CN117737005A - 一株猪轮状病毒毒株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一株猪轮状病毒毒株及其应用。本发明提供了一株传代稳定性好，致病性强，免疫原性好，且能够诱导机体产生高滴度中和抗体且维持时间长的猪轮状病毒毒株，命名为PORV/JL/2021052，将其制备成疫苗后能够特异性的预防或治疗猪轮状病毒所致疾病，为牧区猪轮状病毒感染的防控和治疗提供重要的医用价值。

Description

一株猪轮状病毒毒株及其应用

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，尤其涉及一株猪轮状病毒毒株及其应用。

背景技术

猪轮状病毒 (Porcine rotavirus, PoRV)可以感染各种年龄段的猪，哺乳仔猪和断奶仔猪最易感，感染率达90%-100%，引起仔猪腹泻和胃肠炎，临床表现为水样腹泻，精神不振，食欲减退等。由于感染PoRV的仔猪抵抗力急剧下降，常继发细菌和其它腹泻类病毒的混合感染，直接或间接影响猪群生产力，给养猪业造成严重的经济损失。

轮状病毒（Rotavirus, RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）轮状病毒属（Rotavirus），是无囊膜双链 RNA 病毒。猪轮状病毒(Porcine rotavirus, PoRV)目前被分为四种血清型（A、B、C、E)，其中A群轮状病毒（Group A rotavirus , RVA）流行范围最广，是引起仔猪急性腹泻的主要原因之一。RVA 的基因组是分节段的双股 RNA，其基因组由 11个节段构成，分别编码 6 个结构蛋白（VP1~VP4, VP6, VP7）和 6 个非结构蛋白（NSP1~NSP6）。VP7 和 VP4 是 RVA 重要的两个结构蛋白，是结合宿主细胞受体的病毒蛋白，决定病毒的毒力，也是诱导机体产生中和抗体的主要蛋白。VP7蛋白由 326 个氨基酸组成，分子量为37kDa，决定 RVA 的 G 型。VP4蛋白由轮状病毒基因片段 4 编码，共编码 775 个氨基酸，相对分子质量约为 87.6kDa，它也决定了该病毒的P型。G 型与 P 型之间会产生不同的组合。迄今为止，己经发现的 G 型有 36 个，P 型有 51 个，不同型毒株诱导的交叉保护性低，在猪感染的PoRV中，G3、G4、G5、G9 和G11是最流行的G基因型，通常与P[5]、P[6]、P[7]、P[13]、P[23]和P[28]组合的形式在猪场流行。

针对猪轮状病毒并没有切实有效的治疗方案，接种疫苗是预防控制RVA感染的有效手段。因此，针对不同基因型毒株开发高效的灭活疫苗，对预防和治疗猪轮状病毒所致疾病，为防控猪轮状病毒疫情的暴发和流行具有重大意义。

发明内容

第一方面，本发明提供了一株猪轮状病毒毒株，其为猪轮状病毒PORV/JL/2021052，其保藏号为CGMCC No.45764。

该毒株为猪轮状病毒流行株，能够在贴壁MA104细胞中稳定传代，且致病性强，免疫原性好，能够诱导机体产生高滴度且维持时间长的中和抗体，为有效的疫苗制备和猪轮状病毒疫情的防控提供了基础。

目前已经报道的用于制备疫苗的猪轮状病毒毒株主要为G9基因型，本发明提供的该毒株为G3P23基因型，基于该毒株制备的疫苗或其它检测试剂或试剂盒等产品能够针对G3P23基因型猪轮状病毒毒株，实现特异性地诊断、预防和治疗作用。

该毒株已于2023年12月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；邮政编码：100101，分类命名：猪轮状病毒Porcine rotavirus，保藏编号为CGMCC No.45764。

本发明的猪轮状病毒毒株分离自吉林猪轮状病毒阳性猪的肠组织。

在蚀斑克隆纯化过程中，本发明筛选了大量的蚀斑样进行传代，同时在传代过程中对不同毒株感染细胞的病变程度进行观察，结果发现一部分毒株无法进行长期的传代，其传代稳定性较差，另一部分毒株感染细胞的病变程度较差，其毒力较弱。经过大量筛选以及免疫试验验证，最终获得了本发明致病性强，免疫原性好的保藏毒株PORV/JL/2021052。

第二方面，本发明提供了上述猪轮状病毒毒株在药物或试剂制备中的应用，所述药物或试剂用于治疗、预防或诊断猪轮状病毒所致疾病。

第三方面，本发明提供了一种检测试剂或试剂盒，其中含有所述猪轮状病毒毒株。

所述检测试剂或试剂盒用于治疗、预防或诊断猪轮状病毒所致疾病。

第四方面，本发明提供了一种疫苗，其中含有所述猪轮状病毒或其培养物。

作为本发明的一种优选的实施方案，所述疫苗为灭活疫苗。

作为本发明的一种优选的实施方案，所述疫苗为兽用疫苗。

作为本发明的一种优选的实施方案，制备所述疫苗的猪轮状病毒或其培养物中的病毒含量为10^8.0TCID₅₀/mL以上。

作为本发明的一种优选的实施方案，接种所述疫苗后，血清中和抗体效价水平不低于1:360。

作为本发明的一种优选的实施方案，所述疫苗中还包括佐剂。

第五方面，本发明提供了上述任一实施方案中疫苗的制备方法，包括：

将所述猪轮状病毒毒株接种于细胞中进行培养，制得病毒液培养物；再将所述病毒液培养物灭活后与佐剂混合。

优选地，采用MA104细胞进行病毒培养。

本发明还进一步发现，选择MA104细胞培养所述毒株制得的病毒液的病毒含量较高。

优选地，培养至细胞病变达80%以上时，收获病毒液培养物。

优选地，灭活采用β-丙内酯，更优选0.25‰的β-丙内酯。

优选地，灭活的步骤包括：

将所述病毒液培养物与β-丙内酯混合后，在80~100r/min、0~8℃条件下灭活。

优选地，灭活24h以上。

优选地，灭活的病毒液与佐剂按照重量比1：0.5~1.5混合，在30~33℃下乳化后制得。

优选地，乳化的时间为30min以上。

第六方面，本发明提供了上述任一实施方案中的疫苗或疫苗的制备方法在制备药物或试剂中的应用；所述药物或试剂用于治疗、预防或诊断猪轮状病毒所致疾病。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

本发明提供了一株传代稳定性好，致病性强，免疫原性好，且能够诱导机体产生高滴度中和抗体且维持时间长的猪轮状病毒毒株，将其制备成疫苗后能够特异性的预防或治疗猪轮状病毒所致疾病，为牧区猪轮状病毒感染的防控和治疗提供重要的医用价值。

附图说明

图1为PORV/JL/2021052病毒株感染MA104细胞的光学显微镜观察照片；其中，A为24h阴性对照；B为接种24h的MA104细胞；C为48h阴性对照；D为接种48h的MA104细胞；E为72h阴性对照；F为接种72h的MA104细胞。

图2为PORV/JL/2021052 F12代生长曲线。

图3为PORV/JL/2021052病毒株电镜观察照片。

图4为猪轮状毒毒株VP7和VP4信息表。

图5为猪轮状毒毒株VP7和VP4信息表。

图6为PORV/JL/2021052病毒株VP7基因测序系统同源性分析结果图。

图7为PORV/JL/2021052病毒株VP7基因测序系统进化树分析结果图。

图8为PORV/JL/2021052病毒株VP4基因测序系统同源性分析结果图。

图9为PORV/JL/2021052病毒株VP4基因测序系统进化树分析结果图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》(《Molecular Cloning:A Laboratory Manual》Sambrook，J.，Russell，DavidW.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor)。

实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。

实施例1 毒株分离和鉴定

1.1 细胞、病料

MA104细胞是由金宇保灵生物药品有限公司保存，病料于2021年采集自吉林省发生腹泻猪场的猪的肠组织。

1.2 病料处理

接种细胞前，将经RT-PCR检测为PORV阳性的腹泻猪的肠组织用DMEM 按体积比1：5制成悬液，研磨仪研磨，-80℃冻融一次，4℃条件下 12000r/min离心30min，取上清液用0.22μm的滤器进行过滤后得病毒悬液，加入双抗（100μg链霉素/mL、100U青霉素/mL）放入-4℃冰箱冷藏保存备用。在分离病毒时将肠组织悬液置于-80℃速冻，加快了病毒从肠组织中释放出来的同时减轻冷冻过程中活病毒的损失，提高了病毒分离成功的几率。

1.3 病毒分离筛选

将1.2中制备得到的病毒液加入含终浓度为20μg/mL（0.25%浓度）的胰酶，提前置于水浴温度为37℃的环境中孵育激活1h。选取铺满单层的MA104贴壁细胞(25cm²)，弃掉原培养液，用PBS洗细胞一次，加入上述所得病毒悬液1mL，置于37℃，5％CO₂培养箱中吸附1h后弃去接种物，加入含有双抗（100μg链霉素/mL、100U青霉素/mL）和胰酶（终浓度为5μg/mL)的DMEM培养基10mL培养。每日观察细胞是否产生细胞病变（CPE），第一代无病变于第5天收集培养液冻融3次后继续盲传。在第二代可见细胞产生明显的病变。如图1所示，病变可见典型的细胞圆缩，拉丝，脱落成团块现象。当细胞病变达80％以上时，冻融3次，收获病毒液。病毒在MA104贴壁细胞上传代，进行驯化培养。

1.4 病毒的蚀斑纯化

（1）向猪轮状病毒PORV/JL/2021052株F3代病毒液加入1mL胰酶，使得胰酶的终浓度为20μg/mL，在37℃水浴锅中孵育激活1h，用DMEM进行10倍梯度稀释至10^-1~10^-5后，弃去生长成致密单层的MA104细胞六孔板中培养液，用维持液清洗2次后，每孔加入400uL上述激活后不同稀释倍数的病毒液，置于培养箱中吸附1h后，弃掉液体，加铺约3mm厚的第一层营养琼脂，所述营养琼脂指2％低熔点琼脂糖和2×DMEM等体积混匀，室温静置30min后于CO₂培养箱，37℃，5％CO₂条件下倒置培养3天后，待细胞出现病变时加铺第二层营养琼脂，室温静置30min后于37℃，5％CO₂条件下避光倒置培养，每日观察记录蚀斑生长情况；

（2）待蚀斑形成后，选取细胞孔内小且孤立的空斑，用10µl枪头吸出，连同琼脂糖一起放入100uL的不含血清DMEM中，反复冻融3次，使病毒充分释放，加入终浓度为20μg/mL的胰酶在37℃水浴锅中孵育激活1h后接种新的空白MA104细胞，进行病毒增殖，如此重复克隆三次，随机挑选第四代克隆的五个蚀斑进行传代培养，即F9代病毒进行培养，测定病毒含量，挑选病毒含量最高的一株毒株，通过MA104细胞继续传代，即为纯化后的猪轮状毒PORV/JL/2021052株病毒。

1.5 电镜观察

取猪轮状病毒PORV/JL/2021052病毒液，以10000r/min离心30分钟，取上清液40000r/min离心5小时，弃上清液，沉淀物用0.5mL去离子水溶解，用2%磷钨酸钠负染30分钟，室温下自然干燥后，在透射电镜下观察。如图3所示，可见该分离株为近似圆形，形态大小65-70 nm，似车轮状的病毒颗粒，符合猪轮状病毒的特点。

1.6 PCR鉴定与序列分析

该实验利用GenBank中收录的猪A群轮状病毒VP7基因序列设计扩增VP7引物及2016年原霖在中国畜牧兽医上发表的《猪A群轮状病毒BJ株的分离与鉴定》一文中VP4基因扩增引物。引物的核苷酸序列如表1所示。

表1

利用以上特异性检测引物对分离得到的病毒株进行PCR扩增。将该产物送上海生工公司测序并将结果拼接，与GenBank数据库中已发表的26株猪轮状毒VP4和VP7基因序列（如图4、图5）进行同源性比较，并绘制系统进化树，如图6、图7、图8、图9所示。结果发现毒株VP7基因片段与LNCY株(登录号：MF462326)的核苷酸同源性最高为94.5%，与Toledo143267.2株（登录号：MZ643350）的核苷酸同源性为85.9%。VP7基因片段与KY-2022株(登录号：OR127199.1)同源性最高为98.5%，与7RE株（登录号：KC610703）核苷酸同源性为87.6%，猪轮状病毒毒株PORV/JL/2021052基因型为G3P23。

1.7 病毒毒价的测定

取已长成良好铺满单层的MA104细胞96孔细胞培养板，弃去细胞培养液，并用PBS洗涤两次。分别将连续传代的病毒液用无血清DMEM培养基作10倍系列稀释，分别将10^-2-10^-6稀释度病毒液接种到96孔细胞培养板，每个稀释度接种4孔，同时设立阳性对照与阴性对照。将培养板置于37℃、5%CO₂培养箱中培养3-5天，逐日观察CPE并记录。病毒滴度按Reed-Muench法计算。实验结果第3、4、5、7、10、12、15、17、20代毒毒价分别为10^7.0TCID₅₀/mL、10^6.5TCID₅₀/mL、10^7.5TCID₅₀/mL、10^7.5TCID₅₀/mL、10^8.0TCID₅₀/mL、10^7.5TCID₅₀/mL、10^8.0TCID₅₀/mL、10^8.5TCID₅₀/mL、10^8.0TCID₅₀/mL。表明该猪轮状病毒毒株可在MA104细胞上稳定传代，且可获得高滴度的病毒液，可作为猪轮状病毒疫苗的候选毒株。

1.8病毒生长曲线的测定

为了研究病毒的生长特性，将病毒接种MA104细胞绘制生长曲线，取分离毒F12代病毒液按1%的病毒量接种MA104细胞，37℃，5％CO₂培养箱中吸附1h后弃去接种物，加入维持液继续培养，每隔8小时取样，直至接种后72h，不同时间点收集病毒液测定的TCID₅₀，根据测定结果绘制病毒在MA104细胞上的生长曲线，如图2。

实施例2病毒灭活疫苗的制备

2.1 猪轮状毒种毒的制备

取生长至良好单层的MA104贴壁细胞，弃掉原有培养液，按0.5%-2%（v/v）的比例加入猪轮状病毒液F10，于37℃条件下培养，当细胞病变≧80%时，收获病毒液并冻融3次，即为基础种毒，将此基础毒种用DMEM培养液作10倍系列稀释，取10⁴-10⁸共5个稀释度，接种长成单层的MA104细胞96孔板，每个稀释度分别接种4孔，每孔加100uL稀释液，然后补加100uLDMEM，同时设置阴，阳性对照。37℃，5％CO₂培养箱中培养5天，显微镜下观察细胞病变情况，按Reed-Muench法计算TCID₅₀。经计算该毒种的病毒含量不低于10^8.0TCID₅₀/mL。

2.2 制苗用病毒液的纯净性检验

按现行《中国兽药典》附录进行检验，结果表明该基础毒种无细菌、支原体和外源病毒污染。

2.3制苗用病毒液的灭活

使用0.25‰的β-丙内酯在转速为80-100/min的摇床上4℃灭活24h，室温再次灭活24小时以水解残余的β-丙内酯，获得灭活病毒液。将灭活病毒液用DMEM培养液稀释后，按照培养液10％(V/V)的比例接种于生长良好的MA104贴壁细胞，同时同法设定两个对照，其中一瓶为正常细胞组，另一瓶为含β-丙内酯的维持液(β-丙内酯含量与灭活抗原液试验样一致)，置37℃、含5％CO₂培养箱中培养5日，逐日观察，将培养物于-80℃冻融3次后，按上述方法盲传3代，观察每代培养物CPE。结果表明均无CPE产生，确定灭活完全。

2.4疫苗制备

（1）水相的制备：将灭活病毒液加热至31±1℃备用。

（2）油相的制备：采用ISA 201VG佐剂，预热至31±1℃备用。

（3）乳化：将油相和水相按质量比为1：1的比例配比混合后乳化。具体操作为：将佐剂进料到乳化缸中，在搅拌条件下，将水相正压缓慢进料到乳化缸中，于30-33℃搅拌30min至水相与佐剂充分混合，乳化成双相油乳剂疫苗。随后定量分装，加盖密封，贴签，置2~8℃保存。

2.5疫苗产品检测

（1）外观：乳白色略带粘滞性乳状液。

（2）剂型：水包油包水型。

（3）稳定性：吸取疫苗10mL加入离心管中，以3000r/min离心15分钟，管底析出的水相不多于0.5mL。

（4）黏度：按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。

（5）装量检查：按现行《中国兽药典》附录进行检验，符合规定。

（6）无菌检验：按现行《中国兽药典》附录进行检验，无菌生长。

（7）安全检验

用体重350~450g的豚鼠2只，各皮下注射疫苗2mL；用体重18~22g小鼠5只，各皮下注射疫苗0.5mL。逐日观察7日，结果均不出现因注射疫苗引起的死亡或明显的局部反应或全身不良反应。

2.6 中和抗体效价检测

选取体重为350~450g的健康雌性豚鼠（猪轮状病毒中和抗体效价不高于1:6）8只，随机分为2组。第一组4只豚鼠各腿部肌肉注射疫苗1.0mL，作为免疫组；第二组4只豚鼠各腿部注射DMEM 1.0mL，作为对照组；21天后以同样方式加强免疫。

将一免后21天，二免后21天，60天，90天分别心脏采血，分离血清，测定抗猪轮状病毒中和抗体效价，并且观察豚鼠免疫后抗体在体内维持情况，结果如表2所示。

表2

可见，二免后免疫组豚鼠血清中抗猪轮状病毒中和抗体效价水平均较高（不低于1:360），随着时间的推移，免疫组能够在较长的时间持续维持较高的效价水平，而对照组中和抗体效价均低于1:6。

以上结果表明，本发明提供的毒株能够在细胞上稳定传代，能够为有效的疫苗制备和猪轮状病毒防控提供了基础。采用本发明的毒株制备的灭活疫苗免疫机体后，能够诱导产生高滴度的中和抗体且维持时间长。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.一株猪轮状病毒毒株，其特征在于，其为猪轮状病毒PORV/JL/2021052，其保藏号为CGMCC No.45764。

2.权利要求1所述的猪轮状病毒毒株在药物或试剂制备中的应用，所述药物或试剂用于治疗、预防或诊断猪轮状病毒所致疾病。

3.一种检测试剂或试剂盒，其特征在于，其中含有权利要求1所述的猪轮状病毒毒株。

4.一种疫苗，其特征在于，其中含有权利要求1所述的猪轮状病毒或其培养物。

5.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗为灭活疫苗。

6.根据权利要求4或5所述的疫苗，其特征在于，制备所述疫苗的猪轮状病毒或其培养物中的病毒含量为10^8.0TCID₅₀/mL以上。

7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，接种所述疫苗后，血清中和抗体效价水平不低于1:360。

8.根据权利要求4所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中还包括佐剂。

9.权利要求8所述疫苗的制备方法，其特征在于，包括：

将权利要求1所述的猪轮状病毒毒株接种于细胞中进行培养，制得病毒液培养物；再将所述病毒液培养物灭活后与佐剂混合。

10.权利要求4~8中任一项所述的疫苗、或权利要求9所述的疫苗的制备方法在制备药物或试剂中的应用；所述药物或试剂用于治疗、预防或诊断猪轮状病毒所致疾病。