CN1410771A - 黄曲霉毒素快速检测装置及其制造方法 - Google Patents

黄曲霉毒素快速检测装置及其制造方法 Download PDF

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Abstract

本发明黄曲霉毒素快速检测装置及其制造方法是对真菌所产生有害代谢物的检测、特别是对黄曲霉毒素的快速检测。在既不需要专用设备，又不依赖专业人员参与的情况下，用较低的费用快速检测出样品中黄曲霉毒素的存在，本发明解决该技术问题的要点是：在塑料长条底板上从一端向另一端依次贴附滤纸，聚酯纤维素垫，硝酸纤维素膜和滤纸，在所述聚酯纤维上喷附一层喷涂量为50－80OD/毫升的胶体金—单克隆抗体，在所述硝酸纤维素膜上横向相间隔喷布下述两种物质：黄曲霉毒素—牛血清白蛋白复合体和羊抗小白鼠免疫球蛋白G1抗体，它们的浓度都是1－2毫克/毫升，喷布量都是0.7－1.5微升/厘米。

Description

黄曲霉毒素快速检测装置及其制造方法
技术领域
本发明涉及对真菌所产生代谢物的检测，特别是对黄曲霉毒素的快速检测。
背景技术
众所周知，黄曲霉毒素是一种毒性极强的物质，又是强致癌物质，它的产生及污染大多是通过饲料、谷物及食品进行。对人、畜的危害相当大。因此，引起科学工作者极大的重视，而且也采取很多对黄曲霉毒素进行抑制，防止其扩散，避免人、畜中毒等措施。而对其在饲料和谷物中存在的定性和定量检测是所述措施的一个重要环节。对黄曲霉毒素检测的公知方法，主要有薄层层析法(参见中国卫生检验杂志1998年01期)，酶联免疫法(参见IndianVeterinary Journal(1997，74期))和液相色谱法(参见杂志色谱，1995年04期)。薄层层析法是采用硅胶G薄板进行毒素层析分离，在365纳米紫外光下观察黄曲霉毒素产生的兰荧光并与标准毒素的迁移率比较以确定毒素的存在(见GB/T5009，22-1996)，酶联免疫法是采用黄曲霉毒素—蛋白复合体包被酶联板，然后将样品与识别黄曲霉毒素的抗体混合，在酶联板的小孔中进行免疫反应，通过比色确定样品中黄曲霉毒素的浓度，该法的检测精度为10ppb，液相色谱法测定的黄曲霉毒素的精度与酶联免疫法相似。上述各方法都存在如下缺点：操作程序复杂，只能在实验室进行；需要专业人员操作，用专门的仪器和设备，检测时间长(一般需3-10天)，所需费用高，其费用在200-1000元人民币/每个样品。
发明内容
本发明目的在于为了克服现有技术的缺点而提供一种快速检测黄曲霉毒素的装置：使其可以在现场操作，并可由非专业技术人员参与，不需任何仪器设备，用较低的费用，在较短的时间内就能检测出样品中含黄曲霉毒素的存在和含量。
本发明的目的可以通过下述措施来达到：
该黄曲霉毒素快速检测装置的特征是：在塑料长条底板上从一端向另一端依次贴附滤纸，聚脂纤维素垫，硝酸纤维素膜和滤纸，在所述聚脂纤维素垫上喷附一层浓度为50-80OD/毫升的胶体金—单克隆抗体复合物，其中的单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生并专一性识别黄曲霉毒素的，该杂交瘤细胞是经由黄曲霉毒素AFB1-BSA蛋白复合物免疫小白鼠再按Davis的方法取得的，经纯化的单克隆抗体被包被在由氯金酸制成的胶体金上制得胶体金—单克隆抗体复合物，其颗粒尺寸为18-20纳米，呈深红色，其使用浓度在540纳米的吸光度为50-80OD；在所述的硝酸纤维素膜上横向相间隔喷布下述两种物质：浓度为1～2毫克/毫升的喷布量为0.7～1.5微升/厘米的黄曲霉毒素—牛血清白蛋白复合体，其中分子量为66200道尔顿的牛血清白蛋白分子与11-14个黄曲霉毒素分子结合；浓度为1-2毫克/毫升，喷布量为0.7～1.5微升/厘米的羊抗小白鼠免疫G1抗体，它是通过在山羊体内注射小白鼠免疫球蛋白，取其含抗体的血清并经纯化后制得的，其分子量为80.000道尔顿，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现两条带，一条是分子量为55000道尔顿，另一条是分子量为25.000道尔顿。
由于单克隆抗体是由一个杂交瘤细胞的子代产生的，所以产生的单克隆抗体质量一致，并且单克隆抗体识别目标分子或结构的能力很强，其具有的专一性结合，均一性抗体，可大批量生产并能长期贮存的特点。使其应用和相应产品的工业化生产成为可能。如果在检测试纸靠近胶体金—单克隆抗体的滤纸处滴入一定量的被测样品，当混合液中不存在黄曲霉毒素时，则混合液将带着胶体金—单克隆抗体复合物迁移到黄曲霉毒素—蛋白复合体区域并在5-10分钟就与其其结合产生粉红色的胶体金—单克隆抗体——黄曲霉毒素——蛋白复合体的复合物；当混合液中存在黄曲霉毒素时，则其也将在5-10分钟就与胶体金—单克隆抗体复合物产生胶体金—单克隆抗体—黄曲霉毒素复合物，该复合物不能与固定在硝酸纤维素膜上的AFB1-BSA结合，因此该区域是无色，当混合液中含的黄曲霉毒素的数量少于胶体金——单克隆抗体复合物的数量时，其剩余的胶体金—单克隆抗体复合物将与黄曲霉毒素—蛋白复合体结合生成粉红色的胶体金—单克隆抗体—黄曲霉毒素—蛋白复合体的复合物，只是由于结合的数量少所显示的粉红色浅而已。所以当与标准黄曲霉毒素样品，例如浓度为02，4，6，8……20/毫升同时进行测定时，在黄曲霉毒素—蛋白复合体处显现的粉红色深浅可估算出样品混合液中含黄曲霉毒素量的多少。由于在硝酸纤维素膜上的羊抗鼠抗体遇到源于小白鼠附在胶体金上的单克隆抗体也会变成粉红色，因此，该条粉红色的形成可为测试者指出该检测装置的有效性，即有粉红色产生为有效测试，无粉红色线产生为无效测试或产品已过期。
黄曲霉毒素快速检测装置的制造方法，起特征是：在涂有不干胶的底板的右端贴附滤纸，将调至50-80OD/毫升浓度的胶体金—单克隆抗体复合物喷布在聚脂纤维垫上，将聚脂纤维垫贴附在与滤纸交迭的底板上，将浓度为1-2毫克/毫升的黄曲霉毒素—蛋白复合体和羊抗小白鼠抗体以0.7-1.5微升/厘米的喷布量，相间隔为8-10毫米的距离喷布在硝酸纤维素膜上，将其贴附在与聚脂纤维垫相交迭1-2毫米的底板上；将滤纸贴附在与硝酸纤维素膜交迭1-2毫米的底板上，将贴有上述物质的底板切成4-5毫米的长条；
所述胶体金—单克隆抗体(21)溶液的制备：按Davis的方法，将黄曲霉毒素—蛋白复合体(AFB1-BSA)溶于同体积的磷酸生理盐水(PBS)和完全佐剂中，取150微克，共分三次，每次相隔两周，注入雌性小白鼠体内，第三次注射后的3～5天取效价高的小白鼠断颈处死并取脾脏细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合；将其放入含有1.25％的甲基纤维素，25％的小牛血清和HAT选择试剂的半固体培养基中在37℃的培养箱中培养，7-10天后取出再放入含有10％小牛血清HT添加剂及抗菌素的RPMI1640培养基中培养；三天后取出，并取10微升，于用AFB1-BSA包被的96孔板中进行酶联免疫反应(ELISA)，确定产生抗黄曲霉毒素抗体的杂交瘤细胞，将取得的产生抗黄曲霉毒素的杂交瘤细胞在RPM11640培养基中培养3-5天，待抗体浓度达到5-10毫克/毫升时，将上述培养液中的氯化钠浓度调至3.3摩尔，并加入1/10体积的1摩尔硼酸钠，将上述溶液加入到蛋白质柱A中，两次各用10倍体积的3摩尔的氯化钠，50毫摩尔的硼酸钠冲洗层析住，用100毫摩尔的甘氨酸溶液(pH3.0)洗脱柱中的蛋白；收集管中加入50微升的1摩尔Tris-HCI(pH8.0)，然后用其收集洗脱液，收集的单克隆抗体经透析后用于胶体金—单克隆抗体的制备；取0.1克氯金酸钠并溶于1000毫升的无离子水中，加热煮沸后，放入25毫升新配的1％柠檬酸钠溶液，5分钟后用蒸馏水将540纳米吸光度调至0.8OD制成胶体金溶液，透析后的单克隆抗体经36000g离心30分钟，取其上清液经0.2微米过滤，将其浓度调至0.5毫克/毫升后加入到胶体金溶液中使其最终浓度达到5-10微克/毫升，5分钟后每100毫升上述溶液中加1毫升1％浓度的聚乙烯醇(PEG)以阻止非特异性凝集，以10000g离心1小时，去除上清液，再以10000g离心1小时，去除未吸附的蛋白质，将包被的胶体金稀释到540纳米其光吸收值为50～80OD，用0.2微米滤膜过滤去菌。
所述黄曲霉毒素—牛血清的蛋白质复合体(AFB1-BSA)溶液的制备：用磷酸生理盐水缓冲液(PBS)稀释黄曲霉毒素—牛血请白蛋白复合体至1.2-1.5毫克/毫升；
所述羊抗小白鼠免疫G1(Ig G1)溶液的制备：将小白鼠免疫球蛋白稀释至10毫克/毫升，再加入等体积的福氏佐剂；从经动物饲养室进行适应性饲养的山羊身上取3～5毫升免疫前血样作阴性对照，分四次每隔三周向山羊皮下和肌肉中多点注入总体积为5毫升小白鼠Ig G1，于第66天从山羊颈动脉取血700-1000毫升，离心取血清用于抗体的纯化(其纯化方式与制备胶体金—单克隆抗体复合物溶液过程的纯化方式相同)，用磷酸生理盐水缓冲液稀释至1.2-1.5毫克/毫升。
本发明与现有技术相比，其有益效果是：由上述解决方案不难看出，本发明黄曲霉毒素快速检测装置在检测时不需要任何仪器和设备，其检测场所可以在样品堆存场地，而且只需5-10就能得出结果；另外，操作起来非常简单，只要把粒度为20目的样品放入60％的甲醇水溶液，含有4％的氯化钠混合均匀，然后在试纸下端样品槽中靠近喷附胶体金—单克隆抗体的聚脂纤维素垫的一端滴入90-100微升的混合液，则在5-10内在喷布黄曲霉毒素—蛋白复合体处就会显出反应黄曲霉毒素含量的颜色，这种操作由专业人员操作或一般人员都可进行，还有一个有益效果就是其检测所需费用大大低于现有技术，因为作为本发明检测装置的主要物质—单克隆抗体可以大批量生产而且可以长期贮存。适合大规模工业生产的要求。本发明检测装置的检测精度与现有技术中的液相色谱法相近似。用本发明黄曲霉毒素检测装置对由美国北卡罗来那州州立大学提供的含有黄曲霉毒素的玉米进行检测，其结果与该大学用液相色谱法对相同的样品所测得的结果极其相近似，如下表所示
  序列     稀释倍数     本发明检测结果(估算)     液相色谱法
  31A     2000     10000ppb     11060ppb
  31B     2000     12000ppb     13740ppb
  31C     2000     12000ppb     12670ppb
  32A     1000     8000ppb     6867ppb
  32B     2000     12000ppb     12558ppb
  32C     2000     10000ppb     10620ppb
  32D     1000     6000ppb     6320ppb
  32E     1000     5000ppb     6262ppb
  32F     2000     40000ppb     40817ppb
  33A     2000     40000ppb     40819ppb
  33B     2000     40000ppb     40156ppb
  33C     1000     6000ppb     6121ppb
  34A     500     1000ppb     1260ppb
  34B     1000     4000ppb     3910ppb
  35A     1000     5000ppb     6130ppb
  35C     200     800ppb     680ppb
  35D     500     2500ppb     3010ppb
  35E     500     2500ppb     2840ppb
  35F     500     2500ppb     2800ppb
另外，由大连市产品质量监督检验所用液相色谱法进行的黄曲霉毒素样品检测与本发明黄曲霉毒素快速检测装置检测的结果相比较，结果十分接近理想；其检测报告显示，本发明黄曲霉毒素快速检测装置检测玉米粉中黄曲霉毒AFB1的含量为10纳米/毫升，大连市产品质量监督检验所用液相色谱法的相同样品的检验结果是10.6138纳克/毫升。
附图说明
附图图面说明如下：
图1为黄曲霉毒素检测装置的正视图；
图2为图1的俯视图，图中1为滤纸，2为聚脂纤维垫，21为喷在聚脂纤维垫2上的胶体金—单克隆抗体，3为硝酸纤维素膜，31为喷附在硝酸纤维素膜3上的黄曲霉毒素—蛋白复合体，32为喷附在硝酸纤维素膜3上的羊抗小白鼠抗体，4为滤纸，5为用塑料做成的底板。
具体实施方式
现结合附图(实施例)对本发明作进一步详述：在涂有不干胶的底板5的右端贴附宽约20毫米吸水滤纸1，用液体喷涂机将调至50-80OD/毫升的胶休金—单克隆抗体喷附在宽7毫米的聚脂纤维垫2上，并在37℃烘干1小时，将聚脂纤维垫2贴附在与滤纸1交迭1～2毫米处；用相间为10毫米的双喷咀的液体喷涂机将浓度为1-2毫克/毫升的黄曲霉毒素—蛋白复合体31后天羊抗小白鼠抗体32以0.7-1.5微升/厘米的喷布量喷附在宽度为25毫米的硝酸纤维素膜3上，在37℃条件下烘干1小时，将硝酸纤维素膜3贴附在与聚脂纤维垫2相交迭1-2毫米处，将20毫米宽的滤纸4贴附在与硝酸纤维素膜3交迭1-2毫米处，该滤纸4的作用在于借助交迭联接关系以牵拉滴入滤纸1上的液体样品比较容易的通过聚脂纤维垫2及硝酸纤维膜3，在20-25℃，相对湿度为40％以下的条件下，用切割机将贴附后的底板切成4-5毫米的长条，装入塑料夹中，然后将其装入含有干燥袋的塑料袋中并密封，在2-25℃中避光保存。
所述的胶体金—单克隆抗体溶液的制备如下：将黄曲霉毒素—蛋白复合体(AFB1-BSA)溶于磷酸—生理盐水缓冲液(PBS)中，然后与相同体积的完全佐剂混合均匀。注入雌性小白鼠皮下50微克；两周时，再注射50微克，但此次的抗原与不完全佐剂混合，并在三天后取血样进行抗体滴定度测定；四周时选择表现高效价的小白鼠再次追加免疫，此次抗原溶于PBS，采取腹腔注射，三天后取血样分析，效价高的小白鼠被断颈处死，取脏细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合，采用含1.25％的甲基纤维素，25％的小牛血清和HAT(Hypoxanthine-Aminopterin-Thymidine)用于在组织培养基中选择性地促进杂交瘤细胞生长)选择试剂的半固体培养基进行杂交细胞培养，将杂交细胞混在半固定培养基中，在37℃二氧化碳培养箱中进行培养；7-10天后取出杂交瘤克隆转移至96孔培养盘中，在含有10％小牛血清和HT(含量为136.1毫克/毫升的次黄嘌呤H和38.8毫克/毫升的胸腺嘧啶核苷T为100X的HT培养液，使用时，稀释100倍浓度为1X的(HT)添加剂及抗菌素的RPMI1640培养基中培养；三天后，取出培养液10微升，于用AFB1-BSA包被的96孔板中进行酶联免疫反应(ELISA)；确定产生抗黄曲霉毒素抗体的杂交瘤细胞，将其在RPMI1640培养基中培养3-5天，待抗体浓度达到5-10毫克/毫升时将上述培养液中的氯化钠(NaCl)浓度调至3.3摩尔，加入1/10体积的1.0摩尔硼酸钠(pH8.9)，检查pH；将上述溶液加入蛋白质柱A中，其流过蛋白质A柱时结合IgG1(免疫球蛋白G1)的能力为5毫克/毫升湿凝胶，培养液的上清液中含有20-50毫克/毫升的单克隆抗体；用10倍体积的3.0摩尔的氯化钠，50毫摩尔硼酸钠(pH8.9)冲洗层析柱二次，用100毫摩尔的甘氨酸溶液(pH3.0)洗脱A柱中的蛋白；在收集管中先加入50微升的1摩尔Tris-Hcl(pH8.0)，然后用其收集洗脱液，轻轻混合使每支管的pH值为中性，避免气泡和泡沫发生以防止蛋白变性；利用分光光度计在280纳米波长下测量蛋白质吸收方法，或者考马斯亮兰法来确认收集管中免疫球蛋白的浓度经纯化的单克隆抗体用于胶体——单克隆抗体的制备；2、将0.1克氯金酸钠溶于1000毫升无离子水中，加热到60℃，在搅拌的同时快速加入50毫升的柠檬酸溶液(0.2％柠檬酸，0.2％单宁酸)，然后加热到95℃5分钟，然后放至4℃保存，其所形成的胶体金直径为18-20纳米；3、将单克隆抗体溶液在4℃对蒸馏水透析后，以36000g离心30分钟后取出上清液经0.2微米滤膜过滤，取其一部分溶液作连续10倍稀释，体积为1毫升，然后将稀释的溶液分别加到5毫升胶体金溶液中快速混合(其PH值调至稍高于蛋白质液的PI)，1分钟后加入10％浓度的氯化钠溶液1毫升快速混合后静置5分钟，分别测定光吸收值，选择最低吸收值的溶液用于包被胶体金；将选定的蛋白质溶液的浓度稀释到0.5毫克/毫升后加入到胶体金中使其最终浓度为5-10微克/毫升，快速混合后，让蛋白质吸附5分钟，每100毫升胶体金加1毫升浓度为1％的聚乙烯醇，以阻止发生非特异性凝集；以10000g离心1小时，使包被的胶体金沉淀于管低；吸弃上清液，将胶体金悬浮于含1％的PEG的PBS中；再以10000g离心1小时，洗涤去除未吸附的蛋白质；吸弃上清液后将包被的胶体金稀释到在540纳米光吸收值为50-80O.D，用0.2微米滤膜过滤除菌，制得胶体金—单克隆抗体溶液。
所述黄曲霉毒素—牛血清蛋白的复合体(AFB1-BSA)溶液的制备：取购于Sigma公司(St.louis.Mo。美国)的黄曲霉毒素—牛血清白蛋白的复合体(其产品目录号码为A-6655，每摩尔BSA结合11个AFB1分子)用磷酸生理盐水缓冲液(PBS，其配制方法为0.01摩尔的Na2HPO4，0.15摩尔的NaCl，PH7.4)稀释至1.5毫克/毫升。
所述羊抗小白鼠免疫球蛋白的G1(IgGl)溶液的制备；将来自美国Sigma公司的小白鼠免疫球蛋白稀释至10毫克/毫升，再加入等体积的福氏佐剂，混合均匀，从经动物饲养室进行过适应性饲养的山羊身上取3-5毫升免疫前血样，留其血清作为阴性对照，再向山羊的肌肉或皮下注入5毫升的小白鼠IgG1，第21天再追加上述同样剂量的小白鼠IgG1，第42天第三次注入上述同样剂量的小白鼠IgG1，于第45天后取血样3-5毫升进行效价测定，第63天进行第四次同样剂量的小白鼠IgGl，于第66天取血样3-5毫升进行效价测定后，10天后从山羊的颈动脉取血700-1000毫升，离心取血清用于抗体的纯比(其纯化方式与制备胶体金—单克隆抗体过程中的纯化方式相同)，将经纯化的抗体用磷酸生理盐水缓冲液(PBS其制备方法为0.01摩尔Na2HPO4，0.15摩尔NaCl，PH7.4)稀释至1.2-1.5毫克/毫升。
本发明装置的使用方法如下；将被检测的样品粉碎为20目并取20克粉末放入25-60毫升的抽提液(每100毫升含60毫升甲醇，40毫升蒸馏水，4克氯化钠)经充分混合5分钟，再静置10-20分钟后轻轻吸取上清液，按1∶3的比例与样品缓冲液混合，将本发明装置放置呈30度倾斜，使贴有胶体金—单克隆抗体的聚脂纤维垫处于较低处，向聚脂纤维垫下面的滤纸上缓慢加入90-100微升上述的混合液，静置5分钟后，观察喷有黄曲霉毒素—牛血清白蛋白的复合体31处的颜色并与标准黄曲霉毒素样品(购于美国Sigma公司)相比较。即可估算出样品中含黄曲霉毒素的浓度。

Claims (2)

1、黄曲霉毒素快速检测装置，其特征在于：在塑料长条底板(5)上从一端向另一端依次贴附滤纸(1)，聚脂纤维素垫(2)，硝酸纤维素膜(3)和滤纸(4)，在所述聚脂纤维素垫上喷附一层浓度为50-80OD/毫升的胶体金—单克隆抗体复合物(21)，其中的单克隆抗体是由杂交瘤细胞产生并专一性识别黄曲霉毒素的，该杂交瘤细胞是经由黄曲霉毒素AFB1-BSA蛋白复合物免疫小白鼠，再按Davis的方法取得的，经纯化的单克隆抗体被包被在由氯金酸制成的胶体金上制得胶体金—单克隆抗体复合物，其颗粒尺寸为18-20纳米，呈深红色，其使用浓度在540纳米的吸光度为50-80OD；在所述的硝酸纤维素膜上横向相间隔喷附下述两种物质：浓度为1～2毫克/毫升的喷布量为0.7～1.5微升/厘米的黄曲霉毒素—牛血清白蛋白复合体(31)，其中分子量为66200道尔顿的牛血清白蛋白分子与11-14个黄曲霉毒素分子结合；浓度为1-2毫克/毫升，喷布量为0.7～1.5微升/厘米的羊抗小白鼠免疫G1抗体(32)，它是通过在山羊体内注射小白鼠免疫球蛋白，取其含抗体的血清并经纯化后制得的，其分子量为80.000道尔顿，在聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈现两条带，一条是分子量为55000道尔顿，另一条是分子量为25.000道尔顿。
2、黄曲霉毒素快速检测装置的制造方法，其特征是：
(1)在涂有不干胶的底板(5)的右端贴附吸水纸(1)，将调至50-80OD/毫升浓度的胶体金—单克隆抗体复合物(21)喷附在聚脂纤维垫(2)上，将聚脂纤维垫贴附在与滤纸(1)交迭的底板(5)上，将浓度为1-2毫克/毫升的黄曲霉毒素—蛋白复合体(31)和羊抗小白鼠抗体(32)以0.7-1.5微升/厘米的喷布量，相间隔为8-10毫米的距离喷附在硝酸纤维素膜(3)上，将其贴附在与聚脂纤维垫(2)相交迭1-2毫米的底板(5)上；将滤纸(4)贴附在与硝酸纤维素膜(3)交迭1-2毫米的底板(5)上，将贴有上述物质的底板(5)切成4-5毫米的长条；
(2)所述胶体金—单克隆抗体(21)溶液的制备：按Davis的方法将黄曲霉毒素—蛋白复合体(AFB1-BSA)溶于同体积的磷酸生理盐水(PBS)和完全佐剂中，取150微克，共分三次，每次相隔两周，注入雌性小白鼠体内，第三次注射后的3～5天取效价高的小白鼠断颈处死并取脾脏细胞与NS-1骨髓瘤细胞融合；将其放入含有1.25％的甲基纤维素，25％的小牛血清和HAT选择试剂的半固体培养基中在37℃的培养箱中培养，7-10天后取出再放入含有10％小牛血清HT添加剂及抗菌素的RPMI1640培养基中培养；三天后取出，并取10微升，于用AFB1-BSA包被的96孔板中进行酶联免疫反应(ELISA)，确定产生抗黄曲霉毒素抗体的杂交瘤细胞，将取得的产生抗黄曲霉毒素的杂交瘤细胞在PRMI1640培养基中培养3-5天，待抗体浓度达到5-10毫克/毫升时，将上述培养液中的氯化钠浓度调至3.3摩尔，并加入1/10体积的1摩尔硼酸钠，将上述溶液加入到蛋白质柱A中，两次各用10倍体积的3摩尔的氯化钠，50毫摩尔的硼酸钠冲洗层析柱，用100毫摩尔的甘氨酸溶液(HP3.0)洗脱柱中的蛋白；收集管中加入50微升的1摩尔Tris-HCI(PH8.0)，然后用其收集洗脱液，收集的单克隆抗体经透析后用于胶体金—单克隆抗体的制备；取0.1克氯金酸钠并溶于1000毫升的无离子水中，加热煮至60℃，放入50毫升新配的1％柠檬酸钠溶液(0.2％柠檬酸，0.2％单宁酸)，然后加热到95℃5分钟。所形成的胶体金颗粒直径为18-20纳米，透析后的单克隆抗体经36000g离心30分钟，取其上清液经0.2微米过滤，将其浓度调至0.5毫克/毫升后加入到胶体金溶液中，使其最终浓度达到5-10微克/毫升，5分钟后每100毫升上述溶液中加1毫升1％浓度的聚乙烯醇(PEG)以阻止非特异性凝集，以10000g离心1小时，去除上清液，再以10000g离心1小时，去除未吸附的蛋白质，将包被的胶体金稀释到540纳米光吸收值为50～80OD，用0.2微米滤膜过滤去菌。
(3)所述黄曲霉毒素—牛血清的蛋白质复合体(AFB1-BSA)溶液的制备：用磷酸生理盐水缓冲液(PBS)稀释黄曲霉毒素—牛血请白蛋白复合体至1.2-1.5毫克/毫升；
(4)所述羊抗小白鼠免疫G1(Ig G1)溶液的制备：将小白鼠免疫球蛋白稀释至10毫克/毫升，再加入等体积的福氏佐剂；从经动物饲养室进行适应性饲养的山羊身上取3～5毫升免疫前血样作阴性对照，分四次每隔三周向山羊皮下和肌肉中多点注入总体积为5毫升小白鼠Ig G1，于第66天从山羊颈动脉取血700-1000毫升，离心取血清用于抗体的纯化(其纯化方式与制备胶体金—单克隆抗体复合物溶液过程的纯化方式相同)，用磷酸生理盐水缓冲液稀释至1.2-1.5毫克/毫升。
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