CZ96697A3 - Isolated nucleic acid encoding heliobacter pylori antigen, vector in which it is comprised, purified antigenic preparation being encoded thereby, detection method of the heliobacter pylori strain presence, method of determining pre-diathesis for peptic ulcer, method of determining pre-diathesis for stomach carcinoma, heliobacter pylori mutant and heliobacter pylori strain - Google Patents

Isolated nucleic acid encoding heliobacter pylori antigen, vector in which it is comprised, purified antigenic preparation being encoded thereby, detection method of the heliobacter pylori strain presence, method of determining pre-diathesis for peptic ulcer, method of determining pre-diathesis for stomach carcinoma, heliobacter pylori mutant and heliobacter pylori strain Download PDF

Info

Publication number
CZ96697A3
CZ96697A3 CZ97966A CZ96697A CZ96697A3 CZ 96697 A3 CZ96697 A3 CZ 96697A3 CZ 97966 A CZ97966 A CZ 97966A CZ 96697 A CZ96697 A CZ 96697A CZ 96697 A3 CZ96697 A3 CZ 96697A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
lys
asn
aaa
leu
ser
Prior art date
Application number
CZ97966A
Other languages
English (en)
Inventor
Timothy L Cover
Martin J Blaser
Harry Kleanthous
Murali K R Tummuru
Original Assignee
Univ Vanderbilt
Oravax Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Vanderbilt, Oravax Inc filed Critical Univ Vanderbilt
Publication of CZ96697A3 publication Critical patent/CZ96697A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/205—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Campylobacter (G)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
    • G01N2333/205—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Campylobacter (G)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
    • G01N2469/20—Detection of antibodies in sample from host which are directed against antigens from microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/06—Gastro-intestinal diseases
    • G01N2800/062—Gastritis or peptic ulcer disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/50—Determining the risk of developing a disease

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)

Description

Isolovaná nukleová kyselina kódujíc^ antígfen Éellčobcřčterjayló-i ri, vektor, který ji obsahuje, vyčištěný antigenni_polype.ptid,i který je jí kódován, způsob detegování přítomnosti kmene Helicobacter pylori, způsob určení predisposice pro peptický vřed, způsob určení predisposice pro karcinom žaludku, mutant Helico-. bacter pylori a kmen Helicobacter pylori
Oblast techniky
Tento vynález se týká isolované nukleové kyseliny kódující antigen Helicobacter pylori, vektoru, který ji obsahuje, vyčištěného antigenního polypeptidu, který je jí kódován, způsobu detegování přítomnosti kmene Helicobacter pylori, způsobu určení predisposice pro peptický vřed, způsobu určení predisposice pro karcinom žaludku, mutantu Helicobacter pylori a kmene Helicobacter pylori.
Dosavadní stav techniky
Helicobacter pylori je v dnešní době rozpoznán jako důležitý pathogen u lidí, protože chronická gastritida, kterou způsobuje, je rizikovým faktorem pro vývoj peptického vředového onemocnění. Existuje také stále se zvyšující důkaz, že přetrvávající infekce Helicobacter pylori je rizikovým faktorem pro vyvinutí gastrického adenokarcinomu (Blaser M.J., Parsonnet J.: J. Clin. Invest. 94. 4 (1994), Correa P.: N. Engl. J. Med. 325, 1170 (1991).), zvláště distálního žaludku (Talley a spol.: J. Nat. Cancer Instit. 83, 1734 (1991), Parsonnet a spol.: N. Engl. J. Med. 325. 1127 (1991), Nomura a spol.: N. Engl. J. Med. 325. 1132 (1991).). Tento důkaz pochází hlavně z epidemiologických zkoumání (Forman a spol.: Int. J. Cancer 46. 608 (1990), EUROGAST Study Group: Lancet 341. 1359 (1993), Asaka a spol.: Cancer 73., 2691 (1994), Sipponen a spol.: Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 196. S3-S6 (1993).), včetně kontrolních studií hnízdových případů (Parsonnet a spol.: N. Engl. J. Med. 325. 1127 (1991), Nomura a spol.: N. Engl. J. Med. 325. 1132 (1991), Forman a spol.: BMJ 302, 1302 (1991).). Molekulární a pathologické studie podporují jeho biologickou platnost (Correa
P.: Cancer Res. 52, 6735 (1992).). I když u všech infikovaných osob se v podstatě vyvinula gastritida, klinické důsledky infekce H. pylori jsou však rozpoznávány pouze u menší části osob. Zatímco H. pylori infekce velice převládá u pacientů s rakovinou žaludku, u většiny osob infikovaných H. pylori se nikdy tento novotvar nevyvinul (Taylor D.N., Blaser M.J.: Epidemiologie Rev. 13, 42 (1991).). Je tedy důležité identifikovat jiné faktory, které přesněji určují riziko osob infikovaných
H. pylori.
Kmeny H. pylori jsou na molekulární úrovni velice rozdílné (Akopyanz a spol.: Nucleic Acids Res. 20, 5137 (1992), Fujimot a spol.: J. Clin. Microbiol. 32., 331 (1994) a Prewett a spol.: Gastroenterol. 102, 829 (1992).), ale většina fenotypických vlastností je dobře uchována. Navíc mohou být jednotlivci infikováni více než jedním kmenem (Parsonnet a spol.: N. Engl. J. ♦.
Med. 325. 1127 (1991), Prewett a spol.: Gastroenterol. 102. 829 (1992) .) . Je tedy důležité isolovat příslušné vlastnosti kmenů H. pylori, které mohou ovlivňovat riziko vývoje rakoviny žaludku. a
Běžně jsou známy dvě výjimky fenotypové homogenity. Za prvé, asi 50 až 60 % kmenů H. pylori produkuje vakuolizující toxin in vitro (Cover a spol.: Infect. Immun. 58, 603 (1990) a Leunk a spol.: J. Med. Microbiol. 26, 93 (1988).) a tato produkce toxinu souvisí s peptickým vředem (Figura a spol.: J.
Clin. Microbiol. 27, 225 (1988).). Za druhé, existuje heterogenita v tom, jestli je produkován antigenní protein migrující při molekulové hmotnosti přibližně 120 000 až 128 000 na redukující SDS-PAGE (dodecylsulfát sodný-polykralamidový gel) (Cover a spol.: Infect. Immun. 58, 603 (1990).). Nedávná měření tohoto proteinu (na něž se odkazuje zaměnitelně jako na TagA nebo CagA) poskytla molekulární hmotnosti kolem 140 000. I když toxická aktivita je zprostředkována proteinem o molekulové hmotnosti 87 000 (Cover a spol.: J. Clin. Invest. 90, 913 (1992) a Cover a Blaser: J. Biol. Chem. 267, 10570 (1992).), samotná produkce toxinu souvisí s přítomností antigenního proteinu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 (Cover a spol.:
Infect. Immun. 58, 603 (1990).). Předcházející studie zjistili, že asi 60 až 80 % isolátů H. pylori exprimuje protein o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 (Cover a spol.: Infect. Immun. 58, 603 (1990), Apel a spol.: Zbl. Bakt. Hyg. A. 268. 217 (1988).). Zejména přítomnost protilátek o molekulové hmotnosti
120 000 až 128 000 buď v seru nebo v mukózních exktraktech souvisí s přítomností peptického vředu (Crabtree a spol.: Lancet
338 332 (1991), Cover a spol.: Infect. Immun. 58, 603 (1990).).
Až dosud je málo známo o souvislostech mezi produkcí toxinu, vředy nebo karcinomem žaludku a antigenem o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000. Je tomu tak proto, že dříve neexistovala možnost dále charakterizovat antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 po jeho počátečním zviditelnění.
V předcházejících studiích byl antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 zviditelněn Westernovým blotováním, ale žádná další charakterizace nebyla ve skutečnosti provedena (Cover a spol.: Infect. Immun. 58, 603 (1990).) Na rozdíl od í snadnosti, s jakou byl tento antigen zviditelněn Westernovým blotováním, pás o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 nebyl snadno zviditelněn jinými způsoby, jako je obarvení stříbrem (obrázek 2 v práci Covera a spol.: Infect. Immun. 58. 603 (1990) . Vysvětlením tohoto jevu je to, že tento antigen je přítomen pouze v malých množstvích vzhledem k jiným H. pylori proteinům. Nedávno Gerstenecker a spol. (Gerstenecker a spol.:
Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 11(7). 595 (1992).) popsali isolaci proteinu o molekulové hmotnosti přibližně 120 000 z H. pylori, která reaguje s positivním lidským kontrolním šerem. Ve skutečnosti však nebyla provedena žádná charakterizace (jako je N-koncové sekvenování) tohoto antigenu.
Přes problémy s čištěním poskytuje předložený vynález klonování a sekvenci genu a odvozené aminokyselinové sekvence kódující protein o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000. Tato data byla získána alternativní metodologií, která nevyžaduje čištění antigenu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000. Tento vynález poskytuje také diagnostické, terapeutické a profylaktické prostředky a způsoby.
Imunoblotové studie předpokládají, že osoby infikované tagA* kmeny mají vyšší stupně žaludečního zánětu a poškození epitelových buněk než osoby, od kterých byly isolovány kmeny tagA' (Crabtree a spol.: Lancet 338 332 (1991).). Osoby infikované kmeny tagA* H. pylori měly při biopsii žaludku zvýšenou expresi IL-Ια, IL-lB a IL-8 při srovnání s neinfikovanými osobami a pacienty infikovanými kmeny tagA* (Peek a spol.: Gastroenterol. (1994, v tisku).). Jak intenzita zánětu tak epitelové poškození může být zahrnuto v patogenesi rakoviny žaludku (Blaser M.J., Parsonnet J.: J. Clin. Invest. 94, 4 (1994).). Existuje tedy potřeba zkoumat v této souvislosti důležitost kmenů H. pylori exprimujících tagA.
Tento vynález vyhovuje těmto potřebám tím, že poskytuje nový serologický test založený na rekombinantním fragmentu tagA a způsob stanovení predisposice k rakovině žaludku.
Podstata vynálezu
Předložený vynález poskytuje isolovanou nukleovou kyselinu, která kóduje antigen Helicobacter pylori o molekulové hmotnosti přibližně 120 000 až 128 000 nebo její antigenní fragment, při čemž tento antigen souvisí s peptickým vředem a karcinomem žaludku. Předložený vynález poskytuje také způsoby detegování přítomnosti kmenu Helicobacter pylori antigenem o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 v subjektu, vyznačující se tím, že obsahuje stupně uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím TagA antigenu nebo jeho fragmentu podle předloženého vynálezu a detegování reakce tohoto fragmentu s protilátkou.
Následuje stručný popis obrázků.
Obrázek 1 ukazuje fyzikální mapy plasmide pMCl, pMC2 a pMC3. Velká šipka pod pMC3 představuje umístění genu tagA a směr transkripce, jak byl stanoven delečními mutacemi a imunoblotováním. Malé šipky představují vlákno a rozsah DNA sekvenované od fragmente odvozených od exonukleasy III - Místa štěpení restrikčními endonukleasami: B, BglII; Ba, BamHI; E, EcoRI; H, HindlII; N, Ndel; S, Sací.
Obrázek 2 ukazuje restrikční mapu pMC3:km použitého při konstrukci mutantu H. pylori. Kazeta km z plasmidu pILL600 byla ligována do místa Ndel pMC3, aby se vytvořil pMC3:km. Šipky znamenají otevřené čtecí oblasti včetně upravené otevřené čtecí oblasti tagA s 2577 páry nukleotide (pn). Restrikčními místy jsou: E, EcoRi; B, BglII; H, HindlII; Ba, BamHI; N, Ndel; S, Sací; Sm, Smál. pMC4 znamená fragment od EcoRi k Sací pMC3 o 2 900 párech nukleotide.
Obrázek 3 ukazuje fyzikální mapy plasmide pMC3, pYB2 a pUT2. Velká šipka pod pUT2 představuje místo tagA genu a směr transkripce, jak byl stanoven delečními mutacemi a imunoblotováním. Místa štěpeni restrikčních endonukleas: B, BglII; Ba, BamHI; E, EcoRi; EV, EcoRV; H, HindlII; N, Ndel; S, Sací; X, Xbal.
Obrázek 4 ukazuje fyzikální mapy DNA fragmente z tagA, který byl použit pro překrytí feze gene. Šipky ukazují směr transkripce. Je označena velikost každého produktu. Čisté plochy znamenají ty plochy genu, které mají opakované oblasti nukleotide a které byly určeny pro exprimování imunogenních epitope tohoto proteinu.
V této části spisu jsou popsány nukleové kyseliny.
Předložený vynález poskytuje isolovanou nukleovou kyselinu kódující antigen o molekulové hmnotnosti 120 000 až 128 000 nebo fragment z H. pylori, která souvisí s peptickým vředem (TagA) . Pojem isolovaná znamená dostatečně oddělená od jiných nukleových kyselin, proteinů a ostatních buněčných složek nalézajících se v přirozeně se vyskytujícím organismu, aby byla užitečná pro klinickou diagnostiku nebo jiný vědecký postup. Nukleová kyselina kódující antigen o molekulové hmotností 120 000 až 128 000 může znamenat přírodní tagA gen, který je specifický pro kmeny H. pylori exprimující antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000. Pojem specifický znamená isolovanou sekvenci, která se nehybridizuje významnou měrou nad pozadí s nukleovými kyselinami z kmenů H. pylori, které neexprimují tento antigen.
Příkladem takové isolované nukleové kyseliny je otevřená čtecí oblast o 3543 pn obsahující nukleotidy 1072 až 4614 obsažené v insertu o 4821 pn sekvence id. č. 3
ATGGGCTGCG CGTAACGAAA AACAGTCGCT TGACCTCTTT TGATGTCATC 50
AGAGATTTTC CAAATATCCG CTATACCTTT GACTCCTAGA GCGCAACCAC 100
CTACGATCGC TAGAACAGAA ATGATCTGAA CCACCAAAGT TTTAGTCTCA 150
GTAATGCCTG ATGCAGGACT GTCGAAAGCC ATTAAAGGAT TGGCTGCTAT 200
CGCTAGCCCT AAAGTTACTA CAACTTTCTT GTAGCTGTCA GTGATTCTTG 250
TAAAAAATTT CATGCGTTTC CTTTCAAATT GAAATCAATC GTTTGAGTAT 300
ATCAAAAAAA AGTATTTTTA TACTATTCAT ACAAGCGCTA CTTTATAATT 350
TAAATCAAAA CCGACGCTTT TGTTTGACAA CTGATATAAT TTAGGAACAA 400
TAAACCTACT TGTCCCAACC ATTTTTCTTT CTCAAGTCAT CGTAGAATTG 450
TAGATCTTTA GGATCTTTGA TGTATTTTTT AATCGTCTCA GGTTGAAACC 500
TAAAAACAAG CAGAAACAAA CCCAAGCTGA TCAGAGTGAG AATAAAGCTC 550
CATTTTAAGC AACTCCATAA ACCACTAAAG AAACTTTTTT TGAGACTCTC 600
TTTGAAAATC TGTCCTATTG ATTTGTTTTC CATTTTGTTT CCCATGCGGA 650
TCACAAACGC TTAATTACAA ATACATACTA TAATAAGTAT GGCACACACA 700
AACCAAACCA TTTTTAGAAC GCTTCATGCA CTCACCTTGC TCCTAACCAT 750
TTCTCCAACC ATCTTTAGCG TTGCATTTGA TTTCTTCAAA AAGGCTCATT 800
TCTTAGTTTC TTTTATTCTT aaaatttttc CATTCTAGCA AATTTTTGTT 850
AATTGTGGGT AAAAATGTGA ATCGTTCCTA GCTTTTAGAC GCTTGCAACG 900
ATCGGACTTT TTTCAATATT AATGAAAAAA TGCCAAATAT TCTAAATATT 950
GTGGTATAGT GATAACGTTC AAAGACACGA ATTGCATACT CAAAGTGTGT 1000
AGTAGTTTTT AGCGGTCTTT GATACCAATA AGATACCGAT AGGTATGAAA 1050
CTAGGTATAG AAGGAGAAAC A ATG Met
CAA CCA CAA ACC GAA GCG GCT
Gin Pro 10 Gin Thr Glu Ala Ala 15
AAT AAT CTT CAA GTA GCT TTT
Asn Asn Leu 25 Gin Val Ala Phe
GCT TCA TAC GAT CCT GAT CAA
Ala Ser Tyr Asp 40 Pro Asp Gin
GAT AGG GAT AAC AGG CAA GCT
Asp Arg Asp Asn Arg 55 Gin Ala
AGG GAA GAA TAC TCC AAT AAA
Arg 65 Glu Glu Tyr Ser Asn 70 Lys
AAG AAT CAG TAT TTT TCA GAC
Lys Asn 80 Gin Tyr Phe Ser Asp 85
TTA ATC AAC AAA GAC AAT CTC
Leu Ile Asn 95 Lys Asp Asn Leu
AAG AGC TTT CAG AAA TTT GGG
Lys Ser Phe Gin Lys Phe Gly
110
ACT AAC GAA ACT Thr Asn Glu Thr ATT GAC CAA Gin 1095
Ile Asp
5
TTT AAC CCG CAG CAA TTT ATC 1137
Phe Asn Pro Gin Gin Phe Ile
20
CTT AAA GTT GAT TLAČ GCT GTC 1179
Leu Lys Val Asp Asn Ala Val
30 35
AAA CCA ATC GTT GAT AAG AAC 1221
Lys Pro Ile Val Asp Lys Asn
45 50
TTT GAG GGA ATC TCG CAA TTA 1263
Phe Glu Gly Ile Ser Gin Leu
60
GCG ATC AAA AAT CCT ACC AAA 1305
Ala Ile Lys Asn pro Thr Lys
75
TTT ATC AAT AAG AGC AAT GAT 1347
Phe Ile Asn Lys Ser Asn Asp
90
ATT GTC GTG GAA TCT TCC ACA 1389
Ile Val Val Glu Ser Ser Thr
100 105
GAT CAG CGT TAC CGA ATT TTC 1431
Asp Gin Arg Tyr Arg Ile Phe
115 120
1473
ACA Thr AGT TGG GTG TCC CAT CAA AAC GAT CCG TCT AAA ATC AAC
Ser Trp Val Ser 125 His Gin Asn Asp Pro 130 Ser Lys Ile Asn
ACC CGA TGC ATC CGA AAT TTT ATG GAA CAT ACC ATA CAA CCC
Thr Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His Thr Ile Gin Pro
135 140 145
CCT ATC CCT GAT GAC AAA GAA AAA GCA GAG TTT TTG AAA TCT
Pro Ile Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu Lys Ser
150 155 160
GCC AAA CAA TCT TTT GCA GGA ATC ATC ATA GGG AAT CAA ATC
Ala Lys Gin Ser Phe Ala Gly Ile Ile Ile Gly Asn Gin Ile
165 170 175
CGA ACG GAT CAA AAA TTC ATG GGC GTG TTT GAT GAA TCC TTG
Arg thr Asp Gin Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu
180 185 190
AAA GAA AGG CAA GAA GCA GAA AAA AAT GGA GGG CCT ACT GGT
Lys Glu Arg Gin Glu Ala Glu Lys Asn Gly Gly Pro Thr Gly
195 200
GGG GAT TGG TTG GAT ATT TTT TTA TCA TTT ATA TTT GAC AAA
Gly Asp Trp Leu Asp Ile Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys
205 210 215
AAA CAA TCT TCT GAT GTC AAA GAA GCA ATC AAT CAA GAA CCA
Lys Gin Ser Ser Asp Val Lys Glu Ala Ile Asn Gin Glu Pro
220 225 230
CTT CCT CAT GTC CAA CCA GAT ATA GCC ACT AGC ACC ACT CAC
Leu Pro His Val Gin Pro Asp Ile Ala Thr Ser Thr Thr His
235 240 245
1515
1557
1599
1641
1683
1725
1767
1809
ΑΤΑ CAA GGC TTA CCG GCT GAA TCT AGG GAT TTG CTT GAT GAA 1851
Ile Gin Gly Leu 250 Pro Pro Glu Ser Arg 255 Asp Leu Leu Asp Glu 260
AGG GGT AAT TTT TCT AAA TTC ACT CTT GGC GAT ATG GAA ATG 1893
Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly Asp Met Glu Met
265 270
TTA GAT GTT GAG GGC GTC GCC GAC ATG GAT CCC AAT TAC AAG 1935
Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro Asn Try Lys
275 280 285
TTC AAT CAA TTA TTG ATT CAC AAT AAC ACT CTG TCT TCT GTG 1977
Phe Asn Gin Leu Leu Ile His Asn Asn The Leu Ser Ser Val
290 295 300
TTA ATG GGG AGT CAT GAT GGC ATA GAA CCT GAA AAA GTT TCA 2019
Leu Met Gly Ser His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val Ser
305 310 315
TTA TTG TAT GCG GGC AAT GGT GGT TTT GGA GCC AAG CAC GAT 2061
Leu Leu Tyr Ala Gly Asn Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp
320 325 330
TGG AAC GCC ACC GTT GGT TAT AAA GAC CAA CAA GGT AAC AAT 2103
Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys Asp Gin Gin Gly Asn Asn
335 340
GTG GCT ACA ATA ATT AAT GTG CAT ATG AAA AAC GGC AGT GGC 2145
Val Ala Thr Ile Ile Asn Val His Met Lys Asn Gly Ser Gly
345 350 355
TTA GTC ATA GCA GGT GGT GAG AAA GGG ATT AAC AAC CCT AGT 2187
Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn Pro Ser
360 365 370
ΤΤΤ ΤΑΤ CTC Leu 375 TAC AAA GAA GAC CAA CTC ACA GGC TCA CAA CGA 2229
Phe Tyr Tyr Lys Glu Asp Gin 380 Leu Thr Gly Ser Gin 385 Arg
GCA TTG AGT CAA GAA GAG ATC CAA AAC AAA ATA GAT TTC ATG 2271
Ala Leu Ser Gin Glu Glu Ile Gin Asn Lys Ile Asp Phe Met
390 395 400
GAA TTT CTT GCA CAA AAC AAT GCT AAA TTA GAC AGC TTG AGC 2313
Glu Phe Leu Ala Gin Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser
405 410
GAG AAA GAG AAA GAA AAA TTC CGA AAT GAG ATT AAG GAT TTC 2355
Glu Lys Glu Lys Glu Lys Phe Arg Asn Glu Ile Lys Asp Phe
415 420 425
CAA AAA GAC TCT AAG CCT TAT TTA GAC GCC CTA GGG AAT GAT 2397
Gin Lys Asp Ser Lys Pro Tyr Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp
430 435 440
CGT ATT GCT TTT GTT TCT AAA AAA GAC CCA AAA CAT TCA GCT 2439
Arg Ile Ala Phe Via Ser Lys Lys Asp Pro Lys His Ser Ala
445 450 455
TTA ATT ACT GAG TTT AAT AAG GGG GAT TTG AGC TAC ACT CTC 2481
Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly Asp Leu Ser Tyr Thr Leu
460 465 470
AAA GTT ATG GGA AAA AAG CAG ATA AAG GCT TTA GAT AGG GAG 2523
Lys Val Met Gly Lys Lys Gin Ile Lys Ala Leu Asp Arg Glu
475 480
AAA AAT GTC ACT CTT CAA GGT AAC CTA AAA CAT GAT GGC GTG 2565
Lys Asn Val Thr Leu Gin Gly Asn Leu Lys His Asp Gly Val
485 490 495
ATG TTT Met Phe GTT AAT TAT TCT AAT TTC AAA TAC ACC AAC GCC Ala TCC Ser 2607
Val Asn Tyr Ser Asn Phe 505 Lys Tyr Thr Asn 510
500
AAG AGT CCC AAT AAG GGT GTA GGC GTT ACG AAT GGC GTT TCC 2649
Lys Ser Pro Asn Lys Gly Val Gly Val thr Asn Gly Val Ser
515 520 525
CAT TTA GAA GCA GGC TTT AGC AAG GTG GCT GTC TTT AAT TTG 2691
His Leu Glu Ala Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu
530 535 540
GCT AAT TTA AAT AAT CTC GCT ATC ACT AGT GTC GTA AGG CGG 2733
Pro Asn Leu Asn Asn Leu Ala Ile Thr Ser Val Val Arg Arg
545 550
GAT TTA GAG GAT AAA CTA ATC GCT AAA GGA TTG TCC CCA CAA 2775
Asp leu Glu Asp Lys Leu Ile Ala Lys Gly Leu Ser Pro Gin
555 560 565
GAA GCT AAT AAG CTT GTC AAA GAT TTT TTG AGT AGC AAC AAA 2817
Glu Ala Asn Lys Leu Val Lys Asp Phe Leu Ser Ser Asn Lys
570 575 580
GAA TTG GTT GGA AAA GCT TTA AAC TTC AAT AAA GCT GTA GCT 2859
Glu Leu Val Gly Lys Ala Leu Asn Phe Asn Lys Ala Val Ala
585 590 595
GAA GCT AAA AAC ACA GGC AAC TAT GAC GAG GTG AAA CGA GCT 2901
Glu Ala Lys Asn Thr Gly Asn Tyr Asp Glu Val Lys Arg Ala
600 605 610
CAG AAA GAT CTT GAA AAA TCT CTA AAG AAA CGA GAG CAT TTG 2943
Gin Lys Asp Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu
615 620
GAG Glu 625 AAG GAT GTA GCG AAA AAT TTG GAG AGC AAA AGC GGC AAC 2985
Lys Asp Val Ala Lys 630 Asn Leu Glu Ser Lys 635 Ser Gly Asn
AAA AAT AAA ATG GAA GCA AAA GCT CAA CGT AAC AGC CAA AAA 3027
Lys Asn Lys Met Glu Ala Lys Ala Gin Ala Asn Ser Gin Lys
640 645 650
GAT GAG ATT TTT GCG TTG ATC AAT AAA GAG GCT AAT AGA GAC 3069
Asp Glu Ile Phe Ala Leu Ile Asn Lys Glu Ala Asn Arg Asp
655 660 665
GCA AGA GCA ATC GCT TAC GCT CAA AAT CTT AAA GGC ATC AAA 3111
Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala Gin Asn Leu Lys Gly Ile Lys
670 675 680
AGG GAA TTG TCT GAT AAA CTT GAA AAT ATC AAC AAG GAT TTG 3153
Arg Glu leu Ser Asp Lys Leu Glu Asn Ile Asn Lys Asp Leu
685 690
AAA GAC TTT AGT AAA TCT TTT GAT GGA TTC AAA AAT GGC AAA 3195
Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe Lys Asn Gly Lys
695 700 705
AAT AAG GAT TTC AGC AAG GCA GAA GAA ACG CTA AAA GCC CTT 3237
Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Lys Ala Leu
710 715 720
AAA GGC TCG GTG AAA GAT TTA GGT ATC AAT CCG GAA TGG ATT 3279
Lys Gly Ser Val Lys Asp Leu Gly Ile Asn Pro Glu Trp Ile
725 730 735
TCA AAA GTT GAA AAC CTT AAT GCA GCT TTG AAT GAA TTC AAA 3321
Ser Lys Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe Lys
740 745 750
AAT Asn GGC AAA AAT AAG GAT TTC AGC AAG GTA ACG CAA GCA AAA 3363
Gly Lys Asn Lys 755 Asp Phe Ser Lys Val 760 Thr Gin Ala Lys
AGC GAC CAA GAA AAT TCC ATT AAA GAT GTG ATC ATC AAT CAA 3405 •i
Ser Asp Gin Glu Asn Ser Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gin
765 770 775 i
AAG ATA ACG GAT AAA GTT GAT GAA CTC AAT CAA GCG GTA TCA 3447
Lys Ile Thr Asp Lys Val Asp Glu Leu Asn Gin Ala Val Ser
780 785 790
GTG GCT AAA ATA GCG TGC GAT TTC AGT GGG GTA GAG CAA GCG 3489 1-
Val Ala Lys Ile Ala Cys Asp Phe Ser Gly Val Glu Gin Ala ;
795 800 805 I
TTA GCC GAT CTC AAA AAT TTC TCA AAG GAG CAA TTG GCT CAA 3531 i
Leu Ala Asp Leu Lys Asn Phe Ser Lys Glu Gin Leu Ala Gin {
810 815 820
CAA GCT CAA AAA AAT GAA AGT TTC AAT GTT GGA AAA TCT GAA 3573 ♦
Gin Ala Gin Lys Asn Glu Ser Phe Asn Val Gly Lys Ser Glu i
825 830
ATA TAC CAA TCC GTT AAG AAT GGT GTG AAC GGA ACC CTA GTC 3615
Ile Tyr Gin Ser Val Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Leu Val
835 840 845
GGT AAT GGG TTA TCT GGA ATA GAG GCC ACA GCT CTC GCC AAA 3657
Gly Asn Gly Leu Ser Gly Ile Glu Ala Thr Ala Leu Ala Lys
850 855 860
AAT TTT TCG GAT ATC AAG AAA GAk TTG AAT GAG AAA TTT AAA 3699
Asn Phe Ser Asp Ile Lys Lys Glu Leu Asn Glu Lys Phe Lys
865 870 875
AAT TTC AAT AAC AAT AAC AAT AAT GGT CTC AAA AAC GGC GGA 3741
Asn Phe Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Leu Lys Asn Gly Gly
880 885 890
GAA CCC ATT TAT GCT CAA GTT AAT AAA AAG AAA ACA GGA CAA 3783
Glu Pro Ile Tyr Ala Gin Val Asn Lys Lys Lys Thr Gly Gin
895 900
GTA GCT AGC CCT GAA GAA CCC ATT TAT GCT CAA GTT GCT AAA 3825
Val Ala Ser Pro Glu Glu Pro Ile Tyr Ala Gin Val Ala Lys
905 910 915
AAG GTA ACT AAA AAA ATT GAC CAA CTC AAT CAA GCA GCG ACA 3867
Lys Val Thr Lys Lys Ile Asp Gin Leu Asn Gin Ala Ala Thr
920 925 930
AGT GGT TTC GGT GGT GTA GGG CAA GCG GGC TTC CCT TTG AAA 3909
Ser Gly Phe Gly Gly Val Gly Gin Ala Gly Phe Pro Leu Lys
935 940 945
AGG CAT GAT AAA GTT GAA GAT CTC AGT AAG GTA GGG CGA TCA 3951
Arg His Asp Lys Val Glu Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser
950 955 960
GTT AGC CCT GAA CCC ATT TAT GCT ACA ATT GAT GAT CTC GGT 3993
Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly
965 970
GGG TCT TTC CCT TTG AAA AGG CAT GAT AAA GTT GAT GAT CTC 4035
Gly Ser Phe Pro Leu Lys Arg His Asp Lys Val Asp Asp Leu
975 980 985
AGT AAG GTA GGG CTT TCA AGG AAT CAA GAA TTG ACT CAG AAA 4077
Ser Lys Val Gly Leu Ser Arg Asn Gin Glu Leu Thr Gin Lys
990 995 1000
ATT Ile GAC AAT Asp Asn 1005 CTC Leu AGT Ser CAA Gin GCG GTA Ala Val 1010 TCA Ser GAA Glu GCT Ala AAA GCA Lys Ala 1015 GGT Gly 4119 i
TTT TTT GGC AAT CTA GAA CAA ACG ATA GAC AAG CTC AAA GAT 4161 A
Phe Phe Gly Asn Leu Glu Gin Thr Ile Asp Lys Leu Lys Asp
1020 1025 1030 %
TTT ACA AAA AAC AAT CCT GTG AAT CTA TGG GCT GAA AGC GCA 4203 ▼· f
Phe Thr Lys Asn Asn Pro Val Asn Leu Trp Ala Glu Ser Ala ť
1035 1040
AAA AAA GTG CCT GCT AGT TTG TCA GCG AAA CTA GAC AAT TAC 4245 *
Lys Lys Val Pro Ala Ser Leu Ser Ala Lys Leu Asp Asn Tyr ♦
1045 1050 1055 i 1
GCT ACT AAC AGC CAC ACA CGC ATT AAT AGC AAT ATC CAA AAT 4287 i *
Ala Thr Asn Ser His Thr Arg Ile Asn Ser Asn Ile Gin Asn
1060 1065 1070
GGA GCG ATC AAT Gkk AAA GCG ACC GGC ACT GAA CGG CAA AAA 4329 a
Gly Ala Ile Asn Glu Lys Ala Thr Gly Thr Glu Arg Gin Lys 4
1075 1080 1085
AAC CCT GAG TGG CTC AAA CTC GTG AAT GAT AAG ATC GTT GCG 4371 ί
Asn Pro Glu Trp Leu Lys Leu Val Asn Asp Lys Ile Val Ala
1090 1095 1100
CAT AAT GTG GGA AGC GTT CCT TTG TCA GAG TAT GAT AAC ATT 4413
His Asn Val Gly Ser val Pro Leu Ser Glu Tyr Asp Asn Ile
1105 1110
GGA TTC AGC CAA AAG AAT ATG AAG GAT TAT TCT GAT TCG TTC 4455 í
Gly Phe Ser Gin Lys Asn Met Lys Asp Tyr Ser Asp Ser Phe
1115 1120 1125
AAG TTT TCC ACC AAG TTG AAC AAT GCC GTA AAA GAC ATT AAG 4497 Lys Phe Ser Thr Lys Leu Asn Asn Ala Val Lys Asp Ile Lys
1130 1135 1140
TCT GGC TTT ACG CAA TTT TTA GCC AAT GCA TTT TCT ACA GGA 4539
Ser Gly Phe Thr Gin Phe Leu Ala Asn Ala Phe Ser Thr Gly
1145 1150 1155 i
TAT TAC TCC ATG GCG AGA GAA AAT GCG GAG CAT GGA ATC AAA 4581
Tyr Tyr Ser Met Ala Arg Glu Asn Ala Glu His Gly Ile Lys ♦ í
1160 1165 1170
AAT GCT AAT ACA AAA GGT GGT TTC CAA AAA TCT TAAAGGATTA 4624 4
Asn Ala Asn Thr Lys Gly Gly Phe Gin Lys Ser
1175 1180 t
í
AGGAACACCA
AACTTAAAAT
CTGCATAGAT
AAATTTGATT
AAAACGCAAA
ATCCCGACAG
ATTTCCTACC
GTGCTAGTGG
AACCACCTTG
ACACTAACGA
CCAAAAAGAC
GTTCGTGCTT
CTAAAAGCAA
AAGGCTTTGT
TTAACCCTTT
TATAGTGCGG
GGGGTTTTTT 4674 TGTTTAAAGT 4724 GCTTAAAATT 4774 AATTGGG 4821 (sekv. id. č. 3).
Buněčná linie obsahující plasmid genu tagA plné délky je uložena v Americké sbírce typů kultur (1230 Parklawn Drive,
Rockville, Md. 20852) pod ATCC č. 69273. Tato isolovaná nukleová kyselina specifická pro H. pylori může být použita pro detekci H. pylori exprimující antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 takovými způsoby, jako je polymerasová řetězová reakce (PCR), ligasová řetězová reakce a hybridizace, jak bude dále popsáno. Tato nukleové kyselina nebo její fragmenty mohou být ve vhodném expresním vektoru a hostiteli a mohou se použít pro výrobu proteinu TagA plné délky, jak zde bude » dále popsáno. \
Příkladem nukleové kyseliny kódující antigenní fragment antigenu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 je uříznutá
GCC AAA CAA TCT TTT GCA GGA Gly ATC ATC ATA GGG AAT CAA ATC 1599
Ala Lys Gin 165 Ser Phe Ala Ile 170 Ile Ile Gly Asn Gin 175 Ile
CGA ACG GAT CAA AAA TTC ATG GGC GTG TTT GAT GAA TCC TTG 1641
Arg thr Asp Gin Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu
180 185 190 i
AAA GAA AGG CAA GAA GCA GAA AAA AAT GGA GGG CCT ACT GGT 1683
Lys Glu Arg Gin Glu Ala Glu Lys Asn Gly Gly Pro Thr Gly i
195 200
GGG GAT TGG TTG GAT ATT TTT TTA TCA TTT ATA TTT GAC AAA 1725 i
Gly Asp Trp Leu Asp Ile Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys
205 210 215 t í
AAA CAA TCT TCT GAT GTC AAA GAA GCA ATC AAT CAA GAA CCA 1767 » *
Lys Gin Ser Ser Asp Val Lys Glu Ala Ile Asn Gin Glu Pro 5
220 225 230 *
CTT CCT CAT GTC CAA CCA GAT ATA GCC ACT AGC ACC ACT CAC 1809 ·-. *
Leu Pro His Val Gin Pro Asp Ile Ala Thr Ser Thr Thr His «
235 240 245
ATA CAA GGC TTA CCG CCT GAA TCT AGG GAT TTG CTT GAT GAA 1851
Ile Gin Gly Leu Pro Pro Glu Ser Arg Asp Leu Leu Asp Glu
250 255 260
AGG GGT AAT TTT TCT AAA TTC ACT CTT GGC GAT ATG GAA ATG 1893
Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly Asp Met Glu Met
265 270
TTA GAT GTT GAG GGC GTC GCC GAC ATG GAT CCC AAT TAC AAG 1935
Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro Asn Try Lys
275 280 285
otevřená čtecí oblast o 2577 párech nukleotide obsahující nukleotidy 1072 až 3648 obsažené v insertu o 3648 párech nukleotidů sekv. id. č. 1
ATGGGCTGCG CGTAACGAAA AACAGTCGCT TGACCTCTTT TGATGTCATC 50
AGAGATTTTC CAAATATCCG CTATACCTTT GACTCCTAGA GCGCAACCAC 100
CTACGATCGC TAGAACAGAA ATGATCTGAA CCACCAAAGT TTTAGTCTCA 150
GTAATGCCTG ATGCAGGACT GTCGAAAGCC ATTAAAGGAT TGGCTGCTAT 200 $
CGCTAGCCCT AAAGTTACTA CAACTTTCTT GTAGCTGTCA GTGATTCTTG 250 ii
TAAAAAATTT CATGCGTTTC CTTTCAAATT GAAATCAATC GTTTGAGTAT 300
ATCAAAAAAA AGTATTTTTA TACTATTCAT ACAAGCGCTA CTTTATAATT 350
TAAATCAAAA CCGACGCTTT TGTTTGACAA CTGATATAAT TTAGGAACAA 400
TAAACCTACT TGTCCCAACC ATTTTTCTTT CTCAAGTCAT CGTAGAATTG 450 : i
TAGATCTTTA GGATCTTTGA TGTATTTTTT AATCGTCTCA GGTTGAAACC 500 >- f-
TAAAAACAAG CAGAAACAAA CCCAAGCTGA TCAGAGTGAG AATAAAGCTC 550 t
CATTTTAAGC AACTCCATAA ACCACTAAAG AAACTTTTTT TGAGACTCTC 600 i
TTTGAAAATC TGTCCTATTG ATTTGTTTTC CATTTTGTTT CCCATGCGGA 650 u
TCACAAACGC TTAATTACAA ATACATACTA TAATAAGTAT GGCACACACA 700
AACCAAACCA TTTTTAGAAC GCTTCATGCA CTCACCTTGC TCCTAACCAT 750 ♦
TTCTCCAACC ATCTTTAGCG TTGCATTTGA TTTCTTCAAA AAGGCTCATT 800
TCTTAGTTTC TTTTATTCTT AAAATTTTTC CATTCTAGCA AATTTTTGTT 850 V;
AATTGTGGGT AAAAATGTGA ATCGTTCCTA GCTTTTAGAC GCTTGCAACG 900 1
ATCGGACTTT TTTCAATATT AATGAAAAAA TGCCAAATAT TCTAAATATT 950
GTGGTATAGT GATAACGTTC AAAGACACGA ATTGCATACT CAAAGTGTGT 1000
AGTAGTTTTT AGCGGTCTTT GATACCAATA AGATACCGAT AGGTATGAAA 1050
CTAGGTATAG AAGGAGAAAC A ATG ACT AAC GAA ACT Met Thr Asn Glu Thr 1 5 ATT GAC CAA Ile Asp Gin 1095
CAA CCA CAA ACC GAA GCG GCT TTT AAC CCG CAG Gin Pro Gin Thr Glu Ala Ala Phe Asn Pro Gin 10 15 CAA TTT ATC Gin Phe Ile 20 1137
AAT AAT CTT CAA GTA GCT TTT CTT AAA GTT GAT Asn Asn Leu Gin Val Ala Phe Leu Lys Val Asp 25 30 AAC GCT GTC Asn Ala Val 35 1179
GCT TCA TAC GAT Tyr Asp 40 CCT Pro GAT Asp CAA AAA Gin Lys CCA ATC GTT GAT AAG AAC Pro Ile Val Asp Lys Asn 1221
Ala Ser
45 50
GAT AGG GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG GGA ATC TCG CAA TTA 1263
Asp Arg Asp Asn Arg Gin Ala Phe Glu Gly Ile Ser Gin Leu
55 60 <
AGG GAA GAA TAC TCC AAT AAA GCG ATC AAA AAT CCT ACC AAA 1305 í i
Arg Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Ala Ile Lys Asn pro Thr Lys 9
65 70 75
AAG AAT CAG TAT TTT TCA GAC TTT ATC AAT AAG AGC AAT GAT 1347 »'
Lys Asn Gin Tyr Phe Ser Asp Phe Ile Asn Lys Ser Asn Asp i £
80 85 90 t i
TTA ATC AAC AAA GAC AAT CTC ATT GTC GTG GAA TCT TCC ACA 1389
Leu Ile Asn Lys Asp Asn Leu Ile Val Val Glu Ser Ser Thr u
95 100 105 *
AAG AGC TTT CAG AAA TTT GGG GAT CAG CGT TAC CGA ATT TTC 1431 $ 1
Lys Ser Phe Gin Lys Phe Gly Asp Gin Arg Tyr Arg Ile Phe i
110 115 120
ACA AGT TGG GTG TCC CAT CAA AAC GAT CCG TCT AAA ATC AAC 1473
Thr Ser Trp Val Ser His Gin Asn Asp Pro Ser Lys Ile Asn
125 130
ACC CGA TGC ATC CGA AAT TTT ATG GAA CAT ACC ATA CAA CCC 1515
Thr Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His Thr Ile Gin Pro
135 140 145
CCT ATC CCT GAT GAC AAA GAA AAA GCA GAG TTT TTG AAA TCT 1557
Pro Ile Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu Lys Ser
150 155 160
TTC Phe AAT Asn 290 CAA Gin TTA TTG ATT CAC AAT AAC ACT CTG TCT TCT GTG 1977
Leu Leu Ile His 295 Asn Asn The Leu Ser 300 Ser Val
TTA ATG GGG AGT CAT GAT GGC ATA GAA CCT GAA AAA GTT TCA 2019
Leu Met Gly Ser His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val Ser
305 310 315 $.
TTA TTG TAT GCG GGC AAT GGT GGT TTT GGA GCC AAG CAC GAT 2061 i
Leu Leu Tyr Ala Gly Asn Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp í
320 325 330
TGG AAC GCC ACC GTT GGT TAT AAA GAC CAA CAA GGT AAC AAT 2103
Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys Asp Gin Gin Gly Asn Asn
335 340 1
GTG GCT ACA ATA ATT AAT GTG CAT ATG AAA AAC GGC AGT GGC 2145 . i
Val Ala Thr Ile Ile Asn Val His Met Lys Asn Gly Ser Gly i
345 350 355 í
TTA GTC ATA GCA GGT GGT GAG AAA GGG ATT AAC AAC CCT AGT 2187 i
Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn Pro Ser ♦
360 365 370
TTT TAT CTC TAC AAA GAA GAC CAA CTC ACA GGC TCA CAA CGA 2229
Phe Tyr Leu Tyr Lys Glu Asp Gin Leu Thr Gly Ser Gin Arg
375 380 385
GCA TTG AGT CAA GAA GAG ATC CAA AAC AAA ATA GAT TTC ATG 2271
Ala Leu Ser Gin Glu Glu Ile Gin Asn Lys Ile Asp Phe Met
390 395 400
GAA TTT CTT GCA CAA AAC AAT GCT AAA TTA GAC AGC TTG AGC 2313
Glu Phe Leu Ala Gin Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser
405 410
GAG AAA GAG AAA GAA AAA TTC Phe CGA AAT GAG ATT AAG GAT Asp TTC Phe 2355
Glu 415 Lys Glu Lys Glu Lys 420 Arg Asn Glu Ile 425 Lys
CAA AAA GAC TCT AAG CCT TAT TTA GAC GCC CTA GGG AAT GAT 2397
Gin Lys Asp Ser Lys Pro Tyr Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp
430 435 440
CGT ATT GCT TTT GTT TCT AAA AAA GAC CCA AAA CAT TCA GCT 2439
Arg Ile Ala Phe Via Ser Lys Lys Asp Pro Lys His Ser Ala * *
445 450 455
TTA ATT ACT GAG TTT AAT AAG GGG GAT TTG AGC TAC ACT CTC 2481 i
Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly Asp Leu Ser Tyr Thr Leu
460 465 470 t i
AAA GTT ATG GGA AAA AAG CAG ATA AAG GCT TTA GAT AGG GAG 2523 i
Lys Val Met Gly Lys Lys Gin Ile Lys Ala Leu Asp Arg Glu -1
475 480 í
AAA AAT GTC ACT CTT CAA GGT AAC CTA AAA CAT GAT GGC GTG 2565
Lys Asn Val Thr Leu Gin Gly Asn Leu Lys His Asp Gly Val t
485 490 495
ATG TTT GTT AAT TAT TCT AAT TTC AAA TAC ACC AAC GCC TCC 2607
Met Phe Val Asn Tyr Ser Asn Phe Lys Tyr Thr Asn Ala Ser
500 505 510
AAG AGT CCC AAT AAG GGT GTA GGC GTT ACG AAT GGC GTT TCC 2649
Lys Ser Pro Asn Lys Gly Val Gly Val thr Asn Gly Val Ser
515 520 525
CAT TTA GAA GCA GGC TTT AGC AAG GTG GCT GTC TTT AAT TTG 2691
His Leu Glu Ala Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu
530
535
540
GCT Pro AAT Asn TTA Leu AAT Asn AAT Asn 545 CTC Leu GCT Ala ATC Ile ACT Thr AGT Ser 550 GTC Val GTA Val AGG Arg CGG Arg 2733 i
GAT TTA GAG GAT AAA CTA ATC GCT AAA GGA TTG TCC CCA CAA 2775
Asp leu Glu Asp Lys Leu Ile Ala Lys Gly Leu Ser Pro Gin
555 560 565 i
GAA GCT AAT AAG CTT GTC AAA GAT TTT TTG AGT AGC AAC AAA 2817
Glu Ala Asn Lys Leu Val Lys Asp Phe Leu Ser Ser Asn Lys s
570 575 580
GAA TTG GTT GGA AAA GCT TTA AAC TTC AAT AAA GCT GTA GCT 2859
Glu Leu Val Gly Lys Ala Leu Asn Phe Asn Lys Ala Val Ala *
585 590 595 i
GAA GCT AAA AAC ACA GGC AAC TAT GAC GAG GTG AAA CGA GCT 2901 i
Glu Ala Lys Asn Thr Gly Asn Tyr Asp Glu Val Lys Arg Ala í
600 605 610 I
CAG AAA GAT CTT GAA AAA TCT CTA AAG AAA CGA GAG CAT TTG 2943 4
Gin Lys Asp Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu 1
615 620
GAG AAA GAT GTA GCG AAA AAT TTG GAG AGC AAA AGC GGC AAC 2985
Glu Lys Asp Val Ala Lys Asn Leu Glu Ser Lys Ser Gly Asn
625 630 635
AAA AAT AAA ATG GAA GCA AAA GCT CAA CGT AAC AGC CAA AAA 3027
Lys Asn Lys Met Glu Ala Lys Ala Gin Ala Asn Ser Gin Lys
640 645 650
GAT GAG ATT TTT GCG TTG ATC AAT AAA GAG GCT AAT AGA GAC 3069
Asp Glu Ile Phe Ala Leu Ile Asn Lys Glu Ala Asn Arg Asp
655 660 665
GCA AGA GCA ATC GCT TAC GCT CAA AAT CTT AAA GGC ATC AAA 3111 JI
Ala Arg Ala Ile Ala 670 Tyr Ala Gin Asn 675 Leu Lys Gly Ile Lys 680
AGG GAA TTG TCT GAT AAA CTT GAA AAT ATC AAC -AAG GAT TTG 3153
Arg Glu leu Ser Asp Lys Leu Glu Asn Ile Asn Lys Asp Leu
685 690 2
AAA GAC TTT AGT AAA TCT TTT GAT GGA TTC AAA AAT GGC AAA 3195 T i
Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe Lys Asn Gly Lys s
695 700 705
AAT AAG GAT TTC AGC AAG GCA GAA GAA ACG CTA AAA GCC CTT 3237 >
Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala GlU Glu Thr Leu Lys Ala Leu i
710 715 720 t .?
AAA GGC TCG GTG AAA GAT TTA GGT ATC AAT CCG GAA TGG ATT 3279 . i
Lys Gly Ser Val Lys Asp Leu Gly Ile Asn Pro Glu Trp Ile g *
725 730 735 A.
TCA AAA GTT GAA AAC CTT AAT GCA GCT TTG AAT GAA TTC AAA 3321
Ser Lys Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe Lys 1
740 745 750
AAT GGC AAA AAT AAG GAT TTC AGC AAG GTA ACG CAA GCA AAA 3363
Asn Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Val Thr Gin Ala Lys
755 760
AGC GAC CAA GAA AAT TCC ATT AAA GAT GTG ATC ATC AAT CAA 3405
Ser Asp Gin Glu Asn Ser Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gin
765 770 775
AAG ATA ACG GAT AAA GTT GAT GAA CTC AAT CAA GCG GTA TCA 3447
Lys Ile Thr Asp Lys Val Asp Glu Leu Asn Gin Ala Val Ser
780 785 790
GTG GCT AAA ATA GCG TGC GAT TTC AGT GGG GTA GAG CAA GCG 3489
Val Ala Lys 795 Ile Ala Cys Asp Phe 800 Ser Gly Val Glu Gin 805 Ala
TTA GCC GAT CTC AAA AAT TTC TCA AAG GAG CAA TTG GCT CAA 3531
Leu Ala Asp Leu Lys Asn Phe Ser Lys Glu Gin Leu Ala Gin
810 815 820 4
CAA GCT CAA AAA AAT GAA AGT TTC AAT GTT GGA AAA TCT GAA 3573 I
Gin Ala Gin Lys Asn Glu Ser Phe Asn Val Gly Lys Ser Glu y
825 830
ATA TAC CAA TCC GTT AAG AAT GGT GTG AAC GGA ACC CTA GTC 3615 >
Ile Tyr Gin Ser Val Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Leu Val i
835 840 845 t
GGT AAT GGG TTA TCT GGA ATA GAG GCC ACA GGG i
Gly Asn Gly Leu Ser Gly Ile Glu Ala Thr Gly í
850 855 (sekv. id. č. 1).
I
Tato specifická nukleová kyselina může být použita pro detekci H. pylori nesoucí antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 takovými způsoby, jako je polymerasová řetězová reakce, ligasová řetězová reakce a hybridizace. Pro výrobu antigenního fragmentu TagA se může použít také sekvence o 3648 párech nukleotidů, která může být ve vektoru ve vhodném hostiteli.
Jiným příkladem nukleové kyseliny kódující antigenní fragment antigenu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 je rekombinantní fragment (orv220) genu tagA obsahující nukleotidy 1921 až 3648 sekvence id. č. 1 a 3 (příklad 4). Tato specifická nukleová kyselina se může použít pro detekci kmenů H. pylori exprimujících antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 takovými způsoby, jako je polymerasová řetězová reakce, ligaso25 vá řetězová reakce a hybridizace. Nukleová kyselina může být také ve vektoru ve vhodném hostiteli a používat se pro výrobu antigenního fragmentu TagA.
Nukleové kyseliny kódující jiné antigenní fragmenty TagA mohou zruční odborníci z oblasti techniky rutinními způsoby a rutinním experimentováním podle zde popsaných postupů příkladů získávání nukleových kyselin. Další způsoby získávání fragmentů <
nukleových kyselin známých isolovaných nukleových kyselin, jako ?
jsou restrikční štěpení, se mohou aplikovat na větší kódující ;
sekvenci, aby se získaly nukleové kyseliny kódující fragmenty tohoto antigenu. Takto získané nukleové kyseliny mohou být rutinně testovány na antigeničnost, specifičnost atd. podle zde >
popsaných příkladů. i t
Změny v nukleotidové sekvenci příkladů nukleových kyselin f kódujících TagA nebo jejich antigenních fragmentů jsou zde také ( vzaty v úvahu, pokud se zachovává antageničnost polypeptidu kó- f dováného nukleovou kyselinou. Nukleové kyseliny použité jako * primery nebo sondy mohou nést substituce, pokud existuje dostatečně doplňkových nukleotidů pro selektivní nebo specifickou ; hybridizaci (Kunkel a spol.: Methods Enzymol. 154. 367 $ (1987).) .
Jiným příkladem nukleové kyseliny kódující TagA antigen je alternativní kódující sekvence antigenu, získaná na základě degenerace genetického kódu. Jakmile se získá jedna aminokyselinová sekvence TagA antigenu (sekv. id. č. 3), zručný odborník může určit takovou nukleotidovou sekvenci, která kóduje tento antigen nebo fragment tohoto antigenu a může generovat nukleovou kyselinu pomocí existujících způsobů techniky.
Isolovaná nukleová kyselina, která selektivně hybridizuje s nukleovou kyselinou obsahující nukleotidy 1072 až 4613 obsažené v nukleotidové sekvenci definované sekv. id. č. 3 za podmínek polymerasové řetězové reakce, je také vzata v tomto spisu v úvahu. Pojem selektivní, jak je zde používán, znamená tako26 vou nukleovou kyselinu, která bude hybridizovat za PCR podmínek s referenční nukleovou kyselinou v množství rozpoznatelném od pozadí nebo náhodné hybridizace, ale může hybridizovat také s vybranými jinými nukleovými kyselinami v takovém množství, které je zřetelně odlišitelné od pozadí nebo náhodné hybridizace.
Selektivně hybridizující nukleová kyselina může být doplňková ke shora uvedené nukleové kyselině. Stupeň identifikace sekvence a délka hybridizujících sekvencí může být zvolena na základě izamýšleného použití píslušné sekvence. Jestliže se používá jako ?
primery, tento vynález poskytuje prostředky zahrnující alespoň ;
dvě nukleové kyseliny, které selektivně hybridizují s různými oblastmi tak, aby amplifikovaly žádoucí oblast. Příklady PCR podmínek, které jsou zde uvedeny, jsou dobře známy v oblasti t techniky a jsou dodávány dodavateli PCR reakčních činidel a za- > řízení. t
Isolovaná nukleová kyselina, která specificky hybridizu je I s nukleovou kyselinou obsahující nukleotidy 1072 až 4614 obsa- t ženě v nukleotidové sekvenci, je definována sekv. id. č. 3 za selektivních podmínek 68 °C, 16 h, v pufru obsahujícím 6x SSC,
0,5% (hmotn.) dodecylsulfát sodný, 5x Denhardtův roztok, promý- i vání 60 °C v 0,5x SSC (příklad 1, Southernova hybridizace). ί Jsou uvedeny také jiné příklady hybridizačních podmínek. Specifické hybridizační podmínky vylučují nukleové kyseliny, které hybridizují s jinými nukleovými kyselinami než s referenční nukleovou kyselinou. Hybridizující nukleová kyselina může být tedy doplňková k segmentu nebo k celé shora uvedené nukleové kyselině nebo může mít dostatečnou doplňkovost se segmentem, se kterým hybridizuje, aby se zabránilo její navázání na jiné přirozeně se vyskytující nukleové kyseliny. Sekvence, na které se nukleová kyselina bude hybridizovat, budou vybrány na základě sekvence nukleotidů a užitečnosti příslušné sekvence. Například specificky hybridizující nukleové kyseliny mohou být použity jako sondy pro detegování přítomnosti organismu, který má nukleovou kyselinu, na kterou se hybridizuje. Hybridizující nukleová kyselina může také kódovat fragmenty zde získaného TagA.
Získává se také isolovaná nukleová kyselina, která hybridizuje s nukleovou kyselinou kódující H. pylori tagA za selektivních podínek, která má alespoň 70% doplňkovost se segmentem a vláknem nukleové kyseliny sekv. id. č. 3, na kterou se hybridizuje. Hybridizující nukleové kyseliny podle vynálezu mohou mít alespoň 70, 80, 85, 90, 95, 97, 98 a 99% doplňkovost k segmentu a vláknu příkladné sekvence, na kterou se hybridizují. Tyto nukleové kysliny mohou mít délku v rozsahu od alespoň 18 do 4 000 nukleotidů. Nukleová kyselina tedy může kódovat TaGA z jiného tagA* kmenu nebo se může použít jako sonda nebo primer pro detegování přítomnosti tagA* H. pylori.
Tento vynález poskytuje příklady těchto nukleových kyselin H. pylori, takže stupeň komplementarity vyžadovaný pro rozlišení specificky hybridizujících od nespecificky hybridizujích nukleových kyselin za specifických podmínek může být pro každou nukleovou kyselinu snadno stanoven. Tyto nukleové kyseliny mohou být dvojvláknové nebo jednovláknové podle zamýšleného použití (např. jako kódující sekvence nebo primer/sonda). Mělo by být také zřejmé, že specificky hybridizující nukleová kyselina nebude hybridizovat s nukleovými kyselinami kódujícími nepříbuzné proteiny.
Odborník z oblát i techniky může snadno získat nukleové kyseliny podle předloženého vynálezu použitím rutinních způsobů syntetizování celého genu stejně jako kratších nukleotidových fragmentů. Tato přihláška specificky poskytuje například způsoby získání nukleových kyselin, které jsou zde uvedeny. Lze použít také další způsoby známé z oblasti techniky bez významných modifikací. Ferretti a spol. (Ferretti a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. 82., 599 (1986).) a Wosnick a spol. (Wosnick a spol.: Gene 76, 153 (1989).) ukazují rutinní způsoby syntetizování genu známé skevence. Podrobněji - Ferretti a spol. popisují syntézu genu syntetického hovězího rhodopsinu o 1057 párech nukleotidů ze syntetických oligonukleotidů. Syntetizovaný gen byl shodný se známou sekvencí (první sekvence na str. 603) , což ukazuje spolehlivost tohoto způsobu syntézy genu. Také Wosí i
I i
I i
i í
nick a spol. popisují syntézu genu kukuřičné glutathion-transferasy (GST) použitím účinného, jendostupňového způsobu anelace/ligace. Tento způsob také poskytuje úplný syntetický gen se 100% věrností, která ukazuje na rutinní povahu tohoto postupu.
V úvahu se vezmou také vyčištěné antigenní polypeptidy kódované nukleovými kyselinami podle předloženého vynálezu. Pojem vyčištěný, jak je zde používán, znamená, že antigen v podstatě neobsahuje znečištěniny nebo složky buněk se kterými se antigen normálně vyskytuje, čímž se antigen odliší od znečištěnin nebo složek. Vyčištěný antigenový polypeptid je tedy dostatečně oddělen od znečištěnin, takže se může používat v klinických diagnostických nebo jiných laboratorních postupech. Vyčištěný antigen plné délky o molekulové hmotnosti přibližně 120 000 až 128 000 a antigenní fragmenty podle předloženého vynálezu se také označují jako antigen, TagA antigen nebo cagA antigen.
* i
i *
f i'
Tag antigenní polypeptid plné délky o molekulové hmotnosti
přibližně 130 000 sekv. id. č. - i
Met Thr Asn Glu Thr Ile 1 5 Asp Gin Gin Pro Gin Thr Glu Ala Ala 10 15
Phe Asn Pro Gin Gin Phe 20 Ile Asn Asn Leu Gin Val Ala Phe Leu 25 30
Lys Val Asp Asn Ala Val 35 Ala Ser Tyr Asp Pro Asp Gin Lys Pro 40 45
Ile Val Asp Lys Asn Asp 50 Arg Asp Asn Arg Gin Ala Phe Glu Gly 55 60
Ile Ser Gin Leu Arg Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Ala Ile Lys Asn 65 70 75
Pro Thr Lys Lys Asn Gin Tyr Phe Ser Asp Phe Ile Asn Lys Ser 80 85 90
Asn Asp Leu Ile Asn Lys Asp Asn Leu Ile Val Val Glu Ser Ser 95 100 105
Thr Lys Ser Phe Gin Lys Phe Gly Asp Gin Arg Tyr Arg Ile Phe 110 115 120
Thr Ser Trp Val Ser His Gin Asn Asp Pro Ser Lys Ile Asn Thr 125 130 135
Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His Thr Ile Gin Pro Pro Ile 140 145 150
Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu Lys Ser Ala Lys Gin 155 160 165
Ser Phe Ala Gly Ile Ile Ile Gly Asn Gin Ile Arg Thr Asp Gin 170 175 180
Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu Lys Glu Arg Gin Glu 185 190 195
Ala Glu Lys Asn Gly Gly Pro Thr Gly Gly Asp Trp Leu Asp Ile 200 205 210
Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys Lys Gin Ser Ser Asp Val Lys 215 220 225
Glu Ala Ile Asn Gin Glu Pro Leu Pro His Val Gin Pro Asp Ile 230 235 240
Ala Thr Ser Thr Thr His Ile Gin Gly Leu Pro Pro Glu Ser Arg 245 250 255 t
ií
Asp Leu Leu Asp Glu Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly 260 265 270 t
Asp Met Glu Met Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro 4
275 280 285 i
Asn Try Lys Phe Asn Gin Leu Leu Ile His Asn Asn The Leu Ser
290 295 300 |
Ser Val Leu Met Gly Ser His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val
305 310 315
Ser Leu Leu Tyr Ala Gly Asn Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp >}
320 325 330
Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys Asp Gin Gin Gly Asn Asn Val 4
335 340 345 ?
V*
Ala Thr Ile Ile Asn Val His Met Lys Asn Gly Ser Gly Leu Val
350 355 360 4
Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn Pro Ser Phe Tyr Leu r
365 370 375
Tyr Lys Glu Asp Gin Leu Thr Gly Ser Gin Arg Ala Leu Ser Gin
380 385 390
Glu Glu Ile Gin Asn Lys Ile Asp Phe Met Glu Phe Leu Ala Gin
395 400 405
Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Glu Lys Glu Lys
410 415 420
Phe Arg Asn Glu Ile Lys Asp Phe Gin Lys Asp Ser Lys Pro Tyr
425 430 435
Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp Arg Ile Ala Phe Via Ser Lys Lys
440 445 450
Asp Pro Lys His Ser Ala Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly Asp >
455 460 465
Leu Ser Tyr Thr Leu Lys Val Met Gly Lys Lys Gin Ile Lys Ala
470 475 480
Leu Asp Arg Glu Lys Asn Val Thr Leu Gin Gly Asn Leu Lys His .·.»
485 490 495
Asp Gly Val Met Phe Val Asn Tyr Ser Asn Phe Lys Tyr Thr Asn J
500 505 510 , $ •4
Ala Ser Lys Ser Pro Asn Lys Gly Val Gly Val Thr Asn Gly Val ,»·
515 520 525 4„
Ser His Leu Glu Ala Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu
530 535 540
Pro Asn Leu Asn Asn Leu Ala Ile Thr Ser Val Val Arg Arg Asp
545 550 555
Leu Glu Asp Lys Leu Ile Ala Lys Gly Leu Ser Pro Gin Glu Ala
560 565 570
Asn Lys Leu Val Lys Asp Phe Leu Ser Ser Asn Lys Glu Leu Val
575 580 585
Gly Lys Ala Leu Asn Phe Asn Lys Ala Val Ala Glu Ala Lys Asn
590 595 600
Thr Gly Asn Tyr Asp Glu Val Lys Arg Ala Gin Lys Asp Leu Glu
605 610 615
Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu Glu Lys Asp Val Ala Lys
620 625 630 i
Asn Leu Glu Ser Lys Ser Gly Asn Lys Asn Lys Met Glu Ala Lys j
635 640 645 ť
Ala Gin Ala Asn Ser Gin Lys Asp Glu Ile Phe Ala Leu Ile Asn
650 655 660 4
Lys Glu Ala Asn Arg Asp Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala Gin Asn |
665 670 675
Leu Lys Gly Ile Lys Arg Glu Leu Ser Asp Lys Leu Glu Asn Ile »
680 685 690 , t t
Asn Lys Asp Leu Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe Lys >
695 700 705 ; = . f
Asn Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Lys 710 715 720
Ala Leu Lys Gly Ser Val Lys Asp Leu Gly Ile Asn Pro Glu Trp 725 730 735
Ile Ser Lys Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe Lys 740 745 750
Asn Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Val Thr Gin Ala Lys Ser 755 760 765
Asp Gin Glu Asn Ser Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gin Lys Ile 770 775 780
Thr Asp Lys Val Asp Glu Leu Asn Gin Ala Val Ser Val Ala Lys 785 790 795
Ile Ala Cys Asp Phe Ser Gly Val Glu Gin Ala Leu Ala Asp Leu
800 805 810
Lys Asn Phe Ser Lys Glu Gin Leu Ala Gin Gin Ala Gin Lys Asn *
815 820 825 ř
Glu Ser Phe Asn Val Gly Lys Ser Glu Ile Tyr Gin Ser Val Lys
830 835 840 $
Asn Gly Val Asn Gly Thr Leu Val Gly Asn Gly Leu Ser Gly Ile >
845 850 855
Glu Ala Thr Ala Leu Ala Lys Asn Phe Ser Asp Ile Lys Lys Glu >
860 865 870 4 t
Leu Asn Glu Lys Phe Lys Asn Phe Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly ř • i
875 880 885 f . Λ·
Leu Lys Asn Gly Gly Glu Pro Ile Tyr Ala Gin Val Asn Lys Lys
890 895 900 j,
Lys Thr Gly Gin Val Ala Ser Pro Glu Glu Pro Ile Tyr Ala Gin 905 910 915
Val Ala Lys Lys Val Thr Lys Lys Ile Asp Gin Leu Asn Gin Ala 920 925 930
Ala Thr Ser Gly Phe Gly Gly Val Gly Gin Ala Gly Phe Pro Leu 935 940 945
Lys Arg His Asp Lys Val Glu Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser 950 955 960
Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly Gly 965 970 975
Ser Phe Pro Leu Lys 980 Arg His Asp Lys Val 985 Asp Asp Leu Ser Lys 990
Val Gly Leu Ser Arg 995 Asn Gin Glu Leu Thr 1000 Gin Lys Ile Asp Asn 1005
Leu Ser Gin Ala Val 1010 Ser Glu Ala Lys Ala 1015 Gly Phe Phe Gly Asn 1020
Leu Glu Gin Thr Ile 1025 Asp Lys Leu Lys Asp 1030 Phe Thr Lys Asn Asn 1035
Pro Val Asn Leu Trp 1040 Ala Glu Ser Ala Lys 1045 Lys Val Pro Ala Ser 1050
Leu Ser Ala Lys Leu 1055 Asp Asn Tyr Ala Thr 1060 Asn Ser His Thr Arg 1065
Ile Asn Ser Asn Ile 1070 Gin Asn Gly Ala Ile 1075 Asn Glu Lys Ala Thr 1080
Gly Thr Glu Arg Gin 1085 Lys Asn Pro Glu Trp 1090 Leu Lys Leu Val Asn 1095
Asp Lys Ile Val Ala 1100 His Asn Val Gly Ser 1105 Val Pro Leu Ser Glu 1110
Tyr Asp Asn Ile Gly 1115 Phe Ser Gin Lys Asn 1120 Met Lys Asp Tyr Ser 1125
Asp Ser Phe Lys Phe 1130 Ser Thr Lys Leu Asn 1135 Asn Ala Val Lys Asp 1140
Ile Lys Ser Gly Phe Thr Gin Phe Leu Ala Asn Ala Phe Ser Thr
1145 1150 1155
Gly Tyr Tyr Ser Met Ala Arg Glu Asn Ala Glu His Gly Ile Lys 1160 1165 1170 *
Asn Ala Asn Thr Lys Gly Gly Phe Gin Lys Ser í
1175 1180 Í (sekv. id. č. 4) ♦
je kódován otevřenou čtecí oblastí o velikosti 3543 párů nukleo- i tidů v klonovaném insertu o 4821 párech nukleotidů, sestá- j vajícím v podstatě z aminokyselinových sekvencí kódovaných nukleotidy 1072 až 4614 obsaženými v nukleotidové sekvenci definované jako sekv. id. č. 3. >
£
Antigenní fragment TagA o molekulové hmotnosti přibližně J
000 je kódován otevřenou čtecí oblastí o 2577 párech nukleo- f· tidů v klonovaném insertu o 3648 párech nukleotidů, sestávají- i cím v podstatě z aminokyselin kódovaných nukleotidy 1072 až |
3648 obsaženými v sekvenci nukleotidů definované jako sekv. id. *
č. 1.
i
Jiný antigenní fragment TagA je kódován otevřenou čtecí '·<
oblastí (orv220), sestávající v podstatě z aminokyselin kódovaných nukleotidy 1921 až 3648 obsaženými v nukleotidové sekvenci definované jako sekv. id. č. 1.
Antigenní fragement antigenu, může být vybrán aplikováním rutinních způsobů mapování epitopu na TagA proteinu, aby se stanovily ty oblasti proteinu, které obsahují epitopy reaktivní se sérovými protilátkami nebo schopné vyvolávat imunitní odpověď v živočichovi. Jakmile je jednou epitop vybrán, může být antigenní polypeptid obsahující epitop syntetizován přímo nebo vyroben rekorobinantně klonováním nukleových kyselin kódujících polypeptid v expresním systému podle standardních způsobů. Antigenní fragment antigenu lze také isolovat z celého antigenu nebo většího fragmentu chemickým nebo mechanickým rozštěpením.
Takto získané vyčištěné fragmenty mohou být testovány, aby se stanovila jejich antigeničnost a specifičnost způsoby, které jsou zde popsány. Antigenní fragment je definován aminokyselinovou sekvencí alespoň 5 po sobě následujících aminokyselin odvozených ad aminokyselinové sekvence antigenu, která je reaktivní (váže se) s protilátkou.
Jakmile je jednou aminokyselinová sekvence antigenního polypeptidu získána, mohou se navrhnout takové antigenní polypeptidy, které odpovídají aminokyselinovým sekvencím přírodního antigenu, ale s modifikacemi ve formě substitucí, insercí nebo delecí příslušných aminokyselinových zbytků v odvozených sekvencích. Modifikace mohou zahrnovat připojení antigenu na sekvence, které jsou navrženy pro dosažení některé další vlastnosti, jako je rozpustnost. Modifikace mohou zahrnovat jiné aminokyseliny, které poskytují některou další vlastnost, jako je odstranění/přidání aminokyselin schopných tvořit disulfidovou vazbu, zvýšit biologickou životnost, měnit enzymovou aktivitu nebo měnit interakce s žaludeční kyselostí. V každém případě musí mít peptid biologickou vlastnost, jako je antigeničnost, imunogeničnost, specifičnost atd. Takto navržený polypeptid může být testován na antigeničnost, imunogeničnost a specifičnost způsoby, které jsou zde používány a popsány. Tyto polypeptidy pak mohou být syntetizovány standardními způsoby syntézy peptidů. Je tedy možná syntéza nebo vyčištění extrémně velkého počtu polypeptidů odvozených od příkladu sekvence TagA antigenu.
Vyčištěné antigenní polypeptidy mohou být testovány, aby se stanovila jejich imunogeničnost a specifičnost. Ve stručnosti - připraví se různé koncentrace domněle imunogenicky specifického fragmentu a podají se živočichovi. Stanoví se imunologická odpověď (např. produkce protilátek nebo buňkou zprostředkovaná imunita) živočicha na každou koncentraci. Množství podaného antigenu závisí na subjektu, např. na člověku nebo na morčeti, na stavu subjektu, na jeho velikosti atd. Živočich, kterému je naočkován antigen, může být vystaven bakterii, aby se stanovil účinek vakcíny specifického antigenního fragmentu.
Specifičnost fragmentu lze zajistit testováním sera, jiných kapalin nebo lymfocytů z naočkovaného živočicha na zkříženou reaktivitu s jinými blízce příbuznými bakteriemi. i i
Byl získán také vektor obsahující nukleové kyseliny podle § předloženého vynálezu. Vektory podle vynálezu mohou být v hos-. titeli vhodném pro exprimování polypeptidů kódovaných touto nukleovou kyselinou. Specifické příklady vektorů a hostitelů ♦ jsou uvedeny níže v příkladech provedení vynálezu. t
Existují četné E. coli expresní vektory, které jsou známy odborníkům z oblasti techniky a které jsou užitečné pro expresi antigenu. Mezi další mikrobiální hostitele, kteří jsou vhodní >
pro toto použití, patří bacily, jako je Bacillus subtilus, a t další Enterobacteriaceae, jako je Salmonella, Serratia a další | druhy Pseudomonas. V těchto prokaryotických hostitelích lze také připravit expresní vektory, které budou typicky obsahovat ;
expresní kontrolní sekvence slučitelné s hostitelskou buňkou i (např. počátek replikace). Navíc bude přítomen jakýkoliv počet různých dobře známých promotorů, jako je laktosový promotorvý systém, tryptofanový (Trp) promotorový systém, beta-laktamasový - ;
promotorový systém nebo promotorový systém z fágu lambda. Tyto $ promotory budou typicky regulovat expresi, popřípadě s operační sekvencí. Mají sekvence ribosomového vazebného místa, například pro iniciaci a ukončení transkripce a translace. Jestliže je to nutné, může se methionin na aminovém konci získávat vložením Met kódonu 5' ve fázi s antigenem. Také lze odstranit prodloužení antigenu na karboxylovém konci použitím standardních postupů mutagenese oligonukleotidu.
Může se používat také exprese kvasinek. Kvasinkové expresní systémy mají některé výhody. Za prvé, existuje důkaz, že proteiny produkované v kvasinkových sekrečních systémech vykazují přesné disulfidové párování. Za druhé, post-translační glykosylace je efektivně prováděna kvasinkovými sekrečními systémy. Saccharomyces cerevisiae pre-pro-alfa-faktorová leader oblast (kódovaná genem MFa-1) se rutinně používá pro řízení se38 krece proteinu z kvasinek (Brake a spol.: 1984.). Leader oblast pre-pro-alfa-faktoru obsahuje signální peptid a pro-segment, který zahrnuje rozpoznávací sekvenci kvasinkově proteasy kódované genem boxylové straně Lys-Arg dipeptidové štěpící signální sekvence. Sekvence kódující antigen může být napojena ve fázi na pre-pro-alfa-faktorovou leader oblast. Tato konstrukce se pak vloží pod kontrolu silného transkripčního promotoru, jako je promotor alkohol dehydrogenasy I nebo glykolytický promotor. Oblast kódující antigen je pak následována kódonem terminace translace, po kterém následují signály terminace transkripce. Sekvence kódující antigen mohou být také napojeny na sekvenci kódující druhý protein, jako je Sj26 nebo β-galaktosidasa, použitý pro usnadnění čištění napojeného proteinu afinitní chromatografií. Pro konstrukce použité pro expresi v kvasince je použitelná inserce proteasových míst štěpení, aby se složky od napojeného proteinu oddělily.
Savčí buňky umožňují expresi proteinů v prostředí, které zvýhodňuje důležité posttranslační modifikace, jako je skládání a cysteinové párování, adice komplexních sacharidových struktur a sekrece aktivního proteinu. Vektory, které jsou užitečné pro expresi antigenu v savčích buňkách, se vyznačují vložením sekvence kódující antigen mezi silný virový promtor a polyadenylační signál. Tyto vektory mohou obsahovat geny udělující rezistenci buď na gentamycin nebo methotrexát pro použití jako selektovatelné markéry. Antigen a sekvence kódující imunoreaktivní fragment mohou být vloženy do buněčné linie vaječníků čínského křečka použitím vektoru kódujícího rezistenci na methotrexát. Přítomnost vektorové DNA v transformovaných buňkách lze potvrdit Southernovou analýzou a produkce RNA odpovídající sekvenci kódující antigen může být potvrzena Northernovou analýzou. V oblasti techniky byly vyvinuty četné další vhodné hostitelské buněčné linie schopné sekretovat neporušené lidské proteiny. Patří sem buněčné linie CHO, buňky HeLa, myelomové buněčné linie, Jurkatovy buňky atd. Mezi expresní vektory pro tyto buňky mohou patřit sekvence pro regulaci exprese, jako je počátek replikace, promotor, zesilovač, nutné informace o místě opracování, jako jsou ribosomová vazebná místa, místa štěpení
RNA, polyadenylační místa a sekvence terminace transkripce. Výhodnými sekvencemi pro regulaci exprese jsou promotory odvozené , od imunoglobulinových genů, SV40, Adenoviru, hovězího Papilloma viru atd. Vektory, které obsahují DNA segmenty, o které se jedná, mohou být přeneseny do hostitelské buňky známými způsoby, které jsou různé podle typu buněčného hostitele. Například transfekce chloridem vápenatým se obvykle používá pro prokaryo- « tické buňky, zatímco zpracování s fosforečnanem vápenatým nebo elektroporace se může použít pro jiné buněčné hostitele.
Pro expresi antigenu v savčích buňkách se mohou použít další vektory, podobné těm, které byly vyvinuty pro expresi » lidského gama-interferonu, aktivátoru tkáňového plasminogenu, srážecího faktoru VIII, povrchového antigenu viru hepatitidy |
B, proteasy Nexinl a eosinofilního hlavního bazického proteinu.
Mezi vektor mohou dále patřit CMV promotorové sekvence a polya- A denylační signál dostupný pro expresi DNA vložených v savčích í buňkách (jako je COS7).
DNA sekvence mohou být exprimovány v hostitelích po tom, co jsou tyto sekvence odštěpitelně napojeny na, tj. umístěny tak, aby zajistily fungování, expresní kontrolní sekvenci. Tyto expresní vektory jsou typicky replikovatelné v hostitelských organismech buď jako episomy nebo jako integrální část hostitelské chromosomové DNA. Expresní vektory mohou obecně obsahovat selekční markéry, např. rezistence na tetracyklin nebo rezistence na hygromycin, aby umožnily detekci a/nebo selekci těch buněk, které jsou transformovány žádanými DNA sekvencemi (viz např. USA patent 4 704 362).
Polynukleotidy kódující variantní polypeptid mohou zahrnovat sekvence, které usnadňují transkripci (expresní sekvence) nebo translaci kódujících sekvencí, takže se produkuje kódovaný polypeptidový produkt. Konstrukce takových polynukleotidů je dobře známa odborníkům. Mezi tyto polynukleotidy může patřit například promotor, místo terminace transkripce (polyadenylační místo v eukaryotických expresních hostitelích), ribosomové vazebné místo, popřípadě zesilovač pro použití v eukaryotických expresních hostitelích a popřípadě sekvence, které jsou nutné t pro replikaci vektoru. 3
Podle vynálezu se získává také vyčištěná monoklonální protilátka, která specificky váže TagA antigen nebo antigenní fragment. Tato protilátka může specificky vázat jediný epitop antigenu, může vázat také epitopy jiných organismů. Pojem ”vá- * že” znamená dobře známé navázání antigen/protilátka a také ne- j náhodnou asociaci s antigenem. Pojem specificky váže, jak se zde tento pojem používá, popisuje protilátku nebo jiný ligand, který v podstatě nereaguje zkříženě s jakýmkoliv jiným antige- * nem než se specifickým, v tomto případě, TagA antigenem. Proti-. * látky se mohou připravovat tak, jak je to popsáno v příkladech $ (viz také Harlow a Lané: Antibodies: A Laboratory Manual, $
Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988.). Stručně - vy- * čištěný antigen může být injekčně podáván živočichovi v takovém $ množství a v takových intervalech, které jsou dostatečné pro vyvolání imunitní odpovědi. Polyklonální protilátky mohou být % vyčištěny přímo. Nebo mohou být buňky sleziny živočicha nápoje- * ny na nesmrtelnou buněčnou linii a testovány na sekreci monoklonální protilátky. Nelidské polyklonální protilátky, které t specificky vážou antigen, jsou tedy v rozsahu předloženého vynálezu.
Podle vynálezu se získává také ligand, který specificky váže antigen. Tímto ligandem může být fragment protilátky nebo menší molekula určená pro navázání epitopu TagA antigenu. Protilátka nebo ligand mohou být navázány na substrát nebo označeny detegovatelnou skupinou nebo jak navázány tak označeny. Detegovatelné skupiny uvažované pro prostředek podle předloženého vynálezu jsou ty, jejichž seznam je uveden níže v popisu , diagnostických způsobů, včetně fluorescenčních, enzymatických a radioaktivních markérů.
Podle vynálezu se získává také vyčištěný TagA antigen na41 vázaný na substrát. Antigen může být navázán také na vyčištěnou protilátku nebo ligand. Protilátkou může být monoklonální protilátka získaná standardními způsoby a tak, jak je zde popsáno.
V další části o způsobech serologické detekce (diagnosy) bude nejdříve pojednáno o detekci protilátky antigenem.
Předložený vynález poskytuje způsob detegování přítomnosti kmene H. pylori nesoucího antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 v subjektu, vyznačující se tím, že obsahuje stupně uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím TagA nebo TagA antigenního fragmentu podle předloženého vynálezu a detegování reakce navázání TagA nebo fragmentu a protilátky produkované subjektem; toto navázání znamená přítomnost toxického kmene H. pylori nebo dřívější infekci toxickým kmenem H. pylori. Existují četné rutinní imunologické testy, které se mohou používat v předložené detekci a predisposičních způsobech. Příklady jsou uvedeny níže.
Detekce antigenu s protilátkou/ligand: Jeden příklad způsobu detekce H. pylori nesoucího antigen se provádí tak, že se kapalina nebo vzorek tkáně ze subjektu uvedou do kontaktu s takovým množstvím vyčištěné protilátky, které specificky reaguje s antigenem a deteguje se navázání protilátky na antigen. Je třeba vzít v úvahu, že antigen bude znamenat antigen na neporušené buňce nebo fragmenty antigenu. Protilátka tedy zahrnuje jakýkoliv ligand, který se váže na antigen, například neporušenou protilátku, fragment protilátky nebo jiné reakční činidlo, které reaguje s antigenem. Kapalný vzorek podle tohoto způsobu může obsahovat jakoukoliv tělesnou kapalinu, která obsahuje antigen nebo buňku obsahující antigen, jako je krev, plasma, sérum, sliny a moč. Mezi další možné příklady tělesných kapalin patří sputum, sliz z povrchů sliznic, žaludeční šťáva a podobné.
Jiným způsobem detekce je ELISA. Imunoanalýzy, jako je i42 munofluorescenční analýza (IFA), test na imunosorbentu s navázaným enzymem (ELISA) a imunoblotování, se mohou snadno přizpůsobit pro detekci antigenu. Způsob testu ELISA, který účinný. z pro detekci antigenu, může vypadat například následovně: 1) , protilátka se naváže na substrát, 2) navázaná protilátka se uvede do kontaktu se vzorkem kapaliny nebo tkáně obsahující antigen, 3) předchozí se uvede do kontaktu se sekundární protilátkou navázanou na detegovatelnou skupinu (např. enzym křenová peroxidasa nebo enzym alkalická fosfatasa), 4) předcházející se uvede do kontaktu se substrátem pro enzym, 5) předcházející se uvede do kontaktu s barevným reakčním činidlem, 6) pozoruje se změna barvy. Shora uvedený způsob lze snadno upravit tak, aby se detegovala protilátka nebo také tak, aby se detegoval antigen. 4 i
Test kompetitivní inhibice: Jiný imunologický způsob, kte- * rý může být užitečný pro detekci H. pylori exprimujícího tagA nebo předchozí H. pylori infekce, využívá monoklonální protilátky (MAbs) pro detekci protilátek specificky reaktivních s |
TagA antigenem. Stručně - sérum nebo jiné tělesné kapaliny ze subjektu se nechají zreagovat s antigenem navázaným na substrát (např. desky ELISA s 96 jamkami). Nadbytek sera se řádně opláchne. Označená (navázáním s enzymem, fluorescenčně, radioaktiv- <
ně atd.) monoklonální protilátka se pak nechá zreagovat s předem zreagovaným komplexem antigen-serová protilátka. Změří se množství inhibice navázání monoklonální protilátky vzhledem ke kontrole (žádná sérová protilátka pacienta). Stupeň inhibice monoklonální protilátky je velice specifický test na příslušné druhy nebo kmeny, jelikož je založen na specifičnosti navázání monoklonální protilátky. MAbs se mohou používat také pro detekci přímo v buňkách způsobem IFA.
Pro detekci přítomnosti H. pylori kmene nesoucího TagA v subjektu se může použít také mikroaglutinační test. Stručně latexové perličky (nebo červené krvinky) se potáhnou antigenem a smíchají se se vzorkem ze subjektu, takže protilátky v tkáni nebo tělesných kapalinách, které jsou specificky reaktivní s antigenem, se zkříženě navážou s antigenem, což způsobí aglutinaci. Aglutinované komplexy antígen-protilátka vytvoří sraženinu viditelnou pouhým okem nebo spektrofotometrem. Při modifikaci shora uvedeného testu se mohou protilátky specificky reaktivní s antigenem navázat na perličky a tak detegují antigen v tkáni nebo tělesné kapalině.
Sendvičový test/průtoková cytometrie/imunoprecipitace: V typickém sendvičovém testu se protilátka může navázat na substrát a reagovat s antigenem. Potom se druhá označená protilátka naváže na epitopy nerozpoznávané první protilátkou a druhá protilátka se deteguje. Jelikož předložený vynález poskytuje pro detekci toxického H. pylori nebo předcházející H. pylori infekci TagA antigen, mohou se jako detekční způsoby používat také jiné serologické způsoby, jako je průtoková cytometrie a imunoprecipitace.
Při zde popsaných diagnostických způsobech se antigen může navázat na substrát a uvést se do kontaktu s kapalným vzorkem, jako je sérum, moč, sliny nebo žaludeční šťáva. Tento vzorek může být vzat přímo z pacienta nebo může být v částečně vyčištěném stavu. Podle tohoto způsobu protilátky specifické pro antigen (primární protilátka) budou specificky reagovat s navázaným antigenem. Potom se může přidat druhá protilátka navázaná na detegovatelnou skupinu nebo označená detegovatělnou skupinou, aby se zesílila detekce primární protilátky. Obecně - druhá protilátka nebo jiný ligand, který je reaktivní, buď specificky s odlišným epitopem antigenu nebo nespecificky s ligandem nebo zreagovanou protilátkou, bude vybrán pro svoji schopnost reagovat s více místy na primární protilátce. Například několik molekul sekundární protilátky může reagovat s každou primární protilákou, což způsobuje, že primární protilátka je detegovatelnější.
Detegovatelná část umožní vizuální detekci sraženiny nebo změny barvy, vizuální detekci mikroskopicky nebo automatickou detekci spektrometrem, radiometrickým měřením nebo podobně. Me44 zi příklady detegovatelných skupin patří f luorescein a rhodamin (pro fluorescenční mikroskopii), křenová peroxidasa (jak pro světelnou nebo elektronovou mikroskopii tak pro biochemickou detekci), biotin-streptavidin (pro světelnou nebo elektronovou mikroskopii), alkalická fosfatasa (pro biochemickou detekci změnou barvy) a radioisotopy (pro radiografii). Způsoby detekce a použité částice mohou být vybrány, například ze shora uvedeného seznamu nebo jiných vhodných příkladů podle standardních kriterií aplikovaných na takové výběry (Harlow a Lané: Antibodies; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1988.).
V další části spisu budou popsána detegování onemocnění nebo predisposice k onemocnění.
Peptický vřed: Jelikož vyčištěný TagA antigen podle předloženého vynálezu souvisí s peptickým vředem, předložený vynález poskytuje také způsob stanovení predisposice k peptickému vředu subjektu. Pro detekci H. pylori exprimujícího TagA antigen, pro detekci protilátek specifických pro TagA antigen nebo pro detekci specifických protilátek na TagA antigen se může použít řada shora uvedených způsobů. Přítomnost TagA antigenu nebo protilátek specifických pro TagA znamená predisposici subjektu pro peptický vřed. Mohou se použít také níže popsané způsoby detegování nukleových kyselin specifických pro tagA+ kmeny.
Karcinom žaludku: Jelikož vyčištěný TagA protein podle vynálezu souvisí s karcinomem žaludku, předložený vynález poskytuje také způsob stanovení predisposice ke karcinomu žaludku subjektu. Tento způsob se provádí podle řady shora uvedených způsobů detekce tagA* H. pylori kmenů, detekce protilátek specifických na tagA antigen nebo detekce specifických protilátek na TagA antigen. Přítomnost TagA antigenu nebo protilátek specifických pro TagA znamená predisposici subjektu ke karcinomu žaludku. Příklad 4 poskytuje podpůrná data získaná u člověka a příklad specifického postupu při praktickém provedení tohoto způsobu. Mohou se použít také níže popsané způsoby detegování nukleových kyselin specifických pro tagA+ kmeny.
Předložený vynález popisuje také způsoby léčení peptických vředů subjektu použitím prostředků podle předloženého vynálezu. Například podle jednoho takového způsobu se subjektu podává takové množství ligandu (např. protilátky nebo fragmentu protilátky) , který je specificky reaktivní s antigenem H. pylori o molekulové hmotnosti přibližně 120 000 až 128 000, které je dostatečné pro navázání antigenu v subjektu a zlepšení subjektivního klinického stavu. Takové zlepšení je důsledkem toho, že ligand interferuje s antigenovou normální funkcí při indukování zánětu a poškození buněk. Ligandem může být vyčištěná monoklonální protilátka specificky reaktivní s antigenem, vyčištěná polyklonální protilátka odvozená od živočicha, kterým není člověk, nebo jiné reakční činidlo, která má specifickou reaktivitu s antigenem. Cytotoxické části mohou být konjugovány na komplex ligand/protilátka standardními způsoby. Mezi příklady cytotoxických částí patří ricinový A řetězec, toxin difterie a radioaktivní isotopy.
Jiný způsob léčení peptických vředů u subjektu zahrnuje podávání subjektu takového množství ligandu/antagonisty na receptor antigenu H. pylori o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000, které postačuje pro zreagování s receptorem a zabránění navázání antigenu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 na receptor. V předloženém vynálezu je tedy uvažován také antagonista receptoru. Výsledkem je zlepšení subjektivního klinického stavu. Způsob léčení může také zahrnovat podávání subjektu takového množství analogu TagA receptoru, které má za výsledek kompetitivní navázání tagA antigenu, takže se inhibuje navázání TagA antigenu na receptor přírodního typu. Tento receptor je lokalizován v buňkách přítomných v gastroduodenální mukoze, jako jsou epitelové buňky, zánětlivé buňky nebo endotelové buňky.
Jelikož je uvedeno, že exprese tagA souvisí s karcinomem žaludku, shora uvedené způsoby léčení jsou aplikovatelné pro léčení nebo prevenci karcinomu žlaudku.
Předložený vynález poskytuje také mutant H. pylori, v němž produkt genu tagA je upraven tak, že je nefunkční. Mutant buď neexprimuje tagA nebo exprimuje nefunkční TagA antigen. V jednom příkladu se mutant kmene H. pylori získává tak, že se provede mutační substituce v sekvenci kódující tagA antigen, jak je popsáno v příkladu 2. Jelikož předložený vynález poskytuje nukleovou kyselinu kódující antigen, mohou se pro získání jiných mutovaných kmenů, jak jsou zde uvažovány, použít jiné způsoby mutace sekvence kódující antigen. Příklad mutantu kmene H. pylori podle předloženého vynálezu je označen 84-183:M22 a je uložen v Americké sbírce typů kultur (1230 Parklawn Drive, Rockville, Md., 20852) pod číslem ATCC 55359.
Mohou se připravovat další isogenní mutanty, například vložením nukleové kyseliny do genu tagA nebo delecí části genu tagA tak, že se získá nefunkční gen nebo se produkuje v tak malém množství, že organismus není infekční. Získáním nukleotidové sekvence pro nukleovou kyselinu, která kóduje antigen, umožňuje předložený vynález získání specifického bodu mutací, které mají žádoucí efekt. Deleční, insertní nebo substituční mutace v sekvenci genu se mohou provádět buď v regulační nebo v kódující oblasti, aby se zabránilo transkripci nebo aby se transkribovaný produkt stal nefunkční.
Jedním takovým přístupem je konstrukce delečního nebo insertního mutantu Donnenbergovým způsobem (Donnenberg a Kaper: Infect. Immun. 4310 (1991).). Delece v tagA se vytvoří delecí BamHl-Ndel fragmentu o 200 párech nukleotidů a opětovným navázáním tagA klonu. Tento mutant je klonován do sebevražedného vektoru pILL570. Gen sacB z Bacillus subtilis se také klonuje do sebevražedného vektoru, aby se získal podmínečně letální fenotyp. Tato konstrukce je transformována do H. pylori elektroporací a transformanty se vyberou rezistencí na streptomycin. Merodiploidní kmen, který obsahuje sebevražedný vektor a mutovanou versi tagA genu, se vystaví působení sacharosy pro přímou selekci organismy, které podlehnou druhé rekombinaci, což vede ke ztrátě vektoru. Tyto a další dobře známé způsoby získání mutací lze aplikovat na nukleové kyseliny získané podle vynálezu, aby se získaly další žádoucí mutace.
V rozsahu tohoto vynálezu jsou také neiosogenní mutanty. Například se získává živý zeslabený H. pylori, který je také tagA' mutantem podle předloženého vynálezu. Zkonstruuje se mutantní kmen tagArecA', například insertní mutací jak tagA tak recA genu způsoby zde popsanými a dále popsanými v USA patentové přihlášce č. 08/215928 pro recA. Zkonstruuje se mutovaný kmen tagA'recA', například insertní mutací jak tagA tak recA genu způsoby zde popsanými pro tagA a dále popsanými v USA patentové přihlášce č. 08/215928, která popisuje vznik mutantu vacA. Zkonstruuje se kmen mutantu recA'tagA vacA', například insertní mutací genů recA, tagA a vacA podle způsobů popsaných zde pro recA a vcacA a podle způsobu popsaného v USA patentové přihlášce č. 08/215928. Pro generaci H. pylori mutovaných kmenů lze použít jakýkoliv z dobře známých způsobů mutování genu podle předloženého vynálezu. Tyto kmeny se mohou testovat na imunogeničnost.
Antigen, antigenní fragment nebo mutant H. pylori podle tohoto vynálezu se mohou použít pro konstrukci vakciny obsahující imunogenní množství antigenu nebo mutantu H. pylori a farmaceuticky přijatelný nosič. Vakcínou může být úplný antigen, antigen na neporušeném H. pylori, E. coli nebo jiném kmenu. Vakcína pak může být použita při způsobu prevence peptického vředu nebo dalších komplikací H. pylori infekce (včetně atrofní gastritidy a maligního neoplasmu žaludku).
Imunogenní množství antigenu se může stanovovat použitím standardních postupů. Stručně - připraví se různé koncentrace domněle specifického imunoreaktivního epitopu, podá se živočichovi a stanoví se imunologická odpověď (např. produkce protilátek) živočicha na každou kocentraci.
Farmaceuticky přijatelný nosič ve vakcíně podle tohoto vynálezu může obsahovat solný nebo jiný vhodný nosič (Arnon R. (red.): Synthetic Vaccines X, 83, CRC Press, lne., Boča Raton, Florida 1987.). Pomocným činidlem může být také část nosiče vakcíny. V tomto případě se vybere podle standardních kriterií! podle použitého antigenu, podle způsobu podání a podle subjektu (Arnon R. (red.): Synthetic Vaccines I, 83, CRC Press, lne., Boča Raton, Florida 1987.). Způsoby podání mohou být orální nebo sublinguální, popřípadě injekční, podle příslušné použité vakcíny a podle subjektu, kterému se vakcína podává.
Ze shora uvedeného lze usoudit, že vakcína se může podávat jako profylaktické nebo terapeutické činidlo. Tento vynález tedy poskytuje způsoby předcházení nebo léčení H. pylori infekce a souvisejících onemocnění podáváním vakcíny subjektu.
Způsoby detekce (diagnosy) nukleové kyseliny: Přítomnost TagA antigenu a H. pylori nesoucí TagA antigen lze stanovit také detegováním přítomnosti nukleové kyseliny specifické pro tento antigen. Specifičnost těchto sekvencí pro antigen lze stanovit počítačovým srovnáním se známými sekvencemi, které jsou uvedeny v katalogu GenBak, s počítačovou databazí, použitím programů Word Search nebo FASTA od Genetics Computer Group (Madison, Wi.), které prohledávají nukleotidové sekvence uvedené v katalogu a zjišťují podobnosti genu, o který se jedná.
Nukleová kyselina specifická pro antigen může být detegována použitím způsobu amplifikace nukleové kyseliny, jako je polymerasvoá řetězová reakce nebo ligasová řetězová reakce. Nukleová kyselina se také deteguje přímou hybridizací nebo použitím polymorfie délky restrikčního fragmentu. Například předložený vynález poskytuje způsob detegování přítomnosti H. pylori, který nese TagA antigen, který zahrnuje zjištění přítomnosti nukleotidové sekvence související s místem štěpení restrikční endonukleasou. Dále se mohou využít PCR primery, které hybridizují pouze s nukleovými kyselinami specifickými pro antigen. Přítomnost amplifikace označuje přítomnost antigenu. V ji49 ném provedení může být restrikční fragment vzorku DNA sekvenován přímo použitím například Sanger ddNTp sekvenování nebo 7-deaza-2/-deoxyguanosin-5/-trifosfátu a Taq polymerasy a srovnán se známou jedinečnou sekvencí pro detegování H. pylori. V dalším provedení poskytuje předložený vynález způsob detegování přítomnosti H. pylori obsahující tagA' selektivní araplifikací shora popsanými způsoby. V ještě jiném provedení lze H. pylori detegovat přímo hybridizací jedinečné sekvence sondou nukleové kyseliny specifické na tagA. Navíc by mohla být nukleotidová sekvence před hybridizací amplifikována shora popsanými způsoby.
Jakmile se jednou ukáže, že specifické variabilní sekvence souvisejí s peptickým vředem, pak jsou způsoby detekce těchto sekvencí standardní způsoby v oblasti techniky. Detekce bodu mutací nebo variabilních sekvencí použitím přímého sondování zahrnuje použití oligonukleotidových sond, které se mohou připravit například synteticky nebo zářezovou translací. Tyto sondy mohou být vhodně označeny, například radioaktivní značkou, enzymovou značkou, fluorescenční značkou, biotin-avidinovou značkou a podobně, pro následné zviditelnění v příkladu Southernova blotovacího hybridizačniho postupu. Značená sonda se nechá zreagovat s navázaným vzorkem DNA, např. na nitrocelulosový arch, za takových podmínek, že hybridizují pouze plně doplňkové sekvence. Plochy, které nesou DNA sekvence doplňkové k označené DNA sondě, se tedy označí jako důsledek reanelační reakce. Plochy filtru, které vykazují toto označení, se pak mohou zviditelnit například autoradiografií. Označená sonda se nechá zreagovat s DNA vzorkem navázaným například na nitrocelulosu za takových podmínek, že budou hybrid i z ovát pouze doplňkové sekvence. Selektivita hybridizace je obvykle 5 °C pod Ti (irreversibilni teplota tání hybridu vytvořeného mezi sondou a její cílovou sekvencí) pro danou délku řetězce. Pro dvacetimery je doporučená hybridizační teplota kolem 58 °C. Promývací teploty jsou jedinečné podle sekvence, která se zkoumá, a podle potřeby, která se optimalizuje pro každou variantu.
Alternativní sondující postupy, jako je ligasová řetězová reakce (LCR), zahrnují použití sond s chybným párováním, tj. sond, které jsou plně doplňkové s cílem s výjimkou bodu mutace. Cílové sekvenci je pak umožněno hybridizovat jak s oligonukleotidy, které jsou plně doplňkové, tak s oligonukleotidy obsahujícími chybné párování za podmínek, které budou mezi nimi rozlišovat. Upravením podmínek reakce je možné získat hybridizaci pouze tehdy, když je plně doplňková. Jestliže je přítomno chybné párování, hybridizace je významně snížena.
Polymerasová řetězová reakce (PCR) je způsob, který amplifikuje specifické DNA sekvence s pozoruhodnou účinností. Opakované cykly denaturace, anelování primeru a rozšíření primeru prováděné s polymerasou, např. tepelně stabilním enzymem Taq polymerasa, vede k exponenciálnímu zvýšení koncentrace žádaných DNA sekvencí. Na základě znalosti nukleotidové sekvence mutace se mohou připravit syntetické oligonukleotidy, které jsou doplňkové k sekvencím, které obklopují DNA, o kterou se jedná. Každý oligonukleotid je doplňkový k jednomu ze dvou vláken. DNA může být za vysokých teplot denaturována (např. 95 °C) a potom reanelována v přítomnosti velkého molárního nadbytku oligonukleotidů. Tyto oligonukleotidy, orientované jejich 3' konci směrem k sobě, hybridizují opačná vlákna cílové sekvence a iniciují enzymatické rozšíření podél teraplátu nukleové kyseliny v přítomnosti čtyř deoxyribonukleotidtrifosfátů. Konečný produkt je pak opět děna túro ván pro jiný cyklus. Po tom, co se tento třístupňový cyklus několikrát zopakuje, se může dosáhnout amplifikace DNA segmentu více než miliónkrát. Výsledná DNA může být pak přímo sekvenována, aby se zjistilo umístění genetické změny. Může být také možné připravit takové oligonukleotidy, které se budou vázat jenom na změněnou DNA, takže PCR povede pouze k multiplikaci DNA, jestliže je v ní přítomna mutace. Po PCR se může pro detekci onemocnění souvisejícího s bodovou mutací použít přímé zviditelnění nebo alelově specifická oligonukleotidová hybridizace. Může se také použít adaptace PCR nazvaná amplifikace specifických allel (PASA). Toto používá specifickou amplifikaci pro rychlé a spolehlivé rozlišení mezi alelami, které se liší v jediném páru nukleotidů. Jestliže je to vhodné, mohou se pro dosažení vysokého počtu kopií použít další techniky, jako je 3SR, která využívá RNA polymerasy.
Podle ještě jiného způsobu může po PCR následovat štěpení restrikční endonukleasou s následující analýzou výsledných produktů. Substituce nukleotidů může vést k získání nebo ke ztrátě specifického místa pro restrikční endonukleasu. Získání nebo ztráta místa rozpoznávání restrikční endonukleasou usnadňuje detekci onemocnění souvisejícího s mutací použitím analýzy polymorfie délky restrikčního fragmentu (RFLP) nebo detekcí přítomnosti nebo nepřítomnosti polymorfního místa restrikční endonukleasy v PCR produtu, který překlenuje sekvenci, o kterou se jedná.
Pro RFLP analýzu se DNA získává například z krve, vzorku ze žaludku, slin, dentálního plaku, dalších tělesných tekutin nebo ze stolice subjektu, který je podezřelý, že obsahuje H. pylori nesoucí tagA nebo H. pylori isolovaný ze subjektu a ze subjektu infikovaného netoxickým H. pylori, rozštěpí se restrikční endonukleasou a potom se rozdělí podle velikosti elektroforesou na agarosovou gelu. Pro detekci produktů endonukleasového štepení se pak může použít Southernovo blotování hybridizací se značenými sondami. Vzorky, které se získají ze Southernova blotu, se pak srovnávají. Použitím tohoto přístupu se tagA DNA deteguje stanovením počtu detegovaných pásů a tento počet se srovná s DNA z kmenů H. pylori, které nesouvisejí s těžkým onemocněním. Restrikční endonukleasy se mohou efektivně použít také pro detekci mutací v genu tagA.
Podobné vytvoření dalších restrikčních míst substitucí nukleotidů v místech popsaných mutací lze snadno vypočítat pomocí genetického kódu a seznamu nukleotidových sekvencí rozpoznávaných restrikčními endonukleasami.
Konformační analýza jednoho vlákna (SSCA) nabízí relativně rychlý způsob detegování změn v sekvenci, které mohou být vhod52 né alespoň v některých případech.
Primery pro PCR a LCR mají délku obvykle 20 párů nukleotidů (pn) , s výhodou od 15 do 25 pn. Lepší amplifikace se dosáh- % ne, když oba primery mají stejnou délku a zhruba stejné nukleotidové složení. PCR podmínky mohou zahrnovat denaturaci vláken, ke které obvykle dochází při 94 °C, a rozšíření primeru při obvykle 72 °C. Teplota anelace se mění podle sekvence, kte- 4 rá se zkoumá. Příklady reakčních dob jsou: 20 minut denaturace, cyklů sestávajících z 2 minut anelace, 1 minuty rozšíření | a 1 minuty denaturace a nakonec 5 minutový stupeň rozšíření.
PCR amplifikace specifických alel (PASA) je rychlý způsob « detegování mutací nebo polymorfií jednoho nukleotidu. PASA 1 (známa také jako alelově specifická amplifikace) zahrnuje am- j plifikaci se dvěma oligonukleotidovými primery, z nichž jeden ;
je alelově specifický. Žádaná alela se účinně amplifikuje, za- ·>
tímco další alela (alely) se amplifikuje (amplifikují) slabě, 1 protože je (jsou) chybně zpárována (zpárovány) s nukleotidem t v nebo blízko 3' konce alelově specifického primeru. PASA nebo « způsob příbuzný PA SA mohou být použity pro specifickou amplifikaci mutovaných sekvencí podle vynálezu. Když se taková am- 4 plifikace dělá na H. pylori isolátech nebo vzorcích získaných z jedince, může sloužit jako způsob detegování přítomnosti mutací.
Jak bylo shora uvedeno, způsob známý jako ligasová řetězová reakce (LCR) se může použít pro úspěšné detegování substituce jednoho nukleotidu. LCR sondy mohou být kombinovány nebo se může použít více sond najednou pro simultánní vyhledávání násobných různých mutací. LCR tedy může být zvláště užitečná tehdy, jako zde, když násobné mutace předvídají stejné onemocnění.
Předložený vynález poskytuje sestavu pro diagnosu infekce kmeny H. pylori nesoucími antigen. Podrobně - tato sestava může detegovat přítomnost TagA antigenu specificky reaktivního s protilátkou nebo jejím imunoreaktivním fragmentem. Tato sestava může zahrnovat protilátku navázanou na substrát, sekundární protilátku reaktivní s antigenein a reakční činidlo pro detegování navázání sekundární protilátky na antigen. Touto sestavou může být ELISA sestava a může obsahovat substrát, primární a sekundární protilátky, jestliže je to vhodné, a další nutná reakční činidla, jako jsou detegovatelné částice, enzymové substráty a barvící činidla, jak shora popsáno. Diagnostická sestava může také znamenat imunoblotovou sestavu, která obvykle obsahuje složky a reakční činidla zde popsaná.
Diagnostická sestava podle předloženého vynálezu může být použita pro detegování přítomnosti primární protilátky specificky reaktivní s TagA nebo jeho antigenním fragmentem. Tato sestava může zahrnovat antigen navázaný na substrát, sekundární protilátku reaktivní s protilátkou specificky reaktivní s TagA antigenem a reakční činidlo pro detegování navázání sekundární protilátky na primární protilátku. Tato sestava může znamenat sestavu ELISA a může obsahovat substrát, antigen, primární a sekundární protilátky, jestliže je potřeba, a jakákoliv další nutná reakční činidla, jako jsou detegovatelné části, enzymové substráty a barvící činidla, jak shora popsáno. Diagnostická sestava může také znamenat imunoblotovou sestavu obvykle obsahující zde popsané složky a reakční činidla.
Jakmile je jednou stanovena nukleotidová sekvence TagA antigenu, je možné také zkonstruovat diagnostickou sestavu podle předloženého vynálezu pro detegování nukleotidových sekvencí specifických pro antigen obsahující složky sestavy, jako je substrát a reakční činidla pro detekci nukleových kyselin. Protože H. pylori infekci je možno diagnostikovat detegováním nukleových kyselin specifických pro antigen v žaludeční nebo duodenální tekutině a v tělesných kapalinách, jako je žaludeční šťáva, moč, stolice a sliny, odborníkovi bude zřejmé, že lze zkonstruovat takovou sestavu, která používá způsoby detegování nukleových kyselin, jako jsou analýzy specifickou sondou nukleových kyselin, primerů nebo polymorfie délky restrikčních fragmentů. Je třeba vzít v úvahu, že diagnostické sestavy budou dá54 le obsahovat positivní a negativní kontrolní test.
Příslušná reakční činidla a další složky obsažené v diagnostické sestavě podle předloženého vynálezu lze vybrat z těch, které jsou dostupný v oblasti techniky podle specifického diagnostického zpUsobu, který se v sestavě používá. Takové sestavy se mohou použít pro detegování antigenu v tkáni a v kapalných vzorcích ze subjektu.
Následující příklady jsou zamýšleny jako ilustrace, ale nikoliv jako omezení tohoto vynálezu. I když jsou typické z příkladů, které se mohou použít, mohou se používat i další postupy, které jsou známy odborníkům z oblasti techniky.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad 1
Klonování a exprese TagA antigenu
Bakteriální kmeny a podmínky rUstu
Pro klonování genu pro TagA antigen byl použit H. pylori kmen 84-183 (ATCC 53726). 32 klinických isolátU H. pylori od lidí, včetně kmenu, o nichž byly dříve ukázáno, že mají antigen, bylo použito pro zjištění zachování genu a korelaci s produkcí cytotoxinu (tabulka 1). Zásobní kultury byly uchovávány při -70 °C v živné pUdě bručela (Brucella broth od BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) doplněné 15 % hmotn. glycerolu. H. pylori kmeny byly kultivovány v živné pUdě bručela doplněné 5 % hmotn. plodového hovězího sera v mikroaerobní atmosféře (generované Campy Pak-Plus (BBL)) při 37 °C 48 hodin. Pro transformaci a expresi proteinu byly E. coli kmeny XLl-Blue (Stratagene, La Jola, Ka.), HB101 (ATCC 33694) a DH5a (Stratagene, La Jola, Ka.) kultivovány v mediu Luria-Bertoli (LB) s třepáním při 37 °C. Konečné koncentrace ampicilinu, když byl přidán k mediu, byly 100 /xg/ml.
Chemikálie a enzymy
Isopropyl-B-D-thiogalaktopyranosid (IPTG) byl získán od firmy Sigma Chemical Co. (St. Louis, Mo.) a byl používán v množství 57 /ig/ml. 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-B-D-galaktosid (X-GAL, konečná kocnentrace 40 /ig/ml) byl od firmy Boehringer-Mannheim (Indianopolis, In.). Restrikční enzymy, T4 DNA ligasa, E. coli DNA polymerasový velký (Klenowův) fragment a Sequenase™, byly od firem Promega a United States Biochemical (Cleveland, Oh.). [a-32P)dATP (650 Ci/mmol) byl od ICN Radiochemicals (Irvine, Ka.).
Genetické techniky a analýza nukleotidových sekvencí
Pro získání chromosomové DNA z H. pylori 84-183 byl tento kmen kultivován 48 h v živné půdě bručela obsahující 5 % hmotn. plodového hovězího sera, buňky byly peletovány a resuspendovány ve lOOmM Tris-HCl (pH 7,2) obsahující lOOmM NaCl. Buňky byly lysovány použitím 1% (hmotn.) SDS ve lOOmM Tris-HCl (pH 8,8). Po extrakcích směsí chloroform-fenol byla chromosomová DNA vysrážena 100% ethanolem. Plasmidy byly isolovány rychlou alkalickou extrakcí postupem podle Birnboima a Dolyho (Birnboim a Doly: Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).). čištění bylo ukončeno vysrážením v přítomnosti 800mM NaCl a 6,5% (hmotn.) polyethylenglykolu. Všechny další standardní způsoby molekulární genetiky, včetně sekvenčního pořadí delecí, byly prováděny tak, jak je popsáno v oblasti techniky (Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.). Nukleotidová sekvence byla stanovena jednoznačně na obou vláknech použitím dvouvláknových DNA templátů a dideoxy řetězového terminačního postupu, jak bylo popsáno dříve (Sanger a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 71, 1342 (1977) .) . Oligonukleotidové primery byly syntetizovány Vanderbilt University DNA Core Facility pomocí syntetizátoru Milligen 7500 DNA Synthesizer podle postupu výrobce. Nukleotidové sekvence byly sestaveny a analyzovány pomocí programu DNA-Star (DNA Star, lne., Madison, Wi.), sekvence domnělého promotoru a Shine-Dalgarnova sekvence byly identifikovány srovnáním se souhlasnými sekvencemi (Hawley a McClure: Nucleic Acids Res. 11. 2237 (1983).).
Konstrukce genomové knihovny z H. pylori
Chromosomová DNA z kmene 84-183 byla rozstříhána působením ultrazvuku a výsledné fragmenty byly podrobeny elektroforese na 0,7% (hmotn.) nízkotajícím agar osovém gelu. Fragmenty v rozmezí velikostí 2 000 až 10 000 pn byly vyštěpeny, zpracovány s T4 DNA polymerasou za vzniku zarovnaných konců a ligovány s fosforylovanými EcoRI oktamerovými linkery (New England Biolabs, Beverly, Ma.). DNA byla rozštěpena působením EcoRI a ligována na EcoRI raménka AZapII vektoru podle pokynů výrobce. Ligační směs byla přidána k pakážovací směsi Gigapack Ha (Stratagene) a titrována na XLl-blue buňky (lambda Zapil) nebo Y1088 (lambda gtll) buňky. Knihovny amplifikovaného fágu byly analyzovány adsorbovaným šerem z osob infikovaných H. pylori nebo plakovou hybridizací.
Klonování H. pylori specifických genů
Sérum z osoby infikované H. pylori, které silně rozpoznává antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000, bylo adsorbováno H. pylori kmenem 86-313, který neprodukuje pás o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000, a E. coli buňkami, aby se snížila pravděpodobnost nespecifické reaktivity. Potom bylo použito pro analyzování banky genů z knihovny amplif ikovaného tága ÁZapII (Blaser a Gotschlich: J. Biol. Chem. 265, 14529 (1990) .) . Banka obsahovala přibližně 4.104 insercí. Knihovna amplif ikovaného fágu byla analyzována tak, že přibližně 105 plaků rostlo na XL1 Blue buňkách 2,5 hodiny při 42 °C, potom byly převrstveny nitrocelulosovým filtrem předem impregnovaným lOmM IPTG a inkubovány 2 h při 37 °C. Filtry byly pak vyhodnocovány adsorbovaným šerem. Bylo detegováno 9 reaktivních klonů. Positivní plaky byly pak vyčištěny. Z těchto infikovaných E. coli buněk byly připraveny lysáty. Lysáty byly imunoblotovány adsorbovaným šerem. Klony, které exprimovaly rekombinantní proteiny, byly uchovány. Imunoblotovánim adsorbovaným lidským šerem každý z XLl-Blue lysátů vykazoval silně imunoreaktivní pás migrující při molekulové hmotnosti přibližně 75 000, 85 000 nebo 96 000, což odpovídá plasmidům pMCl, pMC2 nebo pMC3.
Z těchto tří representativních klonů byly koinfekcí s pomocným fágem vyštěpeny pBluescript plasmidy obsahující klonované DNA inserty, jak je podrobně popsány v literatuře (Short a spol.: Nucleic Acids Res. 16, 7583 (1988).). Čerstvé XLl-Blue buňky byly transformovány. Po vyčištění plasmidu byly získány mapy štěpení restrikčnimi enzymy. Plasmidy byly použity pro další charakterizaci. V souběžné studii byly z Agtll knihovny H. pylori 84-183 DNA stejným způsobem isolovány čtyři klony. DNA insert z jednoho ze čtyř positivních klonů byl amplifikován polymerasovou řetězovou reakcí (PCR) pomocí primerů založených na známých obklopujícíh Ágtll sekvencích. Rekombinantní fágová DNA ze čtyř positivních plaků byla vyčištěna. Každá obsahovala insert o 600 párech nukleotidů. Imunoblotové analýzy lysátů z těchto dvou klonů (λΥΒΙ a λΥΒ2) vykazovaly pásy o podobné velikosti o molekulové hmotnosti 130 000, které reagovaly s adsorbovaným lidským antiserem. Pro zjištění, jestli protein o molekulové hmotnosti 130 000 byl syntetizován rekombinanntím fágem jako napojený protein, byl buněčný lysát připravený z λΥΒΙ podroben imunoblotové analýze použitím antisera specifického na β-galaktosidasu. Zkřížená reaktivita ukazuje, že rekombinantní klon λΥΒΙ obsahuje napojení Agtll β-galaktosidasového velkého (o molekulové hmotnosti 116 000) fragmentu a H.pylori otevřené čtecí oblasti. Tento λΥΒΙ insert jsme klonovali do pUCl9, ale rekombinant (pYBl) neexprimoval žádný protein.
Gelová elektroforesa a imunoblotová analýza
Lysáty z E. coli, nesoucí rekombinantní lambda gtll, AZapII nebo pBluescript, byly analyzovány SDS-PAGE a imunoblotováním s adsorbovaným lidským šerem. Diskontinuální SDS (dodecylsulfát sodný)-PAGE (elektroforesa na polyakrylamidovém gelu) byla prováděna, jak bylo dříve popsáno (Blaser a spol.: Infect.
Immun. 42., 276 (1983).), použitím 4,5% (hmotn.) vrstveného gelu a 7,0% (hmotn.) dělícího gelu. Na každý pás gelu byly aplikovány vzorky, které obsahují 3 gg proteinu. Po elektroforese byly gely fixovány a proteiny byly detegovány modifikovaným způsobem obarvením stříbrem podle Oakleyho a spol. (Oakley a spol.: Anal. Biochem. 105, 361 (1980).). Koncentrované supernatanty kultury obsahující protein byly zředěny ve vzorku pufru a byly navrstveny na povrch polyakrylamidového gelu v Mini-PROTEAN II slab cell (Bio-Rad Laboratories, Richmond, Ka.). Po elektroforese byly proteiny elektroblotováním přeneseny na nitrocelulosový papír po dobu 1 h při 1 A. Po blokování nespecifického navázání byl nitrocelulosový papír inkubován 1 h za teploty místnosti se zředěními 1:100 vzorků sera. Jako druhá protilátka byly použity konjugáty kozího protilidského IgG s alkalickou fosfatasou (Tágo, lne., Burlingame, Ka.) ve zředění 1:2000.
Southernova hybridizace
H. pylori nebo C. jejuni chromosomová DNA byla rozštěpena buď působením HindlII nebo EcoRI a BamHI. Výsledné fragmenty byly elektroforesovány na 0,7% (hmotn.) agarosovém gelu v 0,04M Tris-acetát/2mM EDTA pufru (pH 8,2) . Všechny podmínky a postupy hybridizace byly přesně stejné, jak dříve popsáno (Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.). Sondy byly radioaktivně označeny rozšířením primerem použitím náhodných hexamerů (Feinberg a Bogelstein: Anal. Biochem. 132, 6 (1983) .) . Hybridizace byla prováděna 16 h při 68 °C v pufru obsahujícím 6x SSC (lx SSC znamená 0,15M NaCl, 0,015M citrát sodný), 0,5% (hmotn.) dodecylsulát sodný (SDS), 5x Denhardtův roztok (lx Denhardtův roztok znamená 0,02% (hmotn.) Ficol'1, 0,02% (hmotn.) polyvinylpyrrolidon, 0,02% (hmotn.) hovězí sérový albumin) a 100 jiig/ml lososí spermální DNA. Bloty byly promyty při 60 °C v 0,5x SSC a exponovány na XAR-2 rentgenový film (Eastman Kodak, Rochester, N.Y.).
Hybridizace kolonií
H. pylori kmeny byly kultivovány na tryptikasových sojových krevních agarových deskách (BBL) a kopie těchto kolonií byly přeneseny na nitrocelulosové filtry. Každý filtr byl umístěn na 3mm papír Whatman nasycený 0,2M NaOH/l,5M NaCl. Po 3 minutách byl filtr přenášen na 3mm papír Whatman nasycený 0,4M Tris-Cl (pH 7,6)/2x SSC 3 min, potom na 2x SSC 3 minuty. Blotové filtry s koloniemi byly sušeny 90 minut ve vakuové sušárně při 80 °C a hybridizovány radioaktivně označeným pMC3, jak popsáno v literatuře (Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.).
Produkce cytotoxinu
Supernatanty z živné půdy kultivace H. pylori byly 30x zkoncentrovány ultrafiltrací, potom byly pasážovány 0,2μΜ filtrem a inkubovány s HeLa buňkami. Stručně - H. pylori kmeny byly kultivovány při 37 °C v živné půdě bručela (BBL, Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) obsahující 5% (hmotn.) definovaného plodového hovězího sera (Hyclone, Logan, Utah) , doplněného lOmM chloridem amonným pro zvýšení cytotoxinové aktivity. Kultury na živné půdě byly inkubovány 72 h v mikroaerobní atmosféře na rotační míchačce při 100 otáčkách za minutu. Kultury byly odstřeďovány při 3000x g 15 minut. Supernatanty bez buněk byly skladovány při -70 °C. Po roztátí byly supernatanty 30x zahuštěny použitím ultrafiltrační membrány propouštějící molekulovou hmotnost 30 000. Zachycené podíly byly sterilovány pasážováním filtrem o velikost pórů 0,22 μη. Tyto koncentrované supernatanty kultury (CCSs) byly inkubovány s Hela buňkami (získanými od Allison O'Brien, Uniformed Services University of the Health Sciences, Bethesda, Md.) ve dvojnásobných ředěních od 1:10 do 1:320, jak dříve popsáno (Leunk a spol.: J. Med. Microbiol. 26. 93 (1988).) až na to, že analýzy toxicity byly prováděny v celkovém objemu 100 μΐ v mikrotitrovacích deskách o 96 jamkách (Falcon, Becton Dickinson and Co., Lincoln Park, N.J.).
Vakuolizace HeLa buněk byla kvantitativně vyhodnocována testem absorpce neutrální červeně. Ve stručnosti - zásobní roztok 0,5% (hmotn.) čisté neutrální červeně (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) byl připraven v 0,9% (hmotn.) solném roztoku a zfiltrován filtračním papírem Whatman č. 1. Barvící roztoky byly připraveny před každým pokusem zředěním zásobního roztoku 1:10 v mediu Eagle obsahujícím 10 % hmotn. plodového hovězího sera. Po 24 h inkubace s testovanými vzorky bylo medium převrstvující HeLa buňky odstraněno a nahrazeno 100 μΐ barvícího roztoku na jamku na dobu 4 minuty. Buňky byly promyty dvakrát 150 μΐ 0,9% (hmotn.) solného roztoku na jamku a neutrální červeň byla z buněk extrahována přidáním 100 μΐ okyseleného alkoholu na jamku (Montefiori a spol.: J. Clin. Microbiol. 26, 231 (1988).). Optická hustota (OD) při 540 nm jamek byla stanovena použitím MR700 ELISA readeru (Dunatech, Alexandria, Va.). Všechny testy byly prováděny třikrát. Ve všech pokusech střední OD jamek obsahujících buňky inkubované se samotným mediem byla menší než 0,130 (střed 0,101 ± 0,007). Toto pozadí OD bylo odečteno od OD pokusných jamek, aby se získala čistá OD. Z 32 testovaných kmenů H. pylori 15 kmenů produkovalo vakuolizační cytotoxin, jak bylo zjištěno tímto testem (tabulka 3) Mapování insertů pBluescript
Po rozštěpení EcoRI bylo zjištěno, že plasmidy pMCl, pMC2 a pMC3 obsahují DNA inserty o přibližně 2500, 2700 a 3600 párech nukleotidů. Analýza rekombinantních plasmidů zpracovaných s restrikční endonukleasou identifikovala zachovaný HindlII-rozštěpený fragment o 1200 pn ve všech třech případech (obrázek 1). Další studie se koncentrovaly na pMC3, který obsahoval největší insert. Analýza delečních mutací získaných štěpením endonukleasou III identifikovala orientaci a přibližné umístění otevřené čtecí oblasti (ORF) (obrázek 1, velká šipka).
Sekvenační analýza pMC3 a pYBl
Pro stanovení sekvence insertu o 3600 párech nukleotidů v pMC3 byly provedeny serie hnízdově uspořádaných delecí plasmidu použitím exonukleasy III (obrázek 1), jak bylo popsáno dříve (Sarabrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manuál, 1989.). Celkem byla stanovena sekvence úplného pMC3 inseretu představující 3648 pn na obou vláknech (sekv. id. č. 1) . Nukleotidy jsou očíslovány na pravé straně každého řádku. Nukleotidy kódující glycin na zbytku číslo 859 sekv. id. č. 1 jsou artefaktem klonovacího procesu a nejsou částí tagA genu. Sekv. id. č. 2 poskytuje odvozenou aminokyselinovou sekvenci nukleové kyseliny uvedené v sekv. id. č. 1.
Dlouhá otevřená čtecí oblast začínající na nukleotidu 1072 pokračuje ke konci insertu. Dvě další otevřené čtecí oblasti s opačnou orientací začínají na 645 pn a 264 pn. Odvozené aminokyseliny jsou uvedeny pod nukleotidy. Jsou označena potenciální ribosomová vazebná místa (Shine-Delgarnova sekvence, SD) a prvky domnělého promotoru (-35 a -10 sekvence). Ve kterékoliv ze šesti možných čtecích oblastí byla zjištěna pouze jediná ORF oblast přesahující 300 nukleotidů. Tato ORF kóduje TagA antigen o 859 aminokyselinách a poskytuje tak predpovězený protein s molekulovou hmotností 96 022 sekv. id. č. 2
Met Thr Asn Glu Thr Ile Asp Gin Gin Pro Gin Thr Glu Ala Ala 15 10 15
Phe Asn Pro Gin Gin Phe Ile Asn Asn Leu Gin Val Ala Phe Leu 20 25 30
Lys Val Asp Asn Ala Val Ala Ser Tyr Asp Pro Asp Gin Lys Pro 35 40 45
Ile Val Asp Lys Asn Asp Arg Asp Asn Arg Gin Ala Phe Glu Gly 50 55 60
Ile Ser Gin Leu Arg Glu Glu Tyr Ser Asn Lys Ala Ile Lys Asn 65 70 75
Pro Thr Lys Lys Asn Gin Tyr Phe Ser Asp Phe Ile Asn Lys Ser 80 85 90
Asn Asp Leu Ile Asn Lys Asp Asn Leu Ile Val Val Glu Ser Ser 95 100 105
Thr Lys Ser Phe Gin Lys Phe Gly Asp Gin Arg Tyr Arg Ile Phe 110 115 120
Thr Ser Trp Val Ser His Gin Asn Asp Pro Ser Lys Ile Asn Thr 125 130 135
Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His Thr Ile Gin Pro Pro Ile 140 145 150
Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu Lys Ser Ala Lys Gin 155 160 165
Ser Phe Ala Gly Ile Ile Ile Gly Asn Gin Ile Arg Thr Asp Gin I
170 175 180
Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu Lys Glu Arg Gin Glu 185 190 195
Ala Glu Lys Asn Gly Gly Pro Thr Gly Gly Asp Trp Leu Asp Ile 200 205 210
Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys Lys Gin Ser Ser Asp Val Lys 215 220 225
Glu Ala Ile Asn Gin Glu Pro Leu Pro His Val Gin Pro Asp Ile 230 235 240
Ala Thr Ser Thr Thr His Ile Gin Gly Leu Pro Pro Glu Ser Arg 245 250 255
Asp Leu Leu Asp Glu Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly 260 265 270
Asp Met Glu Met Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro 275 280 285
Asn Try Lys Phe Asn Gin Leu Leu Ile His Asn Asn The Leu Ser
290
295
300
Ser Val Leu Met Gly Ser His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val 305 310 315
Ser Leu Leu Tyr Ala Gly Asn Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp 320 325 330
Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys Asp Gin Gin Gly Asn Asn Val 335 340 345
Ala Thr Ile Ile Asn Val His Met Lys Asn Gly Ser Gly Leu Val 350 355 360
Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn Pro Ser Phe Tyr Leu 365 370 375
Tyr Lys Glu Asp Gin Leu Thr Gly Ser Gin Arg Ala Leu Ser Gin 380 385 390
Glu Glu Ile Gin Asn Lys Ile Asp Phe Met Glu Phe Leu Ala Gin 395 400 405
Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser Glu Lys Glu Lys Glu Lys 410 415 420
Phe Arg Asn Glu Ile Lys Asp Phe Gin Lys Asp Ser Lys Pro Tyr 425 430 435
Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp Arg Ile Ala Phe Via Ser Lys Lys 440 445 450
Asp Pro Lys His Ser Ala Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly Asp 455 460 465
Leu Ser Tyr Thr Leu Lys Val Met Gly Lys Lys Gin Ile Lys Ala 470 475 480
Leu Asp Arg Glu Lys Asn Val Thr Leu Gin Gly Asn Leu Lys His 485 490 495
Asp Gly Val Met Phe Val Asn Tyr Ser Asn Phe Lys Tyr Thr Asn 500 505 510
Ala Ser Lys Ser Pro Asn Lys Gly Val Gly Val Thr Asn Gly Val 515 520 525
Ser His Leu Glu Ala Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu ?
530 535 540
Pro Asn Leu Asn Asn Leu Ala Ile Thr Ser Val Val Arg Arg Asp 545 550 555
Leu Glu Asp Lys Leu Ile Ala Lys Gly Leu Ser Pro Gin Glu Ala 560 565 570
Asn Lys Leu Val Lys Asp Phe Leu Ser Ser Asn Lys Glu Leu Val 575 580 585
Gly Lys Ala Leu Asn Phe Asn Lys Ala Val Ala Glu Ala Lys Asn 590 595 6C0
Thr Gly Asn Tyr Asp Glu Val Lys Arg Ala Gin Lys Asp Leu 605 610
Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu Glu Lys Asp Val Ala 620 625
Asn Leu Glu Ser Lys Ser Gly Asn Lys Asn Lys Met Glu Ala 635 640
Ala Gin Ala Asn Ser Gin Lys Asp Glu Ile Phe Ala Leu Ile 650 655
Lys Glu Ala Asn Arg Asp Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala Gin 665 670
Leu Lys Gly Ile Lys Arg Glu Leu Ser Asp Lys Leu Glu Asn 680 685
Asn Lys Asp Leu Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe 695 700
Asn Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu 710 715
Ala Leu Lys Gly Ser Val Lys Asp Leu Gly Ile Asn Pro Glu 725 730
Ile Ser Lys Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe 740 745
Asn Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Val Thr Gin Ala Lys 755 760
Glu
615
Lys
630
Lys
645
Asn
660
Asn
675
Ile
690
Lys
705
Lys
720
Trp
735
Lys
750
Ser
765
Asp Gin Glu Asn Ser Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gin Lys Ile 770 775 780
Thr Asp Lys Val Asp Glu Leu Asn Gin Ala Val Ser Val Ala Lys 795
785 790
Ile Ala Cys Asp Phe Ser Gly Val Glu Gin Ala Leu Ala Asp Leu
800 805 810
Lys Asn Phe Ser Lys Glu Gin Leu Ala Gin Gin Ala Gin Lys Asn
815 820 825 $
Glu Ser Phe Asn Val Gly Lys Ser Glu Ile Tyr Gin Ser Val Lys
830 835 840
Asn Gly Val Asn Gly Thr Leu Val Gly Asn Gly Leu Ser Gly Ile 1
845 850 855
Glu Ala Thr Gly
(sekv. id. č. 2).
Směr transkripce odvozený od této ORF je také v souhlasu se směrem stanoveným dříve použitím delečních mutantů. Neexistuje však žádný terminační signál translace, což ukazuje na to, že i
ORF v pCM3 je uříznuta. Uříznutý fragment je bohatý na bazické aminokyseliny (tabulka 2) a předpovězený isoelektrický bod je 8,0. Potenciální ribosomové vazebné místo (AGGAG) končí 6 pn proti směru ORF. Sekvence 112 pn proti směru místa počátku translace vykazuje sekvenci promotoru TATAGT (sekv. id. č. 1) , která připomíná Pribnowovu souhlasnou promotorovou sekvenci TATNATN (Hawley a McClure). Tato domnělá -10 oblast, která je podobná sigma-70 promotoru, souvisí s -35 oblastí, ATGCCA, která sdílí 4 ze 6 nukleotidů s odpovídající souhlasnou sekvencí,
TTGACA (Hawley a McClure: Nucleic Acids Res. 11. 2237 (1983) .) .
Složení odvozené aminokyseliny uříznutého polypeptidu je uvedeno v tabulce 2.
Byly také identifikovány dvě menší ORF, každá probíhající v opačném směru (sekv. id. č. 1). První, kódující polypeptid aminokyselin, začíná na nukleotidovém páru 645 a nepředchází ji zřejmá Shine Delgarnova nebo domnělá promotorová sekvence. Druhá ORF začíná u páru nukleotidu 264 a kóduje 88 aminokyselin před koncem insertu. Tuto uříznutou ORF předchází Shine Dalgarnova sekvence. Sekvence TTTGAT 90 pn proti směru od místa počátku translace připomíná souhlasné místo promotoru -10, následované sekvencí TTGTCA, která sdílí 5 ze 6 nukleotidů s -35 souhlasnou sekvencí (Hawley a McClure: Nucleic Acids Res. 11. 2237 (1983).).
Insert o 600 párech nukleotidů v pYBl byl sekvenován jak přímým tak reversním primerem známých Agtll obklopujících sekvencí vedle dalších primerů na základě experimentálně odvozených insertních sekvencí. Těchto prvních 464 nukoeoitidů ze 620 pn pYBl sekvence překrývaly konec pMC3, ale ORF stále ještě pokračovala.
Serologické rozpoznání uříznutého rekombinantního TagA antigenu
Vedle uvedeného případu, sera z osob infikovaných H. pylori, která rozpoznávají TagA antigen z H. pylori kmene 84-183, rozpoznávají rekombinantní polypeptid. Kvůli této analýze jsme studovali sérum od 6 osob ne infikovaných H. pylori a od 14 osob infikovaných (7 rozpoznávalo a 7 nerozpoznávalo antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 z kmene 84-183) . Použitím lysátů E. coli XLl-Blue transformovaného pMC3 a imunoblotováním se snadno rozpozná antigen o molekulové hmotnosti 96 000 lidského sérového IgG. Celkem 4 ze 7 ser, která rozpoznávají přírodní pás o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000, také silně rozpoznávají rekombinantní protein proti žádnému z 13 testovaných ser, která nerozpoznávají pás o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 (p=0,007, Fischerův přesný test, oboustranný). Jestliže se uvažují slabé reakce na pMC3 pás, potom všech 7 ser, která rozpoznávají pás o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000, a 3 ze 13, která ho nerozpoznávají, reagují s rekombinantním proteinem (p=0,003, Fischerův přesný test, oboustranný) . Rekombinantní protein produkovaný pMC3 může být tedy použit pro serologická testování, která detegují protilátky na
H. pylori antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000.
Zachování tagA genu
Pro zjištění, jestli jiné H. pylori kmeny neosu tagA gen nebo homologní sekvence, bylo studováno 32 kmenů hybridizaci kolonií použitím pMC3 jako sondy (tabulka 3) . Positivní signál byl získán u 19 (59,34 %) těchto kmenů. SDS-PAGE a imunoblotování celých buněk těchto kmenů ukázalo, že 19 (59,3 %) z těchto kmenů exprimuje pás o molekulové hmnotnosti 120 000 až 128 000.
Zjištění z irounoblotování a hybridizace kolonií se plně shodovala. Všech devatenáct H. Pylori kmenů exprimujících protein má homolog genu, při srovnání se žádným ze 13 kmenů neexprimujících tento protein (p<0,001, Fischerův přesný test, jedno- ;
stranný). Vedle toho všech 15 kmenů produkujících vakuolizační ; cytotoxin vykazovalo jak pMC3 hybridizaci tak přítomnost pásu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 (tabulka 3). i
Pro získání informací o polymorfii restrikčního fragmentu tagA genu a toho, jestli existují násobné homologní geny v každém bakteriálním genomu, byla připravena genomová DNA ze 4 H. j, pylori kmenů a byla provedena Southernova hybridizace použitím pMC3 jako sondy. Dva kmeny expriraující protein o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 a s positivní hybridizaci kolonií vykazovaly nyní silnou hybridizaci na HindlII restrikční fragment migrující při přibližně 1200 pn, slabší pásy u 300 a 3300 pn. U třetího pásu, který vykazoval tento fenotyp a měl positivní hybridizaci kolonií, sonda hybridizovala silně v Southernově analýze na pás o asi 1100 pn. Žádné slabší pásy nebyly vidět. Pás migrující při méně než 500 pn, který hybridizoval slabě se sondou, byl přítomen ve všech třech kmenech. H. pylori kmen, který neexprimoval žádný protein o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 a který měl negativní hybridizaci kolonií, stejně jako C. jejuni kmen použitý jako kontrola, nevykazoval hybridizaci v Southernově analýze. Hybridizace pMC3 na chromosomovou DNA z kmenů 84-183 a 60190 rozštěpených EcoRI a BamHI také vykazovala polymorfii, což potvrzuje heterogenitu pozorovanou u jiného restrikčního enzymu. Tyto studie ukazují, že i když homology TagA existují v jiných H. pylori kmenech, existuje heterogenita buď v intragenových nebo obklopujících sekvencích.
Předložený příklad poskytuje klonovaný fragment H. pylori genomové DNA, která zahrnuje většinu genu, který kóduje důležitý H. pylori antigen. Důkaz, že pMC3 obsahuje gen kódující TagA antigen, může být shrnut uveden následujícím způsobem: i) ani protein ani gen nejsou přítomny ve všech kmenech H. pylori, ii) pouze kmeny, které exprimují protein o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000, hybridizují s pMC3, kmeny, které neexprimu-. jí protein, nehybridizují, iii) sera z osob infikovaných H. pylori, která rozpoznávají antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000, rozpoznávají produkt rekombinantního tagA významně častěji než kontrolní sera.
Částečné sekvence tagA a dvou dalších ORF nemají žádnou identitu s N-koncem nebo třemi vnitřními sekvencemi z cytotoxinu o molekulové hmotnosti 87 000. Toto zjištění je v souladu s dřívějšími pozorováními, že proteiny o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 a 87 000 jsou antigenově nepříbuzné (Cover a Blaser: J. Biol. Chem. 267, 10570 (1992).). Srovnání uříznutého odvozeného genového produktu odhalilo malou přímou homologii se známými proteiny.
Gen tagA nebo homologní geny jsou přítomny v přibližně 60 % studovaných isolátů H. pylori, ale nejsou přítomny v ostatních. Jak ukazuje Southernova analýza, existuje důkaz pro polymorfii restrikčního fragmentu, i když byl zkoumán pouze malý počet kmenů. Nepřítomnost homologie přesně odpovídala chybějící expresi antigenního pásu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000. Fenotyp, kterému chybí tento pás, tedy neexistuje díky deficitům týkajícím se transkripce nebo exprese, ale spíše díky nepřítomnosti implikovaného genu.
Přítomnost genomové DNA obsahující alespoň uříznutý tagA gen velice souvisí s produkcí cytotoxinu. Menší část kmenů, které mají tagA gen, neprodukuje detegovatelná množství cytotoxinu. Tento jev může odrážet suboptimální citlivost detegovat toxin v testu buněčné kultury nebo může znamenat, že s toxinovou aktivitou souvisejí jiné faktory než TagA antigen.
Jak bylo ukázáno imunoblotovými studiemi, pMC3 produkty jsou vynikající diagnostická činidla pro detekci lidských sérových protilátek na TagA antigen. Použití tohoto rekombinantního proteinu může okamžitě doplnit dostatečný antigen a pomoci ve vývoji imunoanalýz, kterými by se zjišťovalo, které osoby jsou infikovány H. pylori kmeny produkujícími přírodní protein o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000. Heterologní protilátky proti pMC3 genovému produktu mohou být použity pro zjištění, které kmeny produkují tagA antigen. Znalost DNA sekvence pMC3 umožňuje konstrukci oligonukleotidů pro použití jako hybridizační sondy nebo primery pro PCR. Tyto způsoby jsou použity také pro rychlou detekci infekce díky kmenu s implikovaným genotypem. Vytvoření delečních mutantů umožňuje objasnění role tohoto genového produktu a poskytuje jak terapeutická činidla tak kandidáty pro vakcíny. Tyto diagnostické způsoby a mutanty jsou zde podrobně popsány.
Tabulka 1
Helicobacter pylori kmeny použité v této studii
označení kmene místo isolace exprese antigenu0 o mol. hmotnosti exprese aktivity vakuolizuj ícího cytotoxinub
120 000 - 128 000
Tx30a Texas - -
84-183 Texas + +
60190 Anglie + +
87-29 Kolorado + +
86-123 Kolorado - -
87-199 Kolorado + +
Tabulka 1 (pokračování)
Helicobacter pylori kmeny použité v této studii
označení kmene místo isolace exprese antigenu8 o mol. hmotnosti exprese aktivity vakuolizujícího cytotoxinub
120 000 - 128 000
86-385 Kolorado - -
87-33 Kolorado + +
87-81 Kolorado + +
87-91 Kolorado + +
86-90 Kolorado - -
87-226 Kolorado + -
86-225 Kolorado - -
87-230 Kolorado - -
87-75 Kolorado - -
87-203 Kolorado - -
87-6 Kolorado + -
86-338 Kolorado - -
86-63 New York + -
86-86 New York + +
86-332 Minesota + +
92-18 Tennessee + +
92-19 Tennessee + +
92-20 Tennessee - -
92-21 Tennessee + +
92-22 Tennessee + -
92-23 Tennessee - -
92-24 Tennessee - -
92-25 Tennessee + +
92-26 Tennessee + +
92-27 Tennessee + +
92-28 Tennessee — —
a Rozpoznání pásu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 v buněčném lysátu lidským šerem, jak bylo detegováno imunoblotem (Cover a spol.: Infect. Immun. 58, 603 (1990).).
T2.
b Produkce vakuolizujícího cytotoxinu, jak byl detegován v HeLa buněčné kultuře (Cover a spol.: Infect. Immun. 59., 1264 (1991)·)
Tabulka 2
Aminokyselinové složení useknutého
TagA polypeptidu o 859 aminokyselinách, jak bylo odvozeno z pMC3
amino- kyselina počet zbytků procento z 859 aminokyselin
Ala 60 7,0
Cys 2 0,2
Asp 62 7,2
Asn 82 9,5
Glu 59 6,9
Gin 48 5,6
Phe 44 5,1
Gly 54 6,3
His 12 1,4
Ile 50 5,8
Lys 101 11,8
Leu 67 7,8
Met 12 1,4
Pro 24 2,8
Arg 22 2,6
Ser 63 7,3
Thr 30 3,5
Val 47 5,5
Trp 4 0,4
Tyr 16 1,9
Tabulka 3
Korelace mezi přítomností pásu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 imunoblotem, hybridizací s pMC3 a produkcí cytotoxi-
nu u 32 H. pylori isolátů z lidí
charakteristiky kmenů počet kmenů
přítomnost pásu o mol. hmotn. 120000-128000 na imunoblotu8 hybridizace pMC3 na H. pylori koloniib produkce cytotoxinu v testu buněčné kulturyc
+ + + 15
- - - 13
+ + - 4
- - + 0
- + - 0
+ - - 0
+ - + 0
— + + 0
8 Rozpoznání pásu o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 v buněčném lysátu lidským šerem, jak bylo detgeováno imunoblotem (Cover a spol.: Infect. Immun. 58, 603 (1990).).
b Hybridizace pMC3 na lysované H. pylori buňky v blotu kolonií (Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.) c Produkce vakuolizujícího cytotoxinu, jak byl detegován v HeLa buněčné kultuře (Cover a spol.: Infect. Immun. 59, 1264 (1991)·)
Příklad 2
Konstrukce a charakterizace tagA-negativního kmene Helicobacter pylori
Bakteriální kmeny, vektory a podmínky růstu
H. pylori kmen 84-183 (ATCC 53726) použitý v této studii byl ze sbírky kultur Vanderbilt University Campylobacter/Helicobacter Laboratory. Byl vybrán proto, že byl obšírně charakterizován. Zásobní kultury byly uchovávány při -70 °C v živné půdě bručela (BBL Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) doplněné 15 % hmotn. glycerolu. H. pylori kmeny byly nechány růst v živné půdě bručela doplněné 5 % hmotn. plodového hovězího sera nebo na deskách krevního agaru doplněného nalidixovou kyselinou (50 mg/1), vankomycinem (10 mg/1), polymyxinem B (5000 j./l) a trimethoprimem (5 mg/1) za mikroaerobních podmínek 48 h při 37 °C. E. coli kmen DH5a (Stratagene, La Jolla, Ka.) použitý pro transformaci, byl nechán růst v LB mediu. Jak shora popsáno, pMC3 obsahuje uříznutý tagA gen na insertu o 3500 pn v Bluscript. Plasmid pILL600 (Labigne-Roussel a spol.: J. Bacteriol. 170, 1704 (1988).) byl použit jako zdroj C. coli genu resistence na kanamycin (km).
Chemikálie a enzymy
Pokud bylo jejich použití nutné, pak byly konečné koncentrace ampicilinu 100 jug/ml a kanamycinu 50 /zg/ml. Restrikční enzymy, T4 DNA ligasa a E. coli DNA polymerasový velký (Klenowův) fragment byly od firmy Promega and United States Biochemicals (Cleveland, Oh.). a-32P-dATP (650 Ci/mmol) byl od ICN Radiochemicals (Irvine, Ka.).
Genetické způsoby
Chromosomová DNA byla připravena jak shora popsáno. Plasmidy byly isolovány postupem podle Birnobima a Dolyho (Birnboim a Doly: Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979).). Všechny další standardní způsoby molekulární genetiky byly prováděny tak, jak je popsáno v oblasti techniky (Sambrook a spol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.). DNA fragmenty použité jako sondy pro hybridizační pokusy byly vyčištěny na gelu.
Zavedení km kazety do H. pylori kmene 84-183
E. coli gen resistence na kanamycin byl vložen do jedinečného Ndel místa pMC3. Vytvořil se tak pMC3:km (obrázek 2). Tato konstrukce byla zavedena přímo do H. pylori kmene 84-183 elektroporací. Stručně - H. pylori buňky vyrostlé na krevních agarových destičkách 48 h byly isolovány, promyty třikrát elektroporačním pufrem (15% (hmotn.) glycerol/5% (hmotn.) sacharosa) a suspendovány ve 2 00 μΐ pufru. Plasmidová DNA z pMC3:km byla isolována rychlým (mini-preparativním) způsobem alkalické lyse podle Birnboima a Dolyho a přidána k buňkám. Směs se inkubuje 5 minut v ledu. Buňky a DNA se přenesou do 0,2cm elektroporační kyvety v přístroji Gene-pulsar (Bio-Rad). Pulsy vysokého napětí (25 F, 2,5 kV a 200 Ω) se dodávají, jak bylo dříve popsáno (Ferrero a spol.: J. Bacteriol. 174. 4212 (1992).). Po elektroporací byly buňky suspendovány ve 400 μΐ LB media a rozprostřeny na krevní agarové destičky. Desky byly inkubovány 24 h při 37 °C za mikroaerobních podmínek. Potom byly buňky isolovány, vysety na krevní agarové destičky obsahující 50 gg/ml kanamycinu a inkubovány mikroaerobně 48 h.
Použitý klonovací vektor nebyl schopen replikovat v H. pylori. Selekce na mediu obsahujícím kanamycin poskytla rekombinanty resistentní na kanamycin. Z přibližně 1010 H. pylori plak tvořících jednotek bylo získáno 3 000 transformantů (10'7), jestliže se použije 500 ng plasmidové DNA.
Hybridizace kolonií
Padesát transformantů resistentních na kanamycin získaných elektroporací bylo necháno růst na krevních agarových destič76 kách. Kopie těchto kolonií byly přeneseny na nitrocelulosové filtry. Každý filtr byl umístěn na 3mM papír Whatman nasycený 0,2M NaOH/l,5M NaCl. Po 3 minutách byl filtr přenesen na 3mM papír Whatman, sycen 0,4M Tris-HCl (pH 7,6)/2x SSC po dobu 3 minut a potom 2x SSC po dobu 3 minut. Blotové filtry kolonií byly sušeny ve vakuové sušárně 90 minut při 80 °C a hybridizovány radioaktivně označeným pBluescriptem nebo genem km-resistence, jak shora popsáno. Bloty kolonií byly promyty při 60 °C V 0,5x SSC a exponovány na XAR-2 rentgenový film (Eastman Kodak, Rocherster, N.Y.).
Gelová elektroforesa a imunoblotová analýza
Byly připraveny lysáty E. coli nesoucí pBluescript, pMC3 nebo pMC3:km nebo z H. pylori buněk a byly analyzovány elektroforesou na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) . Imunoblotování extraktů celých buněk odvozených od přírodního typu a mutantů 1, 21 a 22 bylo prováděno jak shora podrobně popsáno použitím adsorbovaného lidského sera při zředění 1:300 a kozího protilidského imunoglobulinového alkalického fosfatasového konjugátu jako sekundární protilátky při zředění 1:2000, jak shora popsáno. Tyto studie ukázaly, že isogenní mutované kmeny 1, 21 a 22 neměly žádný antigenní tagA genový produkt.
Southernova hybridizace
Byla provedena Southernova hybridizace přírodního H. pylori kmenu 84-183 a transformantů M21 a M22 resistentních na kanamycin. H. pylori chromosomová DNA byla rozštěpena působením HindlII a/nebo BamHI a Sací. Výsledné fragmenty byly elektroforesovány na 0,7% (hmotn.) agarosovém gelu a přeneseny na nylonovou membránu. Sondami byly DNA fragmenty vyčištěné na gelu a odvozené od pMC4 nebo pILL600. Sondy byly radioaktivně označeny primerovým rozšířením použitím náhodných hexamerních oligonukleotidů, jak shora popsáno. DNA byla pak přenesena na nylonovou membránu a hybridizována pMC4 označeným 32P nebo km kazetou o 1300 pn za podmínek vysoké selektivity. Hybridizace by77 ly prováděny v roztoku 6x SSC, 0,5% (hmotn.) SDS, 5x Denhardtův roztok a 100 gg/ml lososové spermální DNA. Bloty byly promývány 30 minut při 60 °C v 0,5x SSC/0,1% (hmotn.) SDS.
Genotypová charakterizace trasformantů
Pro získáni genetického důkazu, že tagA gen je v transformovaných kmenech roztržen, byla DNA, isolovaná z přírodního kmene 84-183 a H. pylori mutantů 21 a 22, rozštěpena restrikční endonukleasou HindlII nebo BamHI a Sací. Po oddělení rozštěpené DNA na agarosovém gelu byla DNA přenesena na nylonovou membránu a hybridizována na pMC4, což je tagA sonda. Tato sonda hybridizovala na BamHI-SacI fragmenty o přibližně 20 000 a 1 000 pn v přírodním kmenu, zatímco BamHI-SacI fragment o 1 000 pn byl ztracen a byl pozorován nový hybridizující fragment o 2 300 pn v obou mutovaných kmenech bez přerušení jiných vazeb. Podobně byl ztracen HindlII fragment o 1 200 pn a v obou mutantech byl získán fragment o 2 200 pn, díky inserci genu resistence na kanamycin. Sonda kanamycinového genu hybridizovala pouze s BamHI-SacI fragmentem o 2 300 pn a HindlII fragmentem o 2 200 pn v mutantech kmenů 21 a 22, což ukazuje, že v tagA genu došlo k substituci. Gen tagA v kmenu 84-183 byl tedy mutagenizován vložením genu km.
Cytotoxinová produkce
Cytotoxinová produkce byla testována jak shora uvedeno. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 4. Výsledky ukazují, že pro vakuolizaci není potřebný ani neporušený TagA antigen ani ne-porušený tagA gen.
Tabulka 4
Cytotoxinová produkce přírodními H. pylori kmeny a tagA mutanty
ředění super- natantu optická hustota8
84-183 Ml M22 87-203b
1:5 0,21±0,04 0,26±0,04 0,23+0,05 0±0,02
1:10 0,16±0,02 0,20±0,03 0,13±0,02 0,01±0,01
1:20 0,13+0,01 0,15±0,02 0,10±0,02 0,01±0,01
1:40 0,09±0,02 0,06±0,01 0,06±0,02 0,01±0
1:80 0,03±0,01 0,04±0 0,02±0,01 0,01±0
1:160 -0,01±0,02 -0,01±0,01 -0,01±0,02 -0,02+0,02
8 čistá optická hustota měřená testem neutrální červeně vakuolizace indukované cytotoxinem, jak shora popsáno (Cover a spol.: Infect. Immun. 59, 1264 (1991).) b Kmen 87-203 je kmen, o němž není známo, že produkuje cytotoxin.
Příklad 3
Gen tagA plné délky a genový produkt
Klonování a sekvenování genu plné délky
Pro isolaci genu plné délky jsme použili fragment o 600 pn z pYBl jako sondu pro testování knihovny λZapil z H. pylori 84-183. Bylo vyčištěno pět positivních plaků. Plasmidy pBluescript obsahující klonované DNA inserty byly vyštípnuty koinfekcí s pomocným fágem. Každý z pěti positivních klonů obsahoval DNA inserty od 2000 do 3000 pn (data neuvedena). Klon označený pYB2, který obsahuje insert o 2700 pn, byl vybrán pro další studie. Byla připravena restrikční mapa (obrázek 3). Byla provedena serie hnízdových delecí počínaje na kterémkoliv konci insertu pYB2 o 2700 pn působením exonukleasy III. Použitím pře79 krývajících se delečních klonů pYB2 jsme stanovili sekvenci o 1969 pn v obou vláknech. Jak bylo očekáváno, prvních 785 nukleotidů této sekvence (sekv. id. č. 3 počínaje nukleotidem 2864) se překrývalo s koncem pMC3. Translace úplné nukleotidové sekvence generované z pMC3, pYBl a pYB2 ve všech možných čtecích formách odhalila jednu otevřenou čtecí oblast o 3543 nukleotidech počínající ATG kodonem v poloze 1072 a končící TAA kodonem v poloze 4615. Tato sekvence kóduje protein 1181 aminokyselinových zbytků (sekv. id. č. 4) . Vypočtená molekulová hmotnost odvozeného polypeptidu je 131 517. Sekvence, která by mohla vytvořit potenciální strukturu kmenové smyčky v mRNA a která by mohla sloužit jako místo terminace transkripce (ÁG = -14,4 kcal) , je sekvence od nukleotidu 4642 do 4674 (sekv. id. č. 3) .
Homologie TagA polypeptidu s jinými proteiny
Prohledání bank s proteinovými daty Swiss.Prot version 21 a NBRF-PIR neukázalo žádné význačné homologie s antigenem TagA plné délky (sekv. id. č. 4) . Nej vyšší homologii však měla chloroplastová H+-transportující ATP synthasa (Hiratsuka a spol.: Mol. Gen. Genet. 217. 185 (1989) a Rodermal a Bogorad: Genetics 116. 127 (1987).) a protein sodného kanálku (Trimmer a spol.: Neutrol 3., 33 (1989).) s 16,8% a 17,3% identitou a 50 % a 42,6 % zachovanými aminokyselinami v oblasti mezi zbytky 1 až 482 a 123 až 1182. Jestliže byly srovnávány aminokyselinové sekvence dalších dvou ORF obsažených v pMC3 s proteinovými databázemi, nebyly pozorovány žádné významné homologie.
Obsah bazických aminokyselin [141 lysinů (11,9 %) a 117 asparaginů (9,9%)] TagA byl neobvykle vysoký a konzistentní s předpovězeným isolelektrickým bodem peptidu (8,89). Průběh hydrofilnosti ukazuje, že odvozený protein je převážně hydrofilní. Zajímavou vlastností primární struktury tohoto proteinu je přítomnost struktur homopolymerní aminokyselinové sekvence, nejpozoruhodněji polyasparaginu (sekv. id. č. 4, poloha 3705). Při analýze srovnávání této oblasti bohaté na asparagin s různými databázemi proteinových sekvencí existovala vysoká homolo80 gie se sekvencemi z kvasinkových (Forsburg a Guarente: Genes Dev. 3, 1166 (1989), Hudspeth a spol.: Cell 30, 617 (1982), Ju a spol.: Moll. Clel. Biol. 10, 5226 (1990), Ju a spol.: Moll. Cell. Biol. 10, 5226 (1990), O'Hara a spol.: Nucleic Acids Res. 16. 10133 (1988), Rhode a spol.: Genes Dev. 3, 1926 (1989), Tanaka a spol.: Mol. Cell. Biol. 9, 757 (1989) a Toda a spol.: Genes Dev. 2, 517 (1988).) a Plasmodium (Stáhl a spol.: Nucleic Acids Res. 14, 3089 (1986).) proteinů vázajících nukleotid. Polyasparagin byl nalezen také v regulačním produktu vázajícím DNA genu lac9 Kluyveromyces var. lactis (Salmeron a Johnston: Nucleic Acids Res. 14, 7767 (1986).) a transportního proteinu draslíku (TRK1) ze Saccharomyces cerevisiae (Gaber a spol.: Mol. Cell. Biol. 8, 2848 (1989).).
Konstrukce tagA genu plné délky
Pro zkonstruování tagA genu plné délky jsme použili jedinečné restrikční místo Sací umístěné jak v pMC3 tak pYB2 (obrázek 3). Nejdříve byl tagA fragment o 3600 pn z pMC3 klonován do pUC19 vektoru pod kontrolou lacZ promotoru. Byl získán pUTl. Potom byl Sací fragment o 2600 pn z pYB2 klonován do plJTl rozštěpeného působením sací. Byl vybrán klon se správnou orientací, který byl nazván pUT2. Identický klon (pEM3), ale přítomný ve vektoru pGEM3z, byl uložen v ATCC v souladu s požadavky Budapešťské dohody pod č. 69273. E. coli buňky, obsahující pUT2 nebo pEM3, exprimovaly imunoreaktivní H. pylori protein o molekulové hmotnosti 128 000.
Detekce lidských serologickýeh odpovědí na rekombinantní TagA protein Westernovým blotováním
Pro stanovení toho, jestli lidské sérum reaguje s rekorabinantním TagA proteinem plné délky, byl lysát z pEM3 obsahujících buněk elektroforesován na 7% (hmotn.) akrylamidovém gelu a elektroblotován na nitrocelulosový papír. Sera od 10 H. pylori infikovaných lidí a 10 neinfikovaných lidí byla zředěna 1: :100 a testována na reaktivitu s rekombinantním proteinem. Sera od 7 osob infikovaných H. pylori rozpoznávala TagA protein při srovnání se séry od 1 z 10 ne infikovaných osob (p=0,01, jednostranný Fischerův přesný test) . Rekombinantní protein plné délky byl tedy užitečným antigenem pro zjišťování odpovědí člověka na H. pylori.
Příklad 4
H. pylori kmeny nesoucí tagA související se zvýšeným rizikem vyvinutí adenokarcinomu žaludku
Tento příklad popisuje serologický test pro stanovení toho, jestli Helicobacter pylori infekce souvisí s tagA* kmenen. Tento test sérového IgG, využívající orv220, zjistil, že rekombinantní tagA fragment má citlivost 94,4 % a specifičnost 92,5 %, jestliže se používá u klinicky definované populace.
Předložený příklad také ukazuje, že H. pylori infekce souvisí s rizikem rakoviny žaludku. Vzorky sera získané od skupiny pacientů japonsko-amerických mužů na Havaji byly použity ve studii 103 mužů infikovaných H. pylori, u nichž se případně (13let po odebrání vzorků sera) vyvinula rakovina žaludku, a 103 spárovaných kontrolních vzorků od mužů infikovaných H. pylori, u nichž se ve stejném období nevyvinula rakovina. Sérové protilátky na TagA souvisely s 1,9-násobkem (0,9 až 4,0, p =0,08) zvýšeného rizika vyvinutí rakoviny žaludku během doby pozorování. Ze 75 mužů s intestinálním typem rakoviny distálního žaludku byl poměr (OR) 2,3 (1,0 až 5,2, p=0,056). Diagnosa nádoru v nízkém věku (<72 let) a pozdní stadium významně souvisely s TagA positivitou.
Následující výsledky ukázaly, že přítomnost sérových protilátek na produkt rekombinantního tagA přesně stanovuje tagA status infikování kmenem H. pylori a ukazuje, že infekce kmenem tagA* souvisí se zvýšeným rizikem vyvinutí rakoviny žaludku, zvláště intestinálního typu ovlivňujícího vzdálený žaludek.
Výběr pacientů pro validační studii
Pro stanovení užitečnosti TagA serologického testu byla studována sera od 181 osob, jejichž H. pylori status byl předem definován (Sipponen a spol.: Scand. J. Gastroenterol. Suppl. 196. S3-S6 (1993), Doolea a spol.: N. Engl. J. Med. 321. 1562 (1989), Cover a spol.: J. Clin. Invest. 90, 913 (1992) a Peek R.M. jr.: J. Clin. Microbiol. (1994).). Neinfikované osoby (n =115) byly ty, u kterých byla provedena endoskopie a biopsie, neodhalila H. pylori infekci rychlým ureasovým testem nebo histologickým zkoumáním. Všichni pacienti měli také negativní sérologii ve standardním testu ELISA na sérum IgG směrované proti H. pylori (Pérez-Pérez a spol.: Ann. Intern. Med. 109. 11 (1988) .) . 115 neinf ikovaných pacientů bylo dohodou rozděleno na referenční skupinu (n=35) a testovanou skupinu (n=80). Infikované osoby byly ty, u nichž byl v kultuře při biopsii získán H. pylori. Těchto 66 pacientů zahrnovalo pacienty s duodenálním vředem (n=14), Žaludečním vředem (n=6), samotnou gastritidou (n= =36) nebo jinými diagnosami (n=10). U každého pacienta byl vyhodnocen jeden isolát, aby se stanovil tagA status hybridizací kolonií genově specifickou sondou, jak bylo dříve popsáno (Forman a spol.: Int. J. Cancer 46. 608 (1990) a Peek R.M. jr.: J. Clin. Microbiol. (1994).). Podle hybridizačního testu bylo 36 pacientů definováno jako infikovaných tagA* kmenem a 30 pacientů tagA kmenem. Všechna sera byla skladována při -20 °C do použití.
Výběr pacientů pro studium rakoviny
Všichni pacienti v této studii byli částí japonsko-havajského studijního souboru pacientů, jak shora uvedeno. Během období 21 let (1968 až 1989) byl u 109 případů identifikován pathologicky potvrzený karcinom žaludku. Předcházející serologické testování ukázalo, že 103 z těchto pacientů bylo infikováno H. pylori v době původního odebrání jejich sera v šedesátých letech (Nomura a spol.: N. Engl. J. Med. 325. 1132 (1991).). Ze 103 spárovaných kontrol těchto případů jich bylo 83 infiko83 váno H. pylori. Pro každých ze zbývajících 20 H. pylori infikovaných případů byly podle předcházejících kriterií identifikovány 3 další kontroly (Nomura a spol.: N. Engl. J. Med. 325, 1132 (1991).). Sérologie pro zjištění, jestli je přítomna H. pylori infekce, byla dělána na kódovaných vzorcích. Z positivních byla náhodně vybrána jedna kontrola infikovaná H. pylori pro každých 20 nespárovaných případů. Celkem tato studie sestávala ze 103 mužů infikovaných H. pylori, u nichž se vyvinula rakovina žaludku, a jejich 103 spárovaných kontrol, které také byly infikovány H. pylori, ale během studijního období se u nich nevyvinula rakovina žaludku.
Příprava rekombinantního TagA antigenu
BamHI fragment o 1700 pn obsahující pn 1921 až 3648 z tagA klonovaného v pMC3 (Tummuru a spol.: Infect. Immun. 61. 1799 (1993).) byl subklonován do BamHI místa plasmidu pET15b (Novagen, Madison, Wi.) po směru vlákna T7 promotoru. Tento plasmid (pORV220) byl použit pro transformaci E. coli hostitelského kmene BL21, ÍDE3 lysogenu obsahujícího gen T7 RNA polymerasy pod kontrolou lacUV5 promotoru (Studier a spol.: J. Mol. Biol. 189. 113 (1986).). Přidání IPTG k rostoucí kultuře lysogenu indukuje T7 polymerasu transkribovat cílovou DNA na rekombinantní plasmid. Tento vektor umožňuje transkripčně regulovanou expresi napojeného proteinu sestávajícího z TagA fragmentu s N-koncovým histidin-tag. Napojený protein sestává ze 600 zbytků (24 vektor + 576 insert) a má předpovězenou molekulovou hmotnost 66 400. Protein byl vyčištěn od lysátů indukovaných kultur živné půdy použitím pryskyřice chelatující nikl a eluován imidazolem, jak je popsáno v literatuře (Baier a spol.: Biotechniques 17, 94 (1994) .) .
Serologické způsoby
Přítomnost sérových IgG protilátek na H. pylori byla stanovena testem ELISA sestavou Pyloristat (Biowhittaker, Walkersville, Md.), jak byl dříve popsáno (Nomura a spol.: N. Engl.
J. Med. 325. 1132 (1991) .) . Pro TagA ELISA testy byly optimální koncentrace antigenu, pacientova sera a anti-lidského IgG konjugátu stanoveny šachovnicovými titracemi. Pro orv220 byla optimální koncentrace antigenu 5 /xg/ml. Jamky mikrotitrovací desky s 96 jamkami byly naplněny ΙΟΟμΙ podíly. Optimální ředění lidského sera bylo 1:100, křenová peroxidasa konjugovaná s kozím protilidským IgG byla použita ve zředění 1:4000. Další podrobnosti serologickýeh zpUsobU byly přesně takové, jak je to popsáno v podobných testech (Cover a spol.: J. Clin. Invest. 90. 913 (1992) a Pérez-Pérez a spol.: Ann. Intern. Med. 109. 11 (1988).).
Statistická analýza
Pro srovnání prostředku byl použit t-test pro párované vzorky. McNemarUv test byl použit pro srovnání distribuce rUzných vlastností mezi pacienty a kontrolní subjekty. Poměry (OR) pro rakovinu žaludku, vztaženo na výsledky TagA analýzy, byly odvozeny od podmíněných logistických regresních zpUsobU (Breslow a spol.: International Agency for Research on Cancer 247 (1980).). Testy pro lineární trend v logistickém risku byly odvozeny od podmíněných logistických regresních modelu použitím seskupených výsledku TagA testu (kódované čtvrtinou jako 1, 2, 3 nebo 4). Všechny modely podmíněné logistické regrese vyhovovaly použití pravděpodobných zpUsobu opakovaného maxima a speciální aplikaci regresního modelu poměrného hazardu (Harrel F.E. jr.: The PHGLM Proceduře” v SUGI supplemental library user's guide, Joyner S.P. (red.)., Cary, NC SAS Institute, 267 (1983).). Ocenění přisouzeného rizika karcinomu žaludku vzhledem k tagA* kmenu bylo založeno na zpUsobu podle Waltera (Walter S. : Int. J. Epidemiol. 7, 175 (1978).). Křivka charakteristická pro operátor přijímače (ROC) byla zkonstruována tak, aby sumarizovala vyhodnocenou citlivost a specifičnost.
Diagnostická přesnost TagA sérologie použitím orv220
Předcházející studie TagA sérologie používaly rekombinant85 ní antigen, který byl vyčištěn z lysáte buněk E. coli (Cover a spol.: The 120-128 kDa cytotoxin-associated protein (CagA) as a markér for ulcerogenic Helicobacter pylori strains, abstrakt přednesený na Annual Meeting of the American Gastroenterological Association, New Orleans, Lusiana, USA, květen 1994.). Jelikož čištění tohoto antigenu bylo zdlouhavé a protahovalo se, byly exprimovány překrývající se tagA genové fragmenty jako napojené proteiny v alternativním prokaryotickém expresním systému. Předběžné studie ukazovaly, že orv220 exprimoval nejlépe z několika kandidátních antigenů založených na dosud studovaných TagA fragmentech. Uříznutý protein byl srovnáván s antigenem vyčištěným z E.coli kmenů transformovaných pEM3, který kóduje úplný tagA ORF. Výsledky získané lineární regresní analýzou sérového IgG pro 41 osob (19 infikovaných a 22 neinfikovaných) úzce korelovalo s analýzami s použitím dvou různých antigenů (r=0,96, p<0,001). Použitím stejného prahu střední hodnoty pro neinfikované osoby + 2 SD, poskytl orv200 antigen negativní výsledek pro 21 (95 %) z 22 neinfikovaných osob. Výjimka byla slabě positivní. U 19 osob infikovaných H. pylori byly výsledky s orv220 přesně stejné jako pro pEM3 antigen (12 positivních a 7 negativních). Serologická reaktivita s TagA fragmentem o molekulové hmotnosti 66 400 kódovaným orv220 byla tedy téměř identická se serologickou reaktivitou detegovanou s větším TagA fragmentem.
Aby se získal test, byla sera od 36 pacientů, o nichž je známo, že nejsou infikováni H. pylori, použita jako referenční a po násobných bězích byly stanoveny prahy na základě středních hodnot plus intervaly standardní odchylky. Současně byla testována sera z druhé skupiny 80 neinfikovaných osob, 36 osob, o nichž je známo, že jsou infikováni kmenem TagA, a 30 osob, u nichž byl jako H. pylori isolát získán pouze tagA*. Nepřekvapivě byly optické hustoty neinfikovaných osob téměř identické s optickými hustotatmi referenčních skupin. Naproti tomu hodnoty u osob infikovaných kmeny tagA+ byly významně vyšší (Studentův T-trest, P<0,001, jednostranný). U 30 ser získaných od osob, z nichž jediným isolátem byl kmen tagA*, byla pozorována bimo86 dální distribuce. U 27 z těchto ser byly hodnoty podobné hodnotám u dvou skupin neinfikováných osob, ale u tří ser byly hodnoty mnohem vyšší a podobné hodnotám u pacientů infikovaných kmeny tagA.
Aby se zjistil práh pro použití diagnostických analýz, byla zkoumána přesnost některých krajových hodnot optické hustoty (tabulka 5) . Celkově byla nejvyšší přesnost získána tehdy, když byla použita střední hodnota pro 35 neinfikováných referenčních) pacientů + 3 intervaly standardní odchylky s citlivostí 94,4 % a specifičností 92,5 %. Ve všech dalších studiích byl použit tento typ prahu. Na základě ROC křivek existuje vysoká hladina diskriminace tagA statutu použitím orv220.
Vyhodnocení stability hladiny protilátek
Pro zjištění, jestli sérové protilátky na TagA produkt přetrvávají během chronické H. pylori infekce, byly vyhodnoceny párované sérové vzorky od 36 epidemiologistů, kteří byli částí dříve studovaného souboru pacientů, kvůli klinickým a epidemiologickým vlastnostem souvisejícím s H. pylori infekcí (Parsonnet a spol.: Gastroenterol. 102. 41 (1992).). V průměry byly vzorky získány po 7,59 roku. Hodnoty ve standardním H. pylori ELISA testu (Parsonnet a spol.: Gastroeneterol. 102. 41 (1992).) byly srovnávány s hodnotami v TagA ELISA testu.
Ze 36 účastníků se žádný sérově nezměnil z positivního na negativního vůči protilátkám anebo naopak. Hodnoty střední optické hustoty získané z prvního a druhého sera byly velice podobné (0,217 proti 0,249, p=0,3, párovaný t-test, tabulka 6).
Souvislost tagA positivity s rakovinou Žaludku
Díky vyvinutí testu pro detegování osob infikovaných H. pylori kmeny nesoucími TagA použitím TagA nebo antigenních fragmentů tento vynález ukzauje, že infekce tagA* kmenem souvisí s rizikem vyvinutí rakoviny žaludku. Z dřívější studie na
109 japonsko-amerických pacientech, u nichž se vyvinula rakovina žaludku během 21 let pozorování (Nomura a spol.: N. Engl. J. Med. 325. 1132 (1991).), bylo 103 zjištěno jako infikovaných H. pylori na základě vzorků sera získaného od nich průměrně 13 let před diagnosou rakoviny. Každý z těchto případů byl spárován s kontrolou ze stejné skupiny pacientů, stejného věku, kteří byli také infikováni H. pylori; charakteristiky 103 mužů infikovaných H. pylori, u nichž se vyvinula rakovina žaludku, a jejich věkově spárovaných kontrol jsou uvedeny v tabulce 7. Tyto dvě skupiny mužů byly podobné, pokud jde o demografické charakteristiky a laboratorní hodnoty.
U této populace přítomnost sérových protilátek proti TagA (tj. infekce tagA positivním H. pylori kmenem) souvisela se zvýšeným rizikem vyvinutí rakoviny (OR=1, p=0,08)(tabulka 8). Analýza omezená na 101 případ rakoviny distálního žaludku a jejich kontroly ukázala velice podobné hodnoty, jak bylo očekáváno (OR=1,8, p=0,ll). Když byly případy s distálními rakovinami rozděleny podle histologického typu nádoru, největší souvislost byla s intestinálním typem (OR=2,3, p=0,065), ale ne difuzním typem (OR=1,0, p=l,0); u 3 mužů byla histologie neurčitelná. Positivita v TagA ELISA testu nebyla výsledkem serokonverze během intervalu, kdy bylo sérum získáno a kdy byla diagnostikována rakovina. Ani velikost TagA protilátkové odpovědi neodpovídala faktoru rizika vyvinutí rakoviny. V populaci osob infikovaných H. pylori přítomnost tagA souvisela s přisouditelným rizikem 28 % (95 % C.I. = 0 až 57 %) rakoviny žaludku. Neexistovala žádná souvislost mezi hladinami IgG protilátek na TagA a hladinami IgG na zachované H. pylori antigeny.
Analýza TagA protilátek byla rozdělena podle věku pacientů, při němž byla rakovina žaludku diagnostikována. TagA seropositivita souvisela s trojnásobným (95 % C.I. = 1,0 až 9,3; =0,057) zvýšením rizika rakoviny žaludku u 52 mužů, jejichž diagnosa byla stanovena před věkem 72 let. Naproti tomu u 51 mužů, jejich diagnosa byla stanovena ve věku 72 let nebo později, nebyla souvislost významná (0R=l,3, 95 % C.I. =0,5 až 3,5).
TagA seropositivita souvisela s rizikem vyvinutí pokročilého stadia nádoru (3 nebo 4), 0R=2,6, 95 % C.I. =1,1 až 6,2, p= =0,03, ale nikoliv s časným (1 nebo 2) stadiem nádoru (0R= =1,0). Riziko vyvinutí rakoviny žaludku související s TagA seropositivitou nebylo zvýšeno, když byly subjekty rozděleny podle data narození nebo podle příbuznosti.
I když některé ze shora uvedených OR hodnot nejsou statisticky významné použitím konzervativní oboustranné analýzy významnosti, použití jednostranné analýzy ukazuje, že souvislosti se všemi typy rakovin a intestinálních typů rakovin dosahují statistickou významnost (p=0,04 a 0,028). Nedetegované rozdíly v riziku mezi těmito dvěma skupinami, chybějící perfektní přesnost testu a variace odpovědí na tuto infekci od pacienta k pacientovi může pomoci vysvětlit chybějící významnost.
Násobná infekce
Současná infekce žaludku dvěma H. pylori kmeny byla popsána s frekvencemi od 10 do 13 % (Fujimoto a spol.: J. Clin. Microbiol. 32., 331 (1994) a Prewett a spol.: Gastroenterol. 102. 829 (1992) .) ; byla popsána také simultánní infekce třemi různými kmeny (Fox a spol.: American Society for Microbiology, Washington, D.C.).). Při původní validační studii byla od každého pacienta získána pouze jediná kopie, takže nebyla příležitost zkoumat násobnou infekci. Avšak skutečnost, že 3 ze 30 (10 %) osob, u nichž tagA' kmen byl jediným isolátem, měly vysokou hladinu serologických odpovědí na TagA, ukazuje na to, že tyto osoby byli koinfikovány tagA* kmenem. Jelikož pouze spojení simultánní infekce tagA' kmenem a druhým tagA* kmenem a nikoliv naopak by mohla vykazovat dichotomické výsledky mezi testováním kolonie a serologickou analýzou, tato data předpokládají, že frekvence násobné infekce může být podstatně vyšší než dříve uváděná frekvence, která byla založena na malém počtu biopsií (Parsonnet a spol.: N. Engl. J. Med. 325. 1127 (1991) a Prewett a spol.: Gastroenterol. 102. 829 (1992).).
Předložený příklad dále podporuje užitečnost neinvazivních serologickýeh analýz H. pylori infekcí, protože bylo ukázáno, že jsou globálními analýzami vzorku z celého žaludku. To je rozdíl proti způsobům založeným na biopsii pouze vzorku malé frakce («1 % hmotn.) mukózy žaludku. Jelikož TagA je imunodominantní antigen (Covacci a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90. 5791 (1993).), serologické testy mají potenciálně schopnost detegovat infekce tagA+ organismy, i když počty jsou nízké vzhledem k tagA' isolátům.
Souvislosti s podřadou agresivnějších nádorů (mladší věk, vyšší stupeň v době diagnosy) a shoda dat s předloženou hypotézou ukazují, že účinnost je skutečná, jak je dále podpořeno četnými skutečnostmi TagA biologie. Za prvé, infekce tagA+ kmeny souvisí se zvýšeným poškozením epitelových buněk (Crabtree a spol.: Lancet 338 332 (1991) a Peek a spol.: Gastroenterol. (1994, v tisku).). Poškození na povrchu žaludečních epitelových buněk podporuje nebo možná iniciuje onkogenesi. Za druhé, infekce cagA+ kmeny souvisí s vyššími stupni zánětu žaludku (Asaka a spol.: Cancer 73, 2691 (1994) a Peek a spol.: Gastroenterol. (1994, v tisku).) a se zvýšenou expresí protizánětlivých cytokinů, jako je IL-1 a IL-8 (Peek a spol.: Gastroenterol. (1994, v tisku) a Crabtree a spol.: Journal of Clinical Pathology 47., 61 (1994) .) . Ty mohou přispívat k epitelovému poškození. Za třetí, většina tagA* kmenů také exprimuje vakuolizující cytotoxinovou aktivitu (Tummuru a spol.: Infect. Immun. 61. 1799 (1993) a Covacci a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90. 5791 (1993).). Exprese cytotoxinu, která se zjistí sérum neutralizujícími protilátkami, může souviset s rakovinou žaludku (Hirai a spol.: Int. J. Cancer 56, 56 (1994).). A konečně, rakovina žaludku intestinálního typu více souvisí se zvýšeným zánětem a atrofickou gastritidou než u difuzního typu (Sipponen P., Lauren: Scand. J. Gastroenterol. 29., 336 (1994) a Sipponen a spol.: J. Gastroenterol. Hepatol. 6, 244 (1991).).
Bylo ukázáno, že protilátkové odpovědi s vysokým titrem na zachované H. pylori antigeny souvisely s rizikem rakoviny žaludku (Nomura a spol.: N. Engl. J. Med. 325, 1132 (1991) a Leunk a spol.: J. Med. Microbiol. 26, 93 (1988).). Jednou interpretací tohoto jevu je to, že vysoké hladiny protilátek jsou markéry stupně zánětu, aktivní zánět je považován za prekursor onkogenních událostí (Blaser M.J., Parsonnet J.: J. Clin. Invest. 94, 4 (1994).). Chybějící striktní korelace rakoviny žaludku a hladiny anti-TagA protilátek může odrážet přepárování, protože byly vybrány pouze osoby infikované H. pylori, které všechny mají jistý stupeň zánětu. Při jakékoliv události musí být význam těchto zjištění přizpůsoben pozorováním, že TagA positivita byla přítomna u 78 % kontrol infikovaných H. pylori, u kterých se nevyvinula rakovina. Infekce tagA+ kmenem tedy buď není nutná nebo není postačující pro onkogenezi. Bylo ale ukázáno, že je faktorem, který je v tomto procesu zahrnut.
Přítomnost tagA v kmenu může být markérem pro přilehlé geny nebo pro příslušný fenotyp, který sám je důležitý pro zánět nebo pro onkogenní proces. Nicméně tento příklad ukazuje, že. příslušné H. pylori kmeny souvisejí s diferenčním rizikem rakoviny žaludku.
Souhrn
U osob, o nichž je známo, že jsou infikovány tagA* kmeny, existuje široké rozmezí serologické reaktivity, ale bez podstatného překryvu s reaktivitou neinfikovaných osob. Stabilita výsledků během let v nepřítomnosti antimikrobiální terapie dále ukazuje na užitečnost TagA testu.
Tím, že tento vynález poskytuje přesný test detegování infekce tagA* kmenem H. pylori, umožňuje také zjištění, že infekce tagA* kmenem je rizikovým faktorem pro vyvinutí rakoviny žaludku. Infekce tagA* kmenem téměř zdvojnásobuje riziko vyvinutí rakoviny žaludku během 21 let při srovnání s infekcí tagA kmenem. Tento účinek byl znatelnější u osob, u kterých se vyvinuly intestinální novotvary.
Další použití předložených objevů je umožněno tím, že byl získán vyčištěný TagA a antigenní fragmenty TagA a že bylo ukázáno, že infekce kmenem exprimujícím TagA ukazuje predispozici pro karcinom žaludku.
Tabulka 5
Diagnostická hodnota TagA ELISA testu použitím orv220 skupina počet počet (v závorce v %) převyšující práh* sub j ekt ů ____________
1SD 2SD 3SD 4SD
neinf ikovaná 80 12 (15) 9 (11,3) 6 (7,5) 3 (3, 8)
infikovaná, 30 9 (30) 6 (20) 5 (16,7) 4 (13 ,3)
tagA kmen infikovaná, 36 36 (100) 35 (97,2) 34 (94,4) 31 (86 ,1)
tagA* kmen
Práh znamená střed plus uvedené intervaly standardní odchylky (SD) hodnot optické hustoty (ODR) pro referenční skupinu 35 osob, o nichž je známo, že nejsou infikováni H. pylori.
Tabulka 6
Stabilita sérových protilátek na H. pylori antigeny u 36 subjektů vzorek sera sérová IgG odpověď na označený antigen zachované H. pylori antigeny** TagA* původní následuj ící*
3260 0,217 ± 0,30
2913 0,249 ± 0,35
Následující vzorek byl získán průměrně 7,59 ± 1,0 rok po původním vzorku.
Hladina protilátky znamená reciproký geometrický střední titr na sestavu sonikátů pěti H. pylori kmenů.
* Hladina protilátky znamená střed ± SD optické hustoty.
Tabulka 7
Chrakteristiky pacientů infikovaných H. pylori s rakovinou žaludku a kontrolních subjektů v době, kdy byl získán vzorek sera
charakteristika pacienti (n=103) kontrola (n=l03) P-hodnota
střední věk při sledování 58,8 58,7 0,18
(roky)
% narozených v USA 83 83 0,83
% ženatých/vdaných 93 95 0,72
% požívajících alkohol 65 73 0,27
střední index tělesné hmotn. 23,5 24,0 0,33
střední diastolický krevní 81,6 82,1 0,74
tlak (v hektoPa)
střední sérový cholesterol 5,7 5,6 0,74
(mmolů/litr)
střední sérová glukosa 9,3 9,2 0,92
(mmolů/litr)
Tabulka 8
VPrůměrná spolehlivost pro souvislosti infekce tagA* H. pylori kmenem s rakovinou žaludku typ status párování8 celkem prům. interval rakoviny (pacienti/kontrola) souvi- 95% spole-
Žaludku +/+ +/~ / + slost hlivostib
celková 69 21 11 2 103 1,9 (0,9-4,0)
distální 68 20 11 2 101 1,8 (0,9-3,8)
intestinální 48 18 8 1 75 2,3 (1,0-5,2)
difuzní 18 2 2 1 23 1,0 (0,1-7,1)
+/+: jak pacient tak spárovaná kontrola vykazují serologickou odpověď na TagA +/-: pacient, ale nikoliv spárovaná kontrola, vykazuje serologickou odpověď na TagA
-/1: kontrola, ale nikoliv pacient, vykazuje serologickou odpověď na TagA
-/- ani pacient ani kontrola nevykazují serologickou odpověď na TagA oboustranná analýza

Claims (26)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Isolovaná nukleová kyselina kódující antigen Helicobacter pylori o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000 nebo jeho antigenový fragment, při čemž tento antigen souvisí s peptickým vředem.
  2. 2. Vektor, který obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 1.
  3. 3. Vektor podle nároku 2 v hostiteli vhodném pro exprimování polypeptidu kódovaného nukleovou kyselinou.
  4. 4. Nukleová kyselina podle nároku 1, která obsahuje nukleotidy 1072 až 4614 obsažené v nukleotidové sekvenci id. č. 3
    ATGGGCTGCG CGTAACGAAA AACAGTCGCT TGACCTCTTT TGATGTCATC 50 AGAGATTTTC CAAATATCCG CTATACCTTT GACTCCTAGA GCGCAACCAC 100 CTACGATGGC TAGAACAGAA ATGATCTGAA CCACCAAAGT TTTAGTCTCA 150 GTAATGCCTG ATGCAGGACT GTCGAAAGCC ATTAAAGGAT TGGCTGCTAT 200 CGCTAGCCCT AAAGTTACTA CAACTTTCTT GTAGCTGTCA GTGATTCTTG 250 TAAAAAATTT CATGCGTTTC CTTTCAAATT GAAATCAATC GTTTGAGTAT 300 ATCAAAAAAA AGTATTTTTA TACTATTCAT ACAAGCGCTA CTTTATAATT 350 TAAATCAAAA CCGACGCTTT TGTTTGACAA CTGATATAAT TTAGGAACAA 400 TAAACCTACT TGTCCCAACC ATTTTTCTTT CTCAAGTCAT CGTAGAATTG 450 TAGATCTTTA GGATCTTTGA TGTATTTTTT AATCGTCTCA GGTTGAAACC 500 TAAAAACAAG CAGAAACAAA CCCAAGCTGA TCAGAGTGAG AATAAAGCTC 550 CATTTTAAGC AACTCCATAA ACCACTAAAG AAACTTTTTT TGAGACTCTC 600 TTTGAAAATC TGTCCTATTG ATTTGTTTTC CATTTTGTTT CCCATGCGGA 650 TCACAAACGC TTAATTACAA ATACATACTA TAATAAGTAT GGCACACACA 700 AACCAAACCA TTTTTAGAAC GCTTCATGCA CTCACCTTGC TCCTAACCAT 750 TTCTCCAACC ATCTTTAGCG TTGCATTTGA TTTCTTCAAA AAGGGTCATT 800 TCTTAGTTTC TTTTATTCTT AAAATTTTTC CATTCTAGCA AATTTTTGTT 850 AATTGTGGGT AAAAATGTGA ATCGTTCCTA GCTTTTAGAC GCTTGCAACG 900 ATCGGACTTT TTTCAATATT AATGAAAAAA TGCCAAATAT TCTAAATATT 950 GTGGTATAGT GATAACGTTC AAAGACACGA ATTGCATACT CAAAGTGTGT 1000 AGTAGTTTTT AGCGGTCTTT GATACCAATA AGATACCGAT AGGTATGAAA 1050
    CTAGGTATAG AAGGAGAAAC A ATG Met
    CAA CCA CAA ACC GAA GCG GCT Gin Pro 10 Gin Thr Glu Ala Ala 15 AAT AAT CTT CAA GTA GCT TTT Asn Asn Leu 25 Gin Val Ala Phe GCT TCA TAC GAT CCT GAT CAA Ala Ser Tyr Asp 40 Pro Asp Gin GAT AGG GAT AAC AGG CAA GCT Asp Arg Asp Asn Arg 55 Gin Ala AGG GAA GAA TAC TCC AAT AAA Arg 65 Glu Glu Tyr Ser Asn 70 Lys AAG AAT CAG TAT TTT TCA GAC Lys Asn 80 Gin Tyr Phe Ser Asp 85 TTA ATC AAC AAA GAC TAT CTC Leu Ile Asn 95 Lys Asp Asn Leu AAG AGC TTT CAG AAA TTT GGG Lys Ser Phe Gin 110 Lys Phe Gly
    ACT Thr AAC Asn GAA ACT ATT Ile GAC Asp CAA Gin 1095 Glu Thr 5 TTT AAC CCG CAG CAA TTT ATC 1137 Phe Asn Pro Gin Gin 20 Phe Ile CTT AAA GTT GAT AAC GCT GTC 1179 Leu 30 Lys Val Asp Asn Ala 35 Val AAA CCA ATC GTT GAT AAG AAC 1221 Lys Pro 45 Ile Val Asp Lys Asn 50 TTT GAG GGA ATC TCG CAA TTA 1263 Phe Glu Gly 60 Ile Ser Gin Leu GCG ATC AAA AAT CCT ACC AAA 1305 Ala Ile Lys Asn 75 pro Thr Lys TTT ATC AAT AAG AGC AAT GAT 1347 Phe Ile Asn Lys Ser 90 Asn Asp ATT GTC GTG GAA TCT TCC ACA 1389 Ile 100 Val Val Glu Ser Ser 105 Thr GAT CAG CGT TAC CGA ATT TTC 1431 Asp Gin 115 Arg Tyr Arg Ile Phe 120
    ACA AGT TGG Trp GTG Val TCC Ser 125 CAT His CAA AAC GAT CCG TCT AAA ATC AAC 1473 Thr Ser Gin Asn Asp Pro 130 Ser Lys Ile Asn ACC CGA TGC ATC CGA AAT TTT ATG GAA CAT ACC ATA CAA CCC 1515 Thr Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His Thr Ile Gin Pro 135 140 145 CCT ATC CCT GAT GAC AAA GAA AAA GCA GAG TTT TTG AAA TCT 1557 Pro Ile Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu Lys Ser 150 155 160 GCC AAA CAA TCT TTT GCA GGA ATC ATC ATA GGG AAT CAA ATC 1599 Ala Lys Gin Ser Phe Ala Gly Ile Ile Ile Gly Asn Gin Ile 165 170 175 CGA ACG GAT CAA AAA TTC ATG GGC GTG TTT GAT GAA TCC TTG 1641 Arg thr Asp Gin Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu 180 185 190 AAA GAA AGG CAA GAA GCA GAA AAA AAT GGA GGG CCT ACT GGT 1683 Lys Glu Arg Gin Glu Ala Glu Lys Asn Gly Gly Pro Thr Gly 195 200 GGG GAT TGG TTG GAT ATT TTT TTA TCA fglfJWJt ATA TTT GAC AAA 1725 Gly Asp Trp Leu Asp Ile Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys 205 210 215 AAA CAA TCT TCT GAT GTC AAA GAA GCA ATC AAT CAA GAA CCA 1767 Lys Gin Ser Ser Asp Val Lys Glu Ala Ile Asn Gin Glu Pro 220 225 230 CTT CCT CAT GTC CAA' CCA GAT ATA GCC ACT AGC ACC ACT CAC 1809 Leu Pro His Val Gin Pro Asp Ile Ala Thr Ser Thr Thr His
    235
    240
    245
    ΑΤΑ CAA GGC TTA CCG CCT GAA TCT AGG Arg 255 GAT TTG CTT GAT GAA Glu 260 1851 Ile Gin Gly Leu 250 Pro Pro Glu Ser Asp Leu Leu Asp AGG GGT AAT TTT TCT AAA TTC ACT CTT GGC GAT ATG GAA ATG 1893 Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly Asp Met Glu Met 265 270 TTA GAT GTT GAG GGC GTC GCC GAC ATG GAT CCC AAT TAC AAG 1935 Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro Asn Try Lys 275 280 285 TTC AAT CAA TTA TTG ATT CAC AAT AAC ACT CTG TCT TCT GTG 1977 Phe Asn Gin Leu Leu Ile His Asn Asn The Leu Ser Ser Val 290 295 300 TTA ATG GGG AGT CAT GAT GGC ATA GAA CCT GAA AAA GTT TCA 2019 Leu Met Gly Ser His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val Ser 305 310 315 TTA TTG TAT GCG GGC AAT GGT GGT TTT GGA GCC AAG CAC GAT 2061 Leu Leu Tyr Ala Gly Asn Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp 320 325 330 TGG AAC GCC ACC GTT GGT TAT AAA GAC CAA CAA GGT AAC AAT 2103 Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys Asp Gin Gin Gly Asn Asn 335 340 GTG GCT ACA ATA ATT AAT GTG CAT ATG AAA AAC GGC AGT GGC 2145 Val Ala Thr Ile Ile Asn Val His Met Lys Asn Gly Ser Gly 345 350 355 TTA GTC ATA GCA GGT GGT GAG AAA GGG ATT AAC AAC CCT AGT 2187 Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn Pro Ser 360 365 370
    TTT TAT CTC TAC Leu Tyr 375 AAA GAA GAC CAA CTC ACA GGC Gly TCA CAA CGA 2229 Phe Tyr Lys Glu Asp Gin 380 Leu Thr Ser Gin 385 Arg GCA TTG AGT CAA GAA GAG ATC CAA AAC AAA ATA GAT TTC ATG 2271 Ala Leu Ser Gin Glu Glu Ile Gin Asn Lys Ile Asp Phe Met 390 395 400 GAA TTT CTT GCA CAA AAC AAT GCT AAA TTA GAC AGC TTG AGC 2313 Glu Phe Leu Ala Gin Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser 405 410 GAG AAA GAG AAA GAA AAA TTC CGA AAT GAG ATT AAG GAT TTC 2355 Glu Lys Glu Lys Glu Lys Phe Arg Asn Glu Ile Lys Asp Phe 415 420 425 CAA AAA GAC TCT AAG CCT TAT TTA GAC GCC CTA GGG AAT GAT 2397 Gin Lys Asp Ser Lys Pro Tyr Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp 430 435 440 CGT ATT GCT TTT GTT TCT AAA AAA GAC CCA AAA CAT TCA GCT 2439 Arg Ile Ala Phe Via Ser Lys Lys Asp Pro Lys His Ser Ala 445 450 455 TTA ATT ACT GAG TTT AAT AAG GGG GAT TTG AGC TAC ACT CTC 2481 Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly Asp Leu Ser Tyr Thr Leu 460 465 470 AAA GTT ATG GGA AAA AAG CAG ATA AAG GCT TTA GAT AGG GAG 2523 Lys Val Met Gly Lys Lys Gin Ile Lys Ala Leu Asp Arg Glu 475 480 AAA AAT GTC ACT CTT CAA GGT AAC CTA AAA CAT GAT GGC GTG 2565 Lys Asn Val Thr Leu Gin Gly Asn Leu Lys His Asp Gly Val
    485 490 495
    ATG TTT Met Phe GTT AAT TAT TCT AAT TTC AAA TAC ACC AAC GCC TCC Ser 2607 Val Asn Tyr Ser Asn Phe 505 Lys Tyr Thr Asn Ala 510 500 AAG AGT CCC AAT AAG GGT GTA GGC GTT ACG AAT GGC GTT TCC 2649 Lys Ser Pro Asn Lys Gly Val Gly Val thr Asn Gly Val Ser 515 520 525 CAT TTA GAA GCA GGC TTT AGC AAG GTG GCT GTC TTT AAT TTG 2691 His Leu Glu Ala Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu 530 535 540 GCT AAT TTA AAT AAT CTC GCT ATC ACT AGT GTC GTA AGG CGG 2733 Pro Asn Leu Asn Asn Leu Ala Ile Thr Ser Val Val Arg Arg 54 5 550 GAT TTA GAG GAT AAA CTA ATC GCT AAA GGA TTG TCC CCA CAA 2775 Asp leu Glu Asp Lys Leu Ile Ala Lys Gly Leu Ser Pro Gin 555 560 565 GAA GCT AAT AAG CTT GTC AAA GAT TTT TTG AGT AGC AAC AAA 2817 Glu Ala Asn Lys Leu Val Lys Asp Phe Leu Ser Ser Asn Lys 570 575 580 GAA TTG GTT GGA AAA GCT TTA AAC TTC AAT AAA GCT GTA GCT 2859 Glu Leu Val Gly Lys Ala Leu Asn Phe Asn Lys Ala Val Ala 585 590 595 GAA GCT AAA AAC ACA GGC AAC TAT GAC GAG GTG AAA CGA GCT 2901 Glu Ala Lys Asn Thr Gly Asn Tyr Asp Glu Val Lys Arg Ala 600 605 610 CAG AAA GAT CTT GAA AAA TCT CTA AAG AAA CGA GAG CAT TTG 2943 Gin Lys Asp Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu 615 620
    100
    GAG AAG GAT GTA GCG AAA Lys 630 AAT TTG GAG AGC AAA AGC GGC AAC 2985 Glu 625 Lys Asp Val Ala Asn Leu Glu Ser Lys 635 Ser Gly Asn AAA AAT AAA ATG GAA GCA AAA GCT CAA CGT AAC AGC CAA AAA 3027 Lys Asn Lys Met Glu Ala Lys Ala Gin Ala Asn Ser Gin Lys 640 645 650 GAT GAG ATT TTT GCG TTG ATC AAT AAA GAG GCT AAT AGA GAC 3069 Asp Glu Ile Phe Ala Leu Ile Asn Lys Glu Ala Asn Arg Asp 655 660 665 GCA AGA GCA ATC GCT TAC GCT CAA AAT CTT AAA GGC ATC AAA 3111 Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala Gin Asn Leu Lys Gly Ile Lys 670 675 680 AGG GAA TTG TCT GAT AAA CTT GAA AAT ATC AAC AAG GAT TTG 3153 Arg Glu leu Ser Asp Lys Leu Glu Asn Ile Asn Lys Asp Leu 685 690 AAA GAC TTT AGT AAA TCT TTT GAT GGA TTC AAA AAT GGC AAA 3195 Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe Lys Asn Gly Lys 695 700 705 AAT AAG GAT TTC AGC AAG GCA GAA GAA ACG CTA AAA GCC CTT 3237 Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Lys Ala Leu 710 715 720 AAA GGC TCG GTG AAA GAT TTA GGT ATC AAT CCG GAA TGG ATT 3279 Lys Gly Ser Val Lys Asp Leu Gly Ile Asn Pro Glu Trp Ile 725 730 735 TCA AAA GTT GAA AAC CTT AAT GCA GCT TTG AAT GAA TTC AAA 3321 Ser Lys Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe Lys 740 745 750
    101
    AAT GGC AAA AAT AAG Asn Gly Lys Asn Lys GAT TTC AGC AAG GTA ACG CAA GCA AAA 3363 Asp Phe Ser Lys Val Thr Gin 760 Ala Lys 755 AGC GAC CAA GAA AAT TCC ATT AAA GAT GTG ATC ATC AAT CAA 3405 Ser Asp Gin Glu Asn Ser Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gin 765 770 775 AAG ATA ACG GAT AAA GTT GAT GAA CTC AAT CAA GCG GTA TCA 3447 Lys Ile Thr Asp Lys Val Asp Glu Leu Asn Gin Ala Val Ser 780 785 790 GTG GCT AAA ATA GCG TGC GAT TTC AGT GGG GTA GAG CAA GCG 3489 Val Ala Lys Ile Ala Cys Asp Phe Ser Gly Val Glu Gin Ala 795 800 805 TTA GCC GAT CTC AAA AAT TTC TCA AAG GAG CAA TTG GCT CAA 3531 Leu Ala Asp ' Leu Lys Asn Phe Ser Lys Glu Gin Leu Ala Gin 810 815 820 CAA GCT CAA AAA AAT GAA AGT TTC AAT GTT GGA AAA TCT GAA 3573 Gin Ala Gin Lys Asn Glu Ser Phe Asn Val Gly Lys Ser Glu
    825 830
    ATA Ile 835 TAC Tyr CAA TCC GTT AAG AAT GGT GTG AAC GGA ACC CTA GTC 3615 Gin Ser Val Lys 840 Asn Gly Val Asn Gly Thr 845 Leu Val GGT AAT GGG TTA TCT GGA ATA GAG GCC ACA GCT CTC GCC AAA 3657 Gly Asn Gly Leu Ser Gly Ile Glu Ala Thr Ala Leu Ala Lys 850 855 860 AAT TTT TCG GAT ATC AAG AAA GAA TTG AAT GAG AAA TTT AAA 3699 Asn Phe Ser Asp Ile Lys Lys Glu Leu Asn Glu Lys Phe Lys
    865 870 875
    102
    AAT TTC AAT AAC AAT AAC AAT AAT GGT CTC AAA AAC GGC GGA 3741 Asn Phe Asn Asn Asn Asn Asn Asn Gly Leu Lys Asn Gly Gly 880 885 890 GAA ccc ATT TAT GCT CAA GTT AAT AAA AAG AAA ACA GGA CAA 3783 Glu Pro Ile Tyr Ala Gin Val Asn Lys Lys Lys Thr Gly Gin 895 900 GTA GCT AGC CCT GAA Gkk CCC ATT TAT GCT CAA GTT GCT AAA 3825 Val Ala Ser Pro Glu Glu Pro Ile Tyr Ala Gin Val Ala Lys 905 910 915 AAG GTA ACT AAA AAA ATT GAC CAA CTC AAT CAA GCA GCG ACA 3867 Lys Val Thr Lys Lys Ile Asp Gin Leu Asn Gin Ala Ala Thr 920 925 930 AGT GGT TTC GGT GGT GTA GGG CAA GCG GGC TTC CCT TTG AAA 3909 Ser Gly Phe Gly Gly Val Gly Gin Ala Gly Phe Pro Leu Lys 935 940 945 AGG CAT GAT AAA GTT GAA GAT CTC AGT AAG GTA GGG CGA TCA 3951 Arg His Asp Lys Val Glu Asp Leu Ser Lys Val Gly Arg Ser 950 955 960 GTT AGC CCT GAA CCC ATT TAT GCT ACA ATT GAT GAT CTC GGT 3993 Val Ser Pro Glu Pro Ile Tyr Ala Thr Ile Asp Asp Leu Gly 965 970 GGG TCT TTC CCT TTG AAA AGG CAT GAT AAA GTT GAT GAT CTC 4035 Gly Ser Phe Pro Leu Lys Arg His Asp Lys Val Asp Asp Leu 975 980 985 AGT AAG GTA GGG CTT TCA AGG AAT CAA GAA TTG ACT CAG AAA 4077 Ser Lys Val Gly Leu Ser Arg Asn Gin Glu Leu Thr Gin Lys 990 995 1000
    103
    ATT Ile GAC AAT Asp Asn 1005 CTC Leu AGT Ser CAA GCG GTA Gin Ala Val 1010 TCA GAA GCT AAA GCA GGT Gly 4119 Ser Glu Ala Lys Ala 1015 TTT TTT GGC AAT CTA GAA CAA ACG ATA GAC AAG CTC AAA GAT 4161 Phe Phe Gly Asn 1020 Leu Glu Gin Thr Ile L025 Asp Lys Leu Lys Asp 1030 TTT ACA AAA AAC AAT CCT GTG AAT CTA TGG GCT GAA AGC GCA 4203 Phe Thr Lys Asn Asn 1035 Pro Val Asn Leu Trp Ala 1040 Glu Ser Ala AAA AAA GTG CCT GCT AGT TTG TCA GCG AAA CTA GAC AAT TAC 4245 Lys Lys Val 1045 Pro Ala Ser Leu Ser 1050 Ala Lys Leu 1055 Asp Asn Tyr GCT ACT AAC AGC CAC ACA CGC ATT AAT AGC AAT ATC CAA AAT 4287 Ala Thr Asn 1060 Ser His Thr Arg Ile 1065 Asn Ser Asn Ile Gin 1070 Asn GGA GCG ATC AAT GAA AAA GCG ACC GGC ACT GAA CGG CAA AAA 4329 Gly Ala Ile 1075 Asn Glu Lys Ala Thr 1080 Gly Thr Glu Arg Gin 1085 Lys AAC CCT GAG TGG CTC AAA CTC GTG AAT GAT AAG ATC GTT GCG 4371 Asn Pro Glu Trp 1090 Leu Lys Leu Val Asn 1095 Asp Lys Ile Val Ala 1100 CAT AAT GTG GGA AGC GTT CCT TTG TCA GAG TAT GAT AAC ATT 4413 His Asn Val Gly Ser 1105 val Pro Leu Ser Glu Tyr 1110 Asp Asn Ile GGA TTC AGC CAA AAG AAT ATG AAG GAT TAT TCT GAT TCG TTC 4455 Gly Phe Ser Gin Lys Asn Met Lys Asp Tyr Ser Asp Ser Phe
    1115 1120 1125
    104
    AAG TTT TCC ACC AAG TTG AAC AAT GCC GTA AAA GAC ATT AAG 4497 Lys Phe 1130 Ser Thr Lys Leu Asn 1135 Asn Ala Val Lys Asp 1140 Ile Lys TCT GGC TTT ACG CAA TTT TTA GCC AAT GCA TTT TCT ACA GGA 4539 Ser Gly Phe Thr Gin Phe Leu Ala Asn Ala Phe Ser Thr Gly 1145 1150 1155 TAT TAC TCC ATG GCG AGA GAA AAT GCG GAG CAT GGA ATC AAA 4581 Tyr Tyr Ser Met Ala Arg Glu Asn Ala Glu His Gly Ile Lys 1160 1165 1170 AAT GCT AAT ACA AAA GGT GGT TTC CAA AAA TCT TAAAGGATTA 4624 Asn Ala Asn Thr Lys Gly Gly Phe Gin Lys Ser 1175 1180
    AGGAACACCA AAAACGCAAA AACCACCTTG CTAAAAGCAA GGGGTTTTTT 4674 AACTTAAAAT ATCCCGACAG ACACTAACGA AAGGCTTTGT TGTTTAAAGT 4724 CTGCATAGAT ATTTCCTACC CCAAAAAGAC TTAACCCTTT GCTTAAAATT 4774 AAATTTGATT GTGCTAGTGG GTTCGTGCTT TATAGTGCGG AATTGGG 4821 (sekv. id. Č. 3).
  5. 5. Nukleová kyselina podle nároku 1, která obsahuje nukleotidy 1072 až 3648 obsažené v nukleotidové sekv. id. č. 1
    ATGGGCTGCG CGTAACGAAA AACAGTCGCT TGACCTCTTT TGATGTCATC 50 AGAGATTTTC CAAATATCCG CTATACCTTT GACTCCTAGA GCGCAACCAC 100 CTACGATCGC TAGAACAGAA ATGATCTGAA CCACCAAAGT TTTAGTCTCA 150 GTAATGCCTG ATGCAGGACT GTCGAAAGCC ATTAAAGGAT TGGCTGCTAT 200 CGCTAGCCCT AAAGTTACTA CAACTTTCTT GTAGCTGTCA GTGATTCTTG 250 TAAAAAATTT CATGCGTTTC CTTTCAAATT GAAATCAATC GTTTGAGTAT 300 ATCAAAAAAA AGTATTTTTA TACTATTCAT ACAAGCGCTA CTTTATAATT 350 TAAATCAAAA CCGACGCTTT TGTTTGACAA CTGATATAAT TTAGGAACAA 400 TAAACCTACT TGTCCCAACC ATTTTTCTTT CTCAAGTCAT CGTAGAATTG 450 TAGATCTTTA GGATCTTTGA TGTATTTTTT AATCGTCTCA GGTTGAAACC 500 TAAAAACAAG CAGAAACAAA CCCAAGCTGA TCAGAGTGAG AATAAAGCTC 550
    105
    CATTTTAAGC AACTCCATAA ACCACTAAAG AAACTTTTTT TGAGACTCTC 600 TTTGAAAATC TGTCCTATTG ATTTGTTTTC CATTTTGTTT CCCATGCGGA 650 TCACAAACGC TTAATTACAA ATACATACTA TAATAAGTAT GGCACACACA 700 AACCAAACCA TTTTTAGAAC GCTTCATGCA CTCACCTTGC TCCTAACCAT 750 TTCTCCAACC ATCTTTAGCG TTGCATTTGA TTTCTTCAAA AAGGCTCATT 800 TCTTAGTTTC TTTTATTCTT AAAATTTTTC CATTCTAGCA AATTTTTGTT 850 AATTGTGGGT AAAAATGTGA ATCGTTCCTA GCTTTTAGAC GCTTGCAACG 900 ATCGGACTTT TTTCAATATT AATGAAAAAA TGCCAAATAT TCTAAATATT 950 GTGGTATAGT GATAACGTTC AAAGACACGA ATTGCATACT CAAAGTGTGT 1000 AGTAGTTTTT AGCGGTCTTT GATACCAATA AGATACCGAT AGGTATGAAA 1050
    CTAGGTATAG AAGGAGAAAC A ATG Met ACT AAC GAA ACT ATT GAC CAA 1095 Thr Asn Glu Thr 5 Ile Asp Gin 1 CAA CCA CAA ACC GAA GCG GCT TTT AAC CCG CAG CAA TTT ATC 1137 Gin Pro 10 Gin Thr Glu Ala Ala 15 Phe Asn Pro Gin Gin Phe Ile 20 AAT AAT CTT CAA GTA GCT TTT CTT AAA GTT GAT AAC GCT GTC 1179 Asn Asn Leu Gin Val Ala Phe 25 Leu 30 Lys Val Asp Asn Ala Val 35 GCT TCA TAC GAT CCT GAT CAA AAA CCA ATC GTT GAT AAG AAC 1221 Ala Ser Tyr Asp Pro Asp Gin 40 Lys Pro Ile 45 Val Asp Lys Asn 50 GAT AGG GAT AAC AGG CAA GCT TTT GAG GGA ATC TCG CAA TTA 1263 Asp Arg Asp Asn Arg Gin Ala 55 Phe Glu Gly 60 Ile Ser Gin Leu AGG GAA GAA TAC TCC AAT AAA GCG ATC AAA AAT CCT ACC AAA 1305 Arg Glu 65 Glu Tyr Ser Asn Lys 70 Ala Ile Lys Asn 75 pro Thr Lys AAG AAT CAG TAT TTT TCA GAC TTT ATC AAT AAG AGC AAT GAT 1347 Lys Asn 80 Gin Tyr Phe Ser Asp 85 Phe Ile Asn Lys Ser Asn Asp 90
    106
    TTA ATC AAC AAA GAC AAT CTC Asn Leu ATT GTC GTG GAA TCT Ser TCC Ser 105 ACA Thr 1389 Leu Ile Asn 95 Lys Asp Ile Val 100 Val GlU AAG AGC TTT CAG AAA TTT GGG GAT CAG CGT TAC CGA ATT TTC 1431 Lys Ser Phe Gin Lys Phe Gly Asp Gin Arg Tyr Arg Ile Phe 110 115 120 ACA AGT TGG GTG TCC CAT CAA AAC GAT CCG TCT AAA ATC AAC 1473 Thr Ser Trp Val Ser His Gin Asn Asp Pro Ser Lys Ile Asn 125 130 ACC CGA TGC ATC CGA AAT TTT ATG GAA CAT ACC ATA CAA CCC 1515 Thr Arg Cys Ile Arg Asn Phe Met Glu His Thr Ile Gin Pro 135 140 145 CCT ATC CCT GAT GAC AAA GAA AAA GCA GAG TTT TTG AAA TCT 1557 Pro Ile Pro Asp Asp Lys Glu Lys Ala Glu Phe Leu Lys Ser 150 155 160 GCC AAA CAA TCT TTT GCA GGA ATC ATC ATA GGG AAT CAA ATC 1599 Ala Lys Gin Ser Phe Ala Gly Ile Ile Ile Gly Asn Gin Ile 165 170 175 CGA ACG GAT CAA AAA TTC ATG GGC GTG TTT GAT GAA TCC TTG 1641 Arg Thr Asp Gin Lys Phe Met Gly Val Phe Asp Glu Ser Leu 180 185 190 AAA GAA AGG CAA GAA GCA GAA AAA AAT GGA GGG CCT ACT GGT 1683 Lys Glu Arg Gin Glu Ala Glu Lys Asn Gly Gly Pro Thr Gly 195 200 GGG GAT TGG TTG GAT ATT TTT TTA TCA TTT ATA TTT GAC AAA 1725 Gly Asp Trp Leu Asp Ile Phe Leu Ser Phe Ile Phe Asp Lys
    205
    210
    215
    107
    AAA CAA TCT TCT GAT GTC AAA GAA GCA ATC AAT CAA GAA CCA Pro 1767 Lys Gin 220 Ser Ser Asp Val Lys 225 Glu Ala Ile Asn Gin 230 Glu CTT CCT CAT GTC CAA CCA GAT ATA GCC ACT AGC ACC ACT CAC 1809 Leu Pro His Val Gin Pro Asp Ile Ala Thr Ser Thr Thr His 235 240 245 ATA CAA GGC TTA CCG CCT GAA TCT AGG GAT TTG CTT GAT GAA 1851 Ile Gin Gly Leu Pro Pro Glu Ser Arg Asp Leu Leu Asp Glu 250 255 260 AGG GGT AAT TTT TCT AAA TTC ACT CTT GGC GAT ATG GAA ATG 1893 Arg Gly Asn Phe Ser Lys Phe Thr Leu Gly Asp Met Glu Met 265 270 TTA GAT GTT GAG GGC GTC GCC GAC ATG GAT CCC AAT TAC AAG 1935 Leu Asp Val Glu Gly Val Ala Asp Met Asp Pro Asn Try Lys 275 280 285 TTC AAT CAA TTA TTG ATT CAC AAT AAC ACT CTG TCT TCT GTG 1977 Phe Asn Gin Leu Leu Ile His Asn Asn The Leu Ser Ser Val 290 295 300 TTA ATG GGG AGT CAT GAT GGC ATA GAA CCT GAA AAA GTT TCA 2019 Leu Met Gly Ser His Asp Gly Ile Glu Pro Glu Lys Val Ser 305 310 315 TTA TTG TAT GCG GGC AAT GGT GGT TTT GGA GCC AAG CAC GAT 2061 Leu Leu Tyr Ala Gly Asn Gly Gly Phe Gly Ala Lys His Asp 320 325 330 TGG AAC GCC ACC GTT GGT TAT AAA GAC CAA CAA GGT AAC AAT 2103 Trp Asn Ala Thr Val Gly Tyr Lys Asp Gin Gin Gly Asn Asn 335 340
    108
    GTG GCT ACA ATA ATT AAT GTG CAT ATG AAA AAC GGC AGT GGC 2145 Val 345 Ala Thr Ile Ile Asn 350 Val His Met Lys Asn Gly 355 Ser Gly TTA GTC ATA GCA GGT GGT GAG AAA GGG ATT AAC AAC CCT AGT 2187 Leu Val Ile Ala Gly Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asn Pro Ser 360 365 370 TTT TAT CTC TAC AAA GAA GAC CAA CTC ACA GGC TCA CAA CGA 2229 Phe Tyr Leu Tyr Lys Glu Asp Gin Leu Thr Gly Ser Gin Arg 375 380 385 GCA TTG AGT CAA GAA GAG ATC CAA AAC AAA ATA GAT TTC ATG 2271 Ala Leu Ser Gin Glu Glu Ile Gin Asn Lys Ile Asp Phe Met 390 395 400 GAA TTT CTT GCA CAA AAC AAT GCT AAA TTA GAC AGC TTG AGC 2313 Glu Phe Leu Ala Gin Asn Asn Ala Lys Leu Asp Ser Leu Ser 405 410 GAG AAA GAG AAA GAA AAA TTC CGA AAT GAG ATT AAG GAT TTC 2355 Glu Lys Glu Lys Glu Lys Phe Arg Asn Glu Ile Lys Asp Phe 415 420 425 CAA AAA GAC TCT AAG CCT TAT TTA GAC GCC CTA GGG AAT GAT 2397 Gin Lys Asp Ser Lys Pro Tyr Leu Asp Ala Leu Gly Asn Asp 430 435 440 CGT ATT GCT TTT GTT TCT AAA AAA GAC CCA AAA CAT TCA GCT 2439 Arg Ile Ala Phe Via Ser Lys Lys Asp Pro Lys His Ser Ala 445 450 455 TTA ATT ACT GAG TTT AAT AAG GGG GAT TTG AGC TAC ACT CTC 2481 Leu Ile Thr Glu Phe Asn Lys Gly Asp Leu Ser Tyr Thr Leu 460 465 470
    109
    AAA Lys GTT ATG Val Met GGA AAA AAG CAG ATA AAG GCT TTA GAT AGG GAG 2523 Gly Lys 475 Lys Gin Ile Lys Ala Leu Asp 480 Arg Glu AAA AAT GTC ACT CTT CAA GGT AAC CTA AAA CAT GAT GGC GTG 2565 Lys Asn Val Thr Leu Gin Gly Asn Leu Lys His Asp Gly Val 485 490 495 ATG TTT GTT AAT TAT TCT AAT TTC AAA TAC ACC AAC GCC TCC 2607 Met Phe Val Asn Tyr Ser Asn Phe Lys Tyr Thr Asn Ala Ser 500 505 510 AAG AGT CCC AAT AAG GGT GTA GGC GTT ACG AAT GGC GTT TCC 2649 Lys Ser Pro Asn Lys Gly Val Gly Val thr Asn Gly Val Ser 515 520 525 CAT TTA GAA GCA GGC TTT AGC AAG GTG GCT GTC TTT AAT TTG 2691 His Leu Glu Ala Gly Phe Ser Lys Val Ala Val Phe Asn Leu 530 535 540 GCT AAT TTA AAT AAT CTC GCT ATC ACT AGT GTC GTA AGG CGG 2733 Pro Asn Leu Asn Asn Leu Ala Ile Thr Ser Val Val Arg Arg 545 550 GAT TTA GAG GAT AAA CTA ATC GCT AAA GGA TTG TCC CCA CAA 2775 Asp leu Glu Asp Lys Leu Ile Ala Lys Gly Leu Ser Pro Gin 555 560 565 GAA GCT AAT AAG CTT GTC AAA GAT TTT TTG AGT AGC AAC AAA 2817 Glu Ala Asn Lys Leu Val Lys Asp Phe Leu Ser Ser Asn Lys 570 575 580 GAA TTG GTT GGA AAA GCT TTA AAC TTC AAT AAA GCT GTA GCT 2859 Glu Leu Val Gly Lys Ala Leu Asn Phe Asn Lys Ala Val Ala 585 590 595
    110
    GAA Glu GCT AAA AAC ACA GGC AAC TAT GAC GAG GTG AAA CGA GCT 2901 Ala Lys Asn 600 Thr Gly Asn Tyr Asp 605 Glu Val Lys Arg Ala 610 CAG AAA GAT CTT GAA AAA TCT CTA AAG AAA CGA GAG CAT TTG 2943 Gin Lys Asp Leu Glu Lys Ser Leu Lys Lys Arg Glu His Leu 615 620 GAG AAA GAT GTA GCG AAA AAT TTG GAG AGC AAA AGC GGC AAC 2985 Glu Lys Asp Val Ala Lys Asn Leu Glu Ser Lys Ser Gly Asn 625 630 635 AAA AAT AAA ATG GAA GCA AAA GCT CAA CGT AAC AGC CAA AAA 3027 Lys Asn Lys Met Glu Ala Lys Ala Gin Ala Asn Ser Gin Lys 640 645 650 GAT GAG ATT TTT GCG TTG ATC AAT AAA GAG GCT AAT AGA GAC 3069 Asp Glu Ile Phe Ala Leu Ile Asn Lys Glu Ala Asn Arg Asp 655 660 665 GCA AGA GCA ATC GCT TAC GCT CAA AAT CTT AAA GGC ATC AAA 3111 Ala Arg Ala Ile Ala Tyr Ala Gin Asn Leu Lys Gly Ile Lys 670 675 680 AGG GAA TTG TCT GAT AAA CTT GAA AAT ATC AAC AAG GAT TTG 3153 Arg Glu leu Ser Asp Lys Leu Glu Asn Ile Asn Lys Asp Leu 685 690 AAA GAC TTT AGT AAA TCT TTT GAT GGA TTC AAA AAT GGC AAA 3195 Lys Asp Phe Ser Lys Ser Phe Asp Gly Phe Lys Asn Gly Lys 695 700 705 AAT AAG GAT TTC AGC AAG GCA GAA GAA ACG CTA AAA GCC CTT 3237 Asn Lys Asp Phe Ser Lys Ala Glu Glu Thr Leu Lys Ala Leu 710 715 720
    111
    AAA Lys GGC TCG GTG AAA GAT TTA GGT ATC AAT CCG GAA TGG ATT 3279 Gly Ser 725 Val Lys Asp Leu Gly 730 Ile Asn Pro Glu Trp 735 Ile TCA AAA GTT GAA AAC CTT AAT GCA GCT TTG AAT GAA TTC AAA 3321 Ser Lys Val Glu Asn Leu Asn Ala Ala Leu Asn Glu Phe Lys 740 745 750 AAT GGC AAA AAT AAG GAT TTC AGC AAG GTA ACG CAA GCA AAA 3363 Asn Gly Lys Asn Lys Asp Phe Ser Lys Val Thr Gin Ala Lys 755 760 AGC GAC CAA GAA AAT TCC ATT AAA GAT GTG ATC ATC AAT CAA 3405 Ser Asp Gin Glu Asn Ser Ile Lys Asp Val Ile Ile Asn Gin 765 770 775 AAG ATA ACG GAT AAA GTT GAT GAA CTC AAT CAA GCG GTA TCA 3447 Lys Ile Thr Asp Lys Val Asp Glu Leu Asn Gin Ala Val Ser 780 785 790 GTG GCT AAA ATA GCG TGC GAT TTC AGT GGG GTA GAG CAA GCG 3489 Val Ala Lys Ile Ala Cys Asp Phe Ser Gly Val Glu Gin Ala 795 800 805 TTA GCC GAT CTC AAA AAT TTC TCA AAG GAG CAA TTG GCT CAA 3531 Leu Ala Asp Leu Lys Asn Phe Ser Lys Glu Gin Leu Ala Gin 810 815 820 CAA GCT CAA AAA AAT GAA AGT TTC AAT GTT GGA AAA TCT GAA 3573 Gin Ala Gin Lys Asn Glu Ser Phe Asn Val Gly Lys Ser Glu 825 830 ATA TAC CAA TCC GTT AAG AAT GGT GTG AAC GGA ACC CTA GTC 3615 Ile Tyr Gin Ser Val Lys Asn Gly Val Asn Gly Thr Leu Val 835 840 845
    112
    GGT AAT GGG TTA TCT GGA ATA GAG GCC ACA GGG Gly Asn Gly Leu Ser Gly Ile Glu Ala Thr Gly
    850 855 (sekv. id. č. 1)
  6. 6. Nukleová kyselina podle nároku 1, která obsahuje nukleotidy 1921 až 3648 obsažené v nukleotidové sekvenci id. č.
    1.
  7. 7. Isolovaná nukleová kyselina, která se selektivně hybridizuje s nukleovou kyselinou podle nároku 4 za podmínek polymerasové řetězové reakce.
  8. 8. Isolovaná nukleová kyselina, která se selektivně hybridizu je s nukleovou kyselinou podle nároku 4 za selektivních podmínek 16 h při 68 °C v pufru obsahujícím 6x SSC, 0,5 % (hmotn.) dodecylsulfátu, 5x Denhardtův roztok, s promytím při 60 °C v 0,5x SSC.
  9. 9. Vyčištěný antigenní polypeptid kódovaný nukleovou kyselinou podle nároku 1.
  10. 10. Antigenní polypeptid podle nároku 9, který sestává z podstatě aminokyseliny kódované nukleotidy 1072 až 4614, které jsou obsaženy v nukleotidové sekvenci id. č. 3.
  11. 11. Antigenní polypeptid podle nároku 9, který sestává z podstatě aminokyseliny kódované nukleotidy 1072 až 3648, které jsou obsaženy v nukleotidové sekvenci id. č. 1
  12. 12. Antigenní polypeptid podle nároku 9, který sestává z podstatě aminokyseliny kódované nukleotidy 1921 až 3648, které jsou obsaženy v nukleotidové sekvenci id. č. l.
  13. 13. Způsob detegování přítomnosti kmene Helicobacter pylori, který obsahuje antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až
    113
    128 000, v subjektu, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:
    a) uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím polypeptidu podle nároku 10, a
    b) detegování navázání polypeptidu a protilátky, tato reakce znamená přítomnost kmene Helicobacter pylori.
  14. 14. Způsob detegování přítomnosti kmene Helicobacter pylori, který obsahuje antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000, v subjektu, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:
    a) uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím polypeptidu podle nároku 11, a
    b) detegování navázání polypeptidu a protilátky, toto navázání znamená přítomnost kmene Helicobacter pylori.
  15. 15. Způsob detegování přítomnosti kmene Helicobacter pylori, který obsahuje antigen o molekulové hmotnosti 120 000 až 128 000, v subjektu, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:
    a) uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím polypeptidu podle nároku 12, a
    b) detegování navázání polypeptidu a protilátky, toto navázání znamená přítomnost kmene Helicobacter pylori.
  16. 16. Způsob určení predisposice pro peptický vřed u subjektu, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:
    a) uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím polypeptidu podle nároku 10, a
    b) detegování navázání polypeptidu a protilátky, toto navázání znamená predisposici subjektu pro peptický vřed.
    114
  17. 17. Způsob určení predisposice pro peptický vřed u subjektu, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:
    a) uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím polypeptidu podle nároku 11, a
    b) detegování navázání polypeptidu a protilátky, toto navázání znamená predisposici subjektu pro peptický vřed.
  18. 18. Způsob určení predisposice pro peptický vřed u subjektu, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:
    a) uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím polypeptidu podle nároku 12, a
    b) detegování navázání polypeptidu a protilátky, toto navázání znamená predisposici subjektu pro peptický vřed.
  19. 19. Způsob určení predisposice pro karcinom žaludku u subjektu, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:
    a) uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím polypeptidu podle nároku 10, a
    b) detegování navázání polypeptidu a protilátky, toto navázání znamená predisposici subjektu pro karcinom žaludku.
  20. 20. Způsob určení predisposice pro karcinom žaludku u subjektu, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:
    a) uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím polypeptidu podle nároku ll, a
    b) detegování navázání polypeptidu a protilátky, toto navázání znamená predisposici subjektu pro karcinom žaludku.
    115
  21. 21. Způsob určení predisposice pro karcinom žaludku u subjektu, vyznačující se tím, že sestává ze stupňů:
    a) uvedení vzorku obsahujícího protilátku ze subjektu do kontaktu s detegovatelným množstvím polypeptidu podle nároku 12, a
    b) detegování navázání polypeptidu a protilátky, toto navázání znamená predisposici subjektu pro karcinom žaludku.
  22. 22. Způsob detegování přítomnosti Helicobacter pylori související s peptickým vředem u subjektu, vyznačuj í cí se tím, že zahrnuje detegování přítomnosti nukleové kyseliny podle nároku l.
  23. 23. Polypeptid podle nároku 9 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
  24. 24. Mutant Helicobacter pylori, v němž je produkt nukleové kyseliny podle nároku l nefunkční.
  25. 25. Kmen Helicobacter pylori podle nároku 24, který je uložen v Americké sbírce typů kultur pod ATCC č. 55359.
  26. 26. Mutant Helicobacter pylori podle nároku 24 ve farmaceuticky přijatelném nosiči.
CZ97966A 1994-09-30 1995-09-29 Isolated nucleic acid encoding heliobacter pylori antigen, vector in which it is comprised, purified antigenic preparation being encoded thereby, detection method of the heliobacter pylori strain presence, method of determining pre-diathesis for peptic ulcer, method of determining pre-diathesis for stomach carcinoma, heliobacter pylori mutant and heliobacter pylori strain CZ96697A3 (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/316,397 US5733740A (en) 1992-10-13 1994-09-30 Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration and gastric carcinoma
PCT/US1995/012669 WO1996010639A2 (en) 1994-09-30 1995-09-29 THE tagA GENE AND METHODS FOR DETECTING PREDISPOSITION TO PEPTIC ULCERATION AND GASTRIC CARCINOMA

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ96697A3 true CZ96697A3 (en) 1997-10-15

Family

ID=23228874

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ97966A CZ96697A3 (en) 1994-09-30 1995-09-29 Isolated nucleic acid encoding heliobacter pylori antigen, vector in which it is comprised, purified antigenic preparation being encoded thereby, detection method of the heliobacter pylori strain presence, method of determining pre-diathesis for peptic ulcer, method of determining pre-diathesis for stomach carcinoma, heliobacter pylori mutant and heliobacter pylori strain

Country Status (16)

Country Link
US (3) US5733740A (cs)
EP (1) EP0783579B1 (cs)
JP (1) JPH10509864A (cs)
CN (1) CN1166858A (cs)
AT (1) ATE276365T1 (cs)
CA (1) CA2201353A1 (cs)
CZ (1) CZ96697A3 (cs)
DE (1) DE69533514T2 (cs)
ES (1) ES2231792T3 (cs)
FI (1) FI971326A (cs)
HU (1) HUT76730A (cs)
MX (1) MX9702335A (cs)
NO (1) NO971473L (cs)
NZ (1) NZ295297A (cs)
PL (1) PL319441A1 (cs)
WO (1) WO1996010639A2 (cs)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993018150A1 (en) * 1992-03-02 1993-09-16 Biocine S.P.A. Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics
US7141244B1 (en) * 1992-03-02 2006-11-28 Chiron Srl Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics
US5733740A (en) * 1992-10-13 1998-03-31 Vanderbilt University Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration and gastric carcinoma
US6290962B1 (en) 1992-11-03 2001-09-18 Oravax, Inc. Urease-based vaccine and treatment for helicobacter infection
US5972336A (en) * 1992-11-03 1999-10-26 Oravax Merieux Co. Urease-based vaccine against helicobacter infection
CA2194237A1 (en) * 1994-07-01 1996-01-18 Dermot Kelleher Helicobacter pylori antigenic protein preparation and immunoassays
GB2324093A (en) * 1996-01-04 1998-10-14 Rican Limited Helicobacter pylori bacterioferritin
WO1998021225A1 (en) * 1996-11-14 1998-05-22 Merieux Oravax Helicobacter polypeptides and corresponding polynucleotide molecules
US6902903B1 (en) * 1996-12-19 2005-06-07 Chiron Corporation Helicobacter pylori diagnostics
TWI237695B (en) * 1999-12-14 2005-08-11 Joy Biomedical Corp Helicobacter pylori antigens in blood
EP1423142A1 (en) * 2001-08-31 2004-06-02 Chiron SRL. Helicobacter pylori vaccination with a combination of caga, vaca and nap proteins
FI118061B (fi) * 2001-09-24 2007-06-15 Beanor Oy Menetelmä ja bioanturi analyysiä varten
WO2003060121A2 (en) * 2001-12-21 2003-07-24 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to gastric specific genes and proteins
FI115166B (fi) * 2001-12-31 2005-03-15 Biofons Oy Diagnostisia menetelmiä
AU2002250779A1 (en) * 2002-03-26 2003-10-08 Peking University School Of Oncology A method of inspecting the genetic susceptibility of h.pylori related gastric carcinoma and the use of it
TWI276631B (en) * 2002-09-12 2007-03-21 Avanir Pharmaceuticals Phenyl-aza-benzimidazole compounds for modulating IgE and inhibiting cellular proliferation
US20040142379A1 (en) 2003-01-16 2004-07-22 Carlsberg Research Laboratory Affinity fishing for ligands and proteins receptors
US7968324B2 (en) 2004-08-13 2011-06-28 Barry J Marshall Helicobacter system and uses thereof
US8029777B2 (en) 2004-08-13 2011-10-04 Marshall Barry J Helicobacter system and uses thereof
US9568471B2 (en) * 2005-01-25 2017-02-14 The Johns Hopkins University Plasmodium diagnostic assay device

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5262156A (en) * 1991-08-12 1993-11-16 Hycor Biomedical, Inc. Antigenic compositions and their use for the detection of Helicobacter pylori
WO1993018150A1 (en) * 1992-03-02 1993-09-16 Biocine S.P.A. Helicobacter pylori proteins useful for vaccines and diagnostics
US5733740A (en) * 1992-10-13 1998-03-31 Vanderbilt University Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration and gastric carcinoma
US5403924A (en) * 1992-10-13 1995-04-04 Vanderbilt University Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration

Also Published As

Publication number Publication date
FI971326A0 (fi) 1997-03-27
EP0783579B1 (en) 2004-09-15
NZ295297A (en) 1999-03-29
FI971326A (fi) 1997-05-27
MX9702335A (es) 1997-10-31
EP0783579A2 (en) 1997-07-16
CN1166858A (zh) 1997-12-03
PL319441A1 (en) 1997-08-04
AU703075B2 (en) 1999-03-11
DE69533514D1 (de) 2004-10-21
WO1996010639A2 (en) 1996-04-11
WO1996010639A3 (en) 1996-05-17
US5733740A (en) 1998-03-31
US5876943A (en) 1999-03-02
HUT76730A (en) 1997-11-28
NO971473L (no) 1997-05-29
US6153390A (en) 2000-11-28
NO971473D0 (no) 1997-04-01
AU3858995A (en) 1996-04-26
DE69533514T2 (de) 2005-09-15
ES2231792T3 (es) 2005-05-16
CA2201353A1 (en) 1996-04-11
JPH10509864A (ja) 1998-09-29
ATE276365T1 (de) 2004-10-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5403924A (en) Taga gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration
US5527678A (en) CagB and CagC genes of helicobacter pylori and related compositions
CZ96697A3 (en) Isolated nucleic acid encoding heliobacter pylori antigen, vector in which it is comprised, purified antigenic preparation being encoded thereby, detection method of the heliobacter pylori strain presence, method of determining pre-diathesis for peptic ulcer, method of determining pre-diathesis for stomach carcinoma, heliobacter pylori mutant and heliobacter pylori strain
JP3920320B2 (ja) 精製されたＨｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ由来の空胞形成毒素およびその使用方法
JP2006348036A (ja) ヘリコバクタータンパク質およびワクチン
US5610060A (en) Isolated Helicobacter hepaticus
BR112016003129B1 (pt) Método para detectar infecção por h.pylori e uso de um kit compreendendo flid
US5721349A (en) Vacuolating toxin-deficient H. pylori
CN110476065B (zh) 诊断法
US20150184230A1 (en) Detection of bacteria belonging to the genus campylobacter by targeting cytolethal distending toxin
US9200330B2 (en) Detection of bacteria belonging to the genus Campylobacter by targeting cytolethal distending toxin
US5780278A (en) IceA gene and related methods
AU703075C (en) The tagA gene and methods for detecting predisposition to peptic ulceration and gastric carcinoma
WO1999041614A2 (en) Method for detecting intimin producing microorganisms
US6296855B1 (en) 17-KDA Brucella abortus antigen, recombinant polypeptides, nucleic acids coding for the same and use thereof in diagnostic and prophylactic methods and kits
KR100602843B1 (ko) 레지오넬라 균종의 공통 지질단백항원 및 이를 이용한레지오넬라 검출용 진단시약
WO2012027288A2 (en) Method for predicting and preventing cardiovascular disease
WO2000062069A1 (en) Method of detecting intimin-expressing microorganisms