CN108845127A - 基于vp2或vp4重组蛋白抗原的dhav-3抗体的间接elisa检测方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV‑3抗体的间接ELISA检测方法及应用。该检测方法中涉及一种试剂盒，所述试剂盒以VP2或VP4重组蛋白为包被抗原。本发明的检测方法特异强，灵敏度高、重复性好、检测方便快捷，与细胞中和试验符合率较高，可为DHAV‑3的检测提供一种途径，也为该病的后续研究以及流行病学调查奠定基础。

Description

基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测 方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，涉及一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法及应用。

背景技术

鸭甲型肝炎病毒(Duck hepatitis A virus，DHAV)是一种无囊膜包裹的单股正链RNA病毒，基因组全长约7.7kb，其基因组仅一个开放阅读框(Open readingframe，ORF)，共编码3种结构蛋白和9种非结构蛋白，主要有3个基因型(DHAV-1、DHAV-2、DHAV-3)，其中DHAV-2主要在台湾等地区流行，我国大陆地区未见报道，而DHAV-1和DHAV-3在我国普遍流行，且存在混合感染的情况，为该病的诊断治疗增加了难度。

酶联免疫吸附试验(ELISA)检测方法是实验室诊断方法中常用的实验手段，也是一种可以用于临床样本检测的方法，既可以用于抗体的检测也可以用于抗原的检测，该方法操作简单，使用方便，可用于DHAV的诊断。目前，可用于DHAV诊断的ELISA检查方法，包括有全病毒包被ELISA法、卵黄抗体ELISA法、PCR-ELISA法、酶标抗原Dot-ELISA法等。然而，这些方法具有取材不易、操作繁琐、设备要求高、价格昂贵、运输不便、流程繁多、使用场所具有局限性、专业知识需求等问题，因此在临床生产中不利于推行使用，如全病毒包被法所需的纯度较高的病毒粒子，需要培养病毒且经过一系列的离心、提纯等操作，每个步骤对温度要求较高，需尽量在低温环境下完成，纯化过程中需小心谨慎，否则病毒纯度很难保证，会影响检测效果。此外，DHAV是RNA病毒，不稳定、易降解，低温保存不利于运输。

VP2和VP4在小RNA病毒中保守性好，不同血清型病毒间差异小，两者蛋白表面均含有抗原表位，可以特异性结合相应抗体，且VP2蛋白表面存在的IgM的抗原决定簇可为后续DHAV-3早期诊断研究奠定基础。目前，尚未见任何有关用VP2或VP4进行DHAV-3诊断的报道，关于DHAV-3的诊断主要集中在免疫组化法、荧光定量RT-PCR法等，虽然说这些方法的诊断准确性也比较高，但是也存在许多缺点。例如，免疫组化法，需要用纯化的病毒粒子作为抗原来获得超免血清，再用该血清作为抗体检测DHAV-3抗原，在这一过程中病毒粒子的获得、纯化以及超免血清的获取均费时费力，且还需特殊设备的支持，因此，资金需求量大，实验周期长。此外，制作切片时，前期样品处理时间比较长，在实际生产过程中会耽误疾病的诊断。荧光定量RT-PCR虽然可以比较准确的检测出DHAV-3病原，但是由于这种方法需要特定的PCR仪辅助完成，而该仪器价格昂贵，且生产实践中基层单位一般都没有该仪器，因此使用地点具有局限性。

发明内容

有鉴于此，本发明针对待检样本处理周期长、诊断地点具有局限性、操作繁琐、实验流程复杂、原材料不稳定易降解的问题，提供了一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法及应用。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒以VP2或VP4重组蛋白为包被抗原。

进一步地，所述VP2重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述VP4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

进一步地，所述VP2重组蛋白以包涵体的形式存在，所述VP4重组蛋白以上清的形式存在。

进一步地，所述试剂盒包括酶标二抗，所述酶标二抗为HRP标记的抗鸭IgG。

本发明还公开了一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法，包括以下步骤：

(1)包被酶标板：将纯化的VP2或VP4重组蛋白用包被液稀释后加入酶标板，100μL/孔，37℃孵育1h后，4℃过夜；

(2)洗涤酶标板：拿出包被好的酶标板，弃抗原液，用PBST洗板5次，5min/次，最后一次洗板后在滤纸上拍干孔内液体；

(3)封闭：向酶标板中加入封闭液，每孔250μL，37℃，封闭1h；

(4)洗涤酶标板：如步骤(2)方法洗涤；

(5)将DHAV-3血清进行稀释，加入待检稀释的DHAV-3鸭血清一抗，100μL/孔，37℃，进行孵育；

(6)洗涤酶标板：如步骤(2)方法洗涤；

(7)加入酶标二抗：

将HRP标记的抗鸭IgG稀释，加入稀释后的HRP标记的抗鸭IgG，每孔100μL，37℃，进行孵育；

(8)洗涤酶标板：如步骤(2)方法洗涤；

(9)显色及终止显色：加入TMB显色液，100μL/孔，显色10min，加入等体积的2mol/LH₂SO₄终止反应。

进一步地，所述步骤(1)中的包被液为0.05mol/LpH 9.6碳酸盐缓冲液；VP2重组蛋白的包被条件为蛋白1:1600稀释(2.23μg/mL)，重组蛋白VP4的最佳包被条件为蛋白1:2000稀释(2.6μg/mL)。

进一步地，根据权利要求6所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的VP2重组蛋白的封闭液为1％的脱脂奶粉，VP4重组蛋白的封闭液为5％的脱脂奶粉。

进一步地，所述步骤(5)中的VP2重组蛋白的待检血清孵育时间为1h，DHAV-3血清按照1:160稀释；VP4重组蛋白的待检血清孵育时间为0.5h，按照DHAV-3血清1:20稀释。

进一步地，所述步骤(7)中的VP2重组蛋白的酶标二抗按1:2000稀释，孵育时间为0.5h；VP4重组蛋白的酶标二抗按1:1600稀释，孵育时间为1h。

本发明还公开了一种上述的试剂盒在检测基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体水平中的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

1)本发明VP2和VP4能够在大肠杆菌中表达大小约为25kDa、28kDa的重组蛋白，分别主要以包涵体和上清的形式存在，Westernblot分析结果表明该蛋白可被兔抗DHAV-3血清识别，表明其具有良好的反应原性。

2)本发明以VP2和VP4重组蛋白作为抗原建立的检测DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法，特异性强、灵敏度高、重复性好、检测方便快捷，与细胞中和试验符合率较高，可为DHAV-3的检测提供一种途径，也为该病的后续研究以及流行病学调查奠定基础。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明DHAV-3QL株VP2和VP4基因的PCR Tm值优化结果；其中，M为DL2,000Marker，泳道1-8为VP4基因不同Tm值的PCR产物，退火温度依次为：50.8、51.4、52.7、53.5、54.7、55.2、56.3、57.5；9-16为VP2基因不同Tm值的PCR产物，退火温度依次为：52.0、53.2、54.3、55.3、56.2、56.9、57.5、57.8；

图2是本发明pET30-VP2菌液PCR鉴定；其中，泳道M为DL2,000Marker；泳道1-18为菌落；

图3是本发明pET32-VP4菌液PCR鉴定；其中，泳道M为DL2,000Marker；泳道1-24为菌落；

图4是本发明pET30-VP2酶切鉴定；其中，M为DL2,000Marker，泳道1为pET30-VP2的EcoRI和XhoI双酶切产物；

图5是本发明pET32-VP4酶切鉴定；M为DL2,000Marker，泳道1为pET32-VP4的EcoRI和XhoI双酶切产物；

图6是本发明pET30-VP2、pET32-VP4在BL21中的表达情况；其中，M：蛋白Marker(低分子量)，A图为VP2：泳道1-4依次为pET30包涵体、pET30-VP2包涵体、pET30-VP2全菌、pET30全菌；B图为VP4：泳道1-6依次为pET32上清、pET32-VP4超声破碎后全上清、pET32全菌、pET32-VP4超声破碎后全菌、pET32包涵体、pET32-VP4超声破碎后包涵体；

图7是本发明pET32-VP4表达条件优化；其中，M为蛋白Marker(低分子量)；A为pET32-VP4温度优化：1-4分别为37℃、30℃、25℃和16℃诱导产物，5为pET32空载；B为pET32-VP4IPTG浓度优化：1-6分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L IPTG诱导产物，7为pET32空载；

图8是本发明VP2和VP4重组蛋白的纯化；其中，M为蛋白Marker，A图为VP2重组蛋白的纯化：1为纯化的VP2重组蛋白，2为未纯化的VP2重组蛋白，B图为VP4重组蛋白的纯化：1为纯化的VP4重组蛋白，2为未纯化的VP4重组蛋白，3为空载蛋白；

图9是本发明VP2和VP4重组蛋白免疫印迹分析；其中，M为预染Marker，A图为VP2重组蛋白印迹：1为纯化的VP2重组蛋白，2为未纯化的VP2重组蛋白；B图为VP4重组蛋白印迹：1为空载，2为纯化的VP4重组蛋白；

图10是本发明VP2重组蛋白交叉反应分析；

图11是本发明VP4重组蛋白交叉反应分析。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1重组蛋白VP2和VP4的制备

1、重组质粒PET30-VP2和PET32-VP4的构建

1.1、VP2和VP4基因片段扩增

以DHAV-3感染鸭胚尿囊液中提取的RNA为模板，VP2-P1、VP2-P2、VP4-P1、VP4-P2为特异性引物(如表1所示)，在表2的扩增体系下，分别经94℃预变性5min，扩增的循环参数为94℃30s，50-60℃30s，72℃50s；30个循环后，72℃总延伸10min，得到不同退火温度下扩增的目的片段，扩增后的基因片段经2％琼脂糖凝胶电泳可知VP2和VP4在退火温度54.7℃、55.3℃条件下获的片段最佳，基因片段分别为558bp、255bp，如图1所示。

表1 VP2和VP4扩增引物

注：下划线为限制性酶切位点，斜体为保护性碱基，小写字母为终止密码子，加粗字体为防移码碱基。

表2 PCR扩增体系

1.2、VP2和VP4基因原核表达质粒的构建

(1)pET30-VP2和pET32-VP4PCR鉴定

根据PCR扩增条件扩增VP2、VP4基因片段，经过DNA凝胶回收试剂盒回收纯化后，按照适当的比例经EcoRI、XhoI双酶切，并回收纯化后分别连接至同样经EcoRI、XhoI双酶切后pET30a-(+)、pET32a-(+)质粒，16℃连接过夜，再转入DH5α感受态细胞中，次日，挑取单个菌落进行菌液PCR扩增，成功筛选到阳性克隆菌，如图2、3所示。

(2)pET30-VP2和pET32-VP4酶切鉴定

将阳性克隆菌扩大培养，抽提质粒后，经限制性内切酶EcoRI和XhoI消化后片段在2％琼脂糖凝胶中电泳分别可在543bp(图4)、234bp(图5)左右见清晰的目的条带，表明VP2、VP4分别成功连接至pET30a-(+)、pET32a-(+)载体，重组质粒构建成功，且测序表明VP2、VP4正确连接至表达载体pET30a-(+)、pET32a-(+)，命名为pET30-VP2、pET32-VP4。

2、重组蛋白VP2和VP4的表达、纯化及鉴定

2.1、重组蛋白VP2和VP4的表达

(1)重组蛋白VP2和VP4表达形式的确认

将上述测序正确的质粒DNA分别转化至宿主菌BL21(DE3)感受态细胞中，培养后在0.4mmol/L IPTG，37℃条件下诱导表达6-8h后，离心收集的菌体经过20mmol/L Tris-HCl重悬超声破碎，SDS-PAGE分析pET30-VP2在宿主菌BL21(DE3)中主要以包涵体的形式大量表达，大小约为25kDa，如图6A所示；而pET32-VP4在宿主菌BL21(DE3)中经0.4mmol/L IPTG，37℃条件下诱导表达6-8h后大量表达，主要在于上清中，大小约为28kDa，如图6B所示，即pET30-VP2在宿主菌BL21中主要以非可溶性的形式大量表达VP2重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，而pET32-VP4在宿主菌BL21中主要以可溶性表达的形式在上清中大量表达VP4重组蛋白，其氨基酸序列如SEQID NO.4所示，编码该氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

(2)重组蛋白VP4表达条件的优化

重组蛋白VP4经过不同温度(37℃、30℃、25℃和16℃)、不同IPTG浓度(0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0mmol/L)优化后，得知pET32-VP4在宿主表达菌BL21中最佳诱导表达条件:诱导温度为30℃、IPTG浓度为0.4mmol/L、诱导表达8h，如图7所示。从图中可以看出温度的变化及IPTG浓度在0.4-1.0mmol/L之间对VP4重组蛋白表达量影响不大，且其表达量较大，故而选取了37℃和0.4mmol/L IPTG作为VP4重组蛋白表达的最佳诱导条件。

2.2、重组蛋白VP2和VP4的纯化及鉴定

根据pET30-VP2和pET32-VP4在宿主菌BL21(DE3)中表达形式的不同分别选取了切胶和镍柱亲和层析的方式纯化，得到了纯度较高且浓度较大的重组蛋白VP2和VP4，如图8A/B所示。经Westeron blot鉴定重组VP2和VP4蛋白均能被DHAV-3血清识别，具有良好的反应原性，如图9A和B所示。

实施例2基于VP2和VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法的建立

1、基于VP2和VP4重组蛋白间接ELISA检测条件的优化

(1)抗原包被浓度和血清释度的优化

通过BCA的方法测定纯化后VP2和VP4重组蛋白浓度，分别3.57mg/mL和5.19mg/mL，稀释为不同浓度包被过夜，结果如表3、4所示，选择P/N最大值作为抗原包被和血清稀释条件，VP2重组蛋白的最佳包被条件为蛋白1:1600稀释(2.23μg/mL)，血清1:160稀释；重组蛋白VP4的最佳包被条件为蛋白1:2000稀释(2.6μg/mL)，血清1:20稀释。

表3基于VP2重组蛋白最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定

注：加粗字体标识为最佳抗原和血清稀释度对应的P、N和P/N值。表4基于VP4重组蛋白最佳抗原包被浓度和血清稀释度的确定

注：加粗字体标识为最佳抗原和血清稀释度对应的P、N和P/N值。

(2)酶标二抗最佳稀释度的优化

以上述优化的抗原和血清稀释度包被、孵育，不同浓度酶标二抗孵育，每个浓度设置3个重复，取其平均值，得到的最佳酶标二抗稀释度即P/N值最大，以VP2重组蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法酶标二抗的最佳稀释度为1:2000，以VP4重组蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法酶标二抗的最佳稀释度为1:1600，如表5、表6所示。

表5基于VP2重组蛋白酶标二抗的优化

注：加粗字体标记为最佳酶标二抗稀释度的P、N以及P/N值

表6基于VP4重组蛋白酶标二抗的优化

注：加粗字体标记为最佳酶标二抗稀释度的P、N以及P/N值

2、基于VP2和VP4重组蛋白的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法的建立

(1)基于VP2和VP4蛋白间接ELISA检测方法临界值的确定

VP2和VP4按照上述优化结果分别检测48份DHAV-3阴性血清，每份血清重复3次，取其平均值，阳性阈值PC＝平均数+3SD，阴性阈值NC＝平均数+2SD，SD为标准差，根据表7、8结果得出，VP2蛋白阳性阈值为0.25，阴性阈值为0.20；VP4蛋白阳性阈值为0.29，阴性阈值为0.25，介于阴阳性之间则需重新测定一次。

表7基于VP2蛋白对48份DHAV-3阴性血清OD值

表8基于VP4蛋白对48份DHAV-3阴性血清OD值

(2)基于VP2和VP4蛋白间接ELISA检测方法的步骤：

①包被酶标板：将纯化的VP2或VP4重组蛋白用包被液(0.05mol/LpH9.6碳酸盐缓冲液)稀释后加入酶标板，100μL/孔，37℃孵育1h后，4℃过夜；

其中，VP2重组蛋白的包被条件为蛋白1:1600稀释(2.23μg/mL)，重组蛋白VP4的最佳包被条件为蛋白1:2000稀释(2.6μg/mL)；

②洗涤酶标板：拿出包被好的酶标板，弃抗原液，用PBST洗板5次，5min/次，最后一次洗板后在滤纸上拍干孔内液体(以下洗板步骤相同)；

③封闭：向酶标板中加入封闭液，每孔250μL，37℃，封闭1h；

其中，VP2重组蛋白的封闭液为1％的脱脂奶粉，VP4重组蛋白的封闭液为5％的脱脂奶粉；

④洗涤酶标板：如步骤②方法洗涤；

⑤将DHAV-3待检血清用0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液进行稀释，加入待检稀释的DHAV-3血清一抗，100μL/孔，37℃，进行孵育；其中，VP2重组蛋白的待检血清孵育时间为1h，DHAV-3血清按照1:160稀释；VP4重组蛋白的待检血清孵育时间为0.5h，按照DHAV-3血清1:20稀释；

⑥洗涤酶标板：如步骤②方法洗涤；

⑦加入酶标二抗：

将HRP标记的兔抗鸭IgG按比例稀释，加入稀释后的HRP标记的兔抗鸭IgG，每孔100μL，37℃，进行孵育；其中，VP2重组蛋白的酶标二抗按1:2000稀释，孵育时间为0.5h；VP4重组蛋白的酶标二抗按1:1600稀释，孵育时间为1h；

⑧洗涤酶标板：如步骤②方法洗涤；

⑨显色及终止显色：加入TMB显色液，100μL/孔，显色10min，加入等体积的2mol/LH₂SO₄终止反应。使用酶标仪在450nm测OD值。

在如上所述建立了DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法后，可以采用该方法评价鸭DHAV-3血清的DHAV-3抗体水平。

实施例3VP2和VP4重组蛋白重复性评价

分别用同一批次和不同批次纯化的VP2和VP4重组蛋白包被，评价同一批次纯化的重组蛋白板间和板内的变异系数以及不同批次间重组蛋白的变异系数，每组数据重复3次，结果如表9、10所示，VP2重组蛋白批内变异系数最大值为10.4％，最小值为3.8％，平均变异系数为6.12％；批间变异系数最大值为9.2％，最小变异系数为5.5％，平均变异系数为7.32％，均小于10％。VP4重组蛋白批内变异系数最大值为5.4％，最小值为0.9％，平均变异系数为2.87％；批间变异系数最大值为9.5％，最小变异系数为2.5％，平均变异系数为5.62％，均小于10％。

表9基于VP2重组蛋白的重复性分析

注：加粗字体分别为最大和最小值

表10基于VP4重组蛋白的重复性分析

注：加粗字体分别为最大和最小值

实施例4特异性评价

(1)交叉反应

分别用基于VP2和VP4重组蛋白建立的ELISA检测方法检测它们与几种常见鸭病是否存在交叉反应，如图10、11所示，VP2和VP4重组蛋白与其它几种常见鸭病阳性血清反应均成阴性，DHAV-1阳性血清除外。

(2)阻断试验

DHAV-3、DHAV-1阳性血清分别用DHAV-3病毒阻断前后，检测结果表明DHAV-3对基于VP2和VP4重组蛋白包被的DHAV-3血清的阳性阻断率分别为67.4％和70.5％，DHAV-1对基于VP2和VP4重组蛋白包被的DHAV-1血清的阳性阻断率分别为63.8％和68.3％，如表11所示。

表11 VP2、VP4重组蛋白阻断试验

实施例5灵敏性评价

基于VP2和VP4重组蛋白分别包被，同时检测3份DHAV-3阳性血清，分别从1:160和1:20开始稀释，如表12、13所示，VP2重组蛋白能检查到的最大稀释度为1:5120，VP4重组蛋白能检查到的最大稀释度为1:640。

表12基于VP2重组蛋白的ELISA灵敏度

注：加粗字体分别为最大稀释度

表13基于VP4重组蛋白的ELISA灵敏度

注：加粗字体分别为最大稀释度

实施例6符合率的计算

本发明检测了30份临床血清，经中和反应检测共15份阳性和15份阴性，而基于V2和VP4重组蛋白的检测方法分别检出阳性血清13、11份，阴性血清15+2、15+4份，与中和试验相比，VP2-ELISA和VP4-ELISA阳性符合率分别为86.7％和73.3％，阴性符合率均为100％，总符合率分别为90.0％和80.0％，如表14所示，说明本试验所建立的两种检测方法均具有较高的符合率，VP2-ELISA符合率高于VP4-ELISA。

表14 VP2和VP4ELISA方法符合率的计算

本发明建立的基于VP2和VP4重组蛋白的间接ELISA检测方法特异强，能特异性检测DHAV-3阳性血清，与其他鸭常见疾病，如鸭瘟、鸭疫里默氏菌、鸭瘟、鸭大肠杆菌、禽流感、肿头症和鸭沙门氏菌等鸭常见疾病的阳性血清均不发生交叉反应，检测结果均呈阴性，DHAV-1阳性血清除外。这就说明DHAV-1与DHAV-3之间存在交叉反应，分析原因，这是与DHAV-1和DHAV-3VP2和VP4蛋白无论在氨基酸水平上还是在碱基序列水平上都具有相似性有关；因而建立基于VP2和VP4重组蛋白的间接ELISA检测方法为DHAV-3检测精准性提供了一重保障，同时在病毒感染早期主要以IgM为主，这也是早期疾病诊断的重要标志，而VP1表面主要以IgG抗原决定簇为主，而IgM的抗原决定簇主要位于VP2和VP3表面，因而本试验所建立的方法在一定程度上能为该病的及早诊断尽早治疗提供参考依据，做到早发现早治疗减少经济损失。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 四川农业大学

<120> 基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法及应用

<130> 2017

<141> 2018-04-13

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 702

<212> DNA

<213> VP2基因(VP2 recombination gene)

<400> 1

atgcaccatc atcatcatca ttcttctggt ctggtgccac gcggttctgg tatgaaagaa 60

accgctgctg ctaaattcga acgccagcac atggacagcc cagatctggg taccgacgac 120

gacgacaagg ccatggctga tatcggatcc gaattcggtg acaacatctc acgtttagtc 180

catctacaca ctggacagtg gtccacacag catggtgtta ctacatgcct tagatggttg 240

gccactcctg gatgttttta tacagttaat acccaaccag catatggaca aaccaggtat 300

tttaggttca tcagatgtgg ctaccacttc cgccttcttg tgaatgcacc atctggtgct 360

gctggtggac taatgatggt gtggatgcct tatccatatt gccgggttct cactggatct 420

tacaatgtgg atgcatcagt agatcgcagg tcgttgttaa atcttcccta tgccatcttg 480

gatctgcgca ccaacactga aattgacttg gttattccat atgtaaattt tagaaattat 540

gttgaaatta ctgccacaga tagtgttggt ggggccatat gtgtctttgt gttgggagct 600

tttacacatg ggtcaggaac ctccaatact gttgattata ctctctttgg tgagatgctt 660

gaaactgact tacaatgtcc tcggcctttt aatgaccagt aa 702

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> VP2重组蛋白(VP2 recombination Protein)

<400> 2

Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro Arg Gly Ser

1 5 10 15

Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln His Met Asp

20 25 30

Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met Ala Asp Ile

35 40 45

Gly Ser Glu Phe Gly Asp Asn Ile Ser Arg Leu Val His Leu His Thr

50 55 60

Gly Gln Trp Ser Thr Gln His Gly Val Thr Thr Cys Leu Arg Trp Leu

65 70 75 80

Ala Thr Pro Gly Cys Phe Tyr Thr Val Asn Thr Gln Pro Ala Tyr Gly

85 90 95

Gln Thr Arg Tyr Phe Arg Phe Ile Arg Cys Gly Tyr His Phe Arg Leu

100 105 110

Leu Val Asn Ala Pro Ser Gly Ala Ala Gly Gly Leu Met Met Val Trp

115 120 125

Met Pro Tyr Pro Tyr Cys Arg Val Leu Thr Gly Ser Tyr Asn Val Asp

130 135 140

Ala Ser Val Asp Arg Arg Ser Leu Leu Asn Leu Pro Tyr Ala Ile Leu

145 150 155 160

Asp Leu Arg Thr Asn Thr Glu Ile Asp Leu Val Ile Pro Tyr Val Asn

165 170 175

Phe Arg Asn Tyr Val Glu Ile Thr Ala Thr Asp Ser Val Gly Gly Ala

180 185 190

Ile Cys Val Phe Val Leu Gly Ala Phe Thr His Gly Ser Gly Thr Ser

195 200 205

Asn Thr Val Asp Tyr Thr Leu Phe Gly Glu Met Leu Glu Thr Asp Leu

210 215 220

Gln Cys Pro Arg Pro Phe Asn Asp Gln

225 230

<210> 3

<211> 738

<212> DNA

<213> VP4基因(VP4 recombination gene)

<400> 3

atgagcgata aaattattca cctgactgac gacagttttg acacggatgt actcaaagcg 60

gacggggcga tcctcgtcga tttctgggca gagtggtgcg gtccgtgcaa aatgatcgcc 120

ccgattctgg atgaaatcgc tgacgaatat cagggcaaac tgaccgttgc aaaactgaac 180

atcgatcaaa accctggcac tgcgccgaaa tatggcatcc gtggtatccc gactctgctg 240

ctgttcaaaa acggtgaagt ggcggcaacc aaagtgggtg cactgtctaa aggtcagttg 300

aaagagttcc tcgacgctaa cctggccggt tctggttctg gccatatgca ccatcatcat 360

catcattctt ctggtctggt gccacgcggt tctggtatga aagaaaccgc tgctgctaaa 420

ttcgaacgcc agcacatgga cagcccagat ctgggtaccg acgacgacga caaggccatg 480

gctgatatcg gatccgaatt ccttcatcga atggatactc taactaaaaa cattgaagat 540

gaaactgtca agattattgg atcctgtgct gagaaggcac aagaagcaat ctctggtctt 600

ggagcagttg agagtgttgc ttcaactaac tctgtggttg ctactgcaaa tgctacaaca 660

acacaaacaa ttcctgatcc aacagatggt tccacagatg acttttattc atgttcctat 720

gaggttgggg cccagtaa 738

<210> 4

<211> 245

<212> PRT

<213> VP4重组蛋白(VP4 recombination Protein)

<400> 4

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1 5 10 15

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

20 25 30

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

35 40 45

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

50 55 60

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65 70 75 80

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

85 90 95

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

100 105 110

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

115 120 125

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

130 135 140

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145 150 155 160

Ala Asp Ile Gly Ser Glu Phe Leu His Arg Met Asp Thr Leu Thr Lys

165 170 175

Asn Ile Glu Asp Glu Thr Val Lys Ile Ile Gly Ser Cys Ala Glu Lys

180 185 190

Ala Gln Glu Ala Ile Ser Gly Leu Gly Ala Val Glu Ser Val Ala Ser

195 200 205

Thr Asn Ser Val Val Ala Thr Ala Asn Ala Thr Thr Thr Gln Thr Ile

210 215 220

Pro Asp Pro Thr Asp Gly Ser Thr Asp Asp Phe Tyr Ser Cys Ser Tyr

225 230 235 240

Glu Val Gly Ala Gln

245

<210> 5

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ccggaattcc ttcatgcaat ggatactcta ac 32

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ccgctcgagt tactgggccc caacctcata g 31

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ccggaattcg gtgacaacat ctcacgttta g 31

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ccgctcgagt tactggtcat taaaaggccg agg 33

Claims (10)

1.一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒以VP2或VP4重组蛋白为包被抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述VP2重组蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；所述VP4重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述VP2重组蛋白以包涵体的形式存在，所述VP4重组蛋白以上清的形式存在。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括酶标二抗，所述酶标二抗为HRP标记的抗鸭IgG。

5.一种基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体的间接ELISA检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)包被酶标板：将纯化的VP2或VP4重组蛋白用包被液稀释后加入酶标板，100μL/孔，37℃孵育1h后，4℃过夜；

(2)洗涤酶标板：拿出包被好的酶标板，弃抗原液，用PBST洗板5次，5min/次，最后一次洗板后在滤纸上拍干孔内液体；

(3)封闭：向酶标板中加入封闭液，每孔250μL，37℃，封闭1h；

(4)洗涤酶标板：如步骤(2)方法洗涤；

(5)将DHAV-3血清进行稀释，加入待检稀释的DHAV-3鸭血清一抗，100μL/孔，37℃，进行孵育；

(6)洗涤酶标板：如步骤(2)方法洗涤；

(7)加入酶标二抗：

将HRP标记的抗鸭IgG稀释，加入稀释后的HRP标记的抗鸭IgG，每孔100μL，37℃，进行孵育；

(8)洗涤酶标板：如步骤(2)方法洗涤；

(9)显色及终止显色：加入TMB显色液，100μL/孔，显色10min，加入等体积的2mol/LH₂SO₄终止反应，测定OD_450nm。

6.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(1)中的包被液为0.05mol/L pH 9.6碳酸盐缓冲液；VP2重组蛋白的包被条件为蛋白1:1600稀释(2.23μg/mL)，重组蛋白VP4的最佳包被条件为蛋白1:2000稀释(2.6μg/mL)。

7.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，根据权利要求6所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中的VP2重组蛋白的封闭液为1％的脱脂奶粉，VP4重组蛋白的封闭液为5％的脱脂奶粉。

8.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(5)中的VP2重组蛋白的待检血清孵育时间为1h，DHAV-3血清按照1:160稀释；VP4重组蛋白的待检血清孵育时间为0.5h，按照DHAV-3血清1:20稀释。

9.根据权利要求5所述的间接ELISA检测方法，其特征在于，所述步骤(7)中的VP2重组蛋白的酶标二抗按1:2000稀释，孵育时间为0.5h；VP4重组蛋白的酶标二抗按1:1600稀释，孵育时间为1h。

10.权利要求1-5任一所述的试剂盒在检测基于VP2或VP4重组蛋白抗原的DHAV-3抗体水平中的应用。