CN110025620A - Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种Inauhzin在制备口蹄疫病毒抑制剂中的应用,涉及兽用药物技术领域。本发明所述Inauhzin毒性低,对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用,且能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。
Description
技术领域
本发明属于兽用药物技术领域,具体涉及Inauhzin在制备预防口蹄疫病 毒感染的药物中的中的应用。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性的偶蹄动物 传染病,严重的危害当地畜牧业的持续健康发展以及相关产品的对外贸易。 世界动物卫生组织将其列为法定报告动物疫病,我国将其列为一类动物疫 病。口蹄疫的病原口蹄疫病毒(FMDV)属小RNA病毒科口蹄疫病毒属, 有O,A,C,Asia I和SAT1,SAT2,SAT3等7个血清型,每个型内还有 多个亚型,各型甚至各亚型病毒又各自具特殊的免疫、变异和传播能力,这 给口蹄疫防控带了一定的挑战。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供一种Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒 感染的药物中的中的应用,对口蹄疫病毒具有抑制作用,同时能够显著延缓 口蹄疫病毒的致死效应。
为了实现上述发明目的,本发明提供以下技术方案:
本发明提供了Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
优选的,所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。
优选的,所述Inauhzin在应用时的浓度>12μmol/L。
本发明还提供了一种口蹄疫病毒抑制剂,所述抑制剂包括Inauhzin和药 学上可接受的辅料。
优选的,所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或 多种。
本发明提供了Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用,所 述Inauhzin毒性低,对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用, 且能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。在本发明实施例中,随着药 物浓度的不断增加,细胞的活性率仍在90%以上;Inauhzin在IBRS-2细胞 上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性;同时在小鼠模型试验中,比对照组 的乳鼠死亡时间延缓了42h。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同浓度的Inauhzin对IBRS-2细胞的细胞毒 性图;
图2为本发明实施例2中不同浓度的Inauhzin对O型FMDV感染IBRS-2 细胞的抑制作用图;
图3为本发明实施例2中不同浓度的Inauhzin对A型FMDV感染IBRS-2 细胞的抑制作用图;
图4为本发明实施例2中不同浓度的Inauhzin对O型FMDV感染细胞 的FMDV mRNA抑制作用图;
图5为本发明实施例2中不同浓度的Inauhzin对O型FMDV感染细胞 的VP1蛋白表达抑制作用图;
图6为本发明实施例3中IFA检测不同浓度的Inauhzin对O型FMDV 感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图;
图7为本发明实施例4中Inauhzin在不同时间段对病毒感染细胞的 FMDV mRNA抑制作用图;
图8为本发明实施例4中Inauhzin在不同时间段对病毒感染细胞的VP1 蛋白表达抑制作用图;
图9为本发明实施例5中Inauhzin对FMDV感染乳鼠死亡时间的影响。
具体实施方式
本发明提供了Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
在本发明所述应用中,所述口蹄疫病毒的类型优选包括A型口蹄疫病毒 和O型口蹄疫病毒。本发明所述Inauhzin在应用时,浓度>12μmol/L。本发 明所述药物的施用量优选为>90μg/g。
本发明对所述抑制剂的剂型并没有特殊限定,优选为注射剂和溶液剂。 本发明对所述各种剂型的抑制剂的制备方法并没有特殊限定,利用本领域的 常规方法即可。
本发明还提供了一种口蹄疫病毒抑制剂,所述抑制剂包括Inauhzin和药 学上可接受的辅料。
本发明所述抑制剂中,所述辅料优选包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇 和甘油中的一种或多种。本发明对所述辅料的来源并没有特殊限定,利用本 领域的常规市售产品即可。
下面结合实施例对本发明提供的Inauhzin在制备口蹄疫病毒抑制剂中的 应用进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
Inauhzin在IBRS-2细胞上的毒性实验:
采用MTS法(MTS检测试剂盒购自Abcam公司)测定Inauhzin(购自 MCE公司)对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满 单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM(购自Gibco公司)洗3 次,最后加入用含2%胎牛血清FBS(购自Gibco公司)的DMEM培养液 梯度稀释好的Inauhzin 100μL,以Inauhzin的配制溶液DMSO的相应浓度作 为阴性对照孔,以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h,弃 掉上层细胞培养液,用新鲜的DMEM洗三次,再加入100μL新鲜的DMEM, 每孔加入20μL MTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度 值,根据公式“细胞活性率=(OD药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100%” 计算出不同浓度的Inauhzin对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。
实验结果如图1所示:MTS结果显示,随着药物浓度的不断增加,细 胞的活性率仍在90%以上,说明Inauhzin对IBRS-2细胞毒性极低。
实施例2
Inauhzin在IBRS-2细胞上抗口蹄疫病毒活性的评价
将含10%胎牛血清FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细 胞铺到96孔板,待IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新 鲜的DMEM洗3次,接种100TCID50O/MY98/BY/2010(国家口蹄疫参考 实验室保存并提供)。1h后,去掉病毒液,用新鲜的DMEM洗3次,加入 用含2%FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Inauhzin 100μL,以Inauhzin的 配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔,以无Inauhzin、无病毒的作细胞 对照孔。放入37℃持续培养48h,弃掉上层细胞培养液,用新鲜的DMEM 洗三次,再加入100μL新鲜的DMEM,每孔加入20μL MTS溶液。37℃孵 育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值,根据公式“细胞活性率=(OD 药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100%”计算出不同浓度Inauhzin的抗病毒 作用。
同时收集不同组上清液,q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基 因的mRNA和FMDV VP1蛋白水平。按照TRIZOL(购自Invitrogen公司) 说明书提取细胞的RNA,按照SYBRPremix Ex TaqII(购自宝生物工程(大 连)有限公司)操作说明书进行荧光定量PCR,β-actin作为内参基因。用 于检测FMDV 2B基因mRNA特异的引物序列为:
FMDV-for,5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1);
FMDV-rev,5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2);
β-actin的引物序列为:
β-actin for,5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3);
β-actin-rev,5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。反 应体系为:SYBRPremix ExTaq:12.5μL,上游引物:1μL,下游引物:1μL, cDNA:1μL,灭菌水:9.5μL,反应程序为:95℃预变性30s;95℃变性5s, 56退火30s,72℃延伸30s,40个循环。根据2-△△CT方法计算样品相对于内 参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白,应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12%的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳,电泳2h后,将蛋白 电转印至PVDF膜(购自BioRad公司)上。转膜2h完毕后,把膜置入新 鲜配制的5%脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后,将膜置入兔抗O型FMDV VP1多克隆抗体(1:3000),小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中,4℃冰 箱孵育过夜。用TBST洗膜5次,每次10min,之后把膜放入相应二抗HRP 标记山羊抗兔IgG,HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000),室温孵育1h,TBST 洗膜5次,每次10min,最后利用ECL化学发光法显影检测FMDVVP1蛋 白。为了研究Inauhzin对A型口蹄疫病毒是否具有抑制作用,利用100TCID50 A/GDMM/CHA/2013感染细胞,MTS方法测定其抗病毒活性。
实验结果如图2~5所示:用MTS检测Inauhzin对FMDV是否具有抗病 毒活性,在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度为12μmol及以 上浓度时,Inauhzin才可以提供IBRS-2细胞80%以上的保护(图2),并且 显著的抑制FMDV mRNA(图4)和VP1蛋白水平(图5)的表达。而当浓 度低于12μmol时,Inauhzin则不能提供细胞有效的保护。同样,当用A型 口蹄疫病毒感染细胞时,6μmol及以上浓度的Inauhzin能有效的保护IBRS-2 细胞(图3),说明Inauhzin对A型FMDV也有抗病毒活性。
实施例3
间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况
将密度为3×105/孔IBRS-2细胞铺到12孔板,待IBRS-2细胞生长满单 层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM洗3次,接种100TCID50 O/MY98/BY/2010。1h后,去掉病毒液,用新鲜的DMEM洗3次,加入用 含2%FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Inauhzin 100μL,以Inauhzin的 配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔,放入37℃持续培养12h。弃掉 上层细胞培养液,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定细胞15min,弃掉多聚 甲醛,加入甲醇作用5min,用PBS漂洗3次,每次5min,加入封闭液(10% FBS,0.3%Triton X-100,89.7%PBS)封闭10min,之后加入用封闭液稀释 好的一抗(1:100),室温孵育1h,PBS漂洗3次,每次5min,加入用封闭 液稀释好的二抗(1:200),室温孵育1h,PBS漂洗5次,每次5min。最后 每孔加入300μLDAPI进行染色,作用5min,PBS漂洗2次,每次5min, 荧光显微镜观察结果。
实验结果如图6所示:未处理感染病毒后的IBRS-2细胞及用3、6μmol Inauhzin处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光,而其他处理组的 IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了Inauhzin在IBRS-2 细胞上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性。
实施例4
Inauhzin对口蹄疫病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价:
将在含10%FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到 12孔板,待IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的 DMEM洗3次,接种100TCID50O/MY98/BY/2010。1h后,去掉病毒液, 用新鲜的DMEM洗3次,加入用含2%FBS的DMEM培养液,此时作为0 h。在病毒感染后0h,2h,4h,8h,16h分别向不同孔中加入Inauhzin, 使其的终浓度为50μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃CO2恒温 细胞培养箱中培养48h。收集不同组上清液,Q-PCR和Western Blot分别检 测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。
实验结果如图7~8所示:在病毒感染后不同时间段用Inauhzin处理细胞, 结果显示,在FMDV复制的0~8h内,与阴性对照相比,FMDV mRNA水 平和VP1蛋白水平明显受到抑制。而在16h时Inauhzin的抑制作用并不明 显,说明Inauhzin只是在FMDV复制早期起作用,而进入病毒复制后期时 则不能阻止病毒的复制。
实施例5
Inauhzin在体内的抗口蹄疫病毒活性评价:
3日龄SPF BALB/C乳鼠24只,随机分成两组,12只/组,乳鼠和母鼠 一同饲养。实验分为两组,实验组12只乳鼠颈部皮下注射90μg Inauhzin, 对照组12只乳鼠全部颈部皮下接种含10%Tween-80的PBS 100μL。2h之 后,全部乳鼠颈部皮下注射含有100LD50O/MY98/BY/2010的PBS 100μL。 连续观察并记录乳鼠死亡情况。为了保证实验的安全性,动物的攻毒在P3 实验室进行,相关操作符合中国农科院实验动物管理委员会相关规定。
实验结果如图9所示:对照组乳鼠从病毒感染之后30h开始死亡,54h 的时候已经全部死亡,而实验组在52h时开始死亡,到96h乳鼠才全部死 亡,比对照组的乳鼠死亡时间延缓了42h。
本发明提供了一种Inauhzin在制备口蹄疫病毒抑制剂中的应用,所述 Inauhzin毒性低,对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用,且 能够显著延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普 通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润 饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacaaaaca cggacccgac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtaccagg gtttggcctc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaccaccttc aactcgatca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgttggcgt agaggtcctt 20
Claims (5)
1.Inauhzin在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。
3.根据权利要求1所述应用,其特征在于,所述Inauhzin在应用时的浓度>12μmol/L。
4.一种口蹄疫病毒抑制剂,其特征在于,所述抑制剂包括Inauhzin和药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的抑制剂,其特征在于,所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。
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