CN116327914A - 纳米硒作为灭活病毒疫苗佐剂的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种纳米硒作为灭活病毒疫苗佐剂的应用。本发明中纳米硒作为灭活病毒疫苗佐剂的应用，是将纳米硒作为佐剂增强灭活病毒的免疫原性，以预防养殖业中出现的多种病毒感染性疾病。本发明利用类生物矿化技术在灭活病毒抗原表面原位生长纳米硒，利用纳米硒的佐剂效应对灭活病毒抗原进行高效呈递，提高灭活病毒疫苗的免疫原性，诱导机体产生强效持续的细胞免疫反应。本发明所得纳米硒佐剂的原料廉价易得，合成和纯化过程简便可控，可通过优化生产工艺，适当扩大合成规模，实现纳米硒疫苗佐剂的商业化应用。

Description

纳米硒作为灭活病毒疫苗佐剂的应用
技术领域
本发明属于纳米硒疫苗领域，尤其涉及灭活病毒疫苗佐剂的应用，以及用于预防养殖业中家畜和家禽的病毒性感染。
背景技术
当前家畜家禽养殖业中，病毒感染性疾病已直接或间接地造成了个人或企业养殖的巨大经济损失。如养猪场出现的猪瘟病毒(CSFV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)，养鸡场出现的新城疫病毒(NDV)，养牛场出现的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)以及养羊场出现的羊边界病病毒(BDV)等。
目前，对这些病毒感染性疾病的主要防治措施是疫苗接种。与传统使用的减毒疫苗相比，灭活病毒疫苗尽管免疫原性较低，但安全性更好，且可以通过引入疫苗佐剂的形式增强灭活病毒疫苗的免疫原性。作为最常用的佐剂，铝佐剂只能增强灭活疫苗的免疫原性，诱导抗体的强效生成，而对触发细胞毒性CD8+T淋巴细胞介导的细胞免疫没有增强作用，而这对于对抗病毒感染至关重要。因此，迫切需要开发安全、经济高效的灭活病毒疫苗增强细胞免疫，从而预防养殖业中出现的多种病毒感染性疾病。
发明内容
针对以上所述现有技术的不足，本发明的首要目的是提供以纳米硒作为佐剂的灭活病毒疫苗的制备方法。
本发明的另一目的在于提供以纳米硒作为佐剂的灭活病毒疫苗。
本发明的再一目的在于提供纳米硒作为灭活病毒疫苗佐剂的应用以预防养殖业中出现的多种病毒感染性疾病。
本发明方案提供纳米硒作为佐剂的灭活病毒疫苗制备方法，包括步骤
(1)制备储备液，取亚硒酸钠和维生素C分别溶于高压灭菌水中，分别制成亚硒酸钠储备液和维生素C储备液；
(2)制备混合溶液，将含灭活病毒抗原加入所述亚硒酸钠储备液中搅拌，再加入高压灭菌水混合后继续搅拌混匀，形成所述混合溶液；
(3)向所述混合溶液中逐滴加入维生素C储备液，并在室温下搅拌使其充分生物矿化，制成含有灭活病毒疫苗的溶液，再进行透析过滤，得到以纳米硒为佐剂的灭活病毒疫苗。
进一步，步骤(1)中所述的亚硒酸钠储备液和维生素C储备液的浓度均为50-400mM。
进一步，步骤(1)中所述的亚硒酸钠储备液和维生素C储备液制成后均需放入2-6度冰箱中低温保存使用。
进一步，步骤(2)所述混合溶液中，亚硒酸钠反应的最终浓度为1-50mM，优选1-30mM；步骤(3)所述含有灭活病毒疫苗的溶液中，维生素C的最终浓度为1-150mM，优选1-100mM。
进一步，步骤(2)包括：将1-2mg灭活病毒抗原和50-400mM的亚硒酸钠储备液加入到0.5-2ml高压灭菌水中，室温下搅拌10-60分钟，再加入0.5-2ml所述纳米硒稳定剂的储备液搅拌混匀1-3小时，形成所述混合溶液。
进一步，所述亚硒酸钠和维生素C按摩尔比为1:2-20，优选1:2-10；所述的亚硒酸钠中所含硒元素与灭活病毒抗原的质量比为1:1-30，优选1:1-20。
进一步，步骤(3)所述的透析过程是采用无菌透析袋在3000-8000kDa条件下，在高压灭菌水中透析12-36小时。
本发明还提供灭活病毒疫苗，通过上述的制备方法制得，是以纳米硒作为佐剂的灭活病毒疫苗。
本发明还提供上述方法制得的以纳米硒作为佐剂的灭活病毒疫苗，在生物医药领域的应用，具体是运用了纳米硒作为抗原载体增强灭活病毒抗原的免疫原性，进而通过调节氧化还原和硒蛋白增强强效的细胞免疫，达到预防养殖业中家禽家畜出现的多种病毒感染性疾病的目的。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：本发明利用类生物矿化技术在灭活病毒抗原表面自然生长纳米硒进行高效呈递，提高灭活病毒疫苗的免疫原性，诱导机体产生强效持续的细胞免疫反应。本发明所得纳米硒佐剂的原料廉价易得，合成和纯化过程简便可控，可通过优化生产工艺，适当扩大合成规模。且纳米硒是一种食品级的物质，生物安全性好，具有更好的临床转化应用前景。
附图说明
图1为本申请实施例中Se@PEDV纳米疫苗的TEM形貌表征图。
图2为本申请实施例中单独PEDV和Se@PEDV纳米疫苗的纳米粒子的水合粒径图。
图3为本申请实施例中单独PEDV和Se@PEDV纳米疫苗的纳米粒子的Zeta电位图。
图4为本申请实施例中单独PEDV和Se@PEDV纳米疫苗在小鼠树突状细胞DC2.4中的摄取。
图5为本申请实施例中单独PEDV和Se@PEDV纳米疫苗在小鼠树突状细胞DC2.4中的定位。
图6为本申请实施例中Se@PEDV纳米疫苗诱导小鼠骨髓源巨噬细胞BMDC成熟度的流式分析图。
图7为本申请实施例中Se@PEDV纳米疫苗第三针免疫7天后小鼠脾脏细胞和血清中的细胞免疫指标如(a)巨噬细胞的吞噬作用、(b)NK、(c)NKT、(d)CD8+T淋巴细胞的表达变化以及血清中(e)TNF-α水平变化和(f)抗体滴度IgG2a和IgG1的比值。
图8为本申请实施例中Se@PEDV纳米疫苗第三针免疫7天后猪血清中炎症因子IFN-γ的表达水平。
图9为本申请实施例中Se@PEDV纳米疫苗第三针免疫7天后猪脾脏中免疫细胞的荧光半定量分析，图9a-f分别为NK细胞,巨噬细胞,γδT细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞和活化的B细胞(浆细胞)的表达情况。
图10为本申请实施例中Se@PEDV纳米疫苗第三针免疫7天后猪肠系淋巴结中免疫细胞的荧光半定量分析，图10a-f分别为NK细胞,巨噬细胞,γδT细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞和活化的B细胞(浆细胞)的表达情况。
图11为Se@PEDV纳米疫苗的粒度与数码高清图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例一，本发明提供的以纳米硒作为佐剂的猪流行性腹泻病毒疫苗的应用，包括以下步骤：
(1)制备亚硒酸钠储备液和维生素C储备液：称取138mg的亚硒酸钠(Na2SeO3)和140mg的维生素C(Vc)分别溶于2mL的高压灭菌水中，各配成浓度为400mM的亚硒酸钠储备液和维生素C储备液，并放于5℃冰箱保存备用。
(2)制备混合溶液：取1mg猪流行性腹泻病毒灭活抗原PEDV加入到1.835mL高压灭菌水中混匀，再滴加33μL亚硒酸钠储备液，反应瓶在室温下磁力搅拌30分钟。
(3)制备Se@PEDV纳米疫苗：随后将132μL维生素C储备液逐滴加入上述混合液中，室温下搅拌2小时使其充分生物矿化，制得含有Se@PEDV纳米疫苗的溶液。
(4)透析：将反应完毕的溶液置于分子量为6000kDa的无菌透析袋中，在高压灭菌水中透析12小时。透析过程中的高压灭菌水需更换3-5次，以充分除去未反应完的亚硒酸钠和维生素C。
(5)保存：最后收集Se@PEDV纳米疫苗于离心管中封口，放于5℃冰箱保存备用。
(6)检测：使用马尔文激光粒度仪测量水合粒径并拍照。按照国家标准方法(GB5009.93-2017)用王水对Se@PEDV纳米疫苗进行消化后，通过电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS测定硒含量，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物，P0010S)测定PEDV的蛋白含量。
(7)实验结果：图11的结果表明，合成后Se@PEDV纳米疫苗的水合粒径约为255nm。制备的Se@PEDV纳米疫苗为澄清透明的红色液体。这些结果表明了PEDV与纳米硒发生相互作用，本实施例成功制备了以纳米硒作为佐剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗。
实施例二，本发明提供的以纳米硒作为佐剂的猪流行性腹泻病毒疫苗的应用，包括以下步骤：
(1)制备亚硒酸钠储备液和维生素C储备液：称取56.2mg的亚硒酸钠(Na2SeO3)和57.24mg的维生素C(Vc)分别溶于2mL的高压灭菌水中，各配成浓度为160mM的亚硒酸钠储备液和维生素C储备液，并放于4℃冰箱保存备用。
(2)制备混合溶液：取1mg猪流行性腹泻病毒灭活抗原PEDV加入到1.835mL高压灭菌水中混匀，再滴加33μL亚硒酸钠储备液，反应瓶在室温下磁力搅拌30分钟。
(3)制备Se@PEDV纳米疫苗：随后将132μL维生素C储备液逐滴加入上述混合液中，室温下搅拌2小时使其充分生物矿化，制得含有Se@PEDV纳米疫苗的溶液。
(4)透析：将反应完毕的溶液置于分子量为5000kDa的无菌透析袋中，在高压灭菌水中透析12小时。透析过程中的高压灭菌水需更换3-5次，以充分除去未反应完的亚硒酸钠和维生素C。
(5)保存：最后收集Se@PEDV纳米疫苗于离心管中封口，放于4℃冰箱保存备用。
(6)检测：使用马尔文激光粒度仪测量水合粒径并拍照。按照国家标准方法(GB5009.93-2017)用王水对Se@PEDV纳米疫苗进行消化后，通过电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS测定硒含量，通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物，P0010S)测定PEDV的蛋白含量。
(7)实验结果比较
(i)实验动物分组
将C57BL/6小鼠(20只，雌性)分生理盐水组、PEDV抗原组、Se@PEDV疫苗组和铝佐剂(铝佐剂+PEDV)组共4组，每组5只。
(ii)给药方式
药物用高压灭菌水分散后，通过皮内注射法，给予每只小鼠150微升的药物。
(iii)实验内容
每只小鼠按PEDV为75μg/只，纳米硒为30μg/只的剂量进行给药。每间隔2周进行一次给药，共给药3次。第三针疫苗注射完后第7天后，通过眼球取血的方式收集小鼠的血清。血样在室温下静置1.5小时后在3000转/分钟的转速和4℃下离心10分钟。将收集的血清转移到500μL的小型EP管中，并将收集到的血清于-80℃保存。
将PEDV按照10μg/mL，100μL/孔的量铺于96孔板中，4℃过夜。次日取出96孔板，弃去上清，拍干后用PBST(含0.5％吐温20的PBS)进行洗涤，5分钟/次，洗涤4次。将板用1％BSA溶液封闭至每个孔并在室温下振荡孵育2小时。PBST洗板3次后，取100μL系列稀释的血清样品(如100-、200-、400-、800-、1600-、3200-、6400-、12800-、25600-、51200倍稀释)加入孔中，室温下孵育2小时。然后，用PBST洗板3次，每孔加入100μL10000倍稀释的HRP偶联山羊抗小鼠IgG1或IgG2a抗体(Abcam，Cambridge，USA)溶液室温下摇晃孵育1小时。PBS-T洗板3次后，每孔加入100μL新鲜混合的TMB底物溶液(BD，SanDiego，USA)，避光孵育10min。最后用1NH2SO4溶液终止反应，记录450nm处的吸光度，用酶标仪检测PEDV特异性抗体滴度。
(iv)实验结果
图1-3的结果表明，单独的PEDV水合粒径大小为116.94nm，生物矿化后Se@PEDV纳米疫苗的水合粒径从116.9nm增加到266.4nm，表面电荷在经过PEDV修饰后从-12.1mV降低到-31.2mV。制备的Se@PEDV纳米疫苗的水合粒径大小与TEM电镜结果一致。这些结果表明了PEDV与纳米硒发生相互作用，本实施例成功制备了以纳米硒作为佐剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗。
为了进一步验证该Se@PEDV纳米疫苗的活性，通过皮内注射对C57BL/6小鼠的免疫原性进行监测。图7a-e表明，与单独的PEDV抗原组相比，Se@PEDV纳米疫苗能增强巨噬细胞的吞噬作用，上调免疫细胞NK、NKT、CD8+T淋巴细胞的表达以及血清中TNF-α的水平。同时，如图7f所示，与商业化的铝佐剂组相比，IgG2a与IgG1的比率证实了Se@PEDV纳米疫苗能触发独特的Th1偏向性的细胞免疫。
相比于作为疫苗佐剂的其他纳米材料如铝佐剂等，纳米硒可通过增强抗原向免疫系统的递送以及通过增强先天性和适应性免疫反应来提供佐剂活性。同时，由于与硒酸盐(Se4+)或亚硒酸盐(Se2+)相比，纳米尺寸的硒(Se0)的毒性较低，因此硒纳米颗粒(SeNPs)是替代营养补充剂或药物剂型中其他形式硒的有力候选者。更重要的是，SeNPs可以在体内转化为硒蛋白，一些硒蛋白参与细胞活化和分化，对先天性和适应性免疫反应很重要。
据有关研究表明，补硒对牲畜的健康和免疫系统功能具有重要作用。补充硒可通过抑制滤泡辅助T(TFH)淋巴细胞铁死亡，有效增强流感疫苗接种后的体液免疫。发明人在前期研究中发现，功能性硒纳米颗粒(functionalSenanoparticles,SeNPs)可以通过调控CIK和肿瘤细胞中的硒蛋白，有效增强细胞因子诱导的杀伤细胞对肿瘤细胞的细胞毒性，促进γδT细胞等适应性免疫细胞消除肿瘤细胞。这些证据表明，具有氧化还原调节和免疫增强特性的纳米硒是开发针对灭活病毒疫苗的理想佐剂。
目前，还尚未有文献报道纳米硒在灭活病毒疫苗领域的应用。以猪流行性腹泻病毒(PEDV)为例，发明人前期发现采用纳米硒作为PEDV灭活病毒的佐剂，可以显著增强单独PEDV灭活病毒的免疫原性，同时硒能在机体内代谢为硒蛋白，维持机体内的氧化还原水平，诱导强效持久的细胞免疫反应。发明人研究发现，与单独的PEDV抗原组相比，Se@PEDV疫苗组能促进小鼠骨髓源性巨噬细胞BMDC更高的成熟度，诱导小鼠体内产生更高的IgG1和IgG2a抗体滴度。并且，在猪的脾脏和肠系膜淋巴结中，Se@PEDV疫苗组能上调多种免疫细胞(如NK细胞,巨噬细胞,γδT细胞,CD4+T细胞,CD8+T细胞以及活化的Bcells)的表达。
实施例三，纳米硒作为猪流行性腹泻病毒灭活疫苗佐剂促进DC2.4细胞的摄取与细胞定位
PEDV首先用N-羟基琥珀酰亚胺端异硫氰酸荧光素FITC-NHS标记。同时，FITC标记的灭活PEDV(PEDV-FITC)被用于合成荧光标记的Se@PEDV纳米疫苗(Se@PEDV-FITC)。然后，DC2.4细胞用PBS、PEDV-FITC和Se@PEDV-FITC纳米疫苗处理6小时，后两组PEDV工作浓度为10μg/mL。随后，收集不同处理的DC2.4细胞，并使用流式细胞术测定法和FlowJo软件分析来确定细胞摄取。如图4所示，DC2.4细胞对Se@PEDV纳米疫苗的摄取明显高于单独的PEDV抗原组，证明纳米硒佐剂能增强PEDV抗原的摄取。
至于细胞定位，不同处理组的DC2.4细胞用PBS缓冲液洗涤3次，然后用溶酶体探针LysoTrackerRedDND-99和细胞核染料Hoechst33342一起孵育。最后，使用共聚焦激光扫描显微镜观察细胞并拍照。如图5所示，荧光图片观察到DC2.4细胞对Se@PEDV纳米疫苗的摄取明显高于单独的PEDV抗原组，并定位在溶酶体中，与图4的结果一致。
实施例四，纳米硒作为猪流行性腹泻病毒灭活疫苗佐剂诱导BMDC细胞成熟的研究
首先，通过将来自雌性C57BL/6小鼠(6-8周龄)股骨和胫骨骨髓的单分散细胞在含有10％胎牛血清、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF，20ng/mL)和β-巯基乙醇(5ng/mL)的RPMI1640培养基中培养，获得骨髓来源的树突状细胞(BMDCs)，持续培养6-8天。
然后，分别用PEDV(10μg/mL)、Se@PEDV纳米疫苗(10μg/mLPEDV)或脂多糖(LPS，1μg/mL，作为阳性对照组)处理BMDC细胞12小时。之后，用荧光标记的抗体(包括CD11c-FITC、CD86-APC-Cy7和CD80-PE)对细胞进行染色，以评估BMDC的成熟度，并使用流式细胞术进行分析。如图6所示，与未处理组(即对照)相比，单独灭活的PEDV抗原组对BMDC成熟(CD80和CD86作为成熟的典型标志物)没有表现出明显的激活，表明其免疫原性较低。但Se@PEDV纳米疫苗可以高效地诱导BMDC成熟。
实施例五，本发明提供的以纳米硒为佐剂的猪流行性腹泻病毒灭活疫苗对猪的免疫原性的调控
(1)实验分组
为了评估所开发的纳米疫苗对猪的免疫原性，9头母猪(长白猪，30公斤)被分为3组，即生理盐水组(对照组)、Se@PEDV疫苗组和商业化铝佐剂(铝佐剂+PEDV)组。
(2)给药方式
肌肉内注射，间隔2周给药一次，共注射3次。控制Se@PEDV疫苗组和商业化铝佐剂(铝佐剂+PEDV)组中PEDV剂量为1mg/只，硒含量剂量为0.4mg/只。
(3)实验内容
给药完成后，在最后一次免疫后第7天处死免疫猪，收集脾脏、肠系膜淋巴结和血清用于随后的免疫学分析。即采用免疫荧光染色法测定Se@PEDV纳米疫苗对猪脾脏和肠系膜淋巴结中NK、巨噬细胞、γδT细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞和活化的B细胞(浆细胞)的影响。同时，采用ELISA法测定免疫猪血清中的IFN-γ水平。
如图8所示，与商业化铝佐剂组疫苗接种相比，Se@PEDV纳米疫苗可以有效提高免疫猪血清中IFN-γ的水平。图9-10结果表明，在脾脏和肠系膜淋巴结中，Se@PEDV纳米疫苗确实能诱导更多的先天免疫相关免疫细胞(包括NK细胞和巨噬细胞)和细胞免疫相关细胞(包括γδT细胞、CD4+和CD8+T细胞)的增殖。至于体液免疫，用Se@PEDV纳米疫苗免疫的猪的脾脏或肠系膜淋巴结中的浆细胞数量与商业化铝佐剂组疫苗相当。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.纳米硒作为灭活病毒疫苗佐剂的应用。
2.一种以纳米硒为佐剂的灭活病毒疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备储备液，取亚硒酸钠和维生素C分别溶于高压灭菌水中，分别制成亚硒酸钠储备液和维生素C储备液；
(2)制备混合溶液，将含灭活病毒抗原加入所述亚硒酸钠储备液中搅拌，再加入高压灭菌水混合后继续搅拌混匀，形成所述混合溶液；
(3)向所述混合溶液中逐滴加入维生素C储备液，并在室温下搅拌使其充分生物矿化，制成含有灭活病毒疫苗的溶液，再进行透析过滤，得到以纳米硒为佐剂的灭活病毒疫苗。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述亚硒酸钠和维生素C按摩尔比为1:2-10，所述亚硒酸钠中所含硒元素与灭活病毒抗原的质量比为1:1-20。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述亚硒酸钠储备液和维生素C储备液的浓度均为50-400mM。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)所述混合溶液中，亚硒酸钠的最终浓度为1-50mM；步骤(3)所述含有灭活病毒疫苗的溶液中，维生素C的最终浓度为1-150mM。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)所述的透析过程是采用无菌透析袋在3000-8000kDa条件下，在高压灭菌水中透析12-36小时。
7.根据权利要求2-6任一项制备方法制得的以纳米硒为佐剂的灭活病毒疫苗。
8.纳米硒作为佐剂在制备灭活病毒疫苗中的应用，该灭活病毒疫苗用于预防养殖业中家禽家畜的病毒性感染。
9.根据权利要求8所述应用，其特征在于，该灭活病毒疫苗具体用于预防猪流行性腹泻病毒。
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