CN1622997A

CN1622997A - 检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的方法及其用途

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Publication number: CN1622997A
Application number: CN02828650.2A
Authority: CN
Inventors: 柯杨; 姜劲迈; 宁涛; 路桂荣; 游伟程; 潘凯枫
Original assignee: SCHOOL OF CLINICAL ONCOLOGY PEKING UNIVERSITY
Current assignee: SCHOOL OF CLINICAL ONCOLOGY PEKING UNIVERSITY
Priority date: 2002-03-26
Filing date: 2002-03-26
Publication date: 2005-06-01
Also published as: AU2002250779A1; WO2003080840A1

Abstract

本发明涉及一种检测胃癌遗传易感性的方法，尤其涉及通过检测Lewis血型抗原相关基因多态性以检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的方法。本发明同时提供了检测Lewis血型抗原相关基因多态性的方法。另外，本发明还涉及本发明的方法在筛选幽门螺杆菌相关胃癌高危个体，有针对性地干预、预防或早诊随访中的应用，依据本发明的方法制备而成试剂盒，以及该试剂盒在筛选幽门螺杆菌相关胃癌高危个体，有针对性地干预、预防或早诊随访中的应用。

Description

检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的方法及其用途技术领域

本发明涉及一种检测胃癌遗传易感性的方法，尤其涉及通过检测 Lewis血型抗原相关基因多态性以检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的方法。本发明同时提供了检测 Lewis 血型抗原相关基因多态性的方法。另外，本申请还涉及本发明的方法在筛选胃癌高危个体，有针对性地干预、预防或早诊随访中的应用，依据本发明的方法制备而成试剂盒、以及该试剂盒在筛选胃癌高危个体，有针对性地干预、预防或早诊随访中的应用。背景技术

胃癌是危害人类健康和生命的一大恶性疾病。在全世界范围内，胃癌占各类恶性肿瘤死因第二位，在中国占第一位且未见下降趋势，因此，对胃癌的深入研究和预防是肿瘤研究的重要课题。流行病学研究强烈提示：幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H. pylori ) 对于胃癌的发生是一个重要的环境病因学因素，估计有 60%胃癌病例与 H. pylori有关。在针对 H. pylori感染的反应中， H. pylori感染个体如何发展有两个途径，多酸一溃疡；或者抑酸生成一胃炎、萎缩、异型增生一高危发生胃癌。而决定个体走哪条途径则取决于以下三个方面： ①宿主因素，例如个体的遗传背景，免疫系统抗感染抗癌变的能力等； ②其它环境因素，感染的年齢，带菌时间，营养状态，饮食和是否吸烟； ③ H. pylori菌株的致病能力。在这三个因素中，外来因素（如致病菌，生存环境等）与内在因素或者称作环境与遗传易感相互影响，缺一不可。

宿主遗传易感性，是以往研究中被忽略和相对薄弱的领域，而其恰恰反映一个普遍与个体因素相关的问题： "为什么极少数的 H. pylori 感染者罹患胃癌"。通常情况下，胃癌发生率大约占 H. pylori感染者的 2%- 3%，甚至更低，在日本，在 60, 000, 000感染者中，大约只有 235， 000'人发生胃癌，这大约只相当于感染者的 0. 4%。更难解释的是 "非洲之谜"现象，在非洲， H. pylori感染率高达 90%, 而胃癌发病率和死亡率却相当低。尤其耐人寻味的是癌症高发区的居民在迁移到低发区后，他们的后裔仍保持原地区癌症的高发倾向。遗传易感性的研究是现代医学中的重大课题，但是对于怎样鉴定遗传易感性，本领域一直缺乏全面、系统、有效的识别方法，对于胃癌遗传易感性的研究成果更少。

Lewis 血型抗原，指的是连接在蛋白质或脂类上的不同类型的糖链所携带的末端结构，存在于红细胞和消化道粘膜细胞的表面。参与 Lewis血型抗原生物合成的糖基转移酶有 FUT 3 ( α -I, 3/4-岩藻糖基转移酶，简称 Le酶），和 FUT 2 ( α -1, 2-岩藻糖基转移酶，简称 Se酶）。人体内编码 Le酶和 Se酶的基因分别为 Lewis基因和 Secretor 基因。

Lewis 基因，，简称 Le基因，已经被克隆，只有一个外显子，编码序列全长 1084bp (Cameron, H. S. , et al , J. Biol. Chem. 270 (34) , 20112-20122 (1995) )。 Le 基因的几个位点的突变导致编码无功能的岩藻糖基转移酶，它们包括 59 位点 T →G、 508 位点 G — A和 1067 位点 T— A 3个错义突变。 59 位点 T—G点突变并不单独出现，而是同 508位点 G—A和（或） 1067位点 T— A点突变相伴出现 (Shin Yazawa, et al, Jpn J Human Genet 1996, 41 : 177-188 )。

Secretor基因，简称 Se基因，也已经被克隆，全长 1152bp (GenBank Accession NO: D82933) , 只有一个外显子。 Se 基因的几个位点的突变导致编码无功能的 α -1， 2-岩藻糖基转移酶，它们包括， ① 4个无意突变： 428位点 G— Α突变（G428A)、 571位点 C— T (C571T) 突变、 628位点 C→T (C628T) 突变和 849位点 G→A (G849A) 突变； ②一个错义突变： 385位点 A— T (A385T) 突变； ③一个融合基因，由假基因的 5'区域和功能基因的 3'区域构成 (Henry S， et al, Biochem Biophys Res Commun 1996 ; 219 : 675-678. 和 Henry S, et al, Vox Sang 1996 ; 70 : 21-25 )。

Lewis 血型抗原生物合成途径如下所示：

Se酶

T pe l 前体， Le ' H Type -1 前体， Le

Le酶

Le 酶

Lewis b, Le^b

Lewis a, Le^a 由上可知， H type-1前体的生物合成是 Se酶作用于 Typel前体的结果。 Lewis a和 Lewis b 的生物合成是酶分别作用于 Type 1前体和 H type-1前体的结果。发明概述

本发明通过大样本的统计分析，比较了 Lewis血型抗原相关基因，即 Lewis基因和 Se基因，在胃癌高发的山东人群与正常对照人群（胃癌低发的北京人群和湖南人群）之间分布的差异,在山东人群内部病人组和正常组之间分布差异，以及在 11种胃癌细胞系中的分布，从而首次把幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性与 Lewis血型抗原相关基因多态性联系起来,满足了本领域对于正确识别幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的需求，为胃癌的深入研究和防治，甚至诊断治疗提供了新的思路。

本发明提供一种检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的方法，即检测 Lewis血型抗原相关基因多态性。

本发明还提供检测待测样品 Lewis血型相关基因多态性的方法，包括在 DNA水平， RNA水平检测 Lewis血型抗原相关基因多态性，或检测由 Lewis基因和 Se基因决定的 H type- 1前体的量。

本发明还涉及本发明的方法在筛选胃癌高危个体中的应用。

本发明还涉及本发明的方法在有针对性地干预、预防或早诊随访中的应用。

此外，本发明提供了依据本发明的方法制备而成的试剂盒。

本发明还提供依据本发明的方法制备的试剂盒在筛选胃癌高危个体中的应用和 /或有针对性地干预、预防或早诊随访中的应用。附图说明

图 1A和图 1B显示 Lewis基因多态性表现形式。其中，图 1A显示 PCR扩增 Lewis基因多态位点结果；图 1B显示 PCR- RFLP方法检测 Lewis基因多态性结果。

图 2-图 4显示 Se基因多态性表现形式。其中，

图 2A-图 2D显示 PCR扩增后直接测序结果。其中，图 2A和图 2B显示 A385T位点直接测序结果：图 2A显示杂合突变，图 2B显示纯合突变；图 2C和图 2D显示 G428A位点直接测序结果：图 2C显示杂合突变，图 2D显示纯合突变；

图 3A-图 3B显示 Se基因中 G849A位点突变的检测：图 3A显示 PCR扩增结果，图 3B 显示 PCR-RFLP检测结果；

图 4A-图 4B显示检测融合基因结果：图 4A显示 PCR扩增结果，图 4B显示 PCR- RFLP 检测结果。

图 5显示山东、湖南和北京人群 Lewis和 Se基因型分布。

图 6显示山东人群内部 Lewis 和 Se基因型分布。发明详述

本发明通过大样本的统计分析，首次证明了 Lewis 抗原相关基因多态性是幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的因素之一，从而提供了一种新的全面、系统、正确地识别幽门 W

4 螺杆菌相关胃癌遗传易感性的方法。也就是，通过检测 Lewis 抗原相关基因多态性，以检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的方法，其中，幽门螺杆菌相关胃癌易感性：隐性 le等位基因，和 /或显性纯合 Se/Se基因型。

这里所说的 "遺传易感性"是指由遗传决定的易于罹患某种（某类）疾病的倾向性 (susceptibility) , 即过去人们常谓的 "素质"（diathesis )。某个体的 H. pylori相关胃癌易感性表现为该个体易受 H. pylori感染和感染后易癌变。

遗传易感基因的存在，是遗传易感性的基础。在本发明的一个优选实施例中（参见实施例 3)，采用山东省临朐县胃癌高发现场的人群，以胃癌低发的北京人群和湖南人群为正常对照，利用统计分析比较 Lewis血型抗原相关基因，即 Lewis基因和 Se基因，在人群之间分布的差异，从而首次成功证明了 Lewis 血型抗原相关基因多态性是 H. pylori 相关癌症的易感因素之一。其中，显性的 Le等位基因是胃癌的保护因素；而隐性的 le等位基因是 H. pylori相关胃癌的危险因素。比值比（ odds ratio, OR)为 7. 06, 95%可信区限（confidence interval, CI)为 3. 17—15. 72，表明隐性 le等位基因携带者比 Le/Le基因型携带者患癌风险增加 7. 06倍，而且山东人群中还出现了 2例罕见的隐性纯合个体，占 1. 4%; 山东人群、湖南人群和北京人群 Se酶的表型大部分为阳性，但山东人群显性纯合的 Se/Se基因型分布频率最高。

在本发明的另一个优选实施例中（参见实施例 4)，在胃癌高发的山东人群内部，统计分析比较 Lewis基因在病人组和正常组中分布差异。其中，病人 69例，正常人 43例，这里所说的 "病人" 为病理诊断从慢性萎缩性胃炎到胃癌的患者。结果显示在山东人群内部， Le/le基因型的分布频率在病人组同正常组之间，具有显著性差异。（P<0. 05) OR为 3. 23。 2例罕见的隐性纯合 le/le个体出现在病人组中。

在本发明的另一个实施例中（参见实施例 7)，检测 11种胃癌细胞系 Lewis血型抗原相关基因，即 Lewis基因和 Se基因的多态性分布。结果显示： 11种胃癌细胞系中，杂合的 Le/le基因型分布频率高达 63. 6%，在正常人群中罕见的隐性纯合的 le/le基因型在胃癌细胞系中高达 18. 2%。而 Se/Se基因型分布频率为 27. 2%。这又一次强有力地验证了在人群中的结论：显性的 Le等位基因是胃癌的保护因素；而隐性的 le等位基因是 H. pylori相关胃癌的危险因素。

因此，本发明提供了检测 H. pylori相关胃癌易感性的方法，即检测待测样品 Lewis血型相关基因多态性。优选 Lewis基因多态性。通过本发明大样本的统计分析，可以单独使用本发明的方法，即检测待测样品 Lewis 血型相关基因多态性来检测 H. pylori 相关胃癌易感性，同时，本领域技术人员已知，胃癌的发生、发展是多因素共同作用的结果, 遗传易感性也有其自身的复杂性，所以本发明也可以与其它方法联合使用，以达到检测

H. pylori相关胃癌易感性的目的。当然，本发明的方法还可以与其它本领域已知的方法联合使用，达到捡测胃癌易感性，以至于胃癌的目的。本发明提供了检测待测样品 Lewis血型相关基因多态性的方法。所谓 "基因多态性" 指的是在人群中，各个体基因的核苷酸序列存在的差异。核苷酸序列的差异可以体现在 DNA水平上或者 RNA水平上， DNA水平包括基因组 DNA或者 cDNA。所以，可以通过检测基因组 DNA, RNA或 cDNA来检测突变。优选基因组 DNA。在本发明中，由于核苷酸序列的差异，导致了由其决定的 H type- 1 前体发生了量的差别，因此，本发明核苷酸序列的差异还体现在由其决定的 H type- 1前体表达水平上。

因此，可以在 DNA水平， RNA水平或者由其决定的 H type- 1前体水平来检测本发明的 Lewis 血型相关基因多态性。优选 DNA, 更优选基因组 DNA。

可以用多种技术在 DNA水平上检测出携带 Lewis 血型相关基因突变的个体。待测样品可以从来自患者的细胞获得，如来自血液，尿，唾液，胃液，头发，活组织检查和尸体解剖材料的细胞。例如，在本发明的优选实施例中，待测样品为来自外周血淋巴细胞的基因组 DNA。基因组 DNA 可以直接用于检测，或者在分析前可以用聚合酶链式反应 (PCR) 扩增（Saiki 等，自然， 324 : 163-166 (1986) )。 RNA或 cDNA也可用于相同目的。与待测 DNA、 RNA或 cDNA特定序列互补的 PCR引物可用于鉴别和分析突变。如通过与正常的基因型相比较，根据扩增产物的大小改变来检测缺失及插入。可以经与用放射性标记的反义 RNA或 DNA探针与扩增后的 RNA或 DNA序列杂交，以鉴别点突变。也可以基于已知的核苷酸顺序的改变，合成正常的和突变的 PCR引物，在 PCR反应的底物中加入荧光标记的核苷酸，根据反应产物中有无荧光出现，确定在扩增所用的引物中有无碱基变化，从而检测突变。类似地，也可以基于已知的核苷酸顺序的改变，合成正常的和突变的 PCR引物，引物末端最后一个核苷酸应该是与正常或者突变的核苷酸性互补的核苷酸，进行 PCR 扩增反应，只有与引物末端核苷酸完全匹配的核苷酸序列才能够扩增出来，这样的 PCR产物可以结合聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离方法,用溴化乙锭染色以后，在紫外灯下观察有无相应的扩增片段，即可检测突变。为了简便起见，也可以只对突变点或者正常基因之一设计引物，当待测样品扩增后出现相应扩增片段时，该待测样品含有或者不含有突变基因。

通过 DNA测序可以直接揭示对照基因和携带突变基因之间的序列差异。当与 PCR结合使用时，这种方法的灵敏性大大提高。例如，将测序引物和双链 PCR产物或者不对称扩增法产生的单链模板分子一起使用。各种 DNA及 DNA片段的核苷酸序列的测定也可用常规方法如双脱氧链终止法 ( Sanger 等人， PNAS , 1977 , 74： 5463-5467)。此外，核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒或自动测序仪等。常规的自动测序法用放射性标记或荧光标记来确定核酸序列。在本发明的一个优选实施例中，（参见实施例 2 ) 对于 Se 基因 A385T, G428A, C571T, C628T位点的多态性，采用 PCR产物经玻璃奶纯化后，利用自动测序仪直接测序。

基于 DNA序列差异的遗传试验可以通过检测在含有或不含变性剂的凝胶中， DNA片段电泳迁移率的变化来实现。小的序列缺失和插入可以由高分辨率凝胶电泳显示。不同序列的 DNA片段可以在变性甲酰胺梯度凝胶上进行区分，根据其特定的熔点或部分解链温度，不同的 DNA 片段将停滞在凝胶的不同位置（参见 Myers 等，科学， 230 : 1242 (1985) ) o

本发明的核苷酸序列的差异还体现在与 DNA相对应的 RNA水平上。 RNA水平的检测通常包括以下步骤：（一） RNA的提取和纯化。利用高浓度强变性剂异硫氰酸胍可迅速破坏细胞结构，使 RNA 从细胞中释放出来，同时异硫氰酸胍和 β -巯基乙醇还能使细胞内各种 RNA酶失活。细胞裂解后，通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使 RNA与其它细胞组分分离，例如， DNA、蛋白质和细胞残片等。为避免非特异性的降解， RNA的纯化要尽量快地在变性条件下进行，所有的材料和溶液都要严格消毒。分子量较大的 RNA, 包括 mRNA 通常都经过反转录合成 cDNA, 然后分析其 cDNA核苷酸序列。（二） RNA的末端标记。要对 RNA的 5'端进行放射性磷酸标记，一定要有一个 5'-羟基，帽子结构要用烟草酸性焦磷酸酶和磷酸酶除去， 5'端磷酸化的 RNA要经碱性磷酸酯酶脱磷，并将此酶失活。 5'端脱磷的 RNA可以用高比活性的 T4多核苷酸激酶（PNK) 磷酸化， PNK可以将 [ Y - ²P] -ATP的 [ Y - ³²P] -磷酸转移到 RNA的 5'-末端。对 RNA的 3'-末端进行标记一般用 T4 RNA 连接酶将 [5'- ³²P] -pCp连接到 RNA的 3'-末端。（三） RNA序列测定。用 RNA酶和 S1保护的核酸酶保护分析法或化学裂解法可以检测特殊位置上的序列变化，（如 Cotton 等， PNAS, 美国， 85 : 4397-機（1985) )。此外，也可以使用商业测序试剂盒直接进行 RNA 序列测定。

因此，可以用杂交、核糖核酸酶保护、化学裂解、直接 DNA测序、或使用限制酶 (如限制性片段长度多态性 (RFLP))和基因组 DNA的 Southern印迹法等来检测核苷酸序列的差异。除了更常规的凝胶电泳和 DNA测序之外，突变也可以用原位分析法检测。

在本发明的一个优选实施例中 (参见实施例 1)，通过与正常对照的基因组 DNA比较，检测待测样品中核苷酸序列的突变，主要采用 PCR扩增以后，限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLP) 方法进行。对于本发明，可以检测使 Lewis 基因错义突变或者无义突变或者其它导致编码无功能的 Le酶的位点，优选检测 Lewis 基因 T59G、 G508A和 T1067A多态性位点，更优选 T59G位点。在本优选实施例中，先提取基因组 DNA，然后基于对已知核苷酸序列的分析，合成 PCR引物，并分别扩增含 T59G、G508A和 T1067A 多态性位点的 Lewis基因片段，接着利用基于突变位点的分析，采用特定的限制性内切酶酶切该 PCR产物，所产生的 DNA片段的数目和各个片段的长度反映了限制性内切酶的切点在 DNA分子上的分布，从而检测出特定的突变。正如本领域的普通技术人员所知， PCR引物可以利用固相亚磷酸酰胺三酯法在 DNA合成仪（ABI， 381A型）上合成。特定的限制性内切酶仅识别并作用于特定的 DNA序列，酶切反应的条件、辅助因子及其它要求应当视具体的酶而定。本发明使用的限制性核酸内切酶都是市售的。对于市售的酶而言，可以参照说明书上推荐的条件，选择合适的缓冲液和加入底物的量。为了分析的目的，一般可以在约 20微升缓冲液中使用 1-2个单位的酶消化 1微克质粒或者 DNA 片段， 37Ό作用 1-2小时的反应条件可以满足大多数酶切反应的要求。酶切后的产物可以直接进行聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳分离，用溴化乙锭染色以后，可以在紫外光下直接观察多态性。

对于 Se基因，可以检测使 Se基因错义突变、无义突变或者其它导致编码无功能 Se 酶的位点的多态性，例如 Se基因 A385T, G428A, C571T, C628T位点， G849A位点和融合基因突变。在本发明的一个优选实施例中（参见实施例 2)，对于 Se基因 A385T， G428A, C571T, C628T位点的多态性，采用 PCR产物经玻璃奶纯化后，直接测序，对于 Se基因的 G849A位点和融合基因突变釆用上述 PCR-RFLP方法进行。

Lewis血型抗原相关基因多态性也可以通过 H type-1前体的量来检测。根据本发明的方法并结合 Lewis 血型抗原生物合成途径可知， Se酶是决定从 Le。转化到 H type-1 前体的关键，其活性的强弱，决定转化效率的高低。 Le 酶决定从 H type-1 前体到 Le^h 的转化，其活性强弱，决定转化效率的高低。当 Se酶活性强而 Le酶活性弱时， H type-1 前体出现的机会就多；当 Se酶活性弱而 Le酶活性强时， H type-1前体出现的机会就少。由于基因的剂量效应， Le/Le基因型较 Le/le基因型酶活性强， le/le基因型酶无活性。同理， Se/Se基因型酶活性较 Se/se、 se/se酶活性强。所以，也可以说当基因型是 Le/le 或者 le/le和 Se/Se时， H type-Ι前体出现的机会最大。所以， Lewis血型抗原相关基因多态性也可以通过 H type-1前体的量来检测。当来自某个体的待测样品 H type-1前体的量超过对照值时，则该个体具有幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性。其中对照值为来自具有统计学意义的正常个体的样品的 H type-1前体的量。分析 H type-1 前体含量的方法是本领域技术人员熟知的，方法包括放射免疫测定、竞争结合测定、 Western 印迹分析、酶联免疫吸附（ELISA) 测定和 "夹心"测定和流式细胞术等。优选 ELISA测定。待测样品可以来自患者表达 H type-1 前体的细胞，可以为来自如血液、尿、唾液、头发、乳汁、活组织检査和尸体解剖材料等的细胞。 ELISA 测定包括首先制备 H type-1 前体的特异性抗体，优选单克隆抗体。然后制备该单克隆抗体的报导抗体。将报导抗体与一种可检测试剂相结合，所说试剂如放射性试剂、荧光试剂或者辣根过氧化物酶。优选辣根过氧化物酶。从宿主取样，并将其在与样品中蛋白质结合的固体支持物 (如聚苯乙烯皿）中孵育。通过和非特异性蛋白质 (如牛血清清蛋白）一起孵育，将覆盖皿中任何自由的蛋白质结合位点。接下来，在单克隆抗体和结合到聚苯乙烯皿上的 H type-1 前体结合期间，将单克隆抗体在皿中孵育。用缓冲液将所有未结合的单克隆抗体洗掉。此时，将和辣根过氧化物酶连接的报导抗体放入皿中，结果导致报导抗体和任何结合到 H type-1 前体抗原的单克隆抗体结合。然后将未结合的报导抗体洗掉。接着向皿中加入过氧化物酶底物，和标准曲线比较，在给定时间内产生的颜色的量即是给定体积的患者样品中存在 H type-1前体的量。

也可以用竞争测定法检测 H type-1前体含量。方法包括将 H type-1前体的特异性抗体结合到固相支持物上，然后标记（如放射性标记）该抗原，将取自宿主的样品通过固相支持物，然后通过检测标记量，确定样品竞争性结合抗体的量，从而确定样品中 H type-1前体的含量。

因此， Lewis血型抗原相关基因多态性可以在 DNA水平上， RNA水平上检测核苷酸序列的差异，也可以在通过检测由 Lewis基因和 Se基因决定的 H typ-1前体的量来完成。优选在 DNA水平上检测 Lewis血型抗原相关基因多态性。更优选基因组 DNA。根据本发明的另一方面，本发明涉及本发明的方法在筛选 H. pylori 相关胃癌高危个体中的应用。例如，体外检测样品中 Lewis 血型抗原相关基因，尤其是 Lewis基因的多态性，从而不必进行胃镜检测-胃镜检测有其自身的危险性，就能检测出 H. pylori相关胃癌的高危个体，为在人群中筛选高危个体提供了一种新的非侵袭性的方法。此外，利用本发明的方法，还可以向个体报告 H. pylori 感染后，该个体的患癌风险。例如，隐性 le基因携带者在感染 H. pylori 后，发展为萎缩性胃炎及胃癌的风险比 Le/Le基因型携带者高 7. 06倍。本发明还涉及本发明的方法在有针对性地干预、预防或早诊随访中的应用。例如，通过检测样品中 Lewis 血型抗原相关基因，优选 Lewis基因的多态性，更优选 T59G位点多态性，就能够检测出 H. pylori相关胃癌的危险因素，从而指导临床对 H. pylori感染的处理方案。比如对于携带隐性 le/le等位基因的个体，因其对 H. pylori 相关胃癌的易感性极高，所以如果其感染了 H. pylori , 则要考虑根除其体内的 H. pylori。根除 H. pylori的方法包括抗体结合疗法等现有技术。

病人一旦检测出癌症的发生和转移，就难以挽救了，所以，预防癌症和早期治疗癌症至关重要。本发明阐明了 H. pylori 相关胃癌个体差异的根本原因，有助于探讨疾病的发病机理，因而能从根本上提供疾病的预防，特别是预防的个体化原则。例如，本发明通过检测样品中 Lewis 血型抗原相关基因多态性，优选 Lewis基因的多态性，更优选 T59G位点多态性，检测出 H. pylori相关胃癌的危险个体，即携带隐性 le基因的个体。对于这样的个体一旦出现早期症状，就应进行胃镜随访，达到早期发现，早期治疗的目的。本发明还提供了一种试剂盒，其内装有一个或多个容 ^，容器内装有用以检测 Lewis 血型抗原相关基因，优选 Lewis基因的多态性，更优选 T59G位点多态性，的一种或多种组分。按照检测方法及检测多态性位点的不同，试剂盒可含有不同组分。与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品制造、使用及销售的信息。例如，（参见实施例 8) 采用 PCR-RFLP法捡测样品中 Lewis基因的 T59G位点多态性的试剂盒，可含有引物

sn3 5'-CCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCCC-3'

sn4 5 '- AGTGGCATCGTCTCGGGACACACG- 3 '

及 dNTP， TagDNA聚合酶， PCR反应缓冲液，核酸内切酶 Msp I等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上的组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为 15- 30个碱基， GC含量为 45%- 50%左右，在适当的温度下与模板特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，例如（0LIG0 4. 06 引物分析软件）；所述的 TagDNA聚合酶可以是 Klenow片段， Tth DNA聚合酶， VENT DNA聚合酶等能够用于 PCR扩增的酶。

并说明使用方法如下：取纯化后的 PCR产物与限制性核酸内切酶 Msp I混合，温育，聚丙烯酰胺胶电泳分析酶切结果。如果酶切结果产生 93bp —个片段，则为野生型纯合子；如果产生 93bp， 68bp和 25bp 3个片段，则为杂合子；如果产生 68bp和 25bp 2个片段，则为突变 le基因纯合子。隐性的 le基因是 H. pylori相关胃癌的危险因素。另外，也可利用 PCR扩增法直接检测 Lewis基因的 T59G位点多态性，为了方便起见，本方法针对隐性 le基因设计引物，

引物 1 ( forward) 5，_CCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCACG- 3，

引物 2 (Reverse ) . 5，_AGTGGCATCGTCTCGGGACACACG- 3，

进行 PCR扩增， 12%聚丙烯酰胺胶分析扩增片段。其中，引物 1 (forward) 3 ' 末端最后一个核苷酸特意设计为 G，因为在这种情况下，只有与引物末端完全相匹配的核苷酸序列才能够扩增出来，所以当 59 位点由 T突变为 G时，就出现 93bp扩增片段，则该待测样品含有 le 等位基因，该个体的患癌风险就髙，应对其进行有针对性地干预、预防或早诊随访。而 59 位点未突变时，其为 T，不能与引物 1 (forward) 3' 末端完全相匹配，所以不能扩增出来，该待测样品不含有 le等位基因。本发明首次把 Lewis 血型抗原相关基因多态性与幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性联系起来，为胃癌的深入研究和防治，甚至诊断治疗提供了新的思路。优选实施例

本发明共采用 294例人血液标本， 142例来自山东临朐县胃癌高发现场人群，其中病人 99例，男性 68人，女性 31人，正常人 43例，男性 30人，女性 13人。病人组由病理诊断从慢性萎縮性胃炎到胃癌的患者组成；正常对照人群 152例，其中 93例来自北京正常对照人群， 59例来自湖南正常对照人群。湖南人群及北京人群正常对照均为正常供血人员。实施例 1 Lewis 基因多态性的检测

应用 PCR分别扩增含 T59G、 G508A和 T1067A多态性位点的 Lewis基因片段。（基本参照 Shin Yazawa, et al, Jpn J Human Genet 1996, 41： 177-188 )。

1. 基因组 DNA的提取

基因组 DNA分离自外周血淋巴细胞。外周血淋巴细胞 DNA提取纯化方法如下- 抗凝或者非抗凝血块，转入 10ml离心管中，加入 2- 3ml 1 XTE,反复振摇后， 3000rpm 离心 10分钟；弃掉上清液，加入 1 XTE 2-3ml , 反复振摇后， 3000rpm离心 10分钟；重复上述步骤，洗 2-5 遍，视红细胞洗净程度而定（一般沉淀发白即可）；将沉淀物加入 lml 裂解缓冲液 ( 10mM Tris- CI (pH 8. 0) ； 0. 1M EDTA (pH 8. 0) ; 0. 5% SDS。），加入蛋白酶 K (Merck公司） 20mg/ml， ΙΟμΙ , 55°C裂解过夜；每管加入 lml饱和酚抽提 1次， lOOOrpm离心 5分钟；移上清至另一干净离心管中，加入等体积酚：氯仿（1 : 1 ) 抽提一次， lOOOrpm离心 5分钟；上清加入等体积氯仿抽提一次， lOOOrpm离心 5分钟；上清加入 1/10体积 3M NaAc, 2. 5倍体积无水乙醇，沉淀过夜； 12000rrap， 4°C离心 10 分钟，沉淀用 70%乙醇洗盐； 12000rmp， 4°C离心 10分钟，沉淀用 dd 0溶解；在紫外分光光度计 260、 280nm比色，使 260/280比率达到 1. 6-1. 8; 分装后， - 20°C冰箱保存。 2. PCR扩增 Lewis基因 T59G 、 G508A、 T1067A多态性位点

(1) PCR扩增 T59G多态性位点

扩增 T59G多态性位点的引物为：

sn3 (Forward)： 5'-CCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCCC-3'

sn4 (Reverse)： 5，- AGTGGCATCGTCTCGGGACACACG-3'

*下划线显示不对称碱基

引物设计时人为将引物 sn3中相对于 Lewis 基因 57位点的 A改变为 C，如果 59位点发生 T→G的改变，就产生一个 Msp I酶切位点，识别序列为 C ^l CGG， 93bp的产物被 Msp I切割成 68和 25bp两个片段。 30 μ 1 PCR反应体系中含 0. 2 μ g模板 DNA， 20 μ M弓 |物各 0. 12 μ 1， 10mM dNTP 0. 5 μ 1， 3 μ 1 10 X PCR反应缓冲液， 2. 5 μ Tag DNA聚合酶。反应条件是： 94Ό预变性 3 分钟后， 94°C 45 ' ， 62°C 45'， 72 °C 30' ，进行 35 个循环，最后 72Ό延伸 10分钟。 PCR产物 93bp (见图 1A)。

PCR产物纯化方法如下：

PCR产物中加入 1/10体积 3M NaAc, 2倍体积 100%乙醇， - 20°C沉淀 1小时以上， 1200 转 /分 X 10分钟， 4°C，去上清；70%乙醇洗涤 1次， 12, 000转 /分 X 10分钟， 4°C，去上清;真空干燥; dd 0溶解。

取纯化后的 PCR产物 17 μ 1与限制性核酸内切酶 Msp I 5u混合， 37°C温育 2-4小时， 12%聚丙烯酰胺胶电泳分析酶切结果。

结果

59 位点 T— G突变后可被 Msp I识别，酶切产物有 68bp和 25bp两个片段。杂合子产生 93bp， 68b 和 25bp 3个片段，野生型纯合子产生 93bp—个片段，突变纯合子产生 68bp和 25bp 2个片段（见表 1 )。如图 IB所示，泳道 1显示 93bp—个片段，为野生型纯合子；泳道 2、 3显示 93bp， 68bp和 25bp 3个片段，为杂合子。

( 2 ) PCR扩增 G508A多态性位点

扩增 G508A多态性位点的引物为- syl (Forward) : 5，— GAAGCCCTGGACAGATACTTCA—3' sy2 (Reverse)： 5，_GCAGGCTCTGGTAGTAGCGCA_3，

30 μ 1 PCR反应体系中含 0. 2 g模板 DNA， 20 μ M引物各 0. 12 μ 1， lOmM dNTP 0. 5 μ ΐ , 3 u l 10 X PCR反应缓冲液， 2. 5 μ Tag DNA聚合酶。反应条件是： 94Ό预变性 3分钟，之后， 94Ό 4 , 55 °C 45', 72 °C 30' ，进行 35个循环，最后 72°C延伸 10分钟。 PCR 产物 202bp (见图 1A)。

取参照前述 PCR产物纯化方法纯化后的 PCR产物 17 μ 1与限制性核酸内切酶 Pvu II 5u 混合， 37°C温育 2-4小时， 12%聚丙烯酰胺胶电泳分析酶切结果。

结果-

G508A位点 G— A突变后，产生一个 Pvu II酶切位点，识别序列为 CA » GCTG， 202 bp 产物被 Pvu II切割成 131和 71bp两个片段。所以杂合子产生 202bp， 131bp和 71bp 3个片段，野生型纯合子产生 202bp—个片段，突变纯合子产生 131bp和 71bp 2个片段 (见表 1)。如图 1B所示，泳道 4、 6显示 202 bp—个片段，为野生型纯化子；泳道 5显示 202bp, 131bp和 71bp 3个片段，为杂合子。

( 3) PCR扩增 T1067A多态性位点

扩增 T1067A多态性位点的引物为：

sn6 (Forward)： 5，- CGCTCCTTCAGCTGGGCACTGGA-3'

sn7 (Reverse)： 5，-CGGCCTCTCAGGTGAACCAAGAAGCT- 3，

30 μ 1 PCR反应体系中含 0. 2 μ g模板 DNA， 20 μ M引物各 0. 12 μ 1， lOmM dNTP 0. 5 μ 1， 3 μ 1 10 X PCR反应缓冲液， 2. 5 μ Tag DNA聚合酶。反应条件是： 94 °C预变性 3分钟，之后， 94°C 45', 60 °C 45，， 72 °C 30' ，进行 35个循环，最后 72°C延伸 10分钟。 PCR产物 109bp (见图 1A)。

取参照前述 PCR产物纯化方法纯化后的 PCR产物 17 u 1与限制性核酸内切酶 Hindlll 5LI混合， 37°C温育 2-4小时， 12%聚丙烯酰胺胶电泳分析酶切结果。

结果

1067位点 T— A突变后，产生一个 Hindlll酶切位点，识别序列为 A ^l AGCTT， 109 bp 产物被 Hindlll切割成 85和 24bp两个片段。所以，杂合子产生 109bp， 85bp和 24bp 3 个片段，野生型纯合子产生 109bp—个，突变纯合子产生 85bp和 24bp 2个片段 (见表 1)。如图 1B所示，泳道 7、 8显示 109bp—个片段，为野生型纯合子；泳道 9显示 109bp， 85bp 和 24bp 3个片段，为杂合子。表 1 PCR-RFLP方法检测各位点突变使用的内切酶以及相应的片段大小突变位点引物产物酶片段大小 (bp)

(bp) 正常突变

T59G sn3/sn4 93 Msp I 93 68, 25

G508A syl/sy2 202 Pvu II 202 131， 71

T1067A sn6/sn7 109 Hind III 109 85， 24

3. 待测样品 Lewis基因多态性分析

请参见图 IB, 如果来自某个体的 Lewis基因进行 PCR-RFLP分析的结果如 1, 4, 7所示，则该个体是没有突变的正常个体;如果来自某个体的待测样品 PCR-RFLP结果如 2, 5， 8 所示，则该个体 T59G和 G508A位点杂合；如果来自某个体的待测样品 PCR- RFLP结果如 3, 6， 9所示，则该个体 T59G和 T1067A位点杂合。实施例 2 Se基因多态性表现形式

A385T, G428A, C571T, C628T位点的多态性采用 PCR产物直接测序的方法检测， G849A 位点和融合基因采用 PCR- RFLP方法检测。（参考 Henry S, et al， Biochem Biophys Res Commun 1996 ; 219 : 675- 678.和 Henry S, et al ， Vox Sang 1996 ; 70 : 21-25. )。

1. 检测 A385T， G428A, C571T, C628T多态性位点

(1) 扩增 A385T, G428A, C571T, C628T多态性位点的引物为:

Se- up (Forward)： 5，- ACCTGAACGACTGGATGGAG— 3，

Se-down (Reverse)： 5，- AGCAAACACCACATCACC-3'

30 μ 1 PCR反应体系中含 0. 2 g模板 DNA， 20 μ M引物各 0. 12 μ 1， lOmM dNTP 0. 5 μ 1， 3 l 10 X PCR反应缓冲液， 2. 5 Tag DNA聚合酶。反应条件是： 94 Ό预变性 3分钟，之后， 94°C 45' ，55°C 45'， 72 °C 30，，进行 35个循环，最后 72°C延伸 10分钟。 PCR产物 404bp。

玻璃奶纯化 PCR产物，方法如下：向 PCR产物溶液中加入 3倍体积 Nal；加入 5μ1玻璃奶 (玻璃奶纯化试剂盒购自 GIBC0) , 此前将玻璃奶震荡 1分钟，使之重悬；混匀，室温放置 5分钟，期间 1-2分钟混匀一次；快速离心 5秒钟，弃上清；用 New wash重悬，快速离心，去上清；重复 2次；真空抽干；用 1 X TE洗 2次，吸上清， -20Ό保存。

PCR产物经纯化后，直接测序（测序仪 Biosystems 3700)。

结果：

如图 2A所示，在 A385T位点，出现双峰，说明其为杂合突变；如图 2B所示，在 A385T 位点，测序结果为 T，且为单峰，说明其为纯合突变。同理，如图 2C所示，显示 G428A 位点杂合突变，如图 2D所示，显示 G428A位点纯合突变。

2. 捡测 G849A多态性位点

扩增 G849A多^^性位点的引物为：

PI (Forward)： 5 '-AGGAGATCCTCCAGGAGTTCA-3 '

P2 (Reverse)： 5，- AGAAGGAGAAAAGGTCTCAAAGG-3'

30 μΐ PCR反应体系中含 0.2ug模板 DNA， 20 μ M引物各 0.12 μ 1， lOm dNTP 0.5 μ1， 3ul 10XPCR反应缓冲液， 2.5yTag DNA聚合酶。反应条件是： 94Ό预变性 3分钟，之后， 94 °C 50，, 60 °C 45，， 72 °C 30，，进行 35个循环，最后 72 °C延伸 10分钟。 PCR 产物 581bp (见图 3A)。

取参照实施例 1 PCR产物纯化方法纯化后的 PCR产物 17 μ 1与限制性核酸内切酶 Dde I 5u混合， 37°C温育 2-4小时， 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。

结果：

在 849位点 G—A的改变，产生一个 Dde I酶切位点，识别序列为（CTNAG) ⁵¹， 581bp 产物被 Dde I切割成 394和 187 bp两个片段。所以杂合子产生 581bp， 394bp和 187bp 3 个片段，野生型纯合子产生 581bp—个，突变纯合子产生 394bp和 187bp 2个片段（见表 2)。如图 3B所示，如果待测样品的检测结果如 1， 2, 3所示，则没有突变。

3. 检测融合基因：

融合基因由正常假基因的 5'端和 Se功能基因的 3'端构成，断点位置为假基因的 314 位点，融合基因 314位点上游属于正常假基因，融合基因 314位点下游属于 Se功能基因。实验采用正常假基因特异的上游引物 P7和普通的下游引物 P4扩增正常假基因和融合基因。 (Yoshiro Koda, et al. Am J Hum Genet 1996; 59: 343-350. )

P7 (Forward) :5，_CTGCCTCCTGACCATGTCC- 3，

P4 (Reverse)： 5 '-CCACTCTGGCAGGAAGGC-3 '

30μ1 PCR反应体系中含 0.2 g模板 DNA， 20 μ M引物各 0.12 μ 1， 10mM dNTP 0.5 μ 1， 3μ1 10 X PCR反应缓冲液， 2.5 μ Tag DNA聚合酶。反应条件是： 94 'C预变性 3分钟，之后， 94°C 45', 55 °C 45', 72 °C 70，，进行 35个循环，最后 72°C延伸 10分钟。 PCR产物 1010bp，见图 4A。

取参照实施例 1 PCR产物纯化方法纯化后的 PCR产物 17 μ 1与限制性核酸内切酶 Pst I 5u混合， 37°C温育 2-4小时， 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。

结果：正常假基因有 2个 Pst I酶切位点， 1010bp产物被 Pst I切割成 579、 112和 319bp 3 个片段； Se功能基因有 1个 Pst I酶切位点¹，识别序列 CTGCA ^l G， 1010bp产物被 Pst I切割成 579和 433bp 2个片段。所以，融合基因酶切产物有 579bp和 433b_P两个片段，正常假基因酶切产物有 579bp， 319bp和 112bp 3个片段（见表 2)。如图 4B所示，待测样品只有 579bp， 319bp和 112bp 3个片段，则该待测样品不具有融合基因。

表 2 PCR-RFLP方法检测 Se基因各位点突变使用的内切酶以及相应的片段大小突变引物产物酶片段大小（bp)

位点 (bp) 正常突变

G849A P1/P2 581 Dde I 581 394, 187

融合基因 P7/P4 1010 Pst I 579, 319, 112 579, 431 实施例 3 山东人群、湖南人群和北京人群

Lewis基因的多态性位点的检测

1. Lewis基因多态性位点检测

多态性位点包括 T59G， G508A和 T1067A 3个位点，方法如实施例 1所述。

2. 统计分析：

以 X²检验比较各基因型在各人群之间分布的差异。以比值比（odds ratios, ORs ) 及其 95%可信区限（confidence interval, CIs ) 表示相对危险度，所有的统计检验均为双侧概率检验。对于四格表中为零的项，加 0. 5来计算比值比。所用的统计软件为 SPSS (for Windows) 10. 0版。

结果：

见表 3。

表 3. 山东人群、湖南人群和北京人群 Lewis基因突变频率分布

人群数量频率 (%)

(染色体） T59G G508A T1067A 山东 284 44 ( 15. 5%) 26 (9. 2%) 18 (6. 3%) 湖南 118 6 (5. 1%) 4 (3. 4%) 2 (1. 7%) 北京 186 2 (1. 1%) 0 2 (1. 1%)

142例山东人群中，发现 T59G突变 44个， G508A突变 26个， T1067A突变 18个，山东人群 T59G、 G508A和 T1067A的突变频率分别为 15. 5%、 9. 2%和 6. 3%。 59例湖南人群中，发现 T59G突变 6个， G508A突变 4个， Π067Α突变 2个，湖南人群 T59G、 G508A 和 1067A的突变频率分别为 5. 1%、 3. 4%和 1. 7%。 93例北京人群中，发现 T59G突变 2 个，未发现 G508A突变， T1067A突变 2个，北京人群 T59G、 G508A和 T1067A的突变频率分别为 1. 1%、 0和 1. 1%。

由于 T59G突变并不单独出现，而是与 G508A或者 T1067A同时出现， T59G和 G508A 组合，定义为隐性, lel， . T59G和 T1067组合，定义为隐性 le2，结合以上 3个突变位点的结果而得出山东、湖南和北京人群的 Lewis基因等位基因频率分布，归纳总结见表 4。

表 4. 山东、湖南和北京人群 Lewis基因等位基因频率分布

数量频率 (%)

人群 (染色体） Le lei le2 山东 284 240 (84. 5%) 26 (9. 2%) 18 (6. 3%) 湖南 118 112 (94. 9%) 4 (3. 4%) 2 (1. 7%) 北京 186 184 (98. 9%) 0 2 (1. 1%)

142例山东人群中，发现 Le等位基因 240个， lei等位基因 26个， le2等位基因 18 个，山东人群的 Le， lei和 le2等位基因频率分别为 84. 5%, 9. 2%和 6. 3%。 59例湖南人群中，发现 Le等位基因 112个， lei等位基因 4个， le2等位基因 2个，湖南人群的 Le， lei和 le2等位基因频率分别为 94. 9%, 3. 4%和 1. 7%。 93例北京人群中，发现 Le等位基因 184个，未发现 lei等位基因， le2等位基因 2个，北京人群的 Le， lei和 le2等为基因频率分别为 98. 9%, 0和 1. 1%。

根据表 4，得出的山东人群和正常对照人群（湖南和北京正常对照人群） Lewis 基因基因型结果，归纳总结见表 5。

山东人群和正常对照人群 Lewis基因基因型分布

人群频率（％)

Le/Le Le/le^b le/le 山东 ( 142) ^a 100 (70. 4) 40 (28. 2) 2 (1. 4) 正常对照 ( 152) 144 (94. 7 ) 8 (5. 3) ° 0

' '显示个体数量。

h显示 lei和 le2。

c P<0. 01, 0R=7. 06 (95% CI, 3. 17-15. 72)

142例山东人群中， Le/Le 基因型的个体 100例，约占总体的 70. 4%, Le/le基因型的个体 40例，约占总体的 28. 2%， le/le基因型个体 2例，约占总体 1. 4%。 152例正常对照人群中， Le/Le 基因型的个体 144例，约占总体的 94. 7%， Le/le基因型的个体 8 例，约占总体的 5. 3%，未发现 le/le基因型个体。 Le/le基因型的分布频率在胃癌高发的山东人群同正常对照人群之间具有显著性差异。（P<0. 01 ) 胃癌高发的山东人群携带 Le/le基因型的危险性是正常对照人群的 7. 06倍。

结果分析： '

从以上结果可以得出， Lewis血型抗原相关基因多态性是 H. pylori相关癌症的易感因素之一。其中，显性的 Le 等位基因是胃癌的保护因素；而隐性的 le 等位基因是 H. pylori 相关胃癌的危险因素。比值比（ odds ratio, OR)为 7. 06, 95% 可信区限 (confidence interval, CI)为 3. 17-15. 72, 表明隐性 le等位基因携带者比 Le/Le基因携带者患癌风险增加 7. 06倍。实施例 4 山东人群内部病人与正常人 Lewis基因型分布

检测方法参照实施例 3，比较分析 Lewis基因型在山东人群内部病人与正常人的分布。结果如下：

表 6. 山东人群内部病人和正常人 Lewis基因基因型频率分布

人群数量频率（%)

(个体） Le/Le Le/le le/le

病人 99 63 (63. 6) 34 (34. 4) * 2 (2. 0)

正常人 43 37 (86. 0) 6 (14. 0) 0

le为 lei 或 le2 ; *P<0. 05， 0R=3. 23, 95% CI (1. 15- -8. 40)

其中， 69例病人组， Le/Le基因型的个体 63例，约占总体的 63. 6%， Le/le基因型的个体 34例，约占总体的 34. 4%， le/le基因型个体 2例，约占总体 2. 0%。 43例正常组中， Le/Le 基因型的个体 37例，约占总体的 86. 0%， Le/le基因型的个体 6例，约占总体的 14. 0%，未发现 le/le基因型个体。 Le/le基因型的分布频率在病人组同正常组之间，具有显著性差异。（P<0. 05) OR为 3. 23。

结果分析：

更进一步表明显性 Le等位基因是胃癌发生的保护因素。隐性 le等位基因是 H. pylori 相关胃癌的高危因素。实施例 5 山东人群、湖南人群和北京人群的

Se基因的多态性位点的检测

利用实施例 2的方法，对山东人群、湖南人群和北京人群的 6个 Se基因的多态性位点进行了检测，它们是 G428A ( sel)、 A385T (se^w)、 C571T ( se3)、 G849A ( se4)、 C628T ( se5) 和融合基因（se6)，其中 G428A、 A385T、 C571T和 C628T位点通过 PCR产物直接测序方法检测， G849A位点和融合基因通过 PCR-RFLP方法检测，结果总结见表 7。表 7 山东、湖南和北京人群 Se基因等位基因频率分布

人群频率 '(%)

(染色体） Se sel se^w se3 se4 se5 se6 山东（284) 159(56.0) 0 125(44.0) 0 0 0 0 湖南（118) 67 (56.8) 0 5 (43.2) 0 0 0 0 北京（186) . 113(60.8) 0 73(39.2) 0 0 0 0

142例山东人群中，发现 A385T突变 125例，突变频率为 44.0%,山东人群中未发现 G428A, C571T, C628T和 G849A突变和融合基因，所以山东人群 Se 等位基因 Se 、 sel、 se^w、 se3、 se4、 se5和 se6的等位基因频率分别为 56.0%， 0, 44.0%, 0, 0， 0和 0。 (见表 7)

59例湖南人群中，发现 A385T突变 51例，突变频率为 43.2%, 湖南人群中未发现任何 G428A, C571T, C628T和 G849A突变和融合基因，所以湖南人群 Se 等位基因 Se , sel、 se se3、 se4、 se5和 se6的等位基因频率分别为 56.8%, 0， 43.2%, 0, 0， 0和 0 (见表 7)。

93例北京人群中，发现 A385T突变 73例，突变频率为 39.2%,北京人群中未发现任何 G428A, C571T, C628T和 G849A突变和融合基因，所以北京人群 Se 等位基因 Se， sel、 se\ se3、 se4、 se5和 se6的等位基因频率分别为 60.8%, 0， 39.2%, 0, 0, 0和 0 (见表 7)。

根据以上结果得出的山东人群、湖南人群和北京人群 Se基因型结果，归纳总结见表 8。

表 8 山东、湖南和北京人群 Se基因基因型频率分布

人群频率 (%)

(个体） Se/Se Se/se se/se seVse

山东（142) 48 (33.8) 0 63 (44.4) 0 0 31(21.8) 湖南（59) 19 (32.2) 0 29 (49.2) 0 0 11(18.6) 北京（93) 29 (31.2) 0 55 (59.1) 0 0 9 (9.7)

* se 包括 sel， se^w， se3—se6. ** P<0.05.

142例山东人群中， Se/Se基因型的个体 48例，约占总体的 33.8%， Se/se^w基因型的个体 63例，约占总体的 44.4%, seVse^w基因型个体 31例，约占总体的 21.8% (见表 8) 。

59例湖南人群中， Se/Se基因型的个体 19例，约占总体的 32.2%， Se/se^w基因型的个体 29例，约占总体的 49.2%， se^w/se^w基因型个体 11例，约占总体的 18.6% (见表 8) 。 93例北京人群中， Se/Se基因型的个体 29例，约占总体的 31.2%， Se/se^w基因型的个体 55例，约占总体的 59.1%, se^w/se^w基因型个体 9例，约占总体的 9.7% (见表 8) 。

实施例 6 Lewis血型抗原相关基因多态性综合分析

由于个体的 Lewis抗原表型是由 Lewis基因和 Se基因共同决定的，现将实施例

3、 4和 5的结果综合起来分析。

表 9和图 5说明的是 Le/Le和 Le/le基因型与 Se/Se或 Se/se基因型的组合在三个人群中的分布情况。表 10和图 6说明的是 Le/Le和 Le/le基因型与 Se/Se或 Se/se基因型的组合在山东人群内部病人和正常人的分布情况。

表 9 山东人群、湖南人群和北京人群 Lewis和 Se基因型分布 i (— 湖南 (59) 16(27.1) 37(62.7) 53(89.8) 6 (10.2) 北京 (93) 28(30.1) 63 (67.7) 91(97.8) 2 (2.2)

I i—

结果显示，北京人群 Lewis基因型几乎全部为显性纯合，分布频率高达 97.8%，湖

- 南人群 Lewis显性纯合基因型分布频率为 89.8%，山东人群最低，分布频率只有 70.3%。而山东人群的 Le/le基因型的分布频率最高，为 28.9%。北京人群最低，为 2.2%，湖南人群 Le/le基因型的分布频率为 10.2% (见表 9和图 5)。表 10 山东人群内部病人和正常人的 Lewis和 Se基因型分布情况

人群 Le/Le (%) Le/le (%)

个体 Se/Se Se/se Se/Se Se/se 总数病人 (99) 19(19.2) 43 (43.4) 62(62.6) 13(13.1) 22(22.2) 35(35.3) 正常人 (43) 14(32.6) 23 (53.5) 37(86.1) 2 (4.7) 4 (9.3) 6 (14.0) 在山东人群内部病人 Lewis显性纯合基因型的分布频率为 62.6%，正常人的分布频率为 86.1%。病人的 Le/le基因型的分布频率为 35.3%, 正常人 Le/le基因型的分布频率为 14.0%，明显低于病人组。山东人群携带 Le/le基因型的危险性是正常对照人群的 7.06倍。 2例罕见的隐性纯合 le/le个体出现在病人组中。（见表 10和图 6)

Se/Se基因型分布频率在山东人群中较高，为 33.8%，湖南人群 Se/Se基因型分布频率为 32.2%，北京人群 Se/Se基因型分布频率分布频率较低，为 31.2%。

结果分析- 从以上结果并结合实施例 3， 4， 5可以得出：显性 Le 等位基因是胃癌发生的保护因素。隐性 le等位基因是 H. pylori相关胃癌的高危因素。 Lewis 抗原相关基因多态性为幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的因素之一。可以通过检测 Lewis 抗原相关基因多态性的方法检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性。实施例 7 11种胃癌细胞系的 Lewis 基因和 Se基因的多态性

1. 培养细胞：

人胃癌细胞系 MGC803 (粘液腺胃癌细胞系，购自山东师大生物系）， BGC823 (胃癌细胞系，购自中国科学院细胞库）， SGC7901 (胃癌转移淋巴节细胞系，中国科学院细胞库）， AGS TCC N0. CRL-1739), KATO- III (ATCC NO. HTB- 103), SNV-KATCC NO. CRL-5971 ), SNV-5 (ATCC NO. CRL- 5973)， SNV- 16 (ATCC NO. CRL- 5974)， RF-1 (ATCC NO. CRL- 1864) , RF - 48 (ATCC NO. CRL— 1863)， N87 (ATCC NO. CRL- 5822)。

^附成成附成附附附

p着浮浮^浮 ^^着着，

2. 11种细胞系培养方法

浮浮浮

表 11 11种细胞系培养条件及生长性质

~~细胞系培养条件生长性质

AGS F-12K, 90%; FBS, 10%

KATO III RPMI 1640, 80% ; FBS, 20%

N87 RPMI 1640， 90%; FBS, 10%

RF-1 L- 15, 90% ; FBS, 10%

RF - 48 L-15, 90%; FBS, 10%

SNV-1 RPMI 1640, 90%; FBS, 10%

SNV - 16 RPMI 1640, 90%; FBS, 10%

SNV-5 RPMI 1640, 80%; FBS, 20%

823 RPMI 1640, 90%; FBS, 10%

803 RPMI 1640, 90%; FBS, 10%

7901 RPMI 1640, 90%; FBS, 10%

RPIM1640培养基配制方法：溶一袋 RPIM1640粉剂（GIBC0)至 1000ml水中，加 NaHC0₃ 2g使之溶解，调 ?1至 7. 2，过滤除菌，分装后 4°C存放。用前加灭活胎牛血清 (FBS)至 10。/。。 F-12K (GIBC0) 和 L-15 (GIBC0)培养基配制方法与此相同。

3. 基因组 DNA制备

基因组 DNA分离自培养细胞。培养细胞基因组 DNA提取纯化方法如下：

收获细胞，至少 l X lOVml , 贴壁细胞弃掉培养液，悬浮细胞釆用离心收集；细胞加入 I X PBS 5ml清洗一次; 将沉淀物加入 lml lysis buffer, 加入蛋白酶 K (20mg/ml ) ΙΟμΙ , 55°C裂解过夜；每管加入 lml饱和酚抽提 1次， lOOOrpm离心 5分钟；移上清至另一干净离心管中，加入等体积酚：氯仿（1 : 1 ) 抽提一次， lOOOrpm离心 5分钟；上清加入等体积氯仿抽提一次， lOOOrpm离心 5分钟；上清加入 1/10体积 3M NaAc, 2. 5 倍体积无水乙醇，沉淀过夜； 12000rmp, 4°C离心 10分钟，沉淀用 70%乙醇洗盐； 12000rmp， 4°C离心 10分钟，沉淀用 ddH₂0溶解；在紫外分光光度计 260、 280nm比色，使 260/280比达到 1. 6-1. 8，分装后， - 20Ό冰箱保存。

4. 检测 11个细胞系的 Lewis基因的多态性位点

应用实施例 1检测 Lewis基因突变的方法，检测 11个细胞系的 Lewis基因的多态性位点，它们是 T59G， G508A和 T1067A位点，结果总结归纳见表 12。

表 12 人胃癌 11个细胞系的 Lewis基因基因型

T59G G508A T1067A 基因型

7901 +/- +/- Le/lel

803 +/- +/- Le/lel

823 Le/Le

N87 +/ - +/- Le/lel

SNV-1 +/- +/- Le/lel

SNV-5 +/- +/- Le/lel

SNV-16 ++ +/- +/- lel/le2

RF-48 +/ - +/- Le/le2

RF-1 ++ ++ Ie2/le2

KAT0-III +/- +/ - Le/lel

AGS Le/Le

+/- : 杂合突变； ++: 纯和突变

其中， 7901、 803、暫、 SNV- 1、 SNV- 5和 KAT0III具有 T59G和 G508A位点的杂合突变，所以这些细胞系的 Lewis基因基因型是 Le/lel。SNV- 16具有 T59G的纯合突变， G508A 和 T1067位点的杂合突变，所以 SNV- 16的 Lewis基因基因型是 lel/le2。 RF-1具有 T59G 的纯合突变和 Π067位点的纯合突变，所以 RF- 1的 Lewis基因基因型是 Ie2/le2。 RF-48 具有 T59G 的杂合突变和 Π067位点的杂合突变，所以 RF- 48 的 Lewis 基因基因型是 Le/le2。 823、 AGS细胞系没有检测到任何突变，所以它们的 Lewis基因基因型是 Le/Le。

应用实施例 2检测 Se基因突变的方法，检测了 Se基因的多态性位点，它们是 G428A、 A385T、 C571T、 G849A、 C628T位点和融合基因，其结果总结归纳见表 3。 P T/CN02/00199

22 表 13 人胃癌 11个细胞系的 Se基因基因型

G428A A385T C571T G849A C628T 融合基因基因型 (sel) (se^w) (se3) (se4) (se5) (se6)

7901 ++ sel/ sel

803 ++ sel/sel

823 ++ ' sel/sel

N87 Se/Se

SNV-1 +/_ Se/se^w

SNV-5 Se/Se

SNV-16 Se/Se

RF-48 +/- Se/sel

o CM t

RF-1 +/- Se/sel

KATO-III ++ se" /se^w

AGS V- Se/sel

+/-：杂合突变； ++: 纯和突变

O O

其中， 7901、 803、 823和 MC细胞系具有 G428A位点的纯合突变， RF-48 RF-1和

湖南（59) 53 (89.8) 18(30.5) 41(69.5) 北京 (93) 91(97.8) 23(24.7) 70(75.3) 结果分析：

11种胃癌细胞系的杂合八 e基因型分布频率高达 63.6%，明显高于山东人群。显性纯合 Se/Se基因型分布频率为 27.2%，高于北京正常人群。在 11中胃癌细胞系中，隐性纯合 le/le个体竟高达 18.2%, 此种基因型在前述检测的整个人群中是罕见的，仅在山东高发人群的癌症病人中发现 2例。这些结果又一次强有力的验证了在人群实验中的结论：显性 Le等位基因是 H. pylori 相关胃癌的保护因素，隐性 le等位基因是 H. pylori相关胃癌高发的危险因素。实施例 8 检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的试剂盒

1 . 试剂盒含有：

扩增 T59G多态性位点的引物：（20μΜ)

sn3 (Forward)： 5，-CCATGGCGCCGCTGTCTGGCCGCCC - 3，

sn4 (Reverse)： 5'-AGTGGCATCGTCTCGGGACACACG-3'

10x PGR缓冲液

dNTP (lOmM)

Tag DNA聚合酶（5ϋ/μ1)

模板 DNA

限制性内切酶 Msp l - 限制性内切酶 10倍反应缓冲液

2. 使用方法：

(1)提取待测样品 DNA。

(2) PCR-RFLP方法检测 Lewis基因 T59G多态性位点多态性。

具体参见实施例 1 ( 1 )检测 T59G多态性位点多态性的方法。

3. 结果分析- 杂合子（Le/le ) 产生 93bp, 68bp和 25bp 3个片段，野生型纯合子（Le/Le)产生 93bp—个片段，突变纯合子（le/le)产生 68bp和 25bp 2个片段。因为隐性 le等位基因是 H. pylori 相关胃癌的高危因素。所以如果某个体为杂合子或突变纯合子，则其患癌风险就高。尤其是检测出为突变纯合子，则其患癌风险更高，应有针对性地对其进行干预、预防或早诊随访，达到早期发现，早期治疗的目的。

应理解，在阅读了本发明的上述讲述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，但改动或修改的等价形式同样落在本申请权利要求书所限定的范围内。

Claims

权利要求书

1、一种检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的方法，其包括检测 Lewis 血型抗原相关基因多态性，，其中，幽门螺杆菌相关胃癌易感性：隐性 le等位基因，和 /或显性纯合 Se/Se基因型。
2、如权利要求 1所述的方法，其特征在于 Lewis血型抗原相关基因多态性为 Lewis 基因的多态性，其中，幽门螺杆菌相关胃癌易感性：隐性 le等位基因。

3、如权利要求 2所述的方法，其特征在于 Lewis基因的多态性为 Lewis基因 T59G, G508A或 T1067A位点或其联合多态性，其中，幽门螺杆菌相关胃癌易感性： T59G位点突变为 G， G508A位点突变为 A或 T1067A位点突变为 A或其联合。
4、如权利要求 3所述的方法，其特征在于检测 Lewis基因 T59G位点多态性，其中，幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性： T59G位点突变为 G。
5、如权利要求 1所述的方法，其特征在于 Lewis血型抗原相关基因多态性为 Se基因的多态性，其中，幽门螺杆菌相关胃癌易感性：显性纯合 Se/Se基因型。
6、权利要求 1-5所述的方法，其中所述的基因多态性为 DNA水平的多态性。
7、权利要求 6 所述的方法，其中检测基因多态性的方法包括直接测序法或限制性片段长度多态性分析。
8、权利要求 7 所述的方法，其中在直接测序法或限制性片段长度多态性分析之前进行 PCR扩增。
9、权利要求 1-5所述的方法，其中所述的基因多态性为与 DNA相对应的 RNA 水平上的多态性。
10、如权利要求 1所述的方法，其特征在于检测 Lewis血型抗原相关基因多态性的方法为检测由 Lewis基因和 Se基因决定的 H type-l前体的量，其中，幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性： H type- 1前体的量超过对照值，对照值为具有统计学意义的来自正常个体样品的 H type-1前体的量。
11、权利要求 1的方法在筛选幽门螺杆菌相关胃癌高危个体中的应用。
12、权利要求 1的方法在有针对性地干预、预防或早诊随访中的应用。 13、一种检测幽门螺杆菌相关胃癌遗传易感性的试剂盒，其包括用以检测 Lewis血型抗原相关基因多态性的一种或多种组分。
14、如权利要求 13所述的试剂盒，其包括 - 扩增 Lewis基因多态性位点的引物； dNTP; DNA聚合酶及其相应的 PCR反应缓冲液。
15、权利要求 13或 14所述的试剂盒在筛选幽门螺杆菌相关胃癌高危个体和 /或有针对性地干预、预防或早诊随访中的应用。