CN108456241A - 多孔框架材料用于生物制品的储运和制备 - Google Patents

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Abstract

本申请针对某些生物制品稳定性差、无法常温储运，在灾害等紧急情况下难以妥善保存、方便使用等问题，创新性地将多孔框架材料应用于生物分子的保存，提高其稳定性等性能。利用多孔框架材料与生物分子形成多孔框架材料/生物分子复合物，对生物分子进行包裹，从而达到保护的效果。在保持生物分子活性的前提下，该系统可实现多孔材料与生物分子的高效分离和回收。在开发出这一生物制品保护体系的同时，我们全面检测和评估了各项性能，解决了合成、保存、释放等技术问题，并实现了良好的技术效果，可以有效保护生物分子，用于生物制剂的储运和新型制剂的制备。

Description

多孔框架材料用于生物制品的储运和制备
技术领域
本发明涉及材料化学和分子生物学、免疫学，尤其是涉及多孔框架材料在生物制品储运与递送方面的应用。
背景技术
随着生物技术的不断发展，生物制品在疾病的诊断、治疗等领域发挥了日益重要作用。但是一些疫苗、抗体、常规蛋白、酶等生物制品容易受外界因素的影响，失去活性，例如疫苗、抗体、蛋白药物等对温度十分敏感，需要低温稳定的储运条件。为了保证低温，在储运中要配备很多专业设备，并消耗大量人力物力，同时也限制了这些生物制品的应用范围和途径。此外，由于生物制品对环境十分敏感，其他物理、化学作用和污染也会引起其活力的下降，如机械力、溶剂、化学品等。我国面积广大，气候地理状况差异极大，同时各地发展不均衡，不能保证所有生物制品在各个环节都能得到绝对妥善的运输和保藏。因此亟需高效的保护手段在不影响生物制品活性的前提下，降低外界环境变化对其影响。从而极大提高生物制品的使用效率和范围，降低储运成本。
多孔框架材料（如金属-有机框架材料，MOF；共价有机框架材料，COF；氢键有机框架材料，HOF等）是近年来迅速发展的新一代多孔材料。它们凭借高比表面积、高孔道率，孔道大小容易调控等性能，在气体吸附与分离、感应器、催化等等方面的应用发展迅速。多孔框架材料具有很好的结晶性、确定的空间结构和孔道环境，可以清楚地研究和分析材料与其所吸附/负载、释放的客体分子间的相互作用和相关机理，这些非凡性能使得多孔框架材料在生物医药领域的应用价值开始引起关注。目前多孔框架材料在生物领域的应用多集中于生物传感器与固定化酶。经多孔框架材料固定、包裹的酶类的稳定性得到了了提升。本项目经过系统深入地研究蛋白、疫苗等生物分子与多孔框架材料的相互作用机制和制备方法等，设计开发出可以应用于生物制剂保护的新技术，可以在较苛刻的环境中（如高温、机械力、化学试剂污染等）使生物分子保持其活性，并且可用于生物制剂的常温储运。此外，本发明可以简便快捷的将生物制剂进行可控性高效释放而发挥其作用。本发明首次研究和发展了多孔框架材料在保存生物分子中的创新性应用，并全面检测和评估了各项性能，解决了合成、保存、释放等技术问题，并实现了良好的技术效果，具有广阔的应用前景。
常见生物制品多为蛋白质类生物分子，而蛋白质因其结构不同，其环境稳定性也各不相同。但其发生降解以及功能降低的原因主要可以归结为以下几点：1）蛋白质的特定残基天冬酰胺和谷氨酰胺，在一定的环境中发生脱酰胺作用，变为天冬氨酸和谷氨酸，造成功能的丧失。2）二、三级结构发生改变。3）由于蛋白质的特性，其中存在有较高灵活度的主链或支链，相对刚度较高的蛋白质，极易出现肽段的断裂。在机械力、pH值改变、温度变化等条件下，蛋白质容易发生降解和聚集。而经晶体材料包裹，可有效隔离外界环境，并对蛋白质结构域进行固定。
本项目旨在提供一种新型技术，解决生物制品的常温储运以及递送等应用，此技术简便高效、成本较低，可显著提高生物制品对于温度变化、机械力和化学品的稳定性。通过提高生物分子的稳定性，可有效降低其保存难度和成本，同时由于生物分子-多孔材料复合物对机械力较强的耐受力，可以根据需要加工为各种形态，建立试剂盒、便携送药体系等。有着宽广的应用前景。
发明内容
本申请针对制备易于储运、递送、便携、便于使用的生物制品（包括蛋白质、抗体、病毒、疫苗、酶等生物制品），创造性地利用多孔框架材料（如金属-有机框架材料，MOF；共价有机框架材料，COF；氢键有机框架材料，HOF等）与生物分子形成生物分子-多孔框架材料复合物，从而保护生物制品耐受较为恶劣的环境（如机械力、抑制剂、化学试剂等的作用，以及溶剂、温度、pH、湿度等的变化），提高其稳定性。同时，该技术的一些体系可根据需要，在特定环境下可释放包裹的生物分子。本发明解决了生物制品储存、运输和使用中的关键难题，对生物制品具有良好的稳定效果，降低其储运成本，同时可方便取用生物制品，并可根据需要对生物分子进行释放。此外，此技术大大提高生物制剂的机械加工性能和稳定性，为进一步加工生物制剂提供新的解决方案。
优选地，多孔框架材料，可以为金属-有机框架材料（Metal-Organic Frameworks,MOFs）。金属-有机框架材料是由金属离子（或金属簇）以及具有特定官能团和形状的有机配体来合成，因此可以根据需要来设计合成孔道尺寸和形状合适的、高比表面积和高孔道率的、具有良好热和溶剂稳定性的MOFs材料。如：ZIF-8、ZIF-90、ZIF-11、ZIF-100、Tb-BDC、Eu-BDC、PCN-333、MIL-88A、HKUST-1，MIL-101，MIL-100，MIL-53，PCN-777，Tb-mesoMOF，PCN-222等。
优选地，多孔框架材料，可以为共价有机框架材料（Covalent OrganicFrameworks, COFs）。共价有机框架材料是由有机构建单元（配体）通过共价键连接形成的结构有序的有机多孔材料，具有高比表面积、较高孔道率、孔径规则并容易调控、结构灵活、易于功能化
等特性，并具有优异的热稳定和化学稳定性。如：PI-1-COF、PI-2-COF、TTI-COF，COF-OMe，COF-OH等。
优选地，多孔框架材料，可以为氢键有机框架材料（Hydrogen-Bonding OrganicFrameworks, HOFs）。氢键有机框架材料是由有机构建单元（配体）通过氢键连接形成的结构有序的有机多孔材料。HOFs具有高比表面积、孔径规则易于调控、结构灵活多变等特点。COFs和HOFs都可以根据需要来设计合成孔道尺寸和形状合适的、高比表面积的、具有良好热和溶剂稳定性的载体材料。
多孔框架材料的结构具有明确性、灵活性和可调控性的特点，经过长期实验摸索我们对部分多孔框架材料的合成过程进行了优化，如缩短反应时间，拓展反应温度的范围，并简化了操作流程。提供的策略具有操作简单、条件温和、稳定性好、有较好的生物制品回收率，所需原料易得等特点。
本发明中，生物分子与多孔框架材料形成生物分子-多孔框架材料复合物。可由本应用进行保护的生物分子，包括但不限于蛋白质、抗体、病毒、疫苗、酶、多肽、核酸等。
用于生物制品保存中的应用的多孔框架材料，其特征在于，多孔框架材料的反应体系可与生物分子形成复合物，而不会破坏其活性。
优选地，根据需要，多孔框架材料可在特定环境（如特定pH值、特定溶液、特定温度等）中温和的释放生物分子。其特征在于，某些多孔框架材料可在不影响生物分子活性的环境中进行分解，并且生物分子可通过但不限于超滤、分子筛、蛋白凝胶电泳等常见理化手段进行分离。特征也可以在于，某些多孔框架材料可以温和的释放生物分子，但是不破坏多孔框架材料的结构。
优选地，本应用所选用的多孔框架材料可以与生物制品形成复合物而提高生物制品的稳定性，提高其对于各种环境变化的耐受性，如机械力、抑制剂、化学试剂等的作用，以及溶剂、温度、pH、湿度等的变化。
优选地，其中以多孔框架材料保存的生物制品的稳定性与传统的生物制品保存方式相当，或优于传统方式，其中传统保存方式为冻干、使用稳定剂后低温冻存等方式。
本发明将多孔框架材料与一些生物制品（如：抗体、酶、疫苗、蛋白等）形成复合物进行生物制品的保存。该复合物由生物分子与多孔框架材料构成，部分复合物可在特定环境（如特定pH值、特定溶液，特定温度）中可以释放。大大提高了生物产品的稳定性和对不佳环境的耐受性以及良好的可加工性，可成为生物制品的新型剂型，有利于降低生物制品的储运成本，利于生物制剂的广泛应用。
优选地，多孔框架材料与生物分子形成复合物的方式，包括但不局限于框架材料前体与生物分子“一锅法”反应，形成生物分子-多孔框架材料复合物；或者是已形成的多孔框架材料通过吸附、共价、包埋、交联等方式将生物分子进行包裹保护。
与此同时，我们筛选了多种具有良好的生物相容性和较低的生物毒性的多孔框架材料。而本应用中在溶解材料后分离溶解液与生物分子的策略进一步降低了材料可能存在的生物安全风险。
附图说明：
图1 ：从MOF-1/human IgG复合物和MOF-1/GOx复合物中回收包裹的IgG抗体和GOx酶的回收率结果图。
图2、3、4 ：经处理的MOF-1/goat anti-BSA IgG复合物中释放的goat anti-BSAIgG与经处理的游离的goat anti-BSA IgG的结合活力的比较图。
图5、6 ：MOF-1/GOx复合物中释放的GOx与游离GOx的初始速率比较图和转化率比较图。图7为摘要附图，为本发明的原理示意图。
具体实施方式：
除非本申请上下文中另有其他说明，否则本申请中所用技术术语及缩写均具有本领域技术人员所知的常规含义；除非另有说明，否则下述实施例中所用原料化合物均为商购获得。
按照本发明所提到的，多孔框架材料的合成、各种性能的表征测试及其对活性物质的活性测试的方法，其具体实施方式如下。下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。
使用本发明中的方法处理疫苗、抗体，溶解后给小鼠使用，与对照组进行比较。实验表明，该方法的溶解体系对生物体有很好的安全性，没有出现不良反应。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的基于多孔框架材料的生物制品储运的制剂及其制备和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
实施例1：
MOF-1/ human IgG复合物的制备：
将含有50uL溶解有10mg/mL Human IgG 的PBS溶液，与200μL的200mM 2-咪唑类水溶液混合，混匀，再向蛋白-咪唑类水溶液中加入40mM 250μL锌离子水溶液。将该体系放入4℃，放置10分钟。反应结束后，将反应混合物以6000rmp离心，弃上清液，得到白色固体，经-80℃预冻，之后冻干8h。反应获得的 MOF-1/ human IgG复合物粉末X射线衍射图及傅里叶红外变换光谱图，证明获得MOF-1材料，human IgG抗体已被包裹进MOF-1内部。
MOF-1/GOx复合物的制备：
将含有5mg的GOx（葡萄糖氧化酶）溶解于2.5mL 160Mm的咪唑类溶液混合，混匀，再向GOx-咪唑类水溶液中加入40mM 2.5mL锌离子水溶液。将该体系放入4℃，放置12小时。反应结束后，将反应混合物以6000rmp离心，弃上清液，得到白色固体，经-80℃预冻，之后冻干8h。反应获得的MOF-1/GOx复合物粉末X射线衍射图及傅里叶红外变换光谱图, 证明获得MOF-1晶体结构，GOx已被包裹进MOF-1内部
MOF-2/ human IgG复合物的制备：
将含有1mg human IgG 溶于500uL的0.16M 的咪唑类水溶液混合，混匀，再向溶液中加入0.04M 500uL锌离子水溶液。搅拌20min。反应结束后，将反应混合物以14000g离心，弃上清液，得到固体，经室温晾干，得到复合物晶体。反应获得的MOF-2/ human IgG复合物粉末X射线衍射图与傅里叶红外变换光谱图，证明获得MOF-2晶体结构，human IgG抗体已被包裹进MOF-1内部
实施例2：
从MOF-1/goat anti-BSA IgG复合物和MOF-1/GOx复合物中回收包裹的IgG抗体和GOx酶的实验：将回收冻干后的MOF-1/goat anti-BSA IgG复合物和MOF-1/GOx复合物，加入与其反应体系相同的20mM EDTA溶液混合，反应15分钟之后，使用掌心离心机短暂离心5秒，使用超滤管，以10000g超滤10-20分钟（具体时间需考虑该蛋白生物制品的浓度、分子量与所使用的超滤管滤膜的孔径）。超滤结束后，使用1×PBS洗涤超滤膜回收抗体。使用A280法检测回收的抗体的浓度，获得回收量数据。计算后与原本加入的抗体总量进行比较。最终回收率不低于80%。回收率=回收的生物制品量/体系中初始加入的生物制品量x100%。回收率实验结果见图1，由图1可见，本应用开发的方法对IgG抗体与酶都有较好的回收率。
实施例3：
抗体保护性检测。goat anti-BSA IgG溶液（0.5mg/ml）及goat anti-BSA IgG/MOF-1复合物通过3种不同的加速应力方法产生聚集体及降解。在1.5ml反应管中在75℃下孵育20分钟来进行热应激。金属的催化的氧化：将待测抗体样品和8mM的抗坏血酸和0.08mM的CuCl2在室温下反应3h。机械力：将goat anti-BSA IgG/MOF-1复合物使用20MPa压力进行挤压。
实施例4：
使用体积排阻色谱HPLC进行经过实施例3中几种处理后的抗体和复合物中抗体的分子量检测。使用pH7.1的100mM磷酸钠和100mM硫酸钠缓冲液洗脱，加样200μL，以0.5ml / min的流速分离。紫外检测在280nm进行，而多角度激光散射（MALLS）检测是在658nm下使用50-nW固态激光器工作的18角检测器进行的。使用1.69（ml mg-1 cm-1）的消光系数，0.185（ml/ g）的dn / dc和第二维里系数为0。使用UV信号的AUC来计算片段，单体，寡聚体，蛋白回收和总聚集的百分比。对于相对的蛋白质回收率，将应激样品的总AUC与未应激样品的总AUC（其设定为100％）进行比较。总聚合百分比不仅考虑低聚物的AUC，而且还考虑未被回收的蛋白质的百分比，其通常包含太大而不能进入柱的聚集体。
实验结果见表1
表1
由表1可知经多孔框架材料包裹并进行释放的IgG并没有发生裂解或聚合，可知与多孔框架材料形成复合物并在复合物分解后回收的过程并没有对抗体的宏观结构产生明显影响，抗体未发生聚集
实施例5：
从MOF-1 / goat anti-BSA IgG 复合物中释放的抗体的结合能力实验：用100ng/孔的BSA包被酶标板，4℃过夜，使用碳酸盐缓冲液作为包被液，50μL/孔，洗板机洗板5 遍，洗液为含0.05% Tween的PBST。用3% BSA-PBS 封闭液37℃封闭2 h，洗板5 遍。以1% BSA-PBS 作为稀释液，加入稀释好的goat anti-BSA IgG，50 μL/孔，37℃放置1 h，洗板5 遍。加入1：5000 稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的rabbit anti goat IgG，50 μL/孔，37℃放置45min，洗板5遍。加入ABTS 显色液，检测OD 415nm根据OD 值，绘制goat anti-BSA IgG特异性抗体与BSA的结合活性图。
实验结果见图2-4。
由图2，MOF-1 / goat anti-BSA IgG 复合物经75℃加热20分钟后与未经处理的goat anti-BSA IgG的进行结合活性的比较。可知与多孔框架材料复合物经75℃加热20分钟后释放的抗体的结合活力没有受到明显影响。
由图3，MOF-1 / goat anti-BSA IgG 复合物使用金属氧化物处理3小时后与未经处理的goat anti-BSA IgG的进行结合活性的比较。可知与多孔框架材料形成复合物金属氧化物处理3小时后释放的抗体的结合活力没有受到明显影响。
由图4 MOF-1/goat anti-BSA IgG复合物使用20MPa压力进行挤压后与未经处理的goat anti-BSA IgG的进行结合活性
的比较。可知与多孔框架材料形成复合物经20MPa机械压力后并后释放的抗体的结合活力没有受到明显影响。
实施例6：
比较从MOF-1/GOx复合物中释放的GOx与未经MOF-1包裹的GOx的活性：使用实施例2中的方法对MOF-1/GOx复合物中的GOx进行回收。对复合物中的GOx和游离的GOx进行定量，将10μg的两种GOx分别加入反应液（100μL 10%葡萄糖溶液、1μg 辣根过氧化物酶、30μL 5mM间苯三酚溶液）并以PBS将体系加之3mL进行反应，检测420nm处的吸收值。分别记录反应前60s的反应初速度和反应停止后的总转化量，进行比较。结果见图5、6。由图5可见经多孔框架材料包裹并进行释放的GOx的反应初反应速率略低于未经包裹的GOx。可知与多孔框架材料形成复合物并在复合物分解后回收的过程对酶GOx的初反应速率有轻微影响。由图6可见经多孔框架材料包裹并进行释放的GOx与未经包裹的GOx有近似的转化率。可知与多孔框架材料形成复合物并在复合物分解后回收的过程并没有对酶GOx的转化率产生明显影响。

Claims (10)

1.本发明针对制备易于储运、递送、便携、便于使用的生物制品，将多孔框架材料应用于生物制品的保护、储运和制备，其特征在于，利用多孔框架材料与活性生物分子形成生物分子-多孔框架材料复合物，从而保护生物分子，提高生物制品的稳定性和对环境变化的耐受性。同时该技术的一些体系可根据需要释放出生物分子。此技术可解决生物制品储存、运输和使用中的关键难题。
2.根据权利要求1所述的应用，其中多孔框架材料包括但不限于金属-有机框架材料（MOFs）、共价有机框架材料（COFs）及氢键有机框架材料（HOFs）。
3.根据权利要求1 所述的应用，其特征在于，应用于保存生物制品时，可保存的生物制品包括但不限于：抗体、酶、肽、疫苗、核苷酸、假病毒、病毒等。
4.根据权利要求1 所述的应用，其特征在于，多孔框架材料与生物分子形成复合物的方式，包括但不局限于框架材料前体与生物分子“一锅法”反应，形成生物分子-框架材料复合物；或者是已形成的框架材料通过吸附、共价、包埋、交联等方式将生物分子进行包裹保护。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，通过多孔框架材料与生物分子形成复合物的形式，进而制备易于储存、运输、递送、便携、便于使用的生物制品。
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，多孔框架材料在储运和递送生物分子应用中的具有良好的可行性和兼容性，可以有效保护生物分子，提高生物制剂的稳定性。并解决生物制品储存、运输和使用中的关键难题，降低其储运成本，扩大其应用范围。
7.根据权利要求1、4所述的应用，其特征在于，生物分子与多孔框架材料形成的生物分子-多孔框架材料复合物，可以有效地提高生物分子的稳定性，保护生物制品耐受恶劣的环境，如机械力、抑制剂、化学试剂等的作用，以及溶剂、温度、pH、湿度等的变化。
8.根据权利要求1、4所述的应用，其特征在于，生物分子与多孔框架材料形成的部分生物分子-多孔框架材料复合物，可在特定环境（如特定pH，特定温度，特定溶液，特定处理方法）中释放。因此可用来制备生物制品的新剂型，并解决相关的（如载体的）生物兼容性问题，利于生物制剂的广泛应用。
9.根据权利要求1、4、7、8所述的应用，其特征在于可利用此技术提高生物制剂稳定性和机械加工性能，从而制备相关产品，包括但不限于生物制品保存试剂盒、便携式药物；或开发新剂型，包括但不限于新型药物递送系统、注射器材等。
10.根据权利要求2所述，用“一锅法”制备多孔框架材料与生物分子复合物时，多孔框架材料可选自MOFs，如:ZIF-8，ZIF-11，ZIF-90，MIL-53等；用已形成的多孔框架材料通过吸附、共价、包埋、交联等方式得到框架材料与生物分子复合物时，多孔框架材料可选自COFs，如PI-1-COF、PI-2-COF、TTI-COF，COF-OMe，COF-OH； MOFs材料，如:HKUST-1，MIL-101，MIL-100，MIL-53，PCN-777，Tb-mesoMOF，PCN-222以及HOFs.材料。
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