CN102175849A - 一种快速检测猪瘟抗体的试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种检测猪瘟抗体的试剂盒。本发明设计出一对特异性的引物，克隆相对保守的基因序列，通过原核表达技术，表达出针对猪瘟E2蛋白的抗原，在此基础上制备出由包被了高纯度、高活性猪瘟病毒特异性抗原的酶联板、含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG单克隆抗体的酶结合物以及TMB显色液等组成的试剂盒。本试剂盒能快速检测血清或血浆中的猪瘟抗体，特异性强，敏感性高。

Description

一种快速检测猪瘟抗体的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种猪瘟抗体检测试剂盒及其制备方法，用于对猪血清或血浆样本进行猪瘟抗体的检测，属于酶标免疫分析领域。

背景技术

猪瘟(Classical swine fever，CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病，1833年首先发现于美国的俄亥俄州，曾广泛流行于世界养猪国家，对养猪业造成严重危害，是世界动物卫生组织(OIE)确定的应报告疾病(Notifiable diseases)之一。多年来CSF也危害我国养猪业的发展，是我国四大动物疫病之一，被我国农业部法定为一类传染病。CSF是一种急性烈性传染病，死亡率高达80％～90％90％，接种疫苗是防制本病唯一有效的措施。我国于1954年成功研制的猪瘟兔化弱毒疫苗(CSFLV)，在防治CSF工作中发挥了重要作用，取得了显著效果，通过疫苗接种有效的控制了CSF的发生，保障了我国养猪业的发展和养猪户的利益。但近些年来，CSF流行发生了较大变化，从频发的大流行转变为周期性、波浪式的地区散发性流行，临床症状和病理变化也由典型转为非典型，并出现了亚临床感染、母猪繁殖障碍和新生仔猪先天性感染等现象。虽通过加大免疫密度、超量、超前免疫和增加免疫次数等多种途径和办法，仍不能有效控制CSF流行，当前CSF发病无季节性，虽然流行规模较小，强度较轻，但这种散发流行见于全国各地，作为一种免疫抑制性疾病，CSF感染可引起多种疾病的继发感染，造成大批猪只发病死亡，这些现象已引起学术界的广泛关注和兽医行政管理、防疫部门的高度重视。

建立安全有效的实验室和临床评价方法尤为重要，血清学检测通常用于了解猪的群体免疫水平和对疫苗免疫效果进行评价，为预防接种提供科学依据，常用的方法有以下几种：(1)猪瘟正向间接血凝试验，(2)中和试验，(3)间接ELISA试验，(4)胶体金免疫检测等技术，其中，间接ELISA法具有敏感性高、特异性强、重复性好的优点，可用于临床猪瘟血清/血浆抗体的定性和定量检测，为猪瘟免疫效果的监测提供参考。但是，目前的检测手段对猪瘟抗体的检测存在重复性不好，操作技术繁琐。

发明内容

本发明的目的是提供一种特异强、灵敏度高，能快速、简便地检测猪瘟抗体的检测试剂盒，通过猪瘟抗体的检测，确定免疫效果，进行抗体监控，及时调整免疫程序，挽回不必要的经济损失。

本发明试剂盒包含：

(1)猪瘟病毒特异性抗原包被的酶联板；

(2)辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG(免疫球蛋白)抗体溶液；

(3)样品稀释液，含有质量浓度为0.5％的NaCl、1％的酪蛋白、0.001％的NaN₃、0.001％的溴甲酚紫的溶液；

(4)TMB显色剂：浓度是0.3g/L；

(5)终止液，浓度为2M的H₂SO₄溶液；

(6)20倍浓缩洗液：含有质量浓度为21g/L的Na₂HPO₄·12H₂O，质量浓度为2.80g/L的NaH₂PO₄·2H₂O，质量浓度为170g/L的NaCl，体积浓度为20ml/L吐温-20；

(7)阴性对照，经稀释的不含猪抗猪瘟病毒抗体的猪血清或血浆；

(8)阳性对照：经稀释的含有猪抗猪瘟病毒抗体的猪血清或血浆；

还包含说明书及其他包材。

本试剂盒中的猪瘟病毒特异性抗原包被酶联板由以下方法制得：

一.制备猪瘟病毒特异性抗原

(1)反转录反应：以P2为引物，CSFV石门株的总RNA为模板反转录反应；

(2)PCR反应：以反转录产物为模板，P1和P2为引物进行PCR反应；其中，

P1的序列为：5’-TAAAAGGATCCGGCCTGACCACCACCTGGGAAG-3’，

P2序列为：5’-CCCCTCTCGAGTTAATAGCTATCACGCGGTTCATAATATTTG-3’；

(3)回收PCR反应产物中片断大小为887bp，将其克隆入pET32a载体的BamH I和Xho I酶切位点之间，构建成功的重组载体命名为pET32a-E2，将重组载体pET32a-E2进一步转化入大肠杆菌宿主菌BL21，进行重组蛋白表达。

(4)纯化重组蛋白，得猪瘟病毒特异性抗原；

二.用猪瘟病毒特异性抗原包被固化于96孔酶联板上。

本试剂盒中的辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG抗体溶液由以下方法制得：

(1)制备兔抗猪IgG抗体：用猪IgG(免疫球蛋白)免疫家兔后，分离得血清，经纯化获得兔抗猪IgG抗体；

(2)用辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体；

(3)用稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体，获得辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG抗体溶液；

本试剂盒中的稀释液由以下方法制得：

在浓度为0.01M，pH7.4的PBST中添加10％小牛血清。

所述阴性对照是经稀释的不含猪抗猪瘟病毒抗体的猪血清或血浆，若其在实验结果中为阳性，则试验以失败论，若其为阴性结果则试验成功；

所述阳性对照为稀释的含有猪抗猪瘟病毒抗体的猪血清或血浆，若其在实验结果中为阴性，则试验以失败论，若其为阳性结果则试验成功。

本发明设计出一对特异性的引物，克隆相对保守的基因序列，通过原核表达技术，表达出针对猪瘟E2蛋白的抗原，在此基础上研制出快速、特异、灵敏的检测试剂盒。

综上所述，本猪瘟抗体检测试剂盒以包被了基因工程表达的高纯度、高活性猪瘟病毒特异性抗原的酶联板、含有辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG单克隆抗体的酶结合物以及TMB显色系统为基础制成，特异性强，敏感性高。其特异性为：100％，总符合率为：100％；1小时内即可判定被检样品液的检测结果，检测结果显示科学、直观，简明、准确，不易出现假阳性或假阴性等人为误判。试剂盒结构简单，仅需实验室准备纯化水和酶标仪等仪器，检测成本低，操作简便、快速、时效性强，特别适用于临床猪瘟血清/血浆抗体的定性检测，监测猪瘟的免疫效果，具有广阔的市场前景和社会效益。

具体实施方式

实施例1制备猪瘟病毒特异性抗原

根据CSFV E2基因序列，设计一对引物，用于扩增E2基因的主要抗原表位区序列。其中，上游引物P1为：5’-TAAAAGGATCCGGCCTGACCACCACCTGGGAAG-3’，

下游引物P2序列为：5’-CCCCTCTCGAGTTAATAGCTATCACGCGGTTCATAATATTTG-3’。

通过RT-PCR方法扩增CSFV石门株(购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心，病毒编号CVCC AV1411)E2基因的主要抗原表位区序列，

具体步骤：

反转录反应体系为：先将2μL下游引物P2(25μmol/L)与CSFV石门株的总RNA混合，70℃水浴10min，然后迅速冰浴5min；再加入dNTP混合物(浓度分别为10mM，TaKaRa，Dalian，China)4μL，RNase抑制剂(40U/μL，TaKaRa，Dalian，China)，AMV(100U/μL，TaKaRa，Dalian，China)1μL，5×Buffer 10μL，添加超纯水至总体积为50μL，混匀，于42℃反转录60min后，95℃水浴5min；扩增产物于-20℃保存。

以反转录产物为模板，进行PCR反应，体系如下：2.5μL 10×buffer(Mg²⁺plus，TaKaRa，Dalian，China)，0.5μL浓度为10mmoL/L dNTP混合物(TaKaRa，Dalian，China)，0.5μL Taq DNA聚合酶(5U/μL，TaKaRa，Dalian，China)，上游引物P1、下游引物P2各1μL(25μmol/L)，3μL cDNA(反转录产物)，加超纯水至总体积25μL。反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性40s，60℃退火40s，72℃延伸40s，30个循环；72℃再延伸10min。扩增产物于4℃保存。取5μL PCR产物1％的琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色检测。可见于887bp处出现清晰的PCR条带，证明扩增成功。

将PCR产物经BamH I和Xho I双酶切后插入pET32a载体的BamH I和Xho I酶切位点之间，构建成功的重组载体命名为pET32a-E2，将重组载体pET32a-E2进一步转化入大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)，用浓度为0.4mM的IPTG诱导重组蛋白表达，应用金斯瑞生物科技有限公司的高亲和力Ni-NTA树脂(High Affinity Ni-NTA Resin货号Cat.No.L00250)进行表达蛋白的纯化，纯化的蛋白用浓度为0.01M的PBS(pH7.4)透析过夜，进行蛋白定量后-70℃保存备用。蛋白浓度经测定为3.2mg/ml，该蛋白即为猪瘟病毒特异性抗原。

蛋白的鉴定：(western blot方法)，表达产物经SDS-PAGE分析后，转移至NC膜上进行Western blot，结果显示，表达产物能被CSFV阳性血清(购自中国兽医药品监察所)所识别，而对照没有发应条带，证明表达产物具有免疫反应，对猪瘟病毒抗体有很好的特异性。

实施例2本发明试剂盒的制备

猪瘟抗体检测试剂盒，包括(1)猪瘟病毒特异性抗原包被的酶联板，(2)辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG(免疫球蛋白)，(3)样品稀释液，(4)TMB显色剂，(5)终止液，(6)20倍浓缩洗液，(7)阴性对照，(8)阳性对照。

CB包被液：pH9.6，具体成分及浓度为：无水碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g/l，碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g g/l。

20倍浓缩洗液：磷酸氢二钠·12H₂O 21g/l，磷酸二氢钠·2H₂O 2.80g/l，氯化钠170g/l，吐温20ml/l。

10mM PBS PH7.4配方：磷酸氢二钠·12H₂O 2.2g/l，磷酸二氢钠·2H₂O 0.2g/l，氯化钠8.5g/l

TMB显色剂：溶液中的TMB浓度是0.3g/L，来源于sigma。

终止液：浓硫酸66.154ml/L。

(1)猪瘟病毒特异性抗原包被的酶联板

酶联板制备：酶联板为聚苯乙烯材质，设有96个微孔。将猪瘟病毒特异性抗原用浓度为0.05M的碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释至0.1μg/ml，加入到微孔中，100μl/孔，2～8℃过夜，次日用封闭液150μl/孔室温封闭2h，弃去液体，干燥，封装。

封闭液：2.9g/l的Na₂HPO₄·12H₂O，8.0g/l的NaCl，0.2g/l的KCl，0.2g/l的KH₂PO₄·2H₂O，200ml/l的小牛血清，50g/l的蔗糖，0.5g/l的吐温20。

(2)辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG溶液

兔抗猪IgG制备：用猪IgG免疫家兔4只，第一次用费氏完全佐剂与猪IgG混合均匀后多点注射免疫，半个月后以费氏不完全佐剂与抗原混合均匀后多点注射免疫，10天后耳缘静脉采血测效价，合格(＞1∶10,000)则采血，不合格则加强免疫，再过10天后采血，分离血清，饱和硫酸铵纯化后即得兔抗猪IgG，紫外分光光度计测蛋白含量。

辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG的方法，称取5mg的HRP溶于1ml蒸馏水中，加入200μl新配的NaIO₄(浓度为0.1M)，室温下避光搅拌20分钟，将上述溶液装入透析袋，用1mM的醋酸盐缓冲液(pH4.4)透析，4℃过夜，加20ul浓度为0.2M，pH9.5碳酸盐缓冲液使pH值升到9.0～9.5，然后立即加入1ml兔抗猪IgG溶液(10mg兔抗猪IgG溶解在1ml浓度为0.01M的碳酸盐缓冲液)，室温避光轻轻搅拌2小时，加入100μl新配的4mg/ml的NaBH₄溶液，混匀，在4℃放置2小时。将上述液体放入透析袋中用0.15M，pH7.4的PBS透析，4℃过夜，取出透析袋内液体，加入等量甘油后放置-20℃保存。

稀释液：浓度为0.01M，pH7.4的PBST中添加10％小牛血清。

辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG溶液：将按照上述方法制备的辣根过氧化物酶(HRP)标记兔抗猪IgG用稀释液稀释至1∶8000，混匀，分装为12ml/瓶。

(3)样品稀释液：含有0.5％的NaCl，1％的casein(酪蛋白)、0.001％的NaN₃、0.001％的溴甲酚紫的溶液，分装为6ml/瓶；

(4)TMB显色剂：TMB浓度是0.3g/L，分装为6ml/瓶；

(5)终止液：2M的H₂SO₄，分装为6ml/瓶；

(6)20倍浓缩洗液：0.2M pH7.4的PBST。分装为30ml/瓶。

(7)阴性对照：稀释的不含猪抗猪瘟病毒抗体的猪血清或血浆，分装为0.5ml/瓶。

(8)阳性对照：为稀释的含有猪抗猪瘟病毒抗体的猪血清或血浆，分装为0.5ml/瓶，

组装：将所有瓶装试剂插于盒托的对应孔内，与酶联板、说明书、自封袋、封板膜一起放入纸盒，储存于2～8℃，检验合格后贴检封签。

实施实例3本发明试剂盒检测猪瘟抗体的方法

检测样品制备：

①采血，静置沉淀或3000转/分钟离心5分钟，上清即为血清。

②采血，加入抗凝剂，3000转/分钟离心5分钟，上清即为血浆。

样品应为淡黄色、黄色、无乳糜、无溶血及异物的血清或血浆。各种常用抗凝剂对试验结果均无影响。如果不立即试验，可在2～8℃冰箱保存1～2天。长期储存需要在-18℃～-25℃冷冻，试验前平衡至室温并混匀。

具体使用操作步骤如下：

1.平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30分钟后使用。

2.配洗液：将20倍浓缩洗液用纯化水稀释20倍备用。

3.设定：留1孔作空白对照，另设阴性对照3孔、阳性对照2孔，A1孔不加标本稀释液，A2A3加100μl阳性对照血清，A4-A6加100μl阴性对照血清。

4.加样：在其它反应孔中各加样品稀释液50μl。

5.温育：在反应板上加盖封板膜，振荡混匀，置室温避光反应20分钟。

6.洗板：弃去反应液，每孔注满洗液，浸泡15秒，甩弃洗液。连续洗板5次，最后拍干。

7.加酶：每孔加入100μl辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG溶液(空白对照孔不加)。

8.温育：在反应板上加盖封板膜，置室温避光反应20分钟。

9.洗板：洗板5次，同操作步骤6。

10.显色：每孔依次加入TMB显色剂100μl(包括空白对照孔)，加盖封板膜，振荡混匀，室温避光反应10分钟。

11.终止：每孔加入终止液各50μl(包括空白对照孔)，振荡混匀终止反应。

12.测定：用酶标仪对空白孔调零，单波长450nm测定各孔OD值。

结果判定：

1.临界值(cut-off值)计算：

临界值＝0.10+阴性对照OD平均值(阴性对照OD平均值≤0.05按0.05计算)。

2.结果判定：

测定标本OD值≥(2×临界值)时为抗猪瘟病毒抗体阳性。

测定标本OD值介于临界值与(2×临界值)之间时为可疑。

测定标本OD值＜临界值时为抗猪瘟病毒抗体阴性。

群体保护率计算：

群体保护率＝(抗体阳性数+抗体可疑数×75％)/总受检数×100％。

实施实例4本发明试剂盒检测猪瘟抗体

取临床样本30例，用本试剂盒检测，检测结果如下：

判定：OD≥0.2时为阳性。

其中，阳性20例，阴性10例，吻合率100％。

购买口蹄疫阳性血清、蓝耳病阳性血清、猪瘟阳性进行对比试验如下表：

样本号	结果	样本号	结果	样本号	结果
						1	0.142	6	0.087	11	1.201
2	0.089	7	0.062	12	1.198
						3	0.035	8	0.047	13	1.274
4	0.078	9	0.108	14	1.767
						5	0.103	10	0.037	15	1.417

其中样本号1-5为口蹄疫阳性血清，6-10为蓝耳病阳性血清，11-15为猪瘟阳性血清。

判定：OD≥0.2时为阳性。其中口蹄疫、蓝耳病血清检出阴性，猪瘟结果阳性，因此本试剂盒具有良好的特异性。

Claims (4)

1.一种检测猪瘟抗体的试剂盒，其特征在于包括：

(1)猪瘟病毒特异性抗原包被的酶联板；

(2)辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体溶液；

(3)样品稀释液，含有质量浓度为0.5％的NaCl、1％的酪蛋白、0.001％的NaN₃、0.001％的溴甲酚紫的溶液；

(4)TMB显色剂：浓度是0.3g/L；

(5)终止液，浓度为2M的H₂SO₄溶液；

(6)20倍浓缩洗液：含有质量浓度为21g/L的Na₂HPO₄·12H₂O，质量浓度为2.80g/L的NaH₂PO₄·2H₂O，质量浓度为170g/L的NaCl，体积浓度为20ml/L吐温-20；

(7)阴性对照，经稀释的不含猪抗猪瘟病毒抗体的猪血清或血浆；

(8)阳性对照：经稀释的含有猪抗猪瘟病毒抗体的猪血清或血浆。

2.根据权利要求1所述的检测猪瘟抗体的试剂盒，其特征在于所述的猪瘟病毒特异性抗原包被酶联板由以下方法制得：

一.制备猪瘟病毒特异性抗原

(1)反转录反应：以P2为引物，CSFV石门株的总RNA为模板反转录反应；

(2)PCR反应：以反转录产物为模板，P1和P2为引物进行PCR反应；其中，

P1的序列为：5’-TAAAAGGATCCGGCCTGACCACCACCTGGGAAG-3’，

P2序列为：5’-CCCCTCTCGAGTTAATAGCTATCACGCGGTTCATAATATTTG-3’；

(3)回收PCR反应产物中片断大小为887bp，将其克隆入pET32a载体的BamH I和Xho I酶切位点之间，构建成功的重组载体命名为pET32a-E2，将重组载体pET32a-E2进一步转化入大肠杆菌宿主菌BL21，进行重组蛋白表达；

(4)纯化重组蛋白，得猪瘟病毒特异性抗原；

二.用猪瘟病毒特异性抗原包被固化于96孔酶联板上。

3.根据权利要求1所述的检测猪瘟抗体的试剂盒，其特征在于所述的辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体溶液由以下方法制得：

(1)制备兔抗猪IgG抗体：用猪IgG免疫家兔后，分离得血清，经纯化获得兔抗猪IgG抗体；

(2)用辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体；

(3)用稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体，获得辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG抗体溶液。

4.根据权利要求1所述的检测猪瘟抗体的试剂盒，其特征在于所述稀释液由以下方法制得：

在浓度为0.01M，pH7.4的PBST中添加10％小牛血清。