CN116656624A - 一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株及其应用 - Google Patents

一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明利用猪丁型冠状病毒PDCoV‑SD clone10株在ST细胞上连续传代至F91代，期间先后共进行了5次病毒克隆纯化，筛选并培育出病毒含量高、特异性强、毒力显著降低但仍保持良好免疫原性的弱毒株。确定PDCoV‑SD‑R株经过在ST细胞上的连续传代和纯化至F91代时，其在ST细胞增殖时病毒含量稳定，另对仔猪的毒力显著降低，免疫原性稳定可靠，可作为弱毒疫苗研制候选毒株。

Description

一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株及其应用
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株及其应用。
背景技术：
PDCoV(猪丁型冠状病毒)属于套式病毒目、冠状病毒科、δ冠状病毒属，是近年来发现的一种新型猪肠道病病原。冠状病毒(Cornavirus，CoV)感染宿主的范围广泛，对自然界生物有极大的威胁性。CoV分为甲型、乙型、丙型、丁型四个属，而猪丁型冠状病毒(porcinedeltacoronavirus，PDCoV)属于丁型冠状病毒属，随着2012年PDCoV首次在猪粪便中检测到后，该病在全球不同地区陆续被发现，我国猪群PDCoV的感染也相当严重，部分地区猪群中腹泻病料样品中PDCoV阳性率超过25％。PDCoV可感染各种年龄段的猪群，但对新生仔猪的危害最大，感染率最高，引起的死亡率约为30-40％。感染仔猪临床表现为水样腹泻、呕吐、脱水，剖检病理结果显示肠壁变薄，变透明，肠内充斥着大量黄色液体，组织病理学变化主要见于空肠中、远端和回肠，十二指肠和空肠近端的病变不明显，病变主要表现为肠绒毛上皮细胞萎缩、坏死，同时退化的肠上皮细胞进入管腔。
目前对于PDCoV，仍没有有效的治疗措施和疫苗。陕西诺威利华生物科技有限公司(本公司的母公司)是国内最早进入PDCoV疫苗研发的企业，且目前也有相关的疫苗在申报，公司基于分离得到的PDCoV-SD株研发了猪流行性腹泻、猪δ冠状病毒二联灭活疫苗(ZL201711087386.4)以及猪流行性腹泻、猪传染性胃肠炎和猪δ冠状病毒的三联灭活疫苗(ZL201711080927.0)等已经获得了国家知识产权局的专利授权，且相关疫苗的申报已经进入临床阶段。然而，我方发现，目前市场上PDCoV以灭活苗为主，而灭活苗始终存在需高剂量免疫的局限，相较之下，弱毒疫苗具有免疫原性好，能够激发宿主原位免疫的优势，弱毒苗不需佐剂且一次免疫即可产生较强免疫力。弱毒疫苗研究的关键是如何将病毒致弱同时使病毒保持较强的抗原性，因而，筛选合适的毒株对于弱毒疫苗的开发具有重要的意义。
发明内容：
为了丰富猪丁型冠状病毒疫苗的种类，以满足疫情防控的需要，本发明旨在提供一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株，该毒株由猪丁型冠状病毒AK株经传代致弱得到，所述毒株在ST细胞增殖时病毒含量稳定，另对仔猪的毒力显著降低，免疫原性稳定可靠，可作为弱毒疫苗研制候选毒株。
本发明具体采用如下技术方案：
一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV-SD-R株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.15897，分类命名:猪丁型冠状病毒，保藏时间是2018年06月25日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
所述猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV-SD-R株是由PDCoV-SD clone10株经传代致弱而得到的。
优选地，所述PDCoV-SD clone10株的微生物保藏编号为CGMCC No.16220。
本发明还请求保护猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV-SD-R株在制备预防猪丁型冠状病毒感染的药物中的应用。
优选的，所述药物为疫苗。
更优选地，所述疫苗为弱毒活疫苗；
更优选地，所述疫苗为单苗或联苗。
基于以上技术方案，本发明具有如下优点和有益效果：
本发明利用猪丁型冠状病毒PDCoV-SD clone10株在ST细胞上连续传代至F91代，期间先后共进行了5次病毒克隆纯化，筛选并培育出病毒含量高、特异性强、毒力显著降低但仍保持良好免疫原性的弱毒株。在毒株传代纯化过程中，先后将F15、F25、F56、F83、F88、F91代各克隆株接种健康仔猪，通过临床症状及剖检来综合判断病毒株的毒力是否降低，结果在F88代克隆株接种试猪后未表现出明显的腹泻症状，剖检后各脏器无明显变化，说明此时该毒株毒力已经弱化，为了确保病毒的稳定性，又对其进行了1次克隆纯化，F91代接种猪后仍表现出弱毒株的系列生物学特性，病毒含量也有所提高。为此，将PDCoV F88代、F91代2个克隆株接种仔猪，通过免疫后21日时的血清中和抗体效价和攻毒保护情况来评价免疫原性，结果F88代、F91代所有免疫猪的血清中和抗体效价均≥1∶79，对照组猪血清中和效价均≤1∶4。所有免疫组猪攻毒后均100％(10/10)保护，对照组猪在攻毒后全部出现腹泻症状，个别猪伴有呕吐、精神沉郁和脱水症状。至此，确定PDCoV-SD-R株经过在ST细胞上的连续传代和纯化至F91代时，其在ST细胞增殖时病毒含量稳定，另对仔猪的毒力显著降低，免疫原性稳定可靠，可作为弱毒疫苗研制候选毒株。
附图说明：
图1：猪丁型冠状病毒电镜观察。
图2：RT-PCR扩增ST细胞培养物电泳图，M:DNA Marker 2000；1：第3代的ST细胞培养物；2：PDCoV阳性质粒样品；3：阴性对照。
图3：PDCoV AK株与流行毒株全基因序列绘制的基因进化树。
具体实施方式：
实施例1：猪丁型冠状病毒的分离与鉴定
1.组织病料：
2015年从陕西安康某养殖场采集有腹泻症状3～5日龄仔猪的回肠。
2.猪丁型冠状病毒分离：
将组织样品剪碎后匀浆，3000r/min离心5分钟，取上清用0.22μm的滤器过滤除菌，接种生长良好的单层ST细胞，吸附1小时后，弃去病毒液，PBS(0.01mol/L，pH值7.2)清洗三次后，加入细胞维持液，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养5日，观察是否出现细胞病变，如此盲传至细胞出现病变，收获培养物并命名，置-70℃以下保存。
病料接种ST细胞后，盲传2代，置37℃，含5％CO2的培养箱中培养72小时后，产生细胞病变，表现为变圆、细胞呈灶状脱落等。再继续传至第3代，收获培养物，标记为猪丁型冠状病毒AK株F3代，置-70℃以下保存。
3.猪丁型冠状病毒鉴定
3.1电镜观察：
将细胞培养物5000r/min离心15分钟，取上清32000r/min超速离心，4℃离心30分钟，沉淀用PBS(pH值7.0)悬浮，磷钨酸负染电镜检查。病毒经过负染电镜观察后，可见到典型的冠状病毒粒子，病毒粒子呈球形，大小80～160nm，具有囊膜、纤突，详见图1。
3.2RT-PCR检测
3.2.1病毒RNA的提取：按照试剂盒的说明进行RNA的提取，提取物立即进行反转录或贮存于-70℃以下备用。
3.2.2反转录：取总RNA 5.25μl，5×Buffer 2μl，dNTP(10mM each)0.5μl，随机引物(10mmol/L)1μl，M-MLV反转录酶0.5μl，RNA酶抑制剂0.25μl，灭菌水0.5μl，总体积10μl。反应条件为37℃10分钟，42℃反转录1小时，冰浴2分钟。
3.2.3PCR：取反转录产物1μl，2×Mix 12.5μl，引物PDCoV-F、PDCoV-R各1μl，高压灭菌水9.5μl，总体积25μl。反应条件：94℃预变性3分钟，94℃变性30秒，56℃退火30秒，72℃延伸30秒，35个循环，72℃7分钟。引物序列
PDCoV-F：CGCGTAATCGTGTGATCTATGT；PDCoV-R：CCGGCCTTTGAAGTGGTTAT。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。
提取细胞培养物总RNA，进行RT-PCR检测，PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳，得到大小约为540bp的目的条带，详见图2。该结果证明该分离毒株为猪丁型冠状病毒。
3.3病毒全基因组测序及序列分析：
提取病毒总RNA，用随机引物反转录后的cDNA产物进行病毒全基因组测序，使用MEGA5.5软件进行全基因组序列比对。将AK株进行全序列测定，并与GenBank中公布的近几年PDCoV流行毒株进行比对与遗传进化分析。结果显示，猪丁型冠状病毒主要分4个亚型，分别为1a、1b、2a、2b，AK株属于1a亚型，与国内报道的大部分毒株属于同一型。详见图3。
3.4特异性试验：
将病毒稀释成200TCID50/0.1ml，与等量猪丁型冠状病毒特异性阳性血清混合，置37℃作用60分钟，接种长成良好单层的ST细胞96孔细胞培养板，接种4孔，100μl/孔，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养5日，同时设阴性血清对照、正常细胞对照组和未中和病毒对照组，每日观察各组细胞病变情况。
将猪丁型冠状病毒AK株与猪丁型冠状病毒特异性阳性血清中和后，接种ST细胞。结果表明，病毒中和组及正常细胞对照组均不产生细胞病变，阴性血清对照组、未中和病毒对照组产生细胞病变。
3.5病毒含量测定：
将猪丁型冠状病毒用MEM培养基作10倍系列稀释，取10-3、10-4、10-5和10-64个稀释度，分别接种已长成良好单层的ST细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，100μl/孔，置37℃作用60分钟，弃去培养液，加入细胞维持液，100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5％CO2的培养箱中培养5日，按Reed-Muench法计算TCID50。经测定猪丁型冠状病毒AK株F3代的病毒含量为107.12TCID50/ml。
选取猪丁型冠状病毒AK株F3代作为疫苗的生产毒株，并按照本公司母公司陕西诺威利华生物科技有限公司的命名规则命名并保存，将其命名为猪丁型冠状病毒PDCoV-SDclone10株，其微生物保藏编号为CGMCC No.16220，分类命名:猪丁型冠状病毒，保藏时间是2018年08月22日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。实施例2：猪丁型冠状病毒弱毒毒株的制备
1.方法
1.1病毒的传代致弱：
在ST细胞上对PDCoV AK株连续传代，同时结合空斑纯化技术对其致弱。
1.1.1病毒的连续传代
选择生长状态良好且已长至80％～90％的单层ST细胞用于病毒连续传代，具体步骤如下：弃去细胞培养液，用细胞维持液洗涤3遍细胞单层；加入含0.2％毒种的细胞维持液，置于37℃、含5％CO2培养箱中继续培养；24～48小时后当80％的细胞出现病变时收获，置-20℃以下冻融两次后，收获病毒。传代过程中胰酶添加量由10μg/ml逐渐降低。
1.1.2空斑纯化试验
1.1.2.1用MEM培养基将待纯化的PDCoV AK株F9代病毒液做10倍系列稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-65个稀释度，同时设正常细胞对照孔。
1.1.2.2接种生长状态良好的ST细胞6孔培养板，每个稀释度接种1孔，每孔接种0.5ml，37℃吸附1小时。
1.1.2.3弃掉吸附液，用无血清MEM培养基清洗2次，每孔加入37℃预热的MEM营养琼脂(等体积比的MEM培养基和2％低熔点营养琼脂)3ml，并加入胰酶至终浓度为10μg/ml。室温冷却凝固成第一层覆盖琼脂，将6孔板在37℃、含5％CO2培养箱中倒置培养3～5日，每天观察蚀斑。
1.1.2.4添加含有0.01％中性红染液的上述营养琼脂，每孔0.3ml，第二层琼脂加入5～10小时后，观察蚀斑大小，挑取最低稀释度的2～4个蚀斑，将挑出蚀斑用1.0ml MEM培养基重悬，反复冻融3次，在4℃条件下，4000r/min离心10分钟，取上清接种6孔培养板生长良好的单层ST细胞，继续传代。
1.1.2.5经蚀斑挑选后重悬病毒离心后上清即为F9-1代，经6孔板传1代后记为F9-2代，从F9-2代开始用25cm2细胞培养瓶进行传代，每5代时进行一次病毒含量测定。挑取病毒含量高的蚀斑克隆株继续纯化传代，直至形成大小、形态一致的蚀斑为止。在传代过程中，将胰酶添加量继续降低，直至不添加。
PDCoV AK株已完全适应ST细胞培养，能够产生明显的细胞病变并稳定增殖，表现为细胞变圆、细胞呈灶状脱落等，且随着病毒传代代次的增加，不需要再在细胞维持液中添加胰酶。在F91代传代过程中，共进行了五次克隆纯化(F9、F14、F19、F83及F88代)，PDCoV AK株接种ST细胞后48小时，逐渐长出蚀斑，随着时间的延长，蚀斑逐渐增大，蚀斑直径大小为1.0～2.0mm，挑取蚀斑进行传代纯化，随着传代纯化，出斑时间、蚀斑大小趋于稳定。经过3次纯化后，F20代病毒蚀斑形态稳定、一致，大小为2.0mm左右。F20代病毒两个克隆F20-10、F20-12代继续传代至F25代，得到F25-10、F25-12代。经过比较筛选，将F25-10代继续传至F83代，又进行了2次克隆纯化，得到F91代。
2.病毒含量测定：
将不同代次待测病毒液用MEM培养基作10倍系列稀释，取10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-96个稀释度，分别接种已长成良好单层的ST细胞96孔细胞培养板，每个稀释度接种6孔，100μl/孔，37℃作用60分钟后，弃去培养液，加入细胞维持液，100μl/孔，同时设正常细胞对照，置37℃、含5％CO2的细胞培养箱中培养，观察5日，用Reed-Muench法计算TCID50。
测定了毒株克隆纯化及传代过程中的F10、F15、F20、F25、F30、F40、F56、F83、F88和F91代毒的病毒含量，具体如表1所示。结果表明，随着在细胞上传代次数增加和蚀斑纯化，病毒对细胞的适应性更强，病毒含量逐渐提高，至F25代，病毒含量可达108.15TCID50/ml，F30～F91代病毒含量基本稳定在107.77～108.39TCID50/ml之间。
表1猪丁型冠状病毒AK株不同代次病毒含量测定结果
3.致病性试验：
选用3～5日龄健康仔猪(猪丁型冠状病毒中和抗体不高于1∶4)进行传代毒株的致病性试验。将不同代次的病毒液分别稀释至106.0TCID50/ml，口服接种仔猪5头，2.0ml/头，另设2头不接种作为对照。接种后连续观察10日，记录各组试验猪的临床症状，统计各组猪发病及死亡数；死亡猪随时剖检，至观察期结束，剖杀所有试验猪，观察各脏器大体变化。
将PDCoV AK株F15-7代、F15-8代，F25-10代、F25-12代、F56代、F83代、F88代和F91代病毒液稀释至105.0TCID50/ml，分别口服接种3～5日龄健康仔猪，接种后观察10天。结果表明，F15代两个克隆株接种试验猪4/5腹泻，个别仔猪伴有呕吐、精神沉郁和脱水症状；F25代两个克隆株接种试验猪仅3/5腹泻，而无其他临床症状；F56代接种猪2/5腹泻；F83代接种猪1/5腹泻；而F88代和F91代接种试验猪后未出现腹泻和其他临床症状；另所有对照猪均健活。说明随着传代代次的增加，PDCoV AK株回归猪体后致病性已显著降低，至F88代后已不能引起明显的仔猪腹泻临床症状。
观察期结束，剖杀所有试验猪，观察各脏器大体变化。结果表明，PDCoV F15-7代组有1头猪小肠出现肉眼可见变化，对照组猪各脏器大体均无明显变化；F25、F56、F83、F88、F91代和对照组猪各脏器大体均无明显变化。
4特异性：
选取传代过程中F56代、F83代、F88代、F91代病毒，用无血清MEM细胞培养液稀释成2000TCID50/ml，然后与等量猪丁型冠状病毒特异性阳性血清混合，置37℃水浴中作用1小时后，接种已长成良好单层、弃去细胞培养液的96孔ST细胞培养板，接种4孔，每孔0.1ml，同时设阴性血清对照、正常细胞对照和病毒对照。置37℃、含5％CO2的培养箱中培养5日，逐日观察并记录细胞病变(CPE)。
PDCoV F56代、F83代、F88代、F91代病毒与猪丁型冠状病毒特异性阳性血清中和后，接种ST细胞，各代次病毒中和组及正常细胞对照组均不产生细胞病变，阴性血清对照组、相同代次未中和病毒对照组均产生细胞病变，如表2。
表2不同代次病毒特异性试验结果
注：“-”表示不出现CPE；“+”表示出现CPE。
5.免疫原性试验：
用3～5日龄仔猪15头，分成3组，每组5头。将F88、F91传代毒分别进行适当稀释(约105.0TCID50/ml)后，第一组猪通过颈部肌肉注射途径接种F88代毒，第二组猪肌肉注射接种F91代毒，剂量1ml/头，另5头猪作为对照组。接种后21日，所有猪采血，分离血清后测定猪丁型冠状病毒中和抗体。同时攻毒，每头口服猪丁型冠状病毒AK F3代毒2.0ml(病毒含量为105.0TCID50/ml)，连续观察10日，记录各组猪的临床症状，统计保护率；死亡猪随时剖检，至观察期结束，剖杀所有试验猪，观察各脏器大体变化。
PDCoV F88代、F91代2个克隆株接种3～5日龄仔猪，21日后血清中和抗体效价和攻毒保护情况见表3。F88代免疫仔猪5头猪血清中和抗体效价≥1∶79；而F91代5头免疫猪血清中和效价≥1∶89；对照组猪血清中和效价均≤1∶4。所有免疫组猪攻毒后均100％(10/10)保护，对照组猪在攻毒后全部出现腹泻症状，个别猪伴有呕吐、精神沉郁和脱水症状。
表3PDCoV F88代、F91代毒免疫试验结果
剖杀所有试验猪，观察各脏器大体变化。结果表明，PDCoV F88、F91代次毒免疫组猪各脏器未见异常；对照组有1头猪小肠出现病变，其他试验猪各脏器大体均无明显变化。
本发明利用猪丁型冠状病毒AK株在ST细胞上连续传代至F91代，期间先后共进行了5次病毒克隆纯化，筛选并培育出病毒含量高、特异性强、毒力显著降低但仍保持良好免疫原性的弱毒株。
测定对仔猪的毒力是检查PDCoV弱毒株安全性的一个重要指标。在毒株传代纯化过程中，先后将F15、F25、F56、F83、F88、F91代各克隆株接种健康仔猪，通过临床症状及剖检来综合判断病毒株的毒力是否降低，结果在F88代克隆株接种试猪后未表现出明显的腹泻症状，剖检后各脏器无明显变化，说明此时该毒株毒力已经弱化，为了确保病毒的稳定性，又对其进行了1次克隆纯化，F91代接种猪后仍表现出弱毒株的系列生物学特性，病毒含量也有所提高。通过在传代细胞上的连续传代和克隆，病毒毒力趋于稳定，免疫原性是否降低对于毒株是否能够作为疫苗候选毒株至关重要，为此，将PDCoV F88代、F91代2个克隆株接种仔猪，通过免疫后21日时的血清中和抗体效价和攻毒保护情况来评价免疫原性，结果F88代、F91代所有免疫猪的血清中和抗体效价均≥1∶79，对照组猪血清中和效价均≤1∶4。所有免疫组猪攻毒后均100％(10/10)保护，对照组猪在攻毒后全部出现腹泻症状，个别猪伴有呕吐、精神沉郁和脱水症状。
至此，确定PDCoV AK-R株经过在ST细胞上的连续传代和纯化至F91代时，其在ST细胞增殖时病毒含量稳定，另对仔猪的毒力显著降低，免疫原性稳定可靠，可作为弱毒疫苗研制候选毒株，根据本公司上级的统一命名规则，将其命名为PDCoV-SD-R株，由陕西诺威利华生物科技有限提交保藏，将其命名为猪丁型冠状病毒PDCoV-SD-R株，其微生物保藏编号为CGMCC No.15897，分类命名:猪丁型冠状病毒，保藏时间是2018年06月25日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

Claims (7)

1.一株猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV-SD-R株，其微生物保藏编号为CGMCCNo.15897，分类命名: 猪丁型冠状病毒，保藏时间是2018年06月25日；保藏单位:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;保藏地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
2. 根据权利要求1所述的猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV-SD-R株，其特征在于，所述猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV-SD-R株是由PDCoV-SD clone10株经传代致弱而得到的。
3. 根据权利要求2所述的猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV-SD-R株，其特征在于，所述PDCoV-SD clone10株的微生物保藏编号为CGMCC No.16220。
4.根据权利要求1所述的猪丁型冠状病毒弱毒毒株PDCoV-SD-R株在制备预防猪丁型冠状病毒感染的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物为疫苗。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述疫苗为弱毒活疫苗。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述疫苗为单苗或联苗。
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