CN109758467B

CN109758467B - 一种吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

Info

Publication number: CN109758467B
Application number: CN201910175580.0A
Authority: CN
Inventors: 常惠芸; 龚美娇; 李世芳; 邵军军; 赵付荣; 常艳燕; 张永光
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2020-12-25
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN109758467A

Abstract

本发明涉及吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用，属于兽用药物技术领域。本发明所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。

Description

一种吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及兽用药物技术领域，具体涉及一种吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起猪、牛、羊等偶蹄动物和多种野生动物的一种急性烈性传染病传染病，临床症状表现为：常在口、鼻、蹄等部位形成水泡并伴随发热、跋行等症状。该病传播途径多、流行范围广和传染性强，目前在多个国家频繁暴发，已严重威胁全球畜牧业的发展。目前主要通过疫苗免疫对口蹄疫进行防控，但由于该病感染性和致病力特别强，易感动物种类繁多，抗原变异性强，疫苗存在“免疫窗口期”等因素，该病至今还没有得到有效的控制与根除。因此，急需研发新型的抗口蹄疫病毒新策略。

发明内容

本发明的目的在于提供吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。

本发明提供了吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

优选的是，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。

优选的是，所述吉西他滨在所述药物中的浓度＞3.1μmol/L。

本发明还提供了一种口蹄疫病毒抑制剂，所述抑制剂包括吉西他滨和药学上可接受的辅料。

优选的是，所述抑制剂中吉西他滨的浓度＞50μg/g。

优选的是，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。

本发明提供了吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。吉西他滨对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，延长感染动物的生存时间，本发明将吉西他滨作为有效组分制备得到的药物能够抑制口蹄疫病毒(FMDV)，防控口蹄疫。细胞毒性试验显示，吉西他滨在0～100μmol浓度范围内对正常细胞不表现出毒性，在 3.1μmol～100μmol范围内可有效的抑制A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒的复制，进一步的实验证实，吉西他滨只在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。体内实验表明，50μg的吉西他滨能够可显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。吉西他滨能够作为抗FMDV 感染的候选药物。

附图说明

图1为本发明实施列1提供的不同浓度的Gemcitabine对IBRS-2细胞的细胞毒性图；

图2为本发明实施列1提供的不同浓度的Gemcitabine对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图3为本发明实施列1提供的不同浓度的Gemcitabine对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图4为本发明实施列1提供的不同浓度的Gemcitabine对O型FMDV感染IBRS-2细胞中的FMDVmRNA抑制作用图；

图5为本发明实施列1提供的不同浓度的Gemcitabine对O型FMDV感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图；

图6为本发明实施例1提供的IFA检测不同浓度的Gemcitabine对O型 FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图；

图7为本发明实施列1提供的Gemcitabine在不同时间段对病毒感染细胞的FMDVmRNA表达水平抑制作用图；

图8为本发明实施列1提供的Gemcitabine在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达水平抑制作用图；

图9为本发明实施列1提供的Gemcitabine对FMDV感染乳鼠死亡时间的影响。

具体实施方式

本发明提供了吉西他滨(Gemcitabine)在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。本发明所述吉西他滨为一类核酸类似物。在本发明中，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。吉西他滨对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，延长感染动物的生存时间，吉西他滨在0～100μmol/L浓度范围内对正常细胞不表现出毒性，在3.1μmol/L～100μmol/L范围内可有效的抑制A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒的复制，吉西他滨只在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。本发明将吉西他滨作为有效组分制备得到的药物毒性低，对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用，能够抑制口蹄疫病毒(FMDV)，防控口蹄疫。

在本发明中，所述吉西他滨在所述药物中的浓度为＞3.1μmol/L，更优选为3.1μmol/L～100μmol/L。

在本发明中，所述抑制剂中吉西他滨的浓度＞50μg/g。

在本发明中，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。在本发明中，所述甘油优选为注射用甘油。本发明对所述辅料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油的市售产品即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.实验材料

1.1细胞、动物、病毒和药物

IBRS-2细胞由本课题组保存；3日龄乳鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物场。FMDV(O/MY98/BY/2010和A/GDMM/CHA/2013)由国家口蹄疫参考实验室保存并提供；Gemcitabine购自北京索莱宝科技有限公司，以DMSO进行配制。

1.2试剂

DMEM、胎牛血清FBS、胰蛋白酶培养基购自Gibco公司；MTS检测试剂盒购自Abcam公司；TRIZOL购自Invitrogen公司；SYBRPremix Ex Taq^Ⅱ试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL购自碧云天公司；BSA、 PVDF膜购自BioRad公司；Tween-20、Tween-80购自上海生工生物工程公司；TritonX-100、DMSO购自Sigma公司；小鼠抗β-actin多克隆抗体、HRP 标记抗兔或抗鼠IgG抗体均购自Abcam公司；兔抗O型FMDVVP1多克隆抗体由国家口蹄疫参考实验室郑海学博士惠赠；兔抗O型FMDV高免血清由国家口蹄疫参考实验室周广青惠赠。

2.实验方法和结果

2.1Gemcitabine在IBRS-2细胞上的毒性实验：

采用MTS法测定Gemcitabine对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96 孔板IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗 3次，最后加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Gemcitabine 100 μL，以Gemcitabine的配制溶液相应DMSO浓度作为阴性对照孔，以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μL MTS 溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度的 Gemcitabine对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。

本实验结果如图1所示：MTS结果显示，随着药物浓度的不断增加，细胞的活性率仍在90％以上，说明Gemcitabine对IBRS-2细胞毒性极低。

2.2Gemcitabine在IBRS-2细胞上抗口蹄疫病毒活性的评价：

将含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96 孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM 洗3次，接种100TCID₅₀O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的 DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Gemcitabine 100μL，以Gemcitabine的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，以无Gemcitabine、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养48h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度Gemcitabine的抗病毒作用。同时收集不同组上清液，q-PCR和WesternBlot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和VP1蛋白水平。按照TRIZOL说明书提取细胞的RNA，按照SYBRPremix Ex Taq^Ⅱ操作说明书进行荧光定量 PCR，β-actin作为内参基因。用于检测FMDV 2B基因mRNA特异的引物序列为：

FMDV-for,5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1)；

FMDV-rev,5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2)；

β-actin的引物序列为：

β-actin for,5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3)；

β-actin-rev,5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。

反应体系为：SYBRPremix ExTaq:12.5μL，上游引物：1μL，下游引物： 1μL，cDNA：1μL，灭菌水：9.5μL，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56退火30s，72℃延伸30s，40个循环。根据2^-△△CT方法计算样品相对于内参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12％的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳，电泳2h后，将蛋白电转印至PVDF膜上。转膜2h完毕后，把膜置入新鲜配制的5％脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后，将膜置入兔抗O型FMDVVP1多克隆抗体(1:3000)，小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中，4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次10min，之后把膜放入相应二抗HRP标记山羊抗兔IgG,HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000)，室温孵育1h，TBST洗膜5次，每次10min，最后利用ECL化学发光法显影检测FMDVVP1蛋白。为了研究Gemcitabine的广谱抗病毒作用，利用100TCID₅₀A/GDMM/CHA/2013感染细胞，MTS方法测定其抗病毒活性。

实验结果如图2～5所示：用MTS检测Gemcitabine对FMDV是否具有抗病毒活性，在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度大于3μmol 时，Gemcitabine可提供IBRS-2细胞80％以上的保护(图2)，并且显著的抑制FMDVmRNA(图4)和VP1蛋白(图5)的水平。而当浓度为1.5μmol， Gemcitabine则不能提供细胞有效的保护以及降低FMDV mRNA和VP1蛋白水平。同样，当用A型口蹄疫病毒感染细胞时，1.5μmol及以上浓度的 Gemcitabine能有效的保护IBRS-2细胞(图3)，说明Gemcitabine对A型 FMDV也有抗病毒活性。

2.3间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况

将密度为3×10⁵/孔IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID₅₀ O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Gemcitabine 100μL，以Gemcitabine的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定细胞15min，弃掉多聚甲醛，加入甲醇作用5min，用PBS漂洗3次，每次5min，加入封闭液(10％FBS，0.3％TritonX-100，89.7％PBS)封闭10min，之后加入用封闭液稀释好的一抗(1:100)，室温孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min，加入用封闭液稀释好的二抗(1:200)，室温孵育1h，PBS漂洗5次，每次5 min。最后每孔加入300μLDAPI进行染色，作用5min，PBS漂洗2次，每次5min，荧光显微镜观察结果。

实验结果如图6(标尺为100μm)所示：未处理感染病毒后的IBRS-2 细胞及用1.5μmol Gemcitabine处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光，而其他处理组的IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了 Gemcitabine在IBRS-2细胞上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性。

2.4Gemcitabine对口蹄疫病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价：

将在含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到 12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的 DMEM洗3次，接种100TCID₅₀O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液，此时作为0 h。在病毒感染后0h，2h，4h，8h，16h分别向不同孔中加入Gemcitabine，使其的终浓度为3μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃CO₂恒温细胞培养箱中培养48h。收集不同组上清液，q-PCR和Western Blot分别检测 FMDV2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。

实验结果如图7～8所示：在病毒感染后不同时间段用Gemcitabine处理细胞，结果显示，在FMDV复制的0～8h内，与阴性对照相比，FMDVmRNA (图7)和VP1蛋白水平(图8)明显受到抑制。而在16h病毒的FMDV mRNA 和VP1蛋白水平抑制作用并不明显，说明Gemcitabine只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。

2.5Gemcitabine在体内的抗口蹄疫病毒活性评价：

3日龄SPF BALB/C乳鼠24只，随机分成两组，12只/组，乳鼠和母鼠一同饲养。实验分为两组，实验组12只乳鼠颈部皮下注射50μg Gemcitabine，对照组12只乳鼠全部颈部皮下接种含10％DMSO和5％Tween-80的PBS 100μL。2h之后，全部乳鼠颈部皮下注射含有100LD₅₀O/MY98/BY/2010 的PBS100μL。连续观察并记录乳鼠死亡情况。为了保证实验的安全性，动物的攻毒在P3实验室进行，相关操作符合中国农科院实验动物管理委员会相关规定。

实验结果如图9所示：对照组乳鼠从病毒感染之后30h开始死亡，54h 的时候已经全部死亡，而实验组在42h时开始死亡，到96h才全部死亡。实验组全部死亡时间与对照组乳鼠相比延迟了42h，由此可以看出， Gemcitabine能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caacaaaaca cggacccgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtaccagg gtttggcctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaccaccttc aactcgatca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgttggcgt agaggtcctt 20

Claims

1.吉西他滨在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述吉西他滨在所述药物中的浓度＞3.1μmol/L。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括口蹄疫病毒抑制剂，所述抑制剂包括吉西他滨和药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述抑制剂中吉西他滨的浓度＞50μg/g。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。