CN109745320B

CN109745320B - 一种sb203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

Info

Publication number: CN109745320B
Application number: CN201910175576.4A
Authority: CN
Inventors: 常惠芸; 李世芳; 龚美娇; 邵军军; 常艳燕; 张永光
Original assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Lanzhou Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2019-03-08
Filing date: 2019-03-08
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2039-03-08
Also published as: CN109745320A

Abstract

本发明涉及SB203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用，属于兽用药物技术领域。本发明所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。

Description

一种SB203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及兽用药物技术领域，具体涉及一种SB203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

背景技术

口蹄疫病毒是一类小RNA病毒科的一种无包膜单股正链RNA病毒。现已发现该病毒包括A型、O型、C型、亚洲I型和南非I、II、III型等7种血清型，同时各血清型又分为多个亚型。由该病毒导致的口蹄疫，主要感染猪、牛等偶蹄类动物，常在口、鼻、蹄等部位形成水泡并伴随发热、跋行等临床症状。口蹄疫传播途径多、流行范围广和传染性强，目前在多个国家频繁暴发，已严重威胁全球畜牧业的发展，并对世界经济和人类社会造成了巨大影响。目前，疫苗免疫是防控口蹄疫的主要手段，然而疫苗的使用存在“免疫窗口期”即它不能在7天之内对动物提供保护。因此，为了弥补“免疫窗口期”，急需开发新型有效的抗病毒药物。

发明内容

本发明的目的在于提供SB203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。所述应用能够为进一步控制口蹄疫的传播提供一类高效、安全且质量可控的抗口蹄疫病毒药物。

本发明提供了SB203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。

优选的是，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。

优选的是，所述SB203580在应用时其浓度范围＞75μmol/L。

本发明还提供了一种口蹄疫病毒抑制剂，所述抑制剂包括SB203580和药学上可接受的辅料。

优选的是，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。

本发明提供了SB203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。SB203580对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，本发明将SB203580作为有效组分制备得到的药物能够抑制口蹄疫病毒(FMDV)。细胞试验显示，SB203580细胞毒性低，对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒的复制均具有抑制作用；进一步的实验证实，SB203580只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。SB203580能够作为一种有效的抗口蹄疫病毒成分。

附图说明

图1为本发明实施列1提供的不同浓度的SB203580对IBRS-2细胞的细胞毒性图；

图2为本发明实施列1提供的不同浓度的SB203580对O型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图3为本发明实施列1提供的不同浓度的SB203580对A型FMDV感染IBRS-2细胞的抑制作用图；

图4为本发明实施列1提供的不同浓度的SB203580对O型FMDV感染细胞的FMDVmRNA抑制作用图；

图5为本发明实施列1提供的不同浓度的SB203580对O型FMDV感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图；

图6为本发明实施列1提供的IFA检测不同浓度的SB203580对O型FMDV感染细胞的FMDV蛋白表达抑制作用图；

图7为本发明实施列1提供的SB203580在不同时间段对病毒感染细胞的FMDV mRNA抑制作用图；

图8为本发明实施列1提供的SB203580在不同时间段对病毒感染细胞的VP1蛋白表达抑制作用图。

具体实施方式

本发明提供了SB203580(p38MAPK选择性抑制剂)在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用。在本发明中，所述口蹄疫病毒包括A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。SB203580对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒诱导的细胞病变均有抑制作用，抑制病毒的复制，SB203580只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。本发明将SB203580作为有效组分制备得到的药物细胞毒性低，对A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒的复制均具有抑制作用，能够抑制口蹄疫病毒(FMDV)。本发明对SB203580的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规p38MAPK选择性抑制剂——SB203580市售产品即可。

在本发明中，所述SB203580在应用时其浓度范围＞75μmol/L。

在本发明中，所述辅料包括淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油中的一种或多种。在本发明中，所述甘油优选为注射用甘油。本发明对所述辅料的来源没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规淀粉、糖粉、糊精、聚乙二醇和甘油的市售产品即可。

下面结合具体实施例对本发明所述的一种SB203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。

实施例1

1.1实验材料

1.2细胞、病毒和药物

IBRS-2细胞由本课题组保存；FMDV(O/MY98/BY/2010和A/GDMM/CHA/2013)由国家口蹄疫参考实验室保存并提供；SB203580购自MCE公司，以DMSO进行配制。

1.3试剂

DMEM、胎牛血清FBS、胰蛋白酶培养基购自Gibco公司；MTS检测试剂盒购自Abcam公司；TRIZOL购自Invitrogen公司；SYBR Premix Ex Taq^II试剂盒均购自宝生物工程(大连)有限公司；RIPA裂解液、BCA法蛋白定量试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL购自碧云天公司；BSA、PVDF膜购自BioRad公司；吐温-20购自上海生工生物工程公司；Triton X-100、DMSO购自Sigma公司；小鼠抗β-actin多克隆抗体、HRP标记抗兔或抗鼠IgG抗体均购自Abcam公司；兔抗O型FMDV VP1多克隆抗体由国家口蹄疫参考实验室郑海学博士惠赠；兔抗O型FMDV高免血清由国家口蹄疫参考实验室周广青惠赠。

2.实验方法和结果

2.1SB203580在IBRS-2细胞上的毒性实验：

采用MTS法测定SB203580对IBRS-2细胞的细胞毒性。待铺到96孔板IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，最后加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的SB203580 100μL，以SB203580的配制溶液相应DMSO浓度作为阴性对照孔，以不作任何处理作细胞对照孔。放入37℃持续培养72h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μL MTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度的SB203580对IBRS-2细胞的毒性。实验独立重复三次。

本实验结果如图1所示：MTS结果显示，随着药物浓度的不断增加，细胞的活性率仍在80％以上，说明SB203580对IBRS-2细胞毒性极低。

2.2 SB203580在IBRS-2细胞上抗口蹄疫病毒活性的评价：

将含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到96孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI＝1)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的SB203580 100μL，以SB203580的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，以无SB203580、无病毒的作细胞对照孔。放入37℃持续培养24h，弃掉上层细胞培养液，用新鲜的DMEM洗三次，再加入100μL新鲜的DMEM，每孔加入20μL MTS溶液。37℃孵育4h后在酶标仪上测490nm处的吸光度值，根据公式“细胞活性率＝(OD_药物-OD_空白)/(OD_阴性-OD_空白)×100％”计算出不同浓度SB203580的抗病毒作用。同时收集不同组上清液，q-PCR和Westem Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDV VP1蛋白水平。按照TRIZOL说明书提取细胞的RNA，按照SYBRPremix Ex Taq^II操作说明书进行荧光定量PCR，β-actin作为内参基因。用于检测FMDV 2B基因mRNA特异的引物序列为

FMDV-for，5’-CAACAAAACACGGACCCGAC-3’(SEQ ID NO.1)；

FMDV-rev，5’-TTGTACCAGGGTTTGGCCTC-3’(SEQ ID NO.2)；

β-actin的引物序列为：

β-actin for，5’-GACCACCTTCAACTCGATCA-3’(SEQ ID NO.3)；

β-actin-rev，5’GTGTTGGCGTAGAGGTCCTT-3’(SEQ ID NO.4)。

反应体系为：SYBR Premix ExTaq：12.5μL，上游引物：1μL，下游引物：1μL，cDNA：1μL，灭菌水：9.5μL，反应程序为：95℃预变性30s；95℃变性5s，56退火30s，72℃延伸30s，40个循环。根据

方法计算样品相对于内参基因的表达量。用蛋白裂解液提取蛋白，应用BCA法测定提取的蛋白浓度。配制12％的分离胶进行蛋白SDS-PAGE变性电泳，电泳2h后，将蛋白电转印至PVDF膜上。转膜2h完毕后，把膜置入新鲜配制的5％脱脂奶粉进行封闭1h。封闭结束后，将膜置入兔抗O型FMDV VP1多克隆抗体(1∶3000)，小鼠抗β-actin多克隆抗体(1∶4000)中，4℃冰箱孵育过夜。用TBST洗膜5次，每次10min，之后把膜放入相应二抗HRP标记山羊抗兔IgG，HRP标记山羊抗小鼠IgG(1∶3000)，室温孵育1h，TBST洗膜5次，每次10min，最后利用ECL化学发光法显影检测FMDV VP1蛋白。为了研究SB203580是否对其他口蹄疫病毒亚型具有抑制作用，利用FMDVA/GDMM/CHA/2013(MOI＝1)感染细胞，MTS测定其抗病毒活性。

实验结果如图2～5所示：用MTS检测SB203580对FMDV是否具有抗病毒活性，在分别加入不同浓度的药物情况下结果显示在浓度为75、100μmol时，SB203580才可以提供IBRS-2细胞90％以上的保护(图2)，并且显著的抑制FMDV mRNA(图4)和VP1蛋白水平的表达(图5)。而当浓度低于75μmol时，SB203580则不能提供细胞有效的保护。同样，当用A型口蹄疫病毒感染细胞时，50μmol及以上浓度的SB203580能有效的保护IBRS-2细胞(图3)，说明SB203580对A型FMDV也有抗病毒活性。

2.3间接免疫荧光检测感染细胞组中FMDV蛋白的表达情况

将密度为3×10⁵/孔IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI＝1)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液梯度稀释好的SB203580 100μL，以SB203580的配制溶液相应DMSO浓度作为病毒对照孔，放入37℃持续培养12h。弃掉上层细胞培养液，PBS清洗2次，4％多聚甲醛固定细胞15min，弃掉多聚甲醛，加入甲醇作用5min，用PBS漂洗3次，每次5min，加入封闭液(10％FBS，0.3％Triton X-100，89.7％PBS)封闭10min，之后加入用封闭液稀释好的一抗(1∶100)，室温孵育1h，PBS漂洗3次，每次5min，加入用封闭液稀释好的二抗(1∶200)，室温孵育1h，PBS漂洗5次，每次5min。最后每孔加入300μL DAPI进行染色，作用5min，PBS漂洗2次，每次5min，荧光显微镜观察结果。

实验结果如图6(标尺为100μm)所示：未处理感染病毒后的IBRS-2细胞及用50μmol及以下浓度的SB203580处理过的病毒感染组可见大量的特异性荧光，而其他处理组的IBRS-2细胞中则有少量的荧光。这一结果进一步的证实了SB203580在IBRS-2细胞上的抗口蹄疫病毒活性呈现剂量依赖性。

2.4SB203580对口蹄疫病毒感染IBRS-2细胞抑制时间的评价：

将在含10％FBS的DMEM完全培养基上生长良好的IBRS-2细胞铺到12孔板，待IBRS-2细胞生长满单层后，弃掉细胞上层培养液，用新鲜的DMEM洗3次，接种FMDV O/MY98/BY/2010(MOI＝1)。1h后，去掉病毒液，用新鲜的DMEM洗3次，加入用含2％FBS的DMEM培养液，此时作为0h。在病毒感染后0h，2h，4h，8h，16h分别向不同孔中加入SB203580，使其的终浓度为100μmol。同时设立不加药物的阴性对照。37℃ CO₂恒温细胞培养箱中培养24h。收集不同组上清液，q-PCR和Western Blot分别检测FMDV 2B基因的mRNA和FMDV VP1蛋白水平。

实验结果如图7～8所示：在病毒感染后不同时间段用SB203580处理细胞，结果显示，在FMDV复制的0～8h内，与阴性对照相比，FMDV mRNA水平(图7)和VP1蛋白水平(图8)明显受到抑制。而在16h时SB203580的抑制作用并不明显，说明SB203580只是在FMDV复制早期起作用，而进入病毒复制后期时则不能阻止病毒的复制。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所

<120> 一种SB203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

caacaaaaca cggacccgac 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgtaccagg gtttggcctc 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaccaccttc aactcgatca 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gtgttggcgt agaggtcctt 20

Claims

1.SB203580在制备预防口蹄疫病毒感染的药物中的应用，所述口蹄疫病毒为A型口蹄疫病毒和O型口蹄疫病毒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述SB203580在应用时其浓度范围＞75μmol/L。