CN117343909A - 一株猪流行性腹泻病毒弱毒株及其应用 - Google Patents

一株猪流行性腹泻病毒弱毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明从养殖场分离得到一株PEDV‑WN株强毒毒株，该WN株与近几年的PEDV流行毒株的同源性要高于目前市场上的CV777与AJ1102株，因而，以其作为出发毒株进行传代致弱，选取的F130代毒株进行保藏，用于弱毒疫苗的生产，该毒株相对其他代次的毒株免疫效果最好，其能刺激仔猪产生最高的平均中和抗体水平，且其培养性能也优于各代次的毒株，是最佳的疫苗生产用毒株。

Description

一株猪流行性腹泻病毒弱毒株及其应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株猪流行性腹泻病毒弱毒株及其应用。
背景技术：
猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的高度接触性猪肠道传染病，临床表现为：呕吐、腹泻、脱水，虽然不同年龄段的猪都可能受到不同程度的感染并出现症状，但仔猪的病情特别严重，致死率高。2010年，PEDV变异毒株在我国出现，其传播速度快、对1周龄内仔猪致死率可达100％，给猪场造成严重的经济损失，对我国养猪业的发展构成严重威胁。
PEDV的高变异性是仔猪腹泻防控的难点，目前临床上，尚无针对PEDV的有效药物，主要通过接种灭活苗和弱毒苗进行防控，但存在安全性和有效性低、成本高等缺陷，因此，开发高效、安全、价廉的PED疫苗迫在眉睫。PED传统疫苗包括灭活疫苗与弱毒疫苗。PED灭活疫苗安全、稳定，分为PED组织灭活苗与PED细胞灭活苗，然而，灭活苗始终存在需高剂量免疫的局限，相较之下，弱毒疫苗具有免疫原性好，能够激发宿主原位免疫的优势，弱毒苗不需佐剂且一次免疫即可产生较强免疫力。
由于PEDV传播速度快、危害大，因而，对于PEDV疫苗的需求量极大，特别是弱毒苗。目前，国内多家兽用疫苗生产企业和研究所都积极布局PEDV弱毒疫苗的技术研发，例如本公司的母公司陕西诺威利华生物科技有限公司是国内较早从事PEDV疫苗开发的企业，公司申请并获得了6项PEDV疫苗相关的发明专利授权的，其中与西北农林科技大学共同开发和布局了PEDV弱毒疫苗的方法(ZL201810691800.0、ZL201810691031.4、ZL201810690966.0)，并且目前新兽药申报已经进入临床阶段。另外，中国农业科学院上海兽医研究所也通过传代培养获得了一株FJzz1-F200(CN112779228A)其致病性弱，具有作为PEDV候选弱毒疫苗毒株的潜力；上海市农业科学院也分离得到了一株JS/PEDV/2/2014G100(CN107619822A)，该毒株归属于G1亚群，在Vero细胞上的增殖不依赖于胰酶，属于细胞适应株，其具有较好的交叉保护性、抗原性和免疫原性。但是，生产中发现，PEDV病毒变异呈现不断加快的趋势，该病毒致病特点使传统疫苗遇到很大挑战。弱毒疫苗研究的关键是如何将病毒致弱同时使病毒保持较强的抗原性，因而，筛选合适的毒株对于弱毒疫苗的开发具有重要的意义。
发明内容：
为了丰富PEDV弱毒疫苗的种类，本发明旨在提供一种猪流行性腹泻病毒弱毒株，该毒株具有良好的培养性能，培养液中病毒含量高，且相对其他代次的弱毒毒株，能够刺激机体产生更高水平的中和抗体。
本发明采用如下技术方案：
一种猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-KB-4-R株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.15898，分类命名:猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus)，保藏时间是2018年06月25日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明还请求保护所述猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-KB-4-R株的分离方法，其特征在于，所述毒株是由PEDV强度经传代致弱制备得到。
本发明还请求保护所述猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-KB-4-R株在制备预防猪流行性腹泻的药物中的应用。
优选地，所述药物为疫苗。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
首先，本发明从养殖场分离得到一株PEDV-WN株强毒毒株，该WN株与近几年的PEDV流行毒株的同源性要高于目前市场上的CV777与AJ1102株，因而，以其作为出发毒株进行传代致弱，所得到的弱毒毒株与现行流行的毒株更为解决，能够更好地保证疫苗的免疫接种效果，对于PED的流行具有预防和控制的作用。
其次，经传代和免疫学试验表明，本发明选取的F130代毒株进行保藏，用于弱毒疫苗的生产，该毒株相对其他代次的毒株免疫效果最好，其能刺激仔猪产生最高的平均中和抗体水平，且其培养性能也优于各代次的毒株，是最佳的疫苗生产用毒株。
附图说明：
图1.RT-PCR扩增Vero细胞培养物电泳图：M：DNA Marker 2000；1：第4代的Vero细胞培养物；2：疫苗毒CV777对照；3：阴性对照。
图2：PEDV-WN株与近年来田间流行毒株全基因序列绘制的基因进化树。
具体实施方式：
实施例1：猪流行性腹泻病毒WN株的分离与鉴定
1.组织病料：
从陕西渭南某养殖场采集有腹泻症状3～5日龄仔猪的十二指肠。
2.猪流行性腹泻病毒分离：
将组织样品剪碎后匀浆，3000r/min离心5分钟，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌，接种生长良好的单层Vero细胞，吸附1小时后，弃去病毒液，PBS(0.01mol/L，pH值7.2)清洗三次后，加入细胞维持液，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养5日，观察是否出现细胞病变，如此盲传至细胞出现病变，收获培养物并命名，置-70℃以下保存。
病料接种Vero细胞后，盲传3代，置37℃，含5％CO2的培养箱中培养96小时后，产生细胞病变，表现为合胞体、细胞呈灶状脱落等。再继续传至第4代，收获培养物，标记为猪流行性腹泻病毒WN株F4代，置-70℃以下保存。
3.猪流行性腹泻病毒鉴定
3.1RT-PCR检测
3.1.1病毒RNA的提取：按照试剂盒的说明进行RNA的提取，提取物立即进行反转录或贮存于-70℃以下备用。
3.1.2反转录：取总RNA 5.25μl，5×Buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.5μl，随机引物(10mmol/L)1μl，M-MLV反转录酶0.5μl，RNA酶抑制剂0.25μl，灭菌水0.5μl，总体积10μl。反应条件为37℃10分钟，42℃反转录1小时，冰浴2分钟。
3.1.3PCR：取反转录产物1μl，2×Mix 12.5μl，引物PEDV-F、PEDV-R各1μl，高压灭菌水9.5μl，总体积25μl。反应条件：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸45秒，35个循环，72℃7分钟。引物序列PEDV-F:AACGGTTCTATTCCCGTTGATG；
PEDV-R：TAAATGAAGCACTTTCTCACTATC。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
提取细胞培养物总RNA，进行RT-PCR检测，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为645bp的目的条带，详见图1。该结果证明该分离毒株为猪流行性腹泻病毒。
3.2病毒全基因组测序及序列分析：
提取病毒总RNA，用随机引物反转录后的cDNA产物进行病毒全基因组测序，使用MEGA5.5软件进行全基因组序列比对。
将WN株进行全序列测定，并与GenBank中公布的近几年PEDV流行毒株17株、弱毒疫苗株CV777、attenuated DR13以及武汉科前公司的PEDV灭活疫苗强毒株AJ1102序列进行比对与遗传进化分析。结果显示，当前PEDV主要分为4个亚型，分别为1a、1b、2a和2b亚型，其中1a与1b主要指2010年前的致病力相对较低的PEDV毒株，而2a和2b则为2010年后困扰中国、韩国、美国、墨西哥以及其它国家的高致病力PEDV毒株，从图中的进化树可以清晰判断WN株与近几年的PEDV流行毒株的同源性要高于目前市场上的CV777与AJ1102株，详见图2。
3.3特异性试验：
将病毒稀释成200TCID50/0.1ml，与等量猪流行性腹泻病毒特异性阳性血清混合，置37℃作用60分钟，接种长成良好单层的Vero细胞96孔细胞培养板，接种4孔，100μl/孔，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养5日，同时设阴性血清对照、正常细胞对照组和未中和病毒对照组，每日观察各组细胞病变情况。
将猪流行性腹泻病毒WN株与猪流行性腹泻病毒特异性阳性血清中和后，接种Vero细胞。结果表明，病毒中和组及正常细胞对照组均不产生细胞病变，阴性血清对照组、未中和病毒对照组产生细胞病变。
3.4病毒含量测定：
将猪流行性腹泻病毒用MEM培养基作10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4和10-54个稀释度，分别接种已长成良好单层的Vero细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，100μl/孔，置37℃作用60分钟，弃去培养液，加入细胞维持液，100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养5日，按Reed-Muench法计算TCID50。
经测定，猪流行性腹泻病毒WN株F4代的病毒含量为104.31TCID50/ml。
实施例2：猪流行性腹泻PEDV-KB-4-R弱毒株的培育
1.毒种：
猪流行性腹泻病毒WN株F4代，由陕西诺威利华生物科技有限公司分离、鉴定和保存。
2.病毒的传代致弱：
在Vero细胞上对PEDV WN株连续传代，同时结合空斑纯化技术对其致弱。
2.1病毒的连续传代
选择生长状态良好且已长至80％～90％的单层Vero细胞用于病毒连续传代，具体步骤如下：弃去细胞培养液，用细胞维持液洗涤3遍细胞单层；加入含0.2％毒种的细胞维持液，置于37℃、含5％CO2培养箱中继续培养；48～72小时后当80％的细胞出现病变时收获，置-20℃以下冻融两次后，收获病毒。传代过程中胰酶添加量由5μg/ml逐渐降低。
2.2空斑纯化试验
2.2.1用MEM培养基将待纯化的PEDV WN株F10代病毒液做10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-65个稀释度，同时设1个正常细胞对照孔；
2.2.2接种生长状态良好的Vero细胞6孔培养板，每个稀释度接种1孔，每孔接种0.5ml，37℃吸附1小时；
2.2.3弃掉吸附液，用无血清MEM培养基清洗2次，每孔加入37℃预热的MEM营养琼脂(等体积比的MEM培养基和2％低熔点营养琼脂)3ml，并加入胰酶至终浓度为5μg/ml。室温冷却凝固成第一层覆盖琼脂，将6孔板在37℃、含5％CO2培养箱中倒置培养3～5日，每天观察蚀斑。
2.2.4添加含有0.01％中性红染液的上述营养琼脂，每孔0.3ml，第二层琼脂加入5～10小时后，观察蚀斑大小，挑取最低稀释度的2～4个蚀斑，将挑出蚀斑用1.0ml MEM培养基重悬，反复冻融3次，在4℃条件下，4000r/min离心10分钟，取上清接种6孔培养板生长良好的单层Vero细胞，继续传代。
2.2.5经蚀斑挑选后重悬病毒离心后上清即为F10-1代，经6孔板传1代后即为F10-2代，从F10-2代开始用25cm2细胞培养瓶进行传代，每5代进行一次病毒含量测定。挑取病毒含量高的蚀斑克隆株继续纯化传代，直至形成大小、形态一致的蚀斑为止。在传代过程中，将胰酶添加量继续降低，直至不添加。
PEDV WN株连续传代至F10代时，胰酶的添加量由5μg/ml降低至3μg/ml。PEDV WN株F10代接种Vero细胞后48小时，逐渐长出蚀斑，随着时间的延长，蚀斑逐渐增大，蚀斑直径大小为1.0～2.0mm，挑取蚀斑进行传代纯化，随着传代纯化，出斑时间、蚀斑大小趋于稳定。经过3次纯化后，F20代病毒蚀斑形态稳定、一致，大小为2.0mm左右。在传代过程中F15代、F19代胰酶添加量分别为1μg/ml、0μg/ml，以后传代时维持液中均不添加胰酶。F25-13代继续传代至F125代，又进行了1次克隆，得到F140代。
2.3病毒含量测定取不同代次病毒，分别用MEM培养基作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-96个稀释度，分别接种已长成良好单层的Vero细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，100μl/孔，37℃作用60分钟后，弃去培养液，加入细胞维持液，100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养，观察5日，用Reed-Muench法计算TCID50。
分别测定F10代、F15代、F20代、F25代、F30代、F50代、F70代、F90代、F125代、F130代、F140代病毒的病毒含量。结果表明，随着病毒在细胞上传代，对细胞的适应性增加，病毒含量逐渐增高，至F30代，病毒含量可达107.88TCID50/ml以上，F50～F140代病毒含量基本稳定在107.46～108.07TCID50/ml之间，其中F130代的病毒含量最高，达到108.07TCID50/ml。详见表1。
表1猪流行性腹泻病毒WN株不同代次病毒含量测定结果
3.致病性试验：
在纯化传代过程中，分别取F20、F30、F70、F125代、F130代和F140代克隆株病毒液，均稀释至106.0TCID50/ml，分别口服接种3～5日龄健康易感仔猪5头，2.0ml/头，另设2头不接种作为对照组。接种后连续观察10日，记录各组试验猪的临床症状，统计各组猪发病及死亡数；死亡猪随时剖检，至观察期结束，剖杀所有试验猪，观察各脏器大体变化。
将F20-8代、F20-9代、F30-11代、F30-13代、F70代、F125代、F130代和F140代病毒液稀释至106.0TCID50/ml，分别口服接种健康仔猪，接种后观察10天。结果表明，F20代两个克隆株接种试验猪5/5腹泻，个别仔猪伴有厌食、寒颤和呕吐症状；F30代两个克隆株接种试验猪仅3/5腹泻，而无其他临床症状；F70代克隆株接种试验猪仅1/5腹泻，而无其他临床症状；F125代、F130代、F140代克隆株接种试验猪后未出现腹泻和其他临床症状；所有对照组猪均健活。说明随着代次增加，PEDV病毒对仔猪的致病性显著降低。
观察期结束，剖杀所有试验猪，观察各脏器大体变化。结果表明，F20-8组有1头猪小肠出现病变，对照组猪各脏器大体均无明显变化；F30、F70、F125、F130代、F140代和对照组猪各脏器大体均无明显变化。
4.特异性：
选取传代过程中F70代、F90代、F125代、F130代、F140代病毒，分别用MEM培养基稀释至2000TCID50/ml，与等量猪流行性腹泻病毒特异性阳性血清混合，置37℃作用60分钟，接种已长成良好单层的Vero细胞96孔细胞培养板，每个样品接种4孔，100μl/孔，同时设阴性血清对照、正常细胞对照和同代次未中和病毒对照，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养5日，观察各组是否出现细胞病变。
各代次病毒与猪流行性腹泻病毒特异性阳性血清中和后，接种Vero细胞。各代次病毒中和组及正常细胞对照组均不产生细胞病变，阴性血清对照组、相同代次未中和病毒对照组均产生细胞病变，详见表2。
表2不同代次病毒特异性试验结果
注：“-”表示不出现CPE；“+”表示出现CPE。
5.免疫原性试验：
25头3～5日龄仔猪，分为5组，每组5头，其中第1组不接种作为空白对照组，组2、3和4分别接种F125、F130、F140代毒，具体将F125、F130、F140传代毒进行适当稀释(约105.0TCID50/ml)后，分别通过颈部肌肉注射途径接种F125、F130、F140代毒，1.0ml/头；组5接种PEDV弱毒疫苗CV777(由陕西诺威利华生物科技有限公司提供)，具体将CV777培养液进行适当稀释(约105.0TCID50/ml)后，通过颈部肌肉注射途径接种，1.0ml/头。免疫后21日，所有猪前腔静脉采血，测定猪流行性腹泻病毒中和抗体。具体结果如下表3所示。
表3免疫试验结果
基于表3的结果可知，本发明传代致弱的F125、F130、F140代毒均能刺激仔猪产生较高的抗体水平，都原高于传统的CV777株，且其中F130代毒株的免疫效果最好，其能刺激仔猪产生最高的平均中和抗体水平，且其培养性能也优于各代次的毒株，因此，选取F130代毒株作为弱毒疫苗的生产毒株，将其命名为猪流行性腹泻PEDV-KB-4-R株，其微生物保藏编号为CGMCC No.15898，分类命名:猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrheavirus)，保藏时间是2018年06月25日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

Claims (4)

1.一种猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-KB-4-R株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.15898，分类命名:猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus），保藏时间是2018年06月25日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-KB-4-R株的分离方法，其特征在于，所述毒株是由PEDV强度经传代致弱制备得到。
3.根据权利要求1所述的猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-KB-4-R株在制备预防猪流行性腹泻的药物中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。
CN202310493345.4A 2023-05-05 2023-05-05 一株猪流行性腹泻病毒弱毒株及其应用 Pending CN117343909A (zh)

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