CN112022836A

CN112022836A - 一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN112022836A
Application number: CN202010910395.4A
Authority: CN
Inventors: 崔基炜; 张贵强; 于群; 郝京诚
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2020-09-02
Filing date: 2020-09-02
Publication date: 2020-12-04

Abstract

本发明涉及一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，该纳米疫苗暴露于高温、酶和长期室温环境中仍保持良好的生物活性，显著地提高了疫苗的稳定性，有利于克服疫苗冷链运输问题。本发明的纳米疫苗能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用于减毒疫苗、蛋白质疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的制备。该纳米疫苗以聚乙二醇为矿化剂，粒径可控，该过程中不涉及有机试剂、微波、高温等剧烈条件，不会对抗原和佐剂的结构和活性造成破坏，并且制备工艺简单、成熟稳定，可以大规模生产。

Description

一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法

技术领域

本发明涉及一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，属于生物医药技术领域。

背景技术

疫苗接种是预防感染性疾病的重要手段，它能有效地降低各类传染性疾病的感染率和死亡率。但使用过程中存在的诸多问题限制了其更广泛的应用，如对疟疾、艾滋病、肺结核等疾病无效，不能充分地激活免疫系统，需要冷链(cold chain)运输等。其中，世界卫生组织(WHO)已把冷链运输问题确认为疫苗接种面临的最严重的挑战之一。每年用于疫苗的冷链运输的费用大约为2-3亿美元，占整个疫苗项目的80％左右。这不仅增加了疫苗成本和偏远地区人群接种疫苗的难度，而且冷链中断引发的疫苗失活或变性问题严重威胁着公共健康。因此，提高疫苗的稳定性、降低对冷链的依赖对于扩大疫苗的保护范围具有十分重要的意义。

近年来，利用纳米颗粒子来传输疫苗是新型疫苗研究的一大热点。纳米粒子应用于疫苗研究具有明显优势，它同时具备疫苗传输功能和免疫佐剂活性，通过调节两方面功能可以增强疫苗的免疫应答能力。另外，纳米疫苗可以使抗原和佐剂到达相同的抗原提呈细胞，产生更加持久的免疫效应。目前，病毒样颗粒、脂质体、聚集体纳米颗粒、乳液、胶束和金纳米颗粒等多种纳米材料已应用到疫苗研究中。纳米疫苗在提高疫苗免疫原性方面已经取得了很大的进展，但是仍存在一些问题：(1)抗原负载量低：虽然可以通过包埋、吸附、偶联等多种方式实现抗原负载，但制备过程复杂繁琐，并且涉及油水界面、机械搅拌、高温、化学反应等剧烈条件，可能会破坏抗原的结构和活性，导致抗原负载量低下；(2)特异性免疫应答弱，例如，诱导抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(cytotoxic T-lymphocyte，CTL)应答；(3)制备过程中使用有毒物质或者有机溶剂，导致生物相容性或生物降解能力较差。

金属有机框架(Metal-organic frameworks，MOF)是通过中心金属离子或金属团簇与有机配体自组装形成的一类具有周期性结构的多孔材料。目前，MOF材料多用于气体吸附和催化领域的研究，作为疫苗载体的研究较少，但其在疫苗递送方面具有非常独特的优势：(1)制备方法简单，能够高效封装抗原分子或免疫刺激剂，实现抗原的高负载；(2)促进抗原交叉呈递，基于金属-配体相互作用的MOF在酸性环境中发生解组装，从而实现抗原的可控释放并有利于交叉呈递；(3)生物相容性和可降解性好，可以经过人体代谢系统排出体外；(4)有利于疫苗的储存，克服对冷链的依赖。MOF通过仿生矿化作用可以将生物大分子固定在晶格内，即便在严苛的环境下仍保持其生物活性，并且调控孔径大小、形状等可以实现不同生物大分子的储存。金属有机框架生物安全性高，既可以提高抗原的负载量和特异性免疫应答能力，又有利于抗原的储存，因此在疫苗传输方面具有良好的应用前景。

但是MOF材料用于疫苗仍存在着一些关键性问题亟待解决：稳定性差，在体内生理环境下容易降解；装载抗原的过程中往往涉及有机试剂、微波、高温等剧烈条件，很可能会对抗原的结构和活性造成破坏。因此，亟需一种稳定性高，装载抗原无需使用有机试剂等苛刻条件，能够增强疫苗稳定性和免疫原性的新型金属有机框架纳米疫苗。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，该方法可以显著提高疫苗的稳定性和免疫原性，在疫苗传输中具有良好的应用前景。

为解决以上问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，包括步骤如下：

1)将聚乙二醇、疫苗和2-甲基咪唑溶液在室温下混合均匀，然后加入硝酸锌溶液，得混合液，将混合液搅拌反应；

2)将步骤1)反应后的溶液离心分离，然后水洗、除菌，制得疫苗制剂。

根据本发明优选的，步骤1)中，所述聚乙二醇为矿化剂，聚乙二醇分子量为2-100kDa，为直链、四臂或八臂聚乙二醇，混合液中聚乙二醇的加入量为1-5mg/mL。

进一步优选的，步骤1)中，所述聚乙二醇为八臂聚乙二醇，分子量为20-80kDa，聚乙二醇的加入量为2-3mg/mL。

根据本发明优选的，步骤1)中，所述2-甲基咪唑溶液的浓度为40-640mmol/L，进一步优选的，2-甲基咪唑溶液的浓度为160mmol/L。

根据本发明优选的，步骤1)中，所述硝酸锌溶液的浓度为20-80mmol/L，进一步优选的，硝酸锌溶液的浓度为40mmol/L。

根据本发明优选的，步骤1)中，2-甲基咪唑与硝酸锌的摩尔比为8:1-2:1，进一步优选的，2-甲基咪唑与硝酸锌摩尔比为4:1。

根据本发明优选的，步骤1)中，所述的疫苗包括疫苗抗原和疫苗佐剂，所述疫苗抗原为蛋白质、多糖、核酸、多肽、多糖结合疫苗、灭活疫苗或减毒活疫苗。

进一步优选的，步骤1)中，所述的蛋白质疫苗抗原为鸡卵清蛋白，分子量为43kDa。

根据本发明优选的，步骤1)中，所述疫苗抗原与聚乙二醇的质量比为1:1-1:10。

根据本发明优选的，步骤1)中，所述疫苗佐剂为铝盐佐剂、胞嘧啶磷酸鸟嘌呤脱氧寡核苷酸(CpG)、聚肌胞苷酸(poly(I:C))或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。

进一步优选的，步骤1)中，所述的疫苗佐剂为胞嘧啶磷酸鸟嘌呤脱氧寡核苷酸(CpG)，混合液中疫苗佐剂加入量为25-150μg/mL。

根据本发明优选的，步骤1)中，反应温度为4-60℃，反应时间为0.25-2小时，优选的，反应温度为25-30℃，反应时间为0.5-1小时。

根据本发明优选的，步骤2)中，所述溶液离心分离所用的离心力为5000-10000g，优选的，溶液离心分离所用的离心力为6000-8000g。

根据本发明优选的，步骤2)中，得到的疫苗制剂中纳米粒子粒径为150-800nm，进一步优选的，疫苗制剂中纳米粒子的粒径为200-400nm。

本发明的技术特点及优点如下：

1、本发明的金属有机框架疫苗能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用于减毒疫苗、蛋白质疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的制备，并且显著地提高了疫苗的稳定性，克服了现有疫苗冷链运输的问题，本发明的金属有机框架疫苗由于稳定性显著提高，无需冷藏储存。

2、本发明的金属有机框架纳米疫苗，直接在反应过程中加入疫苗抗原及佐剂一锅法制得，装载过程中不涉及有机试剂、微波、高温等剧烈条件，不会对抗原和佐剂的结构和活性造成破坏，并且制备工艺简单、成熟稳定，可以大规模生产。

附图说明

图1为实施例1-实施例4制得的封装不同质量抗原的金属有机框架纳米疫苗透射电镜图，A为实施例1的透射电镜图，B为实施例2的透射电镜图，C为实施例3的透射电镜图，D为实施例4的透射电镜图，标尺均为200nm。

图2为实施例1-实施例4制得的封装不同质量抗原的金属有机框架疫苗的粒径分布图；A为实施例1的粒径分布图，B为实施例2的粒径分布图，C为实施例3的粒径分布图，D为实施例4的粒径分布图；

图3为实施例1-实施例4制得的封装不同质量抗原的金属有机框架疫苗的zeta电势图；A为实施例1的zeta电势图，B为实施例2的zeta电势图，C为实施例3的zeta电势图，D为实施例4的粒zeta电势图；

图4为巨噬细胞RAW 264.7与金属有机框架纳米疫苗的相互作用图；其中，A为百分率图，B为平均荧光强度图。

图5为金属有机框架纳米疫苗对巨噬细胞RAW 264.7的细胞活力影响图；

图6为小鼠免疫金属有机框架纳米疫苗后血清特异型抗体滴度示意图；

图7为两种酶对金属有机框架纳米疫苗促进树突状细胞成熟作用的影响图，其中，A为流式细胞仪检测结果图，B为平均荧光强度统计图；

图8为高温及长期储存对金属有机框架纳米疫苗促进树突状细胞成熟作用的影响图。

具体实施方式：

为更好地理解本发明，下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件，按照常规条件进行。所用试剂均为可以通过市场购买获得的常规产品。

实施例1：

纳米疫苗制剂的制备方法，具体如下：

(1)将10mg分子量为40kDa的八臂聚乙二醇(8-arm-PEG-OH)、1mg鸡卵清蛋白(OVA)和2mL的2-甲基咪唑(MIM，160mM)混合均匀，然后加入2mL的硝酸锌溶液(Zn(NO₃)₂，40mM)，常温下搅拌反应0.5h；

(2)反应结束后将混合溶液离心(7000g，3min)，反复操作4次，每次离心后补加4mL超纯水，以除去未反应的物质，除菌后制得疫苗制剂。

实施例2：

同实施例1所述的疫苗制剂的制备方法，不同之处在于：

鸡卵清蛋白(OVA)的加入量为2mg。

实施例3：

同实施例1所述的疫苗制剂的制备方法，不同之处在于：

鸡卵清蛋白(OVA)的加入量为4mg。

实施例4：

同实施例1所述的疫苗制剂的制备方法，不同之处在于：

鸡卵清蛋白(OVA)的加入量为6mg。

实施例5：

封装抗原、佐剂的纳米疫苗制剂的制备

(1)将10mg分子量为40kDa的八臂聚乙二醇(8-arm-PEG-OH)、2mg鸡卵清蛋白(OVA)、100μg佐剂CpG和2mL的2-甲基咪唑(MIM，160mM)混合均匀，然后加入2mL的硝酸锌溶液(Zn(NO₃)₂，40mM)，常温下搅拌反应0.5h；

(2)反应结束后将混合溶液离心(7000g，3min)，反复操作4次，每次离心后补加4mL超纯水，以除去未反应的物质，除菌后制得封装佐剂的纳米疫苗。

应用实验例：

实验例1：免疫细胞对纳米疫苗的摄取

培养至对数期的RAW 264.7细胞(密度80～90％)，用0.25％胰酶消化，转移至24孔细胞培养板中(1mL/well)，培养箱中培养24h至细胞贴壁(37℃、5％CO₂)。吸去培养基，加入PBS清洗24孔培养板3次，分别加入蛋白浓度为10μg/mL的荧光标记疫苗OVA、荧光标记疫苗OVA@ZIF-8(实施例2)、荧光标记疫苗OVA-CpG@ZIF-8(实施例5)，同时以PBS作为空白对照，培养箱中继续培养4h。反复吹打收集细胞，并用0.01M PBS(含2mM EDTA、0.5％BSA，pH为7.2-7.4)清洗、离心细胞2次。用PBS将细胞重悬至0.5mL流式管中，用流式细胞仪进行检测。结果如图4所示，通过图4可以看出，本发明纳米疫苗能显著提高免疫细胞的吞噬和提呈作用。

实验例2：纳米疫苗对免疫细胞活力影响

培养RAW 264.7细胞生长至对数期，消化、收集加入至96孔细胞培养板中(3×10⁴cells/mL)，培养24h至细胞贴壁。分别加入不同浓度的ZIF-8和OVA-CpG@ZIF-8，PBS作为空白对照，培养箱中继续培养24h。取出96孔板，无菌条件下每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4h。弃去上清后，每孔中加入150μL DMSO溶解甲瓒颗粒。完全溶解后，用酶标仪检测570nm处吸光度值(OD570)。细胞活力测定结果如图5所示，结果显示，本发明金属有机框架封装疫苗和佐剂后可以显著减低细胞毒性，并且浓度高达300μg/mL仍具有很好的生物安全性，可以放心使用。

实验例3：纳米疫苗体内免疫原性测定

对实施例2、5中的纳米疫苗进行免疫活性检测，肌肉注射免疫小鼠，测定抗体滴度。具体方法如下：

实验动物：C57BL/6小鼠，4-6周龄，6只/组，雌性。

对照溶剂：磷酸盐缓冲液(PBS)。

给药剂量：以鸡卵清蛋白(OVA)蛋白浓度计：20μg/mouse(小鼠)。

分组：空白对照组(PBS)；单独疫苗组(OVA)；鸡卵清蛋白和佐剂物理混合组(OVA+CpG)；金属有机框架封装抗原组(OVA@ZIF-8)；金属有机框架封装抗原和佐剂组(OVA-CpG@ZIF-8)。

注射等体积的疫苗制剂，100μL/鼠，右后肢肌肉注射。

免疫方案：动物按照免疫分组，分别于第0、14、28天对小鼠进行免疫。首次免疫后第7、21、35天尾静脉取血，测定血清中抗体滴度。ELISA法测定血清中抗体滴度。

ELISA法所用试剂配制：

1.抗原包被液：50mmol/L碳酸盐缓冲液，pH 9.6。称取无水Na₂CO₃ 1.696g，NaHCO₃2.856g，加水溶解到1000mL，pH 9.6。

2.洗涤液(10×PBST，PH 7.4)：称取NaCl 80g，KCl 2g，Na₂HPO₄ 29g，KH₂PO₄ 2g，Tween-20 10mL，加双蒸水至1000mL，调至pH 7.4，使用时稀释10倍即可。

3.封闭液：5％脱脂奶粉，用50mmol/L PBS pH 7.4溶解。

4.底物液A(TMB-过氧化氢溶液)：取3,3＇,5,5＇-四甲基联苯胺(TMB)200mg，无水乙醇100mL，加双蒸水至1000mL。

5.底物液B(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L Na₂HPO₄缓冲液)：Na₂HPO₄ 24.8g，柠檬酸19.33g，加双蒸水至1000mL，调节pH至5.0-5.4。

6.底物液：使用时将底物液A和底物液B按1：1，加入30％H₂O₂至终浓度0.5％。

7.终止液：2N H₂SO₄。

鸡卵清蛋白OVA用抗原包被液稀释至5μg/mL，加入96孔板(Corning)中，100μL/孔，4℃包被过夜。用PBST洗3次，5％脱脂奶粉，200μL/孔，37℃封闭1h。用PBST洗涤3次，小鼠抗血清从1:400开始，用PBST按等比稀释6个梯度，加入酶标板中(100μL/孔)，37℃孵育1h。弃去血清样品，PBST洗涤3次，加入山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(1:1000倍稀释)，加入酶标板中，100μL/孔，37℃孵育1h。弃去二抗，PBST洗涤6次，加入新配置的新鲜TMB底物显色液，100μL/孔，室温避光显色15min。加入2N硫酸溶液终止显色，50μL/孔，并用酶标仪测定450nm吸光度(A₄₅₀)。

实验结果：

以鸡卵清蛋白OVA为免疫抗原，对各组的特异型抗体滴度进行了检测，检测结果如图6所示，结果显示，单独疫苗组(OVA)、鸡卵清蛋白和佐剂物理混合组(OVA+CpG)只能产生较低的抗体滴度；而本发明的金属有机框架封装疫苗抗原组(OVA@ZIF-8)、金属有机框架封装疫苗抗原和佐剂组(OVA-CpG@ZIF-8)与OVA+CpG组相比能明显的产生较高滴度的特异型抗体(P<0.05)，表明纳米疫苗载体具有更好的免疫佐剂活性，能够更好地促进抗体的产生。

实验例4：纳米疫苗稳定性研究

(1)样品处理

将实施例5制备的金属有机框架封装抗原和佐剂组(OVA-CpG@ZIF-8)分别暴露于高温(60℃过夜处理，OVA-CpG@ZIF-8Heat)、胰蛋白酶(OVA-CpG@ZIF-8+Trypsin)、DNA酶(OVA-CpG@ZIF-8+Dnase I)的环境中，或者室温放置180天(OVA-CpG@ZIF-8aging)。通过研究对骨髓来源树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)成熟作用，评价纳米疫苗载体对封装其中的疫苗和佐剂的保护作用。

(2)BMDC提取与分离培养

用颈椎脱臼法将C57BL/6小鼠处死，置于75％酒精中浸泡，小鼠固定后转移至超净台内，取股骨和胫骨并剔除韧带及其他组织，置于含RPMI-1640培养基的培养皿中。在骨干两端分别用注射器钻孔，用低温RPMI-1640培养基冲洗骨髓腔，反复冲洗3次。洗液收集到15mL无菌管中，离心后弃上清(1500rpm×5min)，加入已恢复至室温的红细胞裂解液2mL，混匀后室温下放置0.5-1min裂解红细胞。立即加入6mL培养基终止反应，离心除去上清(1500rpm×5min)。再加入3mL培养基重悬细胞，离心并弃掉上清。

加入12mL含10ng/mL GM-CSF和20ng/mL IL-4的完全培养基将细胞悬浮，转移至24孔培养板中，每孔补加0.5mL同样的完全培养基。24孔培养板在细胞培养箱(37℃,5％CO₂)中孵育48h。吸去培养基，只保留贴壁细胞，然后加入含GM-CSF和IL-4的完全培养基，在培养箱中继续孵育4天。而后加入50％的完全培养基进行置换，并尽可能保留悬浮细胞。此后，每天置换50％的完全培养基。孵育至第6天收集细胞(纯度大于85％)，即为骨髓来源树突状细胞(BMDC)。

(3)促进BMDC细胞成熟作用

向24孔板培养的BMDC细胞中分别加入500μL不同样品，蛋白浓度为10μg/mL，细胞培养箱(37℃,5％CO₂)中培养24h。收集给药处理后的细胞，用含1％FBS的PBS清洗细胞2次。加入流式抗体，APC-CD11c、PE-CD86和PE-CD40。4℃避光标记30min，然后用含1％FBS的PBS清洗细胞三次。加入0.5mL洗液将细胞重悬，充分摇匀后用流式细胞仪进行检测，获得各标记细胞百分率和平均荧光强度(MFI)。

实验结果：

通过比较胰蛋白酶、DNA酶处理和新制备的样品对BMDC细胞成熟作用，图7中细胞百分率和平均荧光强度(MFI)并没有统计学差异，表明纳米疫苗能够显著提高疫苗抗原的稳定性，降低酶对疫苗活性的影响。同样的，图8流式细胞仪结果表明，高温和室温长期储存对疫苗的免疫原性均没有明显的影响。

当然，本发明还可以有多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员可根据本发明的公开做出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明的权利要求的保护范围。

Claims

1.一种无需冷藏储存的金属有机框架纳米疫苗的制备方法，包括步骤如下：

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述聚乙二醇为矿化剂，聚乙二醇分子量为2-100kDa，为直链、四臂或八臂聚乙二醇，混合液中聚乙二醇的加入量为1-5mg/mL；优选的，步骤1)中，所述聚乙二醇为八臂聚乙二醇，分子量为20-80kDa，聚乙二醇的加入量为2-3mg/mL。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述2-甲基咪唑溶液的浓度为40-640mmol/L，优选的，2-甲基咪唑溶液的浓度为160mmol/L。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述硝酸锌溶液的浓度为20-80mmol/L，优选的，硝酸锌溶液的浓度为40mmol/L。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，2-甲基咪唑与硝酸锌的摩尔比为8:1-2:1，优选的，2-甲基咪唑与硝酸锌摩尔比为4:1。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述的疫苗包括疫苗抗原和疫苗佐剂，所述疫苗抗原为蛋白质、多糖、核酸、多肽、多糖结合疫苗、灭活疫苗或减毒活疫苗；优选的，步骤1)中，所述的蛋白质疫苗抗原为鸡卵清蛋白，分子量为43kDa。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述疫苗抗原与聚乙二醇的质量比为1:1-1:10。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述疫苗佐剂为铝盐佐剂、胞嘧啶磷酸鸟嘌呤脱氧寡核苷酸(CpG)、聚肌胞苷酸(poly(I:C))或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；优选的，步骤1)中，所述的疫苗佐剂为胞嘧啶磷酸鸟嘌呤脱氧寡核苷酸(CpG)，混合液中疫苗佐剂加入量为25-150μg/mL。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，反应温度为4-60℃，反应时间为0.25-2小时，优选的，反应温度为25-30℃，反应时间为0.5-1小时。

10.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述溶液离心分离所用的离心力为5000-10000g，优选的，溶液离心分离所用的离心力为6000-8000g。