JP2002186489A - NeisseriagonorrhoeaeおよびNeisseriameningitidis由来トランスフェリン結合蛋白質 - Google Patents

NeisseriagonorrhoeaeおよびNeisseriameningitidis由来トランスフェリン結合蛋白質

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JP2002186489A JP2001296757A JP2001296757A JP2002186489A JP 2002186489 A JP2002186489 A JP 2002186489A JP 2001296757 A JP2001296757 A JP 2001296757A JP 2001296757 A JP2001296757 A JP 2001296757A JP 2002186489 A JP2002186489 A JP 2002186489A
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gonorrhoeae
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P Frederick Sparling
スパーリング,ピー.,フレデリック
Cornelissen Cynthia Nau
コーネリセン,シンチア,ナウ
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University of North Carolina at Chapel Hill
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Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 この蛋白質は、トランスフェリンアフィ
ニティーカラムにより単離され、Neisseria gonorrhoea
eに見出される分子量およそ100kDの鉄調節外層膜蛋白質
に対して惹起される抗血清に特異的に結合する。 【効果】 Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria men
ingitidisに見出される鉄調節外層膜蛋白質は、トラン
スフェリンレセプター機能において重要である。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【発明の属する技術分野】本出願は、Neisseria gonorr
hoeaeおよびNeisseria meningitidis由来のトランスフ
ェリン結合蛋白質および免疫学的交差反応性フラグメン
トおよびそれらのアナログに関するものである。さらに
明細書は、そのような蛋白質に対して惹起される抗体、
さらには、N. gonorrhoeaeおよびN. meningitidisの検
出におけるそのような蛋白質および抗体の使用、および
N. gonorrhoeaeおよびN. meningitidisにより引き起こ
される疾病の処置に関するものである。組換えトランス
フェリン結合蛋白質をコードするDNAおよびそのよう
なDNAを発現する細胞もまた、本発明に包含されるも
のである。
【0002】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】N. gon
orrhoeaeおよびN. meningitidisは、遺伝子的には類似
しているが、病原性的には異なる二つのNeisseria 属病
原体である。鉄は、多くの細菌同様、N.gonorrhoeae
よびN. meningitidisの増殖における必須栄養素であ
る。大部分の他のグラム陰性細菌とは異なり、N. gonor
rhoeaeおよびN. meningitidisは小さな、シデロフォア
(siderofore)と呼ばれる溶解性の鉄−キレート化合物
を産生・分泌しない。これらの他のグラム陰性細菌は鉄
−シデロフォア複合体を取り込むことができるレセプタ
ーを有する。
【0003】一方、N. gonorrhoeaeおよびN. meningiti
disは、各々ヒトの外分泌物中および血清中に存在する
鉄結合糖蛋白質であるラクトフェリンやトランスフェリ
ンに結合する膜蛋白質を有すると考えられる。N. gonor
rhoeaeおよびN. meningitidisは、ヒト宿主において、
ラクトフェリンおよびトランスフェリンを、これらラク
トフェリン−およびトランスフェリン−結合膜蛋白質、
すなわちレセプターへ結合させることにより鉄を取り込
むと考えられる。
【0004】N. meningitidis由来のラクトフェリン結
合蛋白質は105kD の、鉄調節外層膜蛋白質であると考え
られる(Schryvers およびMorris, Infect. Immun. 56,
1144-1149(1988) 参照)。N. meningitidisのうちの一
つの細胞株に由来するトランスフェリン結合蛋白質は71
kDの鉄調節外層膜蛋白質であると報告されているが、そ
の他の細胞株は分子量75kD〜88kD、85kDおよび95kDのト
ランスフェリン結合蛋白質を有することが報告されてい
る(Schryvers およびMorris, Mol.Microbiol.2, 281-2
88(1988)参照)。これらの著者は、N. meningitidis
トランスフェリン結合蛋白質の同定の様々な試験結果が
互いに一致しないことを認めている。事実、85kDおよび
95kDの蛋白質はN. meningitidisのトランスフェリンレ
セプター機能に必要でないことが示された(Dyerら,Mi
crobial Pathogenesis 3, 351-363(1987)参照)。
【0005】N. gonorrhoeaeの鉄同化能力もまた興味深
いものである。ある研究において、鉄欠失条件下で増殖
させた細胞由来の淋菌膜全体を用いたドット結合アッセ
イ(dot binding assay)により、ラクトフェリンおよ
びトランスフェリンの各々のレセプターの存在が示唆さ
れた。結合蛋白質の分子量およびその他の特性は測定さ
れていない(Lee およびSchryvers, Mol. Microbiol.
2, 827-829(1988)参照)。したがって、N. gonorrhoeae
の結合蛋白質の同定は、これまで立証されていない。
【0006】淋菌および髄膜炎菌感染により引き起こさ
れる疾病は広まり、しばしば重篤なものとなる。そのよ
うな疾病である淋病、髄膜炎および敗血性ショックの予
防、検出および処置するための改善方法が必要とされて
いる。
【0007】ヒト体内におけるN. gonorrhoeaeおよびN.
meningitidisの増殖は、これらの細胞の鉄吸収能を低
下させることにより阻害できる。淋菌および髄膜炎菌細
胞の血流中での鉄の同化能力は、トランスフェリンレセ
プター機能をブロックすることにより低下させることが
可能であろう。トランスフェリンレセプターは、例え
ば、レセプターに対する抗体によりブロックできるであ
ろう。しかしながら、レセプターに対する抗体を惹起さ
せるためには、レセプターは単離できるように同定され
なければならない。
【0008】したがって、N. gonorrhoeaeおよびN. men
ingitidis由来のトランスフェリン結合蛋白質の同定、
単離および精製を行う必要がある。組換えトランスフェ
リン結合蛋白質を作製するためには、そのような蛋白質
をコードするDNA分子が必要である。トランスフェリ
ンレセプター機能を阻害するためには、トランスフェリ
ン結合蛋白質に対する抗体が必要である。淋菌および髄
膜炎菌感染を予防および処置をするためには、ワクチン
が必要である。N. gonorrhoeaeおよびN. meningitidis
を検出するためには、抗体および核酸プローブが必要で
ある。本発明の目的は、淋菌および髄膜炎菌感染の検
出、予防および処理のためのそのような蛋白質、抗体、
DNA分子およびワクチンを提供することである。
【0009】
【課題を解決するための手段】これら、およびその他の
目的は、当業者にとって明らかであるように、Neisseri
a gonorrhoeaeまたはNeisseria meningitidis外層膜に
見出され、 (a)洗浄剤; (b)ニトロセルロース/セルロースアセテート紙;お
よび (c)Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria meningi
tidis由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず;トランスフェリンアフィニティー
カラムにより単離され;Neisseria gonorrhoeaeに見出
される分子量およそ100kDの鉄調節外層膜蛋白質に対し
て惹起される抗血清に特異的に結合し;Neisseria gono
rrhoeaeまたはNeisseria meningitidisのトランスフェ
リンレセプター機能において重要である;鉄調節蛋白
質;およびそのような蛋白質の機能性アナログを提供す
ることにより達成される。
【0010】本発明は、さらに、宿主細胞中でトランス
フェリン結合蛋白質およびそのアナログを発現するDN
A分子を提供するものである。その結果得られる組換え
蛋白質もまた本発明に包含される。
【0011】本発明はまた、本発明のトランスフェリン
結合蛋白質に対する抗体をも包含するものである。該抗
体はN. gonorrhoeaeおよび/またはN. meningitidis
増殖を阻害し、これらの病原体の感染を調節するうえで
有用である。
【0012】本発明は、さらに、本発明のトランスフェ
リン結合蛋白質およびそのような蛋白質のアナログを含
有するワクチン組成物、さらにはそのようなワクチンを
投与することにより淋病、髄膜炎および敗血性ショック
等の淋病および髄膜炎菌性疾病に対して宿主を免疫する
方法を包含するものである。本発明の抗体は、淋菌およ
び髄膜炎菌性疾病を処置するための受動免疫に用いても
よい。
【0013】
【発明の実施の形態】蛋白質の細菌からの単離 トランスフェリン結合蛋白質は、N. gonorrhoeaeまたは
N. meningitidisの膜から調製される。この膜は当技術
分野で公知の方法により調製することができる。Schryv
ers およびMorrisによりInfect. Immun. 56, 1144-1149
(1988)に記載されている方法が適当である。この方法は
ここに参考文献として挙げられる。膜は鉄欠損培地で増
殖した細胞から得られる。増殖培地は、Difco製のGC培
地基(淋菌用培地基)等の標準的な増殖培地でもよい。
この培地は、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、エチレ
ン−ジアミン−ジ−オルト−ヒドロキシフェニル酢酸
(EDDA)またはデスフェラル(desferal)(Ciba Pharmace
uticals製)等のキレート剤の添加により鉄欠損化するこ
とができる。一方、増殖培地は、MickelsenおよびSparl
ing(Inf. Immun. 33, 555-564(1981) )により記載され
ている既知組成培地であってもよく、これはキレート剤
であるケレックス(Chelex)-100(Bio-Rad製)で処理
することにより鉄欠損化されている培地である。
【0014】本発明では、正常なトランスフェリンレセ
プター機能を有する如何なる淋菌株および髄膜炎菌株も
有用である。通常、そのような菌株は、American TypeC
ulture Collection, Bethesda, MarylandおよびNeissei
ria Repository, NAMRU,University of California, Be
rkley等の医学的およびその他の入手源から入手するこ
とができる。
【0015】例えば、McKenna ら,Infect. Immun. 56,
785-791(1988)に記載されている淋菌株FA19;Biswas
ら,J. Bacteriol. 151, 77-82(1979) に記載されてい
るFA248;WestおよびSparling, Infect. and Immun. 4
7, 388-394(1985)に記載されているF62 が適当な淋菌ト
ランスフェリン蛋白質源である。髄膜炎菌株FAM18 およ
びFAM20(Dyerら, Microbial Pathogenesis 3, 351-363
(1987))およびB16B6、X群およびW135群(Schryversおよ
びMorris 56, 1144-1149(1988))が、代表的な髄膜炎菌
トランスフェリン結合蛋白質源である。
【0016】トランスフェリンに結合する蛋白質は、当
技術分野で公知であるアフィニティ操作により、固定化
トランスフェリンを有する鉄飢餓化N. gonorrhoeaeおよ
N.meningitidisの他の膜蛋白質から単離されてもよい
(例えば、SchryversおよびMorris, Infect. Immun. 5
6, 1144-1149(1988)参照のこと)。Schryvers およびMo
rrisの方法は、ここに参考文献として挙げられる。好ま
しくは、実施例2aに記載されているこの操作の応用法
が、淋菌および髄膜炎菌の膜蛋白質からトランスフェリ
ン結合蛋白質を分離するために用いられる。
【0017】要約すれば、鉄飢餓化淋菌および髄膜炎菌
細胞由来の膜を単離し、ビオチニル化(biotinylated)
トランスフェリンで処理する。得られた複合体を、例え
ばアビジン−またはストレプタビジン−アガロースで処
理することにより固定化する。アフィニティ樹脂ペレッ
トを十分に洗浄し、緩衝液に懸濁する。トランスフェリ
ンレセプターを、例えば加熱により固定化トランスフェ
リンから分離する。蛋白質を、例えばLaemmli, Nature
227, 680-685(1970)の方法に従ってSDS-PAGEにより分離
する。分子量がおよそ100kDである蛋白質(以下、100kD
蛋白質という。)が淋菌から分離される。分子量がお
よそ95〜95kDである蛋白質(以下、95kD蛋白質とい
う。)が髄膜炎菌から分離される。
【0018】蛋白質の同定 分子量はSDS-PAGE上の単一バンドを解析し、その位置を
既知の標準物質のバンドの位置と比較することにより求
めた。この方法は3〜5%の範囲内の誤差であると、当
業者には理解される。分子量は測定間でほとんどバラツ
キを見せない。淋菌由来の蛋白質の分子量は一定してお
り、再現性もよく、髄膜炎菌からの蛋白質の分子量より
も大きくて97〜100kDであった。
【0019】トランスフェリンレセプター活性が欠損し
ている5つの異なる淋菌突然変異体を調製することによ
り、N. gonorrhoeae由来の100kD トランスフェリン結合
蛋白質がトランスフェリンレセプター機能に重要である
ことが確認された。ウサギにおいて惹起されるポリクロ
ーナル抗血清を用いて、ウエスタンブロットにより100k
Dトランスフェリン結合蛋白質の存在を各突然変異体に
おいてテストした。各突然変異体において、100kD外層
膜蛋白質の量は、野性型淋菌株で観察されるよりも非常
に少なかった。正常なトランスフェリンレセプター活性
を有するその他の突然変異型淋菌株では、野性型レベル
の100kD蛋白質を膜に含有していた。
【0020】同様の実験により、髄膜炎菌由来の95kD蛋
白質がトランスフェリンレセプター機能にとって重要で
あることが確認された。N. gonorrhoeae由来の100kD 蛋
白質に対して惹起される抗血清を用いて、ウエスタンブ
ロット分析を行ったところ、該蛋白質はN. meningitidi
s由来の95kD蛋白質と交差反応することが判明した。し
たがって、N. gonorrhoeaeおよびN. meningitidisにお
いても、トランスフェリンレセプター活性の欠如は、そ
れぞれ100kD蛋白質および95kD蛋白質が存在しないこと
と相関する。
【0021】したがって、先行技術に基づく予想に反し
て、N. gonorrhoeaeに見出される鉄調節100kD外層膜蛋
白質はトランスフェリンレセプターである。N. meningi
tidisに見出される鉄調節95kD外層膜蛋白質は、驚くべ
きことに、N. gonorrhoeaeに見出される100kD蛋白質に
対して惹起される抗血清と交差反応し、かつN. meningi
tidisのトランスフェリンレセプターである。通常、ウ
サギ、マウス、ヤギ、サルおよびヒト等の哺乳動物にお
いて、N. gonorrhoeae由来のトランスフェリンレセプタ
ーに対して惹起される抗血清は、N. meningitidis由来
のトランスフェリンレセプターと交差反応し、N. menin
gitidis由来のトランスフェリンレセプターに対して惹
起される抗血清は、N. gonorrhoeae由来のトランスフェ
リンレセプターと交差反応する。モノクローナル抗体も
また、通常95kDおよび100kD蛋白質と交差反応する。
【0022】ここにおいて用いられるように、N. gonor
rhoeaeおよびN. meningitidis由来のトランスフェリン
レセプターとしては、N. gonorrhoeae由来の鉄調節100k
D外層膜蛋白質およびN. meningitidis由来の鉄調節95kD
外層膜蛋白質が挙げられる。これらのトランスフェリン
レセプターは蛋白質のクラスを構築するものであると理
解されるべきである。そのクラスには、例えば、N. gon
orrhoeaeおよびN. meningitidisの様々な細菌株におい
て自然に生じるアミノ酸配列が変化したものも含まれ
る。
【0023】本発明の蛋白質としては、さらに、N. gon
orrhoeaeまたはN. meningitidis由来のそれぞれ100kDま
たは95kDトランスフェリンレセプターの機能性アナログ
も含まれる。蛋白質がそれ以外の蛋白質と免疫学的に交
差反応する場合および同様の機能を有する場合、該蛋白
質は、以下に記載するように、特異的機能の故に他の蛋
白質の機能性アナログであると考えられる。アナログ
は、例えば、蛋白質のフラグメントまたは蛋白質の置
換、付加または欠失突然変異体であってもよい。
【0024】本発明の蛋白質および機能性アナログは本
質的には本精製されたものである。本明細書では、本質
的に精製されたものであるということは、蛋白質および
機能性アナログが、精製プロセス間に用いられる物質だ
けでなく、微量のその他のN.gonorrhoeaeおよびN. meni
ngitidis由来の鉄調節蛋白質をも含まないことを意味す
る。N. gonorrhoeaeおよびN. meningitidis由来のその
他の鉄調節蛋白質としては、その他のトランスフェリン
結合蛋白質が挙げられる。精製プロセスにおいて用いら
れる物質としては、洗浄剤、アフィニティ結合剤および
分離膜が挙げられる。洗浄剤としては、ドデシル硫酸ナ
トリウムおよびサルコシンが挙げられる。アフィニティ
結合剤としては、アガロース、アビジン−アガロース、
ストレプタビジン−アガロース、ビオチンおよびビオチ
ニル化トランスフェリン等のビオチニル化蛋白質が挙げ
られる。分離膜としては、ニトロセルロース紙およびニ
トロセルロース/セルロースアセテート紙が挙げられ
る。
【0025】組換えDNA 蛋白質が単離・精製されると、そのDNAの単離方法は
公知である。多くのこれらの方法が、Maniatisら,“Mo
lecular Cloning:A Laboratory Manual,”Cold Spring
Harbor Laboratory Press(1982)に記載されている。免
疫学的なスクリーニング法が好ましい。
【0026】例えば、上記のようなトランスフェリンに
結合した鉄を利用できる淋菌または髄膜炎菌株由来の染
色体DNAは単離され、標準的方法により適当な長さの
フラグメントに切断される。適当なDNA切断法として
は、例えば、超音波処理法や制限エンドヌクレアーゼの
を用いる方法等が挙げられる。適当な平均フラグメント
長はおよそ0.5〜10kbpである。
【0027】フラグメントにリンカーを添加し、得られ
たフラグメントを適当なベクターに連結させる。該リン
カーはベクター中の制限部位と符号する。適当なリンカ
ーとしては、例えば、EcoRIPstIおよびBamHIが挙
げられる。適当なベクターとしてはλ−gtllが挙げられ
る。連結したDNAは、Promega 製のキット等の市販の
キットによりパッケージされてもよい。得られたライブ
ラリーからの蛋白質をクローン化し、適当な宿主、典型
的にはE. Coli内で発現させる。クローン化は好ましく
は以下の突然変異、すなわちmcrA、mcrB、mcrC、mrr、h
sdS、hsdRおよびhsdMを伴うE. coli宿主内で行われる。
いくつかの好ましいE. coli株としては、DH5αMCR(BRL
製)および「SURE」(Stratagene製)が挙げられる。
【0028】得られるプラークを当技術分野で公知の方
法により免疫学的に選別する。Maniatisの同著を参照さ
れたい。適当な方法が下記の実施例6に記載されてい
る。スクリーニングは、Stratagene(La Jolla, CA)製の
ピコブルー・イムノロジカル・スクリーニングキット
(Picoblue Immunological Screening Kit)等の市販の
スクリーニングキットを用い、添付のStratageneプロト
コール(Stratageneまたは本明細書のファイルヒストリ
ーから得られる。)に従って行うことにより簡便化して
もよい。
【0029】トランスフェリン結合蛋白質特異性抗血清
を結合するプラークを非反応性プラークから選別し、精
製する。Maniatisの同著を参照されたい。精製されたフ
ァージ由来のDNAを当技術分野で公知の方法により単
離する。適当な方法としては、例えば、ポリエチレング
リコール沈降法、ファージ溶菌法および陰イオン交換ク
ロマトグラフィーが挙げられ、それらはQiagen(Studio
City, CA)製のキットを使用することにより簡便化でき
る。
【0030】得られたDNAは、当技術分野で公知の方
法により増幅してもよい。一つの適当な方法としては、
Mullisらによる米国特許第4,683,195 号およびSambroo
k,FritchおよびManiatis編によるMolecular Cloning, A
Laboratory Manual, 第2版,Cold Spring Harbor Lab
oratory Press(1989)に記載されているポリメラーゼ・
チェーン・リアクション(PCR)法が挙げられる。それ
はλ−gtll−特異性オリゴマー(New England Biolabs
より入手可能)を用いてλ−gtllベクター中でDNAク
ローンを増幅させるのに便利な方法である。
【0031】増幅されたクローンを適当なベクターに挿
入し、当技術分野で公知の方法にしたがってヌクレオチ
ド配列を決定する。適当なヌクレオチド配列決定法とし
ては、SangerらによるProc. Natl. Acad. Sci. USA 74,
5463-5467(1977)に記載されているジデオキシチェーン
ターミネーティング法が挙げられる。
【0032】ヌクレオチド配列決定のための適当なベク
ターおよびポリメラーゼは公知である。適当なベクター
としてはStratagene製のブルースクリプト(Bluescrip
t)ベクターが挙げられる。適当なポリメラーゼとして
はシーケナーゼ(Sequenase)(United States Biochem
ical Corp. 製,Cleveland, OH)が挙げられる。
【0033】通常、上記のイムノスクリーニング法で
は、トランスフェリン結合蛋白質特異性抗血清を有する
フラグメントを同定するために、多数のプラークを選別
することが必要である。例えば、ある実験では、淋菌
(FA19)染色体のフラグメントからおよそ500,000プラ
ークが得られた。N. gonorrhoeae由来の100kD トランス
フェリン結合蛋白質に対する抗血清を用いて二つのプラ
ークが同定された。挿入部の長さが323bpであるクロー
ン(pUNCH401)が一つのプラークから単離され、それ以
外のプラークからは挿入部の長さが483bpであるクロー
ン(pUNCH402)が単離された。これらのDNA配列はFA
19染色体の重複するフラグメントを表している。この二
つのフラグメントの重複部も含む共通配列を図1に示
す。75番目〜323番目のヌクレオチドは重複配列を表し
ている。1番目〜74番目のヌクレオチドは323bpフラグ
メントの非重複配列を表している。324番目〜558番目の
ヌクレオチドは483bpフラグメントの非重複配列を表し
ている。オープンリーディングフレームのみが、図1に
示すものとは反対方向に(すなわち、558番目のヌクレ
オチドから1番目のヌクレオチドに向かって)走ってい
る。実施例6aを参照のこと。
【0034】上記のフラグメントまたはそれらのサブフ
ラグメントは、トランスフェリン結合蛋白質遺伝子の付
加フラグメントを得るためのプローブとして用いられ
る。この技術を用いることにより、FA19染色体の8kbの
ClaIフラグメントおよび3.2kbのHincIIフラグメント
が、323 および483bp フラグメントとハイブリダイズす
る。3.2kb のHincIIフラグメントの制限酵素地図を図2
Bに示す。得られたフラグメントはヌクレオチド配列を
決定することができる。実施例7および8並びに図2A
を参照されたい。
【0035】フラグメントを適当に伸長することによ
り、遺伝子全体がヌクレオチド配列決定される。コード
する配列の限界は、挿入突然変異誘起等の当業界で公知
の方法により決定される。実施例9を参照されたい。95
kD髄膜炎菌トランスフェリン結合蛋白質のヌクレオチド
配列を決定するために、同様の方法が用いられる。実施
例10および11並びに図4〜図6を参照されたい。
【0036】組換え蛋白質 本発明の蛋白質は組換えDNA技術により作製すること
もできる。分離されたDNAから組換え蛋白質を作製す
るための適当な方法としては、Maniatisらの同著に記載
されている。
【0037】要約すれば、本発明のトランスフェリン結
合蛋白質をコードするDNAコードは、それらの蛋白質
の機能性アナログをコードするDNA同様、広範囲にわ
たる様々な宿主細胞および広範囲にわたる様々なベクタ
ーを用いて発現されてもよい。宿主細胞は、原核細胞で
あっても真核細胞であってもよい。DNAは天然源から
得られてもよく、場合によっては修飾されていてもよ
い。DNAはまた、その全体または部分的に合成されて
いてもよい。
【0038】ベクターは染色体DNA配列、非染色体D
NA配列および合成DNA配列のセグメントを含んでい
てもよい。いくつかの適当な原核性ベクターとしては、
colE 1pCR1pBR322pMB9およびRP4等のE. coli由来
のプラスミドが挙げられる。原核性ベクターとしてはま
た、M13およびその他の糸状菌の一本鎖DNAファージ
等のファージDNAの誘導体も挙げられる。
【0039】酵母において有用なベクターが利用でき
る。適当な例としては2uプラスミドが挙げられる。
【0040】哺乳動物細胞において使用する適当なベク
ターも公知である。そのようなベクターとしては、十分
公知であるSV-40 アデノウイルスの誘導体、レトロウイ
ルス誘導DNA配列およびプラスミドとファージDNA
の組合せから誘導されるベクターが挙げられる。
【0041】さらに真核性発現ベクターも当技術分野で
公知である(例えば、P.J. Southern およびP. Berg,
J. Mol. Appl. Genet. 1, 327-341(1982);S. Subraman
i ら,Mol. Cell. Biol. 1, 854-864(1981);R. J. Kau
fmannおよびP. A. Sharp,“Amplification And Express
ion Of Sequences Cotransfected withA Modular Dihyd
rofolate Reductase Complementary DNA Gene,” J. Mo
l. Biol.159, 601-621(1982);R. J. KaufmannおよびP.
A. Sharp, Mol. Cell. Biol. 159, 601-664(1982);S.
I. Scahill ら,“Expression And Characterization
Of The ProductOf A Human Immune Interferon DNA Gen
e In Chinese Hamster Ovary Cells,”Proc. Natl. Aca
d. Sci. USA 80, 4654-4659(1983);G. UrlaubおよびL.
A. Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4216-42
20(1980)参照のこと)。
【0042】有用な発現宿主としては、十分公知である
原核性および真核性宿主が挙げられる。いくつかの適当
な原核性宿主としては、例えば、E. coli SG-936、E. c
oliHB 101、E. coli W3110、E. coli X1776、E. coli X
2282、E. coli DHIおよびE.coli MRC1 等のE. coliPs
eudomonasBacillus subtilis等のBacillus、およびSt
reptomycesが挙げられる。適当な真核性細胞としては、
酵母およびその他の菌類、昆虫、COS細胞およびCHO細胞
などの動物細胞、組織培養のヒト細胞および植物細胞が
挙げられる。
【0043】本発明で有用な発現ベクターは、操作上ト
ランスフェリン結合蛋白質遺伝子またはそれらのフラグ
メントに連結する少なくとも一つの発現調節配列を含有
する。調節配列は、クローン化DNA配列の発現を調節
および制御するためにベクターに挿入される。有用な発
現調節配列の例としては、lac系、trp系、tac系、trc
系、ファージλの主なオペレーターおよびプロモーター
領域、fd被覆蛋白質の調節領域、3−ホスホグリセリン
酸キナーゼのプロモーター等の酵母の解糖プロモータ
ー、Pho5等の酵母酸ホスファターゼのプロモーター、酵
母の接合因子のプロモーターおよびポリオーマ、アデノ
ウイルス、レトロウイルスおよび、初期および後期プロ
モーターまたはSV40等のサルウイルス由来のプロモータ
ー、並びに原核および真核細胞およびそれらのウイルス
またはそれらを組合せた遺伝子の発現を調節するものと
して知られるその他の配列が挙げられる。
【0044】100kDまたは95kD蛋白質は当技術分野で公
知の方法により精製することができる。例えば、トラン
スフェリン結合蛋白質の全体または一部を、適当な融合
パートナーとの融合蛋白質の形態で発現させてもよい。
その融合パートナーは、好ましくは精製および同定を簡
便化させるものである。いくつかの有用な融合パートナ
ーとしては、β−ガラクトシダーゼ(Grayら,Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA 79, 6598(1982));trpE(Itakura
ら, Science 198, 1056(1977))およびプロテインA(U
hlen ら, Gene 23, 369(1983))が挙げられる。例え
ば、β−ガラクトシダーゼを含有する融合蛋白質は、抗
β−ガラクトシダーゼ抗体カラムを用いて、アフィニテ
ィクロマトグラフィーにより精製してもよい(Ullman,
Gene. 29, 27-31(1984))。
【0045】所望により、融合蛋白質がトランスフェリ
ン結合性蛋白質と融合パートナーとの間に切断可能な部
位を含有するような融合蛋白質をコードするDNAを作
製する。化学的および酵素的切断可能部位は共に当技術
分野で公知である。酵素的に切断され得る部位の適当な
例としては、コラゲナーゼにより特異的に認識され切断
される部位(Keilら, FEBS Letters 56, 292-296(197
5));エンテロキナーゼ(Hoppら, Biotechnology 6, 1
204-1210(1988));ファクターXa(Nagai ら,Methods E
nzymol.153, 461-481(1987));トロンビン(Eaton ら,
Biochemistry25,505(1986));およびグルタチオンS
−トランスフェラーゼ(Johnson,Nature 338, 585(198
9);およびVan Ettenら, Cell 58, 669(1989))が挙げ
られる。コラゲナーゼは配列Pro-X-Gly-Pro(配列中の
Xは中性のアミノ酸である。)においてプロリンとXと
の間を切断する。エンテロキナーゼは配列Asp-Asp-Asp-
Asp-Lysにおいてリジンの後ろを切断する。ファクターX
aは配列Ile-Glu-Gly-Argにおいてアルギニンの後ろを切
断する。トロンビンは配列Arg-Gly-Ser-Proにおいてア
ルギニンとグリシンの間を切断する。
【0046】特異的な化学的切断剤も公知である。例え
ば、臭化シアンは蛋白質においてメチオニン残基で切断
する。
【0047】一方、100kDおよび95kDトランスフェリン
レセプター蛋白質は誘導されるプロモーターの後ろで過
剰に発現させ、特異的トランスフェリンレセプター抗体
を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより精製さ
れてもよい。また別の方法として、過剰発現した蛋白質
は、当技術分野で公知の方法により、イオン交換、サイ
ズ排除および疎水的相互作用クロマトグラフィーを組合
せて精製してもよい。これら、およびその他の適当な方
法は、Marston による“The Purification ofEukaryoti
c Polypeptides Expressed in E. coli”(DNA Cloning,
D. M.Glover,Ed., Volume III. IRL Press Ltd., Engl
and, 1987)に記載されている。
【0048】有用性 プローブとしての蛋白質 N. gonorrhoeae 由来の100kD蛋白質、N. meningitidis
来の95kD蛋白質、およびそれらの機能性アナログは、淋
菌および髄膜炎菌感染により引き起こされる疾病を検出
および予防するうえで有用である。
【0049】例えば、蛋白質は、標識化して、淋病、敗
血性ショック、あるいは髄膜炎の被検患者の血清または
その他の体液等の試料中の蛋白質に対する抗体を検出す
るための標準的イムノアッセイにおけるプローブとして
用いてもよい。通常、請求の範囲Aによる蛋白質または
そのような蛋白質の機能性誘導体を、蛋白質の抗体を含
有すると思われる試料とインキュベートする。蛋白質
は、インキュベーション前、インキュベーション中また
はインキュベーション後のいずれかにおいて標識化す
る。試料中の抗体に結合した標識化蛋白質が検出されれ
ば、抗体が存在することになる。抗体は好ましくは固定
化されている。
【0050】蛋白質を有する抗体を検出するための適当
なアッセイとしては、当技術分野で公知であり、例えば
R. H. Kenneth, “Enzyme-Linked Antibody Assay with
Cells Attached to Polyvinyl Chloride Plates” in
Kenneth et al, MonoclonalAntibodies, Plenum Press,
N. Y., 376頁(1981) に記載されている標準ELISAプロ
トコールが挙げられる。要約すれば、プレートを十分量
の抗原性蛋白質で被覆し、検出可能量の抗体を結合させ
る。該プレートをポリペプチドとインキュベートした
後、適当なブロック剤、例えば10%正常ヤギ血清等でブ
ロックする。患者の血清などの試料を添加して終結点を
決定するために力価を求める。正および負の調節を同時
に加え、未知の試料中に存在する目的の抗体を定量す
る。続いてインキュベートし、試料を適当な酵素にコン
ジュゲートさせたヤギ抗ヒトIgでプローブする。試料中
の抗蛋白質抗体の存在は酵素の存在により示される。
【0051】イムノアッセイに使用するために、蛋白質
は放射性または非放射性原子および分子で標識化されて
いてもよい。それらの蛋白質とコンジュゲートさせるた
めのそのような標識および方法は当技術分野では公知で
ある。
【0052】有用な放射性標識のいくつかの例として
は、32P、125I、131Iおよび3Hが挙げられる。放射性標
識の使用については英国特許第2,034,323号、米国特許
第4,358,535号、および同第4,302,204号に記載されてい
る。
【0053】非放射性標識のいくつかの例としては、酵
素、発色団、電子顕微鏡で検出可能な原子および分子お
よび磁気特性により検出可能な金属イオンが挙げられ
る。いくつかの有用な酵素標識としては、基質中で検出
可能な変化を生じる酵素が挙げられる。いくつかの有用
な酵素およびその基質としては、例えば、西洋ワサビの
パーオキシダーゼ(ピロガロールおよびo−フェニレン
ジアミン)、β−ガラクトシダーゼ(フルオレセイン
β−D−ガラクトピラノシド)およびアルカリ性フォス
ファターゼ(5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル
フォスフェート/ニトロブルーテトラゾリウム)が挙げ
られる。酵素標識の使用については、英国特許第2,019,
404号、欧州特許第63,879号およびRotmanによるProc. N
atl. Acad. Sci., 47, 1981-1991(1961)に記載されてい
る。
【0054】有用な発色団としては、例えば、染料以外
に、蛍光性、化学発光性および生物発光性分子が挙げら
れる。本発明において有用ないくつかの具体的な発色団
としては、例えばフルオレセイン、ローダミン、テキサ
スレッド、フィコエリスリン、ウンベリフェロン、ルミ
ノールが挙げられる。
【0055】標識は、当技術分野で公知の方法によりプ
ローブにコンジュゲートしていてもよい。標識は官能基
を介して直接プローブに結合していてもよい。プローブ
はそのような官能基を含有しているか、あるいは含有さ
せることができるものである。適当な官能基のいくつか
の例としては、例えば、アミノ基、カルボキシル基、ス
ルフヒドリル基、マレイミド基、イソシアナート基、イ
ソチオシアナート基が挙げられる。
【0056】標識はまた、上記の方法によりプローブに
結合しているリガントによりプローブにコンジュゲート
していてもよいし、標識に結合しているリガントのレセ
プターによりプローブに結合していてもよい。いかなる
公知のリガンド−レセプター結合体も適当であるが、ビ
オチン−アビジン結合体が好ましい。
【0057】イムノアッセイに用いるために、蛋白質は
100kDまたは95kD蛋白質全体であってもよいし、あるい
はそれらの機能性アナログであってもよい。これらの蛋
白質の機能性アナログとしては、フラグメントおよび該
蛋白質の抗体への結合能力を損なわない置換、付加およ
び欠失突然変異体が挙げられる。トランスフェリン結合
蛋白質に特異的な抗体を検出できる蛋白質ならば、本発
明において有用である。
【0058】ワクチンにおける蛋白質 本発明のトランスフェリン結合蛋白質は、N. gonorrhoe
aeおよびN. meningitidisの生体機能にとって重要であ
り、かつ外層膜に見出されるものであるので、これらの
蛋白質はNeisseria感染により引き起こされる淋病、敗
血性ショックおよび髄膜炎等の疾病の予防用ワクチンに
有用である。このためには、該蛋白質が中和抗体を産生
することが必要である。中和抗体とは、インビトロまた
はインビボで著しく細菌細胞の増殖を阻害、かつ/ある
いは死滅させる抗体である。疾病に感染した哺乳動物の
疾病の微候を防ぐ、または弱めるのに十分阻害された場
合、細菌の増殖にインビボで著しく阻害される。抗原と
して100kDまたは95kD蛋白質または機能性アナログを含
有するワクチンを、本発明に従って淋菌または髄膜炎菌
の増殖を阻害または死滅させるのに用いてもよい。この
ための100kDまたは95kD蛋白質の機能性アナログとして
は、ヒト宿主などの哺乳動物宿主内で中和抗体を産生す
るフラグメントおよび置換、付加または欠失突然変異体
が挙げられる。
【0059】本発明では、さらに、ヒトを含む哺乳動物
N. gonorrhoeaeおよびN. meningitidisによる感染に
対して免疫するためのワクチン組成物を包含する。該ワ
クチンは、N. gonorrhoeae由来の100kDトランスフェリ
ンレセプターおよび/またはN. meningitidis由来の95k
Dトランスフェリンレセプターおよび薬学的に許容され
るアジュバントを含有する。100kDおよび95kD蛋白質の
代わりに、上記のような機能性アナログを代用してもよ
い。
【0060】ワクチンは適当なキャリア中の抗原を含有
する。ワクチンはムラミルペプチドおよびインターフェ
ロン、インターロイキン−1およびインターロイキン−
6等のリンフォカインなどのアジュバンドを含んでいて
もよい。抗原は、あるいは当技術分野において公知であ
るように酸化アルミニウム粒子等の適当な粒子に吸着し
ていてもよいし、リポソームに包まれていてもよい。
【0061】抗原はまた、S. typhimuriumのようなサル
モネラ(Salmonella)の無発病性の細菌株から誘導され
てもよい。そのようなワクチンは、当技術分野で公知で
あるように、サルモネラ菌株におけるトランスフェリン
結合蛋白質の活性蛋白質を含むクローン化DNAによっ
て調製されてもよい(例えば、Curtiss ら, Vaccine6,
155-160(1988)およびGalan ら,Gene 94, 29-35(1990)
参照のこと)。
【0062】本発明は、さらにヒトを含む宿主哺乳動物
を上記のワクチン組成物で免疫する方法を包含するもの
である。該ワクチンは、当技術分野で公知の方法により
哺乳動物に投与してもよい。そのような方法としては、
例えば、静脈内、腹腔内、皮下または筋肉内投与が挙げ
られる。
【0063】ワクチン組成物は、100kD蛋白質または95k
D蛋白質全体を含有していてもよいが、好ましくは100kD
または95kD蛋白質の非毒性フラグメントを含有してい
る。例えば、抗原性蛋白質のフラグメントを作製し、抗
原性部位を含有するそれらのフラグメントを決定するこ
とは十分公知である。抗原性があり非毒性であれば、フ
ラグメントの長さは特に限定されない。したがって、該
フラグメントはエピトープを決定するのに十分なアミノ
酸残基を含有していなければならない。既知の抗原性ポ
リペプチドから抗原性フラグメントを単離および同定す
る方法は、Salfeld らによるJ. Virol. 63, 798-808(19
89) およびIsola らによるJ. Virol. 63, 2325-2334(19
89)に記載されている。
【0064】フラグメントが、エピトープは決定する
が、短すぎて抗原性がない場合には、キャリア分子にコ
ンジュゲートしてもよい。いくつかの適当なキャリア分
子としては、キーホールリンペットヘモシアニン(keyh
ole limpet hemocyanin)およびウシ血清アルブミンが
挙げられる。コンジュゲーションは当技術分野で公知の
方法により行ってもよい。そのような方法の一つは、フ
ラグメントのシステイン残基をキャリア分子上のシステ
イン残基と結合することである。
【0065】処置用抗体 さらに、本発明は、本発明の蛋白質および機能性アナロ
グを特異的に認識し結合する中和抗体の単離を包含する
ものである。該抗体はポリクローナルまたはモノクロー
ナルでもよい。中和抗体およびワクチンとのコンジュゲ
ートに用いられる機能性アナログの定義(上記参照)
は、さらに中和抗体の作製にも適用される。
【0066】ポリクローナル抗体は、当技術分野で公知
の方法により蛋白質または機能性アナログが接種された
哺乳動物から単離される。モノクローナル抗体は、当技
術分野で公知の方法により作製されてもよい。これらの
方法としては、KohlerおよびMilsteinのNature 256, 49
5-497(1975)に記載の免疫学的方法およびHuseらのScien
ce 246, 1275-1281(1989)に記載の組換えDNA法が挙
げられる。
【0067】本発明はまた、N. gonorrhoeaeまたはN. m
eningitidisにより引き起こされる疾病に冒されている
哺乳動物(ヒトを含む)を、本発明の中和抗体をそのよ
うな哺乳動物に有効量投与することにより処置する方法
をも包含するものである。投与は、上記のようなワクチ
ンの投与と同様の方法により行ってもよい。
【0068】プローブとしての抗体 本発明のトランスフェリン結合蛋白質および機能性アナ
ログはまた、試料中のNeisseria gonorrhoeaeまたはNei
sseria meningitidisの存在の検出用プローブとして用
いる抗体の作製に用いられてもよい。該抗体はポリクロ
ーナルまたはモノクローナルであってもよい。この目的
のためには、機能性アナログは、試料中の100kDまたは9
5kD蛋白質の存在が検出可能な抗体を産生するものであ
れば、100kD蛋白質または95kD蛋白質のフラグメントお
よび置換、付加および欠失突然変異体であってもよい。
該試料は、例えば、N. gonorrhoeaeまたはN. meningiti
disに感染していると思われる哺乳動物(ヒトを含む)
の体液であってもよい。
【0069】抗体で蛋白質の存在を検出するアッセイ
は、先に記載しており、続いて標準ブロットおよびELIS
Aフォーマット等の公知のフォーマットを行う。これら
のフォーマットは、通常、抗体を95kDまたは100kD蛋白
質を含有すると思われる試料とインキュベートし、抗体
と蛋白質の複合体の存在を検出することである。抗体は
インキュベーション工程前、インキュベーション工程
中、あるいはインキュベーション工程後のいずれかの段
階において標識化される。好ましくは、蛋白質は検出前
に固定化される。固定化は、蛋白質をマイクロタイター
ウェル等の固相表面に直接結合させるか、あるいは蛋白
質を固定化抗体に結合させることにより達成されてもよ
い。
【0070】プローブとして用いた場合、抗体は通常、
当技術分野で公知の方法により標識化される。蛋白質に
有用な標識(上記参照)と同様の標識もまた、抗体の標
識として有用である。抗体を標識化する方法は、例え
ば、HunterおよびGreenwood によるNature 144, 945(19
62)およびDavid らによるBiochemistry 13, 1014-1021
(1974)に記載されている。それ以外の抗体を標識化する
方法が米国特許第3,940,475号および同第3,645,090号に
記載されている。
【0071】プローブとしての核酸分子 N. gonorrhoeae またはN. meningitidisの存在を検出す
るために、特定の配列を有する100kD蛋白質、95kD蛋白
質、あるいは100kDまたは95kD蛋白質のフラグメントを
コード化する核酸分子を用いることができる。核酸分子
はRNAでもDNAでもよい。
【0072】核酸分子プローブが試料中の特定の核酸分
子を認識するかどうかを決定する方法は、当技術分野で
は公知である。通常、試料中に存在すると思われる核酸
配列と相補的な標識化プローブが調製される。好ましく
は、目的とする核酸分子が固定化される。目的の核酸分
子にハイブリダイズしたプローブの存在は、試料中の核
酸分子の存在を示すものである。適当な方法の例が、Da
llasらによる“The Characterization of an Escherich
ia Coli Plasmid Determinant that Encodes for the P
roduction of a Heat-labile Enterotoxin."(K. N. Tim
mis およびA.Puehler 編, Plasmids of Medical, Envir
onmental, and Commercial Importance,Elsevier/North
-Holland Publishing Co., Amsterdam, 113-122 頁(197
5);Grunstein およびHogness によるProc. Natl. Aca
d. Sci USA 72, 3961-3965(1975);Palva らによる米国
特許第4,731,325 号(Orion-yhtyma, Espoo,Finlandに
譲渡されている。);Mullisらによる米国特許第4,683,
195号(Cetus Corporation, Emeryville, Californiaに
譲渡されている。);Schneiderらによる米国特許第4,8
82,269号(Princeton Universityに譲渡されてい
る。);およびSegevによるPCT出願WO 90/01069号に記
載されている。Schneiderらの特許およびSegevの出願
は、共にImClone Systems Inc., New York Cityのライ
センスである。
【0073】上記のプローブは当技術分野で公知の方法
により標識化される。オリゴヌクレオチドのプローブを
標識化する方法は、例えば、Leary ら, Proc. Natl. Ac
ad.Sci. USA(1983)80:4045;RenzおよびKurz, Nucl. A
cids Res. (1984) 12:3435;RichardsonおよびGumpor
t, Nucl. Acids Res. (1983) 11 :6167;Smithら,Nuc
l. Acids Res. (1985)13:2399;およびMeinkothおよび
Wahl, Anal. Biochem.(1984) 138:267 に記載されてい
る。
【0074】
【実施例】1.細菌株および培養条件 淋菌株FA19は、冷凍保存からGCB寒天に移し、1lのGCB
肉汁を含有するフラスコへの接種用として初濃度20KU
(Klett units)とする。培養は5%のCO2を伴って37℃
で激しく攪拌しながら40KUの濃度に達するまで行い、キ
レート剤、すなわちデスフェラル(desferal)を最終濃
度が50uMとなるように添加する。添加後、細胞を4時間
保存する。
【0075】髄膜炎菌株FAM20は、GCBおよびデスフェラ
ルの代わりにケレックス(Chelex)処理したCDMを用い
る以外は淋菌株FA19と同様の方法により調製する。
【0076】2a.淋菌トランスフェリン結合蛋白質の
アフィニティ精製 膜の調製法並びに淋菌トランスフェリン結合蛋白質の単
離および精製法は、Schryvers およびMorris(Infect. a
nd Immun. 56, 1144-1149(1988))の髄膜炎菌ラクトフェ
リン結合蛋白質で用いた方法と同様である。Schryvers
およびMorrisの報告文に記載されているこの方法は、こ
こに参考文献として挙げられる。SchryversおよびMorri
sの方法を以下のように修飾した。625ugのビオチニル化
トランスフェリン(ビオチニレーション反応剤としてPi
erce製ビオチン−S−S−NHSを用いてSchryversの方法
により調製される。)を、25mlの100mM NaCl/50mMトリ
ス(pH8.0)中で、25mgの淋菌株FA19由来の総膜蛋白質
と混合する。混合物はゆっくり攪拌しながら室温で1時
間インキュベートする。膜は17,000×gで10分遠心分離
してペレットにする。ペレットは25mlの100mM NaCl/50
mM トリス(pH8.0)に再懸濁し、続いてNA2 EDTAを最終
濃度が10mMとなるように、またN−ラウロイル−サルコ
シンを最終濃度が0.75%となるように添加する。膜は、
室温で10分間攪拌して可溶化される。2.5mlのストレプ
タビジン−アガロース(Sigma製)を添加し、室温で1
時間結合させる。樹脂を3000×gで5分間遠心分離し、
上清を除去し、樹脂を5mM EDTAおよび0.5 %N−ラウ
ロイル−サルコシンを添加した1M NaCl/50mM トリス
(pH8.0)中で2度洗浄した後、さらに何も添加されて
いない1M NaCl/50mM トリス(pH8.0)中で2度洗浄
する。蛋白質は、0.45%N−ラウロイル−サルコシンお
よび125mM β−メルラプトエタノールを添加した1M N
aCl/50mM トリス(pH8.0)によりマトリックスから溶
出する。
【0077】2b.髄膜炎菌トランスフェリン結合蛋白
質のアフィニティ精製 淋菌株FA19の代わりに髄膜炎菌株FAM20 を用いる以外
は、実施例2aと同様に操作を行う。
【0078】3a.淋菌トランスフェリン結合蛋白質の
単離 アフィニティ調製による溶出物(実施例2a)をアミコ
ン・コンセントレーター(Amicon concentrator)(30,
000MW分画)を用いて濃縮する。得られた濃縮蛋白質調
製物を20%グリセロール、4% SDS、130mM トリス(pH
8.0)、10ug/mlブロモフェノール・ブルーに可溶化し、
Laemmli (Nature, 227, 680-685(1970))の方法にしたが
って7.5 % SDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離す
る。ゲルはクーマシー・ブリリアント・ブルー(Coomas
sie Brilliant Blue)で染色し、蛋白質が見えるように
する。この方法により2種類の蛋白質が単一のバンドと
して分離される。トランスフェリンの分子量はおよそ80
kDである。トランスフェリン結合蛋白質の分子量はおよ
そ100kDである。100kD蛋白質のバンドは、切り出して凍
結乾燥し、冷浸する。
【0079】3b.髄膜炎菌トランスフェリン結合蛋白
質の単離 実施例2aの溶出物の代わりに実施例2bの溶出物を用
いる以外は、実施例3Aと同様の操作を行う。
【0080】4.トランスフェリン結合蛋白質に対する
抗血清 実施例3aおよび3bで得られた微細粉末を別々に生理
的食塩水に再懸濁し、同量のフロインドのアジュバント
(初回注射用として完全アジュバント;追加注射用とし
ては不完全アジュバント)と混合し、ニュー・イングラ
ンド・ホワイト(New England White)種のメスのウサ
ギに注射する。注射は2週間の間隔で行う。抗100kD蛋
白質抗体は、精製されたトランスフェリン結合蛋白質に
対するウエスタンブロッティングにより、3回目の注射
から2週間後に検出できる。
【0081】5a.淋菌DNA λ−gtll発現ライブラ
リー 淋菌株FA19由来の染色体DNAは、Seifert ら, J. Bac
teriol. 172, 40-46(1990)にしたがって単離され、標準
的な操作(Maniatisら, 1982)により超音波処理され
て、平均サイズが500bpのフラグメントを得る。EcoRI
リンカーを添加し、得られたフラグメントをEcoRI消化
λ−gtllDNAに連結させる(Maniatisら, 1982)。連
結されたDNAはPromega製キットを用いてパッケージ
される。
【0082】5b.髄膜炎菌DNA λ−gtll発現ライ
ブラリー 髄膜炎菌株FAM20由来の染色体DNAは、Seifertら, J.
Bacteriol. 172, 40-46(1990) にしたがって単離さ
れ、制限エンドヌクレアーゼHincIIで消化される。EcoR
Iリンカーを添加し、得られたDNA分子をEcoRIで消
化して、EcoRI消化λ-Zap(Stratagene製) に連結させ
る。連結されたDNAはPromega製キットを用いてパッ
ケージされる。
【0083】6a.発現ライブラリーの免疫学的スクリ
ーニング 実施例5aおよび5bのライブラリーから得られたおよ
そ500,000のプラークを、ピコブルー・イムノロジカル
・スクリーニング・キット(PicoblueImmunological Sc
reening Kit)に添付されているStratageneのプロトコ
ールに記載されている免疫学的スクリーニング法により
選別する。要約すると、一次抗血清をStratagene製(La
Jolla, CA)より入手可能なE. coli/ファージ溶解物
に、添付のプロトコールにしたがって吸着される。およ
そ5×104 pfu(プラーク形成単位;plaque forming un
its)をE. coli宿主菌株であるY1090にプレートする。1
0mMのイソロピルチオガラクトシド(IPTG)に浸漬した
ニトロセルロースフィルターをプレートにのせ、続いて
42℃で3〜4時間インキュベートする。そして、フィル
ターを除去した後でプレートを一晩インキュベートし、
トリス緩衝化生理食塩水および0.05%ツイーン(Twee
n)−20(TBST)で洗浄して、トリス緩衝化生理食塩水
および5%ウシ血清アルブミンで1時間ブロックする。
その後、1:200に希釈した吸着一次抗体でフィルター
を1時間インキュベートする。一次抗体と共にインキュ
ベートした後、フィルターをTBSTで十分洗浄し、それか
ら二次抗体(1:3000に希釈したアルカリ性フォスファ
ターゼとコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ抗体、Bio-Ra
dより購入)で1時間インキュベートする。その後、フ
ィルターをTBSTで十分洗浄し、最後に0.3mg/mlニトロ
ブルーテトラゾリウム(NBT)、0.15mg/ml 5−ブロモ
−4−クロロ−3−インドイルフォスフェート(BCI
P)、100mM トリス(pH9.8)、100mM NaCl、5mM MgC
l2で十分に発色展開するまでインキュベートする。
【0084】トランスフェリン結合蛋白質特異的抗血清
に結合しているプラークを採取し、その他の非反応プラ
ークから純別する。精製プラーク由来のDNAを単離
し、陰イオン交換クロマトグラフィー(Qiagen, Studio
City, CA より購入のカラム)を用いて精製する。
【0085】6b.DNAプローブを用いた発現ライブ
ラリーのスクリーニング 実施例5aおよび5bのライブラリーから得られたプラ
ークもまた、標識化DNAプローブを用いて選別され
る。オリゴマーTfBP1、2、3または5は、ジゴキシジ
ェニン−11−dUTPおよびDNAテイリングキット(共
に、Boehringer Mannhein Biochemicals(BMB)製)を
用いて非放射性的に標識化される。オリゴマーの配列は
以下のとおりである:
【0086】TFBP1:GAG CCC CCC AAT GCG CCG CT TFBP2:AGC GGC GCA TTG GCG GGC TC TFBP3:GGG GCG CAT CGG CGG TGC GG TFBP5:AAA ACA GTT GGA TAC CAT AC
【0087】DNA標識化および検出のプロトコールは
BMB より遺伝子非放射性DNA標識・検出キット(Geni
us nonradioactive DNA labeling and detecting kit)
として入手可能である。一方、同様のオリゴマーは標準
的な技術によりα−32p−dCTPおよびBMBのDNAテイリ
ングキットを用いて放射性に標識化される(Maniatis
ら, 1982)。
【0088】7.DNAの増幅および塩基配列決定 実施例5または6で得られたDNAは、PCR 法(Sambro
okら編, Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 第
2版.Cold Spring Harbor Press(1989))によりλ−gt
ll特異性オリゴマーをアンプライマーとして用いて増幅
される。したがって、増幅される挿入部は、ブルースク
リプトベクター(Bluescript vector)(Stratagene
製)中で、標準的な技術(Maniatisら, 1982)を用いて
クローン化され、Sangerら(Proc. Natl. Acad. Sci US
A 74, 5463-5467(1977))のジデオキシ・チェーン・タ
ーミネーティンク法によりシーケナーゼ(United State
s Biochemical Corp. 製, Cleveland, OH)を用いて塩
基配列が決定される。
【0089】8.淋菌株FA19由来の100kDトランスフェ
リン結合蛋白質遺伝子の付加的なヌクレオチド配列 実施例6および7の一般的な方法を用いて、およそ1.0k
bpの染色体Sau3AIフラグメントを同定する。このフラグ
メントをベクターpHSS6-GCU のBamHI部位にクローン化
する(Eikinsら, V. Bacteriol, 173, 3911-3913(199
1))(GCUとは、淋菌取り込み配列(gonococcal uptake
sequence)として知られている10bpのヌクレオチド配
列がベクターに含有されていることを意味する。)。こ
のヌクレオチド配列は、淋菌への種特異的なDNAの取
り込みを仲介することが知られている(Elkinsら)。こ
のクローニングのための宿主菌株はHB101であった。得
られたクローンはpUNCH403であることが知られている。
【0090】pUNCH403の挿入部は、Kraft らによるBiot
echniques 6, 554-556(1988)に記載される方法により、
二本鎖鋳型を用いてその全体が配列決定される。ヌクレ
オチド配列は、シーケナーゼ(Sequenase,登録商標)
(United States Biochemicals製)を用いて、Sangerの
ジデオキシ法により決定される。pUNCH403中のSau3AIフ
ラグメントのヌクレオチド配列を図2Aに示す。図2A
の1〜558 番目のヌクレオチドの配列は、pUNCH401とpU
NCH402(図1)およびpUNCH403(図2A)の重複部位を
示している。ヌクレオチド659番目からヌクレオチド1
番目に向かう一つのオープンリーディングフレームが存
在する。したがって、メチオニン残基をコード化するヌ
クレオチド659番目(図2Aに示されるものと相補的な
鎖上)から始まるコドンは遺伝子の5’末端である。
【0091】9.100kDトランスフェリン結合蛋白質の
構造および機能の証明 100kD トランスフェリン結合蛋白質遺伝子の不活性化の
効果を調べるために、SeifertらによるGenetic Enginee
ring, Principals and Methods およびSetlow,J. K. お
よびHolleander, A. 編のPlenum Press, N. Y., 第8
巻,123-134 頁に記載のプロトコールにしたがって、ト
ランスポゾン挿入部をpUNCH403の挿入部の長さに合わせ
て単離する。mTn3CATトランスポゾンをシャトル突然変
異誘起によりE. coliに挿入し、それから突然変異体を
作製するためにFA19においてクロラムフェニコール耐性
形質転換体を選択する。mTn3CATトランスポゾンについ
ては、Seifertらによりm-Tn3(Cm)として述べられてい
る。その後、突然変異体を、唯一の鉄供給源としてのト
ランスフェリン上での増殖能力およびウエスタンブロッ
トによりアッセイされる100kD蛋白質の発現能力により
評価する。その実験の結果を図3に示す。「I」の44、
37および24で示される位置にあるトランスポソン100kD
蛋白質の発現およびトランスフェリン上での増殖能力を
共に失わせる。しかしながら、「A」位置にあるトラン
スポゾンはトランスフェリン上で幾分か増殖させ、いく
つかの検出可能な元来の長さのトランスフェリン結合蛋
白質を発現させる。これらの結果より、659位(図2A
参照)にある逆向きの挿入部は野生型の長さの蛋白質を
発現させるので、100kD蛋白質をコード化している構造
遺伝子はこの位置から始まる、という仮定が確認され
る。発現が、突然変異体「A」中の野生型レベルで検出
されないという事実から、推定上の開始コドンの逆向き
の領域が100kD蛋白質をコードする遺伝子の調節に重要
であることがわかる。
【0092】10.髄膜炎菌ゲノムライブラリーの構築お
よび選別 95kD髄膜炎菌トランスフェリン結合蛋白質遺伝子は3工
程でクローン化された。第1工程では、淋菌の抗血清を
用いて、λ−ZapIIライブラリー由来の1.3kbのHincII/
EcoRIフラグメントを同定した(図4参照)。このフラ
グメントのヌクレオチド配列を図5に示す。推定上の開
始コドンを矢印で示すが、これはまた転写の方向を示す
ものでもある。先に述べたリポソーム結合部位には下線
を引いてある。1.3kbフラグメントには約500bpの95kD蛋
白質構造遺伝子が含まれている。このクローンは、髄膜
炎菌株FAM20 染色体の単一の5kb ClaIフラグメントに
ハイブリダイズした。ベクターpHSS6-GCU(実施例8に
記載)における部分的な5kb ClaIライブラリーが構築
され、プローブとして1.3kbフラグメントを用いて5kb
ClaIフラグメントをクローン化した。このClaIフラグ
メントの部分制限地図により、このフラグメントは構造
遺伝子船隊をコードしないことが示唆された。したがっ
て、第3工程において、3.5kbのClaI/EcoRIフラグメ
ント(第2工程で得られた5kbのClaIフラグメントか
ら産生)をプローブとして用いたところ、λ−ZapIIラ
イブラリー(Stragagene製)由来の隣接するHincIIフラ
グメントのクローニングが行われた。このHincIIフラグ
メントは約3.5kbの長さであり、おそらく95kD蛋白質構
造遺伝子の残部をコードするものである。この3.5kb Hi
ncIIフラグメントは、E. Ozkaynak およびS. D. Putney
によるBiotechniques 5,770(1987) に記載されているよ
うに、エクソヌクレアーゼ(Exonuclease)IIIおよびVI
Iを用いて一定方向性の欠失を起こすことにより、ヌク
レオチド配列が決定された。
【0093】11.95kDトランスフェリン結合蛋白質の構
造および機能の証明 髄膜炎菌の95kD蛋白質遺伝子を突然変異させるために、
1.3kb のHincII/EcoRIフラグメントを用いた。mTn3CA
Tトランスポゾンの代わりにmTn3ermトランスポゾンを1.
3kbクローンに導入した以外は、実施例9に記載されて
いるのと同様のシャトル突然変異操作を用いた。mTn3er
mトランスポゾンは、実施例9に記載のmTn3CATトランス
ポゾンを修飾してエリスロマイシン耐性を付与すること
により作製された。この修飾によりエリスロマイシン耐
性髄膜炎菌形質転換体が選択できるようになる。これら
の形質転換体は、実施例9で記載されたようなトランス
フェリンプレート上での増殖能力により選別された。こ
の突然変異誘起実験の結果を図6に詳細に示す。mTn3er
m挿入部および2は、95kD蛋白質の発現およびトランス
フェリンプレート上でのクローンの増殖能力を完全に失
わせたが、mTn3erm挿入部3および4は、トランスフェ
リン上での増殖が幾分か見られ、ウエスタンブロット上
にいくらかの95kD蛋白質を示した。ヌクレオチド配列決
定および突然変異誘起のデータから鑑みて、mTn3erm挿
入部1および2は、各々構造遺伝子およびプロモーター
領域中に存在することは明らかであるが、一方、挿入部
3および4は、発現の正の調節領域に含まれるであろう
逆向きの領域中に存在すると思われる。
【0094】補足引用文献 請求の範囲に記載の発明は、明細書および容易に入手可
能な引用文献および出発物質にしたがって実施可能であ
る。しかし、発明の実施および利用が容易になるよう
に、以下の細胞系をAmerican Type Culture Collectio
n, Bethesda, Marylandに1990年7月16日に寄託してい
る: 髄膜炎菌細胞系FAM18(取得番号 ACTT 55071) 髄膜炎菌細胞系FAM20(取得番号 ACTT 55072) 淋菌細胞系FA19 (取得番号 ACTT 55073)。 さらに、有用なプロトコールおよび情報を含む以下のパ
ンフレットが本明細書のファイルヒストリーで利用でき
る。 "Predigested Lambda Zap/Eco RI Cloning Kit Instruc
tion Manual,"Stratagene, La Jolla, California (Nov
ember 20, 1987); "Gigapack Plus"(for packaging recombinant lambda p
hage), Stratagene, La Jolla, California (April 25,
1988); "picoBlue Immunoscreening Kit"Instruction Manual,"
Stratagene, La Jolla, California (May 19, 1989);
および"Genius Nonradioactive DNA Labeling and Dete
ction Kit,"Boehringer Mannheim Biochemicals, India
napolis, Indiana (January, 1989)。
【0095】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF NORTH CAROLINA AT CHAPEL HILL <120> TRANSFERRIN BINDING PROTEINS FROM NEISSERIA GONORRHOEAE AND NEISSERIA MENINGITIDIS <130> P04261309 <140> <141> 1991-08-23 <150> US 572,187 <151> 1990-08-23 <160> 7 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 558 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 1 agcaaagcct ccgcaccgcc gatgcgcccc gccagcgcga tggattgggt aagcccccgg 60 tttttgccgg aataggcggt tttactctga atgccccact gcctgccttc cccgataaca 120 tcgtcggcgg ttttggtttg aaatgcgacc gagcccgcca atgcgccgct gccttgttcg 180 accgagtttg agcctttgct gatttcgaca gccttgacgt tctcatactc gatttcattg 240 attgcgccgc tgctgcccgc cgtcctcgtc ccgcccaatg ccgcctgcgc gtgtaggact 300 gtatttgcgc caagccgtcc accgtcaagg agacgcggtt tttgtccata ccgcgtatcg 360 agtagcccga gcttgcgccg cgcccctgtt cgacgacggc gatgccgggg tcgtaacgcg 420 tcaggtcgcg gatgtcgagt acctgttcct tgctggaggg tgtcggcggt tttgaccaat 480 ttgcccaaac cggttacttc gttatcgcgg cgggttttct gttttttggc ttttacctgt 540 atggtatcca actgtttt 558 <210> 2 <211> 918 <212> DNA <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 2 agcaaagcct ccgcaccgcc gatgcgcccc gcc
agcgcga tggattgggt aagcccccgg 60 tttttgccgg aataggcggt tttactctga atg
ccccact gcctgccttc cccgataaca 120 tcgtcggcgg ttttggtttg aaatgcgacc gag
cccgcca atgcgccgct gccttgttcg 180 accgagtttg agcctttgct gatttcgaca gcc
ttgacgt tctcatactc gatttcattg 240 attgcgccgc tgctgcccgc cgtcctcgtc ccg
cccaatg ccgcctgcgc gtgtaggact 300 gtatttgcgc caagccgtcc accgtcaagg aga
cgcggtt tttgtccata ccgcgtatcg 360 agtagcccga gcttgcgccg cgcccctgtt cga
cgacggc gatgccgggg tcgtaacgcg 420 tcaggtcgcg gatgtcgagt acctgttcct tgc
tggaggg tgtcggcggt tttgaccaat 480 ttgcccaaac cggttacttc gttatcgcgg cgg
gttttct gttttttggc ttttacctgt 540 atggtatcca actgtttttc ctgtgcttgt ccg
gcttgca cattttctgc ataagcgggc 600 agcgcagtca ttaaagacag gcataaaata ttt
aatcgga acaaatgttg ctgttgcata 660 gtgtttccct aatcttcgct ttcagacgga atc
ggaagga acgatgccgt ctgaagcctt 720 attctcgatt gttgttcggc agccgtgctt att
tcacaag cttttggcgt ttcgcaccga 780 atacgacagt tgcactgctt gctgaatttc cat
tgccgga ttcaactgtt gcatttttcg 840 tttgttcatt gcccggatag gcaaaccatc cgc
ccaactc ttcggcgtta ggcccgtaaa 900 aaccgccctg cacttcgg
918 <210> 3 <211> 1192 <213> Neisseria gonorrhoeae <400> 3 aattccgacg gagtggagct ttcactgctg ccgtctgagg gcaataaggc ggcatttcag 60 cacgagattg agcaaaacgg cgtgaaggca acggtgtgtt gttccaactt ggattacatg 120 agttttggga agctgtcaaa agaaaataaa gacgatatgt tcctgcaagg tgtccgcact 180 cctgtatccg atgtggcggc aaggacggag caaacgccaa atatcgcggt acttggtacg 240 gatatattgc caacggcaca agctggagcg cgaagcctcc aatcaggaag gtggtaatag 300 ggcagagttt gacgtggatt tttccactaa aaaaatcagt ggcacactga cggcaaaaga 360 ccgtacgtct cctgcgttta ctattactgc catgattaag gacaacggtt tttcaggtgt 420 ggcgaaaacc ggtgaaaacg gctttgcgct ggatccgcaa aataccggaa attcccacta 480 tacgcatatt gaagccactg tatccggctg gtttctacgg caaaaacgcc atcgagatgg 540 gcggattcgt tctcatttcc gggaaatgca ccagagggaa aacaagaaaa agcatcggtg 600 gtattcggtg cgaaacgcca acagcttgtg caataagcac ggctgccgaa caatcgagaa 660 taaggcttca gacggcacgt tccttccgat gccgtctgaa agcgaagatt agggaaacat 720 catgcaacag caacatttgt tccgattaaa tattttatgc ctgtctttaa tgaccgcgcg 780 ctgcccgttt atgcagaaaa tgtgcaagcc gaacaagcac aggaaaaaca gttggatacc 840 atacaggtaa aagccaaaaa acagaaaacc cgccgcgata acgaagtaac cgggctgggc 900 aagttggtca agtcttccga tacgctaagt aaagaacagg ttttgaatat ccgagacctg 960 acccgttatg atccggtatt gccgtggtcg aacagggtcg gggcgcaagt tcggctattc 1020 aatacgcggc atggataaaa accgcgtttc cttaacggta gacggcgttt cgcaaataca 1080 gtcctacacc gcgcaggcgg cattgggtgg gacgaggacg gcgggtacga gcggcgcaat 1140 caatgaaatc gagtatgaaa acgtcaaggc cgttgaaatc agcaagggtt cg 1192 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed probe based on Neisser ia gonorrhoeae <400> 4 gagcccccca atgcgccgct 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed probe based on Neisser ia gonorrhoeae <400> 5 agcggcgcat tggcgggctc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed probe based on Neisser ia gonorrhoeae <400> 6 ggggcgcatc ggcggtgcgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:Designed probe based on Neisser ia gonorrhoeae <400> 7 aaaacagttg gataccatac 20
【図面の簡単な説明】
【図1】pUNCH401およびpUNCH402挿入部から得られる淋
菌株FA19由来の100kD蛋白質遺伝子の部分DNAヌクレ
オチド配列を示す。実施例6aおよび実施例7を参照の
こと。
【図2A】pUNCH403挿入部における100kDトランスフェ
リン結合蛋白質遺伝子フラグメントのヌクレオチド配列
を示す。大文字は、クローンpUNCH401およびpUNCH402
(図1)およびpUNCH403間での重複領域を示す。100kD
淋菌トランスフェリン結合蛋白質の提案される開示コド
ンは、659番目のヌクレオチドで生じる。オープンリー
ディングフレームの方向は、図で示される方向とは逆
(すなわち、659番目から1番目のヌクレオチドに向か
う方法)である。実施例8を参照のこと。
【図2B】3.2kbのHincIIフラグメントの制限酵素地図
を示す。
【図3】pUNCH403における100kD淋菌トランスフェリン
結合蛋白質フグメントのトランスポゾン挿入部および各
突然変異体の相当する表現型の位置を示す。トランスポ
ゾン(mTn3CAT)はシャトル突然変異誘起によりE. coli
に挿入された。突然変異体を作製するために、FA19にお
いてクロラムフェニコール耐性形質転換体を選択した。
各トランスポゾン挿入部(逆三角形で示す。)の下に、
2.5uMヒトトランスフェリン(鉄で25%が飽和されてい
る。)上で増殖およびウエスタンブロットによりアッセ
イされる蛋白質の発現を+または−で示す。波線矢印で
示されるオープンリーディングフレームは、右から左へ
(図2Aでの方向性と同じ。)読み取り、Mで示される
メチオニンで開始される。典型的な−10ヌクレオチド配
列が見出されたが(−10)、規範的な−35ヌクレオチド
配列は同定できなかった。野性型の増殖および蛋白質の
発現は、右側に「No Tn」の見出しの下に示す。
【図4】髄膜炎菌95kDトランスフェリン結合蛋白質遺伝
子のクローニング化計画を示すものである。1.3kbのHin
cII/EcoRIフラグメントは、抗体プローブを用いて、
λ−ZapIIライブラリーよりクローン化された。第2工
程で示される5.0kbおよび3.5kbフラグメントは、プロー
ブとして該1.3kbフラグメントを用いて、pHSS6-GCU のC
laIライブラリーの一部からクローン化された。第3工
程の3.5kbのHincIIフラグメントは、第2工程の3.5kbの
EcoRI/ClaIフラグメントをプローブとして用いて、
λ−ZapIIライブラリーからクローン化された。第1〜
3工程で得られたフラグメントは、「FAM20染色体」と
見出しの付いたフラグメントで示されるように、共に適
合する。
【図5】図4の第1工程で得られた1.3kbのHincII/Eco
RIフラグメントのヌクレオチド系列を示す。リポソー
ム結合部位には下線を引いてある。ATG開始コドンおよ
び転写方向は矢印で示す。実施例10を参照のこと。
【図6】図4の第1工程で得られた1.3kbのHincII/Eco
RIフラグメントを含むトランスポゾン突然変異誘起実
験の結果を示す。実施例11を参照のこと。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考) A61P 43/00 111 C07K 14/22 C07K 14/22 16/12 16/12 C12P 21/08 C12P 21/08 C12Q 1/02 C12Q 1/02 G01N 33/53 D G01N 33/53 33/569 F 33/569 C12N 15/00 ZNAA (72)発明者 コーネリセン,シンチア,ナウ アメリカ合衆国 27606 ノースカロライ ナ州,ラレイ,マーシ アベニュー 308 Fターム(参考) 4B024 AA01 BA48 BA63 CA04 DA05 DA06 EA04 GA11 HA01 4B063 QA01 QQ06 QR48 QS33 QS40 QX10 4B064 AG20 AG27 CA02 CA10 CC24 DA01 DA15 4C085 AA03 AA13 AA14 BA16 BB07 CC04 CC07 DD22 FF02 FF24 GG02 GG04 GG06 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA11 DA50 DA75 EA29 EA52 FA30 FA71 FA74 GA26 HA07

Claims (18)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 (a)洗浄剤; (b)ニトロセルロース/セルロースアセテート紙;お
    よび (c)Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria meningi
    tidis由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず;トランスフェリンアフィニティー
    カラムにより単離され;Neisseria gonorrhoeaeに見出
    される分子量およそ100kDの鉄調節外層膜蛋白質に対し
    て惹起される抗血清と特異的に結合し;Neisseria gono
    rrhoeaeまたはNeisseria meningitidisにおけるトラン
    スフェリンレセプター機能において重要である、Neisse
    ria gonorrhoeaeまたはNeisseria meningitidisの外層
    膜に見出される鉄調節蛋白質、およびそのような蛋白質
    の機能性アナログ。
  2. 【請求項2】 蛋白質がNeisseria gonorrhoeaeに見出
    され、かつ分子量が100kDである、請求項1記載の蛋白
    質。
  3. 【請求項3】 蛋白質がNeisseria meningitidisに見出
    され、かつ分子量が95kDである、請求項1記載の蛋白
    質。
  4. 【請求項4】 蛋白質がNeisseria gonorrhoeaeまたはN
    eisseria meningitidisのトランスフェリンレセプター
    である、請求項1記載の蛋白質。
  5. 【請求項5】 蛋白質が標識化されている、請求項1記
    載の蛋白質。
  6. 【請求項6】 (a)洗浄剤; (b)ニトロセルロース/セルロースアセテート紙;お
    よび (c)Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria meningi
    tidis由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず;トランスフェリンアフィニティー
    カラムにより単離され;Neisseria gonorrhoeaeに見出
    される分子量およそ100kDの鉄調節外層膜蛋白質に対し
    て惹起される抗血清に特異的に結合し;Neisseria gono
    rrhoeaeまたはNeisseria meningitidisのトランスフェ
    リンレセプター機能において重要である、Neisseria go
    norrhoeaeまたはNeisseria meningitidisの外層膜に見
    出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性
    アナログに対して惹起される単離抗体。
  7. 【請求項7】 抗体が試料中のNeisseria gonorrhoeae
    またはNeisseria meningitidisの存存の検出に適当であ
    る、請求項6記載の抗体。
  8. 【請求項8】 抗体がN. gonorrhoeaeまたはN. meningi
    tidisに感染した哺乳動物の処置に適当である、請求項
    6記載の抗体。
  9. 【請求項9】 抗体の蛋白質への結合がNeisseria gono
    rrhoeaeまたはNeisseria meningitidisの増殖を阻害す
    る、請求項6記載の抗体。
  10. 【請求項10】 抗体の結合が蛋白質のトランスフェリ
    ンレセプター機能をブロックする、請求項6記載の抗
    体。
  11. 【請求項11】 抗体がモノクローナルである、請求項
    6記載の抗体。
  12. 【請求項12】 (a)洗浄剤; (b)ニトロセルロース/セルロースアセテート紙;お
    よび (c)Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria meningi
    tidis由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず;トランスフェリンアフィニティー
    カラムにより単離され;Neisseria gonorrhoeaeに見出
    される分子量およそ100kDの鉄調節外層膜蛋白質に対し
    て惹起される抗血清に特異的に結合し;Neisseria gono
    rrhoeaeまたはNeisseria meningitidisのトランスフェ
    リンレセプター機能において重要である、Neisseria go
    norrhoeaeまたはNeisseria meningitidisの外層膜に見
    出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性
    アナログの有効量および薬学的に許容されるキャリアを
    含有するワクチン組成物。
  13. 【請求項13】 蛋白質がNeisseria gonorrhoeaeに見
    出され、かつ分子量が100kDである、請求項12記載の
    ワクチン。
  14. 【請求項14】 蛋白質がNeisseria meningitidisに見
    出され、かつ分子量が95kDである、請求項12記載のワ
    クチン。
  15. 【請求項15】 (a)洗浄剤; (b)ニトロセルロース/セルロースアセテート紙;お
    よび (c)Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria meningi
    tidis由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず;トランスフェリンアフィニティー
    カラムにより単離され;Neisseria gonorrhoeaeに見出
    される分子量およそ100kDの鉄調節外層膜蛋白質に対し
    て惹起される抗血清に特異的に結合し;Neisseria gono
    rrhoeaeまたはNeisseria meningitidisのトランスフェ
    リンレセプター機能において重要である、Neisseria go
    norrhoeaeまたはNeisseria meningitidisの外層膜に見
    出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性
    アナログの有効量および薬学的に許容されるキャリアを
    含有するワクチン組成物を宿主に投与する工程を含む、
    Neisseria gonorrhoeaeまたはNeisseria meningitidis
    のにより引き起こされる疾病に対して哺乳動物を免疫す
    る方法。
  16. 【請求項16】 (a)洗浄剤; (b)ニトロセルロース/セルロースアセテート紙;お
    よび (c)Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria meningi
    tidis由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず;トランスフェリンアフィニティー
    カラムにより単離され;Neisseria gonorrhoeaeに見出
    される分子量およそ100kDの鉄調節外層膜蛋白質に対し
    て惹起される抗血清に特異的に結合し;Neisseria gono
    rrhoeaeまたはNeisseria meningitidisのトランスフェ
    リンレセプター機能において重要である、Neisseria go
    norrhoeaeまたはNeisseria meningitidisの外層膜に見
    出される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性
    アナログに対して惹起される単離抗体を哺乳動物に有効
    量投与することを含む、N. gonorrhoeaeまたはN. mening
    itidisにより引き起こされる疾病に冒されている哺乳動
    物を処置する方法。
  17. 【請求項17】 (a)(1)洗浄剤; (2)ニトロセルロース/セルロースアセテート紙;お
    よび (3)Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria meningi
    tidis由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず;トランスフェリンアフィニティー
    カラムにより単離され;Neisseria gonorrhoeaeに見出
    される分子量およそ100kDの鉄調節外層膜蛋白質に対し
    て惹起された抗血清に特異的に結合し;Neisseria gono
    rrhoeaeまたはNeisseria meningitidisにおけるトラン
    スフェリンレセプター機能に重要である、Neisseria go
    norrhoeaeまたはNeisseria meningitidis外層膜に見出
    される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性ア
    ナログに対する抗体を含有していると思われる試料と共
    に、請求項1に記載の蛋白質をインキュベートするこ
    と; (b)該蛋白質を工程(a)のインキュベーション前、
    インキュベーション中またはインキュベーション後のい
    ずれかに標識化すること;および (c)試料中の抗体に結合する該標識化蛋白質を検出す
    ること の工程を含む、試料中のN. gonorrhoeaeまたはN. menin
    gitidis特異性抗体の存在を検出する方法。
  18. 【請求項18】 (a)(1)洗浄剤; (2)ニトロセルロース/セルロースアセテート紙;お
    よび (3)Neisseria gonorrhoeaeおよびNeisseria meningi
    tidis由来のその他の鉄調節蛋白質 を実質的に含有せず;トランスフェリンアフィニティー
    カラムにより単離され;Neisseria gonorrhoeaeに見出
    される分子量およそ100kDの鉄調節外層膜蛋白質に対し
    て惹起される抗血清に特異的に結合し;Neisseria gono
    rrhoeaeまたはNeisseria meningitidisにおけるトラン
    スフェリンレセプター機能に重要である、Neisseria go
    norrhoeaeまたはNeisseria meningitidis外層膜に見出
    される鉄調節蛋白質およびそのような蛋白質の機能性ア
    ナログに対して惹起される抗体と共に、N. gonorrhoeae
    およびN. meningitidisを含有していると思われる試料
    をインキュベートすること; (b)該抗体をインキュベーション前、インキュベーシ
    ョン中またはインキュベーション後のいずれかに標識化
    すること;および (c)蛋白質に結合した抗体の存在を検出することの工
    程を含む、試料中のN.gonorrhoeaeまたはN. meningitid
    isの存在を検出する方法。
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