CN109893529A - 一种pf-4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用 - Google Patents
一种pf-4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及PF‑4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用，属于兽用药物技术领域。本发明所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。
Description
技术领域
本发明涉及兽用药物技术领域，具体涉及一种PF-4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
背景技术
口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种烈性传染病，主要感染猪、牛等偶蹄类动物，常在口、鼻、蹄等部位形成水泡并伴随发热、跋行等临床症状。该病传播途径多、流行范围广和传染性强，目前在多个国家频繁暴发，已严重威胁全球畜牧业的发展，并对世界经济和人类社会造成了巨大影响。鉴于其严重的影响，我国将口蹄疫排在一类动物传染病名单的第一位，同时该病也是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中的三个单列病种之一。FMDV是一种无包膜单股正链RNA病毒，属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属。现已发现该病毒包括A型、O型、C型、亚洲I型和南非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等7种血清型，同时各血清型又分为多个亚型，给特异性治疗口蹄疫带来巨大困难。至今发现我国主要流行A型、O型，其毒力强、分布广，使口蹄疫防御工作面临着严峻的挑战；因此，函待发展新型有效口蹄疫防御策略及治疗方法。
发明内容
本发明的目的在于提供PF-4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。
本发明提供了PF-4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
优选的是，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。
优选的是，所述PF-4708671在应用时其浓度范围为100～200μmol/L。
本发明还提供了一种口蹄疫病毒抑制剂，所述抑制剂包括PF-4708671和药学上可接受的辅料。
优选的是，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。
本发明提供了PF-4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。PF-4708671对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，本发明将PF-4708671作为有效组分制备得到的药物能够抑制口蹄疫病毒(FMDV)。PF-4708671对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用；进一步的实验证实，PF-4708671只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。PF-4708671能够作为一种有效的抗口蹄疫病毒成分。
附图说明
图1为本发明实施列1提供的不同浓度的PF-4708671对IBRS-2细胞的细胞毒性图；
图2为本发明实施列1提供的不同浓度的PF-4708671对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；
图3为本发明实施列1提供的不同浓度的PF-4708671对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；
图4为本发明实施列1提供的不同浓度的PF-4708671对O型FMDV感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；
图5为本发明实施列1提供的不同浓度的PF-4708671对O型FMDV感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图；
图6为本发明实施列1提供的IFA检测不同浓度的PF-4708671对O型FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图；
图7为本发明实施列1提供的PF-4708671在不同时间段对病毒感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；
图8为本发明实施列1提供的PF-4708671在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图。
具体实施方式
本发明提供了PF-4708671(P70S6K1抑制剂，即p70核糖体S6激酶1的细胞渗透性和高特异抑制剂)在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。在本发明中，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。PF-4708671对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，PF-4708671只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。本发明将PF-4708671作为有效组分对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用，能够抑制口蹄疫病毒(FMDV)。本发明对PF-4708671的来源没有特殊限定，采用本领域技术人员熟知的PF-4708671的常规市售产品即可。
在本发明中，所述PF-4708671在应用时其浓度范围为100～200μmol/L。
本发明还提供了一种口蹄疫病毒抑制剂，所述抑制剂包括PF-4708671和药学上可接受的辅料。
在本发明中，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。在本发明中，所述甘油优选为注射用甘油。本发明对所述辅料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油的市售产品即可。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种PF-4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
1.实验材料
1.1细胞、病毒和药物
IBRS-2细胞由本课题组保存；FMDV(O/MY98/BY/2010和A/GDMM/CHA/2013)由国家口蹄疫参考实验室保存并提供；PF-4708671购自MCE公司，以DMSO进行配制。
1.2试剂
DMEM、胎牛血清FBS、胰蛋白酶培养基购自Gibco公司；MTS检测试剂盒购自Abcam公司；TRIZOL购自Invitrogen公司；SYBRPremix Ex TaqⅡ试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL购自碧云天公司；BSA、PVDF膜购自BioRad公司；吐温-20购自上海生工生物工程公司；Triton X-100、DMSO购自Sigma公司；小鼠抗β-actin多克隆抗体、HRP标记抗兔或抗鼠IgG抗体均购自Abcam公司；兔抗O型FMDVVP1多克隆抗体由国家口蹄疫参考实验室郑海学博士惠赠；兔抗O型FMDV高免血清由国家口蹄疫参考实验室周广青惠赠。
2.实验方法和结果
2.1PF-4708671在IBRS-2细胞上的毒性实验：
采用MTS法测定PF-4708671对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，最后加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的PF-4708671100μL，以PF-4708671的配制溶液相应DMSO浓度作为阴性对照孔，以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μL MTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100％”计算出不同浓度的PF-4708671对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。
本实验结果如图1所示：MTS结果显示，当浓度低于200μmol时，细胞活性在80％以上。而当药物浓度的浓度为400μmol时，细胞活性迅速下降，细胞的活性率为4％。所以，当利用该药物制备抗FMDV药物时，其浓度应不高于200μmol。
2.2PF-4708671在IBRS-2细胞上抗口蹄疫病毒活性的评价：
将含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种FMDVO/MY98/BY/2010(MOI＝1)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的PF-4708671100μL，以PF-4708671的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，以无PF-4708671、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养24h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μL MTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100％”计算出不同浓度PF-4708671的抗病毒作用。同时收集不同组上清液，q-PCR和WesternBlot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。按照TRIZOL说明书提取细胞的RNA，按照SYBRPremix Ex TaqⅡ操作说明书进行荧光定量PCR，β-actin作为内参基因。用于检测FMDV2B基因mRNA特异的引物序列为：
FMDV-for,5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1)；
FMDV-rev,5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2)；
β-actin的引物序列为：
β-actin for,5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3)；
β-actin-rev,5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。
反应体系为：SYBRPremix ExTaq:12.5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，cDNA：1μL，灭菌水：9.5μL，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56退火30s，72℃延伸30s，40个循环。根据2-△△CT方法计算样品相对于内参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12％的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳，电泳2h后，将蛋白电转印至PVDF膜上。转膜2h完毕后，把膜置入新鲜配制的5％脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后，将膜置入兔抗O型FMDVVP1多克隆抗体(1:3000)，小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中，4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次10min，之后把膜放入相应二抗HRP标记山羊抗兔IgG,HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000)，室温孵育1h，TBST洗膜5次，每次10min，最后利用ECL化学发光法显影检测FMDVVP1蛋白。为了研究PF-4708671对其他口蹄疫病毒亚型的作用，利用FMDV A/GDMM/CHA/2013(MOI＝1)感染细胞，MTS法测定其抗病毒活性。
实验结果如图2～5所示：用MTS检测PF-4708671对FMDV是否具有抗病毒活性，在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度为100、200μmol时，PF-4708671才可以提供IBRS-2细胞80％以上的保护(图2)，并且显著的抑制FMDVmRNA(图4)和VP1蛋白水平(图5)的表达。而当浓度为50μmol时，PF-4708671则不能提供细胞有效的保护。同样，当用A型口蹄疫病毒感染细胞时，100、200μmol的PF-4708671也能有效的保护IBRS-2细胞(图3)，说明PF-4708671对A型FMDV也有抗病毒活性。
2.3间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况
将密度为3×105/孔IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI＝1)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的PF-4708671100μL，以PF-4708671的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定细胞15min，弃掉多聚甲醛，加入甲醇作用5min，用PBS漂洗3次，每次5min，加入封闭液(10％FBS，0.3％Triton X-100，89.7％PBS)封闭10min，之后加入用封闭液稀释好的一抗(1:100)，室温孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min，加入用封闭液稀释好的二抗(1:200)，室温孵育1h，PBS漂洗5次，每次5min。最后每孔加入300μL DAPI进行染色，作用5min，PBS漂洗2次，每次5min，荧光显微镜观察结果。
实验结果如图6(标尺为100μm)所示：未处理感染病毒后的IBRS-2细胞及用50μmolPF-4708671处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光，而100、200μmol处理组的IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了PF-4708671在IBRS-2细胞上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性。
2.4PF-4708671对口蹄疫病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价：
将在含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种FMDVO/MY98/BY/2010(MOI＝1)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液，此时作为0h。在病毒感染后0h，2h，4h，8h，16h分别向不同孔中加入PF-4708671，使其的终浓度为100μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃CO2恒温细胞培养箱中培养24h。收集不同组上清液，q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因mRNA和FMDVVP1蛋白水平。
实验结果如图7～8所示：在病毒感染后不同时间段用PF-4708671处理细胞，结果显示，在FMDV复制的0～8h内，与阴性对照相比，FMDV mRNA水平(图7)和VP1蛋白水平(图8)明显受到抑制。而在16h时PF-4708671的抑制作用并不明显，说明PF-4708671只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种PF-4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacaaaaca cggacccgac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtaccagg gtttggcctc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaccaccttc aactcgatca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgttggcgt agaggtcctt 20
Claims (5)
1.PF-4708671在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述PF-4708671在应用时其浓度范围为100～200μmol/L。
4.一种口蹄疫病毒抑制剂，其特征在于，所述抑制剂包括PF-4708671和药学上可接受的辅料。
5.根据权利要求4所述的抑制剂，其特征在于，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| LAURA R. PEARCE等: "Characterization of PF-4708671, a novel and highly specific inhibitor of p70 ribosomal S6 kinase (S6K1)", 《BIOCHEM. J.》 * |
| TODD M.BELL等: "Combination Kinase Inhibitor Treatment Suppresses Rift Valley Fever Virus Replication", 《VIRUSES》 * |
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