ES2231792T3 - Fragmento antigenico del gen taga y procedimiento para detectar una predisposicion a las ulceras gastroduodenales y a los carcinomas gastricos. - Google Patents

Fragmento antigenico del gen taga y procedimiento para detectar una predisposicion a las ulceras gastroduodenales y a los carcinomas gastricos.

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Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA UN ACIDO NUCLEICO AISLADO, QUE CODIFICA PARA UN ANTIGENO DE HELICOBACTER PILORII, DE APROX. 120-128 KILODALTON, O UN FRAGMENTO ANTIGENICO DEL MISMO, ESTANDO DICHO ANTIGENO ASOCIADO CON LA ULCERA PEPTICA. LA INVENCION PROPORCIONA ASIMISMO METODOS PARA DETECTAR EN UN SUJETO LA PRESENCIA DE UNA CEPA DE HELICOBACTER PILORII, QUE CONTIENE EL ANTIGENO DE 120-128 KILODALTON. DICHOS METODOS COMPRENDEN LAS FASES DE: CONTACTAR UNA MUESTRA PROCEDENTE DEL SUJETO, QUE CONTIENE EL ANTICUERPO, CON UNA CANTIDAD DETECTABLE DEL ANTIGENO TAGA O EL POLIPEPTIDO ANTIGENICO DE LA PRESENTE INVENCION; Y DETECTAR EL PORCENTAJE DE UNION DEL ANTIGENO O EL FRAGMENTO DEL MISMO, Y EL ANTICUERPO. LA DETECCION DE UNA CEPA QUE EXPRESE EN ANTIGENO TAGA, ES UN INDICATIVO DE LA PREDISPOSICION A LA ULCERA PEPTICA Y AL CARCINOMA GASTRICO. SE PROPORCIONA ASIMISMO UN MUTANTE DE H. PILORII QUE NO EXPRESA UN ANTIGENO FUNCIONAL TAGA.

Description

Fragmento antigénico del gen tagA y procedimientos para detectar una predisposición a las úlceras gastroduodenales y a los carcinomas gástricos.
Antecedentes de la invención
Helicobacter pylori se reconoce en la actualidad como un patógeno importante en humanos porque la gastritis crónica que provoca es un factor de riesgo para el desarrollo de la úlcera péptica. También existe evidencia creciente de que la infección persistente con Helicobacter pylori constituye un factor de riesgo para el desarrollo de adenocarcinoma gástrico (1,2), en especial del estómago distal (3-5). La evidencia proviene principalmente de investigaciones epidemiológicas (6-9), incluyendo estudios de control de casos agrupados (4, 5, 10), y estudios moleculares y patológicos apoyan su verosimilitud biológica (11). Sin embargo, aunque esencialmente todas las personas infectadas desarrollan gastritis, las consecuencias clínicas de la infección por H. pylori sólo se reconocen en una minoría de personas. Además, mientras que la infección por H. pylori prevalece altamente en pacientes con cáncer gástrico, la mayoría de las personas infectadas por H. pylori nunca desarrollan estos neoplasmas (12). Así, es importante identificar otros factores que determinen de manera más precisa el riesgo entre personas infectadas por H. pylori.
Las cadenas de H. pylori son muy diversas (13-15) a nivel genético, pero también se conservan bien la mayoría de las características fenotípicas. Además, los individuos se pueden infectar con más de una cadena (4, 15). Así, es importante aislar características particulares de las cadenas de H. pylori que pueden afectar al riesgo de desarrollo de cáncer gástrico.
Se reconocen habitualmente dos excepciones a la homogeneidad fenotípica. Primero, alrededor del 50%-60% de cadenas de H. pylori producen una citotoxina vacuolizante in vitro (20, 39), y la producción de toxina se asocia con la úlcera péptica (40). Segundo, existe heterogeneidad en cuanto a que si se produce una proteína antigénica que migra a aproximadamente 120-128 kilodalton (kDa) al reducir dodecil sulfato sódico - electroforesis en gel de poliacrilamida [SDS-PAGE] (20). Medidas más recientes de esta proteína (a las que se hace referencia de manera intercambiable como TagA o CagA) han dado pesos moleculares tan altos como 140 kDa. Aunque la actividad tóxica está mediada por una proteína de 87 kDa (23, 41), la producción de toxina en sí misma se asocia con la presencia de la proteína antigénica de 120-128 kDa (20). Estudios previos han encontrado que alrededor del 60-80% de aislados de H. pylori expresan la proteína de 120-128 kDa (20, 42). La presencia de anticuerpos para la proteína de 120-128 kDa tanto en suero como en secreciones mucosas se asocia de manera notable con la presencia de úlcera péptica (18, 20).
Hasta ahora, se sabía poco sobre la asociación entre la producción de toxina, úlceras o carcinoma gástrico y el antígeno de 120-128 kDa. Esto se debe a la incapacidad previa para caracterizar más el antígeno de 120-128 kDa tras su visualización inicial.
En estudios previos, el antígeno de 120-128 kDa se visualizó mediante inmunotransferencia, pero prácticamente no se realizó ninguna otra caracterización (20). En contraste con la facilidad con la que se visualizó este antígeno mediante inmunotransferencia, la banda de 120-128 kDa no se ha visualizado fácilmente por otros procedimientos como la tinción con plata (Figura 2 en Cover y col., 1990 (20)). La explicación para este fenómeno es que este antígeno sólo está presente en cantidades mínimas, en relación con otras proteínas de H. pylori. Recientemente, Gerstenecker y col. (43) informaron sobre el aislamiento de una proteína de aproximadamente 120 kDa de H. pylori que reacciona con suero humano de control positivo. Sin embargo, no se ha realizado prácticamente ninguna caracterización (como secuenciación N-terminal) de este antígeno.
A pesar de la dificultad de purificación, la presente invención aporta la clonación y secuenciación de la secuencia del gen y del aminoácido deducido que codifica la proteína de 120-128 kDa. Estos datos se obtuvieron usando procedimientos alternativos que no requerían la purificación del antígeno de 120-128 kDa. La invención también aporta composiciones y procedimientos de diagnóstico, terapéuticos, y profilácticos.
Estudios con inmunotransferencia sugieren que personas infectadas con cadenas tagA^{+} tienen mayor grado de inflamación gástrica y daño en las células epiteliales que las personas de las que se han aislado cadenas tagA^{-} (18). Las personas infectadas con cadenas de H. pylori tagA^{+} tienen aumentada la expresión de IL-1\alpha, IL-1\beta, e IL-8 en biopsias gástricas en comparación con personas no infectadas, y pacientes infectados con cadenas tagA^{-} (19). Tanto la intensidad de la inflamación como el daño epitelial pueden estar involucrados en la patogénesis del cáncer gástrico (1). Así, existe la necesidad de examinar la importancia de cadenas tagA que expresan H. pylori en este contexto.
La invención afronta estas necesidades aportando un nuevo ensayo serológico basado en un fragmento recombinante de tagA, y un procedimiento para determinar la predisposición al cáncer gástrico.
Resumen de la invención
La presente invención aporta un ácido nucleico aislado que codifica un fragmento antigénico de Helicobacter pylori, en el que el antígeno se asocia con la úlcera péptica o el carcinoma gástrico, que está formado por los nucleótidos 1921 hasta 3648 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el listado de secuencias como SEC ID NO. 1. La presente invención también aporta procedimientos para detectar la presencia de una cadena de Helicobacter pylori que posee un antígeno de 120-128 kilodalton que comprende los nucleótidos 1921 hasta 3648 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el listado de secuencias como SEC ID NO. 1 en un sujeto, que comprende las etapas de poner en contacto una muestra del sujeto que contiene el anticuerpo con una cantidad detectable del fragmento antigénico de la presente invención y la detección de la reacción del fragmento y el anticuerpo.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra mapas físicos de los plásmidos pMC1, pMC2, y pMC3. La flecha grande debajo de pMC3 representa la situación del gen tagA y la dirección de transcripción determinadas por mutaciones de deleción e inmunotransferencia. Las flechas pequeñas representan la cadena y la cantidad de ADN secuenciado de fragmentos derivados de exonucleasa III. Sitios de división de endonucleasa de restricción; B, Bg1II; Ba, BamHI; E, EcoRI; H, HindIII; N, NdeI; S, SacI.
La Figura 2 muestra un mapa de restricción de pMC3: km usado en la construcción del mutante de H. pylori. El cassette km de pILL600 se ligó al sitio NdeI de pMC3 para crear pMC3:km. Las flechas representan marcos de lectura libre incluyendo el marco de lectura libre de tagA de 2577 pares de bases truncado. Los sitios de restricción son E, EcoRI; B, BgIII; H, HindIII; Ba, BamHI; N, NdeI; S, SacI; Sm, SmaI. PMC4 representa el EcoRI de 2,9 kb para el fragmento SacI de pMC3.
La Figura 3 muestra mapas físicos de los plásmidos pMC3, pYB2 y pUT2. La flecha grande debajo de pUT2 representa la situación del gen tagA y la dirección de la transcripción como determinan las mutaciones de deleción y la inmunotransferencia. Sitios de división de endonucleasa de restricción: B, BglII; Ba, BamHI; E, EcoRI; EV, EcoRV; H, HindIII; N, NdeI; S, SacI; X, XbaI.
La Figura 4 muestra mapas físicos de fragmentos de ADN de tagA que se usaron para realizar fusiones de genes superpuestos. Las flechas representan la dirección de transcripción. Se indica el tamaño de cada producto. Las zonas encuadradas claras representan aquellas zonas del gen que poseen regiones nucleótidas repetidas y que se han determinado para expresar epitopos inmunogénicos de esta proteína.
Descripción detallada de la invención Ácidos Nucleicos
La presente invención aporta un ácido nucleico aislado que codifica un fragmento antigénico de H. pylori, asociado con la úlcera péptica (TagA) que consiste de los nucleótidos 1921 hasta 3648 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el listado de secuencias como SEC ID NO. 1. Se entiende por "aislado" como suficientemente separado de otros ácidos nucleicos, proteínas y otros componentes celulares que se encuentran en el organismo que existe de forma natural para ser útil en un diagnóstico clínico u otro protocolo científico.
Una línea celular que contiene un plásmido que tiene el gen tagA completo está depositado en la Colección de Cultivos de Tipo Americano (1230 Parklawn Drive, Rockville MD 20852) según el Número de Solicitud ATCC No. 69273.
El ácido nucleico según la invención codifica un fragmento antigénico del antígeno de 120-128 kDa y es un fragmento recombinante (orv220) del gen tagA que está formado por los nucleótidos 1921 hasta 3648 de la SEC ID No:1. Este ácido nucleico específico se puede usar para detectar cadenas de H. pylori que expresan el antígeno de 120-128 kDa en procedimientos como la reacción polimerasa en cadena, reacción ligasa en cadena e hibridación. Alternativamente, el ácido nucleico puede estar en un vector en un huésped apropiado y se puede utilizar para producir un fragmento antigénico de TagA.
Como ejemplo comparativo, el experto en la técnica puede obtener ácidos nucleicos que codifican otros fragmentos antigénicos de TagA usando procedimientos rutinarios y una cantidad rutinaria de experimentación siguiendo los procedimientos descritos en la presente memoria descriptiva para obtener los ácidos nucleicos ejemplares. Otros procedimientos para obtener fragmentos de ácido nucleico de un ácido nucleico aislado conocido, como asimilados de restricción, se pueden aplicar a la secuencia codificadora mayor para obtener ácidos nucleicos que codifican otros fragmentos del antígeno. Los ácidos nucleicos así obtenidos se pueden examinar de manera rutinaria para su antigenicidad, especificidad, etc., según los ejemplos de la presente memoria descriptiva.
Los cambios en la secuencia de nucleótidos de los ácidos nucleicos ejemplares que codifican TagA o los fragmentos antigénicos del mismo también se contemplan como ejemplos comparativos siempre que se mantenga la antigenicidad del polipéptido codificado por el ácido nucleico. De la misma manera, los ácidos nucleicos usados como iniciadores o sondas pueden sufrir sustituciones en tanto en cuanto existan suficientes bases complementarias para la hibridación selectiva o específica (44).
Otro ejemplo comparativo del ácido nucleico que codifica el antígeno TagA es una secuencia codificadora alternativa para el antígeno, obtenida basándose en la degeneración del código genético. Al aportar una secuencia de aminoácidos del antígeno TagA (SEC ID NO:3), el experto en la técnica puede determinar la secuencia de nucleótidos que codifica el antígeno o un fragmento del antígeno, y puede generar el ácido nucleico usando las técnicas existentes.
Un ácido nucleico aislado que hibrida selectivamente con el ácido nucleico comprendiendo los nucleótidos 1072 hasta 4614 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el Listado de Secuencias como SEC ID NO:3 en condiciones de reacción en cadena de polimerasa también se contempla como ejemplo comparativo.
El término "selectivamente" como se usa en la presente memoria descriptiva se refiere a un ácido nucleico que hibridará en condiciones de PCR con el ácido nucleico de referencia en un nivel diferenciable de la hibridación de fondo o aleatoria, pero que también puede hibridar con otros ácidos nucleicos seleccionados a un nivel claramente diferenciable sobre hibridación de fondo o aleatoria.
El ácido nucleico que hibrida selectivamente puede ser complementario del ácido nucleico anterior. El grado de identidad de la secuencia y la longitud de las secuencias hibridantes se puede seleccionar basándose en el uso intencionado de la secuencia en particular. Si se usan como iniciadores, la invención aporta composiciones que incluyen al menos dos ácidos nucleicos que hibridan selectivamente con diferentes regiones como para amplificar una región deseada. En la presente memoria descriptiva se aportan condiciones PCR ejemplares, se conocen bien en la técnica, y las enseñan los proveedores de reactivos y aparatos PCR.
Como otro ejemplo comparativo, un ácido nucleico aislado que hibrida específicamente con el ácido nucleico que comprende los nucleótidos 1072 hasta 4614 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el Listado de Secuencias como SEC ID NO:3 en las condiciones de rigurosidad de 68ºC durante 16 horas en tampón conteniendo SSC 6X, dodecil sulfato sódico 0,5, solución Denhardt 5X, también se contempla con lavado a 60ºC en SSC 0,5X (Ejemplo 1, hibridación Southern).
También se aportan otros ejemplos comparativos de condiciones de hibridación. Las condiciones de hibridación específicas excluyen ácidos nucleicos que hibridan con ácidos nucleicos diferentes del ácido nucleico de referencia. Así, el ácido nucleico hibridante puede ser complementario de un segmento o del total del ácido nucleico mencionado anteriormente, o puede tener suficiente complementariedad con el segmento al cual se hibrida para prevenir que se una a otros ácidos nucleicos que aparecen de forma natural. Las secuencias a las que se hibridará el ácido nucleico se pueden seleccionar basándose en la secuencia de nucleótidos y en la utilidad de la secuencia en particular. Por ejemplo, los ácidos nucleicos que hibridan específicamente se pueden usar como sondas para detectar la presencia de un organismo que tiene el ácido nucleico al que se hibrida. Alternativamente, los ácidos nucleicos que hibridan pueden codificar los fragmentos de TagA que se aportan en la presente memoria descriptiva como ejemplos comparativos.
Como ejemplo comparativo también se aporta un ácido nucleico aislado que hibrida con el ácido nucleico que codifica el TagA de H. pylori en condiciones de rigurosidad y tiene al menos el 70% de complementariedad con el segmento y la cadena del ácido nucleico de la SEC ID NO:3 al que se hibrida. Los ácidos nucleicos que se hibridan pueden tener al menos el 70%, el 80%, el 85%, el 90%, el 95%, el 97%, el 98% y el 99% de complementariedad con el segmento y la cadena de la secuencia ejemplar a la que se hibrida. Los ácidos nucleicos pueden oscilar de al menos 18 a 4000 nucleótidos de longitud. Así, el ácido nucleico puede codificar TagA de otra cadena de tagA^{+}, o se puede usar como sonda o iniciador para detectar la presencia de tagA de H. pylori.
Se aportan ejemplos comparativos de estos ácidos nucleicos de H. pylori, de forma que el grado de complementariedad requerido para distinguir ácidos nucleicos que hibridan de forma específica de los que lo hacen de forma no específica en condiciones específicas se puede determinar claramente para cada ácido nucleico. Los ácidos nucleicos pueden ser de doble cadena o de cadena sencilla dependiendo en el uso intencionado (por ejemplo como secuencia codificadora o iniciador/sonda, respectivamente). También debería quedar claro que un ácido nucleico que hibrida de manera específica no hibridará con ácidos nucleicos que codifican proteínas no relacionadas.
Un experto en la técnica puede obtener con facilidad los ácidos nucleicos de los ejemplos comparativos usando procedimientos rutinarios para sintetizar un gen completo al igual que fragmentos de nuecleótidos más cortos. Por ejemplo, en la solicitud se aportan específicamente técnicas para obtener ácidos nucleicos como aquellos que aparecen en el Listado de Secuencias. Además, se aportan procedimientos adicionales en la técnica que se pueden usar sin modificación significativa. Ferretti y col. (75) y Wosnick y col. (76) muestran procedimientos rutinarios para sintetizar un gen de secuencia conocida. Más específicamente, Ferretti y col. enseñan la síntesis de un gen de rodopsina bovina sintética de 1057 pares de bases a partir de oligonucleótidos sintéticos. El gen sintetizado era fiel a la secuencia conocida (primera frase, página 603), demostrando la fiabilidad de este procedimiento de síntesis genética. Adicionalmente, Wosnick y col. enseñan la síntesis de un gen de la glutatión tranferasa del maíz (GST) usando un protocolo eficiente de reasociación/unión en una etapa. Esta técnica también produjo un gen sintético completo con el 100% de fidelidad, lo que demuestra la naturaleza rutinaria de este protocolo.
Antígeno
También se contemplan polipéptidos antigénicos purificados codificados por el ácido nucleico de la presente invención. Como se usa en la presente memoria descriptiva, "purificado" significa que el antígeno está suficientemente libre de contaminantes o componentes celulares con los que el antígeno normalmente aparece para distinguir el antígeno de los contaminantes o componentes. Así, el polipéptido antigénico purificado se separa suficientemente de contaminantes, de forma que se puede usar en un diagnóstico clínico u otro protocolo de laboratorio. También se hace referencia en la presente memoria descriptiva al fragmento antigénico purificado de la presente invención y otros ejemplos comparativos como "el antígeno", "el antígeno TagA" o "el antígeno cagA".
Como ejemplo comparativo, se codifica un polipéptido antigénico TagA (SEC ID NO. 4) de longitud total aproximada de 130 kDa mediante un marco de lectura libre de 3543 pares de bases dentro del inserto clonado de 4821 pares de bases, que consiste esencialmente de aminoácidos codificados por los nucleótidos 1072 hasta 4614 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el listado de secuencias como SEC ID NO. 3.
Como otro ejemplo comparativo, se codifica un fragmento antigénico de TagA de aproximadamente 96 kDa mediante un marco de lectura libre de 2577 pares de bases dentro del inserto clonado de 3648 pares de bases, que consiste esencialmente de aminoácidos codificados por los nucleótidos 1072 hasta 3648 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el listado de secuencias como SEC ID NO. 1.
El fragmento antigénico de TagA de la invención se codifica mediante un marco de lectura libre (orv220), que consiste esencialmente de los aminoácidos codificados por los nucleótidos 1921 hasta 3648 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el listado de secuencias como SEC ID NO. 1.
Se pueden seleccionar ejemplos comparativos de fragmentos antigénicos del antígeno TagA aplicando la técnica rutinaria de mapeo del epitopo a la proteína TagA para determinar las regiones de la proteína que contienen epitopos reactivos con anticuerpos séricos o capaces de permitir una respuesta inmune en un animal. Una vez seleccionado el epitopo, se puede sintetizar directamente un polipéptido antigénico que contiene el epitopo, o se puede producir de manera recombinante clonando ácidos nucleicos que codifican el polipéptido en un sistema de expresión, según los procedimientos estándares. De forma alternativa, como ejemplo comparativo se puede aislar un fragmento antigénico del antígeno a partir del antígeno completo o de un fragmento mayor mediante ruptura química o mecánica. Los fragmentos purificados así obtenidos se pueden probar para determinar su antigenicidad y especificidad mediante los procedimientos enseñados en la presente memoria descriptiva. Un fragmento antigénico se define como una secuencia de aminoácidos de al menos 5 aminoácidos consecutivos derivados de la secuencia de aminoácidos que reacciona con (se une a) un anticuerpo.
Una vez que se aporta la secuencia de aminoácidos del polipéptido antigénico, se pueden diseñar polipéptidos antigénicos como ejemplo comparativo que corresponden a secuencias de aminoácidos del antígeno nativo, pero con modificaciones en forma de sustituciones, inclusiones o deleciones de residuos de aminoácidos en particular en las secuencias derivadas. Las modificaciones pueden incluir la adhesión del antígeno a secuencias diseñadas para aportar alguna propiedad adicional, como la solubilidad. Las modificaciones pueden incluir otros aminoácidos que aportan alguna propiedad adicional, como el eliminar/añadir aminoácidos capaces de crear uniones disulfuro, incrementar la bio-longevidad, alterar la actividad enzimática, o alterar interacciones con acidez gástrica. En cualquier caso, el péptido debe poseer una propiedad bioreactiva, como antigenicidad, inmunogenicidad, especificidad, etc. Los polipéptidos así diseñados se pueden examinar para comprobar su antigenicidad, inmunogenicidad y especificidad mediante los procedimientos usados y descritos en la presente memoria descriptiva. Estos polipéptidos luego se pueden sintetizar, usando técnicas de síntesis peptídica estándares. Así, es posible la síntesis o purificación de una cantidad extremadamente grande de polipéptidos derivados de la secuencia ejemplar del antígeno TagA.
Determinación de la Inmunogenicidad
Los polipéptidos antigénicos purificados que son ejemplos comparativos se pueden examinar para determinar su inmunogenicidad y especificidad. Brevemente, se preparan varias concentraciones de un fragmento inmunogénicamente específico putativo y se administran a un animal y se determina la respuesta inmunológica (por ejemplo, la producción de anticuerpos o la inmunidad mediada por células) de un animal a cada concentración. Las cantidades de antígeno administradas dependen del sujeto, por ejemplo un humano o una cobaya, la condición del sujeto, por ejemplo un humano o una cobaya, la condición del sujeto, el tamaño del sujeto, etc. A partir de entonces se puede exponer el animal así inoculado con el antígeno a la bacteria para determinar el efecto de la vacuna del fragmento antigénico específico. La especificidad del fragmento se puede asegurar examinando sueros, otros fluidos o linfocitos del animal inoculado para ver la reacción cruzada con otras bacterias estrechamente relacionadas.
Vectores y Huéspedes
También se contempla un vector que comprende el ejemplo comparativo o el ácido nucleico de la invención. Un vector puede estar en un huésped apropiado para expresar los polipéptidos codificados por el ácido nucleico. Se aportan ejemplos específicos de vectores y huéspedes más adelante en los Ejemplos.
Un experto en la técnica conoce numerosos vectores de expresión de E. coli útiles para la expresión del antígeno. Otros huéspedes microbianos apropiados para su uso incluyen bacilos, como Bacillus subtilus, y otros Enterobacteriaceae, como Salmonella, Serratia, y varias especies de Pseudomonas. En estos huéspedes procariotas uno también puede crear vectores de expresión, que contendrán típicamente secuencias de control de expresión compatibles con la célula huésped (por ejemplo, un origen de replicación). Además, cualquier cantidad de una variedad de promotores bien conocidos estará presente, como el sistema promotor de la lactosa, un sistema promotor del triptófano (Trp), un sistema promotor de la beta-lactamasa, o un sistema promotor del fago lambda. Los promotores controlarán típicamente la expresión, de manera opcional con una secuencia operadora, y tendrán secuencias de sitio de unión de ribosomas por ejemplo, para iniciar y completar la transcripción y traducción. Si es necesario se puede aportar una metionina amino terminal mediante la inserción de un codón Met 5' y en marco con el antígeno. Además, la extensión carboxi-terminal del antígeno se puede eliminar usando procedimientos de mutagénesis de oligonucleótidos estándares.
Adicionalmente, se puede usar la expresión de levaduras. Existen varias ventajas con los sistemas de expresión de levaduras. Primero, existe evidencia de que las proteínas producidas en sistemas de secreción de levadura exhiben un emparejamiento disulfuro correcto. Segundo, la glicosilación post-traductora se lleva a cabo de manera eficiente en sistemas de secreción de levaduras. La región inicial del factor pre-pro-alfa de Saccharomyces cerevisiae (codificada por el gen MF\alpha-1) se usa de manera rutinaria para dirigir la secreción de proteínas de levaduras (45). La región inicial del factor pre-pro-alfa contiene un péptido señal y un pro-segmento que incluye una secuencia de reconocimiento para una proteasa de levadura codificada por el gen KEX2: esta enzima separa la proteína precursora en el lado carboxilo de una secuencia de señal de separación de un dipéptido Lis-Arg. La secuencia que codifica el antígeno se puede fusionar en marco a la región inicial del factor pre-pro-alfa. Esta construcción se pone luego bajo control de un promotor de transcripción fuerte, como el promotor de la alcohol deshidrogenasa I o un promotor glicolítico. La secuencia de codificación del antígeno va seguida de un codón de terminación de la traducción que va seguido de señales de terminación de la transcripción. Alternativamente, las secuencias codificadoras del antígeno se pueden fusionar a una segunda secuencia codificadora de proteína, como Sj26 o \beta-galactosidasa, usada para facilitar la purificación de la proteína de fusión mediante cromatografía de afinidad. La inserción de sitios de división de proteasa para separar los componentes de la proteína de fusión se puede aplicar a construcciones usadas para la expresión en levaduras.
Las células de mamíferos permiten la expresión de proteínas en un entorno que favorece modificaciones post-traductoras importantes como el plegado y emparejamiento de cisteína, adición de estructuras de hidrocarburos complejas, y secreción de proteína activa. Los vectores útiles para la expresión del antígeno en células de mamífero se caracterizan por la inserción de la secuencia codificadora del antígeno entre un promotor viral fuerte y una señal de poliadenilación. Los vectores pueden contener genes que confieren resistencia a gentamicina o a metotrexato para su uso como marcadores selectivos. El antígeno y la secuencia codificadora del fragmento inmunoreactivo se pueden introducir en una línea celular ovárica de un hamster de la China usando un vector que codifica la resistencia a metotrexato. Se puede confirmar la presencia del vector de ADN en células transformadas mediante análisis Southern y la producción de un ARN que corresponde a la secuencia codificadora de antígeno se puede confirmar mediante análisis Northern. Se han desarrollado en la técnica un grupo de otras líneas celulares huésped apropiadas capaces de secretar proteínas humanas intactas, e incluyen las líneas celulares CHO, células HeLa, líneas celulares de mieloma, células Jurkat, etc. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, como un origen de replicación, un promotor, un activador, y sitios de procesamiento de información necesarios, como sitios de unión de ribosomas, sitios de unión de ARN, sitios de poliadenilación, y secuencias terminadoras de transcripción. Las secuencias de control de expresión preferidas son promotores derivados de genes de inmunoglobulina, SV40, Adenovirus, Virus del Papiloma Bovino, etc. Los vectores que contienen los segmentos de ADN de interés se pueden transferir a la célula huésped mediante procedimientos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular. Por ejemplo, la transfección con cloruro cálcico se usa normalmente para células procariotas, mientras que el tratamiento con fosfato cálcico o electroporación se puede usar para otros huéspedes celulares.
Se pueden usar vectores alternativos para la expresión del antígeno en células de mamífero, aquellos similares a los desarrollados para la expresión del interferón gamma humano, activador del plasminógeno de tejidos, Factor VIII de coagulación, antígeno de superficie del virus de la hepatitis B, Nexinl proteasa, y proteína básica principal de eosinófilo. Además, el vector puede incluir secuencias promotoras de CMV y una señal de poliadenilación disponible para la expresión de ADN insertados en células de mamíferos (como COS7).
Las secuencias de ADN se pueden expresar en huéspedes después de que las secuencias se hayan unido de forma operativa a, esto es, se hayan posicionado para asegurar el funcionamiento de, una secuencia de control de expresión. Estos vectores de expresión se replican típicamente en los organismos huésped bien como episomas o bien como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión pueden contener marcadores de selección, por ejemplo, resistencia a tetraciclina o resistencia a higromicina, para permitir la detección y/o selección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas (véase, por ejemplo, patente U.S. 4.704.362).
Los polinucleótidos que codifican un polipéptido alternativo pueden incluir secuencias que facilitan la transcripción (secuencias de expresión) y traducción de las secuencias codificadoras de forma que se produce el producto polipeptídico codificado. La construcción de dichos polinucleótidos se conoce bien en la técnica. Por ejemplo, dichos polinucleótidos pueden incluir un promotor, un sitio de terminación de la transcripción (sitio de poliadenilación en huéspedes de expresión eucariota), un sitio de unión de ribosomas, y, opcionalmente, un activador para su uso en huéspedes de expresión eucariota, y, opcionalmente, secuencias necesarias para la replicación de un
vector.
Anticuerpos Purificados
También se contempla un anticuerpo monoclonal purificado que une específicamente el fragmento antigénico de la invención. El anticuerpo puede unir de manera específica un epitopo único del antígeno y también puede unir epitopos de otros organismos. El término "unir" significa la unión antígeno/anticuerpo bien entendida al igual que otra asociación no aleatoria con un antígeno. "Unir específicamente" como se usa en la presente memoria descriptiva describe un anticuerpo u otro ligando que no reacciona de manera cruzada sustancialmente con ningún antígeno que no sea el especificado, en este caso, el antígeno TagA. Los anticuerpos se pueden hacer como se describe en los Ejemplos (véase también, Harlow y Lane (46)). Brevemente, el antígeno purificado se puede inyectar a un animal en una cantidad y a intervalos suficientes para permitir una respuesta inmune. Los anticuerpos policlonales se pueden purificar directamente, o se pueden fusionar células de bazo del animal con una línea celular inmortal y examinar la secreción de anticuerpo monoclonal. Así, los anticuerpos policlonales no humanos que unen específicamente el antígeno están dentro del ámbito de la presente invención.
También se contempla un ligando que une específicamente el fragmento antigénico de la invención. El ligando puede ser un fragmento de un anticuerpo o una molécula más pequeña diseñada para unir un epitopo del antígeno TagA. El anticuerpo o el ligando se puede unir a un sustrato o se puede marcar con una mitad detectable o tanto unir como marcar. Las mitades detectables contempladas con la composición de la presente invención son aquellas enumeradas más adelante en la descripción de los procedimientos de diagnóstico, incluyendo marcadores fluorescentes, enzimáticos y radioactivos.
Antígeno Unido a Sustrato
También se aporta como ejemplo comparativo un antígeno TagA purificado unido a un sustrato. El antígeno también se puede unir a un anticuerpo monoclonal obtenido por procedimientos estándares y como se describe en la presente memoria descriptiva.
Procedimientos de Detección (Diagnóstico) Serológica Detección del Anticuerpo con Antígeno
La presente invención aporta un procedimiento para detectar la presencia de una cadena de H. pylori que posee el antígeno de 120-128 kDa en un sujeto, comprendiendo las etapas de poner en contacto una muestra que contiene el anticuerpo del sujeto con una cantidad detectable del fragmento antigénico de la presente invención y detectar la reacción de unión del fragmento antigénico y el anticuerpo producido por el sujeto, indicando la unión la presencia de la cadena de H. pylori tóxica o infección previa con la cadena de H. pylori tóxica. Existen numerosos ensayos inmunológicos rutinarios que se pueden usar en los procedimientos actuales de detección y predisposición.
Se aportan ejemplos a continuación.
Detección del Antígeno con Anticuerpo/Ligando
Un ejemplo del procedimiento de detección de H. pylori que posee el antígeno se realiza contactando una muestra de fluido o tejido del sujeto con una cantidad de un anticuerpo purificado específicamente reactivo con el antígeno, y detectando la unión del anticuerpo con el antígeno. Se contempla que el antígeno estará en células intactas que contienen el antígeno, o serán fragmentos del antígeno. Como se contempla en la presente memoria descriptiva, el anticuerpo incluye cualquier ligando que une el antígeno, por ejemplo, un anticuerpo intacto, un fragmento de un anticuerpo u otro reactivo que tiene reactividad con el antígeno. La muestra fluida de este procedimiento puede comprender cualquier fluido corporal que pudiera contener el antígeno o una célula conteniendo el antígeno, como sangre, plasma, suero, saliva u orina. Otros posibles ejemplos de fluidos corporales incluyen esputo, moco, jugo gástrico y otros.
Elisa
Los inmunoensayos como los ensayos inmunofluorescentes (IFA), ensayos con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA) e inmunotransferencia se pueden adaptar fácilmente para conseguir la detección del antígeno. Un procedimiento ELISA efectivo para la detección del antígeno puede tener lugar, por ejemplo, de la siguiente manera: (1) se une el anticuerpo a un sustrato; (2) se contacta el anticuerpo unido con una muestra de fluido o tejido que contiene el antígeno; (3) se contacta el anterior con un anticuerpo secundario unido a una mitad detectable (por ejemplo, enzima peroxidasa de rábano picante o enzima fosfatasa alcalina); (4) se contacta el anterior con el sustrato para la enzima; (5) se contacta el anterior con un reactivo de color; (6) se observa el cambio de color. El procedimiento anterior se puede modificar fácilmente para detectar anticuerpo al igual que antígeno.
Ensayo de Inhibición Competitiva
Otra técnica inmunológica que puede ser útil en la detección de H. pylori que expresa tagA o infección por H. pylori previa usa anticuerpos monoclonales (Mabs) para la detección de anticuerpos específicamente reactivos con el antígeno TagA. Brevemente, se hace reaccionar sueros u otros fluidos corporales del sujeto con el antígeno unido a un sustrato (por ejemplo, una placa de 96 pozos ELISA). El exceso de suero se lava a fondo. Luego se hace reaccionar un anticuerpo monoclonal marcado (unido a enzima, fluorescente, radioactivo, etc.) con el complejo antígeno - anticuerpo sérico anteriormente reaccionado. La cantidad de inhibición de la unión de anticuerpo monoclonal se mide en relación con un control (no anticuerpo sérico de paciente). El grado de inhibición de anticuerpo monoclonal es una prueba muy específica para una variedad o cadena particular ya que se basa en la especificidad de unión del anticuerpo monoclonal. Los Mabs también se pueden usar para la detección directa en células mediante IFA.
Ensayo de Micro-Aglutinación
También se puede usar una prueba de micro-aglutinación para detectar la presencia de una cadena de H. pylori que posee TagA en un sujeto. Brevemente, se recubren bolitas de látex (o glóbulos rojos sanguíneos) con el antígeno y se mezcla con una muestra del sujeto, tal que los anticuerpos en el tejido o en los fluidos corporales que son específicamente reactivos con el antígeno se unen de manera cruzada con el antígeno, causando aglutinación. Los complejos antígeno-anticuerpo aglutinados forman un precipitado, visible a simple vista o con espectrofotómetro. En una modificación de la prueba anterior, los anticuerpos específicamente reactivos con el antígeno se pueden unir a las bolitas y detectarse por lo tanto el antígeno en el tejido o fluido corporal.
Ensayo de Fase Doble/Citometría de Flujo/Inmunoprecipitación
Además, como en un ensayo de fase doble típico, el anticuerpo se puede unir a un sustrato y reaccionar con el antígeno. A partir de entonces, un anticuerpo marcado secundario se une a epitopos no reconocidos por el primer anticuerpo y se detecta el anticuerpo secundario. Ya que la presente invención aporta un antígeno TagA para la detección de H. pylori tóxico o infección por H. pylori previa también se pueden usar otros procedimientos serológicos como la citometría de flujo y la inmunoprecipitación como procedimientos de detección.
En los procedimientos de diagnóstico que se enseñan en la presente memoria descriptiva, el antígeno se puede unir a un sustrato y poner en contacto con una muestra de fluido como suero, orina, saliva o jugo gástrico. Esta muestra se puede tomar directamente del paciente o en una forma parcialmente purificada. De esta manera, los anticuerpos específicos para el antígeno (el anticuerpo primario) reaccionarán de manera específica con el antígeno unido. A partir de entonces, un anticuerpo secundario unido a, o marcado con, una mitad detectable se puede añadir para activar la detección del anticuerpo primario. Generalmente, el anticuerpo secundario u otro ligando que sea reactivo, bien específicamente con un epitopo diferente del antígeno o no específicamente con el ligando o anticuerpo reaccionado, se seleccionará por su capacidad para reaccionar con múltiples sitios en el anticuerpo primario. Así, por ejemplo, varias moléculas del anticuerpo secundario pueden reaccionar con cada anticuerpo primario, haciendo que el anticuerpo primario sea más detectable.
Mitades Detectables
La mitad detectable permitirá la detección visual de un precipitado o un cambio de color, la detección visual con microscopio, o la detección automática mediante espectrometría, medición radiométrica u otros. Los ejemplos de mitades detectables incluyen fluoresceína y rodamina (para microscopía fluorescente), peroxidasa de rábano picante (para microscopía de luz o electrón y detección bioquímica), biotina-estreptavidina (para microscopía de luz o electrón), fosfatasa alcalina (para detección bioquímica por cambio de color) y radioisótopos (para radiografía). Los procedimientos y mitades de detección usados se pueden seleccionar, por ejemplo, de la lista anterior u otros ejemplos apropiados por los criterios estándares aplicados a dichas selecciones (46).
Detección de Enfermedad o Predisposición a la Enfermedad Úlcera Péptica
Debido a que el fragmento antigénico según la invención se asocia con la úlcera péptica, la presente invención también aporta un procedimiento para determinar la predisposición a la úlcera péptica en un sujeto. El procedimiento se puede conseguir según los procedimientos establecidos anteriormente para la detección de H. pylori que expresa el antígeno TagA o para la detección de anticuerpos específicos para el antígeno TagA. La presencia del antígeno TagA o anticuerpos específicos para TagA indica una predisposición del sujeto a la úlcera péptica. También se pueden usar los procedimientos descritos a continuación para detectar ácidos nucleicos específicos para cadenas tagA^{+}.
Carcinoma Gástrico
Debido a que el polipéptido purificado según la invención se asocia con el cáncer gástrico, la presente invención también aporta un procedimiento para determinar la predisposición de un sujeto al carcinoma gástrico. El procedimiento se puede conseguir según los procedimientos establecidos anteriormente para detectar cadenas de H. pylori tagA^{+} o para la detección de anticuerpos específicos para el antígeno TagA. La presencia del antígeno TagA o anticuerpos específicos TagA indica una predisposición del sujeto al carcinoma gástrico. El ejemplo 4 aporta datos humanos acreditativos y un ejemplo de un protocolo específico para practicar este procedimiento. También se pueden usar los procedimientos descritos a continuación para detectar ácidos nucleicos específicos para cadenas tagA^{+}.
Procedimientos de Tratamiento
Se aportan procedimientos para tratar úlceras pépticas en un sujeto usando las composiciones de la presente invención como ejemplos comparativos. Por ejemplo, en uno de dichos procedimientos se administra al sujeto una cantidad de ligando (por ejemplo, anticuerpo o fragmento de anticuerpo) específicamente reactivo con el antígeno de aproximadamente 120-128 kDa de H. pylori suficiente para unir el antígeno en el sujeto y mejorar la condición clínica del sujeto. Dicha mejoría resulta de la interferencia del ligando con la función normal del antígeno al inducir inflamación y daño celular. El ligando puede ser un anticuerpo monoclonal purificado específicamente reactivo con el antígeno, un anticuerpo policlonal purificado derivado de un animal no humano, u otro reactivo que tiene reactividad específica con el antígeno. Además, se pueden conjugar mitades citotóxicas con el ligando/anticuerpo mediante procedimientos estándares. Ejemplos de mitades citotóxicas incluyen cadena A de ricino, toxina diftérica e isótopos
radioactivos.
Otro procedimiento de ejemplo comparativo para tratar la úlcera péptica en un sujeto comprende la administración al sujeto de una cantidad de ligando/antagonista para un receptor para el antígeno de 120-128 kDa de H. pylori suficiente para reaccionar con el receptor y prevenir la unión del antígeno de 120-128 kDa al receptor. Así se contempla un antagonista para el receptor. El resultado es una mejoría en la condición clínica del sujeto. Alternativamente, el procedimiento de tratamiento puede incluir la administración al sujeto de una cantidad de un análogo de un receptor TagA que resulte en la unión competitiva del antígeno TagA, inhibiendo así la unión del antígeno TagA y su receptor de tipo salvaje. El receptor se localiza en células presentes en la mucosa gastroduodenal, como células epiteliales, células inflamatorias, o células endoteliales.
Ya que se muestra que la expresión de TagA se asocia con el carcinoma gástrico, los procedimientos de tratamiento de ejemplo comparativo anteriores se pueden aplicar al tratamiento o prevención del carcinoma gástrico.
Organismo Mutante
También se contempla como ejemplo comparativo un H. pylori mutante en el que el producto del gen tagA se muestra no funcional. El mutante puede no expresar tagA o expresar un ejemplo de TagA que no funciona. En un ejemplo, la cadena de H. pylori mutante se obtiene haciendo una mutación de sustitución en la secuencia codificadora para el antígeno TagA como se describe en el Ejemplo 2. Un ejemplo de la cadena de H. pylori mutante de la presente invención se denomina 84-183:M22 y está depositada con la Colección de Cultivos de Tipo Americano (1230 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852) con el Número de Solicitud ATCC 55359.
Se pueden preparar mutantes isogénicos comparativos adicionales, por ejemplo, insertando un ácido nucleico en el gen tagA o eliminando una porción del gen tagA para hacer que el gen sea no funcional o que se produzca en tan baja cantidad que el organismo sea no-infeccioso. También se pueden realizar mutaciones puntuales específicas con el efecto deseado. Se pueden realizar las mutaciones de deleción, inserción o sustitución en la secuencia genética en la región reguladora o codificadora para prevenir la transcripción o para hacer que el producto transcrito sea no funcional.
Tal enfoque de la construcción de un mutante de deleción o inserción se realiza mediante el procedimiento Donnenberg (47). Se realiza una deleción en tagA eliminando el fragmento BamH1-NdeI de 0,2 kb y reuniendo el clon tagA. Este mutante se clona en el vector suicidio pILL570. El gen sacB de Bacillus subtilis también se clona en el vector suicidio para aportar un fenotipo condicionalmente letal. Esta construcción se transforma en H. pylori mediante electroporación, y los transformantes se seleccionan mediante resistencia a espectinomicina. La cadena de merodiploide que contiene el vector suicidio y la versión mutada del gen tagA se exponen a sacarosa para seleccionar directamente organismos que han sufrido una segunda recombinación, resultando en la pérdida del vector. Estos y otros procedimientos bien conocidos de realizar mutaciones se pueden aplicar a los ácidos nucleicos aportados en la presente memoria descriptiva para obtener otras mutaciones deseadas.
También se contemplan como ejemplos comparativos los mutantes no-isogénicos. Por ejemplo, se contempla un H. pylori atenuado vivo que también es un mutante tagA para la presente invención. Por ejemplo, se construye una cadena mutante tagA^{-}recA^{-} mediante mutación de inserción de ambos genes tagA y recA, según los procedimientos que se enseñan en la presente memoria descriptiva y que se enseñan en la U.S. No. 08/215.928 para recA. Por ejemplo, se construye una cadena mutante tagA^{-}recA^{-} mediante mutación de inserción de ambos genes tagA y vacA, según los procedimientos que se enseñan en la presente memoria descriptiva para tagA y en la solicitud U.S. No. 08/215.928, que describe la generación de un mutante vacA. Por ejemplo, se construye una cadena mutante recA^{-}tagA^{-}vacA^{-} mediante mutación de inserción de los genes recA, tagA y vacA, según los procedimientos que se enseñan en la presente memoria descriptiva para recA y vacA, y que se enseñan en U.S. No. 08/215.928. Se puede usar cualquiera de los procedimientos bien conocidos de mutar un gen para generar cadenas mutantes de H. pylori. Las cadenas se pueden examinar igual que para inmunogenicidad.
Vacunas
El fragmento antigénico de esta invención se puede usar en la construcción de una vacuna que comprende una cantidad inmunogénica del fragmento antigénico y un vehículo farmacéuticamente aceptable. La vacuna puede ser el fragmento antigénico en una cadena de H. pylori, E.coli u otra. Luego se puede usar la vacuna en un procedimiento para prevenir la úlcera péptica u otras complicaciones de la infección por H. pylori (incluyendo la gastritis atrófica y los neoplasmas malignos en el estómago).
Se pueden determinar cantidades inmunogénicas del antígeno usando procedimientos estándares. Brevemente, se preparan varias concentraciones de un epitopo inmunoreactivo específico putativo, se administran a un animal y se determina la respuesta inmunológica (por ejemplo, la producción de anticuerpos) de un animal a cada concentración.
El vehículo farmacéuticamente aceptable en la vacuna de la presente invención puede comprender vehículos aceptables salinos u otros (48). Un coadyuvante también puede formar parte del vehículo de la vacuna, en cuyo caso se puede seleccionar mediante criterios estándares basados en el antígeno usado, el modo de administración y el sujeto (48). Los procedimientos de administración pueden ser por medios orales o sublinguales, o mediante inyección, dependiendo de la vacuna usada en particular y el sujeto al que se le administra.
De lo anterior se puede apreciar que la vacuna se puede usar como modalidad profiláctica o terapéutica.
Procedimientos de Detección (Diagnóstico) de ácidos nucleicos
También se puede determinar la presencia del antígeno TagA y de H. pylori que posee el antígeno TagA detectando la presencia del ácido nucleico según la invención.
El ácido nucleico de la invención se puede detectar usando una técnica de amplificación de ácidos nucleicos, como la reacción en cadena de la polimerasa o la reacción en cadena de la ligasa. Alternativamente, el ácido nucleico se detecta usando la hibridación directa o usando un polimorfismo de longitud de fragmento de restricción. Además, se pueden usar iniciadores PCR que hibridan sólo con ácidos nucleicos según la invención. La presencia de amplificación indica la presencia de antígeno. En otra realización se puede secuenciar directamente un fragmento de restricción de una muestra de ADN usando, por ejemplo, secuenciación Sanger ddNTp o 7-desaza-2'-desoxiguanosina 5'-trifosfato y Taq polimerasa y comparando con la secuencia única conocida para detectar H. pylori. La presencia de H. pylori conteniendo tagA^{-} se puede detectar mediante amplificación selectiva mediante los procedimientos descritos anteriormente.
También se puede detectar H. pylori hibridando directamente el ácido nucleico según la invención con una sonda de ácido nucleico específica. Además, la secuencia de nucleótidos se podría amplificar antes de la hibridación mediante los procedimientos descritos anteriormente.
Los procedimientos para detectar ácidos nucleicos según la invención son estándares en la técnica. Como ejemplo comparativo, la detección de mutaciones puntuales o secuencias variables usando sondeo directo implica el uso de sondas de oligonucleótidos que se pueden preparar, por ejemplo, sintéticamente o mediante traducción por muescas. Las sondas se pueden marcar adecuadamente usando, por ejemplo, marcado con radio, marcado enzimático, marcado fluorescente, marcado con biotina-avidina y otros para la visualización subsecuente en el ejemplo de procedimiento de hibridación por borrones de Southern. La sonda marcada reacciona con una muestra de ADN unida, por ejemplo, a una lámina de nitrocelulosa en tales condiciones que sólo hibridan secuencias totalmente complementarias. Las áreas que portan secuencias de ADN complementarias a la sonda de ADN marcada se convierten en marcadas ellas mismas como consecuencia de la reacción de reasociación. Las áreas del filtro que exhiben dicho marcado se pueden entonces visualizar, por ejemplo, mediante autorradiografía. La sonda marcada reacciona con una muestra de ADN unida a, por ejemplo, nitrocelulosa en condiciones tales que sólo hibridarán secuencias totalmente complementarias. La rigurosidad de hibridación es usualmente 5ºC por debajo de Ti (la temperatura de fusión irreversible del híbrido formado entre la sonda y su secuencia objetivo) para la longitud de cadena dada. Para 20meros la temperatura de hibridación recomendada es de alrededor de 58ºC. Las temperaturas de lavado son únicas para la secuencia que se investiga y tienen que optimizarse para cada variante.
Las técnicas de sondeo como ejemplo comparativo alternativas, como la reacción en cadena de la ligasa (LCR), implican el uso de sondas dispares, esto es, sondas que son totalmente complementarias con el objetivo excepto en el punto de mutación. Luego se permite que la secuencia objetivo hibride ambas con oligonucleótidos que son totalmente complementarios y tienen oligonucleótidos que contienen una disparidad, en condiciones que distinguirán entre las dos. Manipulando las condiciones de reacción, es posible obtener hibridación sólo donde existe complementariedad total. Si existe una disparidad la hibridación se reduce significativamente.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica que amplifica secuencias de ADN específicas con eficacia notable. Los ciclos repetidos de desnaturalización, reasociación del iniciador y extensión llevada a cabo sin polimerasa, por ejemplo, una Taq polimerasa enzimática estable al calor, lleva a incrementos exponenciales en la concentración de las secuencias de ADN deseadas. Dado un conocimiento de la secuencia de nucleótidos de una mutación, se pueden preparar oligonucleótidos sintéticos que son complementarios a secuencias que flanquean el ADN de interés. Cada oligonucleótido es complementario a una de las dos cadenas. El ADN se puede desnaturalizar a temperatura elevada (por ejemplo, 95ºC) y luego se reasocia en presencia de un gran exceso molar de oligonucleótidos. Los oligonucleótidos, orientados con sus extremos 3' apuntando uno hacia otro, hibridan a cadenas opuestas de la secuencia objetivo y la extensión enzimática primaria a lo largo del patrón del ácido nucleico en presencia de los cuatro desoxiribonucleótido trifosfatos. Luego se desnaturaliza el producto final otra vez para otro ciclo. Después de que este ciclo de tres etapas se repita varias veces, se puede conseguir la amplificación de un segmento de ADN en más de un millón de veces. Luego se puede secuenciar directamente el ADN resultante para localizar cualquier alteración genética. Alternativamente, sería posible preparar oligonucleótidos que sólo se unirían a ADN alterado, de forma que el PCR sólo resultaría en la multiplicación del ADN si hay una mutación. Después de PCR, se puede usar visualización directa o hibridación oligonucleótida alelo específica para detectar una enfermedad asociada con un punto de mutación. Alternativamente, se puede usar una adaptación de PCR llamada amplificación de alelos específicos (PASA); ésta usa amplificación diferencial para una distinción rápida y fiable entre alelos que difieren en un único par de bases. También se pueden usar otras técnicas, como 3SR, que usa ARN polimerasa para conseguir un número elevado de copias, donde sea apropiado.
Aún en otro procedimiento, PCR puede ir seguido por digestión con endonucleasa de restricción con análisis subsecuente de los productos resultantes. Las sustituciones de nucleótidos pueden resultar en la ganancia o pérdida de sitio endonucleasa de restricción específico. La ganancia o pérdida de un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción facilita la detección de la mutación asociada a enfermedad usando el análisis de polimorfismo de longitud del fragmento de restricción (RFLP) o mediante detección de la presencia o ausencia de un sitio de endonucleasa de restricción polimórfico en un producto PCR que abarca la secuencia de interés.
Como otro ejemplo comparativo, para el análisis RFLP, se obtiene ADN, por ejemplo, de la sangre, espécimen gástrico, saliva, placa dental, otros fluidos corporales o deposiciones del sujeto sospechoso de contener H. pylori conteniendo tagA, o H. pylori aislada del sujeto, y de un sujeto infectado con H. pylori no tóxica, se digiere con una endonucleasa de restricción, y se separa subsecuentemente en base al tamaño mediante electroforesis en gel de agarosa. Luego se puede usar la técnica de borrones de Southern para detectar, mediante hibridación con sondas marcadas, los productos de digestión endonucleasa. Luego se pueden comparar los modelos obtenidos de los borrones de Southern. Usando tal enfoque, se detecta el ADN de tagA determinando el número de bandas detectadas y comparando este número con el ADN de cadenas de H. pylori que no se asocian con enfermedad grave. También se pueden usar endonucleasas de restricción efectivamente para detectar mutaciones en el gen tagA.
Se puede calcular fácilmente la creación similar de sitios de restricción adicionales mediante sustituciones de nucleótidos en los sitios de mutación desvelados mediante referencia al código genético y una lista de secuencias de nucleótidos reconocida por endonucleasas de restricción.
El análisis conformacional de cadena sencilla (SSCA) ofrece un procedimiento relativamente rápido para detectar cambios en la secuencia que pueden ser apropiados en al menos algunos casos.
En general, los iniciadores de PCR y LCR suelen tener una longitud de 20 pares de bases y el intervalo preferente está en 15-25 pares de bases. Se obtiene mejor amplificación cuando ambos iniciadores tienen la misma longitud y más o menos la misma composición de nucleótidos. Las condiciones de PCR pueden incluir desnaturalización de cadenas que normalmente tiene lugar a 94ºC y la extensión de los iniciadores es usualmente a 72ºC. La temperatura de reasociación varía según la secuencia que se investiga. Ejemplos de tiempos de reacción son: desnaturalización 20 min; 35 ciclos de 2 min, 1 min, 1 min para reasociación, extensión y desnaturalización; y finalmente una etapa de extensión de 5 min.
La amplificación PCR de alelos específicos (PASA) es un procedimiento rápido para detectar mutaciones de base única o polimorfismos. PASA (también conocida como amplificación específica de alelo) implica la amplificación con dos iniciadores de oligonucleótidos tales que uno es específico de alelo. El alelo deseado se amplifica eficientemente, mientras que el(los) otro(s) alelo(s) se amplifica(n) escasamente porque no encajan con una base en o cerca del extremo 3' del iniciador específico de alelo. Así, PASA o el procedimiento relacionado de PAMSA se puede usar para amplificar específicamente las secuencias de mutación de la invención. Donde se realiza dicha amplificación en aislados de H. pylori o muestras obtenidas de un individuo, puede servir como procedimiento para detectar la presencia de mutaciones.
Como se menciona anteriormente, se puede usar un procedimiento conocido como reacción en cadena de la ligasa (LCR) para detectar con éxito una sustitución de base única. Las sondas de LCR se pueden combinar o multiplexar para examinarlas simultáneamente para diferentes mutaciones. Así, LCR puede ser particularmente útil donde, como aquí, son previsibles múltiples mutaciones de la misma enfermedad.
Kit para detectar antígeno
Se aporta como ejemplo comparativo un kit de diagnosis de infección por cadenas de H. pylori que poseen el antígeno TagA. En particular, el kit puede detectar la presencia del antígeno TagA específicamente reactivo con un anticuerpo o un fragmento inmunoreactivo del mismo. El kit puede incluir un anticuerpo unido a un sustrato, un anticuerpo secundario reactivo con el antígeno y un reactivo para detectar la unión del anticuerpo secundario al antígeno. Dicho kit puede ser un kit ELISA y puede comprender el sustrato, anticuerpos primarios y secundarios cuando sea adecuado, y cualquier otro reactivo necesario como mitades detectables, sustratos enzimáticos y reactivos de color como se describe anteriormente. De forma alternativa, el kit de diagnóstico puede ser un kit inmunotransferencia que comprende generalmente los componentes y reactivos descritos en la presente memoria descriptiva.
Kit de detección de anticuerpos
El kit de diagnóstico como ejemplo comparativo se puede usar para detectar la presencia de un anticuerpo primario específicamente reactivo con TagA o un fragmento antigénico del mismo. El kit puede incluir el antígeno unido a un sustrato, un anticuerpo secundario reactivo con el anticuerpo específicamente reactivo con el antígeno TagA y un reactivo para detectar la unión de un anticuerpo secundario para el anticuerpo primario. Dicho kit puede ser un kit ELISA y puede comprender un sustrato, antígeno, anticuerpos primarios y secundarios cuando sea adecuado, y cualquier otro reactivo necesario como mitades detectables, sustratos enzimáticos y reactivos de color como se describe anteriormente. Alternativamente, el kit de diagnóstico puede ser un kit de inmunotransferencia que generalmente comprende los componentes y reactivos descritos en la presente memoria descriptiva.
Kit de Detección (Diagnóstico) de Ácidos Nucleicos
Una vez determinada la secuencia de nucleótidos del antígeno TagA, el kit de diagnóstico como ejemplo comparativo se puede construir alternativamente para detectar secuencias de nucleótidos específicas para el antígeno comprendiendo los componentes del kit estándar como el sustrato y los reactivos para la detección de ácidos nucleicos. Debido a que la infección por H. pylori se puede diagnosticar detectando ácidos nucleicos específicos para el antígeno en tejido gástrico o duodenal y fluidos corporales como jugo gástrico, orina, defecaciones, y saliva, será evidente para un experto que se pueda construir un kit que utiliza los procedimientos de detección de ácidos nucleicos, como sondas de ácido nucleico específicas, polimorfismos de longitud de iniciadores o fragmentos de restricción en análisis. Se contempla que los kits de diagnóstico además comprenderán pruebas de control positivo y negativo.
Los reactivos particulares y otros componentes incluidos en los kits de diagnóstico se pueden seleccionar de entre aquellos disponibles en la técnica de acuerdo con los procedimientos de diagnóstico específicos practicados en el kit. Dichos kits se pueden usar para detectar el antígeno en muestras de tejido y fluido de un sujeto.
Se pretende que los siguientes ejemplos ilustren, pero no limiten, la invención. Aunque son típicos de aquellos que se pueden usar, otros procedimientos conocidos por aquellos expertos en la técnica se pueden usar alternativamente.
Ejemplo comparativo 1
Clonación y Expresión del Antígeno TagA Cadenas bacterianas y condiciones de crecimiento
Se usó la cadena 84-183 de H. pylori (ATCC 53726) para clonar el gen para el antígeno TagA. Se usaron treinta y dos aislados clínicos de H. pylori de humanos, incluyendo cadenas que previamente habían demostrado tener el antígeno, para evaluar la conservación del gen y la correlación con la producción de citotoxina (Tabla 1). Se mantuvieron cultivos a -70ºC en caldo de cultivo Brucella (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD) suplementado con glicerol al 15%. Se cultivaron cadenas de H. pylori en caldo Brucella suplementado con suero bovino fetal al 5% en una atmósfera microaeróbica (generada por CampyPak-Plus (BBL)) a 37ºC durante 48 horas. Para la transformación y la expresión de proteínas, se cultivaron cadenas de E. coli XL1-Blue (Stratagene, La Jolla, CA), HB101 (ATCC 33694), y DH5\alpha (Stratagene, La Jolla, CA) en medio Luria-Bertoli (LB) agitando a 37ºC. La concentración final de ampicilina cuando se añadió al medio era de 100 \mug/ml.
Agentes Químicos y Enzimas
Se compró isopropil-\beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG) de Sigma Chemical Co. (San Luis, MO) y se usó a 57 \mug/ml, y el 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactósido (X-GAL; concentración final de 40 \mug/ml) era de Boehringer-Mannheim (Indianápolis, IN). Las enzimas de restricción, la ADN ligasa T4, el fragmento grande de ADN polimerasa de E. coli (Klenow) y Sequenase™ eran de Promega y United States Biochemicals (Cleveland, OH). El [\alpha-^{32}P] dATP (650 Ci/mmol) era de ICN Radiochemicals (Irvine, CA).
Técnicas genéticas y análisis de secuencias de nucleótidos
Para obtener ADN cromosómico de H. pylori 84-183, se cultivó la cadena durante 48 h en caldo de cultivo Brucella conteniendo suero bovino fetal al 5%, las células se sedimentaron y resuspendieron en Tris-HCl 100 mM (pH 7,2) conteniendo NaCl 100 mM. Se lisaron las células usando SDS al 1% en Tris-HCl 100 mM (pH 8,8). Tras las extracciones con cloroformo-fenol, se precipitó el ADN cromosómico con etanol al 100%. Se aislaron los plásmidos mediante el procedimiento de extracción alcalina rápida de Birnboim y Doly (49) y se completó la purificación mediante precipitación en presencia de NaCl 800 mM y polietilén glicol al 6,5%. Todas las demás técnicas genéticas moleculares estándares, incluyendo la deleción ordenada secuencial, se realizaron como se describe (50). La secuencia de nucleótidos se determinó de manera no ambigua en ambas cadenas usando patrones de ADN de doble cadena y el procedimiento de terminación de cadena dideoxi como se describió anteriormente (51). El Vanderbilt University DNA Core Facility sintetizó iniciadores de oligonucleótidos usando un sintetizador de ADN Milligen 7500, usando el protocolo del fabricante. Se compilaron secuencias de nucleótidos y se analizaron con la ayuda del programa ADN-Star (ADN Star, Inc., Madison, WI); se identificaron el promotor putativo y las secuencias Shine-Dalgarno por comparación con las secuencias de consenso (52).
Construcción de una librería genómica de H. pylori
El ADN cromosómico de cadena 84-183 se rompió por sonicación y los fragmentos resultantes se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa de baja temperatura de fusión al 0,7%. Se separaron fragmentos en el intervalo de tamaño de 2-10 kb, se trataron con ADN polimerasa T4 para producir terminaciones romas, y se ligaron a enlazadores de octámeros de EcoRI fosforilados (New England Biolabs, Beverly, MA). El ADN se digirió con EcoRI y se ligó a las ramas de EcoRI del vector \lambdaZapII, según el protocolo del fabricante. Las mezclas de unión se añadieron a la mezcla de empaquetamiento Gigapack IIa (Stratagene) y se titularon sobre células XL1-blue (lambda ZapII) o células Y1088 (lambda gt11). Se examinaron las librerías del fago amplificado con sueros adsorbidos de una persona infectada con H. pylori o por hibridación de placa.
Clonación de genes específicos de H. pylori
Se adsorbió suero de una persona infectada por H. pylori que reconoce fuertemente el antígeno de 120-128 kDa con la cadena 86-313 de H. pylori, que no produce la banda de 120-128 kDa, y con células de E. coli para reducir el parecido de reactividad no específica y luego se usó para examinar un banco de genes de la librería del fago \lambdaZapII amplificada (53). El banco contenía aproximadamente 4x10^{4} inserciones. Se examinó la librería del fago amplificada permitiendo que aproximadamente 10^{5} placas crecieran en células XL1 Blue durante 2,5 h a 42ºC, superponiéndose con un filtro de nitrocelulosa previamente impregnado con IPTG 10 mM, y se incubó durante 2 h a 37ºC. Luego se examinaron los filtros con el suero adsorbido para detectar 9 clones reactivos. Las placas positivas luego se purificaron, y se prepararon lisados de estas células de E. coli infectadas. Los lisados se inmunotransfirieron con el suero adsorbido y se salvaron los clones que expresaban proteínas recombinantes. Mediante inmunotransferencia con el suero humano adsorbido, cada uno de los lisados XL1-Blue mostraron una banda fuertemente inmunoreactiva que migraba a aproximadamente 75, 85, ó 96 kDa, correspondientes a los plásmidos pMC1, pMC2, o pMC3, respectivamente.
De los tres clones representativos, los plásmidos pBluescript conteniendo los insertos de ADN clonados se separaron mediante co-infección con fago ayudante, como se detalla (54), y se transformaron células XL1-Blue frescas. Tras la purificación de los plásmidos, se generaron mapas de división de la enzima de restricción y los plásmidos se usaron para la posterior caracterización. En un estudio paralelo, se aislaron cuatro clones de la librería \lambdagt11 de ADN 84-183 de H. pylori mediante el mismo procedimiento, y el ADN insertado de uno de cuatro clones positivos se amplificó mediante reacción en cadena de polimerasa (PCR) usando iniciadores basados en las secuencias \lambdagt11 flanqueadoras conocidas. Se purificó el ADN recombinante del fago de cuatro placas positivas, y cada una contenía inserto de 0,6 kb. El análisis por inmunotransferencia de lisados de dos clones (\lambdaYB1 y \lambdaYB2) mostró bandas de 130 kDa de tamaño similar que reaccionaban con el antisuero humano adsorbido. Para determinar si la proteína de 130 kDa se sintetizó por un fago recombinante como proteína de fusión, se sometió lisado celular preparado de \lambdaYB1 a análisis por inmunotransferencia usando antisuero específico de \beta-galactosidasa. La reactividad cruzada mostrada indica que el clon recombinante \lambdaYB1 contiene una fusión del fragmento grande (116 kDa) de \beta-galactosidasa de \lambdagt11 y un marco de lectura libre de H. pylori. Clonamos el inserto \lambdaYB1 en pUC19, pero el recombinante (pYB1) no expresó ninguna proteína.
Electroforesis en gel y análisis inmunotransferencia
Se analizaron lisados de E. coli que portaban lambda gt11 recombinante, \lambdaZapII o pBluescript mediante SDS-PAGE e inmunotransferencia con suero humano adsorbido. Se sometió a dodecil sulfato sódico (SDS)-electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) discontínua como se describió anteriormente (55) usando un gel aglutinante al 4,5% y un gel separador al 7,0%. Se aplicaron muestras conteniendo 3 \mug de proteína a cada banda de gel. Tras la electroforesis, los geles se fijaron y las proteínas se resolvieron mediante el método de tinción en plata de Oakley y col. (56). Se disolvieron los sobrenadantes del cultivo concentrados conteniendo la proteína en tampón de muestra y se colocaron en capas sobre la superficie de un gel de poliacrilamida en un trozo de célula Mini-PROTEAN II (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Calif.). Tras la electroforesis, las proteínas se transfirieron a papel de nitrocelulosa mediante electro transferencia durante 1 h a 1 amp. Tras bloquear la unión no específica, el papel de nitrocelulosa se incubó a temperatura ambiente durante 1 h con diluciones de 1:100 de muestras de suero. Se usaron conjugados de fosfatasa alcalina de IgG antihumana de cabra (Tago, Inc., Burlingame, Calif.), en una dilución de 1:2.000 como anticuerpo secundario.
Hibridación Southern
Se digirió ADN cromosómico de H. pylori o C. jejuni con HindIII o EcoRI y BamHI y los fragmentos resultantes se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% en tampón Tris-acetato 0,04 M - EDTA 2 mM (pH 8,2). Todas las condiciones y procedimientos de hibridación fueron exactamente como se describe (50). Las sondas se radiomarcaron mediante extensión del iniciador usando hexámeros aleatorios (57). Se realizó la hibridación a 68ºC durante 16 h en tampón que contenía SSC 6X (SSC 1X es NaCl 0,15 M, citrato sódico 0,015 M), dodecil sulfato sódico (SDS) al 0,5%, solución Denhardt 5X (1X de solución Denhardt es Ficoll al 0,02%, polivinilpirrolidona al 0,02%, albúmina sérica bovina al 0,02%), y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón. Se lavaron los borrones a 60ºC en SSC 0,5X y se expusieron a película de rayos X XAR-2 (Eastman Kodak, Rochester, NY).
Hibridación de colonias
Se cultivaron cadenas de H. pylori en placas de agar sangre soja tripticasa (BBL) y las copias réplica de estas colonias se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Cada filtro se colocó en papel Whatman de 3 mm saturado con NaOH 0,2 M/NaCl 1,5 M. Tras 3 minutos el filtro se transfirió a papel Whatman de 3 mm saturado con Tris-Cl 0,4 M (pH 7,6)/ SSC 2X durante 3 minutos, y luego a SSC 2X durante 3 minutos. Se secaron los filtros de transferencia de la colonia en una estufa de vacío durante 90 minutos a 80ºC y se hibridaron con pMC3 radiomarcado como se ha descrito (50).
Producción de citotoxina
Se concentraron 30 veces sobrenadantes de caldo de cultivo de H. pylori mediante ultrafiltración, se pasaron por un filtro de 0,2 \muM, y se incubaron con células HeLa. Brevemente, se cultivaron cadenas de H. pylori a 37ºC en caldo de brucella (BBL, Microbiology Systems, Cockeysville, MD) conteniendo suero bovino fetal definido al 5% (Hyclone, Logan, Utah), suplementado con cloruro de amonio 10 mM para potenciar la actividad citotoxina. Se incubaron los caldos de cultivo en una atmósfera microaerobia en un agitador giratorio a 100 rpm durante 72 h. Se centrifugaron los cultivos a 3.000 x g durante 15 minutos, y se almacenaron los sobrenadantes libres de células a -70ºC. Tras descongelar, se concentraron los sobrenadantes 30 veces usando una membrana de ultrafiltración de 30 kDa, y se esterilizaron los concentrados pasándolos por un filtro de 0,22 \mum de tamaño de poro. Estos sobrenadantes de cultivo concentrados (CCS_{s}) se incubaron con células HeLa (obtenidas de Allison O'Brien, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, Md.) en diluciones dos veces de 1:10 a 1:320 como se describió anteriormente (39), excepto que los ensayos de toxicidad se realizaron en un volumen total de 100 \mul en placas de microtitulación de 96 pozos (Falcon; Becton Dickinson y Co., Lincoln Park, N.J.).
Se cuantificó la vacuolación de células HeLa usando un ensayo de ingesta de rojo neutro. Brevemente, se preparó una solución de rojo neutro de grado purificado al 0,5% (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) en solución salina al 0,9% y se filtró con papel de filtro Whatman no. 1. Se prepararon soluciones de tinción antes de cada experimento diluyendo la solución 1:10 en medio Eagle conteniendo suero bovino fetal al 10%. Tras la incubación con muestras de prueba durante 24 h se retiró el medio que envolvía las células HeLa y se reemplazó con 100 \mul de solución de tinción por pozo durante 4 minutos. Se lavaron las células dos veces con 150 \mul de solución salina al 0,9% por pozo, y se extrajo el rojo neutro de las células añadiendo 100 \mul de alcohol acidificado por pozo (58). La densidad óptica (OD) a 540 nm de los pozos se determinó usando un lector de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzima MR700 (Dynatech, Alexandria, VA.). Todos los ensayos se realizaron por triplicado. En todos los experimentos, la OD media de los pozos conteniendo células incubadas sólo con medio era menos de 0,130 (media, 0,101 \pm 0,007); esta OD antecedente se sustrajo de la OD de pozos experimentales para conseguir una OD neta. De las 32 cadenas de H. pylori probadas, 15 produjeron la citotoxina vacuolizante, como se determinó en este ensayo (Tabla 3).
Mapeo de insertos pBluescript
Tras la digestión con EcoRI, se observó que los plásmidos pMC1, pMC2, y pMC3 contenían insertos de ADN de aproximadamente 2,5, 2,7, y 3,6 kb, respectivamente. El análisis del tratamiento con endonucleasa de restricción de los plásmidos recombinantes identificó un fragmento de digestión de HindIII de 1,2 kb en los tres (Figura 1). Como tal, más estudios se concentraron en pMC3, que contenía el inserto mayor. El análisis de mutaciones de deleción producidas por digestión con exonucleasa III, identificó la orientación y situación aproximada del marco de lectura libre (ORF) (Figura 1, flecha grande).
Análisis secuencial de pMC3 y pYB1
Para determinar la secuencia del inserto de 3,6 kb en pMC3, se realizaron una serie de deleciones ordenadas agrupadas del plásmido usando exonucleasa III (Figura 1), como se describe (50). En total, la secuencia para el inserto de pMC3 entero representando 3648 pares de bases se determinó en ambas cadenas (SEC ID NO:1). Los nucleótidos se numeran a la derecha de cada línea. Los nucleótidos que codifican la glicina en el residuo número 859 de la SEC ID NO:1 son un artefacto del procedimiento de clonación y no son parte del gen tagA. La SEC ID NO:2 aporta la secuencia de aminoácidos deducida del ácido nucleico mostrado en SEC ID NO:1.
Un marco de lectura libre largo comenzando en el nucleótido 1072 continúa hasta la terminación del inserto. Otros dos marcos de lectura libre en el sentido opuesto empiezan en los pares de bases 645 y 264. Los aminoácidos deducidos se muestran bajo los nucleótidos. Se indican los sitios de unión ribosómicos (secuencia Shine-Delgarno; SD) potenciales, y los elementos promotores putativos (secuencias -35 y -10). Sólo se encontró un único ORF que excedía 300 bases en cualquiera de los seis marcos de lectura libre posibles. Este ORF codifica un antígeno TagA de 859 aminoácidos, produciendo una proteína predicha con un peso molecular de 96.022 (SEC ID NO:2). La dirección de transcripción deducida de este ORF también está de acuerdo con aquella previamente determinada mediante el uso de mutantes de deleción. Sin embargo, no hay ninguna señal de terminación de la traducción, indicando que el ORF en PMC3 está truncado. El fragmento truncado es rico en aminoácidos básicos (Tabla 2) y el punto isoeléctrico predicho es 8,0. Un sitio de unión ribosómica potencial (AGGAG) finaliza 6 pares de bases hacia arriba del ORF. La secuencia que está 112 pares de bases hacia arriba del sitio de iniciación de la traducción exhibe la secuencia promotora TATAGT (SEC ID NO:1) que se parece a la secuencia TATNATN promotora de consenso Pribnow (Hawley y McClure). Esta región -10 putativa, que es similar al promotor sigma-70, se asocia con una región -35, ATGCCA, que comparte 4 de 6 bases con la correspondiente secuencia consenso, TTGACA (52). La composición del aminoácido deducida del polipéptido truncado se muestra en la
Tabla 2.
También se identificaron (SEC ID NO:1) dos ORFs más pequeños, cada uno en dirección opuesta. El primero, que codifica un polipéptido de 79 aminoácidos, comienza en el par de bases 645 y no está precedido por una secuencia Shine Delgarno o secuencia promotora putativa obvia. El segundo ORF empieza en el par de bases 264 y codifica 88 aminoácidos antes del final del inserto. Este ORF truncado va precedido por una secuencia Shine Delgarno, y la secuencia TTTGAT 90 pares de bases hacia arriba del sitio de inicio de la traducción se parece al sitio promotor de consenso -10, seguido por la secuencia TTGTCA, que comparte 5 o 6 bases con la secuencia consenso -35 (52).
Se secuenció el inserto de 0,6 kb en pYB1 usando ambos iniciadores delantero e invertido de las secuencias flanqueadoras de \lambdagt11 conocidas junto con iniciadores adicionales basados en secuencias de inserto derivadas experimentalmente. Las primeras 464 bases de la secuencia de pYB1 de 620 pares de bases se superponía con el final de pMC3, pero el ORF todavía continuaba.
Reconocimiento serológico del antígeno de TagA recombinante truncado
Además del caso índice, sueros de personas infectadas con H. pylori que reconocen el antígeno TagA de la cadena de H. pylori 84-183 reconocen el polipéptido recombinante. Para este análisis, estudiamos suero de 6 personas no infectadas con H. pylori, y de 14 personas infectadas (7 reconocieron y 7 no el antígeno de 120-128 kDa de la cadena 84-183). Usando lisados de E. coli XL1-Blue transformados con pMC3 e inmunotransferencia, existe un claro reconocimiento del antígeno de 96 kDa mediante IgG de suero humano. En total, 4 de los 7 sueros que reconocen la banda de 120-128 kDa nativa también reconocen fuertemente la proteína recombinante contra ninguno de los 13 sueros probados que no reconocen la banda de 120-128 kDa (p=0,007, prueba exacta de Fisher, 2 colas). Si se consideran reacciones leves a la banda de pMC3, entonces los 7 sueros que reconocen la banda de 120-128 kDa, y 3 de los 13 sueros que no la reconocen reaccionan a la proteína recombinante (p=0,003, prueba exacta de Fisher, 2 colas). Así, la proteína recombinante producida por pMC3 se puede usar para ensayos serológicos para detectar anticuerpos para el antígeno de 120-128 kDa de H. pylori.
Conservación del gen tagA
Para determinar si otras cadenas de H. pylori poseen el gen tagA o secuencias homólogas, se estudiaron 32 cadenas mediante hibridación de colonias usando pMC3 como sonda (Tabla 3). Se obtuvo una señal positiva de 19 (59,3%) de estas cadenas. SDS-PAGE e inmunotransferencia de todas las células de estas cadenas indicaron que 19 (59,3%) de las 32 cadenas expresaron una banda a 120-128 kDa. Las averiguaciones por inmunotransferencia e hibridación de colonias se correlacionaron completamente,; las 19 cadenas de H. pylori que expresaban la proteína poseían un homólogo del gen, en comparación con ninguna de las 13 cadenas que no expresaban la proteína (p<0,001, prueba exacta de Fisher, una cola). Además, las 15 cadenas que producían la citotoxina vacuolizadora mostraron tanto hibridación pMC3 como presencia de banda de 120-128 kDa (Tabla 3).
Para conseguir información sobre el polimorfismo del fragmento de restricción del gen tagA y si hay múltiples genes homólogos en cada genoma bacteriano, se preparó ADN genómico de 4 cadenas de H. pylori y se realizó hibridación Southern usando pMC3 como sonda. Dos cadenas que expresan la proteína de 120-128 kDa y con hibridación de colonias positiva ahora mostraron hibridación fuerte al fragmento de restricción HindIII migrando a aproximadamente 1,2 kb, y bandas más débiles a 3,0 y 3,3 kb. Para una tercera cadena que mostró el fenotipo y tenía una hibridación de colonias positiva, la sonda hibridó fuertemente en el análisis Southern a una banda de aproximadamente 1,1 kb; no se vieron bandas más débiles. Una banda migrando a menos de 0,5 kb que hibridaba levemente con la sonda estaba presente en las tres cadenas. Una cadena de H. pylori que no expresaba ninguna proteína de 120-128 kDa y que tenía una hibridación de colonias negativa, al igual que una cadena de C. jejuni usada como control, mostró falta de hibridación en el análisis Southern. La hibridación de pMC3 a ADN cromosómico de las cadenas 84-183 y 60190 digeridas con EcoRI y BamHI también mostró polimorfismo, confirmando la heterogenicidad observada con las otras enzimas de restricción. Estos estudios indican que aunque existen homólogos de TagA en otras cadenas de H. pylori, existe heterogenicidad tanto en las secuencias intragénicas como flanqueadoras.
El presente ejemplo aporta un fragmento clonado del ADN genómico de H. pylori que incluye la mayor parte de un gen que codifica un importante antígeno de H. pylori. La evidencia de que pMC3 contiene el gen que codifica el antígeno TagA se puede resumir de la siguiente manera: (i) ni la proteína ni el gen están presentes en todas las cadenas de H. pylori; (ii) sólo las cadenas que expresan la proteína de 120-128 kDa hibridan con pMC3 y las cadenas que no expresan la proteína no hibridan; (iii) los sueros de personas infectadas con H. pylori que reconocen el antígeno de 120-128 kDa reconocen el producto de tagA recombinante significativamente con más frecuencia que lo hacen los sueros control.
Las secuencias parciales de tagA y los otros dos ORFs no tienen ninguna identidad con el extremo N o 3 secuencias internas de la citotoxina de 87 kDa. Este descubrimiento es consistente con observaciones anteriores de que las proteínas de 120-128 kDa y 87 kDa no están relacionadas antigénicamente (41). La comparación del producto del gen deducido truncado reveló escasa homología directa con proteínas conocidas.
El gen tagA o genes homólogos están presentes en aproximadamente el 60% de los aislados de los H. pylori estudiados pero ausentes de los otros. Como indica el análisis Southern, existe evidencia de polimorfismo del fragmento de restricción incluso cuando sólo se examina un pequeño número de cadenas. La ausencia de un homólogo se correlacionó exactamente con la falta de expresión de una banda antigénica a 120-128 kDa. Así, el fenotipo que carece de esta banda no se debe a deficiencias relacionadas con la transcripción o expresión, sino más bien a la ausencia del gen implicado.
La presencia de ADN genómico conteniendo al menos el gen tagA truncado está altamente asociada con la producción de citotoxina. Una minoría de cadenas que poseen el gen tagA no produce niveles detectables de citotoxina. Este fenómeno puede reflejar sensibilidad subóptima en el ensayo de cultivo celular para detectar toxina, o puede indicar que factores diferentes del antígeno TagA se asocian con la actividad de la toxina.
Según muestran los estudios de inmunotransferencia, los productos pMC3 son excelentes reactivos de diagnóstico para la detección de anticuerpos de suero humano para el antígeno TagA. El uso de esta proteína recombinante puede aportar rápidamente el suficiente antígeno para ayudar al desarrollo de inmunoensayos para determinar qué personas están infectadas con cadenas de H. pylori produciendo la proteína de 120-128 kDa nativa, y se pueden usar anticuerpos heterólogos creados contra el producto genético de pMC3 para determinar qué cadenas producen el antígeno TagA. El conocimiento de la secuencia de ADN de pMC3 permite la construcción de oligonucleótidos para su uso como sondas de hibridación o para iniciadores para PCR. Dichas técnicas también se usan para la detección rápida de la infección debida a una cadena con el genotipo implicado. La creación de mutantes de eliminación permite la elucidación del papel de este producto genético y aporta tanto reactivos terapéutico como candidatos a vacuna. Dichos procedimientos de diagnóstico y mutantes se detallan en la presente memoria descriptiva.
TABLA 1 Cadenas de Helicobacter pylori usadas en este ensayo
1
TABLA 2 Composición de aminoácidos del polipéptido TagA de 859 aminoácidos truncado según se deduce por pMC3
2
TABLA 3 Correlación entre la presencia de la banda de 120-128 kDa por inmunotransferencia, hibridación con pMC3, y producción de citotoxina mediante aislados de H. pylori de humanos
3 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{a}  \+ \begin{minipage}[t]{130mm} Reconocimiento de la banda
de 120-128 kDa en lisados celulares mediante suero
humano según se detecta con inmunotransferencia
(20).\end{minipage} \cr   ^{b}  \+ Hibridación de pMC3 a
células de  H. pylori  lisadas en borrones de colonia (50).\cr 
 ^{c}  \+ Producción de citotoxina vacuolizante según se detecta en
cultivos celulares HeLa
(59).\cr}
Ejemplo comparativo 2
Construcción y caracterización de una cadena negativa de tagA de Helicobacter pylori Cadenas bacterianas, vectores y condiciones de crecimiento
La cadena 84-183 de H. pylori (ATCC 53726) usada en este estudio provenía de la colección de cultivos del Laboratorio de Campylobacter/Helicobacter de la Universidad de Vanderbilt y se eligió porque se ha caracterizado ampliamente. Se mantuvieron cultivos a -70ºC en caldo Brucella (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, MD) suplementado con glicerol al 15%. Se cultivaron cadenas de H. pylori en caldo Brucella suplementado con suero fetal bovino al 5% o en placas de agar sangre suplementadas con ácido nalidíxico (50 mg/litro), vancomicina (10 mg/litro), polimixina B (5000 U/litro), y trimetoprima (5 mg/litro) en condiciones microaeróbicas a 37ºC durante 48 horas. La cadena DH5\alpha de E. coli (Stratagene, La Jolla, CA) usada para transformación, se cultivó en medio LB. Como se describe anteriormente, pMC3 contiene el gen tagA truncado en un inserto de 3,5 kb en pBluescript. El plásmido pILL600 (60) se usó como fuente de un gen resistente a la kanamicina (km) de C. coli.
Agentes químicos y enzimas
Se usaron concentraciones finales de ampicilina (100 \mug/ml) y kanamicina (50 \mug/ml) siempre que fue necesario. Las enzimas de restricción, la ADN ligasa T4, el fragmento grande de ADN polimerasa de E. coli (Klenow) eran de Promega y United States Biochemicals (Cleveland, OH). El \alpha-^{32}P-dATP (650 Ci/mmol) era de ICN Radiochemicals (Irvine, CA).
Técnicas genéticas
Se preparó ADN cromosómico como se describe anteriormente. Se aislaron plásmidos mediante el procedimiento de Birnboim y Doly (49). El resto de técnicas genéticas moleculares estándares se realizaron como se describe (50). Los fragmentos de ADN usados como sondas para experimentos de hibridación se purificaron en gel.
Introducción de cassette de km en la cadena 84-183 de H. pylori
Se insertó un gen resistente a kanamicina de E. coli en el único sitio NdeI de pMC3 para crear pMC3:km (Figura 2). Esta construcción se introdujo directamente en la cadena 84-183 de H. pylori mediante electroporación. Brevemente, se cultivaron células de H. pylori cultivadas en placas de agar sangre durante 48 horas, se lavaron tres veces en tampón de electroporación (glicerol al 15%/sacarosa al 5%) y se suspendieron en 200 \mul del tampón. Se aisló el plásmido de ADN de pMC3:km mediante un procedimiento de lisis alcalina rápida (mini-prep) de Birnboim y Doly y se añadió a las células y se incubó durante 5 minutos en hielo. Las células y el ADN se transfirieron a una cubeta de electroporación de 0,2 cm en un aparato Gene-pulsar (Bio-Rad), y se suministraron descargas de alto voltaje (25F, 2,5 kv y 200\Omega) como se describe anteriormente (61). Tras la electroporación, las células se suspendieron en 400 \mul de medio LB y se esparcieron en placas de agar sangre. Se incubaron las placas a 37ºC en condiciones microaerobias durante 24 horas, se cultivaron las células, se pusieron en placas de agar sangre conteniendo 50 \mug/ml de kanamicina, y se incubaron de manera microaerobia durante 48 horas.
El vector de clonación usado era incapaz de replicarse en H. pylori y la selección en medios conteniendo kanamicina produjo recombinantes resistentes a kanamicina. Se obtuvieron 3000 transformantes (10^{-7}) de aproximadamente 10^{10} cfu de H. pylori cuando se usaron 500 ng de ADN de plásmido.
Hibridación de la colonia
Se cultivaron cincuenta transformantes resistentes a kanamicina obtenidos mediante electroporación en placas de agar sangre y se transfirieron copias réplica de estas colonias a filtros de nitrocelulosa. Cada filtro se colocó en papel Whatman 3 mM saturado con NaOH 0,2 M/NaCl 1,5 M. Después de 3 minutos se transfirió el filtro a papel Whatman 3 mM, saturado con Tris-HCl 0,4 M (pH 7,6)/ SSC 2 X durante 3 minutos, y luego a SSC 2 X durante 3 minutos. Los filtros de borrones de la colonia se secaron en una estufa de vacío durante 90 minutos a 80ºC y se hibridaron con pBluescript radiomarcado o el gen de resistencia a km, como se describe anteriormente. Se lavaron los borrones de las colonias a 60ºC en SSC 0,5X y se expusieron a película de rayos X XAR-2 (Eastman Kodak, Rochester, NY).
Electroforesis en gel y análisis por inmunotransferencia
Se prepararon lisados de E. coli portadores de pBluescript, pMC3 o pMC3:km o de células de H. pylori y se analizaron mediante SDS - electroforesis en gel de ploacrilamida (SDS-PAGE). Se realizó inmunotransferencia de todos los extractos celulares derivados del tipo salvaje y de los mutantes 1, 21 y 22 como se detalla anteriormente usando una dilución 1:300 de sueros humanos adsorbidos, y una dilución 1:2000 de conjugado de fosfatasa alcalina de inmunoglobulina antihumana de cabra como anticuerpo secundario, como se describe anteriormente. Estos estudios mostraron que las cadenas mutantes isogénicas 1, 21, y 22 no tienen producto genético de tagA antigénico.
Hibridación Southern
Se realizó la hibridación Southern de la cadena 84-183 de H. pylori de tipo salvaje y de los transformantes M21 y M22 resistentes a kanamicina. Se digirió ADN cromosómico de H. pylori con HindIII o BamHI o SacI y los fragmentos resultantes se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 0,7% y se transfirieron a una membrana de nailon. Las sondas eran fragmentos de ADN purificados en gel derivados de pMC4 o pILL600 y se radiomarcaron mediante extensión del iniciador usando oligonucleótidos hexámeros aleatorios como se describe anteriormente. Luego se transfirió el ADN a una membrana de nailon y se hibridó con pMC4 marcado con ^{32}P o el cassette de km de 1,3 kb en condiciones de alta rigurosidad. Se realizaron hibridaciones en una solución de SSC 6X, SDS al 0,5%, solución Denhardt 5X y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón y se lavaron los borrones durante 30 min a 60ºC en SSC 0,5X/SDS al 0,1%.
Caracterización del genotipo de los transformantes
Para aportar evidencia genética de que el gen tagA se interrumpe en las cadenas del transformante, se digirió ADN aislado de la cadena 84-183 de tipo salvaje y de los mutantes 21 y 22 de H. pylori con endonucleasa de restricción HindIII o BamHI y SacI. Tras la separación del ADN digerido en un gel de agarosa, se transfirió el ADN a una membrana de nailon y se hibridó a pMC4 que es una sonda de tagA. Esta sonda hibridó a fragmentos BamHI-SacI de aproximadamente 20 y 1,0 kb en la cadena de tipo salvaje, mientras que se pierde el fragmento BamHI-SacI de 1,0 kb y se observó un nuevo fragmento de hibridación de 2,3 kb en ambas cadenas mutantes sin interrupción de las otras bandas. De manera similar, se perdió un fragmento HindIII de 1,2 kb y se ganó un fragmento de 2,2 kb en ambos mutantes debido a la inserción del gen de resistencia a la kanamicina. La sonda del gen de la kanamicina hibridó sólo con el fragmento BamHI-SacI de 2,3 kb y HindIII de 2,2 kb en las cadenas mutantes 21 y 22, lo que indica que había tenido lugar una sustitución en el gen tagA. Así, el gen tagA en la cadena 84-183 se había mutagenizado mediante la inserción del gen km.
Producción de citotoxina
Se ensayó la producción de citotoxina como se describe anteriormente y los resultados se muestran en la Tabla 4. Los resultados indican que no se requiere ni el antígeno TagA intacto ni el gen tagA intacto para la vacuolización.
TABLA 4 Producción de citotoxina mediante cadenas de H. pylori de tipo salvaje y mutantes tagA^{-}
4
Ejemplo comparativo 3
Gen tagA de Longitud Completa y Producto Genético Clonación y secuenciación del gen de longitud completa
Para aislar el gen de longitud completa, luego usamos el fragmento de 0,6 kb de pYB1 como sonda para examinar la librería \lambdaZapII de H. pylori 84-183. Se purificaron cinco placas positivas y se separaron los plásmidos pBluescript conteniendo insertos de ADN clonado mediante co-infección con el fago de ayuda. Cada uno de los cinco clones positivos contenía insertos de ADN de 2 a 3 kb (no se muestran los datos). El clon denominado pYB2, que contiene un inserto de 2,7 kb, se eligió para un estudio posterior y se generó un mapa de restricción (Figura 3). Se realizó una serie de deleciones agrupadas empezando en cualquiera de los extremos del inserto de 2,7 kb de pYB2 usando exonucleasa III. Usando clones de deleción superpuestos de pYB2, determinamos la secuencia de 1969 pares de bases en ambas cadenas. Como se esperaba, las primeras 785 bases de esta secuencia (SEC ID NO:3, empezando con el nucleótido 2864) se superponían con el extremo de pMC3. La traducción de la secuencia de nucleótidos completa generada de pMC3, pYB1 y pYB2 en todos los marcos de lectura posibles reveló un único marco de lectura libre de 3.543 nucleótidos iniciado por un codón ATG en la posición 1072 y finalizado por un codón TAA en la posición 4.615. La secuencia codifica una proteína de 1181 residuos de aminoácido (SEC ID NO:4) y el peso molecular calculado del polipéptido deducido es de 131.517 daltons. Una secuencia que podría formar una estructura rizo-tallo potencial en el ARNm y que podría servir como sitio de terminación de la transcripción (\DeltaG= -14,4 Kcal) se extiende de los nucleótidos 4642 a 4674 (SEC ID NO:3).
Homologías del polipéptido TagA con otras proteínas
La búsqueda en los bancos de datos de proteínas Swiss.Prot versión 21, y NBRF-PIR mostró que no había homologías llamativas con el antígeno TagA de longitud completa (SEC ID NO:4). Sin embargo, entre las homologías con las mayores puntuaciones estaban las ATP sintasas transportadoras de H^{+} del cloroplasto (62,63), y una proteína del canal del sodio (74) con un 16,8% y un 17,3% de identidad, y con un 50% y un 42,6% de aminoácidos conservados en la región entre los residuos 1-482 y 123-1182, respectivamente. No se observaron homologías significativas cuando las secuencias de aminoácidos de los otros dos ORFs contenidos en pMC3 se compararon con las bases de datos de proteínas.
El contenido en aminoácidos básicos [141 lisinas, (11,9%) y 117 asparaginas (9,9%)] de TagA era inusualmente alto y consistente con el punto isoeléctrico predicho del péptido (8,89). Un diagrama de hidropaticidad indicó que la proteína deducida es predominantemente hidrófila. Una característica interesante de la estructura primaria de esta proteína es la presencia de estructuras de secuencia de aminoácidos homopoliméricos, más notablemente poliasparagina (SEC ID NO:4, Posición 3705). En búsquedas comparando esta región rica en asparagina con varias bases de datos de secuencias proteicas, aparecía una fuerte homología con las secuencias de la levadura (64, 65, 66, 67, 68, 69, 70) y proteínas de unión de nucleótidos de Plasmodium (71). La poliasparagina también se encuentra en el producto regulador de la unión de ADN del gen lac9 de Kluyveromices var.lactis (72) y la proteína de transporte de potasio (TRK1) de Saccharomyces cerevisiae (73).
Construcción del gen tagA de longitud completa
Para construir el gen tagA de longitud completa, usamos el sitio de restricción SacI único situado en ambos pMC3 y pYB2 (Figura 3). Primero, se clonó el fragmento tagA de 3,6 kb de pMC3 en un vector pUC19 bajo el control del promotor lacZ, para generar pUT1. Luego, el fragmento SacI de 2,6 kb de pYB2 se clonó en un pUT1 digerido con sacI. Se seleccionó un clon con la orientación correcta, que se denominó pUT2. Un clon idéntico (pEM3), pero presente en el vector pGEM3z, se depositó con el ATCC de acuerdo con los requerimientos del Tratado de Budapest según la Solicitud No. 69273. Las células de E. coli que contenían pUT2 o pEM3 expresaron la proteína de 128 kDa de H. pylori inmunoreactiva.
Detección de respuestas serológicas humanas a la proteína TagA recombinante mediante inmunotransferencia
Para determinar si los sueros humanos reaccionaban con la proteína TagA recombinate de longitud completa, el lisado de células conteniendo pEM3 se sometió a electroforesis en un gel de acrilamida al 7%, y se electrotransfirió en papel de nitrocelulosa. Se diluyeron al 1:100 sueros de 10 humanos infectados por H. pylori y 10 humanos no infectados y se probó la reactividad con la proteína recombinante. Los sueros de 7 personas infectadas por H. pylori reconocieron la proteína TagA, en comparación con los sueros de 1 de 10 personas no infectadas (p=0,01, prueba exacta de Fisher de una cola). Así, la proteína de longitud completa recombinante fue un antígeno útil para evaluar las respuestas humanas a H. pylori.
Ejemplo 4 Cadenas de H. pylori que poseen tagA asociado con un riesgo incrementado de desarrollo de adenocarcinoma de estómago
Este ejemplo describe un ensayo serológico para determinar si la infección por Helicobacter pylori se debe a la cadena tagA^{+}. En este ensayo con IgG sérica, usando orv220, se encontró que un fragmento de tagA recombinante tenía una sensibilidad del 94,4% y una especificidad del 92,5% cuando se usa en una población definida
clínicamente.
El presente ejemplo también muestra que la infección por H. pylori se asocia con el riesgo de cáncer gástrico. Se usaron muestras de suero obtenidos de una cohorte de hombres Japoneses-Americanos en Hawai en un estudio de 103 hombres infectados por H. pylori que eventualmente (13 años después de que se recogieran las muestras de suero) desarrollaron cáncer gástico, y 103 muestras de control infectadas por H. pylori contrastadas de los hombres que no desarrollaron cáncer en el mismo periodo de tiempo. Los anticuerpos séricos para TagA se asociaron con un riesgo incrementado 1,9 veces (0,9-4,0, p=0,08) de desarrollo de cáncer gástrico durante el periodo de observación. Entre los 75 hombres con cáncer de tipo intestinal del estómago distal, la proporción (OR) era de 2,3 (1,0-5,2, p=0,056). La edad joven (<72 años) y la etapa tardía en el diagnóstico del tumor se asociaron de manera significativa con la positividad de TagA.
Los siguientes resultados indican que la presencia de anticuerpos séricos para el producto de un tagA recombinante determina con exactitud el estado de tagA de una cadena de H. pylori infecciosa, e indican que la infección con una cadena de tagA^{+} se asocia con un riesgo incrementado de desarrollo de cáncer gástrico, especialmente de tipo intestinal que afecta al estómago distal.
Selección de pacientes para el estudio de validación
Para determinar la utilidad del ensayo serológico de TagA, se estudiaron sueros de 181 personas cuyo estado de H. pylori se había definido previamente (9,22-24). Las personas no infectadas (n=115) son las que se sometieron a endoscopia y tuvieron biopsias que no revelaron infección por H. pylori mediante prueba de ureasa rápida o por examen histológico; todos los pacientes también tuvieron serología negativa en un ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (ELISA) estandarizado para IgG sérica dirigido a H. pylori (25). Los 115 pacientes no infectados se dividieron arbitrariamente en un grupo de referencia (n=35) y un grupo de prueba (n=80). Las personas infectadas son aquellas de las que se obtuvo H. pylori en cultivo con biopsia; estos 66 pacientes incluían aquellos con úlcera duodenal (n=14), úlcera gástrica (n=6), sólo gastritis (n=36), u otros diagnósticos (n=10). Para cada paciente, se evaluó un único aislado para determinar el estado de tagA mediante hibridación de colonia con una sonda específica de gen, como se describe anteriormente (6, 24). En base al ensayo de hibridación, se determinó que 36 pacientes estaban infectados por la cadena tagA^{+}, y 30 pacientes por la cadena tagA^{-}. Todos los sueros se habían almacenado a -20ºC hasta su uso.
Selección de pacientes para estudio del cáncer
Todos los pacientes de este estudio formaban parte de la cohorte del Estudio Japón-Hawai, como se describe anteriormente. Durante el periodo de 21 años entre 1968-1989, se identificaron 109 casos de carcinoma gástrico confirmado patológicamente, y la prueba serológica previa indicaba que 103 de estos pacientes se habían infectado con H. pylori en el momento de la entrega de su suero original en la década de 1960 (5). De los 103 controles contrastados para estos casos, 83 estaban infectados con H. pylori. Para cada uno de los 20 casos infectados restantes con H. pylori, se identificaron 3 controles más según los criterios previos (5). Se realizaron pruebas de serología para determinar si la infección con H. pylori estaba presente en muestras codificadas, y de las positivas, se seleccionó al azar un control infectado con H. pylori para cada uno de los 20 casos no contrastados. En total, el estudio consistía en 103 hombres infectados con H. pylori que desarrollaron cáncer gástrico, y sus 103 controles contrastados, que también estaban infectados con H. pylori pero no desarrollaron cáncer gástrico durante el periodo de estudio.
Preparación del antígeno TagA recombinante
Un fragmento BamHI de 1,7 kb conteniendo los pares de bases 1921-3648 de tagA clonado en pMC3 (16) se subclonó en el sitio BamHI de pET15b (Novagen, Madison WI), hacia abajo del promotor T7. Este plásmido (pORV220) se usó para transformar la cadena BL21 huésped de E. coli, un lisógeno de \lambdaDE3 conteniendo el gen de la ARN polimerasa T7 bajo el control del promotor lacUV5 (26). La adición de IPTG a un cultivo en crecimiento del lisógeno induce la polimerasa T7 a transcribir el ADN objetivo en el plásmido recombinante. Este vector permite la expresión regulada transcripcionalmente de una proteína de fusión que consiste en el fragmento TagA con un apéndice histidina N-terminal. La proteína de fusión consiste en 600 residuos (vector 24 + inserto 576), y tiene una masa molecular predicha de 66,4 kDa. La proteína se purificó de lisados de cultivos en caldo inducidos usando una resina queladora de níquel, y se eluyó con imidazol, como se describe (27).
Procedimientos serológicos
La presencia de anticuerpos de IgG sérica para H. pylori se determinó mediante ELISA con el kit Pyloristat (Biowhittaker, Walkersville, MD) como se describió previamente (5). Para el ELISA de TagA, se determinaron concentraciones óptimas de antígeno, suero de paciente, y conjugado IgG anti-humano mediante titulaciones en tablero de ajedrez. Para orv220, la concentración de antígeno óptima era de 5 \mug/ml y se cargaron alícuotas de 100\mul en pozos de una placa de microtitulación de 96 pozos. La dilución óptima de suero humano era 1:100, y se usó IgG de cabra anti-humana conjugada con peroxidasa de rábano picante en una disolución de 1:4000. Otros detalles de los procedimientos serológicos fueron exactamente como se describe en ensayos similares (23,25).
Análisis estadístico
La prueba t para muestras emparejadas se usó para la comparación de medios, y la prueba McNemar se usó para la comparación de la distribución de varias características entre pacientes y sujetos control. Las proporciones (OR) para el cáncer de estómago, basadas en los resultados del ensayo TagA, se derivaron de procedimientos de regresión logística condicionales (29). Las pruebas para la tendencia lineal en el logit del riesgo se derivaron de modelos de regresión logística condicional mediante el uso de resultados de pruebas de TagA agrupadas (codificadas por el cuartil como 1, 2, 3, ó 4). Todos los modelos de regresión logística condicional se ajustaron usando procedimientos de parecido máximo iterativo del modelo de regresión de riesgos proporcionales (30). La estimación del riesgo atribuible de carcinoma gástrico relacionado con una cadena tagA^{+} se basó en el procedimiento de Walter (31). Se construyó una curva característica operador receptor (ROC) para resumir las estimaciones de sensibilidad y especificidad (32).
Exactitud diagnóstica de la serología TagA usando orv220
Estudios previos de la serología TagA usaron un antígeno recombinante que se purificó de lisados de células de E. coli (21). Como la purificación de este antígeno era tediosa y prolongada, se expresaron fragmentos del gen tagA superpuestos como proteínas de fusión en un sistema de expresión procariota alternativo. Estudios preliminares indicaron que orv220 expresaba el mejor de varios de los antígenos candidatos basándose en los fragmentos de TagA estudiados hasta entonces. La proteína truncada se comparó con el antígeno purificado de cadenas de E. coli transformadas con pEM3, que codifica el ORF de tagA entero. Mediante análisis de regresión lineal, los resultados de IgG sérica de 41 personas (19 infectadas y 22 no infectadas), se correlacionaron estrechamente entre ensayos usando los dos antígenos diferentes (r=0,96, p<0,001). Usando el mismo umbral del valor medio para personas no infectadas + 2 SD, el antígeno orv220 dio un resultado negativo para 21 (95%) de las 22 personas no infectadas; y la excepción era levemente positiva. Para las 19 personas infectadas por H. pylori, los resultados con orv220 eran exactamente los mismos que para el antígeno pEM3 (12 positivos y 7 negativos). Así, la reactividad serológica con el fragmento de TagA de 66,4 kDa codificado por orv220 era casi idéntica que aquella detectada con un fragmento de tagA más grande.
Para establecer el ensayo, se usó como referencia suero de 36 personas que se sabía no estar infectadas con H. pylori, y tras múltiples pasadas, se establecieron umbrales basados en valores medios además de intervalos de desviación estándares. Al mismo tiempo, se probaron sueros de un segundo grupo de 80 personas no infectadas, 36 personas que se sabía infectadas con una cadena de tagA^{+}, y 30 personas de las que el único aislado de H. pylori obtenido es tagA^{-}. No es sorprendente que los ratios de densidad óptica para las personas no infectadas eran casi idénticos a aquellos para los grupos de referencia. En contraste, los valores para las personas infectadas con cadenas de tagA^{+} eran significativamente más altos (Prueba T de Students, p<0,001, una cola). Entre los 30 sueros obtenidos de personas de las que el único aislado era una cadena de tagA^{-}, se observó una distribución bimodal. Para 27 de los sueros, los valores eran similares a aquellos en los dos grupos de personas no infectadas, pero para tres sueros los valores eran mucho mayores y similares a aquellos para pacientes infectados con cadenas de tagA^{+}.
Para establecer un umbral para su uso en ensayos de diagnóstico, se examinó la exactitud de varios límites del ratio de densidad óptica (tabla 5). En conjunto, la mayor exactitud se obtuvo cuando se usó el valor medio para los 35 pacientes no infectados (referencia) + 3 intervalos de desviación estándar, con una sensibilidad del 94,4% y una especificidad del 92,5%. Este tipo de umbral se usó en todos los estudios futuros. En base a curvas receptor operador características (ROC), existía un alto nivel de discriminación del estado de tagA usando orv220.
Evaluación de la estabilidad de niveles de anticuerpos
Para determinar si los anticuerpos séricos para el producto de TagA persisten durante el curso de la infección por H. pylori crónica, se evaluaron muestras de suero emparejados de 36 epidemiólogos que formaban parte de una cohorte previamente estudiada para características clínicas y epidemiológicas asociadas con infección por H. pylori (28). De media, las muestras se obtuvieron con una diferencia de 7,59 años, y los valores del ELISA de H. pylori estándares (28) se compararon con valores en el ELISA de TagA.
Entre 36 participantes, ninguno había sufrido una conversión sérica de positivo a negativo en el estado del anticuerpo o viceversa. Los valores de densidad óptica medios producidos por el primer y segundo suero eran muy similares (0,217 contra 0,249; p=0,3, prueba t emparejada; Tabla 6).
Asociación de la positividad de tagA con el cáncer gástrico
Al haber desarrollado un ensayo para detectar personas infectadas con cadenas de H. pylori que poseen TagA usando TagA o fragmentos antigénicos del mismo, la invención muestra que la infección con la cadena tagA^{+} se asocia con el riesgo de desarrollo de cáncer gástrico. De un estudio previo con 109 pacientes Japoneses-Americanos, que desarrollaron cáncer gástrico durante un periodo de observación de 21 años (5), se observó que 103 estaban infectados por H. pylori basándose en muestras de suero obtenidos de ellos una media de 13 años antes del diagnóstico del cáncer. Cada uno de estos casos se contrastó con un control de la misma cohorte, de la misma edad, y que también estaba infectado con H. pylori; las características de los 103 hombres infectados por H. pylori que desarrollaron cáncer gástrico y sus controles ajustados a la edad se muestran en la Tabla 7. Los dos grupos de hombres eran similares con respecto a características demográficas y valores de laboratorio.
Para esta población, la presencia de anticuerpos séricos para TagA (esto es, infección con una cadena de H. pylori positiva de tagA) se asoció con un riesgo incrementado de desarrollo cancerígeno (OR=1,9, p=0,08) (Tabla 8). Un análisis confinado a los 101 casos de cáncer del estómago distal y sus controles mostraron valores muy similares, como se esperaba (OR=1,8, p=0,11). Cuando los casos con cánceres distales se estratificaron mediante el tumor de tipo histológico, la asociación más fuerte tuvo lugar con el tipo intestinal (OR=2,3, p=0,056) pero no el tipo difuso (OR=1,0, p=1,0); 3 hombres tenían un cuadro histológico indeterminado. La positividad en el ELISA de TagA no era el resultado de la seroconversión durante el intervalo entre que se obtuvo el suero y el diagnóstico del cáncer, como no fue la magnitud de la respuesta del anticuerpo de tagA un factor en el riesgo de desarrollo de cáncer. En la población de personas infectadas por H. pylori, la presencia de tagA se asoció con un riesgo atribuible del 28% (95% C.I.=0-57%) para el cáncer gástrico. No existía asociación entre niveles de anticuerpos IgG para TagA y los niveles de IgG para los antígenos de H. pylori conservados.
El análisis del anticuerpo TagA se estratificó por la edad del paciente a la que se diagnóstico el cáncer gástrico. La seropositividad de TagA se asoció con un incremento de 3,0 veces (95% C.I.=1,0-9,3; p=0,057) en el riesgo de cáncer gástrico para 52 hombres diagnosticados de menos de 72 años. En contraste, para 51 hombres que eran mayores o iguales a 72 años en el momento del diagnóstico, la asociación no era significativa (OR=1,3, 95% C.I.=0,5-3,5). La seropositividad de TagA se asoció con el riesgo de desarrollar un tumor en estado avanzado (3 ó 4), OR=2,6, 95% C.I.=1,1-6,2; p=0,03, pero no un tumor en etapa de iniciación (1 ó 2) (OR=1,0). El riesgo de desarrollar cáncer gástrico asociado con la seropositividad de TagA no se incrementó cuando los sujetos se estratificaron según el orden de nacimiento o el tamaño del grupo de personas que descienden de un ancestro común.
Aunque algunos de los valores de OR anteriores no son significativos estadísticamente usando el análisis significativo de 2 colas conservativo, el uso de análisis de una cola indica que las asociaciones con todos los cánceres y tipo de cánceres intestinales alcanza significado estadístico (p=0,04 y 0,028 respectivamente). Además, las diferencias no detectadas en el riesgo entre los dos grupos, la falta de exactitud perfecta del ensayo, y la variación en la respuesta paciente-paciente a esta infección podrían ayudar a explicar la falta de significado.
Infección múltiple
Se ha informado de infección gástrica simultánea con dos cadenas de H. pylori con frecuencia del 10 al 13% (14,15), y también se ha informado de infección simultánea con tres cadenas diferentes (33). En el estudio de validación inicial, sólo se ha cogido una única colonia de cada paciente, así que no había oportunidad de examinar la infección múltiple. Sin embargo, que 3 de 30 (10%) personas, de las que la cadena de tagA^{-} era el único aislado, tenían respuestas serológicas de alto nivel a TagA, lo que sugiere que estas personas estaban co-infectadas con la cadena de tagA^{+}. Ya que sólo la conjunción de infección simultánea con una cadena índice de tagA^{-} y una segunda cadena tagA^{+} y no viceversa, podría mostrar resultados dicótomos entre pruebas de colonia y el ensayo serológico, los datos sugieren que la frecuencia de infección múltiple puede ser sustancialmente mayor que la frecuencia previamente informada, que se basaba en un pequeño número de biopsias (4, 15).
El presente ejemplo apoya además la utilidad de ensayos serológicos no invasivos para infecciones con H. pylori, porque se muestran como ensayos globales que en esencia muestrean todo el estómago. En contraste, las técnicas basadas en biopsia sólo muestrean una fracción minúscula (<<1%) de la mucosa gástrica. Como TagA es un antígeno inmunodominante (17), los ensayos serológicos potencialmente tienen el poder de detectar infecciones con organismos tagA^{+} incluso si las cantidades son bajas en relación con los aislados de tagA^{-}.
Las asociaciones con el subconjunto de tumores más agresivos (edad más joven, estado más avanzado cuando se diagnostica), y la consistencia de los datos con la hipótesis subyacente, muestran que el efecto es real ya que además se apoya en un número de realidades de la biología de TagA. Primero, la infección con cadenas de tagA^{+} se asocia con el daño celular epitelial incrementado (18, 19), el daño a células epiteliales gástricas superficiales que promocionan o posiblemente inician la oncogénesis. Segundo, la infección con cadenas cagA^{+} se asocia con mayores grados de inflamación gástrica (8, 19), y con la expresión incrementada de citoquinas pro-inflamatorias como IL-1 e IL-8 (19, 35). Estas pueden contribuir al daño epitelial. Tercero, la mayoría de las cadenas de tagA^{+} también expresan la actividad citotoxina vacuolizadora (16, 17). La expresión de la citotoxina evaluada por anticuerpos neutralizadores séricos, puede asociarse con el cáncer gástrico (36). Finalmente, el cáncer gástrico de tipo intestinal se asocia más con la inflamación incrementada y la gastritis atrófica que lo es el tipo difuso (37, 38).
Se ha demostrado que respuestas de anticuerpos muy tituladas a antígenos de H. pylori conservados se asocian con el riesgo de cáncer gástrico (5, 8). Una interpretación de este fenómeno es que los niveles altos de anticuerpos son marcadores para el grado de inflamación, considerándose la inflamación activa un precursor de eventos oncogénicos (1). La falta de correlación estricta entre cáncer gástrico y niveles de anticuerpo anti-TagA pueden reflejar mayor ajuste, ya que sólo se seleccionaron personas infectadas con H. pylori, todas las cuales tienen algún grado de inflamación. En cualquier caso, el significado de estas averiguaciones se puede atenuar por la observación de positividad TagA presente en el 78% de los controles infectados con H. pylori que no desarrollaron cáncer. Así, la infección con la cadena tagA^{+} no es ni necesaria ni suficiente para la oncogénesis pero aparece como un factor que participa en este procedimiento.
La presencia de tagA en una cadena puede ser un marcador para genes adyacentes o para un fenotipo particular que en sí mismo es relevante para la inflamación o para el proceso oncogénico. En cualquier caso, este Ejemplo muestra que cadenas de H. pylori particulares están asociadas con el riesgo diferencial de cáncer gástrico.
Resumen
Entre personas que se sabe están infectadas con cadenas tagA^{+}, existía un amplio intervalo de reactividad serológica, pero sin superposición sustancial con la reactividad de personas no infectadas. La estabilidad de los resultados a lo largo de los años en ausencia de terapia antimicrobiana además indica la utilidad del presente ensayo de TagA.
Al aportar un ensayo ajustado para detectar la infección con la cadena de tagA^{+} de H. pylori, la invención también permitió la determinación de que la infección con una cadena de tagA^{+} es un factor de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico. La infección con una cadena de tagA^{+} casi doblaba el riesgo de desarrollar cáncer gástrico durante los 21 años siguientes, en comparación con la infección con la cadena de tagA^{-}, y el efecto estaba más marcado para personas que desarrollaban neoplasmas de tipo intestinal
Al aportar un TagA purificado y fragmentos antigénicos de TagA, y mostrar que la infección con una cadena de expresión de TagA indica predisposición al carcinoma gástrico, se permiten más usos de los presentes descubrimientos.
TABLA 5 Valor diagnóstico de ELISA de TagA usando orv220
5
TABLA 6 Estabilidad de anticuerpos séricos para antígenos de H. pylori en 36 sujetos
6
TABLA 7 Características de pacientes infectados con H. pylori con cáncer gástrico y sujetos control en el momento en que se obtuvo la muestra del suero
7
TABLA 8 Proporciones para la Asociación entre la infección con una cadena de H. pylori tagA^{+} y el cáncer gástrico
8
Referencias
1. Blaser Mj, Parsonnet J. J Clin Invest 94:4-8, 1994.
2. Correa P. N Engl J Med 325:1170-1171, 1991.
3. Talley y col. J Nat Cancer Instit 83:1734-1739, 1991.
4. Parsonnet y col. N Engl J Med 325:1127-1131, 1991.
5. Nomura y col. N Engl J Med 325:1132-1136, 1991.
6. Forman y col. Int J Cancer 46:608-611, 1990.
7. EUROGAST Study Group Lancet 341:1359-1362, 1993.
8. Asaka y col. Cáncer 73:2691-2694, 1994.
9. Sipponen y col. Scand J Gastroenterol Suppl 196:S3-S6, 1993.
10. Forman y col. BMJ 302:1302-1305, 1991.
11. Correa P. Cancer Res 52:6735-6740, 1992.
12. Taylor DN, Blaser MJ Epidemiologic Rev 13:42-59, 1991.
13. Akopyanz y col. Nucleic Acids Res 20:5137-5142, 1992.
14. Fujimoto y col. J Clin Microbiol 32:331-334, 1994.
15. Prewett y col. Gastroenterol 102:829-833, 1992.
16. Tummuru y col. Infect Immun 61:1799-1809, 1993.
17. Covacci y col. Proc Natl Acad Sci U S A 90:5791-5795, 1993.
18. Crabtree y col. Lancet 338:332-335, 1991.
19. Peek y col. Gastroenterol 1994; (In Press).
20. Cover y col. Infect Immun 58:603-610, 1990.
21. Cover y col. "La proteína asociada a citotoxina (CagA) de 120-128 kDa como marcador para cadenas de Helicobacter pylori ulcerógenas" Abstracto presentado en la Reunión Anual de la Asociación Americana de Gastroenterología, Nueva Orleans, Luisiana, Mayo de 1994.
22. Dooley y col. N Engl J Med 321:1562-1566, 1989.
23. Cover y col. J Clin Invest 90:913-918, 1992.
24. Peek RM, Jr. J Clin Microbiol 1994;
25. Pérez-Pérez y col. Ann Intern Med 109:11-17, 1988.
26. Studier y col. J Mol Biol 189:113-130, 1986.
27. Baier y col. Biotechniques 17:94-99, 1994.
28. Parsonnet y col. Gastroenterol 102:41-46, 1992.
29. Breslow y col. Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer 247-276, 1980.
30. Harrell FE, Jr. The PHGLM procedure, in Joyner SP (ed): SUGI supplemental library user's guide. Cary, NC, SAS Institute; 1983:267-294.
31. Walter S. Int J Epidemiol 7:175-182, 1978.
32. ROC
33. Fox y col. American Society for Microbiology, Washington, DC.
34. Worth y col. J Chronic Dis 23:389-397, 1970.
35. Crabtree y col. Journal of Clinical Pathology 47:61-66, 1994.
36. Hirai y col. Int J Cancer 56:56-60, 1994.
37. Sipponen P, Lauren: Scand J Gastroenterol 29:336-340, 1994.
38. Sipponen y col. J Gastroenterol Hepatol 6:244-248, 1991.
39. Leunk y col. J. Med. Microbiol. 26:93-99, 1988.
40. Figura y col. J. Clin. Microbiol. 27:225-226, 1988.
41. Cover y Blaser J. Biol. Chem. 267:10570-10575, 1992.
42. Apel y col. Zbl. Bakt. Hyg. A. 268:217-276, 1988.
43. Gerstenecker y col. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11(7):595-601, 1992.
44. Kunkel y col. Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987
45. Brake y col., 1984.
46. Harlow y Lane, Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York, 1988
47. Donnenberg y Kaper Infect. Immun. 4310-4317, 1991.
48. Arnon, R. (Ed.) Synthetic Vaccines I:83-92, CRC Press, Inc., Boca Ratón, Florida, 1987.
49. Birnboim y Doly (Nucleic Acids. Res., 7:1513-1523, 1979)
50. Sambrook y col. Molecular cloning: A Laboratory Manual, 1989.
51. Sanger y col. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 71:1342-1346.32, 1977.
52. Hawley y McClure Nucleic Acids Res. 11:2237-2255, 1983.
53. Blaser y Gotsclich J. Biol. Chem. 265:14529-14535, 1990.
54. Short y col. Nucleic Acids Res., 16:7583-7600, 1988.
55. Blaser y col. Infect. Immun., 42:276-284, 1983.
56. Oakley y col. (Anal. Biochem. 105:361-363, 1980).
57. Feinberg y Bogelstein Anal. Biochem. 132:6-13, 1983.
58. Montefiori y col. J. Clin. Microbiol. 26:231-235, 1988.
59. Cover y col. Infect. Immun. 59:1264-1270, 1991.
60. Labigne-Roussel y col. J. Bacteriol., 170:1704, 1988.
61. Ferrero y col. J. Bacteriol., 174:4212, 1992.
62. Hiratsuka y col. Mol. Gen. Genet. 217:185-194, 1989.
63. Rodermel y Bogorad Genetics, 116:127-139, 1987.
64. Forsburg y Guarente Genes Dev. 3:1166-1178, 1989.
65. Hudspeth y col. Cell 30:617-626, 1982.
66. Ju y col. Mol. Cell. Biol. 10:5226-5234, 1990.
67. O'Hara y col. Nucleic Acids Res. 16:10133-10170, 1988.
68. Rhode y col. Genes Dev. 3:1926-1939, 1989.
69. Tanaka y col. Mol. Cell. Biol. 9:757-768, 1989.
70. Toda y col. Genes Dev. 2:517-527, 1988.
71. Stahl y col. Nucleic Acids Res. 14:3089-3102, 1986.
72. Salmeron y Johnston Nucleic Acids Res. 14:7767-7781, 1986.
73. Gaber y col. Mol. Cell. Biol. 8:2848-2859, 1989.
74. Trimmer y col. Neutrol 3:33-49, 1989.
75. Ferretti y col. Proc. Natl. Acad. Sci. 82:599-603, 1986.
76. Wosnick y col. Gene 76:153-160, 1989.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:COVER, TIMOTHY L.
\hskip3.8cm
BLASER, MARTIN J. 
\hskip3.8cm
HARRY KLEANTHOUS 
\hskip3.8cm
TUMMURU, MURALI K.R. 
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: EL GEN tagA Y PROCEDIMIENTOS PARA DETECTAR LA PREDISPOSICIÓN A LA ÚLCERA PÉPTICA Y EL CARCINOMA GÁSTRICO.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DOMICILIO PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: NEEDLE & ROSENBERG, P.C.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 127 Peachtree Street, Suite 1200
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Atlanta
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: Georgia
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: EEUU
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 30303
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE DEL ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Versión #1,0, Versión #1,25.
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
DATOS ACTUALES DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE ABOGADO/ AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: SPRATT, GWENDOLYN D.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 36.016
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/ NÚMERO DE EXPEDIENTE: 2200,030
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 404/688-0770
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: 404/688-9880
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 3648 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Helycobacter pylori 
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/ CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1072..3648
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
9
10
11
12
13
14 
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 859 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
15
16
17
18 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUd: 4821 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
SITUACIÓN: 1072..4614
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
19
20
21
22
23
24
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO:4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1181 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID NO:4:
26
27
28
29
30

Claims (7)

1. Un ácido nucleico aislado que codifica un fragmento antigénico de Helicobacter pylori en el que el antígeno se asocia con la úlcera péptica, formado por los nucleótidos 1921 a 3648 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el listado de secuencias como SEC ID NO:1.
2. Un polipéptido antigénico purificado codificado por el ácido nucleico de la reivindicación 1.
3. Un procedimiento para detectar la presencia de una cadena de Helicobacter pylori que posee un antígeno de 120-128 kilodalton comprendiendo los nucleótidos 1921 a 3648 contenidos en la secuencia de nucleótidos definida en el listado de secuencias como SEC ID NO:1 en un sujeto, comprendiendo las etapas de:
a.
poner en contacto una muestra que contiene anticuerpo del sujeto con una cantidad detectable del polipéptido de la reivindicación 2;
b.
detectar la unión del polipéptido y el anticuerpo, cuya reacción indica la presencia de la cadena de Helicobacter pylori.
4. Un procedimiento para determinar la predisposición a la úlcera péptica en un sujeto, comprendiendo las etapas de:
a.
poner en contacto una muestra que contiene el anticuerpo del sujeto con una cantidad detectable del polipéptido de la reivindicación 2;
b.
detectar la unión del polipéptido y el anticuerpo, cuya unión indica una predisposición del sujeto a la úlcera péptica.
5. Un procedimiento para determinar la predisposición al carcinoma gástrico en un sujeto, comprendiendo las etapas de:
a.
poner en contacto una muestra que contiene el anticuerpo del sujeto con una cantidad detectable del polipéptido de la reivindicación 2;
b.
detectar la unión del polipéptido y el anticuerpo, cuya unión indica una predisposición del sujeto al carcinoma gástrico.
6. Un procedimiento in vitro para detectar la presencia de Helicobacter pylori asociada con la úlcera péptica en un sujeto, comprendiendo la detección de la presencia del ácido nucleico de la reivindicación 1.
7. El polipéptido de la reivindicación 2 en un vehículo farmacéuticamente aceptable.
ES95936850T 1994-09-30 1995-09-29 Fragmento antigenico del gen taga y procedimiento para detectar una predisposicion a las ulceras gastroduodenales y a los carcinomas gastricos. Expired - Lifetime ES2231792T3 (es)

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MX (1) MX9702335A (es)
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NZ (1) NZ295297A (es)
PL (1) PL319441A1 (es)
WO (1) WO1996010639A2 (es)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3630093A (en) * 1992-03-02 1993-10-05 Biocine S.P.A. Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics
US7141244B1 (en) * 1992-03-02 2006-11-28 Chiron Srl Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics
US5733740A (en) * 1992-10-13 1998-03-31 Vanderbilt University Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration and gastric carcinoma
US6290962B1 (en) 1992-11-03 2001-09-18 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
US5972336A (en) * 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
ATE229978T1 (de) * 1994-07-01 2003-01-15 Chiron Corp Helicobacter proteine und impstoffe
ES2283012T3 (es) * 1996-01-04 2007-10-16 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Bacterioferritina de helicobacter pylori.
WO1998021225A1 (en) * 1996-11-14 1998-05-22 Merieux Oravax Helicobacter polypeptides and corresponding polynucleotide molecules
US6902903B1 (en) * 1996-12-19 2005-06-07 Chiron Corporation Helicobacter pylori diagnostics
TWI237695B (en) * 1999-12-14 2005-08-11 Joy Biomedical Corp Helicobacter pylori antigens in blood
EP1423142A1 (en) * 2001-08-31 2004-06-02 Chiron SRL. Helicobacter pylori vaccination with a combination of caga, vaca and nap proteins
FI118061B (fi) * 2001-09-24 2007-06-15 Beanor Oy Menetelmä ja bioanturi analyysiä varten
WO2003060121A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to gastric specific genes and proteins
FI115166B (fi) * 2001-12-31 2005-03-15 Biofons Oy Diagnostisia menetelmiä
CN1622997A (zh) * 2002-03-26 2005-06-01 北京大学临床肿瘤学院 检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的方法及其用途
TWI276631B (en) * 2002-09-12 2007-03-21 Avanir Pharmaceuticals Phenyl-aza-benzimidazole compounds for modulating IgE and inhibiting cellular proliferation
US20040142379A1 (en) 2003-01-16 2004-07-22 Carlsberg Research Laboratory Affinity fishing for ligands and proteins receptors
US8029777B2 (en) 2004-08-13 2011-10-04 Marshall Barry J Helicobacter system and uses thereof
CN102078622A (zh) 2004-08-13 2011-06-01 巴里.J.马沙尔 细菌递送系统
EP1853914B1 (en) * 2005-01-25 2015-04-22 The Johns Hopkins University Plasmodium diagnostic assay

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5262156A (en) * 1991-08-12 1993-11-16 Hycor Biomedical, Inc. Antigenic compositions and their use for the detection of Helicobacter pylori
AU3630093A (en) * 1992-03-02 1993-10-05 Biocine S.P.A. Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics
US5733740A (en) * 1992-10-13 1998-03-31 Vanderbilt University Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration and gastric carcinoma
US5403924A (en) * 1992-10-13 1995-04-04 Vanderbilt University Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration

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