CN1814286A - 乙型肝炎－戊型肝炎联合疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙型肝炎－戊型肝炎联合疫苗(乙－戊肝联合疫苗)，包括戊型肝炎病毒(HEV)重组蛋白以及重组乙型肝炎病毒表面抗原(重组HBsAg)，所说的重组HBsAg含量为50－500μg/ml，HEV重组蛋白的含量为50－500μg/ml。及乙－戊肝联合疫苗的制备方法：(a)在制备最终的乙－戊肝联合疫苗之前，将重组HBsAg吸附于氢氧化铝凝胶，将HEV重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶，调整pH至5.5－9.6；(b)将调整了pH的上述组份混合。使用联合疫苗，则可以大大降低疫苗成本，因此具有显著的优越性。
Description
技术领域
本发明涉及一种联合疫苗及其制备方法，特别是涉及乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗(乙—戊肝联合疫苗)及其制备方法。
背景技术
病毒性肝炎是由多种肝炎病毒引起的以肝脏损害为主的急性或持续性传染病，在世界各地均有流行。乙型肝炎(乙肝)是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所致，广泛流行于世界各地，我国是乙肝的高流行区，全国有1.2亿多人为HBV携带者，每年新发病人多达900多万。自1985年全国开展乙肝疫苗接种以来，在免疫儿童中乙肝病毒携带率已由10％左右降低为1％左右；1991年，WHO将乙肝疫苗接种纳入扩大免疫计划，对婴儿和成人实施普遍的免疫接种；我国于1992年将乙肝疫苗的免疫接种纳入国家计划免疫项目。实践证明，如同其它疫苗可预防疾病一样，接种乙肝疫苗是预防和控制乙肝传播和流行的有效措施。
戊型肝炎(戊肝)是经粪-口途径传播的急性病毒性肝炎，由戊型肝炎病毒(HEV)感染所致。1986-1988年我国新疆发生戊肝大流行，是世界上最大的一次戊肝爆发性流行，12万余人受到感染。据我国2004年的统计报告表明，在各种肝炎的发病率中，戊肝发病率有上升趋势。然而，由于HEV细胞培养非常困难，因此目前难以研制灭活疫苗或减毒活疫苗，国内外的研究大都集中于通过基因重组技术来研制基因工程亚单位疫苗。
含有两种或两种以上抗原、可以预防两种或两种以上疾病的联合疫苗的研究一直受到众多学者关注，并以其方便、多效、低成本成为新一代疫苗研究的热点。与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存、销售乃至全部使用过程均需在较低温度下进行，即所谓的“冷链”，这种环环相扣的冷链运作，费用极高，使疫苗成本居高不下。而使用联合疫苗，则可以大大降低冷链运作的费用，因此具有显著的优越性。百日咳-白喉-破伤风三联疫苗在计划免疫中已使用多年即为一成功之例。近年来一些新的联合疫苗如甲肝和乙肝联合疫苗也已经获得专利(欧洲专利0339667)。但是，同作为病毒性肝炎的乙肝和戊肝的联合疫苗，迄今为止其研制在国内外尚未见报道。
发明内容
本发明提供一种方便、多效、低成本、并能够有效预防人及动物乙肝和戊肝的乙—戊肝联合疫苗及其制备方法。
本发明采用如下技术方案：
一种乙—戊肝联合疫苗，包括HEV重组蛋白以及重组HBsAg，所说的重组HBsAg含量为50-500μg/ml，HEV重组蛋白的含量为50-500μg/ml。
一种用于制备上述乙—戊肝联合疫苗的方法：
(a)在制备最终的乙—戊肝联合疫苗之前，将重组HBsAg吸附于佐剂氢氧
化铝凝胶，将HEV重组蛋白吸附于佐剂氢氧化铝凝胶，调整pH至5.5-9.6；
(b)将调整了pH的上述组份混合。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明的联合疫苗可以有效的用于预防人及动物的乙肝和戊肝。动物实验表明，乙—戊肝联合疫苗的免疫效果明显优于单价疫苗，因此本发明提供的联合疫苗具有比单价疫苗更好的免疫原性。
与单一疫苗相比，联合疫苗可以减少疫苗的接种次数，避免因漏种而不能得到全程免疫；另外，疫苗大多不耐热，其生产、运输、储存、销售乃至全部使用过程所需的“冷链运作”，费用极高。而使用联合疫苗，则可以大大降低疫苗成本，因此具有显著的优越性。
由于本发明的联合疫苗中使用了经充分证明具有良好安全性及免疫原性的乙肝疫苗，所以能够大大降低联合疫苗的生产成本和市场价格。
本发明也提供了联合疫苗的贮藏方法，包括将明胶加入乙-戊肝联合疫苗，或使用硅涂层的玻璃瓶作为联合疫苗的贮藏瓶。优选明胶的浓度范围为0.5-0.7w/v％。
本发明的乙-戊肝联合疫苗中，使用的氢氧化铝凝胶可以购买或采用已知方法进行制备。该类佐剂为本领域技术人员所熟知的，易于获得和制备。
根据本发明联合疫苗的优选实施方案，联合疫苗中所含的重组HBsAg含量为50-500μg/ml，HEV重组蛋白的含量为50-500μg/ml，氢氧化铝凝胶浓度为0.6-1.5mg/ml。
动物实验表明，根据本发明联合疫苗的优选实施方案制备的乙-戊肝联合疫苗能够诱导机体产生针对HBV和HEV的高滴度、特异性抗体，特别是乙—戊肝联合疫苗的免疫效果明显优于单价疫苗，因此本发明提供的联合疫苗具有比单价疫苗更好的免疫原性。
具体实施方式
实施例中乙-戊肝联合疫苗以HBV-HEV或HBV-HEV联合疫苗表示。
实施例1
一种乙—戊肝联合疫苗，包括HEV重组蛋白以及重组HBsAg，所说的重组HBsAg含量为50-500μg/ml，HEV重组蛋白的含量为50-500μg/ml。
本实施例还包括免疫佐剂，该免疫佐剂为氢氧化铝凝胶溶液，氢氧化铝凝胶的浓度范围调整为0.6-1.5mg/ml。
上述重组HBsAg是由酵母细胞，哺乳动物细胞，或其他可用细胞表达的基因工程重组蛋白，其特征在于包括任何HBV的HBsAg或其片断，其优选的序列为HBsAg S抗原的226个氨基酸序列(见Tiollais等，Nature，317,489(1985))。HEV重组蛋白的氨基末端位于戊型肝炎病毒开放阅读框架2编码的380位至480位氨基酸之间，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之间或由此氨基酸产生的衍生物，其所述的序列为：
RGIALTLFNLADTLLGGLPTELISSAGGQLFYSRPVVSANGEPTVKLYTSVENA
QQDKGIAIPHDIDLGESRVVIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWL
SLTAAEYDQTTYGSSTNPMYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRP
LMTIQQYSKTFFVLPLRGKLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHR
VCISTYTTNLGSGPVSISAVGVLAPHSALAALEDTVDYPARAHTFDDFCPECR
ALGLQ
优先选用第453位至631位氨基酸序列(p179)。其所述的序列如下：
VIQDYDNQHEQDRPTPSPAPSRPFSVLRANDVLWLSLTAAEYDQTTYGSSTNP
MYVSDTVTFVNVATGAQGVSRSLDWSKVTLDGRPLTTIQQYSKTFYVLPLRG
KLSFWEAGTTKAGYPYNYNTTASDQILIENAAGHRVCISTYTTNLGSGPVSISA
VGVLAPHSALAVLEDTVDYP
本发明的HBV-HEV联合疫苗还含有0.5-0.7w/v％用量的明胶。
实施例2
一种用于制备上述HBV-HEV联合疫苗的方法：
(a)在制备最终的HBV-HEV联合疫苗之前，将重组HBsAg吸附于氢氧化铝凝胶，将HEV重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶，调整pH至5.5-9.6：
(b)将调整了pH的上述组份混合。
实施例3：重组HBsAg的制备
培养通过基因工程方法制备的可以表达重组HBsAg的酵母细胞，通过离心获得的酵母细胞沉淀以1∶2的比例稀释到缓冲液中(0.5M NaCl，10mM EDTA，0.01％ HgSO4，pH 7.0)。稀释后的溶液用玻璃珠搅拌器破碎细胞壁。获得的溶液加入0.5％的中性表面活性剂，4℃搅拌混合均匀。得到的溶液中加入NaOH至pH 11，然后4℃搅拌混合5小时。得到的溶液加入HCl至pH4。离心去除沉淀，调整pH值至7.0。然后用硅胶吸附、葡聚糖层析等方法纯化重组HBsAg，纯化后产物通过电泳验证并用以疫苗制备。
重组HBsAg也可按2000年版《中国生物制品规程》中《重组(CHO细胞)乙型肝炎疫苗制造及检定规程》制备。
实施例4：HEV重组蛋白的表达和纯化
(1)以HEV 4型中国株基因序列为模板，用引物1(5’-CCC CCC ATG GTTATC CAG GAC TAT GAT AAT C-3’)和引物2(5’-CCC CTC GAG TCA AGG GTAATC AAC AGT GTC CTC CA-3’)扩增ORF2编码多肽453-631(p179)的基因片段。PCR条件为：94℃-45秒，52℃-45秒，72℃-50秒，35个循环。PCR产物经琼脂糖凝胶回收纯化，克隆入质粒载体pET28(a)+中。
(2)将表达质粒转化入表达菌株E.coli BL-21(DE3)中，挑取单菌落，用含有50ug/ml卡那霉素的LB培养基培养至OD550＝0.6～0.8，用终浓度为0.2～1.0mMIPTG进行诱导，诱导温度为37℃，摇床摇速为200rpm，3-4小时后离心收集菌体，用细胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH 7.2，300mM NaCl)悬浮菌体沉淀，冻融6次后超声破碎菌体，离心收集上清液，再用离子交换、葡聚糖层析等方法进行纯化，最后使用UV280、SDS-PAGE等方法进行检测。
实施例5：制备重组HBsAg和HEV重组蛋白氢氧化铝凝胶吸附溶液
为了增加免疫原性，分别将重组HBsAg和HEV重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶：(1)将重组HBsAg和氢氧化铝凝胶搅拌混合；(2)将HEV重组蛋白和氢氧化铝凝胶搅拌混合。再将(1)和(2)所得的溶液混合，调整重组HBsAg的浓度为200μg/ml，HEV重组蛋白浓度为200μg/ml，氢氧化铝凝胶的浓度为1.0mg/ml；所得的混合溶液即为重组HBsAg和HEV重组蛋白氢氧化铝凝胶吸附溶液。
实施例6：HBV-HEV联合疫苗的免疫原性实验
A：实验动物分组和免疫方案
选用6-8周龄的雌性BALB/C纯系小鼠250只(扬州大学比较医学实验中心提供)，随机分为24组，每组10只。A组：空白对照组，注射浓度为1.0mg/ml的氢氧化铝凝胶，0.1ml/只；B组：乙肝疫苗组，注射乙肝疫苗(重组HBsAg含量为50μg/ml)，0.1ml/只；C组：乙肝疫苗组，注射乙肝疫苗(重组HBsAg含量为100μg/ml)，0.1ml/只；；D组：乙肝疫苗组，注射乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)，0.1ml/只；；E组：乙肝疫苗组，注射乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml)，0.1ml/只；F组：戊肝疫苗组，注射HEV重组蛋白(50μg/ml)，0.1ml/只；G组：戊肝疫苗组，注射HEV重组蛋白(100μg/ml)，0.1ml/只；H组：戊肝疫苗组，注射HEV重组蛋白(200μg/ml)，0.1ml/只；I组：戊肝疫苗组，注射HEV重组蛋白(500μg/ml)，0.1ml/只；J组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(50μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为50μg/ml)，0.1ml/只；K组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(100μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为50μg/ml)，0.1ml/只；L组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为50μg/ml)，0.1ml/只；M组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为50μg/ml)，0.1ml/只；N组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(50μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为100μg/ml)，0.1ml/只；O组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(100μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为100μg/ml)，0.1ml/只；P组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为100μg/ml)，0.1ml/只；Q组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为100μg/ml)，0.1ml/只；R组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(50μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)，0.1ml/只；S组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(100μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)，0.1ml/只；T组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)，0.1ml/只；U组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)，0.1ml/只；V组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(50μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml)，0.1ml/只；W组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(100μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml)，0.1ml/只；X组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml)，0.1ml/只；Y组：HBV-HEV联合疫苗组，注射HEV重组蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml)，0.1ml/只；各组实验动物分别于0、4、6周注射相应疫苗三次，其中0周背部皮下多点注射0.1ml相应疫苗，4、6周腹腔注射0.05ml相应疫苗。
B：检测方法：
B-1：血清采集
所有动物均于免疫前、免疫后2、4、6、8、10、14、18、24、48周经眼眶静脉采血，-20℃冻存，于实验结束后统一检测。
B-2：乙肝、戊肝抗体检测
采用ELISA检测各组动物血清(1∶100稀释)，检测各动物抗体产生情况，以1∶10的免疫前血清作为阴性对照，P/N比值大于2.1为抗体阳性血清。
将不同组别、不同时间的免疫血清分别系列稀释，以1∶100为起点，采用ELISA法检测乙肝、戊肝抗体滴度。
C：结果
C-1：如表1-1所示，使用不同剂量的乙肝疫苗免疫小鼠的结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数随乙肝疫苗免疫剂量的提高而升高，D组和E组之间无明显差异。如表1-2所示，免疫血清中乙肝抗体滴度随乙肝疫苗免疫剂量、免疫次数的增加而升高，至8-10周时达到最高水平(1∶102400)，D组和E组48周后免疫血清滴度仍可维持1∶51200。
表1-1不同剂量的乙肝疫苗诱生小鼠乙肝抗体的产生情况
| A组 | B组 | C组 | D组 | E组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 0 | 60 | 90 | 100 | 100 |
表1-1不同剂量的乙肝疫苗诱生小鼠乙肝抗体的产生水平
| 时间(周) | 乙肝抗体滴度 | ||||
| A组 | B组 | C组 | D组 | E组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶512001∶512001∶256001∶128001∶6400 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶512001∶512001∶256001∶128001∶6400 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶512001∶1024001∶512001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶512001∶51200 |
C-2：如表2-1所示，使用不同剂量的戊肝疫苗免疫小鼠的结果表明，产生阳性血清小鼠的百分数随戊肝疫苗免疫剂量的提高而升高，当戊肝重组蛋白免疫剂量≥200μg/ml时，全部小鼠均能产生阳性血清。
如表2-2所示，免疫血清中戊肝抗体滴度同样与戊肝疫苗免疫剂量、免疫次数有关，H组和I组免疫血清抗体滴度高于F组和G组，血清抗体滴度于8-10周时达到最高水平(1∶102400)，H组和I组48周后免疫血清滴度仍可维持1∶25600。
表2-1不同剂量的戊肝疫苗诱生小鼠戊肝抗体的产生情况
| A组 | F组 | G组 | H组 | I组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 0 | 80 | 80 | 100 | 100 |
表2-2不同剂量的戊肝疫苗诱生小鼠戊肝抗体的产生水平
| 时间(周) | 戊肝抗体滴度 | ||||
| A组 | F组 | G组 | H组 | I组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10＜1∶10 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶512001∶512001∶128001∶64001∶6400 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶512001∶512001∶128001∶64001∶6400 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶512001∶1024001∶512001∶512001∶256001∶25600 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶256001∶25600 |
C-3：如表3-1所示，乙肝疫苗(重组HBsAg含量为50μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，B、J、K组分别有60％、80％、90％的动物能够诱导出乙肝抗体，L、M组100％的动物诱导出乙肝抗体。
表3-2表明，乙肝疫苗(重组HBsAg含量为50μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白联合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价乙肝疫苗组(重组HBsAg含量为50μg/ml)，且L、M组优于J、K组，48周后，L、M组的血清抗体滴度仍可维持在1∶51200。
表3-1乙肝疫苗(重组HBsAg含量为50μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免疫
诱生小鼠乙肝抗体的产生情况
| B组 | J组 | K组 | L组 | M组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 60 | 80 | 90 | 100 | 100 |
表3-2乙肝疫苗(重组HBsAg含量为50μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免疫
诱生小鼠乙肝抗体的产生水平
| 时间(周) | 乙肝抗体滴度 | ||||
| B组 | J组 | K组 | L组 | M组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶512001∶512001∶128001∶64001∶6400 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶256001∶25600 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶256001∶25600 | ＜1∶10＜1∶1001∶8001∶512001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶1001∶16001∶512001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶512001∶51200 |
C-4：如表4-1所示，乙肝疫苗(重组HBsAg含量为100μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，C组有90％的动物能够诱导出乙肝抗体，N、O、P、Q组的动物均能诱导出抗乙肝抗体。
表4-2表明，乙肝疫苗(重组HBsAg含量为100μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白联合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价乙肝疫苗组(重组HBsAg含量为100μg/ml)，且P、Q组优于N、O组，48周后，P、Q组的血清抗体滴度仍可维持在1∶51200。
表4-1乙肝疫苗(重组HBsAg含量为100μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免
疫诱生小鼠乙肝抗体的产生情况
| C组 | N组 | O组 | P组 | Q组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 90 | 100 | 100 | 100 | 100 |
表4-2乙肝疫苗(重组HBsAg含量为100μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免
疫诱生小鼠乙肝抗体的产生水平
| 时间(周) | 乙肝抗体滴度 | ||||
| C组 | N组 | O组 | P组 | Q组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶512001∶512001∶256001∶128001∶6400 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶256001∶25600 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶256001∶25600 | ＜1∶10＜1∶1001∶8001∶512001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶1001∶16001∶512001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶512001∶51200 |
C-5：如表5-1所示，乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，D、R、S、T、U组的动物均能诱导出乙肝抗体。
表5-2表明，乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白联合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价乙肝疫苗组(重组HBsAg含量为200μg/ml)，且T、U组优于R、S组，48周后，T、U组的血清抗体滴度仍可维持在1∶102400。
表5-1乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免
疫诱生小鼠乙肝抗体的产生情况
| D组 | R组 | S组 | T组 | U组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
表5-2乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免
疫诱生小鼠乙肝抗体的产生水平
| 时间(周) | 乙肝抗体滴度 | ||||
| D组 | R组 | S组 | T组 | U组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶512001∶1024001∶512001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶1001∶8001∶512001∶4096001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶102400 | ＜1∶10＜1∶1001∶16001∶512001∶4096001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶102400 |
C-6：如表6-1所示，乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免疫小鼠的结果表明，E、V、W、X、Y组的动物均能诱导乙肝抗体。
表6-2表明，乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白联合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价乙肝疫苗组(重组HBsAg含量为500μg/ml)，且X、Y组优于V、W组，48周后，X、Y组的血清抗体滴度仍可维持在1∶102400。
表6-1乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免
疫诱生小鼠乙肝抗体的产生情况
| E组 | V组 | W组 | X组 | Y组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
表6-2乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml)与不同剂量的HEV重组蛋白进行联合免
疫诱生小鼠乙肝抗体的产生水平
| 时间(周) | 乙肝抗体滴度 | ||||
| D组 | R组 | S组 | T组 | U组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶512001∶1024001∶512001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶1001∶8001∶512001∶4096001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶102400 | ＜1∶10＜1∶1001∶16001∶512001∶4096001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶102400 |
C-7：如表7-1所示，HEV重组蛋白(50μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，F组有80％的动物能诱导出抗HEV的阳性血清，J、N、R、V组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表6-2表明，HEV重组蛋白(50μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗联合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价戊肝疫苗组(50μg/ml)，且R、V组优于J、N组，48周后，R、V组的血清抗体滴度仍可维持在1∶51200。
表7-1 HEV重组蛋白(50μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊肝抗体的
产生情况
| F组 | J组 | N组 | R组 | V组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 |
表7-2 HEV重组蛋白(50μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊肝抗体的
产生水平
| 时间(周) | 戊肝抗体滴度 | ||||
| F组 | J组 | N组 | R组 | V组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶512001∶512001∶128001∶64001∶6400 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶1024001∶512001∶128001∶128001∶12800 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶1024001∶512001∶128001∶128001∶12800 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶1024001∶2048001∶1024001∶1024001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶128001∶2048001∶1024001∶1024001∶1024001∶512001∶51200 |
C-8：如表8-1所示，HEV重组蛋白(100μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，G组有80％的动物能诱导出抗HEV的阳性血清，K、O、S、W组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表8-2表明，HEV重组蛋白(100μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗联合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价戊肝疫苗组(100μg/ml)，且S、W组优于K、O组，48周后，S、W组的血清抗体滴度仍可维持在1∶51200。
表8-1 HEV重组蛋白(100μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊肝抗体
的产生情况
| G组 | K组 | O组 | S组 | W组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 80 | 100 | 100 | 100 | 100 |
表8-2 HEV重组蛋白(100μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊肝抗体
的产生水平
| 时间(周) | 戊肝抗体滴度 | ||||
| G组 | K组 | O组 | S组 | W组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶512001∶512001∶128001∶64001∶6400 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶1024001∶512001∶512001∶128001∶12800 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶512001∶1024001∶1024001∶512001∶128001∶12800 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶128001∶2048001∶1024001∶1024001∶1024001∶512001∶51200 |
C-9：如表9-1所示，HEV重组蛋白(200μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，H、L、P、T、X组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表9-2表明，HEV重组蛋白(200μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗联合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价戊肝疫苗组(200μg/ml)，且T、X组优于L、P组，48周后，T、X组的血清抗体滴度仍可维持在1∶102400。
表9-1 HEV重组蛋白(200μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗联合免疫诱生小鼠戊肝抗体的产
生情况
| H组 | L组 | P组 | T组 | X组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
表9-2 HEV重组蛋白(200μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊肝抗体
的产生水平
| 时间(周) | 戊肝抗体滴度 | ||||
| H组 | L组 | P组 | T组 | X组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶128001∶512001∶1024001∶512001∶512001∶256001∶25600 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶1024001∶2048001∶1024001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶2048001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶512001∶4096001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶102400 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶512001∶2048001∶4096001∶2048001∶1024001∶1024001∶102400 |
C-10：如表10-1所示，HEV重组蛋白(500μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫小鼠的结果表明，I、M、Q、U、Y组的动物均能诱导出抗HEV的阳性血清。
表10-2表明，HEV重组蛋白(500μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗联合免疫小鼠后，小鼠乙肝抗体产生水平明显高于单价戊肝疫苗组(500μg/ml)，且U、Y组优于M、Q组，48周后，U、Y组的血清抗体滴度仍可维持在1∶102400。
表10-1 HEV重组蛋白(500μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗联合免疫诱导小鼠戊肝抗体的产
生情况
| I组 | M组 | Q组 | U组 | Y组 | |
| 产生阳性血清小鼠的百分数 | 100 | 100 | 100 | 100 | 100 |
表10-2 HEV重组蛋白(500μg/ml)与不同剂量的乙肝疫苗进行联合免疫诱生小鼠戊肝抗体
的产生水平
| 时间(周) | 戊肝抗体滴度 | ||||
| I组 | M组 | Q组 | U组 | Y组 | |
| 免疫前24681014182448 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶128001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶256001∶25600 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶2048001∶2048001∶1024001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶64001∶2048001∶1024001∶1024001∶512001∶512001∶51200 | ＜1∶10＜1∶100＜1∶1001∶512001∶4096001∶2048001∶2048001∶1024001∶1024001∶102400 | ＜1∶10＜1∶1001∶1001∶1024001∶4096001∶4096001∶2048001∶1024001∶1024001∶102400 |
以上的实施例结果表明，不同剂量配比的乙—戊肝联合疫苗的免疫效果均优于单价疫苗；其中以T组(HEV重组蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml))、U组(HEV重组蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)、X组(HEV重组蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml))、Y组(HEV重组蛋白(500μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为500μg/ml))效果较好，比较该几组疫苗之间的免疫效果亦无明显差异。因此，我们认为乙—戊肝联合疫苗中重组HBsAg和HEV重组蛋白的剂量≥200μg/ml时可以取的很好的免疫效果，且其中以HEV重组蛋白(200μg/ml)+乙肝疫苗(重组HBsAg含量为200μg/ml)的成本相对最低。
Claims (7)
1.一种乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗(乙-戊肝联合疫苗)，其特征在于包括戊型肝炎病毒(HEV)重组蛋白以及重组乙型肝炎病毒表面抗原(重组HBsAg)，所说的重组HBsAg含量为50-500μg/ml，HEV重组蛋白的含量为50-500μg/ml。
2.根据权利要求1所述的乙-戊肝联合疫苗，其特征在于重组HBsAg为酵母细胞，哺乳动物细胞，或其他可用细胞表达的基因工程重组蛋白。
3.根据权利要求1所述的乙-戊肝联合疫苗，其特征在于重组HBsAg为基因工程重组抗原或其片段或含pre S1/pre S2成分的抗原。
4.根据权利要求1所述的乙-戊肝联合疫苗，其特征在于HEV重组蛋白的氨基末端位于其开放阅读框架2编码蛋白的380位至480位氨基酸之间，其羧基末端位于580位至650位氨基酸之间或由此蛋白片段产生的衍生物。
5.根据权利要求1所述的乙-戊肝联合疫苗，其特征在于包括免疫佐剂，该免疫佐剂为氢氧化铝凝胶溶液，氢氧化铝凝胶的浓度范围调整为0.6-1.5mg/ml。
6.根据权利要求1所述的乙-戊肝联合疫苗，其特征在于含有0.5-0.7w/v％用量的明胶。
7.一种用于制备权利要求1所述乙-戊肝联合疫苗的方法，其特征在于：
(a)在制备最终的乙-戊肝联合疫苗之前，将重组HBsAg吸附于氢氧化铝凝胶，将HEV重组蛋白吸附于氢氧化铝凝胶，调整pH至5.5-9.6；
(b)将调整了pH的上述组份混合。
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|---|---|---|---|---|
| CN101085347B (zh) * | 2007-06-15 | 2010-05-19 | 东南大学 | 甲型肝炎-乙型肝炎-戊型肝炎联合疫苗 |
| CN110013549A (zh) * | 2019-04-29 | 2019-07-16 | 青岛易邦生物工程有限公司 | 一种戊型肝炎亚单位疫苗 |
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2005
- 2005-11-29 CN CNB2005101226044A patent/CN100482274C/zh not_active Expired - Fee Related
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