CN117731766A - 一种基于金属有机框架的猪圆环病毒ⅱ型纳米疫苗的制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗的制备方法与应用，涉及纳米材料制备技术领域。本发明基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗是通过纳米晶体材料ZIF‑8对猪圆环病毒Ⅱ型生物分子进行封装得到，其中，猪圆环病毒Ⅱ型生物分子为PCV2Cap蛋白。本发明的纳米疫苗能够为猪圆环病毒Ⅱ型生物大分子提供稳定的微环境，可以增强生物大分子的热稳定性和化学稳定性，从而诱导长效的免疫反应，构建起有效的免疫防御体系。
Description
技术领域
本发明涉及纳米材料制备技术领域，特别是涉及一种基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗的制备方法与应用。
背景技术
猪圆环病毒Ⅱ型是一种DNA病毒，属于单股负链环状DNA病毒。该病毒主要感染家畜和野生动物，是一种常见的病原体。感染猪圆环病毒Ⅱ型后，动物会出现呼吸道症状、消化道症状、神经系统症状等，严重时甚至会导致动物死亡，给养殖业和野生动物保护带来严重的威胁。因此，对该病毒的预防和治疗一直是研究的热点之一。目前，疫苗是预防和控制猪圆环病毒病的重要手段之一，为此，开发更加稳定且长效的疫苗，对预防和控制该病的发生具有重要意义。
金属有机骨架材料(Metal-Organic Frameworks，MOFs)是一种具有极高应用潜力的有机-无机杂化材料，由有机配体和桥连金属离子或簇组成，被广泛应用于各个领域。近年来，由于MOFs纳米材料的高负载能力、优良的生物相容性及丰富的设计性能使其在疫苗递送系统中也发挥着重要作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗的制备方法与应用，以解决上述现有技术存在的问题。
本发明提供了一种基于MOFs的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗，该纳米疫苗以猪圆环病毒Ⅱ型生物分子为介质，多孔纳米晶体材料MOFs为载体，通过封装的方式结合制得，具有良好的生物安全性及优异的免疫应答，从而能够有效诱导机体产生针对猪圆环病毒Ⅱ型的抗体，发挥长效保护。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供一种基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗，通过纳米晶体材料ZIF-8对猪圆环病毒Ⅱ型生物分子进行封装得到。
进一步地，所述猪圆环病毒Ⅱ型生物分子为PCV2 Cap蛋白。
本发明进一步提供上述基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗的制备方法，包括以下步骤：
利用纳米晶体材料ZIF-8对所述猪圆环病毒Ⅱ型生物分子进行封装，得到所述基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗。
其中，纳米晶体材料ZIF-8由甲基咪唑前体和锌离子经室温合成法制备而成。
进一步地，制备方法具体包括以下步骤：
将甲基咪唑前体、所述猪圆环病毒Ⅱ型生物分子与锌离子化合物混合反应，得到所述基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗。该纳米疫苗为空腔中含有生物大分子的MOFs材料。
具体的，本发明将构成MOFs纳米材料的甲基咪唑前体和原始生物分子共同孵育，并加入锌离子在室温下反应，通过封装的方式生成载有生物大分子的MOFs纳米材料。
封装过程中所用溶剂包括甲醇、乙醇、PBS或去离子水，更优选为去离子水。
进一步地，所述甲基咪唑前体为2-甲基咪唑；所述锌离子化合物包括Zn(NO3)2·6H2O或ZnO。
进一步地，所述甲基咪唑前体与锌离子化合物中锌离子的摩尔比为7:1。
进一步地，所述封装的温度为0～30℃；所述封装的时间为4～30h。
更进一步地，所述封装的温度为20～28℃；所述封装的时间为10～24h。
再进一步地，所述封装的温度为25～26℃；所述封装的时间为12h。
本发明中，在封装步骤完成后还包括低温离心、真空干燥的步骤。
针对目前对猪圆环病毒Ⅱ型的预防和治疗不足的情况，本发明提供了一种新型纳米疫苗的制备方法，通过共沉淀方法，将甲基咪唑前体、锌离子与生物大分子共同形成沸石咪唑酸盐框架MOFs，实现生物大分子的高载量封装，得到了基于MOFs的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗(PCV2@ZIF-8)。
ZIF-8为一种金属有机骨架材料，具有高度的孔隙结构和表面积，可以用于吸附和包裹目标蛋白质。溶液中的锌离子利用静电相互作用，可以与蛋白结合并矿化，在与甲基咪唑前体共沉淀，增加了对溶液中游离蛋白的捕获效率，提高了蛋白利用率，实现蛋白高负载量。
同时，由于ZIF-8的合成原料价格低廉，制备成本低。所利用的共沉淀法合成ZIF-8纳米颗粒的方式简单易操作，无需复杂的设备和苛刻条件、制备时间短，便于转化并投入实际生产应用。
本发明以PCV2@ZIF-8纳米疫苗为基础，可以将生物大分子(碳水化合物、氨基酸及蛋白质等)封装在材料内部，为生物大分子提供稳定的微环境，以实现生物分子的热稳定性和化学稳定性的增强，提高纳米疫苗的适应性与长效性，增强免疫抗体的表达水平。
本发明上述基于MOFs的猪圆环病毒Ⅱ型纳米材料在动物免疫中具有潜在应用。
本发明进一步提供上述基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗在制备治疗猪圆环病毒Ⅱ型防治药物中的应用，为猪圆环病毒Ⅱ型的预防和治疗提供新思路和方法。
本发明公开了以下技术效果：
本发明提供的基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗能够为猪圆环病毒Ⅱ型生物大分子提供稳定的微环境，可以增强生物大分子的热稳定性和化学稳定性。
本发明针对猪圆环病毒(PCV2)的免疫治疗方法，基于纳米疫苗材料，将疫苗抗原或蛋白的递送作用与缓释作用结合，从而诱导长效的免疫反应，构建起有效的免疫防御体系。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1制备的PCV2@ZIF-8的XRD粉末衍射谱图；
图2为本发明实施例1制备的PCV2@ZIF-8的红外光谱图；
图3为77K下本发明实施例1制备的PCV2@ZIF-8的N2吸附曲线；
图4为本发明实施例1制备的PCV2@ZIF-8的TGA照片；
图5为本发明实施例1制备的PCV2@ZIF-8的孔径分布图；
图6为本发明实施例1制备的PCV2@ZIF-8的SEM照片；
图7为本发明实施例1制备的PCV2@ZIF-8的DLS粒径分布图；
图8为本发明实施例2中不同浓度BSA蛋白的吸光度对应的校准曲线；
图9为本发明实施例2中标准BCA蛋白检测结果图；
图10为本发明实施例3中PCV2@ZIF-8在不同pH下的蛋白释放曲线；
图11为本发明实施例4中PCV2@ZIF-8对PK-15猪肾细胞的细胞毒性谱图；
图12为本发明实施例4中PCV2@ZIF-8对RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞的细胞毒性谱图；
图13为本发明实施例5中PCV2@ZIF-8对RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞炎症反应中TNF-α的分泌情况；
图14为本发明实施例5中PCV2@ZIF-8对RAW 264.7小鼠单核巨噬细胞炎症反应中IL-6的分泌情况；
图15为本发明实施例5中PCV2@ZIF-8对PK-15猪肾细胞炎症反应中TNF-α的分泌情况；
图16为本发明实施例5中PCV2@ZIF-8对PK-15猪肾细胞炎症反应中IL-6的分泌情况；
图17为本发明实施例6中PCV2@ZIF-8的溶血实验谱图；
图18为本发明实施例7中不同实验条件下小鼠的体重情况；
图19为本发明实施例7中用ELISA检测不同浓度的PCV2@ZIF-8作用下小鼠血清中抗分泌情况；
图20为本发明实施例7中用ELISA检测不同实验条件下小鼠血清中抗分泌情况；
图21为本发明PCV2@ZIF-8纳米疫苗制备及免疫实验的示意图。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
本发明提供一种新型纳米疫苗PCV2@ZIF-8的制备方法，将所述的纳米晶体材料ZIF-8包封PCV2 Cap蛋白，形成PCV2 Cap包埋ZIF-8复合材料。
本发明以ZIF-8为外壳，以PCV2-Cap蛋白为核心，制备一例新型的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗，研究表明本发明制备的纳米疫苗可以将抗体或蛋白递送到目标位点，经抗原递呈细胞的摄取以诱导相对强烈的免疫反应，为猪圆环病毒Ⅱ型蛋白纳米疫苗的研发提供了充分条件。
实施例1新型纳米疫苗PCV2@ZIF-8的制备
在H2O(0.45mL)中加入2-甲基咪唑(11.08mg，0.14mmol)，超声至充分溶解。向上述溶液中加入PCV-2Cap(0.45mL)溶液，并在室温下搅拌30min。然后，将0.1mL的Zn(NO3)2·6H2O(6.00mg，0.02mmol)水溶液加至上述反应液中，室温下搅拌12h，离心收集沉淀产物。将固体产物在25℃下真空干燥24h，得到PCV2@ZIF-8白色粉末(3.98mg)。
PCV2@ZIF-8的XRD粉末衍射谱如图1所示，证明PCV2@ZIF-8具有较高的结晶度；如图2所示，在PCV2@ZIF-8的红外光谱中，1660cm-1肽键特征伸缩振动峰的出现，证明PCV2蛋白被成功包裹在ZIF-8材料中；相较于ZIF-8的77K下N2吸附量(596.2cm3/g)，PCV2@ZIF-8下降为364.3cm3/g(图3)，进一步佐证了包裹有PCV2蛋白的ZIF-8复合材料成功制备；PCV2@ZIF-8的TGA谱图证明了PCV2@ZIF-8依然具有良好的热稳定性(图4)；由于PCV2蛋白的加入，PCV2@ZIF-8的孔径分布明显降低，如图5所示；PCV2@ZIF-8的SEM图片及DLS粒径分布图表明PCV2@ZIF-8为平均粒径161nm的球状纳米材料(图6和图7所示)。
实施例2PCV2 Cap蛋白的封装能力
PCV2 Cap蛋白的封装能力采用BCA蛋白定量分析试剂盒(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)，并使用BCA蛋白定量分析试剂盒建立BSA蛋白浓度与吸光度的校准曲线，如图8所示。然后，通过BCA法检测实施例1中PCV2@ZIF-8离心后上清液的PCV2蛋白浓度，为消除实验误差，测定重复三次。检测结果如图9所示，根据标准曲线测得上清液中PCV2 Cap的浓度平均值为15.27μg/mL。PCV2 Cap原始蛋白浓度为485μg/mL，计算得到PCV2@ZIF-8的蛋白包被率为93％，负载率为5.1％。
实施例3PCV2@ZIF-8的蛋白释放测试
在37℃下，将PCV2@ZIF-8(5mg)分散在3.0mL pH＝6.0和pH＝7.4的缓冲溶液中，在给定时间内从混合液中取出样品并离心，采用BCA蛋白定量分析试剂盒检测所取样品溶液中蛋白质的浓度。如图10所示，在pH＝6.0时，超过90％的抗原在2h内被释放，几乎所有抗原在8h内被释放。而在pH＝7.4时，只有少量PCV2被释放，证明PCV2@ZIF-8在不同pH环境中，具有控制PCV2蛋白释放及缓释作用。
实施例4PCV2@ZIF-8的细胞毒性实验
PCV2@ZIF-8的细胞毒性使用CCK-8试剂盒(武汉爱博泰克生物科技有限公司)。用PBS缓冲液配制PCV2@ZIF-8母液，充分溶解混匀后，使用2％ DMEM将母液稀释为：3.1μg/mL、6.2μg/mL、12.5μg/mL、25.0μg/mL和50.0μg/mL。为减小实验误差，每组取6个平行实验。
将PK-15和RAW264.7的细胞悬液接种至96孔板中(约5000个细胞/孔)，放置在37℃、5％CO2培养箱中预培养24h。以未处理的细胞作为空白对照。PBS缓冲液洗涤培养板3次后，每孔中加入不同浓度的PCV2@ZIF-8(100μL)再培养24h。然后每孔加入CCK-8溶液(10μL)孵育4h，酶标仪检测450nm处的吸光度。所得数据均以空白对照组的活细胞率为对比，以百分比表示。如图11和12所示，当PCV2@ZIF-8作用于PK-15和RAW 264.7细胞时，50μg/mL实验组的细胞活性明显下降，与对照组形成显著差异。结果表明在50μg/mL以内，PCV2@ZIF-8具备细胞安全性。
实施例5PCV2@ZIF-8的细胞炎症因子的分泌情况
RAW 264.7和PK-15细胞在12孔培养板上培养好后，向实验组每孔中分别加入100μLPCV2(2.5μg/mL)、ZIF-8(47.5μg/mL)和PCV2@ZIF-8(50μg/mL)孵育12h，每组取3个平行实验。PBS缓冲液洗涤5次后，每孔中加入250μL RNA-easy充分覆盖细胞表面，反复吹打混匀使细胞完全裂解，根据试剂盒说明(RNA-easy Isolation Reagent，Vazyme#R701)提取RNA。依据逆转录说明书(HiScript III RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)，Vazyme#R323)将RNA逆转录为cDNA。按照qPCR检测试剂说明书(ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix，Vazyme#Q711)，检测不同实验组处理RAW 264.7和PK-15细胞并孵育后，其TNF-α、IL-6的分泌情况。如图13与14所示，PCV2@ZIF-8处理的RAW 264.7细胞，其TNF-α分泌量比PBS、PCV2和ZIF-8实验组的分泌量高约2倍。同时，IL-6的分泌量也比PBS、PCV2和ZIF-8实验组高。如图15与16所示，同样的实验结果在PK-15细胞得到验证。结果表明经MOFs包裹后，PCV2@ZIF-8的免疫应答水平比PCV2蛋白更强，这印证PCV2@ZIF-8具有更优异的免疫刺激作用。
实施例6PCV2@ZIF-8的溶血性实验
将PCV2@ZIF-8加入D-PBS缓冲液中，配制成9种不同浓度的样品，再将新鲜的小鼠血液分散在D-PBS缓冲液中，分别加入以上9种浓度的样品溶液、D-PBS缓冲液与二次水。PCV2@ZIF-8的最终浓度为：25μg/mL、50μg/mL、75μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL和1600μg/mL。然后，将样品溶液于37℃下孵育4h后，离心至分层。将样品分别转移至96孔板中，检测570nm处的OD值(每组3个平行实验)。如图17所示，当PCV2@ZIF-8的浓度达到1600μg/mL时，并未检测到溶血现象。上述实验结果表明新型纳米疫苗PCV2@ZIF-8具有良好的生物相容性，为后期动物实验打下基础。
实施例7PCV2@ZIF-8作用下小鼠抗体分泌情况
在体内进一步检测PCV2@ZIF-8的抗原特异性体液免疫。以6-8周龄的BALB/c雌性小鼠为模型，将40只小鼠随机分成4组(每组10只)。采用皮下注射方式，分别将100μL的PBS、ZIF-8(19mg/mL)、PCV2(100μg)和PCV2@ZIF-8(PCV2蛋白量为100μg)的纳米疫苗接种到小鼠体内，分别记为PBS组、ZIF-8组、PCV2组和PCV2@ZIF-8组。观察14天后，所有小鼠均以相同处理方式进行第二次免疫。免疫过程中，每周通过尾部静脉采血对所有实验组小鼠进行血样采集，并利用ELISA抗体试剂盒(北京金诺百泰生物技术有限公司)对析出的小鼠血清中抗体分泌水平进行监测。同时，对所有实验组的小鼠每日进行体重检测，记录不同实验条件下小鼠体重随时间的生长曲线。如图18所示，各组小鼠的体重差异可以忽略不计，这证明整个实验过程并未影响小鼠健康。如图19所示，PCV2@ZIF-8组的抗体检测结果表明抗体水平与时间先呈正相关，然后在42天后维持在相对稳定水平。如图20所示，在小鼠免疫的第126天，PCV2组免疫峰值明显降低，但PCV2@ZIF-8的免疫峰值远高于PCV2蛋白组且仍依然保持强阳性，这表明PCV2@ZIF-8不仅免疫效果好且持续时间长。
本发明制备的基于MOFs的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗具有良好的稳定性和生物相容性，可以有效地稳定PCV2 Cap蛋白，具有良好的缓释作用，能够实现疫苗抗原的长效免疫保护作用。本发明提供的该疫苗能够显著提高小鼠的免疫力，降低感染猪圆环病毒Ⅱ型的风险。
基于本发明MOFs的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗具有广阔的应用前景，可以为猪圆环病毒Ⅱ型的预防和治疗提供新的思路和方法，也将为新型纳米疫苗的开发和应用提供更多、更新的思路。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗，其特征在于，通过纳米晶体材料ZIF-8对猪圆环病毒Ⅱ型生物分子进行封装得到。
2.根据权利要求1所述的基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗，其特征在于，所述猪圆环病毒Ⅱ型生物分子为PCV2 Cap蛋白。
3.如权利要求1或2所述的基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
利用纳米晶体材料ZIF-8对所述猪圆环病毒Ⅱ型生物分子进行封装，得到所述基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，制备方法包括以下步骤：
将甲基咪唑前体、所述猪圆环病毒Ⅱ型生物分子与锌离子化合物混合反应，得到所述基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述甲基咪唑前体为2-甲基咪唑；所述锌离子化合物包括Zn(NO3)2·6H2O或ZnO。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述甲基咪唑前体与锌离子化合物中锌离子的摩尔比为7:1。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述封装的温度为0～30℃；所述封装的时间为4～30h。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述封装的温度为20～28℃；所述封装的时间为10～24h。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述封装的温度为25～26℃；所述封装的时间为12h。
10.如权利要求1或2所述的基于金属有机框架的猪圆环病毒Ⅱ型纳米疫苗在制备治疗猪圆环病毒Ⅱ型防治药物中的应用。
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