NO324963B1 - Fremgangsmate til deteksjon av Ki-ras mutasjoner og oligonukleotidprimer molekyl for anvendelse til deteksjonen. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til å detektere mutasjoner i prøver av vev og avføring ved PCR-oppformering ved å bruke spesifikke oligoprimere, og oligonukleotidprimer molekyl for bruk i fremgangsmåten.

Et øket antall funn angir somatiske mutasjoner som årsaksmessig viktige ved induksjon av kreft hos mennesker. Disse somatiske mutasjoner kan akkumulere i genomene til tidligere normale celler hvorav noen av disse deretter demonstrerer fenotypen assosiert med maligne vekster. Slike onkogene mutasjoner kan inkludere et antall forskjellige typer av forandringer i DNA-struktur, inkludert delesjoner, translokasjoner og enkeltnukleotidforandringer. Det siste også kjent som punktmutasjoner kan ofte intervenere i karsinogenesen ved at et utvalg av mutagene kjemikalier induserer slike mutasjoner. I tillegg kan slike mutasjoner skje spontant som resultat av feil i DNA-replikasjon.

Fremskritt i rekombinant DNA-teknologi har ført til oppdagelsen av normale cellulære gener (protoonkogener og tumor suppressorgener) som kontrollerer vekst, utvikling og differensiering. Under visse omstendigheter blir regulering av disse genene forandret og det forårsaker normale celler å anta neoplastisk vekst og adferd. Det er over 100 kjente protoonkogener og supressorgener opp til dags dato, som faller i forskjellige kategorier avhengig av deres funksjonelle egenskaper. Disse inkluderer (1) vekstfaktorer og vekstfaktorreseptorer, (2) budbringere ved intracellulære signaltransduk-sjonsveier, f.eks. mellom cytoplasma og kjernen og (3) regulerende proteiner som påvirker genekspresjon og DNA-replikasjon.

Punktmutasjoner er blitt direkte implisert i årsaken til mange tumorer hos mennesket. Noen tumorer bærer onkogener fra ras genfamilien, som avviker fra sine normale cellulære motpartprotoonkogener ved nærvær av en punkt-mutasjon i ett av et begrenset antall seter i disse gener. På samme måte blir punktmutasjoner i kritiske regioner på tumor supressorgener, så som p53, ofte detektert i tumorceller. Disse mutasjoner representerer kvalitative forandringer i tumorcellegenomet som atskiller disse celler fra normale celler og tilveiebringer et grunnlag for diagnose av den genetiske opprinnelse til en tumor under undersøkelse. Identifikasjon av mutasjonene som har dannet aktive onkogener kan tilveiebringe viktige diagnostiske og prognostiske momenter for tumorutvikling. F.eks. har et antall mutasjoner blitt funnet å forandre det tolvte kodon i ras-onkogenet, som forårsaker erstatning av et normalt tilstedeværende glycin av ett av flere alternative aminosyrerester. Slike aminosyresubstitusjoner danner et mulig transformerende allel. Således kan nærvær av en spesiell nukleotidsubstitusjon være sterkt determinant på tumorcellens adferd (f.eks. veksthastighet, invasivitet, etc). Som et resultat har DNA-probér på onkogene mutasjoner muligheter som diagnostiske reagenser i klinisk onkologi.

Blant de forskjellige typer av neoplasmer er et antall av de som finnes i den gastrointestinale trakt assosiert med onkogene mutasjoner. Denne assosiasjonen er spesielt viktig for pancreascancer og colorektalcancer. Colorektalcancer er den tredje mest vanlige ondartede lidelse i verden, med mer enn 700 000 nye tilfelle forventet i 1996.1 de Forente Stater alene vil over 70 000 mennesker dø av colorektal kreft i det samme år. Mens pasienter med fremskredet sykdom har meget dårlig prognose kan colorektale tumorer diagnostisert på ethvert stadium før metastase vanligvis kureres ved kirurgisk eller colonoskopisk eksisjon. En fremgangsmåte til å detektere tumorer som kan fjernes kirurgisk ville derfor redusere i betydelig grad dødsfall fra denne sykdommen (Winawer et al., J. National Cancer Institute, 83: 243, 1991).

En fremgangsmåte til å detektere pattedyrnukleinsyre i avføring er kjent fra WO93/20235 (Vogelstein, B. & Kinzler, K.). Denne fremgangsmåte omfatter rensing av faeces og to forskjellige fremgangsmåter for oppformering av muterte rasgener. Fremgangsmåte 1 er basert på PCR-oppformering av Ki-ras og påfølgende kloning av det oppformerte Ki-ras i en bakteriell fag, dyrking av fagen og plakkhybridisering med oligonukleotidprober som er spesifikke for de enkle mutasjoner i Ki-ras. Fremgangsmåte 2 er basert på PCR-oppformering, etterfulgt av gelelektroforese av PCR-produktet, hybridisering av produktet til nylonfilteret og allelspesifikk hybridisering med isotopmerkede prober, spesifikt for hver mutasjon. Begge fremgangsmåter er sensitive og spesifikke. Uheldigvis er disse fremgangsmåter både tidkrevende og arbeidskrevende siden alle mutasjoner i Ki-ras ikke blir detektert med én metode. Mer enn 10 mutasjoner av Ki-ras i exon I er allerede beskrevet. De ovenfor beskrevne fremgangsmåter bruker genprober som er spesifikke for hver av disse mutasjoner. Hvis en avføringsprøve skal screenes og det a priori ikke er kjent hvilken mutasjon som er tilstede må et stort antall forskjellige prober brukes på hver prøve og i tillegg må hver probe bli isotopmerket.

PCR-oppformering av DNA fra avføring er også kjent fra Smith-Ravin et al. (Gut, 35, 81-86, (1995)). I denne prosedyre blir det brukt 10-50 g avføring og DNA ble ekstrahert, deretter ble renset DNA oppformert ved å bruke mitokondrieprimere og analysert for ras-mutasjoner ved å bruke en allelspesifikk mismatch-metode. Total deteksjonsgrad var 9 av 22, fremgangsmåten brukte store mengder av avføring og var ikke egnet for screening siden det var nødvendig å bruke spesifikke MASA-prober for å detektere mutasjonene.

I en artikkel i Oncogene, 10, 1441-45, (1995) har Hasegawa et al. oppformert DNA fra 15 pasienter av 19 og identifisert tre mutasjoner ved å bruke standard MASA-teknikk. Etter dette ble en spesiell MASA-teknikk utført som resulterte i detekterte mutasjoner i 10 pasienter. Problemet ved denne fremgangsmåten er en lav deteksjonsgrad og at en spesifikk probe må anvendes for hver mutasjon. Således er fremgangsmåten ikke egnet for screeninganalyse.

A. Ulvik et al. (Tidskr. Nor Lægeforen nr. 26, 1995, 115: 3266-70) rapporterer resultater fra en fremgangsmåte til å detektere Ki-ras mutasjoner i avføring fra pasienter. Fremgangsmåten er ikke beskrevet i detalj, ei heller de benyttede oligonukleotider benyttet i metoden.

G. D. Sorensen (WO 93/22456) tilveiebringer fremgangsmåter for å detektere og kvantifisere gensekvenser i biologiske væsker. Denne metoden skiller seg fra den foreliggende metode ved at den krever et flertall av primere og et flertall av PCR-reaksjoner for å detektere enhver av de spesifikke mutasjoner, og det er således fundamentale forskjeller i metodene.

Y. Suzuki et al. (Oncogene (1990), 5, 1037-43) beskriver en fremgangsmåte for DNA analyse av nukleotidsubstitusjoner for deteksjon av muterte ras-gener ved human lungekreft. Blant andre forskjeller krever denne metoden bruk av radioaktivt merkede primere i tillegg til at det resulterende amplikon krever polyacrylamidgel for å diskriminere mellom normale og mutante alleler. Dette er forskjellig fra foreliggende fremgangsmåte.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er derfor å frembringe en

screeningfremgangsmåte for deteksjon av Ki-ras-mutasjoner i vev og avføring, med tilstrekkelig spesifisitet og enkel utførelse og som bruker små mengder av substrat.

Disse hensikter er oppnådd ved foreliggende oppfinnelse kjennetegnet ved det som fremkommer i de vedheftede krav.

Den foreliggende oppfinnelse angår en screeningfremgangsmåte for deteksjon av Ki-ras-mutasjoner i små vevsprøver eller avføringsprøver hvor spesifikke primere i henhold til oppfinnelsen blir brukt for å danne et PCR-produkt på 221 basepar. Dette produktet viser unike SSCP-mønster hvori hver mutasjon blir detektert og identifisert ved å bruke SSCP-analyse utført på Phast-geler (Pharmacia).

For å øke mengden av PCR-produkt er det mulig å utføre påfølgende »semi-nested» PCR i hvilke et ekstra oligonukleotid ble bruke i 5'-enden mens den spesifikke oligoprimer i det første trinn ble brukt i 3'-enden. I den neste PCR-syklus ble begge oligoprimere fra første trinn brukt og dette resulterte i PCR-produktet på 221 basepar. I dette produktet ble mutasjonene detektert som ovenfor med Phast-gel

SSCP.

Enda en annen økning av sensitiviteten i henhold til oppfinnelsen oppnås ved et tredje trinn som bruker allelspesifikk oppformering eller mutasjonspesifikk primerutvidelse. Dette trinn involverer bruk av prober som inneholder en mismatch mot villtypegenet på den siste base i 3'-enden og en ytterligere mismatch på base nummer 2 eller 3 fra 3'-enden. Denne strategi øket overraskende sensitiviteten til fremgangsmåten. Således ved å bruke fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ble Ki-ras-mutasjoner detektert i 8 pasienter av 12 ved å bruke dobbel PCR, og i en annen undersøkelse ble 6 pasienter med mutasjoner i Ki-ras av 7 pasienter detektert ved det første trinn mens de 7 med mutasjoner ble detektert ved å kombinere trinn 1 og 2. Således var deteksjonsgraden 90% med enkel PCR og 100% med kombinert

PCR.

I det følgende blir oppfinnelsen beskrevet mer detaljert sammen med eksempler og figurer. Fig. 1 viser SSCP-analyse av Ki-ras exon 1. Spor 1: Villtype (villtypesekvens i kodon 12 og 13 er henholdsvis GGT og GGC). Spor 2 til 7: Prøver som er heterozygote for villtype og kodon 12-mutasjoner: 2: AGT, 3: CGT, 4: TGT, 5: GAT, 6: GCT og 7: GTT. Spor 8: En prøve som er heterozygot for villtypen og kodon 13-mutasjon GAC. Spor 9: En prøve som er heterozygot for villtypen og en sjelden dobbelmutasjon i kodon 12: TTT. Fig. 2 viser PCR-SSCP-analyse av exon I i Ki-ras-genet fra kirurgiske prøver. Alle prøvene var heterozygote med unntagelse av prøven i spor 1. Villtypekodon 12 er GGT og kodon 13 GGC. Elektroforese ble kjørt på Phast Gel homogen 20. Kodon 12-mutasjoner er vist i følgende spor: 1: AGT (villtypeallel mangler); spor 2: CGT; spor 3: TGT; spor 4: GAT; spor 5: GCT; spor 6: GTT; spor 8: TTT. Spor 7 viser en kodon 13-mutasjon: GAC.

Fig. 3 viser frekvenser av de forskjellige mutasjonene funnet i tumorene.

Fig. 4 viser sekvensanalyse av adenom 1 fra pasient C-05. DNA-sekvensanalyse av exon 1 fra Ki-ras viser to G til T-transisjoner i kodon 12 (pil). Fig. 5 viser gelelektroforese av PCR-produkter fra ASA-analyse (diskriminant PCR) av DNA renset fira avføring. Signalene viser positiv GTT-mutasjon. 1 og 2: Pasient C04, 3 og 4: Pasient C-23, 5 og 6: Positiv kontroll, 7: Positiv kontroll fortynnet 1:100, 8 og 9: Negativ kontroll (avføring fra pasient med annen mutasjon enn den som det er testet for), 12: Negativ kontroll (DNA ikke tilsatt).

Den foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte til å detektere en nukleinsyre som har en mutant nukleotidsekvens tilstede i avføring, hvori nærvær av den endrede nukleinsekvens er assosiert med neoplasi i gastrointestinaltrakt.

I sin bredeste betydning tillater foreliggende oppfinnelse deteksjonen av hver målnukleinsyresekvens av diagnostisk eller terapeutisk relevans, hvor målnukleotidsyresekvensen er tilstede i avføring. Således kan målnukleotid-sekvensen f.eks. være et mutant nukleotid, en restriksjonsfragmentlengde polymorfisme (RFLP), en nukleotiddelesjon, en nukleotidsubstitusjon, eller enhver annen pattedyrnukleinsyresekvens av interesse.

I en utforming er fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen anvendbar for deteksjon av mutante nukleotidsekvenser assosiert med benigne såvel som maligne neoplasier. I en foretrukket utforming blir neoplasi i gastrointestinal-traktus, inkludert både tynntarm og tykktarm, pancreas og mage detektert skjønt fremgangsmåten brukes til å detektere enhver neoplastisk mutant nukleotidsekvens uavhengig av opprinnelse så lenge sekvensene er detekterbart tilstede i avføring.

Fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen tilveiebringer også oligonukleotidprimer molekyl for anvendelse til å detektere Ki-ras mutasjoner i exon 1, kodon 12 til 13 i forskjellige typer vev, vevssekreter, ekskreter og ekspektorater.

Benigne neoplasier i tynntarmen inkluderer adenomer, leiomyomer, lipomer og angiomer, mens i tykktarmen er benigne neoplasier primært adenomatøse polypper. De maligne neoplasier i tynntarmen inkluderer adenocarcinomer, leiomyocarcinomer, lymfomer og carcinoide tumorer. I tilfelle av tykktarmen og kolon er colorektal carcinom det mest vanlige maligne neoplasi som er identifisert.

Tallrike nukleinsyrer som har mutante nukleotidsekvenser som produserer et unormalt genprodukt er kjent for å være satt i forbindelse med forskjellige neoplasier. Blant de mest vanlige mutante nukleotidsekvenser er onkogener og tumor supressorgener, så som MCCDCC, APC, FAP, p53 og forskjellige DNA reparasjonsenzymer. Av spesiell betydning i foreliggende oppfinnelse er deteksjon av Ki-ras mutant onkogenet.

For å analysere avføringsprøver i henhold til oppfinnelsen er det nødvendig å atskille pattedyrnukleinsyre som er tilstede i prøven. Det er to primære problemer assosiert med preparering av pattedyrnukleinsyre fra avføring. For det første må pattedyrnukleinsyre frigjøres fra pattedyrcellene og separeres fra bakterielle celler. Dette trinn blir ytterligere komplisert ved det faktum at det er ønskelig å unngå frigjøring av nukleinsyre fra bakteriecellene siden det er et slikt voldsomt overskudd av bakteriell nukleinsyre sammenlignet med eukaryotisk nukleinsyre i avføringsprøven. For det andre når det er frigjort kan pattedyrnukleinsyre beskyttes fra den relativt høye konsentrasjon av nukleaser som er tilstede i avføring og som kan degradere den frigjorte pattedyrnukleinsyren og derved forhindre dens analyse. I den foreliggende oppfinnelse er det funnet at disse strenge kriterier kan møtes ved å inkubere avføringen med en kommersielt tilgjengelig lysebuffer som inneholder høy konsentrasjon av buffer på minst ca. 500 mM, ved en pH-verdi på minst ca. 8,0, som inneholder et gelaterende middel så som EDTA og en relativt lav saltkonsentrasjon, fortrinnsvis mindre enn 10 mM.

Avføringslysebufferen minimaliserer nukleindegraderingen ved hjelp av pH-verdien og gelaterende egenskaper, lyser eukaryote celler men ikke bakterielle celler og er egnet for videre prosessering til å rense og/eller konsentrere den eukaryote nukleinsyren. Etter behandling med lysebuffer blir prøven prosessert (f.eks. ved sentrifugering) for å fjerne bakterier og andre uønskede rester. Fraksjonen uten partikler i lysatet blir deretter inkubert med en proteinase (så som 0,5 jig/ml proteinase K) i SDS (1%) for å degradere nukleaser og andre proteiner. Nukleinsyren i prøven kan ytterligere separeres ved kjemiske midler, så som å binde den negativt ladede nukleinsyre til jernbyttekolonner, og deretter eluere renset/konsentrert og/eller konsentrering av DNA kan utføres ved utfelling med etanol.

I tillegg er det blitt funnet at avføring også inneholder inhibitorer som fortrinnsvis fjernes hvis den mutante nukleotidsekvens som er tilstede i nukleotinsyren fra avføringen skal oppformeres, så som ved polymerase kjedereaksjon (PCR). En av disse inhibitorer interfererer med DNA-oppformering ved Taq polymerase. Denne inhibitor kan fjernes ved å binde nukleinsyren fra avføringen til en stasjonær matriks i nærvær av kaotropiske salter, så som 6,0 M natriumiodid eller natriumperklorat. Overraskende er det funnet at glass er den foretrukne matriks for denne hensikt. Spesielt foretrukne kommersielle versjoner av glass er Prep-A-gene™ (Bio-Rad) og Spin-Bind™ (FMC).

Den andre inhibitor som er tilstede i avføring forhindrer binding av nukleinsyre til glass. Det er blitt funnet at denne siste inhibitor kan fjernes ved å binde inhibitoren til en modifisert ioneutbytterharpiks (f.eks. Qiagen) i nærvær av høye saltkonsentrasjoner, så som minst ca. 1,0 M. De med kunnskap på området kan se forskjellige måter som den ovenfor beskrevne prosess for konsentrering og/eller rensing av pattedyr DNA fra avførings-prøver kan modifiseres idet det er anerkjent at pattedyrnukleinsyre selektivt kan oppnås fra avføringsprøver. Alternativt kan de med kunnskap på området forsikre seg uten unødige eksperimenter om alternative reagenser og betingelser som er funksjonelt ekvivalente til de beskrevet heri, nå når det er kjent at slike metoder kan praktiseres på avføringsprøver. Slike modifikasjoner og funksjonelle ekvivalenter er omfattet ved foreliggende oppfinnelse.

Aminosyrer referert til heri kan identifiseres i henhold til de følgende trebokstavs-eller enbokstavforkortelser:

Når det er ønsket å oppformere den mutante nukleotidsekvens før deteksjon kan dette utføres ved å bruke oligonukleotid(er) som er primere for oppformering. Disse unike oligonukleotidprimere er basert på identifikasjon av de flankerende regioner tilstøtende den mutante nukleotidsekvens. F.eks. angående Ki-ras omfatter disse oligonukleotidprimerne sekvensen som er i stand til å hybridisere med den flankerende nukleotidsekvens 5'-

sekvenser.

Primerne som kan anvendes i henhold til oppfinnelsen omfatter oligonukleotider av tilstrekkelig lengde og egnet sekvens for å tilveiebringe igangsettelse av polymerisering av et signifikant antall av nukleinsyre-molekyler som inneholder målnukleinsyren. På denne måten er det mulig selektivt å oppformere den spesifikke målnukleinsyresekvens som inneholder nukleinsyren av interesse. Spesifikt refererer betegnelsen »primer» som brukt heri til en sekvens som omfatter to eller flere deoksyribonukleotider eller ribonukleotider, fortrinnsvis minst åtte, hvor sekvensen er i stand til å igangsette syntese av et primer ekstensjonsprodukt, som er hovedsakelig komplementært til en målnukleinsyretråd. Oligonukleotidprimeren inneholder typisk 15-22 eller flere nukleotider, skjønt den kan inneholde færre nukleotider.

Eksperimentelle betingelser som leder til syntese inkluderer nærvær av nukleotidtrifosfater og et polymerisasjonsmiddel, så som DNA-polymerase og en egnet temperatur og pH. Primeren er fortrinnsvis enkelttrådet. Dersom den er dobbelttrådet må primeren først behandles for å skille trådene før den blir brukt til å fremstille utvidelsesprodukter. Fortrinnsvis må primeren være tilstrekkelig lang til å prime syntesen av utvidelsesprodukter i nærvær av induksjonsmiddelet for polymerisasjon. Den nøyaktige lengden til primeren vil avhenge av mange faktorer, inkludert temperatur, buffer og nukleotidsammensetning.

Primere brukt i henhold til oppfinnelsen er konstruert til å være «hovedsakelig» komplementære til hver tråd av den mutante nukleotid-sekvens som skal oppformeres. Hovedsakelig komplementær betyr at primerne må være tilstrekkelig komplementære til å hybridisere med de respektive tråder under betingelser som tillater polymerisasjonsmiddelet å funksjonere. Med andre ord må primerne være tilstrekkelig komplementære med flankerende sekvenser til å hybridiseres dertil og tillate oppformering av den mutante nukleotidsekvens. Fortrinnsvis bør avslutningen av primeren som skal utvides være perfekt baseparret komplementært med den komplementære flankerende tråd.

Oligonukleotidprimere brukt i henhold til oppfinnelsen blir anvendt i enhver oppformeringsprosess som produserer økede mengder av målnukleinsyre. Typisk er en primær komplementær til den negative (-) tråd til den mutante nukleotidsekvens og den andre er komplementær til den positive (+) tråd. Sammenføyning av primerne til denaturert nukleinsyre etterfulgt av utvidelse med et enzym, så som det termostabile eller Taq DNA-polymerase og nukleotider eller ligaser, resulterer i nysyntetiserte + og - tråder som inneholder nukleinsyren. Fordi disse ny syntetiserte nukleinsyrer også er templater resulterer gjentatte sykler av denaturering, primersammenføyning og utvidelse i eksponensielle produkter av regionen (det vil si mål mutant nukleotidsekvens) definert av primeren. Produktet til oppformerings-reaksjonen er en adskilt nukleinsyredupleks med avslutninger som tilpasser endene av de spesifikke primerne anvendt. De med kunnskap på området vil kjenne til andre oppformeringsmetoder som også kan benyttes for å øke kopiantallet til målnukleinsyre.

En egnet måte å øke antall kopier av beskrevet PCR-produkt er å anvende fremgangsmåten kalt »semi-nested» PCR. Ved å bruke denne tilnærming vil en av de opprinnelige primere bli brukt som en ny primer, f.eks. å merke 3'-regionen til det første PCR-produkt. En annen oppstrømsprimer, f.eks. 5'-AACTTATGTGTGACATGTTCTAAT-3' (sekv.id. nr. 3) kan deretter brukes i den motsatte merkingsregion for å danne et nytt, mindre PCR-produkt som inneholder den positivt muterte region innenfor det nyproduserte PCR-produkt.

Oligonukleotidprimerne til anvendelse i oppfinnelsen kan fremstilles ved å bruke enhver egnet metode, så som konvensjonelle fosfotriester og fosfodiestermetoder eller automatiserte utforminger derav. I en slik automatisert utforming blir dietylfosforamiditt brukt som utgangsmateriale og kan syntetiseres som beskrevet av Beaucage et al. (Tetrahedron Letters, 22: 1859-1862, 1981). En fremgangsmåte til å syntetisere oligonukleotider på en modifisert fast bærer er beskrevet i US patent nr. 4 458 066. En oppformeringsfremgangsmåte som kan brukes i henhold til foreliggende oppfinnelse er polymerasekjedereaksjon (PCR) beskrevet i US patent nr. 4 683 202 og 4 683 195.

Enhver nukleinsyre fra avføringsprøver, i renset eller urenset form, kan benyttes som utgangsnukleinsyre eller syrer, forutsatt at den inneholder, eller er mistenkt for å inneholde, den spesifikke nukleinsyresekvens som inneholder målnukleinsyren. Således kan prosessen anvende f.eks. DNA eller RNA, inkludert budbringer RNA, hvori DNA eller RNA kan være enkelt-trådet eller dobbelttrådet. I det tilfelle at RNA skal benyttes som et templat, må enzymer og/eller betingelser som er optimale for revers transkripsjon av templatet til DNA benyttes. I tillegg kan en DNA-RNA-hybrid som inneholder en tråd av hver benyttes. En blanding av nukleinsyrer kan også benyttes eller nukleinsyrene produsert i en tidligere oppformeringsreaksjon heri, under bruk av de samme eller forskjellige primere kan også benyttes. Den mutante nukleotidsekvens som skal oppformeres kan være en fraksjon av et større molekyl eller kan være tilstede opprinnelig som et adskilt molekyl slik at den spesifikke sekvens utgjør hele nukleinsyren. Det er ikke nødvendig at sekvensen som oppformeres skal være tilstede initielt i en ren form; den kan være en mindre fraksjon av en kompleks blanding, slik som den inneholdt i totalt humant DNA.

Der hvor målmutantnukleotidsekvensen i prøven inneholder to tråder er det nødvendig å separere trådene i nukleinsyren før den kan brukes som templat. Trådseparasjon kan utføres enten som et adskilt trinn eller samtidig med syntese av primerutvidelsesproduktene. Denne trådadskillelsen kan utføres ved å bruke forskjellige egnede denaturerende betingelser, inkludert fysikalske, kjemiske eller enzymatiske midler; ordet »denaturering» inkluderer alle slike midler. En fysikalsk fremgangsmåte til å atskille nukleinsyretråder omfatter oppvarming av nukleinsyren inntil den er denaturert. Typisk varmedenaturering kan involvere temperaturer som strekker seg fra ca. 80° til 105°C i tidsrom som varierer fra ca. 1 til 10 minutter. Trådatskillelse kan også induseres av et enzym fra klassen av enzymer kjent som helikaser eller av enzymet Ree A, som har helikase-akti vitet og i nærvær av riboATP, er kjent for å denaturere DNA. Reaksjons-betingelsene egnet for trådseparasjon av nukleinsyrer med helikaser er beskrevet av Kuhn Hoffman-Berling (CSH-Quantitative Biology, 43: 63, 1978) og teknikker for å benytte RecA er omtalt i C. Radding (Ann. Rev. Genetics, 16: 405-437, 1982).

Hvis nukleinsyren inneholder målnukleinsyren som skal oppformeres er enkelttrådet blir dets kompliment syntetisert ved å tilsette en eller to oligonukleotidprimere. Hvis en enkelt primer blir benyttet blir primer-utvidelsesproduktet syntetisert i nærvær av primeren, et middel for polymerisering og de fire nukleotidtrifosfatene beskrevet nedenfor. Produktet vil være komplementært til den enkelttrådede nukleinsyre og vil hybridisere med den enkelttrådede nukleinsyre for å danne en dupleks av ulik lengde tråder som deretter kan separeres i enkelttråder for å fremstille to enkle adskilte komplementære tråder. Alternativt kan to primere tilsettes til den enkelttrådede nukleinsyre og reaksjonen utføres som beskrevet.

Når komplementære tråder av nukleinsyren eller syrene blir separert uavhengig av at nukleinsyren opprinnelig var dobbelt- eller enkelttrådet er de adskilte trådene klare til å brukes som et templat for syntese av ytterligere nukleinsyretråder. Denne syntese blir utført under betingelser som tillater hybridisering av primere til templater. Generell syntese skjer i en bufret vandig oppløsning, fortrinnsvis ved en pH-verdi på 7-9, mest fortrinnsvis ca. 8. Fortrinnsvis blir et molart overskudd (for genomiske nukleinsyrer, vanligvis ca. IO<8>:1, primer:templat) av de to oligonukleotidprimere tilsatt bufferen som inneholder de adskilte templattrådene. Det er imidlertid forstått at mengden av komplementær tråd behøver ikke å være kjent hvis prosessen i henhold til oppfinnelsen blir brukt for diagnostiske anvendelser, slik at mengden av primer i forhold til mengden av komplementærtråd ikke kan bestemmes med sikkerhet. I praksis vil imidlertid mengden av primer tilsatt generelt være i molart overskudd over mengden av komplementærtråd (templat) når sekvensen som skal oppformeres inneholdes i en blanding av kompliserte langkjedede nukleinsyretråder. Et stort molart overskudd er foretrukket for å øke effektiviteten til prosessen.

I noen oppformeringsutforminger blir substratene, f.eks. deoksyribonukleo-tidtrifosfatene dATP, dCTP, dGTP og dTTP tilsatt til synteseblandingen enten separat eller sammen med primerne, i tilstrekkelige mengder og den resulterende oppløsning blir oppvarmet til ca. 90° til 100°C fra 1 til 10 minutter, fortrinnsvis fra 1 til 4 minutter. Etter denne oppvarmingsperioden blir oppløsningen tillatt å avkjøles til romtemperatur som er fordelaktig for primerhybridisering. Til den avkjølte blanding blir det tilsatt et egnet middel for å utføre primerutvidelsesreaksjonen (heri kalt »middel for polymerisering») og reaksjonen blir tillatt å skje under betingelsene kjent på området. Polymerisasjonsmiddelet kan også tilsettes sammen med de andre reagensene dersom det er varmestabilt. Denne syntese (eller oppformering) reaksjon kan skje ved romtemperatur opp til en temperatur over hvilken polymerisasjonsmiddelet ikke lenger funksjonerer. Således, f.eks. hvis DNA-polymerase er brukt som middelet, er temperaturen generelt ikke høyere enn ca. 40°C. Mest egnet skjer reaksjonen ved romtemperatur.

Polymerisasjonsmiddelet kan være enhver forbindelse eller system som vil funksjonere slik at det utfører syntesen av primerutvidelsesproduktene, inkludert enzymer. Egnede enzymer for denne hensikt inkluderer f.eks. E. coli DNA-polymerase I, Taq-polymerase, Klenow-fragment av E. coli-polymerase I, T4 DNA-polymerase, andre tilgjengelige DNA-polymeraser, polymerase mutein revers transkriptase, ligase og andre enzymer, inkludert varmestabile enzymer (det vil si de enzymer som utfører primerutvidelse etter å ha blitt utsatt for temperaturer tilstrekkelig hevet til å forårsake denaturering). Egnede enzymer vil fasilitere kombinasjon av nukleotidene på den riktige måte til å danne primerutvidelsesprodukter som er komplementære til hver mutant nukleotidtråd. Generelt vil syntesen initieres i 3'-enden av hver primer og fortsette i 5'-retningen langs templattråden, inntil syntese avsluttes, og produsere molekyler med forskjellige lengder. Det kan være polymerisasjonsmidler som imidlertid initierer syntese i 5'-enden og fortsetter i den andre retningen ved å bruke samme prosess som beskrevet ovenfor. I ethvert tilfelle skal fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen ikke begrenses til de oppformeringsutformingene som er beskrevet heri.

Den nylig syntetiserte mutante nukleotidtråd og dens komplementære nukleinsyretråd vil danne et dobbelttrådet molekyl under hybridiserings-betingelser beskrevet ovenfor og dette hybrid blir brukt i påfølgende trinn av prosessen. I det neste trinn er det nylig syntetiserte dobbelttrådede molekyl utsatt for denaturerende betingelser ved å bruke en av de fremgangsmåter beskrevet ovenfor for å tilveiebringe enkelttrådede molekyler.

Den ovenfor nevnte prosess blir gjentatt på de enkelttrådede molekyler. Ytterligere polymerisasjonsmidler, nukleotider og primere kan tilsettes dersom det er nødvendig for at reaksjonen skal fortsette under betingelsene beskrevet ovenfor. Igjen vil syntesene initieres i en ende av hver av oligonukleotidprimerne og fortsette langs de enkle trådene til templatet for å fremstille ytterligere nukleinsyre. Etter dette trinn vil halvparten av utvidelsesproduktet bestå av den spesifikke nukleinsyresekvens omgitt av de to primere.

Denatureringstrinnene og syntese av utvidelsesproduktene kan gjentas så ofte som det er nødvendig for å oppformere målmutant nukleotidsekvens i den utstrekning som er nødvendig for deteksjon. Mengden av den mutante nukleotidsekvensen fremstilt vil akkumulere på en eksponensiell måte.

Det oppformerte produkt kan detekteres og identifiseres ved å analysere det ved enkelttrådet konform polymorfisme ved å bruke Pharmacia Phast System for Automatic Temperature Controlled Electrophoresis og Silverstaining. I en slik prosess blir f.eks. en liten prøve av oppformert DNA utsatt for denaturering etter elektroforese på en forstøpt phast-gel, f.eks. en levert fra Pharmacia. I en gel som dette vil et enkelttrådet DNA-fragment migrere avhengig av dens konformasjon. Konformasjonen er avhengig av primersekvensen av nukleotidene og sekvensene som varierer med en eller flere nukleotider vil inneholde en spesifikk unik konformasjon.

I en utforming av oppfinnelsen blir nukleotidfragmenter fra avføring etter oppformering separert i fragmenter med forskjellig konformasjon ved gelelektroforese på Pharmacia phast-geler. Etter elektroforering blir gelen eksponert til en blanding som inneholder sølv for å farge de forskjellige nukleotidfragmentene, for derved å detektere og identifisere forskjellige typer av mutante nukleotidfragmenter.

Eksempel 1.

Deteksjon og identifikasjon av Ki- ras Exon 1- mutasjoner ved minigel enkelttrådet konformasionspolvmorfisme

Enkelttrådet konformasjonspolymorfisme (SSCP) er en egnet fremgangsmåte for å detektere mutasjoner (40). Fremgangsmåten hviler på det faktum at konformasjon antatt av et enkelttrådet DNA-fragment under ikke-denaturerende betingelser, og således dets mobilitet under elektroforese, avhenger av den nøyaktige basesekvens. Med SSCP forblir mutasjonen normalt identifisert etter at den har blitt detektert. Imidlertid i tilfelle av onkogene Ki-ras er det et begrenset antall mutasjoner rapportert hvorav flertallet av disse finnes i kodon 12 og 13 i exon 1. Således forutsatt at hver mutantvariant har et karakteristisk SSCP-mønster vil det være en basis for identifikasjon. Dette er blitt angitt i noen tidligere artikler vedrørende Ki-ras (18, 41, 42).

Denne undersøkelse beskriver en SSCP-protokoll hvor alle de vanlig rapporterte mutantvarianter av Ki-ras exon 1 er detekterbare og identifiserbare. Videre ble to andre varianter som i henhold til oppfinnernes kunnskap ikke tidligere er rapportert i kirurgisk biopsimateriale også detektert. Protokollen benytter forstøpte polyakrylamidgeler og et automatisk elektroforese- og fargingsinstrument (Phast System, Pharmacia, Sweden). Ingen isotopmerking av DNA er involvert.

Polymerase kjedereaksjoner (PCR) ble utført på et Perkin Eimer TC 1 termosykleringsapparat ved å bruke en totrinns profil; 94°C, 15 sek; 58°C, 30 sek, i 30-40 sykler avhengig av mengden av templat. Denne profil ble forutgått av to minutter ved 94°C og avsluttet med 5 minutter ved 72°C. De anvendte primere var: 5'-AACCTTATGTGTGACATGTTCTAAT-3' (sekv.id. nr. 4) (oppstrøms) og 5'-AATGGTCCTGCACCAGTAAT-3' (sekv.id. nr. 2) (nedstrøms). PCR-reaksjonsblandingen besto av 10 mM Tris-HCl pH-verdi 9,0, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (vekt/vol) gelatin, 0,1% Triton, 125 uM av hver dNTP, 0,2 uM av hver primer og 0,2 u.M av Taq polymerase (Supertaq, HT Biotechnology Ltd., UK) i et totalt volum på 100 ul. Produktstørrelsen av 221 bp.

SSCP-protokoll: 4 ul av PCR-produktene ble denaturert ved å blande dem med et likt volum av ionisert formamid og kort oppvarming til 80°C. Påfølgende hurtig avkjøling på is var ikke nødvendig for å holde DNA i denaturert tilstand. Prøvene ble applisert på en 20% homogen polyakryl-amidgel (Phast gel) med bufferstriper som inneholder 0,88 M L-Alanin, 0,25 M Tris, pH-verdi 8,8 og kjørt med det følgende program: Forkjøring: 400 V, 10 mA, 2,5 W, 15°C, 100 Vh, belastning: 400 V, 1 mA, 2,5 W, 15°C, 3 Vh, atskillelse: 400 V, 10 mA, 2,5 W, 15°C, 300 Vh. Etter elektroforese ble gelene sølvfarget i henhold til fabrikantens instruksjoner. Ved å bruke denne fremgangsmåte kunne 24 prøver analyseres på to timer.

Alle de syv mest vanlig rapporterte Ki-ras exon 1-mutasjoner (7) og en uvanlig dobbeltmutasjon (kodon 12: GGT til TTT) viste seg å være detekterbare og identifiserbare ved den presenterte fremgangsmåte (fig. 1). Mutasjoner ble alle funnet under screening av et antall av lunge-, kolon- og pancreastumorbiopsier (n>400). Identiteten av mutasjonene ble etablert ved å sekvensere minst to prøver som representerte en individuell type av bindingsmønster. I tillegg ble ytterligere prøver analysert med teknikken allelspesifikk oppformering (ASA) (20) som en kontroll. I hvert tilfelle opptrådte mutasjonene som to bånd (eller noen ganger flere, på grunn av sekundære bånd som antagelig representerer metastabile konformasjoner) i tillegg til villtypebåndene. Dette ble fortolket til å bety at begge de muterte enkelttrådene migrerte forskjellig fra villtypeenkelttrådene. Det var således mulig å atskille mellom forskjellige mutantvariasjoner og tilfeldige PCR-produserte uspesifikke bånd relativt til de to villtypespesifikke bånd). Dette ble vurdert å være en nødvendighet for en tilforlatelig identifikasjon.

Minimumsforholdet av mutert mot normalt DNA nødvendig for at mutasjonen skal være detekterbar ble testet som følger: Genomisk DNA med en homozygot AGT-mutasjon ble blandet med normalt genomisk DNA i forholdene 1:10, 1:20, 1:40, 1:80 og 1:160 med de kombinerte mengder holdt konstant og lik 250 ng. Disse blandinger ble deretter brukt som templater i en PCR-reaksjon på 35 sykler. Deretter ble SSCP-analyse utført på PCR-produktene. Mutasjonssignalet var detekterbart i alle prøvene, men bare med vanskelighet når blandingsforholdet (mutant/normalt DNA) var 1:160 (resultater ikke vist).

I tillegg til de ovenfor nevnte mutasjoner ble det detektert en mutasjon i den siste base i kodon 19: TTG til TTT, funnet i en kolon kreftbiopsi, som kunne atskilles fra de andre mutasjoner (ikke vist).

Det skal manes til forsiktighet at ved å bruke SSCP for å identifisere mutasjoner er det mulig bare i spesielle tilfeller hvor et begrenset spektrum av spesifikke mutasjoner er rapportert å skje. I den presenterte sak fasiliterte den demonstrerte heterogeniteten til SSCP-mønstrene hurtig, enkel og sensitiv deteksjon og identifikasjon av Ki-ras exon 1-mutasjon ved SSCP alene.

Eksempel 2.

Deteksjon av Ki- ras- mutasjoner i avføringen til pasienter med kolorektale tumorer, ved å bruke PCR

II Materialer og metoder

Pasientseleksjon

25 pasienter innlagt mellom august og november 1994 på kirurgisk avdeling ved universitetssykehuset i Bergen (Haukeland Sykehus), Norge inngikk i undersøkelsen. Vi valgte å inkludere to forskjellige grupper som ville gjøre det mulig for oss å bedømme sensitiviteten til fremgangsmåtene vi brukte. Den første gruppe (A) ble dannet av 10 pasienter som gjennomgikk kolonoskopisk undersøkelse av mistenkt kolorektal tumor og som i det påfølgende ble funnet å ha enten en malign kolorektal tumor (carcinom) eller en benign tumor (adenom) større enn 1 cm i størrelse. Den andre gruppe (B) besto av 15 pasienter som omfattet pasienter som gjennomgikk kirurgisk reseksjon av kolorektale carcinomer eller adenomer større enn 1 cm i størrelse. Pasientene (10 menn og 15 kvinner) var mellom 49 og 90 år gamle (gjennomsnittlig alder 70) på operasjonstidspunktet.

Oppsamling av tumor og avføring

Fra hver pasient ble tumorvevsprøver oppsamlet, i de fleste tilfeller rett etter kirurgi og kolonoskopi. I det siste tilfellet ble vevsprøver oppnådd gjennom biopsi eller polypektomi. Fra 5 pasienter ble parafininnstøpte vevsblokker tilveiebragt fra patologisk avdeling ved Haukeland Sykehus. Totalt 27 colorektale tumorprøver ble oppnådd fra 25 pasienter. Fra to pasienter oppnådde vi totalt fire forskjellige tumorer som oppfylte vårt kriterium. Disse tumorer ble funnet sammen med de kirurgiske fjernede prøver. Av disse 27 tumorer var 15 carcinom og 12 var adenom i henhold til patologirapporten.

Avføringsprøver ble oppnådd enten ved kolonoskopi eller gjennom oppsamling av vaskevæsken eller før kirurgi. Prøvene ble lagret ved -80°C.

DNA-preparering fra tumorprøver

Genomisk DNA ble ekstrahert fra tumorprøvene ved å bruke følgende standardmetoder<10>.

Ca. 25 mg tumorvev ble oppsamlet i 1,5 ml Eppendorfrør. For å gjennomføre cellelyse ble prøvene oppløst 300 ul TE-buffer (10 mM TrisHCl, pH-verdi 8,0 og 1 mM EDTA), 30 pl proteinase XIV (10 mg/ml), 30 pl av 10% SDS (natriumdodekylsulfat) og 30 ul av TNE-buffer (100 mM TrisHCl, pH-verdi 8m0, 1,5 M NaCl og 100 mM EDTA, pH-verdi 8,0). Prøvene ble inkubert natten over ved 37°C.

For å fjerne protein og kontaminanter fra prøvene ble fenol/kloroform-ekstraksjoner utført: Til hver prøve ble 1 volum fenol tilsatt, blandet ved virvling og sentrifugert ved 4°C, 13000 g i 5 minutter. Deretter ble det øvre lag overført til et nytt rør hvoretter 1 volum kloroform ble tilsatt, oppløsningen ble blandet ved virvling og sentrifugert i 5 minutter. Det øvre vandige lag ble overført til et nytt rør og 2,5 volum av 96% etanol ble tilsatt. Etter utfelling ved -20°C i minst 1 time ble prøven sentrifugert i 10 minutter hvoretter supernatanten ble forsiktig fjernet. Pelleten ble vasket i 70% etanol og deretter lufttørket. Avslutningsvis ble DNA resuspendert i 100 pl TE-buffer.

DNA fra parafininnstøpte vevsblokker ble ekstrahert ved å bruke den tidligere beskrevne metode<11>.

En 20 pm snitt ble skåret fra en vevsblokk. Snittet ble suspendert i 10 mM Tris-HCl, pH-verdi 9,0 som inneholdt 5% Chelex-100-harpiks (Bio Rad Laboratories, Hercules, California, USA) og kokt i 10 minutter.

Polymerasekjedereaksjonsfremgangsmåter.

Polymerasekjedereaksjonen (PCR) er blitt etablert som en av de mest brukte teknikker i molekylærbiologi. Årsaken er det følgende; det er en hurtig, billig og enkel metode til å fremstille mikrogrammengder av DNA fra små mengder av kildemateriale. PCR-teknikken hviler på kjennskap til minst deler av DNA-sekvensen rundt den interessante region. Vi vil først kort beskrive det grunnleggende prinsipp i PCR før vi kommer til fremgangsmåten implementert i denne undersøkelse.

I PCR blir det dobbelttrådede DNA-fragment som skal oppformeres (templat) blandet med to korte enkelttrådede DNA-molekyler (primere) som er komplementære til sekvenser i hver ende av sekvensen som skal oppformeres. Reaksjonsblandingen inneholder også en varmestabil DNA-polymerase og de fire nukleotidene nødvendig for DNA-syntese.

Blandingen blir oppvarmet til ca. 95°C for å denaturere det dobbelttrådede templat i enkelttråder og deretter avkjølt til ca. 60°C for å tillate hver primer å føye seg sammen med sin komplementære sekvens på de enkelttrådede templater. Temperaturen blir deretter justert til 72°C som er den optimale temperatur for polymerasen til å syntetisere nye tråder, gjennom utvidelse av hver primer ved påfølgende tilsettinger av nukleotider. Hver ny syntetisert DNA-tråd vil inneholde et bindingssete for den andre primer og tjener således som et ytterligere templat i neste syklus. Sykl en blir gjentatt et antall ganger hvorav hver gang mengden av produktet fordobles. For å gi et inntrykk av oppformeringsstyrken i PCR kan det nevnes at 20 sykler fremstiller en million kopier av ett DNA-molekyl " .

Exon 1 i Ki-ras ble oppformert ved PCR under følgende betingelser. 2 pl oppløst DNA ble oppformert i et totalt volum på 100 pl som inneholder 10 mM Tris-HCl (pH-verdi 9,0 ved 25°C), 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl2, 0,01% (vekt/vol) gelatin, 0,1% triton X-100, 125 pm av hver deoksynukleotid-trifosfat og 0,5 pM av hver primer. 0,2 enheter av Taq DNA-polymerase ble tilsatt. Taq polymerasen (Supertaq) ble kjøpt fra HT Biotechnology Ltd. (Cambridge, England). Reaksjonene ble kjørt på en DNA-termocycler (Perkin-Elmer Cetus, Norwalk, CT, USA) ved å bruke en totrinns profil: 94°C i 15 sekunder (denaturere), 60°C i 30 sekunder (sammenføye/utvide), i 40 sykler. Denne profil ble forutgått ved 2 minutter på 94°C (enkelt denatureringstrinn) og et avsluttende utvidelsestrinn på 4 minutter ved 72°C. Oligonukleotidprimerne var som følger: Oppstrøms: 5'-AAC CTT ATG TGT GAC ATG TTC TAA T-3' (sekv.id. nr. 5) (betegnet RI) og nedstrøms: 5'-AAT GGT CCT GCA CCA GTA AT-3' (sekv.id. nr. 2) (R2). Primerne ga et produkt på 221 basepar (bp) i lengde.

Identifikasjon av Ki-ras-mutasjoner i tumorprøver.

Flere metoder eksisterer for å bestemme om en enkel-baseforandring eksisterer i oppformert DNA(<14>"<21>). Av disse valgte vi en fremgangsmåte som er blitt vist å være både hurtig og sensitiv, nemlig enkelttråd konformasjonspolymorfismeanalyse (SSCP)<22-24>.

Siden DNA er en negativt ladet heteropolymer vil den beveges mot den positive pol når den plasseres i et elektrisk felt. Dette er kalt elektroforese.

I laboratoriet blir prinsippet molekylsiling ofte benyttet. Med denne fremgangsmåte er man i stand til å atskille et utvalg av forskjellige molekyler, f.eks. forskjellige DNA-fragmenter, ved å tvinge dem til å bevege seg i et nettverk av hydrerte organiske polymerer, kalt en gel. Bevegelseshastigheten til DNA-fragmentene vil retarderes i henhold til deres størrelse og/eller fasong.

Teknikken SSCP utnytter en viss egenskap hos små (100-400 bp) enkelttrådede DNA-fragmenter av lik størrelse: Når de tillates å folde seg selv, vil de danne bestemte strukturer (konformasjoner). Disse konformasjoner blir bestemt ved intramolekylære interaksjoner og således ved sekvens. Følgelig vil en punktmutasjon relekteres som en forandret konformasjon som, under gunstige bufferbetingelser og gelporstørrelse, vil resultere i forandret mobilitet under elektroforese. Siden komplementære tråder utviser forskjellige konformasjoner, kommer villtype (normal, uforandret) DNA-fragmentet som to bånd i gelen. En punktmutasjon vil føre til to ytterligere bånd . I praksis kommer ytterligere bånd ofte til syne på grunn av alternative konformasjoner.

I denne undersøkelse ble elektroforese av PCR-produkter utført på forstøpte polyakrylamid mini-geler (Phast Gels) ved å bruke Pharmacia Phast System (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Sweden).

SSCP-protokoll: PCR-produktene ble denaturert ved å blande dem med formamid og oppvarme til 80°C i 1 minutt. Prøvene ble deretter applisert på en 20% homogen polyakrylamidgel med Phast-gel native bufferstriper som inneholder 0,88 M L-Alanin, 0,25 M Tris, pH-verdi 8,8 og kjørt med følgende program: Forkjøring: 400 V, 10 mA, 2,5 W, 100 Vh; opplasting, 400 V, 1 mA, 2,5 W, 3 Vh; atskillelse: 400 V, 10 mA, 2,5 W, 300 Vh. Etter elektroforese ble gelene sølvfaget i henhold til fabrikantens anbefalinger og tørket.

Ved å bruke den beskrevne metode utviste hver mutasjon i kodon 12 og 13 i Ki-ras et adskilt båndmønster på Phast-gelen. Identiteten av hver mutasjon ble etablert tidligere ved direkte sekvensering og mutasjon spesifikk primerutvidelse (MSPE, diskutert senere) . I denne undersøkelsen ble disse mønstre brukt som referanse for å etablere mutasjonstype i kreftprøvene.

Alle kreftprøvene ble analysert for nærvær av mutasjoner i exon 1 i Ki-ras. Fra de pasienter hvis tumorer inneholdt en mutasjon analyserte vi avføringsprøvene.

DNA-fremstilling fra avføringsprøver.

Genomisk DNA fra avføring ble renset ved å bruke Qiagen-cellekultur DNA-kit (Qiagen Inc., Chatsworth CA, USA).

Ca. 10 mg avføring ble blandet med 1 ml G2-buffer. Fra en kolonoskopisk vask tok vi 500 pl og tilsatt en lik mengde av G2-buffer. Denne buffer lyser kjernen og denaturerer alle typer av proteiner. Avførings-lyse-buffer-blandingen ble virvlet og klaret ved sentrifugering ved 13000 g i 10 minutter ved 4°C. Supernatanten ble deretter overført til et nytt rør etter hvilke 25 pl proteinase K (20 mg/ml) ble tilsatt. Proteinasen fordøyer de denaturerte proteiner i mindre fragmenter. DNA blir deretter strippet for alle bundne proteiner. Etter inkubasjon ved 50°C i 60 minutter, ble Qiagen genomiske tupper plassert over et avfallskar og ekvilibrert med 1 ml av likevektsbuffer QBT. Deretter ble prøvene applisert på ekvilibrerte genomiske tupper etter hvilke kolonnen ble vasket med 4x1 ml QC vaskebuffer. Kolonnene ble deretter plassert på rene oppsamlingsrør og et egnet volum av elueringsbuffer QF ble tilsatt. DNA ble utfelt med 0,7 volum av isopropanol, manuelt blandet, sentrifugert ved 4°C i 10 minutter ved 13000 g og supernatanten ble forsiktig fjernet. DNA ble vasket med etanol 70% og deretter repelletert ved sentrifugering. Prøvene ble lufttørket i 10 minutter og endelig ble pelletene gjenoppløst i 50 pl TE-buffer.

Deteksjon av Ki-ras-mutasjoner i avføringsprøvene.

For å undersøke den forventede mutasjon i kodon 12 eller 13 i Ki-ras-genet brukte vi mutasjonsspesifikk primerutvidelse (MSPE), også kalt allelspesifikk oppformering (ASA)<27-30>.

Fremgangsmåten i MSPE avhenger av konstruksjon av en primer som i PCR fortrinnsvis vil oppformere en sekvens fremfor en annen selv om sekvensene atskilles bare av en base. Dette blir utført hvis primeren fullstendig er tilpasset den ønskede (mutasjonsholdige) sekvens, men ikke passer med den andre sekvens (som ikke har noen mutasjon), ved eller nær 3'-enden. Mistilpasningen mellom det normale (ikke muterte) DNA-templat og oligonukleotidet vil resultere i dårlig oppformering av dette normale fragment.

Større sikkerhet med hensyn på spesifisiteten i MSPE kan oppnås hvis den mutasjonsspesifikke primer er destabilisert ved ytterligere tilsiktede mistilpasninger nær 3'-enden på en slik måte at muligheten til forlengelse (og således for oppformering) på tross av mistilpasningen er enda mer redusert<31>.

Utilpassede primere ble valgt ved hjelp av et kommersielt Edb-program (Oligo 4.0, National Biosciences Inc., USA) inkludert en ytterligere mistilpasning, noen basepar vekk fra 3'-enden. Alle primere brukt i denne undersøkelse ble kjøpt.

For MSPE brukte vi (semi) nested PCR-fremgangsmåter og AmpliWax Gems.

I nested PCR blir sensitivitet og spesifisitet av DNA-oppformering betydelig forbedret<32-34.> Fremgangsmåten involverer to påfølgende PCR. Den første PCR inneholder et par eksterne primere mens den andre inneholder to nested primere som er indre i forhold til de første primerpar (nested PCR) eller en av de første primere og en enkel nested primer (semi-nested). Det større fragment fremstilt av den første reaksjon ble brukt som et templat for den andre PCR.

PCR Ampliwax Gems (Perkin Eimer) fasiliterer anvendelse av varmstart-teknikken. Denne teknikk forhindrer fullstendig blanding av PCR-reaktantene inntil reaksjonen har nådd en temperatur som minimaliserer ikke-spesifikk sammenføyning av primer til ikkemål DNA. Som et resultat blir spesifisitet av PCR-prosessen øket og risikoen for primerdimerisering (primer-primer-sammenføyning) bli redusert<35>'<36>.

PCR-fremgangsmåter.

I den første runde ble 5 pl oppløst DNA oppformert i samme reaksjons-blanding som tumorprøvene med primerkonsentrasjoner på 0,2 uM. Sekvensen til oppstrømsprimer var: 5'-GGT GGA GTA TTT GAT AGT GTA TTA ACC TTA TGT-3' (R3) (sekv.id. nr. 1). Nedstrømsprimer var R2 (sekv.id. nr. 2). Disse primere ga fragmenter på 244 bp lengde. Etter denaturering i to minutter ved 94°C ble PCR utført med 156 sykler (94°C i 15 s, 60°C i 15 s).

Oppformerbarheten av templatet i hver prøve ble kontrollert før MSPE ble utført.

1 ul av PCR-produktet fra den første runden ble gjenoppformert ved PCR, ved å bruke primerne RI (sekv.id. nr. 5) og R2 (sekv.id. nr. 2) (0,5 uM) i 40 sykler (94°C i 15 s, 60°C i 15 s). Porsjoner på 15 pl ble analysert ved elektroforese på en 3% NuSieve GTG (FMC BioProducts) agarosegel. De prøver fra den første runden som viste seg å være oppformerbare ble utsatt for MSPE.

Vi inkorporerte AmpliWax Gems og varmstart-teknikken i den andre PCR-runde. 1 ul av PCR-produktet fra første runde ble gjenoppformert med kombinasjonen av primer R3 (0,2 uM) og den mutasjonsspesifikke mistilpassede primer. De mistilpassede primere hadde følgende sekvenser: GCT: 5'-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CTA G-3' (R4); (sekv.id. nr. 11); GTT: 5'-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CTA A-3' (R5) (sekv.id. nr. 6); GAT: 5'-AAG GCA CTC TTG CCT ACG CTA T-3' (R6) (sekv.id. nr. 7); GAC: 5'-CGT CAA GGC ACT CTT GCC TAC CT-3' (R7) (sekv.id. nr. 8); AGT: 5'-AGG CAC TCT TGC CTA CGC TAT T-3'

(R8) (sekv.id. nr. 9); TGT: 5'-GCA CTC TTG CCT ACG CCA TA-3' (R9)

(sekv.id. nr. 10).

Kombinasjonene av R3 (sekv.id. nr. 1) med de mistilpassede primere ga produkter på 143 (TGT) til 150 (AGT) bp. PCR ble utført med 40 sykler (94°C i 15 s, 60°C i 30 s) med primerkonsentrasjoner på 0,2 uM (R4, R5) (sekv.id. nr. 11; sekv.id. nr. 6) eller 0,4 uM (R6-R9) (sekv.id. nr. 7-10). For å undersøke TTT-mutasjonen vi fant i en tumor utførte vi både GTT og TGT mistilpasning på avføringsprøven; bare når begge serier ville gi positive resultater kunne vi anta at TTT-mutasjonen som inneholder tumorcellene var tilstede i avføringen.

Som negative kontroller ble det brukt DNA fra faeces til pasienter med colorektale tumorer uten mutasjoner i kodon 12 og 13 i Ki-ras. Disse prøvene med den beste oppformeringsbarheten ble valgt for å minimalisere sjansen for falske positive resultater. Som positive kontroller brukte vi DNA fra tumorer hvor typen av mutasjon i Ki-ras var etablert av SSCP og konfirmert ved sekvensering. MSPE-produkter ble utsatt for elektroforese i en 3% NuSieve agarosegel. Å betegne et signal som positivt krevde et distinkt intens signal sterkere enn de negative kontroller.

Resultater.

En totrinns eksperimentell tilnærming ble konstruert. Vi analyserte først colorektale tumorer for nærvær av Ki-ras-mutasjoner. Dersom de var tilstede analyserte vi avføringen til disse pasienter. Resultatene er oppsummert i tabell 1. Genomisk DNA fra 27 tumorer ble analysert for nærvær av mutasjoner på det 12. og 13. kodon i Ki-ras-genet ved teknikken PCR-SSCP. Polyakrylamidgel-elektroforese og sølvfarging ble utført ved å bruke PhastSystem. Båndmønstre er vist i figur 2.

Vi detekterte punktmutasjoner i 13 tumorprøver (48%) som var oppnådd fra 12 pasienter (4 fra gruppe A, 8 fra gruppe B). Mutasjoner ble detektert i 4 av 12 adenom (33%, alle av villustypen) og 9 av 15 carcinom (60%). Hovedparten av mutasjonene var lokalisert i sigmoid og rektum.

Av de 15 kvinnelige pasientene som inngikk i undersøkelsen hadde 8 (53%) en mutasjon i Ki-ras, mens 4 av 10 mannlige (40%) var påvirket. I en pasient (C-05) ble prøver oppnådd fra to forskjellige adenom funnet å inneholde forskjellige mutasjoner.

Mutasjonsspekteret til tumorer er vist i figur 3. Den hyppigste mutasjon var GGT til GAT (glycin til asparaginsyre) i kodon 12, observert i 5 tilfeller. De andre mutasjoner vi fant i samme kodon var GGT til GTT (glycin til valin, 3 tilfeller), GGT til GCT (glycin til alanin, 2 tilfeller) og GGT til AGT (glycin til serin, 1 tilfelle). Vi fant 1 tilfelle av mutasjon i kodon 13, nemlig GGC til GAC (glycin til asparaginsyre).

En tumor (C-05, adenom 1) produserte et uvanlig båndmønster som lignet et mønster tidligere assosiert med en dobbeltmutasjon i kodon 12 (GGT til TTT). Sekvensanalyse av PCR-produktet konfirmerte denne dobbelt-mutasjonen (figur 4).

Vi analyserte dernest avføringsprøver fra de 12 pasientene hvis tumorer inneholdt en mutasjon. En pasient fra gruppe A (C-01) ble operert rett etter colonoskopi slik at vi oppnådde en pre-kirurgiprøve i tillegg til colonoskopi-prøven.

Etter rensing av DNA fra faeces, ble exon 1 i Ki-ras PCR-oppformert. Det ble snart klart at colonoskopiprøvene inneholdt mer humant DNA enn de pre-kirurgiske prøver. Den mekaniske effekt av å vaske en fluid rundt tumoren under colonoskopi provoserte tilsynelatende frigjøring av celler inn i lumen. Følgelig både den totale mengde av celler og den tumoravledede cellefraksjonen var generelt høyere i prøvene oppnådd under colonoskopi.

En entrinns PCR med 40 sykler, som normalt er tilstrekkelig for enhver mengde av utgangsmateriale var tilsynelatende ikke tilstrekkelig for flere av avføringsprøvene, muligens på grunn av «inhiberende faktorer» i faeces. Vi håpet å øke effektiviteten til PCR ved å fortynne disse faktorene ved å utføre nested PCR. Dette ville også øke mengden av templat for MSPE.

Med denne totrinns PCR-strategi viste alle avføringsprøvene fra både gruppe A og B å være oppformeringsbare, og således passende for MSPE. Templatet for MSPE var 1 ul av PCR-produktet fra den første runden. AmpliWax Gems og varmstart-teknikken var inkorporert. Positive og negative kontroller ble inkludert.

På denne måten konfirmerte vi mutasjonene funnet i de respektive tumorer i alle fire avføringsprøver fra gruppe A. I avføringsprøvene oppnådd fra gruppe B (pluss tilfelle C-01) identifiserte vi mutasjonen i 5 av de 9 tilfellene. Proksimale såvel som distale tumorer (pasient C-09, oppadstigende kolon) ga positive resultater. Fire forskjellige typer av mutasjoner ble detektert: GCT, GTT, GAT og GAC.

For optimale resultater måtte konsentrasjonen av de mutasjonsspesifikke primere justeres til verdier som varierte fra 0,2 til 0,4 uM.

Representative resultater av deteksjonen av mutasjoner i Ki-ras i avføring med MSPE er vist i figur 5.

Diskusjon.

I denne undersøkelse undersøkte vi muligheten av å detektere Ki-ras-mutasjoner i avføring fra pasienter med colorektale tumorer. I 27 tumorer (12 adenom og 15 carcinom) ble Ki-ras-mutasjoner funnet i 13 tumorer; 4 i adenom (33%) og i 9 carcinom (60%). Disse frekvenser er overens-stemmende med tidligere rapporter<4,5>. Dette resultat konfirmerer den potensielle rolle til Kiras-mutasjoner som en relativt tidlig markør for colorektal neoplasi.

Det er nylig blitt observert at kvinner har en høyere prevalens for Ki-ras-mutasjoner i colorektal cancer enn menn . Det er blitt foreslått at denne forskjell er relatert til kontakttiden med og konsentrasjonen av spesielle carcinogener i avføringen. Både tarmgjennomføringstid og konstipasjons-prevalens er rapportert å være betydelig høyere hos kvinner . En refleksjon vedrørende denne kjønnsforskjell er synlig i vårt materiale, hvor 53% av tumorene i kvinner og 40% av tumorene hos menn ble funnet å ha en mutasjon.

Vi fant hovedparten av mutasjonene (12 av 14 når vi vurderte TTT som to mutasjoner) å skje i posisjon 2 i kodon 12 og 13. Dette har også blitt funnet tidligere<2>'<3>'<6>.

Skjønt antall tumorer undersøkt i denne undersøkelse er lite, er den totale frekvens av de tre mutasjoner som er ment å være den mest vanlige (CAC, GAT og GTT) overraskende tett opptil frekvensen funnet i større serier ' .

Noen punktmutasjoner er blitt assosiert med distinkte anatomiske lokaliseringer<40>. På dette området er våre resultater med GCT-mutasjonen i overensstemmelse med observasjonen at denne mutasjonen synes å være begrenset til rektum.

Korrelasjonen av visse typer Ki-ras-mutasjoner med det kliniske stadiet, så som de nylig beskrevne restriksjon av GAT-mutasjon til Dukes B-graderte tumorer<9>, kunne ikke gjenkjennes i vårt pasientmateriale. Faktum er at av de fem tumorer med en GAT-mutasjon, var to klassifisert som Dukes C.

Vi analyserte avføringsprøvene fra de 12 pasientene (fra en pasient både en colonoskopiprøve og en pre-kirurgiprøve) hvis tumorer inneholdt en Ki-ras-mutasjon. Vi var i stand til å identifisere tilsvarende Ki-ras-mutasjon i 9 av 13 (4 colonoskopi og 9 prekirurgi) avføringsprøver. Identifikasjonen ble oppnådd i alle 4 colonoskopiprøvene og i 5 av 9 av de pre-kirurgiske prøver. Bare de siste prøvene er av diagnostisk verdi. Colonoskopiprøvene tilveiebragte bare verdifull informasjon under evaluering av fremgangsmåten.

Skjønt oppformerbarheten av alle avføringsprøvene var blitt etablert, ga ikke MSPE positive resultater i hver prøve. Som en mulig forklaring kan et antall problemer erkjennes. Først, som nevnt tidligere, avviker avføringsprøvene muligens i stor grad med hensyn til både det totale innhold av mucosalceller og den tumoravledede cellefraksjon. For det andre er rensingen av humane celler fra avføringen sannsynligvis forhindret av nærværet av bakterielle celler. Et annet problem angår det faktum at humane celler er utsatt for en meget høy konsentrasjon av degraderende enzymer i avføringen. I tillegg er avføringen blitt funnet å inneholde visse inhibitorer, som interfererer med DNA-oppformering i PCR<1>. Ved å binde DNA til en modifisert ioneutbytteharpiks (f.eks. Qiagen, brukt i denne undersøkelse) kan disse inhibitorer fjernes, minst delvis.

MSPE-metoden som sådan synes meget vel egnet for deteksjon av Ki-ras-mutasjoner i avføring. Analysen av avføringsprøvene krevde deteksjon av muterte Ki-ras-sekvenser avledet fra tumorceller blant et overskudd av villtype Ki-ras fra normale celler. Eksperimenter som etablerte sensitiviteten av fremgangsmåten demonstrerte at MSPE kunne detektere minst 0,01% muterte celler i en heterogen cellepopulasjon (upubliserte data). Et annet trekk ved MSPE er at fremgangsmåten er relativt ufølsom til «luftbårne» pre-PCR-kontaminasjon (f.eks. humant DNA frigjort fra hår, hud etc).

Ytterligere undersøkelser er nødvendig for å forbedre metodens effektivitet, f.eks. ved anstrengelser rettet mot å likgjøre startmengden av templatet for MSPE. Senere eksperimenter i vårt laboratorium angir at dette kan oppnås med et trerunders PCR-oppsett. En annen forbedring kan være foretatt ved å anrike prøven med mutante celler før analyse, f.eks. ved fortrinnsvis rensing av mutant versus villtypeceller.

Screening for flere mutasjoner i en analyse kan være en mulighet ved hjelp av et antall mistilpassede primere samtidig. Ytterligere undersøkelser av en slik såkalt »multiplex-PCR» assay ville være verdifull. Avslutningsvis, ytterligere evaluering av en mulig anvendelse av teknikken i en screeningtest er nødvendig. En slik test, muligens med høy spesifisitet, ville gi en positivt predikterende verdi som langt overskrider den til deteksjon av blod i faeces.

I det senere er Ki-ras-mutasjoner også blitt identifisert i avføring til pasienten med pancrea adnocarcinom og er antatt å være forløperlesjoner . Dette funn gjør det potensielle området for Ki-ras-analyse i avføring enda bredere. Følgelig kunne Ki-ras-deteksjon i avføring være en hurtig og ikke-invasiv screeningstrategi, ikke bare for tidlig deteksjon av colorektal kreft men for andre gastrointestinale og pancreatiske ondartede svulster såvel.

Eksempel 3

Ki- ras onkogenanalvse i den nøyaktige diagnose av maligne lesjoner i pancreas.

Aktivering av Ki-ras-onkogenet ved spesifikke punktmutasjoner på kodon 12 skjer med en bemerkelsesverdig høy frekvens i adenocarcinom i pancreasdukten og er sannsynlig å være en viktig hendelse i patogenesen til denne kreftform. Ki-ras-onkogene mutasjoner er også detekterbare i pancreatisk væske fra pasienter med maligne lesjoner. Denne spesifikke genaktivering kan således hjelpe til ved diagnosen av ondartede pancreas-lidelser, i differensialdiagnose mot kronisk pancreatitt og også for å separere benign cystisk sykdom i pancreas fra malign.

Vi har nylig utviklet en hurtig ikke-radioaktiv SSCP-assay for deteksjon og identifikasjon av Ki-ras-mutasjoner med en sensitivitetsgrense (celler med en mutert allel/normalcelle) på 0,02. Vi anvendte denne teknikken til to forskjellige prøver fra 30 pasienter som ble operert for malign lesjon i pancreas. Alle tretti pasientene hadde en kodon 12-mutasjon i tumoren. Pancreasvæske som ble oppsamlet fra 12 pasienter viste nærvær av mutasjon i 9 tilfeller. Tre pasienter med cystisk sykdom i pancreas som opprinnelig var klassifiserte som ikke-maligne viste Ki-ras-mutasjon i cystevæsken og i cysteveggbiopsier og en malign histologi ble konfirmert etter operasjonen. Peritonealvæske oppsamlet fra tre pasienter viste nærvær av den samme mutasjon som den funnet i tumoren.

Nærvær av mutasjonene GAT og GTT synes å være assosiert med en bedre prognose etter operasjonen enn nærvær av alle de andre mutasjoner. Vi konkluderer at analyse for Ki-ras-mutasjoner i pancreaslesjoner kan være en god hjelp både diagnostisk og prognostisk og kan føre til en tidligere diagnose for denne nedbrytende sykdommen hvis eneste håp for overlevelse er tidlig diagnose og radikal kirurgi.

Eksempel 4

Assosiasjon av spesifikke Ki- ras genmutasjoner med forbedret overlevelse for pasientene i pancreas adenocarcinom

Pancreas adenocarcinom er kjent for å ha en høy insidens av Ki-ras genmutasjoner. I den foreliggende undersøkelse ble formalinfikserte og parafininnstøpt tumormateriale fra 73 pasienter med primære adenocarcinom undersøkt for nærvær av aktiverende punktmutasjoner i exon 1 i Ki-ras ved å bruke en enkelttrådet konformasjonspolymorfismebasert metode. 49 (72%) av de 68 carcinom som ble vellykket oppformert hadde en eller flere punktmutasjoner.

Overlevelsesanalyser viste ingen korrelasjon mellom fravær eller nærvær av Ki-ras-mutasjon og pasientoverlevelse og ingen forskjell mellom tilfeller med en eller flere mutasjoner ble observert. Nærvær av to spesifikke mutasjoner (GTT og GAT-tripletter i kodon 12) var imidlertid signifikant assosiert med forbedret pasientoverlevelse sammenlignet med alle andre typer av mutasjoner eller fravær av mutasjon (p=0,0038). I en multivariat overlevelsesanalyse (Cox' metode) som inkluderer pasientens alder på diagnosetidspunktet, tumordiameter og tumorlokalisering i tillegg til type av Ki-ras-mutasjon viste en sterk og uavhengig prognostisk viktighet (p=0,03).

Således definerer nærvær av GTT og GAT-mutasjoner i exon 1 i Ki-ras en undergruppe av pasienter med pancreas adenocarcinom i hvilke prognosen er signifikant forbedret. Molekylæranalyse av Ki-ras kunne være en markør til stor hjelp til å plukke ut pasienter som har større sjanse til å dra nytte fra utstrakt kirurgisk behandling.

REFERANSER

1. Sidransky D, Tokino, T, Hamilton SR, et al. Identification of ras oncogene mutations in the stool of patients with curable colorectal tumours. Science 1992; 256: 102-105. 2. Bos JL, Fearon ER, Hamilton SR, et al. Prevalence of ras gene mutations in human colorectal cancers. Nature 1987; 327: 293-297. 3. Forrester K, Almoguera C, Han K, et al. Detection of high incidence of Ki-ras oncogenes during human colon tumorigenesis. Nature 1987; 327: 298-303. 4. Bos JL, Ras. Oncogenes in human cancer: A review. Cancer Res. 1989; 49: 4682-4689. 5. Burmer GC, Rabinovitch PS, Loeb LA. Analysis of c-Ki-ras mutations in human colon carcinoma by cell sorting, polymerase chain reaction, and DNA sequencing. Cancer Res. 1989; 49: 2141-2146. 6. Vogelstein B, Fearon ER, Hamilton SR, et al. Genetic alterations during colorectal tumour development. N. Eng. J. Med. 1988; 319: 525-532. 7. Capella G, Cronauer-Mitra S, Peinado MA, Perucho M. Frequency and spectrum of mutations at codons 12 and 13 of the c-Ki-ras gene in human tumours. Environ. Health Perspect. 1991; 93: 125-131. 8. Breivik J, Meling GJ, Spurkland A, Rognum TO, Gaudernack G. Ki-ras mutation in colorectal cancer: relations to patient age, sex and tumour location. Br. J. Cancer 1994; 69: 367-371. 9. Moerkerk P, Arends JW, van Driel M, de Bruine A, de Goeij A, ten Kate J. Type and number of Ki-ras point mutations relate to stage of human colorectal cancer. Cancer Res. 1994; 54: 3376-3378. 10. Davis LG, Battery J, Dibner MD. Basic methods in molecular biology. New York: Elsevier, 1986, 1986: 320-323. 11. Sepp R, Szabo I, Uda H, Sakamoto H. Rapid techniques for DNA extraction from routinely processed archival tissue for use in PCR. J. Clin. Pathology 1994; 47: 518-523. 12. Taylor GR. Polymerase chain reaction: basic principles and automation. In: McPherson MJ, Quirke P, Taylor GR, eds. PCR: a practical approach. Oxford: Oxford University Press, 1992: 1-14. 13. Rolfs A, Schuller I, Finckh U, Weber-Rolfs I. PCR: Clinical diagnostics and research. Berlin, Springer-Verlag, 1992: 1-22. 14. Myers RM, Lumelsky N, Lerman L, Maniatis T. Detection of single-base substitutions in total genomic DNA. Nature 1985; 313: 495-498. 15. Winter B, Yamamoto F, Almoguera C, Perucho M. A method to detect and characterize point mutations in transcribed genes: amplification and overexpression of mutant c-Ki-ras allele in human tumour cells. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1985; 82: 7575-7579. 16. Verlaan-de Vries M, Bogaard ME, van den Elst H, van Boom JH, van der Eb AJ, Bos JL. A dot-blot screening procedure for mutated ras oncogenes using synthetic oligodeoxynucleotides. Gene 1986; 50: 313-320. 17. Ehlen T, Dubeau L. Detection of ras point mutations by polymerase chain reaction using mutation-specific, inosine-containing oligonucleotide primers. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989; 160: 441-447. 18. Suzuki Y, Orita M, Shiraishi M, Hayashi K, Sekiya T. Detection of ras gene mutations in human lung cancers by single-strand conformation polymorphism analysis of polymerase chain reaction products. Oncogene 1990; 5:1037-1043. 19. Rossiter BJF, Caskey CT. Molecular scanning methods of mutation detection. J. Biol. Chem. 1990; 265: 12753-12756. 20. Levi S, Urbano-Ispizua A, Gill R, et al. Multiple Ki-ras codon 12 mutations in cholangiocarcinomas demonstrated with a sensitive polymerase chain reaction technique. Cancer Res. 1991; 51: 3497-3502. 21. Pellegata NS, Losekoot M, Fodde R, et al. Detection of Ki-ras mutations by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE): A study on pancreatic cancer. Anticancer res. 1992; 12: 1731-1736. 22. Orita M, Suzuki Y, Hayashi K. A rapid and sensitive detection of point mutations and genetic polymorphisms using polymerase chain reaction. Genomics 1989; 5: 874-879. 23. Orita M, Iwahana H, Kamazawa K, et al. Detection of polymorphisms of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms. Proe. Nati. Aca. Sei. 1989; 86: 2766-2770. 24. Hayashi K. PCR-SSCP: A simple and sensitive method for detection of mutations in genomic DNA. PCR Methods Appl. 1991; 1: 34-38. 25. Rolfs A, Schuller I, Finckh U, Weber-Rolfs I. PCR: Clinical diagnostics and research. Berlin: Springer-Verlag 1992: 163-167. 26. Ulvik A. Rapid detection and identification of mutations in exon 1 of Ki-ras by SSCP on the Pharmacia Phast System (manuscript submitted). 27. Sommer SS, Cassady JD, Sobell JL, Bottema CDK. A novel method for detecting point mutations or polymorphisms and its application to population screening for carriers of phenylketonuria. Mayo Clin. Proe. 1989; 64: 1361-1372. 28. Wu DY, Ugozzoli L, Pal BK, Wallace RB. Allele-specific amplification of p-globin genomic DNA for diagnosis of sickle cell anaemia. Proe. Nati. Acad. Sei. USA 1989; 86: 2757-2760. 29. Sommer SS, Groszbach AR, Bottema CDK. PCR amplification of specific alleles (PASA) is a general method for rapidly detecting known single-base mutations. BioTechniques 1992; 12: 82-87. 30. Bottema CDK, Sommer SS. PCR amplification of specific alleles: Rapid detection of known mutations and polymorphisms. Mutation Res. 1993; 288: 93-102. 31. Newton CR, Graham A, Heptinstall LE, et al. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS). Nucl. acids Res. 1989; 17: 2503-2516. 32. Porter-Jordan K, Rosenberg EI, Keiser JF, et al. Nested polymerase chain reaction assay for the detection of cytomegalovirus overcomes false positives caused by contamination with fragmented DNA. J. Med. Virol. 1990; 30: 85-91. 33. Simmonds P, Balfe P, Peutherer JF, Ludlam CA, Bishop JO, Brown AJL. Human immunodefiency virus-infected individuals contain provirus in small numbers of peripheral mononuclear cells and at low numbers. J. Virol. 1990; 64: 864-872. 34. Porter-Jordan K, Garret CT. Source of contamination in polymerase chain reaction assay. Lancet 1990; 19: 335. 35. D'Aquila RT, Bechtel LJ, Videler JA, Eron JJ, Gorzyca P, Kaplan JC. Maximizing sensitivity and specific of PCR by preamplification heating. Nucleic Acids Res. 1991; 19: 3749. 36. Chou Q, Russel M. Birch DE, Raymond J, Bloch W. Prevention of pre-PCR dimerization improves low-copy-number amplifications. Nucleic Acids Res. 1992; 20: 1717-1723. 37. Dukes CE. The classification of cancer of the rectum. J. Pathol. Bacteriol. 1932; 35: 323-332. 38. Lampe JW, Fredstrom SB, Slavin JL, Potter JD. Sex differences in colonic function: a randomised trial. Gut 1993; 34: 531-536. 39. Caldas C, Hahn SA, Hruban RH, Redston MS, Yeo CJ, Kem SE. Detection of Ki-ras mutations in the stool of patients with pancreatic adenocarcinoma and pancreatic ductal hyperplasia. Cancer Res. 1994; 54: 3568-3573.

40. Hayashi K. (1992) Genet. Anal. Tech. Appl. 9, 73-79.

41. Takahashi-Fujii, Ishino A, Shimada A and Kato I. (1993) PCR Methods Appl. 2, 323-327. 42. Trumper LH, Burger B, von-Bonin F, Hintze A, von-Blohn G, Pfreundschuh M, and Daus H. (1994) Br. J. Cancer. 80, 278-284.

Claims (10)

1. En fremgangsmåte til å detektere Ki-ras-mutasjoner i exon I, kodon 12 til 13 i prøver valgt fra vev, tumorvev, tumorsekreter, ekskreter og ekspektorater, karakterisert ved at den omfatter; (a) å rense og separere DNA fra prøven; og (b) å utføre minst en PCR-amplifikasjon ved å bruke en oppstrøms flankerende oligoprimer 5'-ACC CTT ATG TGT GAC ATG TTC TA A T-3'(R1) (SEKV.ID. NR. 5) og en nedstrøms flankerende oligoprimer 5'-AAT GGT CCT GCA CCA GTA AT-3' (R2) (SEKV.ID. NR. 2) til å fremstille et spesifikt PCR-produkt som omfatter mutasjonene.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at mellom trinn (a) og trinn (b) blir en ytterligere PCR amplifikasjon utført ved å bruke den oppstrøms flankerende oligoprimer 5'-GGT GGA GTA TTT GAT AGT GTA TTA ACC TTA TGT-3' (R3) (SEKV.ID. NR. 1) og nedstrøms flankerende oligoprimer 5'-AAT GGT CCT GCA CCA GTA AT-3' (R2) (SEKV.ID. NR. 2).

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at PCR produktet er identifisert ved å bruke egnede geler.

4. Fremgangsmåte i henhold til ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at prøvene er tatt fra colon, rectum, lunge og pancreas.

5. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved at prøvene brukt i fremgangsmåten er ferske, frosne eller innbakt i parafin.

6. Fremgangsmåte som angitt i ethvert av de foregående krav, karakterisert ved at prøven omfatter avføring, pancreasvæske, cystisk væske fra pancreas, biopsier fra colon og rektum.

7. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved at mengden av avføring brukt som utgangsmateriale i fremgangsmåten varierer fra 5-100 mg, fortrinnsvis 10 mg.

8. Fremgangsmåte som angitt i ett av de foregående krav, karakterisert ved at mengden av tumorvev brukt som utgangsmateriale i fremgangsmåten varierer fra 2-50 mg, fortrinnsvis 25 mg.

9. Fremgangsmåte til å detektere Ki-ras mutasjoner i exon 1, kodon 12 til 13 i prøver valgt fra vev og avføring, karakterisert ved at den omfatter å utføre på DNA fra nevnte prøve en PCR-amplifikasjon ved å bruke oligonukleotidprimere hovedsakelig komplementære til hver tråd av mutantnukleotidsekvensen som skal amplifiseres og som er i stand til å hybridiseres med en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID. NR. 1 og en nukleotidsekvens som vist i SEKV.ID. NR. 2, eller sekvenser komplementære dertil under betingelser som tillater polymerisasjonsmiddelet å funksjonere.

10. Ologonukleotidprimer molekyl for anvendelse til å detektere Ki-ras mutasjoner i exon 1, kodon 12 til 13 i prøver valgt fra vev, tumorvev, vevssekresjoner, ekskreter, ekspektorater, karakterisert ved at oligonukleotidet består av en sekvens av nukleotider fremsatt i enhver av SEKV.ID. NR. 1, 2 eller 5.