CN109758462B - 一种阿米洛利在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及阿米洛利在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用,属于兽用药物技术领域。本发明所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。
Description
技术领域
本发明涉及兽用药物技术领域,具体涉及一种阿米洛利在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
背景技术
口蹄疫病毒是一类小RNA病毒科的一种无包膜单股正链RNA病毒。现已发现该病毒包括A型、O型、C型、亚洲I型和南非Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型等7种血清型,同时各血清型又分为多个亚型。由该病毒导致的口蹄疫,主要感染猪、牛等偶蹄类动物,常在口、鼻、蹄等部位形成水泡并伴随发热、跋行等临床症状。口蹄疫传播途径多、流行范围广和传染性强,目前在多个国家频繁暴发,已严重威胁全球畜牧业的发展,并对世界经济和人类社会造成了巨大影响。它被世界动物卫生组织列为A类动物疫病名单之首,我国也将该病排在一类动物传染病名单的第一位,同时也是《国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)》中的三个单列病种之一。目前,疫苗免疫是防控口蹄疫的主要手段,然而疫苗的使用存在“免疫窗口期”即它不能在7天之内对动物提供保护。因此,为了弥补“免疫窗口期”,急需开发新型有效的抗病毒药物。
发明内容
本发明的目的在于提供阿米洛利在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。
本发明提供了阿米洛利在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。
优选的是,所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。
优选的是,所述阿米洛利在应用时的浓度范围为>400μmol/L。
本发明提供了阿米洛利(Amiloride)在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。阿米洛利对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用,抑制病毒的复制。细胞试验显示,阿米洛利细胞毒性低,对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒的复制均具有抑制作用;进一步的实验证实,阿米洛利能抑制FMDV复制的早期阶段,可将阿米洛利作为一种有效的抗口蹄疫病毒成分。
附图说明
图1为本发明实施例1中不同浓度的Amiloride对IBRS-2细胞的细胞毒性图;
图2为本发明实施例2中不同浓度的Amiloride对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图;
图3为本发明实施例2中不同浓度的Amiloride对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图;
图4为本发明实施例2中不同浓度的Amiloride对O型FMDV感染细胞的FMDV mRNA抑制作用图;
图5为本发明实施例2中不同浓度的Amiloride对O型FMDV感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图;
图6为本发明实施例3中IFA检测不同浓度的Amiloride对O型FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图;
图7为本发明实施例4中q-PCR检测Amiloride对FMDV吸附、穿入阶段中的mRNA抑制作用图;
图8为本发明实施例5中Amiloride在不同时间段对病毒感染细胞的FMDV mRNA抑制作用图;
图9为本发明实施例5中Amiloride在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图。
具体实施方式
本发明提供了阿米洛利(uPA合成抑制剂)在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。在本发明中,所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。阿米洛利对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用,抑制病毒的复制,阿米洛利只是在FMDV复制早期起作用,而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。本发明对阿米洛利的来源没有特殊的限定,采用本领域常规市售产品即可。
在本发明中,所述阿米洛利在应用时其浓度范围>400μmol/L。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种阿米洛利在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍,本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
Amiloride在IBRS-2细胞上的毒性实验
采用MTS法(MTS检测试剂盒购自Abcam公司)测定Amiloride(购自MCE公司)对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM(购自Gibco公司)洗3次,最后加入用含2%FBS(购自Gibco公司)的DMEM培养液梯度稀释好的Amiloride 100μL,以Amiloride的配制溶液相应DMSO浓度作为阴性对照孔,以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h,弃掉上层细胞培养液,用新鲜的DMEM洗三次,再加入100μL新鲜的DMEM,每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值,根据公式“细胞活性率=(OD药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100%”计算出不同浓度的Amiloride对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。
实验结果如图1所示:MTS结果显示,随着药物浓度的不断增加,细胞的活性率仍在70%以上,说明Amiloride对IBRS-2细胞毒性较低。
实施例2
Amiloride在IBRS-2细胞上抗口蹄疫病毒活性的评价
将含10%FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96孔板,待IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM洗3次,接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI=1)(国家口蹄疫参考实验室保存并提供)。1h后,去掉病毒液,用新鲜的DMEM洗3次,加入用含2%FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Amiloride 100μL,以Amiloride的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔,以无Amiloride、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养24h,弃掉上层细胞培养液,用新鲜的DMEM洗三次,再加入100μL新鲜的DMEM,每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值,根据公式“细胞活性率=(OD药物-OD空白)/(OD阴性-OD空白)×100%”计算出不同浓度Amiloride的抗病毒作用。同时收集不同组上清液,q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。
按照TRIZOL说明书提取细胞的RNA,按照SYBR Premix Ex TaqⅡ操作说明书进行荧光定量PCR,β-actin作为内参基因。用于检测FMDV 2B基因mRNA特异的引物序列为:
FMDV-for,5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1);
FMDV-rev,5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2);
β-actin的引物序列为:
β-actin for,5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3);
β-actin-rev,5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。反应体系为:SYBRPremix ExTaq:12.5μL,上游引物:1μL,下游引物:1μL,cDNA:1μL,灭菌水:9.5μL,反应程序为:95℃预变性30s;95℃变性5s,56退火30s,72℃延伸30s,40个循环。根据2-△△CT方法计算样品相对于内参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白,应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12%的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳,电泳2h后,将蛋白电转印至PVDF膜上。转膜2h完毕后,把膜置入新鲜配制的5%脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后,将膜置入兔抗O型FMDV VP1多克隆抗体(1:3000),小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中,4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜5次,每次10min,之后把膜放入相应二抗HRP标记山羊抗兔IgG,HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000),室温孵育1h,TBST洗膜5次,每次10min,最后利用ECL化学发光法显影检测FMDV VP1蛋白。为了研究Amiloride对其他口蹄疫病毒亚型是否具有抑制作用,利用FMDVA/GDMM/CHA/2013(MOI=1)感染细胞,MTS法测定其抗病毒活性。
实验结果如图2~5所示:用MTS检测Amiloride对FMDV是否具有抗病毒活性,在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度为400μmol及以上浓度时,Amiloride才可以提供IBRS-2细胞80%以上的保护(图2),并且降低FMDV mRNA(图4)和VP1蛋白水平(图5)的表达;而当浓度低于400μmol时,Amiloride则不能提供细胞有效的保护。同样,当用A型口蹄疫病毒感染细胞时,200μmol及以上浓度的Amiloride能有效的保护IBRS-2细胞(图3),说明Amiloride对A型FMDV也具有抗病毒活性。
实施例3
间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况
将密度为3×105/孔IBRS-2细胞铺到12孔板,待IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM洗3次,接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI=1)。1h后,去掉病毒液,用新鲜的DMEM洗3次,加入用含2%FBS的DMEM培养液梯度稀释好的Amiloride 100μL,以Amiloride的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔,放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定细胞15min,弃掉多聚甲醛,加入甲醇作用5min,用PBS漂洗3次,每次5min,加入封闭液(10%FBS,0.3%Triton X-100,89.7%PBS)封闭10min,之后加入用封闭液稀释好的一抗(1:100),室温孵育1h,PBS漂洗3次,每次5min,加入用封闭液稀释好的二抗(1:200),室温孵育1h,PBS漂洗5次,每次5min。最后每孔加入300μLDAPI进行染色,作用5min,PBS漂洗2次,每次5min,荧光显微镜观察结果。
实验结果如图6所示:未处理感染病毒后的IBRS-2细胞及用100、200μmolAmiloride处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光,而其他处理组的IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了Amiloride在IBRS-2细胞上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性。
实施例4
FMDV抑制病毒复制阶段的检测
将IBRS-2细胞铺至24孔板中,待细胞长满单层后,弃掉培养液。在病毒的吸附阶段:每孔加入FMDV病毒液(MOI=1)。然后向每孔中加入不同浓度的Amiloride,使其终浓度分别为400、600、800、1000μmol,设立不加入药物的阴性对照组,将细胞板放入4℃冰箱作用1h,只允许病毒附着于细胞表面。弃去病毒液,用DMEM洗去未结合的病毒,每孔加入400μL培养液,放入-80℃冰箱反复冻融3次,收集病毒液,10000r/min离心10min去除细胞碎片,上清液用于检测mRNA表达水平情况。在病毒穿入阶段:每孔加入200μL的FMDV病毒液,将细胞放入37℃温箱1h,允许病毒吸附细胞表面,用DMEM洗去未结合的病毒,然后向每孔中加入不同浓度的Amiloride 200μL,使Amiloride的终浓度分别为400、600、800、1000μmol,同时设立不加药物的阴性对照组,将细胞板放入37℃温箱培养1h,去掉药物,用DMEM洗去残留的药物,加入含有2%FBS的维持液,放入37℃温箱继续培养24h,收集上清检测mRNA表达水平情况。
实验结果如图7所示:在病毒的吸附(Attachment)阶段,分别用不同浓度的Amiloride和FMDV病毒液处理细胞,在培养箱中共同作用1h,结果显示无论用不同浓度的Amiloride处理细胞,病毒的mRNA表达水平与未处理组无明显差别,所以Amiloride不会对FMDV吸附细胞产生影响。在病毒的穿入(Entry)阶段,各药物处理组的mRNA和未经药物处理的阴性对照组相比没有明显差别,说明Amiloride不会影响病毒进入细胞的能力。
实施例5
Amiloride对口蹄疫病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价
将在含10%FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到12孔板,待IBRS-2细胞生长满单层后,弃掉细胞上层培养液,用新鲜的DMEM洗3次,接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI=1)。1h后,去掉病毒液,用新鲜的DMEM洗3次,加入用含2%FBS的DMEM培养液,此时作为0h。在病毒感染后0h,2h,4h,8h,16h分别向不同孔中加入Amiloride,使其的终浓度为1000μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃CO2恒温细胞培养箱中培养24h。收集不同组上清液,q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。
实验结果如图8~9所示:在病毒感染后不同时间段用Amiloride处理细胞,结果显示,在FMDV复制的0~8h内,与阴性对照相比,FMDV mRNA水平(图8)和VP1蛋白水平(图9)明显受到抑制。而在16h时Amiloride的抑制作用并不明显,说明Amiloride只是在FMDV复制早期起作用,而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种阿米洛利在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caacaaaaca cggacccgac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ttgtaccagg gtttggcctc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gaccaccttc aactcgatca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgttggcgt agaggtcctt 20
Claims (1)
1.阿米洛利在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用,其特征在于,所述口蹄疫病毒为A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒;
所述阿米洛利在应用时浓度>400μmol/L。
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Biological function of Foot-and-mouth disease virus non-structural proteins and non-coding elements;Gao等;《Virology Journal》;20161231;第13卷;第1-17页 * |
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