CN109745315B - 一种Merimepodib在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及Merimepodib在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用，属于兽用药物技术领域。本发明所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。

Description

一种Merimepodib在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的 应用

技术领域

本发明涉及兽用药物技术领域，具体涉及一种Merimepodib在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

背景技术

口蹄疫(FMD)是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种急性烈性传染病，主要感染猪、牛、羊等偶蹄兽和多种野生动物。口蹄疫的发生严重影响畜产品的质量和产量，传播极其迅制约动物产品的正常贸易，造成巨大的经济损失。因其影响的严重性，世界动物卫生组织(OIE)将FMD列在A类传染病的第一位，我国农业部也将其列在一类动物疾病的首位。目前主要通过疫苗免疫对口蹄疫进行防控，但由于该病潜伏期短，感染性和致病力特别强，易感动物种类繁多，抗原变异性强，机体对口蹄疫动物免疫应答程度较低等因素，该病至今还没有得到有效的控制与根除。因此，急需开发可供选择的控制口蹄疫的新策略。

发明内容

本发明的目的在于提供Merimepodib(MMPD)在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。

本发明提供了Merimepodib在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

优选的是，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。

优选的是，所述Merimepodib在应用时其浓度范围在12～25μmol/L。

本发明还提供了一种口蹄疫病毒抑制剂，所述抑制剂包括Merimepodib和药学上可接受的辅料。

优选的是，所述抑制剂中Merimepodib的浓度＞30μg/g。

优选的是，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。

本发明提供了Merimepodib在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。Merimepodib对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，延长感染动物的生存时间，本发明将Merimepodib作为有效组分制备得到的药物能够抑制口蹄疫病毒(FMDV)，防控口蹄疫。选用基本无毒性的药物浓度进行抗病毒实验，通过检测特立氟胺对FMDV复制的影响，显示了Merimepodib具有显著的抗FMDV活性并呈剂量依赖性。体内实验表明Merimepodib能够延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。Merimepodib能够作为抗FMDV感染的候选药物。

附图说明

图1为本发明实施列1提供的不同浓度的MMPD对IBRS-2细胞的细胞毒性图；

图2为本发明实施列1提供的不同浓度的MMPD对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图3为本发明实施列1提供的不同浓度的MMPD对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图4为本发明实施列1提供的不同浓度的MMPD对O型FMDV感染IBRS-2细胞中的FMDVmRNA抑制作用图；

图5为本发明实施列1提供的IFA检测不同浓度的MMPD对O型FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图；

图6为本发明实施列1提供的MMPD在不同时间段对病毒感染细胞的FMDVmRNA表达水平抑制作用图；

图7为本发明实施列1提供的MMPD在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达水平抑制作用图；

图8为本发明实施列1提供的MMPD对FMDV感染乳鼠死亡时间的影响。

具体实施方式

本发明提供了Merimepodib(MMPD，又名VX-497)在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。在本发明中，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。Merimepodib对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，延长感染动物的生存时间。本发明将Merimepodib作为有效组分制备得到的药物对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒均具有抑制作用，能够抑制口蹄疫病毒(FMDV)，防控口蹄疫。本发明对所述Merimepodib的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的Merimepodib常规市售产品即可。

在本发明中，所述Merimepodib在应用时其浓度范围在12～25μmol/L。

本发明还提供了一种口蹄疫病毒抑制剂，所述抑制剂包括Merimepodib和药学上可接受的辅料。

在本发明中，所述抑制剂中Merimepodib的浓度＞30μg/g。

在本发明中，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。在本发明中，所述甘油优选为注射用甘油。本发明对所述辅料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油的市售产品即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种Merimepodib在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.实验材料

1.1细胞、动物、病毒和药物

IBRS-2细胞由本课题组保存；3日龄乳鼠购自中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物场。FMDV(O/MY98/BY/2010和A/GDMM/CHA/2013)由国家口蹄疫参考实验室保存并提供；MMPD购自MCE公司，以DMSO进行配制。

1.2试剂

DMEM、胎牛血清FBS、胰蛋白酶培养基购自Gibco公司；MTS检测试剂盒购自Abcam公司；TRIZOL购自Invitrogen公司；SYBRPremix Ex Taq^Ⅱ试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL购自碧云天公司；BSA、PVDF膜购自BioRad公司；Tween-20、Tween-80购自上海生工生物工程公司；TritonX-100、DMSO购自Sigma公司；小鼠抗β-actin多克隆抗体、HRP标记抗兔或抗鼠IgG抗体均购自Abcam公司；兔抗O型FMDVVP1多克隆抗体由国家口蹄疫参考实验室郑海学博士惠赠；兔抗O型FMDV高免血清由国家口蹄疫参考实验室周广青惠赠。

2.实验方法和结果

2.1MMPD在IBRS-2细胞上的毒性实验：

采用MTS法测定MMPD对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，最后加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的MMPD 100μL，以MMPD的配制溶液相应DMSO浓度作为阴性对照孔，以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度的MMPD对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。

本实验结果如图1所示：MTS结果显示，随着药物浓度的不断增加，其对IBRS-2细胞的毒性加大。当浓度低于25μmol时，细胞活性在90％以上。当药物浓度的浓度高于25μmol时，细胞活性迅速下降，在100μmol的浓度下，细胞的活性率为20％。所以，当利用该药物制备抗FMDV药物时，其浓度应不高于25μmol。

2.2MMPD在IBRS-2细胞上抗口蹄疫病毒活性的评价：

将含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID₅₀O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的MMPD 100μL，以MMPD的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，以无MMPD、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养48h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μLMTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度MMPD的抗病毒作用。同时收集不同组上清液，q-PCR检测FMDV 2B基因的mRNA水平。按照TRIZOL说明书提取细胞的RNA，按照SYBRPremix Ex Taq^Ⅱ操作说明书进行荧光定量PCR，β-actin作为内参基因。用于检测FMDV 2B基因mRNA特异的引物序列为：

FMDV-for,5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1)；

FMDV-rev,5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2)；

β-actin的引物序列为：

β-actin for,5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3)；

β-actin-rev,5’-GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。

反应体系为：SYBRPremix ExTaq:12.5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，cDNA：1μL，灭菌水：9.5μL，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56退火30s，72℃延伸30s，40个循环。根据2^-△△CT方法计算样品相对于内参基因的表达量。为了研究MMPD对其他口蹄疫病毒亚型是否具有作用，利用100TCID₅₀A/GDMM/CHA/2013感染细胞，MTS方法测定抗病毒活性。

实验结果如图2～4所示：用MTS检测MMPD对FMDV是否具有抗FMDV病毒活性，在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度为12μmol和25μmol时，MMPD可提供IBRS-2细胞70％以上的保护(图2)，并且显著的抑制FMDVmRNA的表达水平(图4)。而当浓度低于12μmol，MMPD则不能提供细胞有效的保护。同样，当用A型口蹄疫病毒感染细胞时，6μmol及以上浓度的MMPD能有效的保护IBRS-2细胞(图3)，说明MMPD对A型FMDV也有抗病毒活性。

2.3间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况

将密度为3×10⁵/孔IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID₅₀O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的MMPD 100μL，以MMPD的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定细胞15min，弃掉多聚甲醛，加入甲醇作用5min，用PBS漂洗3次，每次5min，加入封闭液(10％FBS，0.3％TritonX-100，89.7％PBS)封闭10min，之后加入用封闭液稀释好的一抗(1:100)，室温孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min，加入用封闭液稀释好的二抗(1:200)，室温孵育1h，PBS漂洗5次，每次5min。最后每孔加入300μLDAPI进行染色，作用5min，PBS漂洗2次，每次5min，荧光显微镜观察结果。

实验结果如图5(标尺为100μm)所示：未处理感染病毒后的IBRS-2细胞及用6μmol及以下浓度的MMPD处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光，而其他处理组的IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了MMPD在IBRS-2细胞上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性。

2.4MMPD对口蹄疫病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价：

将在含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种100TCID₅₀O/MY98/BY/2010。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液，此时作为0h。在病毒感染后0h，2h，4h，8h，16h分别向不同孔中加入MMPD，使其的终浓度为25μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃CO₂恒温细胞培养箱中培养48h。收集不同组上清液，q-PCR和Western Blot分别检测FMDV2B基因的mRNA和FMDVVP1蛋白水平。用蛋白裂解液提取蛋白，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12％的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳，电泳2h后，将蛋白电转印至PVDF膜上。转膜2h完毕后，把膜置入新鲜配制的5％脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后，将膜置入兔抗O型FMDVVP1多克隆抗体(1:3000)，小鼠抗β-actin多克隆抗体(1:4000)中，4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次10min，之后把膜放入相应二抗HRP标记山羊抗兔IgG,HRP标记山羊抗小鼠IgG(1:3000)，室温孵育1h，TBST洗膜5次，每次10min，最后利用ECL化学发光法显影检测FMDVVP1蛋白。

实验结果如图6～7所示：在病毒感染后不同时间段用MMPD处理细胞，结果显示，在FMDV复制的0～8h内，与阴性对照相比，FMDV mRNA水平(图6)和VP1蛋白水平(图7)明显受到抑制。而在16h时MMPD的抑制作用并不明显，说明MMPD只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。

2.5MMPD在体内的抗口蹄疫病毒活性评价：

3～4日龄SPF BALB/C乳鼠24只，随机分成两组，12只/组，乳鼠和母鼠一同饲养。O型FMDV病毒来源于国家口蹄疫参考实验室细胞适应毒。实验分为两组，实验组12只乳鼠颈部皮下注射30μg MMPD，对照组12只乳鼠全部颈部皮下接种含10％DMSO和5％Tween-80的PBS100μL。2h之后，全部乳鼠颈部皮下注射含有100LD₅₀O型FMDV的PBS100μL。连续观察并记录乳鼠死亡情况。为了保证实验的安全性，动物的攻毒在P3实验室进行，相关操作符合实验动物管理委员会相关规定。

实验结果如图8所示：对照组乳鼠从病毒感染之后36h开始死亡，60h的时候已经全部死亡，而实验组虽然在48h开始死亡，到108h才全部死亡。实验组全部死亡时间与对照组乳鼠相比延迟了48h，由此可以看出，MMPD能够延缓口蹄疫病毒对乳鼠的致死效应。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种Merimepodib在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caacaaaaca cggacccgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtaccagg gtttggcctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaccaccttc aactcgatca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgttggcgt agaggtcctt 20

Claims (4)

1.Merimepodib在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用；所述口蹄疫病毒为A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Merimepodib在应用时其浓度范围在12～25μmol/L。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包括Merimepodib和药学上可接受的辅料；所述辅料为淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种；

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物中Merimepodib的浓度＞30μg/g。

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