CN110025620B

CN110025620B - Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

Info

Publication number: CN110025620B
Application number: CN201910178107.8A
Authority: CN
Inventors: 李世芳; 常惠芸; 龚美娇; 邵军军; 常艳燕; 张永光
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN110025620A

Abstract

本发明提供了一种Inauhzin在制备口蹄疫病毒抑制剂中的应用，涉及兽用药物技术领域。本发明所述Inauhzin毒性低，对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用，且能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。

Description

Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明属于兽用药物技术领域，具体涉及Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的中的应用。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性的偶蹄动物传染病，严重的危害当地畜牧业的持续健康发展以及相关产品的对外贸易。世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。口蹄疫的病原口蹄疫病毒(FMDV)属小RNA病毒科口蹄疫病毒属，有O，A，C，Asia I和SAT1，SAT2，SAT3等7个血清型，每个型内还有多个亚型，各型甚至各亚型病毒又各自具特殊的免疫、变异和传播能力，这给口蹄疫防控带了一定的挑战。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的中的应用，对口蹄疫病毒具有抑制作用，同时能够显著延缓口蹄疫病毒的致死效应。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

优选的，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。

优选的，所述Inauhzin在应用时的浓度＞12μmol/L。

本发明还提供了一种口蹄疫病毒抑制剂，所述抑制剂包括Inauhzin和药学上可接受的辅料。

优选的，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。

本发明提供了Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用，所述Inauhzin毒性低，对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用，且能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。在本发明实施例中，随着药物浓度的不断增加，细胞的活性率仍在90％以上；Inauhzin在IBRS-2细胞上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性；同时在小鼠模型试验中，比对照组的乳鼠死亡时间延缓了42h。

附图说明

图1为本发明实施例1中不同浓度的Inauhzin对IBRS-2细胞的细胞毒性图；

图2为本发明实施例2中不同浓度的Inauhzin对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图3为本发明实施例2中不同浓度的Inauhzin对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图4为本发明实施例2中不同浓度的Inauhzin对O型FMDV感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；

图5为本发明实施例2中不同浓度的Inauhzin对O型FMDV感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图；

图6为本发明实施例3中IFA检测不同浓度的Inauhzin对O型FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图；

图7为本发明实施例4中Inauhzin在不同时间段对病毒感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；

图8为本发明实施例4中Inauhzin在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图；

图9为本发明实施例5中Inauhzin对FMDV感染乳鼠死亡时间的影响。

具体实施方式

在本发明所述应用中，所述口蹄疫病毒的类型优选包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。本发明所述Inauhzin在应用时，浓度＞12μmol/L。本发明所述药物的施用量优选为＞90μg/g。

本发明对所述抑制剂的剂型并没有特殊限定，优选为注射剂和溶液剂。本发明对所述各种剂型的抑制剂的制备方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。

本发明所述抑制剂中，所述辅料优选包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。本发明对所述辅料的来源并没有特殊限定，利用本领域的常规市售产品即可。

下面结合实施例对本发明提供的Inauhzin在制备口蹄疫病毒抑制剂中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

Inauhzin在IBRS-2细胞上的毒性实验：

采用MTS法(MTS检测试剂盒购自Abcam公司)测定Inauhzin(购自MCE公司)对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM(购自Gibco公司)洗3次，最后加入用含2％胎牛血清FBS(购自Gibco公司)的DMEM培养液梯度稀释好的Inauhzin 100μL，以Inauhzin的配制溶液DMSO的相应浓度作为阴性对照孔，以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度的Inauhzin对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。

实验结果如图1所示：MTS结果显示，随着药物浓度的不断增加，细胞的活性率仍在90％以上，说明Inauhzin对IBRS-2细胞毒性极低。

实施例2

Inauhzin在IBRS-2细胞上抗口蹄疫病毒活性的评价

将含10％胎牛血清FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID50O/MY98/BY/2010(国家口蹄疫参考实验室保存并提供)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Inauhzin 100μL，以Inauhzin的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，以无Inauhzin、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养48h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度Inauhzin的抗病毒作用。

同时收集不同组上清液，q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。按照TRIZOL(购自Invitrogen公司)说明书提取细胞的RNA，按照SYBRPremix Ex Taq^II(购自宝生物工程(大连)有限公司)操作说明书进行荧光定量PCR，β-actin作为内参基因。用于检测FMDV 2B基因mRNA特异的引物序列为：

FMDV-for,5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1)；

FMDV-rev,5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2)；

β-actin的引物序列为：

β-actin for,5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3)；

β-actin-rev,5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。反应体系为：SYBRPremix ExTaq:12.5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，cDNA：1μL，灭菌水：9.5μL，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56退火30s，72℃延伸30s，40个循环。根据2^-ΔΔCT方法计算样品相对于内参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12％的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳，电泳2h后，将蛋白电转印至PVDF膜(购自BioRad公司)上。转膜2h完毕后，把膜置入新鲜配制的5％脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后，将膜置入兔抗O型FMDV VP1多克隆抗体(1:3000)，小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中，4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次10min，之后把膜放入相应二抗HRP标记山羊抗兔IgG,HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000)，室温孵育1h，TBST洗膜5次，每次10min，最后利用ECL化学发光法显影检测FMDVVP1蛋白。为了研究Inauhzin对A型口蹄疫病毒是否具有抑制作用，利用100TCID₅₀A/GDMM/CHA/2013感染细胞，MTS方法测定其抗病毒活性。

实验结果如图2～5所示：用MTS检测Inauhzin对FMDV是否具有抗病毒活性，在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度为12μmol及以上浓度时，Inauhzin才可以提供IBRS-2细胞80％以上的保护(图2)，并且显著的抑制FMDVmRNA(图4)和VP1蛋白水平(图5)的表达。而当浓度低于12μmol时，Inauhzin则不能提供细胞有效的保护。同样，当用A型口蹄疫病毒感染细胞时，6μmol及以上浓度的Inauhzin能有效的保护IBRS-2细胞(图3)，说明Inauhzin对A型FMDV也有抗病毒活性。

实施例3

间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况

将密度为3×10⁵/孔IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID₅₀O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Inauhzin 100μL，以Inauhzin的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定细胞15min，弃掉多聚甲醛，加入甲醇作用5min，用PBS漂洗3次，每次5min，加入封闭液(10％FBS，0.3％TritonX-100，89.7％PBS)封闭10min，之后加入用封闭液稀释好的一抗(1:100)，室温孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min，加入用封闭液稀释好的二抗(1:200)，室温孵育1h，PBS漂洗5次，每次5min。最后每孔加入300μLDAPI进行染色，作用5min，PBS漂洗2次，每次5min，荧光显微镜观察结果。

实验结果如图6所示：未处理感染病毒后的IBRS-2细胞及用3、6μmol Inauhzin处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光，而其他处理组的IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了Inauhzin在IBRS-2细胞上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性。

实施例4

Inauhzin对口蹄疫病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价：

将在含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID₅₀O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液，此时作为0h。在病毒感染后0h，2h，4h，8h，16h分别向不同孔中加入Inauhzin，使其的终浓度为50μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃CO₂恒温细胞培养箱中培养48h。收集不同组上清液，Q-PCR和WesternBlot分别检测FMDV2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。

实验结果如图7～8所示：在病毒感染后不同时间段用Inauhzin处理细胞，结果显示，在FMDV复制的0～8h内，与阴性对照相比，FMDV mRNA水平和VP1蛋白水平明显受到抑制。而在16h时Inauhzin的抑制作用并不明显，说明Inauhzin只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。

实施例5

Inauhzin在体内的抗口蹄疫病毒活性评价：

3日龄SPF BALB/C乳鼠24只，随机分成两组，12只/组，乳鼠和母鼠一同饲养。实验分为两组，实验组12只乳鼠颈部皮下注射90μg Inauhzin，对照组12只乳鼠全部颈部皮下接种含10％Tween-80的PBS 100μL。2h之后，全部乳鼠颈部皮下注射含有100LD50O/MY98/BY/2010的PBS 100μL。连续观察并记录乳鼠死亡情况。为了保证实验的安全性，动物的攻毒在P3实验室进行，相关操作符合中国农科院实验动物管理委员会相关规定。

实验结果如图9所示：对照组乳鼠从病毒感染之后30h开始死亡，54h的时候已经全部死亡，而实验组在52h时开始死亡，到96h乳鼠才全部死亡，比对照组的乳鼠死亡时间延缓了42h。

本发明提供了一种Inauhzin在制备口蹄疫病毒抑制剂中的应用，所述Inauhzin毒性低，对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用，且能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caacaaaaca cggacccgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtaccagg gtttggcctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaccaccttc aactcgatca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgttggcgt agaggtcctt 20

Claims

1.Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用；

所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述Inauhzin在应用时的浓度＞12μmol/L。