resina de intercambio anionico a pH 8. A pesar de estar mas de media unidad de pH por encima de su pi
teorico, el rLP2086 permanece no adsorbido a pH 8. Se consiguio purificacion adicional por adsorcion del rLP2086 en una resina de intercambio cationico a pH 4,5.
La homogeneidad del rLP2086 se muestra en la FIG. 2 despues de SDS-PAGE. Se determino por analisis espectral de masas MALDI-TOF que la masa de rLP2086 era 27.836. Esta masa difiere de la masa teorica de 27.100 por 736, 5 que se aproxima a la masa de la modificacion lipfdica N terminal comun a las lipoprotemas bacterianas. Tanto rLP2086 como la nativa parecen ser lipoprotemas de membrana externa. Los intentos con secuenciacion N terminal se bloquearon y esto es coherente con la modificacion terminal.
Procedimientos de purificacion:
Se resuspendieron sedimentos congelados de celulas BLR DE3 pLysS que expresaban P2086 en HEPES-NaOH 10 10 mM/EDTA 1 mM/inhibidor de proteasa Pefabloc SC 1 pg/ml (Roche) pH 7,4 (HEP) a 20 ml/g de peso celular humedo y se liso por microfluidificador (Microfluidics Corporation Modelo 110Y). El lisado celular se centrifugo a 150.000 x g durante una hora. El sedimento se lavo dos veces con HEP y se centrifugo dos veces, y el sedimento de membrana resultante se congelo durante una noche. El sedimento se solubilizo con HEPES-NaOH 10 mM/MgCl2 1 mM/TX-100 1 % pH 7,4 durante 30 minutos, seguido de centrifugacion a 150.000 x g durante 30 minutos. Esto se repitio tres 15 veces. El sedimento de membrana se lavo como anteriormente dos veces con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent 3-12 1 %, pH 8, seguido de dos lavados cada uno de Tris-HC 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent 3-12 1 % pH 8, y Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent 3-14 1 %/NaCl 0,5 M pH 8.
La rLP2086 se solubilizo despues con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/sarcosilo 1 % pH 8. Este extracto de sarcosilo se ajusto a Zwittergent 3-14 1 % (Z3-14) y se dializo dos veces frente a un exceso 30 veces de Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 20 mM/Z3-14 1 %. El extracto de rLP2086 dializado se precipito con etanol al 90 % para retirar el sarcosilo restante, y
se solubilizo con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Z3-14 1 % pH 8 (TEZ). Se retiro el material insoluble por centrifugacion, el sobrenadante se paso sobre una columna de cromatograffa de intercambio anionico y se recogio rLP2086 en la fraccion no unida. El material no unido se dializo despues dos veces frente a un exceso 30 veces de NaAc 25 mM/Z3-14 1 % pH 4,5 y se paso sobre una columna de cromatograffa de intercambio cationico. La rLP2086 25 se eluyo con un gradiente de NaCl de 0-0,3 M y se analizo por SDS-PAGE (tincion de Coomassie). Se determino que el grupo de rLP2086 era 84 % puro por densitometna por laser.
Reactividad de superficie y actividad bactericida de antisueros para la Subfamilia B de rLP2086
En referencia a la Tabla VII, los antisueros para rLP2086 purificada de la cepa 8529 de la Subfamilia B, demostraron reactividad de superficie para las diez cepas de Subfamilia B 2086 ensayadas por ELISA de celulas completas. Se 30 detecto actividad bactericida contra nueve de diez cepas de Subfamilia B 2086 que expresaban antfgenos de serosubtipo heterologo, PorA. Estas cepas son representativas de cepas que provocan enfermedad meningococica de serogrupo B en toda Europa occidental, America, Australia y Nueva Zelanda. La unica cepa que no se destruyo en el ensayo bactericida, 870227, reacciono fuertemente con los sueros anti-rLP2086 (Subfamilia B) por ELISA de celulas completas, lo que indica que esta cepa expresa una protema con epftopos en comun con P2086.
35 Las cepas de Subfamilia A 2086 enumeradas en la Tabla VII tambien se ensayaron con respecto a reactividad de superficie por ELISA de celulas completas. Dos de tres de estas cepas paredan tener un nivel de reactividad muy bajo, lo que indica que algunas cepas de Subfamilia A 2086 pueden no tener reactividad cruzada con anticuerpos inducidos para Subfamilia B de rLP2086. El procedimiento de amplificacion por PCR usado para identificar el gen de Subfamilia B de 2086 de la cepa 8529 tambien se realizo en las cepas 870446, NMB y 6557. No se detecto ningun 40 producto amplificado por PCR de Subfamilia B de 2086.
Procedimientos de inmunogenicidad:
Preparacion de antisueros:
Se formularon vacunas como se ha descrito previamente en el Ejemplo 1. Sin embargo, se uso una dosis de 10 pg.
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de celulas completas:
45 Se diluyeron suspensiones de celulas completas de N. meningitidis hasta una densidad optica de 0,1 a 620 nm en fosfato 0,01 M esteril, NaCl 0,137 M, KCl 0,002 M (PBS). A partir de esta suspension, se anadieron 0,1 ml a cada pocillo de placas Nunc Bac T de 96 pocillos (Cat. N° 2-69620). Las celulas se secaron en las placas a temperatura ambiente durante tres dfas, despues se cubrieron, se invirtieron y se almacenaron a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con tampon de lavado (Tris-HCl 0,01 M, NaCl/KCl 0,139 M, dodecilpoli(oxietilerenglicoleter)” 0,1 % n=23 (Brij- 50 35®, disponible de ICI Americas, Inc., Wilmington, Delaware), pH 7,0-7,4). Se prepararon diluciones de antisueros
en PBS, Tween-20 0,05 %/Azida y se transfirieron 0,1 ml a las placas revestidas. Las placas se incubaron durante dos horas a 37 °C. Las placas se lavaron tres veces en tampon de lavado. Se diluyo AP anti-IgG de raton de cabra (Southern Biotech) a 1:1500 en PBS/Tween-20 0,05 %, se anadieron 0,1 ml a cada pocillo, y se incubaron las placas a 37 °C durante dos horas. Las placas se lavaron (como anteriormente). Se preparo solucion de sustrato diluyendo 55 p-nitrofenil fosfato (Sigma) en dietanolamina 1 M/MgCl2 0,5 mM hasta 1 mg/ml. Se anadio sustrato a la placa a 0,1 ml por pocillo y se incubo a temperatura ambiente durante una hora. La reaccion se detuvo con 5 pl/pocillo de NaOH
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
3 N y las placas se leyeron a 405 nm con una referencia de 690 nm.
B.) Secuencia Lider P4:
Amplificacion por PCR y Estrategia de Clonacion:
Para optimizar la expresion de rLP2086, el gen 2086 se clono detras de la secuencia senal P4 de Haemophilus influenzae no tipificable (Green y col., 1991). Se enumeran cebadores utilizados para la clonacion de lipoprotemas en la Tabla IV y se identifican por los numeros de compuesto: 5658, 5660, 6473, 6543 y 6385. Se amplifico ORF 2086 de la cepa 8529 de N. meningitidis B usando cebadores con los siguientes numeros de compuesto 5658 y 5660. Se amplifico ORF 2086 de la cepa CDC1573 del serogrupo B de N. meningitidis usando cebadores con los siguientes numeros de compuestos 6385 y 5660. Se amplifico ORF 2086 de la cepa 2996 del serogrupo B de N. meningitidis usando cebadores con los siguientes numeros de compuesto 6473 y 6543. Los cebadores N terminales (5') se disenaron para ser homologos de la region madura del gen 2086 (comenzando en el resto de serina en la posicion de aminoacido 3 justo cadena abajo de la cistema). El sitio de restriccion BamHI (GGATTC) se incorporo en el extremo 5' de cada cebador N terminal y dio como resultado la insercion de un resto de glicina en la protema madura en la posicion de aminoacido 2. Los cebadores C terminales (3') se disenaron para ser homologos del extremo C terminal del gen 2086 e incluyo el codon de Parada asf como un sitio SphI para fines de clonacion. El fragmento amplificado de cada cepa de N. meningitidis B se clono en un vector intermedio y se exploro por analisis de secuencia.
Se dirigio ADN plasmfdico de clones correctos con enzimas de restriccion BamHI y SphI ((New England Biolabs, (NEB)). Se eligio un vector designado pLP339 (proporcionado por el cesionario de los solicitantes) como el vector de expresion. Este vector utiliza la cadena principal de pBAD18-Cm (Beckwith y col., 1995) y contiene la secuencia senal de lipoprotema P4 y el gen P4 de Haemophilus influenzae no tipificable (Green y col., 1991). El vector pLP339 se digirio parcialmente con la enzima de restriccion BamHI y despues se sometio a digestion con SphI. Los fragmentos de 2086 amplificados (BamHI/Sphl) se ligaron cada uno por separado en el vector pLP339 (BamHI/Sphl parcial). Esta estrategia de clonacion coloca el gen 2086 maduro detras de la secuencia senal de lipoprotema P4. El sitio BamHI permanece en el punto de union de clonacion entre la secuencia senal P4 y el gen 2086 (vease la construccion plasmfdica mostrada en la FIG. 7). Lo siguiente es un ejemplo de la secuencia en el punto de union de clonacion de BamHI:
[secuencia senal P4] - TGT GGA TCC - [secuencia de acido nucleico madura 2086 restante]
[secuencia senal P4] - Cys Gly Ser - [secuencia de aminoacidos madura 2086 restante]
En referencia a la FIG. 7, cada fragmento amplificado se clono en un vector pBAD18-Cm modificado que contema la secuencia lfder P4. Se realizo fermentacion en pPX7343 de BLR de E. coli que expresa rP4LP2086 (2086 lipidado P4 recombinante) para intentar aumentar la densidad celular anadiendo glucosa adicional. El fermentador se cargo con 10 l de medio Mmimo M9 completo, de acuerdo con Sambrook, complementado con glucosa al 1 %.
La concentracion inicial de glucosa en el fermentador fue de 45 g/l. El fermentador se inoculo hasta DO inicial de ~0,25. A ~DO 25, se anadio glucosa 20 g/l adicional. El cultivo se indujo con arabinosa al 1 % con agotamiento de glucosa a DO 63,4. La fermentacion continuo hasta 3 horas despues de la induccion. Se guardaron muestras a t=0, 1, 2, 3 despues de la induccion y la protema se cuantifico usando BSA. A t=3, el rendimiento proteico es ~0,35 g/l y protema celular total 7 %. Se recogio un total de 895 gramos de pasta celular humeda de ~10 l de cultivo.
Se realizo purificacion del rP4LP2086 usando los mismos procedimientos que se han descrito anteriormente en el Ejemplo 2, seccion A.
Ejemplo 3
Genetica del desarrollo para protema 2086 madura no lipidada:
Para evaluar adicionalmente la inmunogenicidad de la protema 2086, se realizaron clonacion y expresion de la forma no lipidada de P2086.
Amplificacion genica por PCR de la ORF 2086:
Se enumeran los oligonucleotidos usados para amplificacion por PCR del gen de 2086 no lipidada en la tabla de cebadores, Tabla IV. El gen 2086 de la cepa 8529 puede amplificarse con cebadores identificados por los numeros de compuesto 5135 y 6406 (SEC ID N°: 308 y 312, respectivamente), como se indica en la tabla. El gen 2086 de la cepa CDC1573 puede amplificarse con cebadores identificados por los numeros de compuesto 5135 y 6474 (SEC ID N°: 308 y 316, respectivamente). El gen 2086 de la cepa 2996 puede amplificarse con cebadores identificados por los numeros de compuesto 6406 y 6605 (SEC ID N°: 312 y 320, respectivamente).
Las caractensticas de estos cebadores incluyen un sitio de restriccion BgIII sintetico en cada cebador, un sitio de restriccion NdeI sintetico en los numeros de compuesto 6406 y 6474 y codones de terminacion en las tres fases de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
lectura estan presentes en los numeros de compuesto 5135 y 6605. Los numeros de cebadores 6406 y 6474 amplifican el gen 2086 con un ATG (Met) fusionado con el segundo codon amino terminal (ACG) que representa una sustitucion de un unico aminoacido (reemplaza TGC Cys) del polipeptido 2086 maduro.
El vector de clonacion de PCR fue TOPO-PCR2.1, Invitrogen, Valencia, CA.
El vector usado para expresar protema 2086 no lipidada fue pET9a de Novagen, Madison, WI.
La cepa de clonacion de E. colifue Top 10, Invitrogen, Carlsbad, CA.
La cepa de expresion de E. coli fue BLR(DE3)pLysS, Novagen, Madison, WI.
El medio de cultivo para fines de clonacion fue Caldo de Cultivo Terrific lfquido o agar, de acuerdo con Sambrook y col., con glucosa esteril 1 % que sustituye al glicerol, y el antibiotico apropiado (ampicilina o kanamicina).
La purificacion del plasmido fue con el Kit de Miniprep Qiagen Spin (Valencia, CA).
Preparacion de la cepa de produccion o lmea celular para expresion de 2086 no lipidada:
El gen 2086 se amplifico por reaccion en cadena de la polimerasa (PCR) [AmpliTaq y termociclador ABI 2400, Applied Biosystems, Foster City, CA] a partir de ADN cromosomico derivado de la cepa meningococica 8529. La amplificacion por PCR del gen 2086 utilizo dos cebadores oligonucleotfdicos en cada reaccion identificada por los numeros de compuesto 6474 y 5135 (SEC ID N°: 316 y 318, respectivamente). El producto de PCR 2086 amplificado se clono directamente en el vector de clonacion TOPO-PCR2.1 y se selecciono en agar de Caldo de Cultivo Terrific complementado con ampicilina 100 |ig/ml y X-Gal 20 |ig/ml. Se seleccionaron y cultivaron colonias blancas. Se preparo ADN plasmfdico usando un kit de miniprep Qiagen y los plasmidos se exploraron con respecto al inserto de fragmento de PCR. Se sometieron plasmidos de inserto de PCR a secuenciacion de ADN (qrnmica Big Dye en un secuenciador ABI377, Applied Biosystems, Foster City, CA).
Se digirieron los plasmidos que mostraban la secuencia de ADN correcta con enzima de restriccion BgIII y el fragmento de BglII se purifico en gel usando un kit de purificacion GeneClean II (Bio101, Carlsbad, CA). El fragmento de BgIII se clono en el sitio BamHI del vector de expresion pET9a. Los clones de pET9a/2086 se seleccionaron en placas de Caldo de Cultivo Terrific complementadas con kanamicina 30 |ig/ml. Se cultivaron clones resistentes a kanamicina y se preparo ADN plasirndico de miniprep. Los plasmidos se exploraron con respecto a la orientacion apropiada del gen 2086 en el sitio BamHI. Los plasmidos de orientacion correcta representan una fusion del antfgeno T7 con el extremo amino terminal del gen 2086 (rP2086T7). Estas fusiones genicas rP2086T7 se transformaron en BLR(DE3)pLysS, seleccionadas en placas de Caldo de Cultivo Terrific/Kan, cultivadas en Caldo de Cultivo Terrific e inducidas para que expresen la protema de fusion rP2086T7 con IPTG (isopropilo p-D- tiogalactopiranosido) 1 mM. La protema de fusion rP2086T7 se expreso a altos niveles.
Estos plasmidos de fusion se sometieron despues a una digestion de restriccion con NdeI, que suprime el antfgeno T7 y une el gen 2086 maduro directamente con el inicio ATG proporcionado por el vector. Estos plasmidos con NdeI suprimido se transformaron en celulas Top 10 y se seleccionaron en placas de Caldo de Cultivo Terrific/Kan. Los clones candidatos se cultivaron y se preparo ADN plasirndico de miniprep. El ADN plasirndico se sometio a secuenciacion de ADN para confirmar la delecion y la integracion de la secuencia genica de 2086. Estos plasmidos se representan por el mapa plasirndico designado pPX7328 (FIG. 6). Los plasmidos que representan la secuencia de aDn correcta se transformaron en BLR(DE3)pLysS, se seleccionaron en placas de Caldo de Cultivo Terrific/Kan, se cultivaron en Caldo de Cultivo Terrific y se indujo que expresaran la protema 2086 con IPTG. El vector pET9a no consiguio expresar la protema 2086 madura, en la cepa BLR(DE3)pLysS, cuando se retiro el marcador de T7.
Produccion de protema 2086 no lipidada:
Se uso ADN plasirndico purificado para transformar la cepa de expresion BLR(DE3)pLysS. Las celulas BLR(DE3)pLysS que portan los plasmidos son resistentes a kanamicina y puede inducirse que expresen altos niveles de protema PorA por la adicion de IPTG 1 mM. La protema de fusion rP2086T7 puede expresarse como cuerpos de inclusion insolubles en la lmea celular de E. coli BLR(DE3)pLysS a -40 % de protema total. Esta protema de fusion purificada se uso para inmunizar ratones y genero niveles significativos de anticuerpos bactericidas contra una cepa meningococica heterologa. (Vease Tabla V).
Mutagenesis de genes no lipidados 2086
Se realizo mutagenesis de cebadores de PCR en el extremo 5' del gen 2086. Se estan realizando estudios de expresion para determinar si el marcador T7 puede retirarse mostrando a la vez los altos niveles de expresion de rP2086T7 madura.
Purificacion de rP2086T7 no lipidada:
Se lisaron celulas E. coli BLR(DE3)pLysS que expresaban rP2086T7 no lipidada por microfluidificador en Hepes- NaOH 10 mM/EDTA 5 mM/Pefabloc sC 1 mM pH 7,4. El lisado celular se centrifugo despues a 18.000 x g durante
30 minutos. El sedimento de cuerpos de inclusion se lavo tres veces con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Triton X-100 1 % pH 8 seguido de centrifugacion cada vez a 24.000 x g durante 30 minutos. El sedimento de cuerpos de inclusion se lavo despues dos veces con Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/Zwittergent 3-14 1 % pH 8 seguido de centrifugacion cada vez a 24.000 x g durante 15 minutos. El sedimento de cuerpos de inclusion se solubilizo despues con Tris-HCl 5 50 mM/EDTA 5 mM/Urea 4 M pH 8 durante dos horas seguido de centrifugacion para retirar el material insoluble. El
sobrenadante (rP2086T7 solubilizado) se repartio en cuatro muestras iguales. Una muestra se ajusto a Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 250 mM/Urea 2 M pH 8 (sin detergente), una se ajusto a Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 250 mM/Urea 2 M/Triton X-100 hidrogenado 1 % pH 8 (TX-100), una se ajusto a Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 250 mM/Urea 2 M/Zwittergent 3-12 1 % pH 8 (Z3-12) y una se ajusto a Tris-HCl 50 mM/EDTA 5 mM/NaCl 250 10 mM/Urea 2 M/Zwittergent 3-14 1 % pH 8 (Z3-14) usando soluciones madre. Para retirar la urea, las muestras se dializaron hasta su complecion frente al tampon respectivo que no contema urea. Las muestras se dializaron despues hasta su complecion frente al tampon respectivo que no contema urea y NaCl 60 mM para reducir la concentracion de NaCl. Se retiro el material insoluble por centrifugacion a 2.000 x g durante 15 minutos, y el sobrenadante resultante (rP2086T7 replegada) se uso para experimentos adicionales. Se descubrio que la 15 homogeneidad de rP2086T7 era del 91-95 % como se determino usando SDS-PAGE tenido con Coomassie y densitometna por laser.
Procedimiento de inmunogenicidad - Como se ha descrito en el Ejemplo 2
Esta protema de fusion purificada se uso para inmunizar ratones y genero niveles significativos de anticuerpos bactericidas contra una cepa meningococica heterologa (Vease Tabla V a continuacion):
20 TABLA V: Titulos bactericidas de anticuerpo de raton inducido para rP2086T7
- SUERO DE RATON
- DESCRIPCION CEPA HETEROLOGA/H44/76
- AF780 semana 6
- r2086T7, 10 ug 3200
- Grupo de semana 0
- Suero pre-inmunitario 10
- AE203 semana 6
- rLP2086, 10 ug (control positivo)* 6400
- (*sueros de control positivo generados por inmunizacion de ratones con rP2086T7)
Ejemplo 4
Desarrollo de clones quimericos de ORF 2086
La region N terminal del gen 2086 de la cepa CDC-1573 contiene un segmento repetido no presente en el gen 2086 25 de las cepas 8529 y 2996 (vease FIG. 8). Parece que este segmento repetido es responsable de niveles aumentados de expresion de la protema 2086 recombinante de dos sistemas de expresion basados en E. coli (pET y pBAD). El nivel de expresion de protema recombinante del gen 2086 CDC-1573 fue significativamente mejor en los sistemas de expresion pET y pBAD en comparacion con los niveles de expresion recombinante del gen 2086 con las cepas 8529 y 2996 usando los mismos sistemas. La region N terminal del gen 2086 de las tres cepas es 30 relativamente homologa, excepto por este segmento repetido. Por lo tanto, es razonable suponer que fusionando el extremo N terminal de CDC-1573 con los genes 2086 de las cepas 8529 y 2996, los niveles de protema 2086 recombinante expresados a partir de estos genes aumentaran cuando se usen los sistemas pET y pBAD.
Materiales y Procedimientos:
Se purifico ADN cromosomico de las cepas 8529 y 2996 y se uso como un molde para amplificacion por PCR del 35 gen 2086 quimerico. Se usaron cebadores de PCR con los numeros de compuestos 6721 y 5135 (SEC ID N°: 321 y 308, respectivamente) para amplificar el gen 2086 quimerico de la cepa 8529 y se usaron cebadores de PCR con los numeros de compuestos 6721 y 6605 (SEC ID N° 321 y 320, respectivamente) para amplificar el gen 2086 quimerico de la cepa 2996. Los productos de PCR se clonaron directamente en el vector PCR2.1 TOPO de Invitrogen y despues se exploraron por analisis de secuencia de ADN para identificar un gen 2086 quimerico intacto. Ese gen se 40 escindio despues del vector PCR2.1 con BgIII y el fragmento de BglII se inserto en el sitio BamHI del plasmido pET9a. Se exploraron insertos plasirndicos con respecto a la orientacion apropiada y despues se sometieron a una digestion con NdeI. Los fragmentos de NdeI lineales se auto-ligaron para conseguir la delecion de un fragmento de NdeI pequeno que contema la secuencia de marcador T7 a la que contribrna el vector pET9a. Esta delecion une directamente el promotor T7 con el extremo 5' del gen 2086 quimerico. El plasmido con NdeI suprimido se 45 transformo en la cepa de E. coli BL21(DE3) y se exploraron colonias resistentes a kanamicina con respecto a expresion de protema 2086 quimerica con induccion de IPTG.
Los estudios iniciales indican que el 2086 quimerico de la cepa 2996 expresa aproximadamente dos veces tanta protema recombinante en comparacion con el gen 2996/2086 nativo cuando se expresa en el sistema pET9a. El
5
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20
25
30
35
40
45
sistema pBAD no se ha ensayado aun.
Aunque se ha realizado solamente un experimento, los datos indican que hay una utilidad potenciada del gen 2086 quimerico. La generacion de fusiones N terminales de CDC-1573 con los genes 2086 de las cepas 8529 y 2996 proporciona expresion de la protema 2086 recombinante potenciada.
Ejemplo 5
Exploracion por PCR de 2086 de cepas de N. meningitidis:
Para determinar la conservacion del gen 2086 entre aislados clmicos, se realizo amplificacion por PCR en 88 cepas de N. meningitidis.
La identificacion por PCR inicial de ORF 2086 utilizo cebadores enumerados en la Tabla IV (vease Ejemplo 2 anterior) identificados por los numeros de compuesto: 4623, 4624 y 4625 (SEC ID N° 303, 304 y 305, respectivamente). Estos cebadores se disenaron basandose en la secuencia del serogrupo A de N. meningitidis de Sanger. Para facilitar la exploracion de un gran numero de cepas, se disenaron cebadores internos para el gen 2086. Se exploro un total de 88 cepas de N. meningitidis por PCR con los cebadores de 2086 internos de nuevo diseno identificados por los numeros de compuesto 5005 y 5007 (SEC ID N°: 306 y 307). Con estos cebadores los solicitantes fueron capaces de identificar el gen 2086 de 63 de las 88 cepas de N. meningitidis (~70 %), (vease Tabla VI-A).
Se examinaron y alinearon regiones expandidas que rodeaban al gen 2086 en la secuencia del serogrupo A de N. meningitidis de Sanger y la secuencia del serogrupo B de N. meningitidis de TIGR. Los cebadores se disenaron para corresponder a las regiones cadena arriba y cadena abajo del gen 2086. El fin era utilizar estos cebadores para amplificar genes 2086 mayores de longitud completa de una diversidad de cepas de N. meningitidis para comparacion de secuencias. La amplificacion por PCR de una cepa (6557), usando los Compuestos N° 6470 y 6472 (SEC ID N°: 313 y 314, respectivamente), dio como resultado un bajo rendimiento de producto. El producto amplificado de la cepa 6557 se clono y se envio el ADN plasmfdico para analisis de secuencia. Los resultados indicaron un nuevo tipo de gen 2086 con mayor variabilidad de secuencia de lo que se habfa visto previamente. El gen 2086 de la cepa 6557 fue -75 % identico al nivel de aminoacidos de las otras cepas secuenciadas. Resulta interesante que la cepa 6557 fue una del 30 % de las cepas que habfa dado resultado negativo previamente por exploracion por PCR de 2086 descrita anteriormente.
Se disenaron cebadores internos espedficos para las regiones variables C terminales dentro de la cepa 6557. Estos cebadores se usaron para explorar con respecto al gen 2086 mas variable en el ~30 % de cepas que habfan dado resultado negativo previamente por exploracion por PCR de 2086. Todas las cepas de N. meningitidis disponibles (n=88) se exploraron por PCR con estos cebadores 2086 internos de nueva identificacion (identificados por los numeros de compuestos 6495 y 6496; SEC ID N°: 159 y 160, respectivamente). Solamente el ~30 % de las cepas N. meningitidis que habfan dado resultado negativo previamente por PCR para 2086 fueron positivas para PCR en esta exploracion. El conjunto de genes amplificados a partir de las cepas previamente negativas para PCR (~30 %) debena representar un nuevo tipo de gen 2086 o una segunda familia de genes 2086 y se designan en el presente documento Subfamilia A 2086. El conjunto de genes 2086 amplificados a partir del ~70 % de las cepas con los cebadores derivados de 8529 se designa en el presente documento Subfamilia B.
La Subfamilia A de los genes 2086 se ejemplifica por la SEC ID N°: 1-173 de numeros impares sin limitacion. La Subfamilia B de los genes 2086 se ejemplifica, sin limitacion, por las SEC ID N°: 175-251 de numeros impares.
Las cepas de N. meningitidis usadas para estudios de amplificacion por PCR se seleccionaron a partir de las siguientes tablas, Tabla VI-A y Tabla VI-B. Las cepas enumeradas en las tablas se proporcionan como ejemplos de cepas de N. meningitidis, sin limitacion. Las cepas enumeradas en la Tabla VI-A se clasifican en la Subfamilia A de protema 2086 y las cepas enumeradas en la Tabla VI-B se clasifican en la Subfamilia B de protema 2086. Las cepas enumeradas en cada tabla se agrupan por serosubtipo. Las cepas estan disponibles de las siguientes cuatro fuentes como se indica en la tabla: MPHL-Manchester Public Health Laboratory, Manchester, Reino Unido; RIVM, Bilthoven, Pafses Bajos; University of Iowa, College of Medicine, Department of Microbiology, Iowa City, IA; y Walter Reed Army Institute of Research, Washington, D.C.
TABLA VI-A
- Cepa
- Serosubtipo Fuente
- M97 251854
- B:4z, PI:4 MPHL
- M98 250622
- B:2b, PI:10 MPHL
- M98 250572
- B:2b, PI:10 MPHL
- M98 250771
- B:4z, PI.22,14 MPHL
- M98 250732
- B:4z, PI.22,14a MPHL
- Cepa
- Serosubtipo Fuente
- M98 250809
- B:15, PI:7,16 MPHL
- M97 252697
- B:1, PI:6, P1.18,25 MPHL
- M97 252988
- B:4, PI:6, P1.18,25,6 MPHL
- M97 252976
- B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL
- M97 252153
- B:4, PI:6, P1.18,25 MPHL
- M97 253248
- B:15,PI:7, NT, 16 MPHL
- CDC1610
- P1:NT 4(15), P1.18-7,16-14 CDC
- CDC1521
- P1.6,3 2b(4) CDC
- CDC1034
- P1.7 4(15) CDC
- L8
- P1.7,1 15(4) Walter Reed
- CDC1492
- P1.7,1 4(15) CDC
- 870446
- P1.12a,13 RIVM
- CDC2369
- P1.(9),14 CDC
- 6557
- P1.(9),14, P1.22a,14a RIVM
- 2996
- P1.5,2, P1.5a,2c RIVM
- NmB
- P1.5,2, P1.5a,2c UIOWA
- L3
- P1.5,2 Walter Reed
- B16B6
- P1.5,2 RIVM
- CDC1135
- CDC
- L5
- P1.NT, P1.21-6,1 Walter Reed
- L4
- P1.21,16 Walter Reed
- W135
- Walter Reed
- C11
- C:16, P1.7,1 CDC
- Y
- Walter Reed
TABLA VI-B
- Cepa
- Serosubtipo Fuente
- M98 250670
- B:1, PI:4 MPHL
- M98 250024
- B:1, PI:4 MPHL
- M97 253524
- B:1, PI:4 MPHL
- M97 252060
- B:1, PI:4 MPHL
- M97 251870
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251836
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251830
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251905
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251898
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251885
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251876
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251994
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251985
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251957
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 251926
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 252045
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 252038
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 252026
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 252010
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 252098
- B:4z, PI:4 MPHL
- Cepa
- Serosubtipo Fuente
- M97 252083
- B:4z, PI:4 MPHL
- M97 252078
- B:4z, PI:4 MPHL
- M98 250735
- B:4z, PI:15 MPHL
- M98 250797
- B:4z, PI:15 MPHL
- M98 250768
- B:4z, PI:15 MPHL
- M98 250716
- B:2b, PI:10 MPHL
- M98 250699
- B:4z,PI:10 MPHL
- M98 250393
- B:4z,PI:10 MPHL
- M98 250173
- B:4z,PI:10 MPHL
- M97 253462
- B:4z, PI:14 MPHL
- M98 250762
- B:15, PI:7,16 MPHL
- M98 250610
- B:15, PI:7,16 MPHL
- M98 250626
- B:15, PI:7,16 MPHL
- M97 250571
- B:15, PI:16 MPHL
- M97 252097
- B:15, PI:16, PI.7b,16 MPHL
- M97 253092
- B:1, PI:6 MPHL
- M97 252029
- B:15,PI:7, NT MPHL
- M97 251875
- B:15,PI:7, NT MPHL
- CDC1127
- PI.7,16 4(15) CDC
- CDC982
- PI.7,16 4(15) CDC
- CDC1359
- PI.7,16 4(15) CDC
- CDC798
- PI.7,16 15(4) CDC
- CDC1078
- PI.7,16 15(4) CDC
- CDC1614
- PI.7,16 15(4) CDC
- CDC1658
- PI.7,16 15(4) CDC
- H44/76
- PI.7,16 15(4) RIVM
- CDC1985
- P1.7,13 4(15) CDC
- L6
- P1.7,1 ?(4) Walter Reed
- CDC1573
- P1.7,1 4(15) CDC
- L7
- P1.7,(9),1 Walter Reed
- CDC937
- P1.7,3, P1.7b,3 CDC
- 8529
- P1.7,3, P1.7b,3 RIVM
- 880049
- P1.7b,4 RIVM
- CDC2367
- P1.15 4(15) CDC
- H355
- P1.19,15 RIVM
- CDC1343
- P1.14 4(15) CDC
- M982
- P1.22,9 RIVM
- 870227
- P1.5c,10 RIVM
- B40
- P1.5c,10 RIVM
- 5315
- P1.5c,10 RIVM
- CDC983
- P1.5,2 CDC
- CDC852
- P1.5,2 CDC
- 6940
- P1.18,25 (6) RIVM
- A4
Otras cepas estan facilmente disponibles como aislados de individuos infectados.
Ejemplo 6
Reactividad de antisuero rLP2086 contra cepas meningococicas:
La siguiente tabla, Tabla VII, muestra la reactividad cruzada y capacidad de proteccion cruzada del rLP2086 como se ha descrito anteriormente. Como se indica en la tabla, el rLP2086 se proceso y analizo usando una diversidad de 5 tecnicas incluyendo tttulos de ELISA de celulas completas (WCE), ensayo bactericida (BCA) y ensayos de Cnas de Rata (IR) para determina la reactividad de superficie celular bacteriana de un anticuerpo policlonal inducido contra la protema 2086.
TABLA VII
- Reactividad de antisueros rLP2086-8529 contra multiples cepas meningococicas
- Cepa
- Serosubtipo WCE BC IR
- Subfamilia A de 2086
- 870446
- P1.12a,13 808.615 >800
- NmB
- P1.5a,2c 47.954 <100
- 6557
- P1.22a,14a 169.479 <25 -
- Subfamilia B de 2086
- 880049
- P1.7b,4 1.402.767 100 +
- H44/76
- P1.7,16 8.009.507 >6400
- H355
- P1.19,15 10.258.475 3.200 +
- 6940
- P1.18,25(6) 5.625.410 800
- 870227
- P1.5c,10 4.213.324 <25 +
- 252097
- P1.7b,16 10.354.512 >800
- 539/8529
- P1.7b,3 11.635.737 3.200
- M982
- P1.22,9 1.896.800 800
- CDC-1573
- P1.7a,1 208.259 25
- CDC-937
- P1.7b,(3) 9.151.863 >800
- + reduccion mayor de 10 veces en bacteremia - menos reduccion menor de 10 veces en bacteremia
10 Ejemplo 7
Se prepararon diversas construcciones para expresar la protema ORF2086. La siguiente tabla, Tabla VIII, es una tabla de construccion r2086 que se proporciona para el fin de mostrar ejemplos e ilustrar una implementacion de la presente invencion, sin limitacion a la misma.
TABLA VIII
- Sumario de Construccion de r2086
- Construccion
- Promotor Lider Expresion Extraccion Vector % de protema total
- pPX7340
- T7 nativo Coomassie sarcosilo soluble pET27b 2,5 % de lipoprotema procesada
- pPX7341
- T7 P4 Coomassie sarcosilo soluble pET27b 5 % de lipoprotema procesada
- pPX7343
- Arabinosa P4 Coomassie sarcosilo soluble pBAD18 cm 7-10 % de lipoprotema procesada
- pPX7325
- T7 Fusion de un marcador T7/ maduro Coomassie cuerpos de inclusion pET9a 40-50 % de protema madura
- pPX7328
- T7 maduro Coomassie soluble pET9a 10 % de protema madura
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
Ejemplo 8
Estudios adicionales con protemas de membrana externa sin LOS identificaron cepas adicionales que produdan protema o protemas de la membrana externa distintas de PorA que eran capaces de inducir anticuerpos bactericidas para cepas que expresaban serosubtipos heterologos. A continuacion se describen estudios adicionales para identificar protemas adicionales de acuerdo con una realizacion de la presente invencion, y espedficamente lipoprotemas de membrana externa, que pueden reducir el numero de protemas requeridas en una composicion inmunogenica meningococica. Estos estudios adicionales complementan los estudios descritos en los ejemplos anteriores.
Se usaron fraccionamiento subcelular, extraccion con detergente diferencial, isoelectroenfoque y cromatograffa de intercambio ionico junto con inmunizacion y ensayos bactericidas contra multiples cepas para identificar pequenos grupos de protemas de interes. La secuenciacion directa de los componentes principales indico que los extremos N terminales estaban bloqueados. Se obtuvieron secuencias proteicas internas por secuenciacion directa de polipeptidos derivados de digestiones qmmicas y proteolfficas. La secuencia genomica de una cepa meningococica del grupo A se descargo del Centro Sanger y se analizo por el grupo de Bioinformatica de los inventores usando algoritmos existentes y patentados para crear una base de datos explorable. Los datos de secuencia pepffdica indicaron que ORF2086 era de interes. Se usaron cebadores basados en esta orf para amplificar por PCR el gen P0286 de la cepa 8529. El analisis de la secuencia genica, el hecho de que el extremo N terminal estaba bloqueado, y su localizacion subcelular indicaron que P2086 es una protema de membrana externa lipidada (LP2086). rLP2086- 8529 y variantes de otras cepas meningococicas se expresaron de forma recombinante como lipoprotemas en E. coli usando la secuencia senal P4 de H. influenzae. Estas protemas recombinantes se aislaron de membranas de E. coli por extraccion con detergente diferencial, se purificaron usando cromatograffa de intercambio ionico y se usaron para inmunizar ratones. Los sueros anti-LP2086 fueron capaces de facilitar la actividad bactericida contra varias cepas de serosubtipo diferente de N. meningitidis. El analisis adicional de los genes P2086 de muchas cepas de N. meningitidis mostro que estas secuencias quedan en dos grupos designados Subfamilia A y Subfamilia B. (Vease FIG. 12). Los antisueros inducidos contra las protemas de Subfamilia B fueron bactericidas contra nueve cepas que expresaban protemas de la Subfamilia B, y una cepa que expresaba una protema de la Subfamilia A. Los antisueros de Subfamilia A eran bactericidas contra las cepas de Subfamilia A. Una mezcla de una rPorA y una rLP2086 indujo anticuerpos complementarios que extendfan la cobertura de vacuna mas alla de la inducida por cada protema por sf sola.
Estas observaciones conducen a las siguientes conclusiones. Los anffgenos de rLP2086 son capaces de inducir anticuerpos bactericidas contra cepas meningococicas que expresan PorA heterologas y protemas P2086 heterologas. La familia P2086 de anffgenos puede ser una vacuna util o inmunogenica bien sola o bien en combinacion con otros anffgenos de Neisseria.
A continuacion se describe el estudio anterior en detalle. Se descubrio que una mezcla compleja de protemas de membrana externa solubles (sOMP) indudan anticuerpos bactericidas independientes de PorA contra cepas que expresaban protemas PorA heterologas. Se uso un procedimiento de extraccion con detergente diferencial, isoelectroenfoque y cromatograffa de intercambio ionico seguido de inmunizacion de ratones para seguir los componentes inmunologicamente activos.
En cada etapa, se ensayaron sueros con respecto a reactividad de superficie y actividad bactericida contra varias cepas que conteman anffgenos de serosubtipo que son representativos de la epidemiologfa global de la enfermedad meningococica.
Este proceso de separacion e inmunizacion se uso para identificar un nuevo candidato inmunogenico con reactividad cruzada para el Grupo B de N. meningitidis.
Generacion de cepas deficientes en PorA - Se clono el locus cromosomico porA en el plasmido pPX7016 de la cepa 2996. Dentro del plasmido se ha suprimido el promotor de porA, la caja S/D y los primeros 38 codones N terminales y se ha reemplazado con un casete que expresa KanR autonomo. Los plasmidos se linealizaron con enzimas de restriccion y se transformaron de forma natural en las cepas de serosubtipo PI:5,2; PI:9; PI:7,16; PI:15; PI:4; PI:3 y PI:10. Se seleccionaron transformantes resistentes a kanamicina y se exploraron con respecto a la perdida de PorA por monoclonales espedficos de serosubtipo en un ELISA.
Ensayo Bactericida: Vease Mountzourous, K.T. y Howell, A.P. Detection of Complement-Mediated Antibody- Dependent Bactericidal Activity in a Flourescence-Based Serum Bactericidal Assay for Group B Neisseria meningitidis. J Clin Microbiol. 2000; 38: 2878-2884.
Ensayo Inmunoabsorbente Ligado a Enzimas (ELISA) de Celulas Completas: Se diluyeron suspensiones de celulas completas de N. meningitidis hasta una densidad optica de 0,1 a 620 nm en fosfato 0,01 M esteril, NaCl 0,137 M, KCl 0,002 M (PBS). A partir de esta suspension, se anadieron 0,1 ml a cada pocillo de placas de 96 pocillos Nunc Bac T (Cat. N° 2-69620). Las celulas se secaron en las placas a 37 °C durante una noche, despues se cubrieron, se invirtieron y se almacenaron a 4 °C. Las placas se lavaron tres veces con tampon de lavado (Tris-HCl 0,01 M, NaCl/KCl 0,139 M, Brij-35 0,1 %, pH 7,0-7,4). Se prepararon diluciones de antisueros en PBS, Tween-20/Azida 0,05
5
10
15
20
25
30
% y se transfirieron 0,1 ml a las placas recubiertas y se incubaron durante dos horas a 37 °C. Las placas se lavaron tres veces en tampon de lavado. Se diluyo AP anti-IgG de raton de cabra (Southern Biotech) a 1:1500 en PBS/Tween-20 0,05 %, se anadieron 0,1 ml a cada pocillo, y las placas se incubaron a 37 °C durante dos horas. Las placas se lavaron (como anteriormente). La solucion del sustrato se preparo diluyendo p-nitrofenil fosfato (Sigma) en dietanolamina a 1 mg/ml. Se anadio sustrato a la placa a 0,1 ml por pocillo y se incubo a temperatura ambiente durante una hora. La reaccion se detuvo con 50 ul/pocillo de NaOH 3N y las placas se leyeron a 405 nm con 690 nm de referencia.
Induccion de PorA Recombinante: Las cepas BLR(DE3)/pET9a se cultivaron durante una noche a 37 °C en Caldo de Cultivo HySoy (Sheffield Products) complementado con Kan-30 y glucosa al 2 %. Por la manana se diluyeron los cultivos de una noche 1/20 en Caldo de Cultivo HySoy Kan-30 y glicerol al 1 % y se cultivaron a 37 °C durante 1 hora. Estos cultivos se indujeron mediante la adicion de IPTG hasta una concentracion final de 1 mM. Los cultivos se dejaron crecer durante 2-3 horas adicionales y despues se recogieron.
Purificacion de PorA Recombinante: La rPorA se solubilizo de los cuerpos de inclusion de E. coli con Urea 8 M, y se replego por dialisis frente a tampon que no contema urea. La rPorA replegada se concentro despues por diafiltracion y se cambio el tampon por columna de G25 en NaPO4 pH 6. La rPorA dializada se proceso despues en una columna de intercambio cationico (Fractogel S) y se eluyo con NaCl 1 M.
Las sOMP de la cepa 8529 (P1.7-2,3) inducen actividad bactericida independiente de PorA en ratones contra cepas que expresan serosubtipos heterologos. La siguiente tabla, Tabla IX, muestra la actividad bactericida en las cepas estudiadas.
TABLA IX
- Cepa de Ensayo
- Serosubtipo Tftulo de CB501
- 539
- P1.7-2,3 1280
- 539 PorA-
- NST2 1080
- H44/76
- P1.7,16 3285
- H44/76
- NST 2620
- PorA-
- H355
- P1.19,15 >1350
- H355PorA-
- NST >1350
- 880049
- P1.7-2,4 290
- 880049 PorA.
- NST 85
- M982
- P1.22,9 85
- M982 PorA-
- NST <50
Preparacion de sOMP: Se extrajeron membranas de N. meningitidis con TX-100, 3-14 y Zwittergent 3-14+ NaCl 0,5 M. Las sOMP indicadas anteriormente se solubilizaron en el extracto de Zwittergent 3-14/NaCl 0,5 M. La extraccion se realiza usando tecnicas bien conocidas por los expertos en la materia, por ejemplo, vease Patente de Estados Unidos N° 6.355.253 que se incorpora por la presente por referencia.
Inmunogenicidad: Se inmunizaron ratones hembra Swiss-Webster con 25 ug de protema total con 20 ug de QS-21 como adyuvante en la semana 0 y 4. Se realizo un sangrado de exsanguinacion y analisis de datos en la semana 6.
1 Los tttulos bactericidas (CB50) representados como el redproco de la dilucion de antisueros que reduce el recuento de celulas viables en 50 %. Los sueros de raton normal de semana 0 tuvieron tftulos de CB50 de <25.
2 NST = No serosubtipificable
La siguiente tabla, Tabla X, muestra el sumario de purificacion y caracterizacion para P2086 lipidada recombinante (rLP2086) tanto para Subfamilia A como para Subfamilia B.
Purificacion de rLP2086 de Subfamilia A
TABLA X
- Variante de rLP2086
- Homologfa de A.A. (%)1 pI teorico Pureza (%)2
- 870446
- 75 6,1 80
- 2996
- 71 5,9 95
- M97252988
- 71 6,3 96
- C11
- 68 6,4 82
- Variante de rLP2086
- Homologfa de A.A. (%)1 pi teorico Pureza (%)2
- M98250771
- 62 6,1 83
Purificacion de rLP2086 de Subfamilia B
TABLA XI
- Variante de rLP2086
- Homologfa de A.A. (%)1 pi teorico Pureza (%)2
- 8529
- 100 7,5 96
- M982
- 94 6,3 96
- 88049
- 92 6,2 90
- CDC1573
- 87 5,6 93
5
Procedimiento de Purificacion: Todas las variantes se solubilizaron de membranas de E. coli con TX-100 (excepcion rLP2086-8529 que se solubilizo con Sarcosilo o Urea). Se consiguio purificacion adicional con una combinacion de intercambio anionico (TMAE), exclusion por tamano y/o cromatograffa de intercambio cationico (Fractogel S) en un tampon Tris-HCl o NaPO4.
10 1 Homologfa de aminoacidos en comparacion con P2086 de la cepa 8529.
2 Pureza como se determinada por SDS-PAGE y densitometna por laser de banda tenida por Coomassie coloidal (tincion Simply Blue).
Inmunogenicidad de un miembro de Subfamilia B, rLP2086-8529, ensayado frente a cepas homologas y heterologas.
15 La Tabla XII a continuacion muestra la inmunogenicidad de un miembro de Subfamilia B, rLP2086-8529, ensayado frente a cepas homologas y heterologas.
TABLA XII
- Cepa diana
- Subfamilia de P2086 Serosubtipo de la cepa diana Homolog^a de A.A.a Tftulo de ELISA de celulas completasb Tftulo de CB50c
- 539
- B P1.7-2,3 100 >1.458.000 3.200
- H44/76
- B P1.7,16 100 >1.458.000 3.200
- H355
- B P1.19,15 100 >1.458.000 3.200
- CDC937
- B P1.7-2,3-4 100 >1.458.000 >800
- M97252097
- B P1.7-2,16 100 >1.458.000 >800
- 870227
- B P1.5-2,10 100 >1.458.000 <25
- 6940
- B P1.18,25,6 97 900.162 >800
- M982
- B P1.22,9 94 435.909 200
- 880049
- B P1.7-2,4 92 349.912 400
- CDC1573
- B P1.7-1,1 87 102.508 25
- 870446
- A P1.12-1,13 71 389.829 800
- M98250771
- A P1.22,14 62 139.397 <25
- NmB
- A P1.5-1,2-2 71 <2.000 <25
5
10
15
20
Procedimiento de vacunacion: se inmunizaron ratones Swiss-Webster hembra de 6-8 semanas de edad con 10 ug de rLP2086-8529+20 ug de QS-21 en la semana 0 y la semana 4. Se realizaron analisis de datos en el sangrado de exsanguinacion de la semana 6.
a Homologfa de aminoacidos de P2086 en comparacion con rLP2086-8529.
b Tftulos de puntos finales expresados como el redproco de la dilucion a absorbancia = 0,1
c Tftulos de CB50 representados como el redproco de la dilucion de antisuero que reduce el recuento de celulas viables en 50 %. Los sueros de raton normal de la semana 0 tuvieron tftulos de CB50 de <10
La Tabla XIII muestra la inmunogenicidad de un miembro de la Subfamilia B, rLP2086-2996, ensayado frente a cepas homologas y heterologas.
TABLA XIII
- Cepa diana
- Subfamilia de P2086 Serosubtipo de cepa diana Homologfa de A.A.a Tftulo de ELISA de celulas completasb Tftulo de CB50c
- NmB
- A P1.5-1,2-2 99,6 8.979 <25
- 870446
- A P1.12-1,13 99 <1.458.000 >800
- M97 252697
- A P1.18,25,6 98 320.732 >800
- 6557
- A P1.22-1,14-1 98 17.319 <25
- M98 250732
- A P1.22,14-1 89 241.510 >800
- M98 250771
- A P1.22,14 89 447.867 800
- H44/76
- B P1.7,16 72 56.386 <25
Procedimiento de Vacunacion: se inmunizaron ratones Swiss-Webster hembra de 6-8 semanas de edad con 10 ug de rLP2086-2996+20 ug de QS-21 en la semana 0 y la semana 4. Se realizaron analisis de datos en el sangrado de exsanguinacion de la semana 6.
a Homologfa de aminoacidos de P2086 en comparacion con rLP2086-2996.
b Tftulos de puntos finales expresados como el redproco de la dilucion a absorbancia = 0,1
c Tftulos bactericidas (CB50) representados como el redproco de la dilucion de antisueros que reduce el recuento de celulas viables en 50 %. Los sueros de raton normal de semana 0 tuvieron tftulos de cB50 de <10
La Tabla XIV a continuacion muestra que los antisueros para rLP2086 y rPorA son complementarios cuando se mezclan y ensayan con respecto a actividad bactericida.
TABLA XIV
- Antisueros
- H44/76 (P1.7,16) NMB (P1.5 1,2-2) 880049(P1.7- 2,4) H355 (P1.19,15) 870227 (P1.5-2,10) 6557 (P1.22 1,14-1)
- Antisueros anti-rLP2086 + tres rPorA
- >3,200 >800 200 >800 200 200
- Controles
- anti-rLP2086
- 6.400 <25 100 3.200 <25 <25
- Antisueros monovalentes correspondientes de rPorA
- 1.600 200 400
Procedimiento de vacunacion: se inmunizaron ratones Swiss-Webster hembra de 6-8 semanas de edad con 10 ug de rLP2086-8529+20 ug de QS-21 o 15 o 15 ug de rPorA/100 ug de MPL en la semana 0 y la semana 4. Se realizo analisis de datos en el sangrado de exsanguinacion de la semana 6.
a Tttulos bactericidas (CB50) representados como el redproco de la dilucion de antisueros que reduce el recuento 5 de celulas viables en 50 %. Los sueros de raton normal de semana 0 tuvieron tftulos de CB50 de <10
La siguiente tabla, Tabla XV, muestra que las mezclas de Subfamilias rLP2086 y dos rPorA inducen anticuerpos bactericidas en ratones.
Claims (24)
- 51015202530351. Una composicion que comprende al menos una protema que comprende una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia mayor del 99 % con la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEC ID N°: 182, 184 y 186 en la que la composicion comprende adicionalmente al menos una protema PorA.
- 2. La composicion de la reivindicacion 1, en la que dicha al menos una protema esta codificada por un polinucleotido que tiene la secuencia de acido nucleico de una cualquiera de las SEC Id N°: 181, 183 o 185.
- 3. La composicion de la reivindicacion 1, en la que dicha al menos una protema comprende la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEC ID N°: 182, 184 y 186.
- 4. La composicion de la reivindicacion 1, en la que dicha al menos una protema comprende una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia mayor del 99 % con la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEC ID N°: 194, 196 y 198.
- 5. La composicion de la reivindicacion 1, en la que dicha al menos una protema comprende la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEC ID N°: 194, 196 y 198.
- 6. La composicion de la reivindicacion 1, en la que dicha al menos una protema consiste en una secuencia de aminoacidos que tiene identidad de secuencia mayor del 99 % con la secuencia de aminoacidos de una cualquiera de las SEC ID N°: 182, 184, 186, 194, 196 y 198.
- 7. La composicion de la reivindicacion 1-6, en la que dicha al menos una protema esta lipidada.
- 8. La composicion de la reivindicacion 1-6, en la que dicha al menos una protema no esta lipidada.
- 9. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en la que dicha al menos una protema es una protema recombinante.
- 10. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que dicha al menos una protema es una protema de fusion.
- 11. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en la que dicha al menos una protema esta conjugada con un vehmulo.
- 12. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en la que dicha composicion comprende ademas un tampon, diluyente, adyuvante o vehmulo farmaceuticamente aceptable.
- 13. La composicion de la reivindicacion 12, en la que el adyuvante es hidroxido de aluminio o fosfato de aluminio.
- 14. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que la composicion comprende ademas otros inmunogenos activos.
- 15. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en la que la composicion comprende ademas otros polipeptidos inmunogenicos de una especie de Neisseria.
- 16. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende ademas un polisacarido.
- 17. La composicion de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para su uso como un medicamento.
- 18. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso en un procedimiento para inducir una respuesta inmunitaria en un mairnfero.
- 19. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-16 para su uso en un procedimiento para mejorar o prevenir la infeccion por N. meningitidis en un ser humano.364FIG. 1AIdentificacion de componentes en la fraccion de TMAE no adsorbida: Aislamiento por SDS-PAGE de peptidos(Escision por CNBr de la fraccion TMAE no adsorbida seguido de SDS-PAGE y secuenciacion N-terminal de fragmentos de transferencia de PVDF)
- pm (kd) i 2 3 203 m
- - TMAE no adsorbido
- 116—
- no digerido
- SOriM P4431-SEC ID N°: 327
- - TMAE no adsorbido
- 50 ** / pm previsto 37.675
- digestion con LysC
- - TMAE no adsorbido
- ■“— -- /
- escision con CNBR
- 33 - /
- 28 m '■■■ ** P2086 -SEC ID N°: 212
- 20** pm previsto 28.000
- SDS-PAGE 10-20 %
365FIG. IBIdentificacion de componentes en la fraccion de TMAE no adsorbida Aislamiento de fase inversa de peptidosDigestion enzimatica de la fraccion de TMAE no adsorbida seguido de separacion por cromatografia de fase inversa de peptidos y secuenciacion N terminal directa- Digestion enzimatica
- Tiempo de retencion del peptido (min) Peso molecular del peptido (d) ID N tenninal
- GluC (V8)
- 6,716 2069,7 P5163
- LysC
- 13,800 3351,2 P4431
- LysC
- 13,800 3351,2 P2086
- ArgC
- 6,860 2278,9 P5163
P4431 (SEC ID N°: 327) pm previsto 36.775P2086 (SEC ID N°: 212) pm previsto 27.100P5163 (SEC ID N°: 328) pm previsto 7.081366FIG. 2Purification de rLP2086celulas BLR DE3 pLysS pET27b 2086A11extracto de sarcosiloCromatografia de TMAEiCromatografia de SP Sepharose 84 % de homogeneidadpm (kd)- 209
- 124
- * b
- 80
- 49
- r
- 34,8
- 28,9
:4 .E.'iTiJ.20,6W-'i'7,1i i,- extracto de sarcosilo- grupo de SP367FIG. 3Identificacion de componentes en la fraccion de TMAE no adsorbida: EM-CL/EMSDS-PAGE seguido de escision de gel, digestion proteolitica y analisis de EM-CL/EM (Espectrometria de masas en tandem con cromatogratia liquida)pm (kd)203 mUS’**8050«*28«TMAEno adsorbido;P4431 (SEC ID N°: 327) P2086 (SEC ID N°: 212)P5163 (SEC ID N°: 328)368Expresion de rLP2086pm (kd) 1 2imagen1 Tincion de Coomassie SDS-PAGE 10-20 %369FIG. 5imagen2 Hind!11Basil! 1DrainORF 2086imagen3 BsiHIlPshAI370FIG. 6DramSsalEco3?ISphtimagen4 ssHIiJhAl371FIG. 7imagen5 372FIG. 8111102030CSSGGC5 C S S G G G G C 3 S G G G GI1 --------------------------1-----------------------------------L?HDI GAGHDHTA? LD 7AADIGAGUHLTAPLS?(t]a d I g(t)g lad altap idimagen6 8529 nat.pro 2996 nat.pro 1573 nat.prorepetition de 5 aminoacidos373Identification de componente inmunogenico en la cepa de Nm8529- A. Extraction con detergente difererencial: 1
- B. Isoelectroenfoque preparatorio:
- C i to/oeri ------------------------------—■
- Realizado en Rotofor BioRad de acuerdo con las instrucciones
- ’ TX-100: tftulos de BC para 4/5 cepas ensayada^>
- del fabricante. Se uso una solution de anfolito 7/10 1 % y 4/6
- Zwittergent 3-12
- 1 %en TX-100 1 %
- Zwitiergenl 3-14
- Recoger fracciones en intervalo de pi ~ 5,6 - 7,67"
- Zwittergent 3-14+NaCl Sarcostlo Zwittergent 3-14+calor
- -Xf||ilns de BC para 4/4 cepas ensavadas —.—
-------------------------------------------------------------------------------C. Cromatografia de intercambio anionico:La proteina se separo de los anfolitos usando precipitation con etanol al 90 %. Cromatografia realizada usando resina de TMAE con tampon Tris-HCl pH 8 y elution con NaCl. TX-100 1 % en todos los tampones.imagen7 374imagen8 Peptido coincidente con la ORF n° 2086 de los inventores375rP2086 lipidadopBAD18-promotor de Arabinosaimagen9 FIG. 10ArP2086 no lipidadopET9a-promotor de T7 8529, CDC-1573y 2996Dralllimagen10 FIG. 10B376rLP2086 expresado en pBAD/BLR, Induccion de ArabinosarP2086 expresado en pET/BL21(DE3), induccion de IPTG con/sin el marcador de T7Arab. Arab. .Ar ab. Arab. Marcador 7343 7343 p\V62 PW105 PYY102•r. *7? *' -203IPTG IPTG IFI’G IPTG IFTG IPTG Marcador 7328 12-7328 7328 T7-7334 7334 T7-7344 7344imagen11 123 "■123 «*>■■!!••• ••- 86
- ups ••'I ”* 86 HtiSsn
- 51
- Si
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- r*-~
- 36
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- 36
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- 30
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,,,,,imagen12 imagen13 * rP20868529 1573 2996 250771imagen14 8529 C DC-1573 2996FIG.11Bimagen15 M38250732 M98 250771 CDC113S M97 251153 CDC1613 CDC1492 LB MS78(B) M972529BB M97251697 6557 2996M37 252976 M97 251854 CDC1521 M98 250B22 B7G446 M97 2522'IS MSB 25C0O9 L5 M931 (0) NM5M382505721 CDC2363PI; m ,14lr CDC1034PI :7L4 amPI t3 J., Ifer B1S06P1:S,2f W135 (ATCD35559)"- C11 *Y(ATCC;35561)* - 71.22,1471,19,25 PI:19-7,16-4 71:7,1 71:7,1 Pl:10,2S,<5 Pl:16,25 Pl:22a.l4a Pl:na,2c P1:1E,2S PI,4 Pl:o.3 PlrlO pmio.i: Pl:7,IS PI:7,IS PI:23-S,l PI :5a,2c PI :lflSubfamilia AA4 Sanford *■ MS7 251636M97 251357M37 251985MS7 25205C■ M37 251870■ M97 251994M9B 250024M97 251905M.97 251676PI: 4M97 251090PI: 4-M37 251830ri:7L,3CDC937M97 252097Pl:7b,16B702I7n: SC,10pi ns, isH355H44 760529PI :7b, 30940PI lfl,25,6Subfamilia BM982PI 7.2.9880049PI:7b,4M97 153524M97 2510B5M97251B2GU90 2501371)CDC1573* Cepas no W, meningitidis BSustituciones de nucleotidos (x 100)378Datos de ELISA de celulas completas para antisueros de la subfamilia A de rLP2086Cepas de la subfamilia BCepas de la subfamilia A1.MG.0DO1.200,0001.000.000O 900.000OQ
- 600.000~s^ 400.000 - ■
- 200.000■ rLP2085-2996■ flP?0flS -870446■ rtP2085-250771 □ fLP208B-2S2988 U rtP2086-C11E-CSgCO
imagen16 FIG. 13379Datos de ELISA de celulas completas para antisueros de la subfamilia B de rLP2086UOO.OOOCepas de la subfamilia BCepas de la subfamilia Aimagen17 250771Titulo (DO 0,1)Estudio de mezcla de rLP2086 - Titulos de WCEimagen18 fig. isTitulo (DO 0,1)Estudio de mezcla de rLP2086/rPorA - Titulos de WCECepas de la subfamilia BCepas de la subfamilia Ai.40:.oao1.200.000 --1.000.000 •eoo.ooo - 600.000 - ■4DOOOO200 00 - ■
imagen19 imagen20 para lisados de celulas completas de N. meningitidis de subfamilia B de P2086P2086 nativaCDC13591 — Marcador de peso molecular (kDa)8 — CDC1658M97 251985M97 252026CDC937IO-M97 2520296940U-M982M97 251926CDC1573Los lisados celulares de P2086 de subfamilia B son todos de N. meningitidis del Grupo BFIG. 17imagen21 para lisados de celulas completas de N. lactamica y N. meningitidisde la subtamiha A de P2086- P2086 nativa3 518Marc adores de peso molecular (kDa)N. meningitidis del gi'upo B2-A4 de TV. meningitidis del grupo A7 - CDC1034(P2086 subfamilia B)M9S 250732TV. meningitidis grupo C - C11NmBa - TV. meningitidis grupo r -106557ATCC35561CDC 1521TV. meningitidis grupo W135 -M97 2521532ATCC35559N. lactamica - UR5FIG. 18
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