CZ20004617A3

CZ20004617A3 - Vakcína

Info

Publication number: CZ20004617A3
Application number: CZ20004617A
Authority: CZ
Inventors: Lauren O Bakaletz; Joseph Cohen; Guy Dequesne; Yves Lobert
Original assignee: Smithkline Beecham Biolog; Univ Ohio State Res Found
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 1999-05-28
Publication date: 2001-06-13

Abstract

Nově identifikované peptidy a polynukleotidy kódující tyto peptidy, a chimémí proteiny obsahující tyto peptidy. Způsob izolace těchto peptidů nebo chimémích proteinů a vakcíny pro použití při léčbě infekce bakteriemi Haemophillus influenzae.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nově identifikovaných peptidů a polynukleotidů kódujících tyto' peptidy, a chimérních proteinů obsahujících tyto peptidy. Vynález se také týká způsobu izolace těchto peptidů nebo chimérních proteinů a vakcíny pro použití při léčbě infekce bakteriemi Haemophilus influenzae.

Dosavadní stav techniky

Haemophilus influenzae (Hi) je gramnegativní kulovitý bacil, žijící v striktní symbiose s člověkem. Kmeny Hi jsou buď opouzdřené polysacharidovým obalem nebo nejsou opouzdřené a podle toho se klasifikují jako typovatelné (opouzdřené) a. netypovatelné (neopouzdřené) kmeny.

Opouzdřené patogenní kmeny Hi vyvolávají zejména, avšak nikoli výlučně, invasivní onemocnění u dětí do ''věku šesti let. Haemophilus influenzae typu b (Hib) je například hlavním původcem meningitidy a dalších invasivních infekcí u dětí. Proti Hib infekcím existují účinné vakcíny, založené na tvorbě protilátek proti polysacharidovému pouzdru, které jsou proto neúčinné proti netypovatelným kmenům Haemophilus influenzae (ntHi).

Netypovatelné kmeny Haemophilus influenzae (ntHi) představují většinu kolonizujících kmenů a ačkoliv jsou málokdy invasivní, zodpovídají za významnou část mukosálních onemocnění včetně zánětu středního ucha (otitis media), sinusitidy, chronické konjunktivitidy a chronických nebo akutních infekcí dolních cest dýchacích. V současné době je přibližně 30% a v některých případech až 62% ntHi kmenů resistentních k penicilinům. Odhaduje se, že zhruba 44% dětí a 5% dospělých je bacilonosičů, a toto nosičství může • · · · · ·

- 2 přetrvávat po měsíce. U zánětu středního ucha způsobeného ntHi nebyly dosud plně objasněny mechanismy patogenese ani mechanismy imunologické reakce hostitele.

Otitis media je běžné onemocnění u dětí do věku 2 let. Je charakterizováno přítomností tekutiny ve středním uchu za současných příznaků akutní místní nebo systémové nemoci. Akutní příznaky zahrnují bolest v uchu, výtok z ucha, ztrátu sluchu, zatímco systémové příznaky zahrnují horečku, letargii, podrážděnost, anorexii, zvracení nebo průjem. Mezi nejčastější bakteriální původce tohoto io onemocnění patří Streptococcus pneumoniae a netypovatelné kmeny Haemophilus influenzae (ntHi), přičemž v odběrech se po kultivaci identifikuje z 25-50% S. pneumoniae a z 15-30% ntHi. Navíc, ntHi kmeny zodpovídají za 53% recidivujících případů otitis media. Přibližně 60% dětí do jednoho roku a 80% dětí do tří let věku prodělají toto onemocnění alespoň jedenkrát (nejčastěji kolem 10. měsíce věku).

Existují důkazy o existenci ochranné imunity proti ntHi, avšak díky pozvolným změnám (tzv. antigenic drift) příslušných epitopů (vnějších membránových proteinů P2, P4, P6) má ntHi schopnost unikat imunitní obraně hostitele.

Jsou tedy žádoucí další účinné vakcíny proti Haemophilus influenzae a zejména vakcíny proti netypovatelným kmenům Haemophilus influenzae, proti kterým současné vakcíny namířené proti Hi polysacharidům nepůsobí.

Na 100% bakterií izolovaných ze středního ucha a nosohltanu dětí trpících chronickou otitis media jsou přítomny fimbrie, tj. přívěsky nacházející se na povrchu ntHi. Byla popsána vakcina obsahující fimbrin, vláknitý protein odvozený z fimbrii ntHi (WO 94/26304). Fimbrin je homologní s proteinem P5, což je vnější membránový protein ntHi, který je předmětem jiné patentové přihlášky (EP 680765). Fimbrinový protein podobný P5 je schopen vyvolat

tvorbu protilátek, jež reagují s bakteriálním povrchem a vykazují baktericidní účinek (WO 94/26304). Protein byl purifikován a bylo prokázáno, že indukuje imunitní odpověď proti různým kmenům ntHi.

Současné postupy používané k izolaci fimbrinového proteinu z vnější bakteriální membrány jsou pracné a časově náročné. Strategie používaná u jiných bakteriálních druhů, spočívající v produkci relativně krátkých lineárních peptidů nativního proteinu, má však v tomto případě omezenou použitelnost, neboť protilátky namířené proti takovýmto alternativním imunogenům často nemají schopnost io rozpoznat nativní patogen.

LB1(f) je 19 aminokyselin dlouhý peptid (SEQ ID NO:5) odvozený ze sekvence fimbrinového proteinu, podobného proteinu P5, z kmene ntHi1128 (zahrnující oblast Arg117 až Gly135). Tento peptid byl původně navržen na základě analýzy primární sekvence fimbrinového proteinu podobného P5 jako potenciální epitop rozpoznatelný buňkami B. Imunizace zvířat chimérními fimbrinqvými peptidy (nazvanými LB1 peptidy), obsahujícími LB1(f) peptid, linkerový peptid a epitop rozpoznatelný buňkami T, indukuje imunitní odpověď vůči fimbrinovému proteinu podobnému P5, a po následném setkání s ntHi snižuje ve zvířatech kolonizaci těmito ntHi (viz patent US 5,843,464). LB1 peptid je imunogenní in vivo a antiséra vytvořená proti němu jsou imunoreaktivní jak proti denaturovaným tak nativním fimbriím. Peptid je tedy schopen působit jako účinný imunogen, vedoucí ke tvorbě protilátek, jež rozpoznávají a vážou se k epitopu v kontextu jeho nativní struktury. Zčásti tomu je tak proto, že syntetický LB1(f) peptid napodobuje sekundární strukturu stočené šroubovice, v jaké se peptid nachází ve fimbrinovém proteinu.

Používání vakcíny obsahující proteinové antigeny pouze z jednoho kmene H. influenzae je problematické tím, že často vede jen k ochraně omezené na homologní výzvu (Bakaletz et al., 1997, Vaccine 15:955-961; Haase et al., 1991, infect. immun. 59:1278-1284;

• ···· ·· ···· ·· φ ··· ·· · · · · · • · ·· ·· · · · · • · · · · · · · · · • · ···· · · · ··· ··· ·· ·· ·· ee<

- 4 Sirakova et al., 1994, Infect. Immun. 62:2002-2020). Vzhledem k antigenní diversitě vnějších membránových proteinů ntHi bude vývoj širokospektrální vakcíny proti takto hetorogenní skupině mikroorganismů vyžadovat novou strategii.

Jak je níže ukázáno, tento vynález se týká účinnějšího využití

LB1(f) peptidů jako vakcíny proti širokému spektru heterologních kmenů Haemophilus influenzae, jež exprimují fimbrinový protein podobný P5 (nebo přirozeně se vyskytující varianty tohoto proteinu).

Podstata vynálezu io Cílem vynálezu je poskytnout skupiny nově identifikovaných antigenních fimbrinových peptidů (LB1(f) peptidů), které jsou součástí fimbrinových proteinů, podobných P5, z různých ntHi kmenů. Dalším cílem je poskytnout chimérní polypeptidy, které obsahují tyto peptidy a které indukují u zvířat imunitní odpověď na ntHi, a polynukleotidy kódující takovéto peptidy a polypeptidy. Vynález se také týká způsobu izolace peptidů nebo chimérních polypeptidů, způsobu detekce přítomnosti těchto peptidů v biologických vzorcích, a vakcíny pro použití k léčbě infekce vyvolané Haemophilus influenzae.

Skupiny LB1 (f) peptidů obsahují peptidy o délce přibližně 13 až aminokyselin. Peptidy lze rozdělit do 3 hlavních skupin (z nichž jedna obsahuje 2 podskupiny). Chimérní polypeptid obsahuje jednu nebo více jednotek LB1 (f) peptidů kovalentě spojených s nosičovým proteinem, který zároveň působí jako epitop rozpoznatelný buňkami T.

Nosičový protein s výhodou pochází z Haemophilus influenzae, takže může rovněž indukovat u zvířat imunitní odpověď proti Haemophilus influenzae (včetně netypovatelných Haemophilus influenzae).

K dokonalejšímu pochopení vynálezu poslouží následující obrázky a podrobný popis.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1: Plasmid pMGIMCS s DNA sekvencí mnohočetného klonovacího místa.

Obrázek 2: Plasmid pRIT14588.

Obrázek 3; Plasmid LPD-LB1-A.

Obrázek 4: Plasmid LPD-LB1-II. Šipkami jsou vyznačeny DNA sekvence a aminokyselinové sekvence LB1 (f) peptidů skupiny 1 (LB1GR1) a skupiny 2 (LB1-GR2). Šipky ukazují LB1(f) v přirozeném kontextu sekvence fimbrinového proteinu podobného p5.

Obrázek 5: Plasmid LPD-LB1 -III. Šipkami jsou vyznačeny DNA sekvence a aminokyselinové sekvence LB1(f) peptidů skupiny 1 (LB1GR1), skupiny 2 (LB1-GR2) a skupiny 3 (LB1-GR3). Šipky ukazují LB1(f) v přirozeném kontextu sekvence fimbrinového proteinu podobného p5. LB1(f) polypeptid (nazvaný LPD-LB1 (f)₂,i,3) sahá od Metl k C-koncovému His zbytku před Stop kodonem.

Obrázek 6: Akrylamidový gel, barvený Coomassie Blue, znázorňující produkty exprese následujících plasmidů: Dráhy: 1. Standardy molekulové hmotnosti; 2. pMGMCS; 3. pRIT14588; 4. LPD-LB1-A; 5. LPD-LB1-II; 6. LPD-LB1-III; 7. LPD-LB1-III (LPD-LB1 (f)₂,i,3 po purifikaci); 8. Standardy molekulové hmotnosti.

Obrázek 7: Westernová analýza (s použitím králičího anti-LB1 antiséra) akrylamidového gelu znázorňujícího produkty exprese následujících plasmidů: Dráhy: 1. Standardy molekulové hmotnosti; 2. pMGMCS; 3. pRIT14588; 4. LPD-LB1-A; 5. LPD-LB1-II; 6. LPD-LB1III; 7. LPD-LB1-III (LPD-LB1(f)₂,i,3 po purifikaci); 8. Standardy molekulové hmotnosti.

Obrázek 8: Westernová anaiýza (s použitím monoklonální anti-LPD protilátky) akrylamidového gelu znázorňujícho produkty exprese následujících plasmidů; Dráhy; 1. Standardy molekulové hmotnosti; 2. pMGMCS; 3. pRIT14588; 4. LPD-LB1-A; 5. LPD-LB1-II; 6. LPD-LB16 lil; 7. LPD-LB1-III (LPD-LB1(f)₂,₁₃ po purifikaci); 8. Standardy molekulové hmotnosti.

Obrázek 9: Westernová analýza (s použitím protilátky proti (His)© kotvě) akrylamidového gelu znázorňujícho produkty exprese následujících plasmidů: Dráhy: 1. Standardy molekulové hmotnosti; 2. pMGMCS; 3. pRIT14588; 4. LPD-LB1-A; 5. LPD-LB1-II; 6. LPD-LB1lll; 7. LPD-LB1-II1 (LPD-LB1(f)₂,i,₃ po purifikaci); 8. Standardy molekulové hmotnosti.

Obrázek 10: Pasivní přenos/výzva. Střední hodnoty parametru io kvantifikujícího zánět membrány bubínku (TM) v průběhu 35 dnů sledování pěti pasivně imunizovaných skupin činčil. Přerušovaná vodorovná čára, odpovídající střední hodnotě 1,5 značí hladinu zánětu připsatelného samotnému adenoviru. Hodnoty nad touto čarou se považují za známku ntHi-indukovaného zánětu. ▼ - simulace (sham);

□ - LB1; - LPD; 0 - PD; _Δ - LPD-LB1(f)_2>1,₃.

Obrázek 11: Histogram znázorňující v celém průběhu experimentu procentní podíl případů prokázané, efúze nebo podezření na efúzi v středním uchu, zjišťované na základě otoskopického vyšetření a tympanometrie, u pěti skupin činčil koinfikovaných adenovirem. Časová škála se počítá od intranasalního podání ntHi v den 0. Každé zvíře obdrželo před intranasálním podáním kmene ntHi#86-028NP specifické antisérum (ředěné 1:5) procesem pasivního přenosu. Jednotlivé skupiny dostaly antiséra namířená proti:

simulace, sham” (sterilní rozpouštědlo)

LB1

LPD

PD

LPD-LB1(f)₂,i,₃

Obrázek 12: Westernová analýza séra použitého k pasivnímu přenosu. Panel A = směsné sérum anti-LB1. Panel B = směsné sérum anti-LPD-LB1(f)₂,i,3· Dráhy: (1) standardy molekulových hmotností; (2) LPD; (3) LPD-LB1 (f)₂,i,3; (4) LB1; (5) celkový preparát vnějších membránových proteinů (OMP) kmene ntHi 86-028NP; (6) celkový preparát OMP kmene ntHi 1885MEE; (7) celkový preparát OMP kmene ntHi 1728MEÉ.

Obrázek 13: Studie A. Pasivní přenos/výzva. Střední hodnoty parametru kvantifikujícího zánět membrány bubínku (TM) v průběhu ío 35 dnů sledování pěti pasivně imunizovaných skupin činčil. Výzva byla buď kmenem ntHi 86-028NP nebo kmenem ntHi 1885MEE.

Obrázek 14: Studie B. Pasivní přenos/výzva. Střední hodnoty parametru kvantifikujícího zánět membrány bubínku (TM) v průběhu 35 dnů sledování pěti pasivně imunizovaných skupin činčil. Výzva byla buď kmenem ntHi 86-028NP nebo kmenem ntHi 1728MEE.

Obrázek 15: Studie A. Tabulka znázorňující pro celý průběh experimentu procentní podíl případů prokázané efúze nebo podezření na efúzi v středním uchu, zjišťované na základě otoskopického vyšetření a tympanometrie, u šesti skupin činčil koinfikovaných adenovirem. Časová škála se počítá od intranasalního podání ntHi v den 0. Každé zvíře obdrželo před intranasálním podáním kmene ntHi#86-028NP nebo kmene ntHi 1885MEE uvedené antisérum (ředěné 1:5) procesem pasivního přenosu.

Obrázek 16: Studie B. Diagram znázorňující pro celý průběh experimentu procentní podíl případů prokázané efúze nebo podezření na efúzi v středním uchu, zjišťované na základě otoskopického vyšetření a tympanometrie, u šesti skupin činčil koinfikovaných adenovirem. Časová škála se počítá od intranasalního podání ntHi v den 0. Každé zvíře obdrželo před intranasálním podáním kmene

- 8 ntHi#86-028NP nebo kmene ntHi 1728MEE uvedené antisérum (ředěné 1:5) procesem pasivního přenosu.

···

Podrobný popis vynálezu

Peptidy podle vynálezu

Peptidy podle vynálezu se týkají skupin nově identifikovaných LB1(f) peptidů z fimbrinových- proteinů podobných proteinu P5, pocházejících z různých kmenů ntHi z Evropy a USA.

w V 83 kmenech ntHi byla stanovena DNA sekvence fimbrinového proteinu podobného P5, a odvozena peptidová sekvence LB1(f) peptidů. Peptidy podle vynálezu jsou epitopy rozpoznatelné B buňkami a nacházejí se v každém proteinu ve zhruba stejné oblasti (a ve stejném kontextu) - přibližně v oblasti vymezené pozicemi 110 a 140 aminokyselinové sekvence proteinu. Například u kmene ntHi-10567RM se peptid nachází mezi Arg117 a Gly 135 (SEQ ID NO:1).

Porovnání sekvencí ukázalo, že peptidové sekvence kmenů ntHi pocházejících z Ameriky i Evropy lze roztřídit do stejných tří skupin, s drobnějšími obměnami uvnitř těchto skupin. Peptidy Skupiny 1 [neboli LB1(f)i] představují 71% peptidů, mají délku přibližně 19 aminokyselin a vykazují ne méně než 75% identitu s peptidem uvedeným v SEQ ID NO:1. Peptidy Skupiny 2 [neboli LB1(f)2] představují 19% peptidů, mají délku 19-22 aminokyselin a vykazují ne méně než 75% identitu s peptidem uvedeným v SEQ ID NO:2.

Skupina může být dále rozdělena na dvě podskupiny, Skupinu 2a [neboli LB1(f)2a], jejímž příkladem je SEQ ID NO:2, a Skupinu 2b [neboli LB1(f)2b], jejímž příkladem je SEQ ID NO:4. Peptidy Skupiny 3 [neboli LB1(f)3] představují 10% peptidů a mají délku 13 aminokyselin (SEQ ID NO:3).

- 9 Identita sekvence se u peptidů (a polypeptidů a polynukleotidů) dá vypočítat například s použitím softwarového balíku UWGCG Package, který poskytuje program BESTFIT pro výpočet homologie (identity), s výhodou ve standardním nastavení (Deveraux et al., 1984, Nucl. Acids Res. 12:387-395).

Z celkem 83 analyzovaných kmenů ntHi náleží LB1 (f) peptidy ze všech 62 US kmenů a všech 21 Evropských kmenů do některé ze Skupiny 1-3. Tabulka 1 ukazuje všechny analyzované ntHi kmeny, a příslušnou Skupinu, do níž patří jejich LB1(f) peptidy. Tabulky 2, 3 a 4 souhrne uvádějí sekvence LB1(f) peptidů Skupiny 1, resp. 2, resp. 3. V Tabulce 5 jsou uvedeny typické příklady LB1 (f) peptidů náležejících do Skupin 1,2a, 2b a 3.

Dříve známý LB1 (f) peptid (SEQ ID NO:5) přísluší do Skupiny 1. Ačkoliv je známo, že tento peptid je účinným imunogenem, který poskytuje ochranu přeď otitis media působenou ntHi, doposud nebylo zřejmé, že tento užitečný peptid existuje v těchto třech antigenně odlišných formách, jež by mohly být případně kombinovány tak, aby poskytovaly ochranné imunogeny proti všem kmenům Haemophilus influenzae, které exprimují fimbrinový protein podobný P5.

Peptidy podle vynálezu se týkají reprezentativních peptidů Skupiny 1, 2a, 2b, a 3 (SEQ ID NO:1, 2, 4 a 3), a antigenně příbuzných variant těchto peptidů. Antigenně příbuzné varianty” mohou být buď přirozené varianty (příkladem jsou peptidy uvedené v Tabulkách 2, 3 a 4), anebo uměle modifikované varianty, které imunologicky napodobují LB1(f) antigenní determinantu fimbrinového proteinu podobného P5. Takovéto uměle modifikované varianty mohou být získány chemickou syntézou nebo technikami rekombinantní DNA mutagenézy, jež jsou dobře známé osobám zběhlým v oboru (viz např. Kapitolu 15 manuálu Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, a Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Antigenně příbuzné varianty peptidů by měly vykazovat nejméně 75% • φ

Φ·Φ· φ φ φ φφφφ φφ φ φ φ φ · φ φφφ φφφ φ • φφφφ φφφ φ ΦΦΦΦ·· φφφ φφφ φφ φφ

- 10 identitu aminokyselinové sekvence vůči některému z peptidů poskytnutých v SEQ ID NO:4 (výhodněji alespoň 85% a nejvýhodněji alespoň 95% identitu), přičemž by stále měly mít schopnost imunologicky napodobovat odpovídající antigenní determinantu fimbrinového proteinu podobného proteinu P5 z netypovatelného Haemophilus influenzae. Imunologické napodobování odpovídající antigenní determinanty fimbrinového proteinu podobného proteinu P5 z ntHi” je pro tento vynález definováno tak, že (variantní) peptid je schopen indukovat tvorbu protilátek, jež specificky rozpoznávají jednu z LB1(f) sekvencí divokého typu (uvedených v Tabulkách 2, 3,a 4) v kontextu celého fimbrinového proteinu podobného P5, A/NEBO je definováno tak, že (variantní) peptid je rozpoznatelný stejnou imunospecifickou protilátkou, jež rozpoznává jednu z LB1(f) sekvencí divokého typu (uvedených v Tabulkách 2, 3, a 4) v kontextu celého fimbrinového proteinu podobného P5. V první definici by variantní peptid měl být schopen indukovat takovéto protilátky buď sám o sobě nebo ve spojení s nosičovou molekulou. V druhé definici by variantní peptid měl být rozpoznatelný buď sám, nebo ve spojení s nosičovou molekulou. Mezi antigenně příbuzné variantní peptidy se nezahrnují peptidy, jež jsou uvedeny v SEQ ID NO:5 (dříve stanovený LB1(f) peptid fimbrinového proteinu podobného P5, z kmene ntHi-1128) a v SEQ ID NO:6 (dříve stanovený peptid proteinu P5 z ntHi, podobný LB1(f) peptidů).

Antigenně příbuzné varianty mohou mít aminokyselinové zbytky přidány, vneseny, nahrazeny nebo vypuštěny. Výhodné varianty jsou ty, které se od referenčních peptidů liší konzervativními záměnami aminokyselin (s výhodou jedné).

Peptidy podle vynálezu se rovněž týkají kombinací shora popsaných LB1 (f) peptidů kovalentně propojených do jednoho peptidů, s případnými vloženými dalšími aminokyselinami (tzv. spacery). Pro takovéto kombinace mohou být použity peptidy o sekvencích SEQ ID NO: 5 a 6. Způsob chemické syntézy nebo rekombinantní exprese ft···

I »··

- 11 takovýchto peptidů je dobře znám osobám zběhlým v oboru (viz např. Sambrook et al., 1989). Případný spacer by s výhodou neměl být delší než 18 aminokyselin na každé straně peptidu a měl by s výhodou obsahovat aminokyseliny z přirozeného kontextu LB1(f) peptidu ve fimbrinovém proteinu podobném P5 (například, při spojení dvou LB1(f) peptidů by první, neboli N-koncový LB1(f) peptid mohl mít 9 aminokyselin ze svého přirozeného C-koncového kontextu spojeno s 9 aminokyselinami přirozeného N-koncového kontextu druhého, neboli C-koncového LB1(í) peptidu. Tímto způsober

U//+ iuz.c uyi propojen jeden nebo více LB1(f) peptidů. S výhodou je spojeno 1-10 LB1 (f) peptidů, výhodněji 1-5, a ještě výhodněji 1-3. Výhodněji je takto spojeno nejméně po jednom LB1(f) peptidu z každé LB1(f) skupiny. Ještě výhodnější je spojení LB1 (f) peptidů uvedených v SEQ ID NO:2, 3, a 5. Jelikož kombinace obsahuje tři antigenně odlišné peptidy, výsledkem je imunogen se širším ochranným potenciálem.

Polypeptidy podle vynálezu

Polypeptidy podle vynálezu se týkají shora popsaných peptidů, kovalentně spojených s nosičovým polypeptidem, který obsahuje nejméně jeden epitop rozpoznatelný buňkami T (například tetanový toxin, difterický toxin, CRM197, Borrelia burgdorferi sensu lato OspA, hemocyanin mořského měkýše KHL, H. influenzae P6 protein, Ή. influenzae fimbrinový protein podobný proteinu P5, H. influenzae OMP26, H. influenzae protein D, nebo H. influenzae lipoprotein D), za vzniku chimérního LB1(f) polypeptidů. Tento chimérní polypeptid obsahuje nejméně jeden z LB1(f) peptidů podle vynálezu. Chimérní polypeptid s výhodou obsahuje 1-10 LB1(f) peptidů, výhodněji 1-5 a ještě výhodněji 1-3 tyto peptidy. Tyto peptidy mohou být připojeny k nosičovému polypeptidů N-koncově, C-koncově, nebo N- i C-koncově.

Nosičový polypeptid je s výhodou původem z Haemophilus influenzae, takže může působit jako dobrý imunogenní nosič, přičemž má určitou

ochrannou účinnost sám o sobě a/nebo současně poskytuje homologní epitopy, odvozené z H. influenzae, rozpoznatelné buňkami T. Chimérní polypeptid může případně obsahovat též specifickou sekvenci (tag) usnadňující purifikaci polypeptidu (jako například histidinovou kotvu nebo vazebnou doménu Glutathion-S-transferasy). Mezi základní složky chimérního polypeptidu mohou být případně zavedeny krátké peptidové sekvence - spacery (jak byly definovány shora, v části Peptidy podle vynálezu).

Nosičový polypeptid je s výhodou OMP26 z H. influenzae (\NO

97/01638), nebo protein P6 z H. influenzae (Nelson, M.B. et al., 1988,

Infection and Immunity 56:128-134).

Jako nosičový polypeptid je nejvýhodnější protein D (PD) z netypovatelného Haemophilus influenzae, nebo lipoprotein D (LPD lipidovaná forma PD). PD je 42 kDa protein nacházející se na vnějším povrchu, který váže lidský IgD, a o němž bylo prokázáno, že je vysoce konzervovaný mezi všemi dosud studovanými kmeny Haemophilus influenzae (WO 91/18926). PD i LPD již byly exprimovány v E. coli.

O proteinu LPD bylo zjištěno, že v H. influenzae má funkci faktoru virulence a že vyvolává baktericidní aktivitu proti ntHi v krysím antiséru. LPD z H. influenzae a rekombinantně exprimovaný ekvivalent LPD tedy mohou působit jako dobrý imunogenní nosič, přičemž mají samy o sobě určitou ochrannou účinnost. Forma bez lipidové složky (tj. PD) se z praktického hlediska pohodlněji používá a PD je též potenciálním nosičovým polypeptidem podle vynálezu. LPD je velmi imunogenní vzhledem ke svým inherentním adjuvantním vlastnostem; tj. schopnosti indukovat interleukiny v makrofágách a schopnosti stimulovat proliferaci B buněk (WO 96/32963). PD nemá tyto inherentní adjuvantní vlastnosti a tak se k těmto konjugátům s výhodou přidávají adjuvans, například (ale bez omezení) hydroxid hlinitý nebo fosfát hlinitý. Protilátky vytvořené proti LPD mohou ·« ····

- 13 ···· • · • « · · poskytovat ochranu před typovatelnými i netypovatelnými kmeny ntHi.

LPD je tedy důležitou nosičovou molekulou, která po připojení dalších

Hi antigenů (jako např. LB1(f) peptidů) vede k účinnějším vakcínám proti tomuto mikroorganismu. Vedle zesilování imunitní odpovědi na

LB1(f) peptidový antigen, může LPD sloužit jako ochranný ántigen jak proti neopouzdřeným, tak proti opouzdřeným kmenům Hi.

K nosičovému polypeptidu jsou s výhodou připojeny tři LB1(f) peptidy, po jednom z každé LB1(f) skupiny. S výhodou se použijí LB1(f) peptidy uvedené v SEQ ID NO: 2,3, a 5; tyto peptidy jsou io s výhodou připojeny na C-konci nosičového polypeptidu v pořadí SEQ ID NO: 2 (peptid ze skupiny 2), SEQ ID NO: 5 (peptid ze skupiny 1), SEQ ID NO: 3 (peptid ze skupiny 3). Takovýto polypeptid připojený k LPD je označen jako LPD-LB1(f)_2i1i3. Spojením tří antigenně odlišných peptidů se vytvoří imunogen se šiřším ochranným potenciálem.

I jcdyž chimérní polypeptid nemusí obsahovat purifikační ”tag”, je-li tento vyžadován, s výhodou se používá histidinová kotva”, která je s výhodou umístěná na C-konci polypeptidu.

Sekvence výhodného chimérního polypeptidu LPD-LB1 (f)₂,i,3 je 20 uvedena na Obr. 5. Aminokyselinové zbytky 1-19 představují signální sekvenci Proteinu D. Tento signální peptid může být odstraněn, za vzniku PD verze chimérního polypeptidu.

Polypeptidy podle vynálezu mohou být připravovány jakýmkoli vhodným způsobem. Takovéto polypeptidy zahrnují rekombinantně připravené polypeptidy, polypeptidy připravené synteticky, nebo polypeptidy připravené kombinací těchto metod. Způsoby přípravy takovýchto polypeptidů jsou dobře známy v oboru, nicméně příklady metod jsou uvedeny v části Příklady provedení vynálezu.

«« ·*·0 • ·#·· · 0 · • 000 0 0 0 • 0 0 0 0

0 0 0 0

0000«· 0· 00 - 14 Polynukleotidy podle vynálezu

Polynukleotidy podle vynálezu se týkají polynukleotidových sekvencí LB1(f) peptidů divokého typu uvedených v Tabulkách 6-8. Rovněž se týkají DNA sekvencí polypeptidů divokého typu, podle vynálezu, tj. týkají se konstrukcí genu chimérního polypeptidu, při nichž je použita sekvence genu divokého typu pro nosičový polypeptid a polynukleotidové sekvence divokého typu pro LB1(f) peptidy. Takovýto polynukleotid je uveden na Obr. 5. DNA sekvence případných spacerových aminokyselin není z hlediska vynálezu io zásadní, avšak v případech, kde spacerové aminokyseliny představují přirozený kontext LB1(f) peptidů, použijí se s výhodou (ale nikoli nutně) přirozené DNA sekvence těchto spacerů.

Polynukleotidy podle vynálezu se též týkají DNA sekvencí, jež mohou být odvozeny z aminokyselinových sekvencí peptidů a polypeptidů podle vynálezu s přihlédnutím k degeneraci genetického kódu. Toto je dobře známé v oboru, právě tak jako znalosti o využití kodonů v různých hostitelských organismech, což je užitečné při optimalizaci rekombinantní exprese peptidů a polypeptidů podle vynálezu.

Vynález též poskytuje polynukleotidy, jež jsou komplementární ke všem shora popsaným polynukleotidům.

Jsou-li· polynukleotidy podle vynálezu používány pro rekombinantní produkci polypeptidů podle vynálezu, mohou tyto polynukleotidy obsahovat kódující sekvenci samotného maturního polypeptidu; nebo kódující sekvenci maturního polypeptidu v totožném čtecím rámci s jinými kódujícími sekvencemi, jako jsou např. sekvence kódující zaváděcí sekvenci nebo signální sekvenci, pre-, nebo pro-, nebo prepro- proteinovou sekvenci, nebo jiné části fúzovaného peptidů (například aminokyselinové zbytky 1-19 na Obr. 5, tj. přirozená

3o signální sekvence LPD). Kódována tak například může být speciální sekvence (tzv. ”tag”) usnadňující purifikaci fúzovaného polypeptidu.

- 15 0000 00 000 0 00 • · * . 0 0 0 000 0 0 0 0 0

0 0 0 000 0 0 0 0 0 0 0 0

V určitých výhodných provedeních tohoto aspektu vynálezu je touto sekvencí hexa-histidinový peptid, který je součástí pQE vektoru (Qiagen, lne.) a je popsán v Gentz et al., 1989, Proč. Nati. Acad. Sci.

USA 86:821-824, nebo HA tag, nebo glutathion-S-transferasa.

Výhodným provedením je též LPD fúzovaný ke své přirozené signální sekvenci (aminokyseliny 1-19 na Obr. 5). Polynukleotid může též obsahovat nekódující 5' a 3' sekvence, jako jsou transkribované nepřekládané sekvence, signály pro sestřih a polyadenylaci, ribosomáiní vazebná místa a sekvence stabilizující mRNA.

Vektory, hostitelské buňky, exprese

Vynález se dále též týká vektorů, které obsahují polynukleotid nebo polynukleotidy podle vynálezu, hostitelských buněk geneticky manipulovaných pomocí vektorů podle vynálezu, a rekombinantní produkce peptidů a polypeptidů podle vynálezu. K produkci těchto proteinů lze též použít bezbuněčných systémů translace, s použitím molekul RNA odvozených z DNA konstruktů podle vynálezu.

Pro účely rekombinantní produkce mohou být hostitelské buňky manipulovány tak, aby obsahovaly systémy, nebo částí systémů, umožňujících expresi polynukleotidů podle vynálezu. Vnesení polynukleotidů do hostitelských buněk může být dosaženo postupy popsanými v mnoha standardních laboratorních příručkách, jako např. Davis et al., BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (1986) a Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2.vydání, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989). Mezi tyto postupy patří např. transfekce s použitím kalcium fosfátu nebo DEAE-dextranu, transvekce, mikroinjikace, transfekce zprostředkovaná kationickým lipidem,

3o elektroporace, transdukce, serape loading” (tj. způsob vnášení makromolekul do adherujících buněk, spočívající v opatrném • ···· ·· 9·99 ·· • 9 · 9 9 > · • ··· · · · · · · • · · 9 · b » 9 9 * • 9 9999 99 9

- 16·-··....... ·’ ··· mechanickém uvolnění buněk z povrchu kultivační misky stěrkou, v přítomnosti makromolekul, např. DNA), bombardování mikročásticemi potaženými DNA, nebo infekce.

Reprezentativní příklady vhodných hostitelů zahrnují bakteriální buňky, jako např. meningokoky, streptokoky, stafylokoky, E. coli, Streptomyces, a Bacillus subtilis·, houby jako např. buňky kvasinek a buňky Aspergillus·, hmyzí buňky jako např. Drosophila S2 buňky a Spodoptera Sf9 buňky; živočišné buňky jako např. CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK 293 a buňky Bowesova melanomů; a rostlinné io buňky.

Použít lze celou řadu různých systémů exprese. Takovéto systémy zahrnují mj. systémy odvozené z chromosomů, episomů a virů, např. vektory vycházející z bakteriálních plasmidů, z bakteriofágů, z transposonů, z kvasinkových episomů, z inserčních is elementů, z kvasinkových chromosomálních elementů, z virů jako např. bakulovirů, papovavirů, jako např. SV40, virů vakcínie, adenovirů, virů drůbežích neštovic, virů pseudorabies a retrovirů, a dále pak vektory tvořené jejich kombinacemi, jako např. vektory odvozené z genetických elementů plasmidů a bakteriofágů, jako jsou kosmidy a phagemidy. Expresní systémy mohou obsahovat regulační oblasti, které umožňují a regulují expresi. Obecně lze použít jakýkoli systém nebo vektor, vhodný k udržení, propagaci nebo expresi polynukleotidů za vzniku polypeptidů v hostiteli. Příslušná nukleotidová sekvence může být vnesena do expresního systému pomocí kterékoli z řady dobře známých a rutinně používaných technik, jež jsou uvedeny např. v Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (supra).

K zajištění sekrece proteinového produktu translace do lumenu endoplasmatického retikula, do periplasmatického prostoru nebo do extracelulárního prostředí, mohou být do požadovaného polypeptidů zabudovány příslušné signály řídící sekreci. Tyto signály mohou být z • ·

- 17 hlediska polypeptidů endogenní (aminokyselinové zbytky 1-19 v Obr. 5), nebo může jít o signály heterologní.

Purifikace rekombinantně exprimovaných peptidů/poiypeptidů

Peptidy a polypeptidy podle vynálezu mohou být z kultur rekombinantních buněk izolovány a purifikovány dobře známými postupy, které zahrnují srážení síranem amonným nebo etanolem, kyselou extrakci, iontoměničovou chromatograf!!, chromatograf!! na fosfocelulose, hydrofobní chromatografií, afinitní chromatografií, chromatografií na hydroxylapatitu a chromatografií na lektinech. Nejvýhodnější je purifikace s použtitím HPLC. K obnovení aktivní konformace polypeptidů, pokud byl během izolace a/nebo purifikace denaturován, se mohou použít dobře známé renaturační postupy.

Genová sekvence chimérního LB1(f) polypeptidů, obsažená ve vektoru, může být případně opatřena hexa-histidinovou sekvencí (tágem) k usnadnění purifikace polypeptidů, avšak tato modifikace není podstatným prvkem vynálezu, neboť polypeptidy bez tohoto Histagu mohou být purifikovány některou ze shora zmíněných metod.

Příklad 3 popisuje purifikační postup použitý pro chimérní polypeptid LPD-LB1(f)(Skupina 2 / Skupina 1 / Skupina 3) (neboli LPDLB1(f)₂,i,3). Purifikace chimérního LPD-LB1(f) polypeptidů, obsahujícího tři nebo více LB1(f) peptidů na C-konci polypeptidů, je snazší než purifikace polypeptidů, který má na C-konci pouze jeden LB1(f) peptid. Důvodem je pozorovaná částečná degradace polypeptidů od C-konce v případě, že obsahuje pouze jeden LB1(f) peptid, která nebyla pozorována u polypeptidů s třemi LB1(f) peptidy na C-konci. Pokud dojde k nějaké degradaci, může být polypeptid o plné délce oddělen od degradované formy chromatografií na anexové koloně, která se zařadí do purifikačního protokolu.

• · · ·

- 18 Protilátky

Peptidy a polypeptidy podle vynálezu, nebo buňky, které je exprimují, mohou být použity rovněž jako imunogeny k získání protilátek imunospecifických pro LB1 (f) peptidy divokého typu. Termín imunospecifický” znamená, že afinita protilátek k peptidům nebo polypeptidům podle vynálezu je podstatně větší než jejich afinita k jiným příbuzným polypeptidům v dosavadním stavu techniky.

Protilátkv namířené proti peptidům a nnivnentirlům ra získávaií ’ běžnými postupy spočívajícími v imunizaci, tj. podání antigenu zvířeti, s výhodou nikoli člověku, v odebrání krve, a v izolaci séra a protilátek, jež. reagují s peptidem. Sérum nebo IgG frakce obsahující protilátky mohou být použity při analýzách proteinu. Pro přípravu monoklonálních protilátek lze použít kteroukoli z technik, jež produkují protilátky v kontinuální buněčné kultuře. Příklady zahrnují hybridomovou techniku (Kohler, G. a Milstein, C., 1975, Nátuře 256:495-497), triomovou techniku, hybridomovou techniku s lidskými B-buňkami (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72) a EBVhybridomovou techniku (Cole et al., MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, str. 77-96, Alan R. Liss, lne., 1985).

Pro tvorbu jednořetězcových protilátek proti peptidům nebo polypeptidům podle vynálezu lze adaptovat metody pro přípravu jednořetězcových protilátek (US Patent No. 4,946,778). K expresi * humanizovaných protilátek lze též použít transgenní myši nebo jiné organismy, včetně jiných savců.

Shora popsané protilátky mohou být použity k izolaci nebo k identifikaci klonů exprimujících peptid, nebo k purifikaci peptidů či polypeptidů podle vynálezu na principu afinitní chromatografie.

Peptidy a polypeptidy podle vynálezu jsou rovněž užitečné k produkci polyklonálních protilátek, jež se mohou použít při pasivní imunoterapii proti H. influenzae. Lidský imunoglobulin je v tomto ohledu výhodnější, neboť heterologní imunoglobulin může vyvolat • · · · • ···· ···· • · ···· · · ♦ ·· ··· ·· ί· ··

- 19 škodlivou imunitní odpověď proti svým cizím imunogenním částem.

Polyklonální antisérum se získá z jednotlivců imunizovaných peptidy nebo polypeptidy v kterékoli z popsaných forem a poté se izoluje obohacená imunoglobulinová frakce. Například, imunoglobuliny specifické pro epitopy proteinu jsou obohaceny imunoafinitními techikami s použitím peptidů nebo polypeptidů podle vynálezu. Protilátka z antiséra je specificky adsorbována na imunoadsorbent obsahující epitopy polypeptidu a pak je z tohoto nosiče eluována jako obohacená frakce imunoglobuiinu.

¹⁰

Vakcíny

Dřívější studie LB1(f) peptidu z kmene ntHi-1128 naznačily, že tento peptid by mohl být použitelný jako imunogen při vývoji podjednotkové vakcíny proti nemocem působeným bakteriemi

HaemophHus influenzae, zejména k prevenci či snížení náchylnosti k akutní otitis media a dalším chorobám způsobovaným netypovatelnými kmeny. Vynález rozšiřuje tyto studie v tom, že objevuje tři hlavní Skupiny LB1(f) peptidů. Rozdíly mezi těmito třemi skupinami jsou takové, že možnost dosažení účinné křížové ochrany mezi kmeny náležejícími do odlišných skupin je nepravděpodobná. Vynález proto vychází z předpokladu, že použití typických peptidů zastupujících každou z těchto peptidových skupin, poskytne účinnější a úplnější vakcínu proti kmenům HaemophHus influenzae (s výhodou ntHi), které exprimují fimbrinový protein podobný proteinu P5.

Dalším aspektem vynálezu je tedy vakcína obsahující imunogenní množství nejméně jednoho peptidu nebo polypeptidu podle vynálezu. Prostředek by s výhodou měl obsahovat též farmaceuticky přijatelné pomocné látky. Příprava vakcín obecně, je popsána v publikaci Vaccine Design (The subunit and adjuvant approach” (eds. Powel M.F. a Newman M.J.), 1995, Plenům Press, New York).

• · · · ··· • · • · · ·

- 20 Dále, vakcína podle vynálezu obsahuje s výhodou vedle peptidů a polypeptidů podle vynálezu i adjuvans. Vhodná adjuvans zahrnují sole hliníku jako např. gel hydroxidu hlinitého (kamenec) či fosfát hlinitý, nebo sole vápníku, železa či zinku, nebo nerozpustnou suspenzi acylovaného tyrosinu, nebo acylované cukry, kationtové nebo aniontové deriváty polysacharidů, nebo polyfosfazeny. Další známá adjuvans zahrnují oligonukleotidy obsahující dinukleotid CpG, který je v nich nemethylovaný. Takovéto oligonukleotidy jsou dobře známy a jsou například popsány ve WO 96/02555.

io Další výhodná adjuvans jsou ta, která indukují imunitní odpověď, s výhodou odpověď typu TH1. Vysoké hladiny cytokinů Th1-typu podporují indukci buněčné imunitní odpovědi na daný antigen, zatímco vysoké hladiny cytokinů Th2-typu spíše napomáhají indukci humorální imunitní odpovědi na antigen. Vhodné systémy adjuvans zahrnují například monofosforyl lipid A, s výhodou 3-de-O-acylovaný monofosforyl lipid A (3D-MPL), nebo kombinaci 3D-MPL spolu s hlinitou solí. CpG oligonukleotidy též přednostně indukují TH1 odpověď. Zesílený systém představuje kombinace monofosforyl lipidu A a derivátů saponinu, zejména kombinace QS21 a 3D-MPL, jak se uvádí ve WO 94/00153, nebo méně účinný prostředek, ve kterém je QS21 tlumen cholesterolem, jak se uvádí ve WO 96/33739. Obzvláště účinný a výhodný přípravek adjuvans, zahrnující QS21, 3D-MPL a tokoferol v emulsi olej ve vodě, je popsaný ve WO 95/17210.

Další aspekt vynálezu se týká způsobu indukce imunitní odpovědi v savci, přičemž tento způsob zahrnuje inokulaci savce peptidem nebo polypeptidem podle vynálezu, postačujícím pro vytvoření protilátky a/nebo T-buněčné imunitní odpovědi, aby toto zvíře bylo chráněno mimo jiné před nemocemi vyvolanými H. influenzae. Ještě další aspekt vynálezu se týká způsobu indukce imunitní odpovědi v savci, přičemž tento způsob zahrnuje vnesení peptidu nebo polypeptidu podle vynálezu prostřednictvím vektoru, který řídí expresi polynukleotidu podle vynálezu in vivo, s cílem

	• · ·	•	• ·	• · ·	•	• ·
• ·	• .		• ·		•	•	• ·
	···		• ·	•		•	•
		• ·	• ·		•	• ·	•
		•	• ·	•	•	•	•
			• ·	• ·		• ·	•

indukovat takovou imunitní odpověď, aby vytvořená protilátka chránila toto zvíře před nemocemi.

Další aspekt vynálezu se týká imunologického prostředku/vakcíny, který po vnesení do savčího hostitele indukuje v tomto savci imunitní odpověď proti LB1(f) peptidu nebo polypeptidu, přičemž prostředek obsahuje gen pro LB1 (f) peptid nebo polypeptid, nebo samotný LB1(f) peptid nebo polypeptid. Vakcína může dále obsahovat vhodný nosič. Přípravek LB1(f) vakcíny se s výhodou podává orálně, intranasálně nebo parenterálně (čímž jsou zahrnuty injekce subkutánní, intramuskulární, intravenosní, intradermální, transdermální). Přípravky vhodné k parenterální aplikaci zahrnují vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatika a rozpuštěné látky, které činí přípravek isotonickým s krví příjemce; a vodné a nevodné sterilní suspense, jež mohou zahrnovat stabilizátory suspense a přísady na zvýšení hustoty. Přípravky mohou být v jednodávkových nebo vícedávkových obalech, například v zatavených ampulích a v lahvičkách, mohou být skladovány v lyofilizované formě, která vyžaduje pouhé přidání sterilního kapalného nosiče těsně před použitím. Přípravek vakcíny může také obsahovat adjuvans jak bylo popsáno shora. Dávka bude záviset na specifické aktivitě vakcíny a může být snadno stanovena běžným experimentováním.

Ještě další aspekt se týká imunologického prostředku/vakcíny, který obsahuje polynukleotid podle vynálezu. Takovéto techniky jsou známé v oboru, viz například Woíff et al., 1990, Science 247:1465-8.

Aby se dosáhlo zvýšené baktericidní aktivity mohou být peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu aplikovány jako multivalentní podjednotkové vakcíny v kombinaci s antigeny z jiných proteinů /7. influenzae. Peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu mohou být také aplikovány v kombinaci s polysacharidovými antigeny, například PRP kapsulárním polysacharidem H. influenzae b (s výhodou • · ·

- 22 Λ.

?»· konjugovaným s proteinem). Při kombinované aplikaci s epitopy jiných proteinů je LB1(f) peptid nebo polypeptid aplikován buď samostatně, ve směsi, nebo ve formě konjugátu nebo geneticky fúzovaného polypeptidu. Konjugát se připravuje standardními technikami pro spojování bílkovinných molekul. Peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu mohou být použity v kombinaci s antigeny jiných organismů (např. opouzdřených nebo neopouzdřených bakterií, virů, hub a parazitů). Peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu jsou například užitečné v kombinaci s antigeny jiných mikroorganismů způsobujících otitis media nebo jiné nemoci. Patří mezi ně Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyrogenes skupiny A, Staphylococcus aureus, respirační syncytiální virus a Branhemella catarrhalis.

Jelikož polypeptidy podle vynálezu zahrnují i samotný fimbrinový protein podobný P5, dalším výhodným aspektem vynálezu je vakcína obsahující kombinaci dvou nebo více fimbrinových proteinů podobných P5 z odlišných LB1(f) skupin.

Vyhodnocení peptidů nebo polypeptidů podle vynálezu z hlediska účinnosti jako potenciálních vakcín proti otitis media vyvolané ntHi se provádí na zvířecím činčilovém modelu, který vyvinula Dr. L. Bakaletz z Ohio State University. Tento model napodobuje rozvoj otitis media u dětí a spočívá v následných, týden od sebe vzdálených, intranasalních aplikacích adenoviru a ntHi. Za těchto podmínek jsou bakterie schopné, po kolonizaci nosohltanu, proniknout Eustachovou trubicí do středního ucha. Zde se ntHi pomnoží a vyvolá zánětlivý proces podobný zánětu, který je pozorován u dětí.

Při experimentálním hodnocení účinnosti vakcíny je nutno vycházet z toho, že v době, kdy činčily dovrší proces aktivní imunizace, jsou již příliš staré na to, aby k výzevné inokulaci ntHi mohlo být použito intranasalní cesty: dokonce i s předcházející infekcí adenovirem, nenastane téměř u žádného zvířete otitis media. Jako * ·

- 23 alternativní způsob výzvy še používá přímá inokulace bakterií do středního ucha (bullae) přes lebeční kost. Této formě výzvy se lze vyhnout použitím protokolů spočívajících v pasivním -transferu následovaném-výzvou.

U všech těchto typů výzev je stupeň závažnosti průběhu onemocnění kvantitativně hodnocen na základě otoskopického vyšetření (přes vnější ucho) nebo tympanometrie, které hodnotí míru zánětu ve středním uchu nebo změny tlaku ve středním uchu, případně přítomnost tekutiny ve středním uchu. Účinnost vakcíny se určí podle poklesu míry závažnosti a/nebo délky trvání zánětu a podle snížení bakteriální kolonizace v uchu a nosohltanu.

V dřívějších experimentech se ochranná účinnost LB1 z kmene ntHi-1128 a LPD hodnotila po aktivní imunizaci a následné přímé inokulaci bakterií do středního ucha. Imunizace vakčínou LB1 reprodukovatelně chránila pokusné činčily před otitis media, soudě podle zkrácení délky trvání otitidy, mírnějšího průběhu a snížené kolonizace v uších i nosohltanu. Imunizace samotným LPD chránila činčily před otitis media, ale ne tak dobře jako LB1 a účinek nebyl reprodukovatelný.

Vakcíny podle vynálezu mohou dále být hodnoceny z hlediska toho, zda peptidy nebo polypeptidy podle vynálezu inhibují adherenci ntHi k epitelovým buňkám z krku činčil, a zda dokáží zabránit kolonizaci nosohltanu bakteriemi ntHi in vivo. LB1 peptid z ntHi-1128 inhibuje adherenci ntHi k epitelovým buňkám krku činčil v závislosti na dávce (pravděpodobně tak, že působí přímo jako stérický inhibitor vazby ntHi), a snižuje obsah ntHi v tekutině po výplachu nosohltanu. Kolonizace nosohltanu je nezbytný první krok vedoucí k rozvoji otitis media, a proto může tato inhibice kolonizace přispět k inhibici rozvoje otitis media.

- 24 Diagnostické soupravy

Vynález se též týká použití peptidů nebo polypeptidů podle vynálezu, a protilátek proti těmto peptidům nebo polypeptidům, jako diagnostických činidel. Detekce LB1(f) peptidů představuje diagnostický nástroj, který mimo jiné může zpřesnit nebo definovat diagnosu nemoci způsobené Haemophilus influenzae.

Biologické vzorky k diagnose mohou být získány z pacientových buněk, jako např. ze séra, krve, moči, slin, tkáňové biopsie, sputa, výplachových tekutin.

Polynukleotidy podle vynálezu, jež jsou identické nebo dostatečné identické s některou z nukleotidových sekvencí uvedených v Tabulkách 6-8, mohou být použity jako sondy k hybridizaci cDNA

- a genomové DNA nebo jako primery. pro PCR (polymerasovou řetězovou reakci) při izolaci cDNA molekul plné délky a genomových klonů,, kódujících fimbrinový protein podobný P5. Takovéto hybridizační techniky jsou známé osobám zběhlým v oboru. Tyto nukleotidové sekvence bývají typicky z 80% identické, výhodně z 90% identické, ještě výhodněji z 95% identické s referenční sekvencí. Hybridizační sondy mají zpravidla délku nejméně 15 nukleotidů.

S výhodou mají takovéto sondy nejméně 30 nukleotidů a mohou mít nejméně 50 nukleotidů. Tímto způsobem může být v biologických vzorcích detekován Haemophilus influenzae a za obzvláště stringentních podmínek hybridizace a s použitím nukleotidových sekvencí uvedených v Tabulkách 6-8 lze ve vzorku stanovit specifický kmen nebo kmeny Haemophilus influenzae.

Další aspekt vynálezu se tedy týká diagnostické soupravy, zejména na nemoce vyvolávané Haemophilus influenzae, která obsahuje:

(a) polynukleotid podle vynálezu, s výhodou nukleotidovou sekvenci 30 uvedenou v Tabulkách 6-8;

···· • 0 · 0 0 0 0 0 *

0000 0 0 0 ·

0 0000 00

000 000 00 00 0· ·

- 25 (b) nukleotidovou sekvenci komplementární k sekvenci (a);

(c) LB1(f) peptid podle vynálezu, s výhodou peptidy o sekvenci SEQ ID NO: 1-4; nebo (d) protilátku proti LB1(f) peptidu podle vynálezu, s výhodou proti 5 peptidům o sekvenci SEQ ID NO: 1-4.

Je zřejmé, že v jakékoli takovéto soupravě mohou (a), (b), (c), nebo (d) představovat podstatnou složku.

Citované dokumenty jsou zde zahrnuty odkazem.

Vynález je dále doložen následujícími příklady.

• · · · · · · ····

······ * · ·« · · ·· ·

- 26 Příklady provedení vynálezu

Níže uvedené příklady se provádějí standardními technikami, dobře známými osobám zběhlým v oboru, pokud není jinak podrobněji popsáno.

Příklady vynález dokládají, ale nijak neomezují.

Příklad 1: Stanovení variability aminokyselinové sekvence peptidů LB1(f) u různých kmenů ntHi.

la) Kultivace ntHi izolátů - příprava vzorků pro PCR analýzu ntHi izolátů poskytla Dr. L. Bakaletz z Ohio State University, io a 30 ntHi izolátů poskytl Dr. A. Forsgren z Malmo, Švédsko.

0,1 ml tekuté kultury od každého izolátu se naočkovalo na agarovou misku GCA (Gelose Chocolate Agar). Čistota vzorků se ověřila na tuhém médiu (TSA - Tryptose Soy Agar. v Petriho miskách). Misky se inkubovaly 24 hod při 35°C. Kolonie z misek se resuspendovaly v 5 ml filtrovaného TSB (Tryptose Soy Broth + 3 gg/μΙ NAD, + 3 pg/μΙ hemin, + 1% koňské sérum).. 50 ml tekutého média TSB se inokulovalo 2,5 mí kultury a inkubovalo se při 35°C. Po dosažení hustoty 10⁸ buněk / ml se 10 ml kultury zcentrifugovalo (15 min, 10 000 ot/min, 4°C). Supernatant se odstranil a stočené buňky se

2o promyly fyziologickým pufrem a stočily při 10 000 ot/min, 15 min, 4°C. Buňky se resuspendovaly do výsledné koncentrace 10⁹ buněk / ml. Pak se buňky povařily po dobu 10-15 min při při 95-100°C a hned přenesly do ledové lázně. Vzorky se zmrazily při -70°C. Takto připravené vzorky pak sloužily k amplifikaci DNA pomocí PCR.

lb) PCR amplifikace DNA fragmentu nesoucího gen pro fimbrin podobný P5.

PCR amplifikace fragmentu fimbrinového genu se prováděla na preparátech ntHi z příkladu 1a). K tomu se zcentrifugovalo 200 μΙ ntHi • · · « · *· *··?

• i · • · · • · '· · • · * · • · · ·

- 27 preparátu (3 min, 14 200 ot/min, pokojová teplota), všechen supernatant se odstranil, buňky se resuspendovaly v 25 μΙ ADI, povařily se při 95^qC po dobu 10 min a zcentrifugovaly se 3 min při 14 : 200 ot/min. Pro PCR reakci se použilo 5 μΙ supernatantu.

K amplifikaci DNA se použily specifické primery:

NTHi-01: 5 - ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC - 3'

NTHi-02: 5' - CCA-AAT-GCG-AAA-GTT-ACA-TCA-G -3'

Složení reakční směsi pro PCR bylo následující: 5μΙ supernatantu buněčného extraktu; 1 μΙ primerů NTHi-01 (1/1.0); 1 μΙ ίο primerů NTHi-02 (1/10); 2 μΙ DMSO; 4 μΙ směsi dNTP; 5 μΙ 10x pufru;

31,5 μΙ ADI; 0,5 μΙ Taq polymerasy.

Podmínky cyklování při PCR byly následující: (1 min 94°C; 1 min 50°C; 3 min 72°C) 25 cyklů a závěrečných 10 min při 72°C. Výsledek reakce byl kontrolován elektroforézou na 3% agarosovém gelu v TBE pufru.

Primery k určení skupiny, do které přísluší daný ntHi peptid LB1(f) z fimbrinu podobného P5, byly následující (primery se použily podobně jako v reakci uvedené shora):

Skupina 1:

NTHi-01: 5'- ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC - 3'

NTHÍ-GR1: 5'- GTG-GTC-ACG-AGT-ACC-G - 3'

Skupina 2:

NTHi-01: 5' - ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC - 3'

NTHi-GR2bis: 5' - TCT-GTG-ATG-TTC-GCC-TAG - 3'

Skupina 3:

NTHi-01: 5' - ACT-GCA-ATC-GCA-TTA-GTA-GTT-GC - 3'

NTHÍ-GR3: 5' - CTA-TCG-ATG-CGT-TTA-TTA-TC - 3' 'y£v,' ·«·· «·«···

- 28 ··· · • 0 4

1c) Purifikace DNA

K purifikaci DNA fragmentů z PCR reakcí se použila souprava PCR Clean Up Kit (Boehringer Mannheim). V závěrečném kroku 5 postupu se purifikovaný PCR produkt eluoval z nosiče (křemeliny) dvakrát 25 μΙ redestilované vody.

Purifikované produkty se analyzovaly elektroforézou na 3% agarosovern gelu barveném ethidium bromidem. DNA byla takto připravena k sekvenování.

1d) Sekvenace DNA

Sekvenace se prováděla na automatickém sekvenátoru ABIPRISM s použitím příslušného kitu, využívajícího terminační metodu s PCR cyklováním a enzymu Amplitaq DNA polymerasu FS (Perkin

Elmer).

Reakční směs pro PCR obsahovala: Mix (z kitu), 8 μΙ; DNA (přibližně 1 pg), 3 μΙ; primer (viz níže) 1/5 nebo 1/10, 1 μΐ, .ADI, 8 μΙ.

Sekvenační primery byly následující:

NTHi-03: 5'-AGG-TTA-CGA-CGA-TTT-CGG-3' nebo

NTHi-04: 5'- CGC-GAG-TTA-GCC-ATT-GG-3' nebo

NTHi-05: 5'-AAA-GCA-GGT-GCT-TTA-G-3' nebo

NTHi-06: 5'- TAC-TGC-GTA-TTC-TGC-ACC-3'

NEBO

NTHi-03: 5'- AGG-TTA-CGA-CGA-TTT-CGG-3'

NTHi-04: 5'- CGC-GAG-TTA-GCC-ATT-GG-3'

NTHi-05: 5'-AAA-GCA-GGT-GTT-GCT-TTA-G-3'

NTHi-06: 5'- TAC-TGC-GTA-TTC-TTA-TGC-ACC-3' • · ·<♦» ·· · • * · · · · · • t · · · ί ·«·♦

- 29 • ·'·

NTHi-14: 5'- GGT-GTA-TTT-GGT-GGT-TAC-C-3'

NTHi-15: 5'- GTT-ACG-ACG-ATT-ACG-GTC-G-3'

Podmínky PCR cyklování pro sekvenování byly následující: (30 sec 96°C; 15 sec 50°C; 4 min 60°C) 25 cyklů a závěrečných 10 min při s 72°C.

K přípravě a analýze PCR produktu se k PCR sekvenační reakci přidalo 80 μΙ ADI do výsledného objemu 100 μΙ a dále se k roztoku γλκιλ

L/ΙΝΛΆ pitUdl OlCJIiy uujcill OIIICOI ICI IkJI/IIUI U l.ui I-II.

VAUicf\ oc par\ centrifugoval (3 min, 14 500 ot/min, 4°C), odebrala se horní vodná vrstva a extrakce směsí fenol/chloroform á centrifugace se opakovaly. K vodné vrstvě se přidalo 10 μΙ 3M Na-acetátu pH 4,8 a 220 μΙ 100% etanolu (při pokojové teplotě), po zamíchání se vzorek uložil na 5 min do -20°C a pak se centrifugoval 20 min při 14 000 ot/min při 4°C. Etanolový supernatant se odstranil, peleta se opláchla 1 ml 70% etanolu (při pokojové teplotě) a opakovala se centrifugace (10 min, 14 000 ot/min, 4°C). Supernatant se odstranil jako předtím, peleta'se usušila na vzduchu a přes noc se zamrazila. Peleta byla'nakonec rozpuštěna v roztoku: formamid 100% deionizovaná voda, 5 objemů; 0,5M EDTA pH 8,0, 1 objem. Roztok byl několik sekund míchán na vortexu a pak nanesen na sekvenační gel.

e) Souhrnné výsledky a závěry

Tabulka 1 přehledně uvádí různé izoláty ntHi, které byly analyzovány z hlediska sekvence jim příslušejících LB1(f) peptidů z fimbrinového proteinu podobného P5. Roztřídění do skupin bylo určeno podle porovnání sekvence LB1 (f) peptidu se sekvencemi SEQ ID NO: 5, 2 nebo 3 (které reprezentují LB1 (f) peptidy Skupiny 1, resp. 2, resp. 3). Testovaný LB1(f) peptid musel vykazovat nejméně 75% identitu s reprezentativním peptidem skupiny, aby byl zařazen do příslušné skupiny. V Tabulkách 2, 3, a 4 jsou uvedeny sekvence

LB1 (f) peptidů přiřazené do Skupin 1, resp. 2, resp. 3. Tabulka 5 •··· ·· ···· ’ • ·. · · φ ··· · © · · • ·.·. · · · · · • · · · · · • · ukazuje vzájemné srovnání reprezentativních LB1(f) peptidů Skupin 1, 2a, 2b a 3.

Tabulky 6-9 ukazují DNA sekvence LB1(f) peptidů uvedených v Tabulkách2-5.

·· ♦ ·♦·

	Serotyp	č.izolátu	- Kmen	Skupina
1	TTHi	1848L	H. influenzae	1
2	NTHi	1848NP	H. influenzae	1
3	NTHi	1885R	H. influenzae	1
4	NTHi	1885MEE	H. influenzae	2
5	NTHi	10547RMEE	H. influenzae
6	NTHi	10548LMEE	H. influenzae
7	NTHi	10567RMEE	H. influenzae	1
	> 1·	4ř\£:±OI nCC
o	n i m
9	NTHi	10567&8NP	H. influenzae
10	NTHi	1371MEE .	H. influenzae.	1< .
11	NTHi	214NP	H. influenzae	1
12	NTHi	1370MEE	H. influenzae	1
13	NTHi	1380MEE	H. influenzae	1
14	NTHi \ -	217NP	H. influenzae	1
15	NTHi	266NP	H. influenzae	2
16	NTHi	167NP	H. influenzae	1
17	NTHi	1657MEE	H. influenzae	1
18	NTHi	284NP	H. influenzae	1
19	NTHi	1666MEE	H. influenzae	1
20	NTHi	287NP	H. influenzae	1
21	NTHi	1236MEE	H. influenzae	2
22	NTHi	183NP	H. influenzae	2
23	NTHi	165NP	H. influenzae	2
24	NTHi %	1182MEE	H. influenzae	1
25	NTHi	166NP	H. influenzae	1
26	NTHi	1199MEE	H. influenzae	1
27	NTHi	172NP	H. influenzae	1
28	NTHi	1230MEE	H. influenzae	1
29	NTHi	180NP	H. influenzae	1
30	NTHi	1234MEE	H. influenzae	1
31	NTHi	182NP	H. influenzae	1
32	NTHi	152NP	H. influenzae	1
33	NTHi	226NP	H. influenzae	1
34	NTHi	1714MEE	H. influenzae	2
35	NTHi	297NP	H. influenzae	2
36	NTHi	1715MEE	H. influenzae	2
37	NTHi	1729MEE	H. influenzae
. 38	NTHi	1728MEE	H. influenzae

···· ··· ·· ····

39	MTHi	250NP	H. influenzae	1
40	MTHi	1563MEE	H. influenzae	1
41	MTHi ··	1562MEE	H. influenzae	1
42	NTHi	10559RMEE	H. influenzae	1
43	NTHi	1712MEE	H. influenzae	1
44	NTHi	1521	H. influenzae	1
45	NTHi	1060RMEE	H. influenzae	1
46	NTHi	86-027MEE	H. influenzae		2
47	NTHi	86-027NP	H. influenzae	1
48	NTHi	86-028NP	H. influenzae	1
49	NTHi	86-028LMEE	H. influenzae	1
50	NTHi	90-100	H. influenzae	1
51	NTHi;	9O-121RMEE	H. influenzae	1
52	NTHi	1128	H. influenzae	1
53	NTHi	90-100RMEE	H. influenzae	1
	NTHi’	.476	H. influenzae	1
55	NTHi*	480	H. influenzae	1
56	NTHi*	481	H. influenzae	1
57	NTHi*	482	H. influenzae	1
58	NTHi*	484	H. influenzae	1
59	NTHi*	486	H? influenzae	1
60	NTHi*	490	H. influenzae	1'
61	NTHi*	492	H. influenzae		2
62	NTHi*	494	H. influenzae	1
63	NTHi’	495	H. influenzae		2
64	NTHi*	498	H. influenzae	1
65	NTHi*	499	H. influenzae	1
66	NTHi*	500	H. influenzae		2
67 ..	NTHi*	501	H. influenzae	1
68	NTHi*	502	H. influenzae		2
69	NTHi*	503	H. influenzae	1
70	NTHi*	504	H. influenzae		3
71	NTHi*	506	H. influenzae		2
72	NTHi’	507	H. influenzae	1
73	NTHi*	546	H. influenzae		2
74	NTHi*	567	H. influenzae	1
75	NTHi	544	H. influenzae		3
76	NTHi	565	H. influenzae	1
77	NTHi	600	H. influenzae		3
78	NTHi	601	H. influenzae	1
79	NTHi	603	. H. influenzae	1

• ·

80	NTHi	604	H. influenzae	2
81	NTHi	605	H. influenzae	1
82	NTHi	606	H. influenzae	1
83 .	NTH i '	608	H. influenzae	1

Souhrnný přehled studovaných ntHi kmenů a klasifikace sekvencí jejich příslušných LB1(f) peptidů z fimbrinového proteinu podobného P5 (kmeny 1-53 od L. Bakaletz, kmeny 54-83 od A. Forsgren). * značí r-.+ Lj; Ιζγλλκμ/ k./h, II _Λ , A „ , , \, ΙΙΟΛ IZ o «i .

i_vnjpor\c r\i ii^iiy s ιιι ιι, υοιαιιιι r\u ισι iy uyiy ií.uiuvany v uon. r\iiidiy

1885 a 1128 jsou dostupné ve sbírce Američan Type Culture Collection (ATCC # 55431 a # 55430).

Λ íř <·

- 34· -

•	• flflfl
flfl	•
•	• flfl
•	•
•	•

• fl flflflfl

Tabulka 2: Souhrnné sekvence peptidu Skupiny 1

N1128

N1380MEE

N.1885R

N1562MEE

N1563MEE

N18ONP

N217NP

N284NP

N1666MEE

N1230MEE

NTHI-501

NTHI-507

NTHI-565

NTHI-603

NTHI-608

N287NP

N86028LM

N86028NP

N152NP

N1234MEE

N182NP

N90100RM

N90100

N10567RM

N1060MEE

N172NP

N1199MEE

N10568LM

N90121RM

N86027NP

NTHI-486

N1712MEE

NTHI-503

NTHI-476

N166NP

N1182MEE

N1848NP

N1371MEE

NTHI-498

NTHI-606

N1848L

NTHI-567

NTHI-484

N10559RM

NTHI-601

NTHI-481

NTHI-482

N1370MEE

N226NP

NTHI-480

N1657MEE

N267NP

RSDYKFYEDANGTRDHKKG

RSDYKFYEDADGTRDHKKG

RSDYKFYDDANGTRDHKKG

RSDYKFYEDENGTRDHKKG

RS DYKFYEAANGTRDHKKG

RSDYKFYEAANGTRDHKKG

RSDYKFYEVANGTRDHKKG

RSDYKFYE.VANGTRDHKKG.

RS DYKFYEVANGTRDHKKG

RSDYKFYEAANGTRDHKKG

RSDYKFYEEANGTRDHKKG

RSDYKFYNDANGTRDHKKS

RSDYKFYEVANGTRDHKKS

RSDYKFYEDANGTRDRKTG

RSDYKFYEDANGTRKHKEG

RSDYKLYEVANGTRDHKKS

RSDYKFYEVANGTRDHKQS

RS DYKFYEEANGTRDHKRS

RSDYKFYEDANGTRERKRG

RSDYKFYEVANGTRERKKG

RSDYKFYEVANGTRERKKG ·· ···♦

NTHI-490

NTHI-494

N214NP.

N25ONP

N1521

NTHI-605

NTHI-499

- 35 RSDYKFYEVANGTRERKKG RSDYKFYEVANGTRERKKG RSDYKFYEVPNGTRDHKQS RS DYKRYEEANGTRNHDKG RSDYKRYEEANGTRNHDKG RSDYKRYEEANGTRNHDKG RSDYEFYEAPNSTRDHKKG

Tabulka 3:

Souhrnné sekvence peptidů Skupiny 2

N1715MEE

N1714MEE

N86027RM

N297NP

N266NP

N1885MEE

NTHI-546

NTHI-604

NTHI-492

NTHI-502

NTHI-506

N1236MEE

NTHI-500

NTHI-183

N165NP

NTHI-495

RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE RS DYKLYNKNS S SN STLKNLGE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE RSDYKLYNKNSS-NSTLKNLGE RS DYKLYDKNSS SN-TLKKLGE RSDYKLYNKNSS-NSTLKNLGE

RSDYKLYNKNSS---TLKDLGE

RSDYKLYNKNSS;---TLKDLGE

RSDYKLYNKNSSN-TLKDLGE

RSDYKLYNKNSSD-ALKKLGE

Tabulka 4

Souhrnné sekvence peptidů Skupiny 3

N1729MEE

NTHI-504

NTHI-544

NTHI-600

N1728MEE

N10548LM

N10547RM

N105678R

RSDYKFYDNKRID

Tabulka 5

Souhrnné sekvence peptidů Skupiny 1, 2a, 2b a 3

N1128

N1715MEE

NTHI-183

N1729MEE

RSDYKFYEDANGTRDHKKG--RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE

RSDYKLYNKNSS---TLKDLGE

RSDYKFYDN------KRID--«· ···· ·· • · · · · · * « · · · • · · * · · « · »

Tabulka : Souhrnné nukleotidové sekvence Skupiny 1

N1128

N1380MEE

N1885R

N1562MEE

N1563MEEN180NP

N217NP

N284NP

N1666MEE

N1230MEE

NTHI-501

NTHI-507

NTHI-565

NTHI-603

NTHI-608

N287NP .

N86028LM

N86028NP

N152NP

N1234MEE

182NP

N90100RM

N90100

N10567RM

N1060MEE

N172NP

N1199MEE

N10568LM

N90121RM

N86027NP

NTHI-486

N1712MEE

NTHI-503

NTHI-476

N166NP

N1182MEE

N1848NP

N1371MEE

NTHI-498

NTHI-606

N1848L

NTHI-567

NTHI-484

N10559RM

NTHI-601

NTHI-481

NTHI-482

N1370MEE

N226NP

NTHI-480

N1657MEE

N267NP

NTHI-490

NTHI-494

N214NP

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACT.CGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAGACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGÁTTATAAATTTTATGATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGAAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT.

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGAAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACGACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT cgttctgattataaattttatgaagctgcaaacggtactcgtgaccacaaGaaaggt

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAATGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGCTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATAATGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCGCAAGACAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTAAGCACAAGGAAGGT

CGTTCTGATTATAAACTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAAGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAGAAGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAGAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTGCAAACGGTACTCGTGAGCGCAAGAAAGGT

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGTTCCAAACGGTACTCGTGACCACAAGCAAAGT • · 4 · « · ·» • ··· • · · • · « · • ·

CGTTCTGATTATAAACGTTATGAAGAAGCAAACGGTACTCGTAACCACGACAAAGGT

CGTTCTGATTATGAATTTTATGAAGCTCCAAACAGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT ·· ·

N250NP

N1521

NTHI-605

NTHI-499

Tabulka 7: Souhrnné nukleotidové sekvence Skupiny 2

N1715MEE

N1714MEE

N86027RM

N297NP

N266NP

N1885MEE

NTHI-546

NTHI-604

NTHI-492

NTHI-502

NTHI-506

N1236MEE

NTHI-500

NTHI-183

N165NP

NTHI-495

CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATŤGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---AATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTGTACGATAAAAATAGTAGTAGTAAT---ACTCTTAAAAAACTAGGCGAA

CGTTCIGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---AATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT------ ACTCTTAAAGACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAAT------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTATACAATAAAAATAGTAGTGAT------GCTCTTAAAAAACTAGGCGAA

Tabulka 8: Souhrnné nukleotidové sekvence Skupiny 3

N1729MEE

NTHI-504

NTHI-544

NTHI-600

N1728MEE

N10548LM

N10547RM

N105678R

CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGAT CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGAT C G T T C T G AC T AT AAAT T C T AC G ATAAT AAAC G C AT C G AT CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGAT CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGAT CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGAT CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGAT CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAATAAACGCATCGAT

Tabulka 9: Souhrnné nukleotidové sekvence Skupiny 1,2a,2b, a 3

N1128

N1715MEE

NTHI-183

N1729MEE

CGTTCTGATTATAAATTTTATGAAGATGCAAACGGTACTCGTGACCACAAGAAAGGT

CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGTAGTAATAGTACTCTTAAAAACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTGTACAATAAAAATAGTAGT---------ACTCTTAAAGACCTAGGCGAA

CGTTCTGACTATAAATTCTACGATAAT------------------AAACGCATCGAT

- 38 ···· ··· • · · • · · • · · · • · · · »# ·· «· ···· »* · · • ·

Φ · · • · • Φ . ·

Studie ukázala, že LB1(f) peptidy z fimbrinového proteinu podobného P5 ze všech zkoumaných 83 ntHi izolátů mohou být roztříděny do tří skupin, a že do této klasifikace lze zařadit izoláty z USA i Evropy.

Příklad 2: Exprese fúzovaných polypeptidů LPD-LB1(f) peptid v E. coli Výchozí materiály

1) Expresní vektor pMG1

Expresní vektor pMG1 je derivátem pBR322, do kterého byly zavedeny regulační elementy z bakteriofága λ k řízení transkripce a translace cizorodých vnesených genů (Young et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80:6105-6109). Vedle toho byl v plasmidu nahražen gen resistence k ampicilinu genem resistence ke kanamycinu.

Vektor obsahuje λ promotor P_L, operátor Ol a dvě místa, Nuíl a Nuír, která slouží k uvolnění efektu transkripční polarity. K stabilizaci plasmidové DNA se vektory obsahující Pl promotor vnášejí do lysogenních E. coli hostitelů. Lysogenní hostitelské kmeny mají v genomu integrovanou replikačně defektní λ fágovou DNA. Chromosomální λ fágová DNA řídí syntézu represorového proteinu cl, který se váže k Ol na vektoru a tím brání vazbě RNA polymerasy k Pl promotoru a tím i brání transkripci cizího, do vektoru klonovaného genu. Kmen AR58 vhodný k expresi obsahuje teplotně senzitivní mutaci v genu pro cl, takže transkripce z promotoru Pl může být regulována teplotním posuvem, tzn. zvýšením teploty bakteriální kultury se inaktivuje mutantní represor cl a tím se umožní exprese cizího proteinu. Tento expresní systém umožňuje regulovanou syntézu cizích proteinů, zejména proteinů, které by mohly být toxické pro hostitelskou buňku.

2) Expresní vektor pMGMCS

Nukleotidové sekvence mezi restrikčními místy BamHI a Xbal v pMG1 byla nahrazena DNA fragmentem nesoucím mnohočetné klonovací místo (MCS), za vzniku expresního vektoru pMGMCS (Obr. 1).

Na 3'konec MCS byla přidána sekvence kódující poly-His, což umožňuje expresi fúzovaného proteinového produktu nesoucího na C-konci hexa-histidinovou kotvu.

Vektor obsahuje před BamHI restrikčním místem sekvenci, jež io kóduje první tři aminokyseliny NS1 (Met-Asp-Pro).

3) Konstrukce vektoru pRIT14588

Klonovací strategie pro sestavení expresního vektoru pRIT14588 z vektoru pMGMCS je načrtnuta na Obr.2. Gen pro lipoprotein D byl amplifikován pomocí PCR z vektoru pHIC348 (Jansún et al., 1991, Infect. Immun. 59:119-125) s použitím primerů, které vnesly na 5' konec restrikční místo BamHI a na 3' konec restrikční místo Ncol. Fragment BamHl-Ncol pak byl vnesen do pMGMCS mezi BamHI a Ncol.

2o Produkt genu lipoproteinu D obsahuje svoji přirozenou signální sekvenci kromě prvních tří aminokyselin, které byly nahraženy sekvencí Met-Asp-Pro z NS1.

Ke 3' konci genu pro lipoprotein D pak byly v plasmidů pRIT14588 klonovány následující LB1 (f) peptidy: skupina 1, ntHi-1128 (SEQ ID NO:5); skupina 2, ntHi-1715 MEE (SEQ ID NO:2); skupina 3, ntHi-1729 MEE (SEQ ID NO:3).

• · · · . 40 - ...... ** ’* **

4) E. coli kmen AR58

Lysogenní kmen E. coli AR58, který byl použit k produkci nosičového proteinu D, je derivátem standardního NIH E. coli K12 kmene N99 (F'su'galK2, lacZ'thr). Obsahuje defektní lysogenní λ fág (galE::TN10, λ Kil cl857 DH1). Kil fenotyp brání zastavení hostitelské makromolekulám! syntézy. Mutace cl857 způsobuje teplotní senzitivitu cl represoru. DH1 delece odstraňuje pravý operon λ fág a a hostitelské lokusy bio, uvr3 a chlA. Kmen AR58 (Mott et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82:88-92) byl vytvořen transdukci kmene N99 fágem io Pl, předtím narostlým na SA500 derivátu (galE::TN10, λ Kil cl857 DH1). Pro vnesení defektního lysogenu do N99 byla použita selekce tetracyklinem (TN10 transposon kódující tetracyklinovou resistenci je přítomen v sousedícím genu galE).

Příklad 2a: Konstrukce fúze Lipoprotein D-LB1(f) Skupiny 1

Cílem této konstrukce bylo vnesení 19 zbytků LB1(f) peptidu 3' vzhledem k Ncol místu v mnohočetném klonovacím linkeru plasmidu pRIT14588. Těsně 3' vzhledem k Ncol místu byly vneseny dva glycinové zbytky tak, aby gen pro LB1 (f) peptid byl ve stejném čtecím rámci sgenem pro LPD. Po dvou Gly zbytcích následovala DNA kódující 8 aminokyselinových zbytků sousedících na N-konci s LB1 (f) peptidem ve fimbrinovém proteinu podobném P5, dále následovala DNA kódující LB1(f) peptid a nakonec DNA kódující 5 přirozených zbytků sousedících na C-konci s LB1(f) peptidem. Plasmid (nazvaný

LPD-LB1-A) je znázorněn na Obr. 3 a byl konstruován jak uvedeno níže:

pRIT14588 se štěpil restrikčními enzymy Ncol a Spěl, a lineární velký fragment se defosforyloval. Gen pro LB1(f) peptid se amplifikoval z DNA kódující ntHi-1128 fimbrinový protein podobný P5 s použitím následujících primerů:

··· · · · · · primer LB-Baka-01 (5' - obsahující Ncol místo)

5'- CTA-GCC-ATG-GAT-GGT-GGC-AAA-GCA-GGT-G-3' primer LB-Baka-05 (3' - obsahující Spěl místo)

5'- CAC-TAG-TAC-GTG-CGT-TGT-GAC-GAC-3'

DNA vytvořená PCR amplifikací byla štěpena restrikčními enzymy Ncol a Spěl. LB1(f) DNA fragment byl purifikován a ligován mezi Ncol a Spěl místa štěpeného vektoru pRlT14588. Ligační směsí se transformovaly buňky E. coli AR58 a ty se nanesly na tuhé médium ίο (BP) LBT + kanamycin (50 pg/ml). Agarové misky se inkubovaly přes noc při 30°C. Transformanty se zkontrolovaly pomocí PCR a pozitivní kandidátní klony se rozrostly v tekuté kultuře při .30°C. K indukci exprese chimérního polypeptidu LPD-LB1(f) se kultura převedla v průběhu 4 hodin z teploty 30°C na 39°C. Exprese byla sledována elektroforézou na 12,5% polyakrylamidovém gelu (s vizualizací barvením Coomassie modří a/nebo Westernovou analýzou). Molekulová hmotnost chimérního polypeptidu byla přibližně 44 kDa.

Příklad 2b: Konstrukce fúze LPD-LB1(f) Skupiny 2+LB1(f)

Skupiny 1

Plasmid (nazvaný LPD-LB1-II) je znázorněn na Obr. 4 a jeho konstrukce byla následovná:

Plasmid LPD-LB1-A se štěpil enzymem Ncol a lineární DNA se defosforylovala. Gen pro LB1(f) peptid Skupiny 2 se amplifikoval z DNA kódující ntHi-1715MEE fimbrinový protein podobný P5 s použitím následujících primerů:

primer NT1715-11NCO (5' obsahující Ncol místo)

5CAT-GCC-ATG-GAT-GGC-GGT-AAA-GCA-GGT-GTT-GCT-3' • · • ·

primer NT1715-12NCO (3' obsahující Ncol místo)

5'- CAT-GCC-ATG-GCA-CGT-GCT-CTG-TGA-TG-3'

DNA vytvořená PCR amplifikací byla štěpena enzymem Ncol. LB1(f) DNA fragment byl purifikován a ligován do Ncol místa plasmidu LPD-LB1-A (5' vzhledem ke genu pro LB1(f) peptid Skupiny 1). Ligační směsí se transformovaly buňky E. coli AR58 a ty se nanesly na

x.. i- z z j:. /d n\ i ot luně uieuiuiii \Drj uo i

L·o n q m\/^·/ C ZT ,../*· /m i\ MieLn/ rva 11 ci 111 y 111 μ,^/ιιιι/. iviioixy ínUi ihnvalv ..............· 3 přes noc při 30°C. Transformanty se zkontrolovaly pomocí PCR a pozitivní kandidátní klony se rozrostly v tekuté kultuře při 30°C. K indukci exprese chimérního polypeptidu LPD-LB1 (f)₂,i se kultura převedla v průběhu 4 hodin z teploty 30°C na 39°C. Exprese byla sledována elektroforézou na 12,5% polyakrylamidovém gelu (s vizualizací barvením Coomassie modří a/nebo Westernovou analýzou). Molekulová hmotnost chimérního polypeptidu byla přibližně kDa.

Příklad 2c: Konstrukce fúze Lipoprotein D-LB1(f) Skupiny 2 + LB1(f) Skupiny 1 + LB1(f) Skupiny 3

2o Plasmid (nazvaný LPD-LB1-III) je znázorněn na Obr. 5 ajeho konstrukce byla následovně:

Plasmid LPD-LB1-II se štěpil enzymem Spěl a lineární DNA se defosforylovala. Gen pro LB1(f) peptid Skupiny 3 se připravil z ntHi1929MEE hybridizací následujících primerů:

primer NT1729-18SPE (5'-obsahující štěpené Spěl místo na 5' konci)

5'-CTA-GTC-GTT-CTG-ACT-ATA-AAT-TCT-ACG-ATA-ATA-AACGCA-TCG-ATA-GTA-3'

primer NT1729-19SPE (3'-obsahující štěpené Spěl místo na 3' konci)

5'-CTA-GTA-CTA-TCG-ATG-CGT-TTA-TCG-TAG-AAT-TTA-TAGGCA-GAA-CGA-3'

Hybridizovaná DNA obsahovala gen pro LB1(f) peptid Skupiny 3 a štěpené Spěl místo na obou koncích. LB1(f) DNA fragment byl iigován do Speí místa plasmidů LPD-LB1-II (3' vzhledem ke genu pro LB1(f) peptid Skupiny 1).. Ligační směsí se transformovaly buňky E. coli AR58 a ty se nanesly na tuhé médium (BP) LBT + kanamycin (50 pg/ml). Misky se inkubovaly přes noc při 30°C. Transformanty se zkontrolovaly pomocí PCR a pozitivní kandidátní klony se rozrostly v tekuté kultuře při 30°C. K indukci exprese chimérního polypeptidu LPD-LB1 (f)2,i,3 se kultura převedla v průběhu 4 hodin z teploty 30°C na 39°C. Exprese byla sledována elektroforézou na 12,5% polyakrylamidovém gelu (s vizualizací barvením Coomassie modří á/nebo Westernovou analýzou). Molekulová hmotnost chimérního polypeptidu byla přibližně 53 kDa.

Příklad 2d: Charakterizace exprese chimérních polypeptidů

Exprese shora uvedených chimérních polypeptidů byla sledována pomocí elektroforézy na 12,5% polyakrylamidovém gelu, který byl vizualizován buď jako:

a) Coomassie barvený gel

b) Western blot

1) s použitím králičích anti-LB1 protilátek (Obr. 7)

2) s použitím monoklonální anti-LPD protilátky (Obr. 8)

3) s použitím protilátky namířené proti hexa-hisitidinové kotvě (Obr. 9)

- 44 Z výsledků plyne, že všechny studované chimérní polypeptidy mohou být účinně exprimovány v E. coli.

Příklad 3: Purifikace chimérních polypeptidů

Purifikace LPD-LB1(f)2,i,3 (exprimovaného z vektoru uvedeného na Obr. 5) byla provedena následovně:

Sklizené buňky E. coli byly promyty a resuspendovány ve fosfátovém pufru (50 mM, pH 7,0). Buňky byly lyžovány přes noc při 4°C mírným mícháním v přítomnosti 3% Empigenu. Roztok pak byl io centrifugován 30 min při 8 000 ot/min v rotoru Beckman JA10. Supernatant byl 4x zředěn pufrem o složení 50 mM fosfát, 500 mM NaCI, pH 7,0. První krok purifikace byl dosažen na koloně Qiagen NTA Ni++, díky přítomnosti hexa-histidinové sekvence na C-konci polypeptidů. Kolonka byla ekvilibrována pufrem o složení 10- mM fosfát sodný, 500 mM NaCI, 0,5% Empigen, pH 7,5, a zachycený polypeptid byl z kolony elúován imidazolovým gradientem (0-100 mM) v pufru o složení 20 mM fosfát sodný, 0,5% Empigen, pH 7,0. Eluované frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE.

Dalším krokem v purifikaci byla chromatografie na koloně Bio20 Rad Macro-Prep 50S. Polypeptid se vázal na kolonu ekvilibrovanou roztokem o složení 20 mM fosfátový pufr, 0,5% Empigen, pH 7,0 a jeho eluce z kolony bylo dosaženo gradientem NaCI (0-500 mM) ve stejném pufru. Eluované frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE.

Posledním dočišťovacím krokem postupu byla gelová filtrace na koloně Sephacryl S200 HR. Roztok polypeptidů z předchozího kroku byl nejprve zahuštěn na koncentrátoru Filtron Omega 10 kDa a pak byl aplikován na kolonu ekvilibrovanou roztokem PBS s 0,5% Empigenem. Eluované frakce byly analyzovány pomocí SDS-PAGE.

Spojené pozitivní .frakce byly zfiltrovány přes 0,22 μιτι filtr.

Výsledný protein poskytoval jeden čistý pruh na SDS-PAGE gelu

···· ·· ·<

barveném Coomassie modří a na odpovídajícím western blotu s antiLB1 protilátkou. Testy ukázaly, že protein zůstával neporušený i po 7 dnech při 37°C.

Uvedený postup dává výtěžek přibližně 200 mg polypeptidu 5 z jednoho litru bakteriální kultury.

Příklad 4: Předklinické testováni účinnosti chimérních polypeptidů jako vakcíny

Příklad 4a) Příprava antisér io Antiséra byla připravena proti 4 typům antigenů: LPD; PD; LPDLB1(f)2,i,3 (připraveného rekombinantně s použitím plasmidů LPD-LB1III); LB1 (LB1(f) peptid skupiny 1 fúzovaný k nahodilému epitopu fusogenního proteinu viru spalniček, rozpoznatelného T buňkami, přičemž sekvence celého tohoto peptidů je:

RSDYKFYEDANGTRDHKKGPSLKLLSLIKGVIVHRLEGVE).

K imunizaci byly vzaty čtyři skupiny činčil, každá zahrnující 5 zvířat, přičemž každá skupina obdržela jeden z imunogenů uvedených shora. Dávka činila 10 μρ antigenu / 200 μΙ AIPO₄ / 20 μρ MPL (3O-deacylovaný monofosforyl lipid A) pro první tři antigeny, a 10 pg antigenu v kompletním nebo nekompletním Freundově adjuvans (CFA nebo IFA) pro LB1.

Celkem zvířata obdržela tři dávky v měsíčních odstupech. Patnáct dnů po poslední imunizaci byla za účelem odebrání séra všechna zvířata vykrvácena kardiální punkcí při thorektomii. Séra zvířat v jednotlivých skupinách byla spojena a skladována při -70°C.

Hodnoty získaných titrů byly 10-50K pro anti-PD sérum, 50K pro anti-LPD, 50-100K pro anti-LB1 a 50-100K pro anti-LPD-LB1 (f)2,i,3· Anti-LB1 sérum rozpoznávalo při Westernové analýze vedle LB1 peptidů také LPD-LB1(f)₂,i,3. Anti-LPD a anti-PD rovněž rozpoznávaly

LPD-LB1(f)2,i,3- Imunochemické barvení zlatém (používající konjugát

- 46 '4 · proteinu A se zlatém) ukázalo, že polyklonální antiséra anti-LB1 a anti-LPD-LB1(f)₂,i,3 rozpoznávala podobné, povrchově dostupné epitopy na buňkách ntHi 86-028NP, jako monoklonální protilátka proti fimbrinovému proteinu podobnému P5.

Z Westernově analýzy na Obr. 12 je dále patrné, že anti-LPDLB1 (f)₂,i,3 sérum rozpoznává fimbrinový protein podobný P5 u tří ntHi kmenů reprezentujících 3 hlavní LB1(f) skupiny. Rozpoznání těchto kmenů anti-LPD-LB1(f)_2ii,3 sérem je mnohem silnější než v případě séra anti-LB1.

Příklad 4b) Pasivní transfer a výzva

V této studii byly pasivně imunizované činčily vystaveny in vivo infekci ntHi (výzvě) s cílem určit, jaká je relativní účinnost . 4 imunogenů (nebo simulované imunizace, ”sham”) v procesu vedoucím k vymizení ntHi z nosohltanu.

Pět skupin po 11 činčilách (Chinchilla lanigera), prostých chorob θ středního ucha, bylo v den -7 intranasalně inokulováno dávkou 6x10 TCID₅o adenoviru typu 1. V den -1 byla každá skupina zvířat pasivně imunizována vpichem do srdce jedním ze čtyř vzorků sér, popsaných v Příkladu 4a, v ředění 1:5. Pátá skupina (simulovaná imunizace, sham) obdržela místo séra sterilní nepyrogenní fyziologický roztok, taktéž vpichem do srdce. Přibližně bylo aplikováno 5 ml séra/kg hmotnosti zvířete.

V den 0 byly všechny skupiny zvířat vystaveny intranasalní výzvě ntHi, přibližně 10⁸ cfu ntHi # 86-028NP (skupina 1) na zvíře.

Celá tato studie pasivního transferu byla v režimu slepého pokusu”, přičemž statistické vyhodnocení se provedlo před rozkrytím podkladů.

• ·

- 47 Tato postupná inokulace dvěma patogeny velmi blízce napodobuje jak přirozenou cestu nákazy, tak i synergickou interakci v lidském hostiteli.

Stupeň závažnosti onemocnění byl kvantitativně hodnocen po 5 otoskopickém vyšetření s použitím stupnice od 0 do 4. Byly sledovány příznaky zánětu membrány bubínku (tympanu, TM): přítomnost efúze, rozšíření malých cév, rozhraní vzduch-tekutina, opacita,. atd.

Pro srovnání odpovědí pozorovaných v průběhu času (dnů) na uších (levých nebo pravých) u všech pěti skupin zvířat byl použit io opakovaný test variance. Vzhledem k velkému počtu opakovaných vyšetření každého zvířete, byla analýza rozdělena do pěti oddílů: dny 1-7, dny 8-14, dny 19-21, dny 22-28, a dny 29-33. V datech zjištěných pro dny -7 až 0, 34 a 35 byly jen malé odchylky, a proto se pro tyto dny tento test neprováděl. Kde' to bylo možné (tj. při nenulové variabilitě střední odpovědi), se provedly testy porovnávající střední odpovědi těchto skupin v těchto časových bodech. Pro všechna post hoc mnohočetná porovnání se použil Tukeyův HSD test. Statistická významnost byla hodnocena při hladině testu alfa 0,05.

Výsledky jsou ukázány na Obr.10. U všech skupin se zánět

2o v čase významně zvětšuje v časovém úseku od 1. do 7. dne. Ve dnech 29-33 zánět s časem významně klesal u všech skupin. Z výsledků plyne, že sérum obsahující protilátky proti rekombinantnímu LPDLB1(f)₂,i,3 napomáhalo v průběhu celého experimentu k snížení zánětu TM. Účinný vakcinogen by měl udržovat zánět TM na nebo pod hodnotou 1,5 po celou dobu trvání studie. Antisérum proti LPDLB1(f)₂,i,3 povolilo překročení střední hodnoty parametru nad 1,5 pouze po dva dny, a potom již indukovalo trvale sestupný trend.

Kromě otoskopického vyšetření byla rovněž použita tympanometrie (EarScan, South Daytona, FL, USA), která měří změny

3o tlaku ve středním uchu. Spojení těchto dvou vyšetření může poskytnout spolehlivou indikaci přítomnosti efúze ve středním uchu.

- 48 Z tympanometrických výsledků se usuzovalo na nález mimo normu, pokud byl získán tympanogram typu B, anebo pokud tlak ve středním uchu byl nižší než -100 daPa. Na Obr. 11 jsou výsledky této analýzy.

Hodnotí-li se zamezení zánětu TM a vzniku efúze, je zřejmé, že rekombinantní LPD-LB1 (f)₂.i,3 se v této studii osvědčil. Celkově se LPD-LB1(f)2,i,3 účinkem řadí hned za pozitivní kontrolu, LB1 peptid. Ten však byl užíván v přítomnosti velmi silného adjuvans CFA, a nemůže proto být přímo srovnáván s výsledky LPD-LB1(f)2,i,3·

Statistické vyhodnocení údajů shrnutých v Obr. 11 je uvedeno io v Tabulce 10. Při hodnocení se srovnávalo snížení procenta výskytu efúze ve všech imunizovaných skupinách zvířat vzhledem ke skupině simulované imunizovaných zvířat (sham); srovnání se týkalo období vrcholícího výskytu nemoci [tj. čtyř dnů, kdy nejméně 50% uší simulované imunizovaných zvířat (sham) vykazovalo efúzi (mělo otitis media)] .

Hodnoty pozitivní kontroly (anti-LB1/CFA) po všechny čtyři dny (dny 11-14) byly statisticky významné při p<0,001. Anti-LPD-LB1(f)₂,i,3 rovněž inhiboval vznik otitis media při hodnotě p menší nebo rovné 0,001 ve dnech 11,12,13 a 14. Účinek anti-PD byl statisticky významný pouze ve dnech 13 a 14, zatímco LPD byl schopen zamezit vzniku otitis media, ve srovnání s kontrolními zvířaty, pouze v den 14 (p hodnota blízká 0,02).

Rekombinantní polypeptid LPD-LB1(f)₂,i,3 proto významně inhibuje vznik otitis media u činčil, kterým bylo pasivně podáno směsné sérum proti tomuto antigenů.

ί

Den	Skupina	. % Efúze	p-hodnota
11 (sham =70%)	LB1	0	<0,0001
PD	45	0,1010
LPD-LB1(f)_2i1,₃	17	0,0010
.LPD	68	0,8886
12 (sham =80%) ' t	LB1	0	<0,0001
PD	55	0,0854
LPD-LB1(f)₂._1>3	22	0,0004
LPD	68	0,3788
13 (sham =65%)	LB1	15	0,0012
PD	18	0,0020
LPD-LB1 (f)_{2; 3}	1Λ	' 0,0002
LPD	41	0,1188
14 (sham =60%)	LB1	0	<0,0001
PD	5,	0,0002
LPD-LB1(f)₂,i,₃	0	<0,0001
LPD	23	0,0146

Tabulka 10: Srovnání podílu uší (v%) vykazujících efúzi u skupin LB1, PD, LPD-LB1(f)₂,i,3. ^a LPD ^s podílem uší (v %) vykazujících efúzi v simulované skupině ”sham ve dnech 11 až 14.

Příklad 4c) Inhibice adherence

Byl proveden zavedený test adherence buněk s použitím lidských orofaryngálních buněk. Střední hodnota procentní inhibice adherence (±střední chyba, s.e.m.) ntHi kmenů k těmto buňkám, způsobená činčilími imunními séry proti LPD a LPD-LB1(f)₂,i,3 *· ···*

- 50 z Příkladu 4a, je uvedena v Tabulce 11. Antisérum proti LPDLB1 (f)₂,i,3 bylo účinné v inhibici adherence ntHi kmenů Skupiny 1 a 2. Toto antisérum bylo vůči všem kmenům ve srovnání s anti-LPD účinnější.

Název skupiny	Kmen ntHi (skupina)	n	Ředění směsného séra 1:25 1:50 1:100 1:200 1:400 1:800
LPD/ AIPO₄/ MPL	S6-02SL (skupina 1)	3	29+3	31+4-	13+7	4 λ , n 1 yxo	4 r 1 zu	d l V J_ /
1128MEE (skupina 1)	2	0±0	12+12	8±5	12+1	8±8	16±1
266NP (skupina 2a)	3	46±9	38±7	24±13	24±21	30±16	28+19
LPD- LB1(f)₂i₃/ AIPO4/. MPL	86-028L (skupina 1)	3	32±2	36±1	38±2	27±3	3+2	19±3
1128MEE (skupina 1)	2	24±14	23±4	30+7	13±13	11±11 ,	12±6
266NP (skupina 2a)	3	52±10	43±3	36±7	13±10	6±9	14±19

Tabulka 11: Střední procentní inhibice adherence (±střední chyba) ntHi kmenů k lidským orofaryngálním buňkám způsobená imunními séry z činčily.

Příklad 4d) Pasivní transfer a výzva heterogenními ntHi kmeny

Ve studii podobné Příkladu 4b) uvedenému shora, byly v modelu činčil koinfikovaných adenovirem použity k výzvě ntHi kmeny příslušející do rozdílných klasifikačních skupin LB1(f).

·· ····

- 51 . Ve dvou studiích bylo celkem použito 132 mladých (přibližně 300

g) činčil (Chinchilla lanigera) bez známek infekce středního ucha podle otoskopického vyšetření nebo tympanometrie, přičemž ve studiích byla použita anti-LB1 a anti-LPD-LB1(f)2,i,3 antiséra. Střední váha zvířat pro tyto dvě studie, detailně popsané níže, byla 296±38 g, resp. 298±42 g. Zvířata se po dodání nechala 10 dnů odpočinout a potom jim bylo odebráno malé množství krve kardiální punkcí pro získání preimunního séra, jež bylo skladováno až do použití při -70°C. Od odběru preimunního séra do infekce adenovirem se ponechala zvířata io odpočinout nejméně 7 dnů.

Kmeny ntHi použité v těchto studiích jsou omezeně pasážované klinické izoláty kultivované ze středního ucha nebo nosohltanu dětí, u nichž byla v Columbus Children's Hospital provedena tympanostomie a zavedení kanyly z důvodu chronické otitis media s efúzí [86-028NP (skupina .1), 1885MEE (skupina 2) a 1728MEE (skupina 3)]. Všechny izoláty byly udržovány zmražené v odtučněném mléce s 20% glycerolem (obj/obj); před použitím byly rozočkovány na čokoládovém agaru a inkubovány 18 hod při 37°C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5% CO2. Adenovirus serotypu 1 byl rovněž odebrán od pediatrického pacienta v Columbus Children's Hospital.

V obou studiích pasivního transferu bylo použito 66 mladých činčil rozdělených do šesti skupin po jedenácti zvířatech. Před začátkem studie bylo od všech těchto zvířat odebráno sérum a jednotlivě otestováno Westernovou analýzou, zda neobsahuje již před vzetím do pokusu významný titr protilátek. Experimenty byly provedeny jako v Příkladu 4b) shora. Dvě skupiny obdržely směsné antisérum proti LB1, dvě skupiny směsné antisérum proti LPDLB1(f)₂.i,3, a dvě skupiny obdržely sterilní, nepyrogenní fyziologický roztok. Osobám provádějícím experiment nebylo známo, která zvířata patří do které skupiny, ani jaké sérum bylo zvířatům podáno.

·« «00« • « ««« « · · «« 0 «00 • ·«· · · 0 00 • 0 0 0 0 0 '« 0 « * · 0 0 0« 00

- 52 - ··· ··· .......

Při výzvě bylo každému zvířeti podáno intranasalně, formou pasivní inhalace přibližně 10⁸ CFU bakterií kmene ntHi 86-028NP nebo 1885MEE (studie A); nebo ntHi 86-028NP nebo 1728MEE (studie B). Každý z těchto tří kmenů reprezentuje odlišnou skupinu ntHi z hlediska sekvence LB1(f) peptidu: skupinu 1 představuje kmen ntHi 86-028NP, skupinu 2 kmen 1885MEE, a skupinu 3 kmen 1728MEE.

Stejně jako v Příkladu 4b byla zvířata denně nebo každý druhý den, počínaje dnem inokulace adenovirem až po 35.den od výzvy ntHi, vyšetřována v režimu slepého pokusu otoskopicky a tympanometrií. Známky zánětu TM byly kvantifikovány podle stupnice od 0 do 4+; vynesení výsledků tympanometrie bylo použito ke sledování změn tlaku ve středním uchu, změn tympanické šířky a změn poddajnosti bubínku. Z tympanometrických výsledků se usuzovalo na nález mimo normu při: získání tympanogramu typu B; při poddajnosti < 0,5 ml nebo > 1,2 ml; při tlaku ve středním uchu menším než -100 daPa; nebo při tympanické šířce větší než 150 daPa.

Pro porovnání středních hodnot parametru zánětu TM v jednotlivých dnech během období 1-35 dnů od bakteriální výzvy, u skupin činčil vystavených stejnému ntHi kmeni, byl použit Tukeyův HSD test. Každá skupina imunizovaných zvířat vykazovala, na základě otoskopického vyšetření, minimálně po dobu 7 dnů (max. 22 dnů) významně nižší střední hodnoty zánětu (p < 0,05) než skupina se simulovanou imunizací, u níž bylo k výzvě použito stejného kmene ntHi. Výsledky hodnocení jsou uvedeny na Obr. 13 (studie A) a Obr. 14 (studie B). Dny, ve kterých byly střední nálezy významně nižší pro LPD-LB1 (f)₂,i,3 než pro skupinu se simulovanou imunizací (sham) byly: dny 13-35 (studie A, 86-028NP); dny 1-8, 12-21 (studie A, 1885MEE); dny 8-14, 23 (studie B, 86-028NP); dny 8-14 (studie Β, 1728MEE).

Analýza podílu normálních uší (v %) v studii A a B je na Obr. 15 a Obr. 16.

- 53 ···· ·· 0000 ·· · • · · · · · · · ··· 0 0 0 0 0 0 • <· · .0 0 0 0 · ·

0 0 00 00 0 •00 00 00 00 000

Schopnost pasivního přenosu specifických antisér chránit před otitis media byla hodnocena pomocí Z testu. Zobou studií vyplynulo, že zvířata, která obdržela anti-l_B1 sérum neprojevila po výzvě kmenem ntHi 86-028 žádné známky vzniku otitis media s efúzí. Dny, ve kterých pasivní přenos anti-LPD-LB1(f)₂,i,3 séra významně bránil rozvoji otitis media ve srovnání s ”sham” skupinou, tj. skupinou simulované imunizace (měřeno ve dnech, kdy více než 50% těchto ”sham” zvířat mělo efúzi) byly: dny 13-21 (studie A, 86-028NP); dny

13-1b (studie a, loeoivittj; any ιo-1^studie B, 86-028NP); dny (studie B, 1728MEE).

V souhrnu, podání kteréhokoli z těchto tří izolátů ntHi pokusným činčilám vedlo k počáteční kolonizaci nosohltanu. Z vyhodnocení údajů získaných na základě otoskopického vyšetření, a tympanometrie vyplynulo, že skupiny zvířat, které obdržely antisérum namířené proti

LPD-LB1(f)2,i,3 vykazovaly po mnoho dnů významně nižší hodnoty nálezu a významné snížení výskytu otitis media ve srovnání s kontrolními skupinami, u kterých byly k výzvě použity tytéž kmeny ntHi.

LPD-LB1(f)₂,i,3 tedy poskytoval činčilám, koinfikovaným 20 adenovirem, významnou ochranu před vývojem otitis media indukovaným heterologními kmeny ntHi. LB1 rovněž poskytoval ochranu, avšak efekt by mohl být zčásti připsán silnému adjuvans (CFA), které bylo v tomto případě použito.

Vedle popsaných a uvedených provedení vynálezu jsou možné různé adaptace a modifikace, aniž by tím došlo k vybočení z rozsahu vynálezu, jak je popsán v připojených nárocích. Například, do rozsahu vynálezu spadají peptidy nebo polypeptidy mající v podstatě stejné aminokyselinové sekvence, jako sekvence zde popsané.

···» • ··

- 54 ·· ··*· • · · · · • · · · ' • · · · • * · · · k ·· ·· ·

SEQ ID NO: 1

RSDYKFYEAANGTRDHKKG [z kmene ntHi-10567RM (Skupina 1)] s SEQ ID NO: 2

RSDYKLYNKNSSSNSTLKNLGE [z kmene ntHi-1715MEE (Skupina 2a)]

SEQ ID NO: 3 io RSDYKFYDNKRID [z kmene ntHi-1729MEE (Skupina 3)]

SEQ ID NO: 4

RSDYKLYNKNSSTLKDLGE [z kmene ntHi-183NP (Skupina 2b)]

SEQ ID NO: 5

RSDYKFYEDANGTRDHKKG [z kmene ntHi-1128 (Skupina 1)]

SEQ ID NO: 6

RSDYKFYEAPNSTRDXKKG [z proteinu P5 z ntHi, zbytky 119-137 (Skupina 1)]

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Peptid obsahující jednu nebo více aminokyselinových sekvencí

5 vybraných ze skupiny sestávající z:

SEQ ID NO: 1

SEQ ID NO: 2

SEQ ID NO: 3, a

SEQ ID NO: 4 io nebo jakékoli antigenně příbuzné varianty těchto uvedených sekvencí, které vykazují alespoň 75% identitu s odpovídající antigenní determinantou fimbrinového proteinu podobného P5 z netypovatelného Haemophilus influenzae, a jsou schopné ji imunologicky napodobovat, s výhradou, že antigenně příbuzné

15 varianty nazahrnují peptidy uvedené v SEQ ID NO: 5 nebo SEQ ID NO: 6.
2. Peptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1.
3. Peptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 2.
4. Peptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci

SEQ ID NO: 3.

- 56 5. Peptid podle nároku 1, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci

SEQ ID NO; 4.

• MM · 9 ·*· 9 9

9 9 9 99 9 9 9 9

9 9·· 99 9 99

9 9 9 9 9 9999

6. Chimémí polypeptid obsahující jeden nebo více peptidů podle 5 nároků 1-5 kovalentně spojených s nosičovým polypeptidem, který obsahuje alespoň jeden epitop rozpoznatelný buňkami T.

t. unimérní poiypeptia poaie nároku 6, který obsahuje také peptidovou sekvenci usnadňující purifikaci.

8. Chimémí polypeptid podle nároku 7, kde peptidová sekvence usnadňující purifikaci je hexa-histidinová sekvence.

9. Chimémí polypeptid podle nároku 6, kde nosičový polypeptid je 15 lipoprotein D.

10. Chimémí polypeptid podle nároku . 6, kde aminokyselinové sekvence použitých peptidů jsou vybrány ze skupiny sestávající ze SEQ ID NO: 1, 2, a 3.

11. Chimémí polypeptid obsahující tři podjednotky LB1(f) a lipoprotein D, kde aminokyselinové sekvence použitých LB1(f) podjednotek jsou poskytnuty v SEQ ID NO: 2,3, a 5.

25 12. Chimémí polypeptid podle nároku 11, který obsahuje také histidinovou purifikační sekvenci.

- 57 • ···· ** ···· ·· • · · ·· · «·· • ··· · · « ♦ ♦

13. Chimérní polypeptid podle nároku 11, kde pořadí peptidových složek od N-konce polypeptidu je: lipoprotein D, LB1(f) podjednotka (SEQ ID NO: 2), LB1(f) podjednotka (SEQ ID NO: 5), a LB1(f) podjednotka (SEQ ID NO: 3).

14. Chimérní polypeptid podle nároku 13, kde aminokyselinová sekvence polypeptidu je poskytnuta na Obr. 5.

15. Vakcína, vyznačující se tím, že obsahuje io imunogenní množství alespoň jednoho peptidu nebo polypeptidu podle nároků 1-14 ve farmaceuticky přijatelném excipientu, a případné adjuvans.

16. Použití imunogenního množství alespoň jednoho peptidu nebo 15 polypeptidu podle nároků 1-14 ve farmaceuticky přijatelném excipientu, a případného adjuvans, k prevenci nebo léčení nemocí vyvolaných HaemophHus influenzae.

17. Použití podle nároku 16, kde nemoc vyvolaná HaemophHus 20 influenzae je otitis media, sinusitida, konjuktivitida, nebo infekce dolních cest dýchacích.

18. Způsob indukce imunitní odpovědi u savce náchylného k infekci HaemophHus influenzae, vyznačující se tím,že savci

25 se podává účinné množství vakcíny podle nároku 15.

Φ AAAA •« · • · ·· • A

A

A A

A

A

- 58 19. Způsob prevence infekce Haemophilus influenzae, vyznačující se tím.že savci se podává účinné množství vakcíny podle nároku 15.
5 20. DNA nebo RNA molekula kódující jeden z LB1 (f) peptidů nebo polypeptidů podle nároků 1-14.

Γ\ΜΛ DMA .Ixi

L/IN/Λ IICUU ΙΑΪΝΓΛ 111VI r\ U IO podle nároku 20, kde DNA sekvence zmíněného LB1 (f) polypeptidu je poskytnuta v Obr. 5.

22. DNA nebo RNA molekula podle nároku 20 nebo 21, obsažená v expresním vektoru, přičemž tento expresní vektor je schopen produkovat LB1 (f) peptid nebo polypeptid, je-li přítomen v kompatibilní hostitelské buňce.

23. Hostitelská buňka obsahující expresní vektor podle nároku 22.

24. Způsob produkce LB1(f) peptidu nebo polypeptidu, vyznačující se tím, že hostitelská buňka podle

20 nároků 23 se kultivuje za podmínek vhodných k produkci řečeného polypeptidu a LB1 (f) peptid nebo polypeptid se izolují.

25. Způsob produkce LB1 (f) peptidu nebo polypeptidu podle nároku 24, vyznačující se tím, že hostitelské buňky se lyžují

25 a rozpustný extrakt se purifikuje s použitím chromatografie na sloupci s imobilizovaným niklem, na sloupci s kationtovým iontoměničem a na sloupci pro gelovou filtraci.

«φφφ φφφ «· φφφφ • φ • .φ • φ φ

26. Způsob produkce hostitelské buňky, jež produkuje LB1(f) peptid nebo jeho polypeptid, vyznačující se tím, ž e hostitelská buňka se transformuje nebo transfekuje expresním vektorem podle nároku 22 tak, aby za vhodných kultivačních podmínek tato hostitelská buňka exprimovala LB1(f) peptid nebo polypeptid.

27. Purifikovaná protilátka imunospecifická pro peptid podle nároků 1-5.

28. Purifikovaná protilátka imunospecifická pro chimérní polypeptid podle nároků 6-14.

29. Způsob detekce přítomnosti Haemophilus influenzae ve vzorku, vyznačující setím, že se tento vzorek uvede do kontaktu s protilátkou podle nároku 27 v přítomnosti indikátoru.

30. Způsob detekce přítomnosti Haemophilus influenzae ve vzorku, vyznačujícíse tím, že se tento vzorek uvede do kontaktu s DNA sondou nebo primerem navrženými tak, aby odpovídaly nukleotidové sekvenci divokého typu, která kóduje LB1 (f) peptid fimbrinového proteinu podobného P5 z Haemophilus influenzae, přičemž sonda je vybrána ze skupiny sestávající z genových sekvencí uvedených v Tabulkách 6-8.

31. Diagnostická souprava k určení infekce Haemophilus influenzae u savců, vyznačující se tím, že obsahuje DNA sondy podle nároku 30, nebo LB1(f) peptid podle nároku 1-5, nebo protilátku podle nároku 27.