JP2023060976A - テストステロン濃度の測定方法 - Google Patents

Abstract

【課題】テストステロン（Ｔｅｓｔ）の血中濃度は臨床上非常に重要な情報ではあるが、その血中濃度は非常に低いため、検出感度を向上させる。【解決手段】Ｔｅｓｔと結合することができる分子（Ｔｅｓｔ結合分子;抗体等）と、ＴｅｓｔとＴｅｓｔ結合分子との複合体に対して特異的に結合することができる分子（捕捉分子;抗体等）とを使用し、ＴｅｓｔとＴｅｓｔ結合分子との複合体の量を酵素標識を用いて測定する。【選択図】 図５

Description

本発明は、テストステロン濃度を測定する方法に関するものである。

抗体を用いた特定物質の検出方法についてはこれまで非常によく研究されており、数多くの方法が報告されている。しかしその技術の中心部分に注目すると、数種類の方法に分類することができる。そしてその中でも最も代表的な方法が、サンドイッチ法と競合法である。サンドイッチ法は、抗原を二種類の抗体で挟みこむことで捕捉し、検出する手法である。この方法ではまず、一方の抗体（一次抗体）を担体に固定化しておき、この一次抗体の働きにより、抗原を担体上に固定する。次に酵素や蛍光色素などで標識したもう一方の抗体（二次抗体）を加える。この標識した二次抗体が担体上に固定された抗原を捕捉して結合する。そしてこの標識した二次抗体により発せられるシグナルを検出することで抗原を定量する（図１）。一方競合法は、一種類の抗体を用いて抗原を検出する方法である。この方法では、抗体を担体に固定化しておき、抗原を含む試料と酵素や蛍光色素などで標識した抗原（標識化抗原）とを添加する。試料中の抗原量が増えると、抗体と結合する標識化抗原が減り、シグナルが弱くなる。抗原が含まれない試料を添加した時に標識化抗原から発せられるシグナルの強度を１００％とし、抗原が含まれる試料を添加した時に標識化抗原から発せられるシグナル強度をこれに対する相対的な値として計算し、試料中の抗原量を算出する（図２）。

サンドイッチ法、競合法、いずれの方法でも、抗原を定量的に検出可能である。しかし、その測定原理の違いにより利点と欠点がある。サンドイッチ法では、二次抗体の量を自由に増やすことができるため、シグナルの増幅が可能である。そのため、微量の抗原でも高い感度で検出できる。しかしこの方法では、二種類の抗体が抗原上で同時に結合する必要がある。そのためサンドイッチ法では、抗体と相互作用する部位を複数有した比較的分子量の大きいものしか検出できない。一方競合法では、使用する抗体が一種類で済むため抗体と相互作用する部位の少ない低分子量化合物（非特許文献１）であっても定量的に検出できる。また実験操作がサンドイッチ法より１ステップ少ないため、測定時間が短く済む。しかし、サンドイッチ法のようにシグナルを増幅することができないため、同じ性能の抗体を使用した場合で比較すると、感度の点ではサンドイッチ法より劣る。

ステロイドホルモンの一種に、テストステロン（以下、「Ｔｅｓｔ」とする）と呼ばれる低分子化合物がある。Ｔｅｓｔは、精巣機能不全や男性ホルモン過剰症などで異常な血中濃度を示すことが分かっている。そのためこのホルモンは、不妊などの診断マーカーとして広く利用されている。

Ｔｅｓｔの血中濃度は臨床上非常に重要な情報ではあるが、その測定系の構築は容易ではない。特に血中のＴｅｓｔ濃度は非常に低いため、その検出には感度のよい測定系を構築する必要がある。しかしＴｅｓｔとの親和性が高い抗体は容易には得られない。またＴｅｓｔは分子量が小さいためサンドイッチ法による検出が難しく、通常は競合法が利用されている。そのため、感度よくＴｅｓｔを検出することは非常に難しく、これまで大きな課題となっていた。

生化学、８２（８）、７１０：２０１０

本発明が解決しようとする課題は、Ｔｅｓｔの検出感度を向上させることである。

本発明者は上記課題に関し鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は以下のとおりである。
（１）テストステロン（Ｔｅｓｔ）と結合することができる分子（Ｔｅｓｔ結合分子）と、ＴｅｓｔとＴｅｓｔ結合分子との複合体に対して特異的に結合することができる分子（捕捉分子）とを使用することを特徴とするＴｅｓｔ濃度の測定方法。
（２）ＴｅｓｔとＴｅｓｔ結合分子との複合体の量を測定する、（１）に記載の測定方法。
（３）Ｔｅｓｔ結合分子が抗体である、（１）又は（２）に記載の測定方法。
（４）補足分子が抗体である、（１）～（３）いずれか１項に記載の測定方法。
（５）酵素標識を用いてＴｅｓｔ濃度を測定する、（１）～（４）いずれか１項に記載の測定方法。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明はＴｅｓｔ濃度を測定する方法に関するものであり、Ｔｅｓｔ結合分子と、捕捉分子とを使用することによってＴｅｓｔ濃度を測定することを特徴とする。

測定に使用するＴｅｓｔ結合分子は、Ｔｅｓｔと結合することができる分子であれば特にその種類が限定されるわけではなく、アプタマーやペプチド、受容体、抗体などを使用できる。またこのＴｅｓｔ結合分子が抗体である場合、特にそのサブクラスが限定されるわけでもなく、ＩｇＧ１やＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥなどを利用することができる。またこの抗体はその由来やフォーマットに関しても特に限定されるものではなく、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、魚類、鳥類などに由来するものや、一本鎖抗体、バイスペシフィック抗体、Ｆ（ａｂ），Ｆ（ａｂ’），Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦ（ａｂ）、Ｆｖ，ｓｃＦｖ，ｓｄＡｂなどを利用することができる。

また測定に使用する捕捉分子は、ＴｅｓｔとＴｅｓｔ結合分子との複合体に対して特異的に結合する性質があれば特にその種類が限定されるわけではなく、アプタマーやペプチド、受容体、抗体などを使用できる。またこの捕捉分子が抗体である場合、抗イムノコンプレックス抗体ともいうことができ、特にそのサブクラスが限定されるわけでもなく、ＩｇＧ１やＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＭ、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥなどを利用することができる。またこの抗体はその由来やフォーマットに関しても特に限定されるものではなく、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、魚類、鳥類などに由来するものや、一本鎖抗体、バイスペシフィック抗体、Ｆ（ａｂ），Ｆ（ａｂ’），Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦ（ａｂ）、Ｆｖ，ｓｃＦｖ，ｓｄＡｂなどを利用することができる。

Ｔｅｓｔ結合分子又は捕捉分子は標識されていることが好ましく、その標識によってＴｅｓｔ濃度を測定することが好ましい。標識としては特に限定は無く、例えば酵素、放射性物質、金コロイド、蛍光物質等を用いることができ、特に酵素が好ましく用いられる。

このようなＴｅｓｔ結合分子と捕捉分子とを用いることにより、Ｔｅｓｔ濃度を感度良く測定することが可能となる。

本発明により、感度よくテストステロン濃度を測定することができる

サンドイッチ法による測定の原理図である。 競合法による測定の原理図である。 比較例の競合法によってＴｅｓｔを測定した結果の図である。 本発明の方法によってＴｅｓｔを測定する原理図である。 実施例の方法によってＴｅｓｔを測定した結果の図である。

以下、実施例によって本発明を具体的に示すが、本発明はこの実施例に限定されるものではない。尚、本実施例に使用した薬品の組成及びｐＨは以下に示す通りである。

炭酸緩衝液（ｐＨ９．６）
１２ｍＭ 炭酸ナトリウム
３８ｍＭ 炭酸水素ナトリウム
洗浄緩衝液（ｐＨ７．４）
１ｍＭ トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン
７．５ｍＭ 塩化ナトリウム
０．０５％ ｔｗｅｅｎ２０
ブロッキング緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．７ｍＭ 塩化カリウム
１％ スキムミルク。

インキュベーション緩衝液（ｐＨ７．５）
８．１ｍＭ りん酸水素二ナトリウム・１２水和物
１．５ｍＭ りん酸水素カリウム
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
２．７ｍＭ 塩化カリウム
０．１％ スキムミルク
ＡＬＰ緩衝液（ｐＨ９．８）
１Ｍ ジエタノールアミン
０．５ｍＭ 塩化マグネシウム
１０ｍＭ ４－メチルウンベリフェリルリン酸
ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）
１３７ｍＭ 塩化ナトリウム
８．１ｍＭ リン酸水素二ナトリウム
２．６８ｍＭ 塩化カリウム
１．４７ｍＭ リン酸二水素カリウム。

（１）Ｔｅｓｔ結合抗体単離用免疫抗原の調製
ウシ血清アルブミン（以下、ＢＳＡ）を１００ｍｇ量り取り、１０ｍｌの５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８．５）へ溶かした。次にリンカーが導入されているＴｅｓｔを１４ｍｇ量り取り、２００μｌのジメチルホルムアミドヘ溶かした。その後このＴｅｓｔ溶液をＢＳＡ溶液へ加え、室温で３０分反応させた。そしてこの反応液を透析チューブの中へ入れてからＰＢＳ溶液に対して透析し、未反応のＴｅｓｔを除去した。透析後は透析チューブの中からＴｅｓｔで標識されたＢＳＡを回収し、Ｔｅｓｔ結合抗体単離用免疫抗原として利用した。

（２）Ｔｅｓｔ結合抗体を単離するための実験動物への免疫
免疫動物としてウサギ（雌、日本白色種、１２週齢）を２匹用意した。２ｍｇ／ｍｌのＴｅｓｔ結合抗体単離用免疫抗原溶液とフロイントコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そしてこの混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるウサギの背部皮下へ１ｍｌずつ注入し、免疫した。

初回の免疫を行った１週間後、下記の通り再度免疫を行った。まず、２ｍｇ／ｍｌのＴｅｓｔ結合抗体単離用免疫抗原溶液とフロイントインコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。そしてこの混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるウサギの背部皮下へ１ｍｌずつ注入し、免疫した。２回目の免疫以降は、フロイントインコンプリートアジュバンドを用いたこの免疫作業を２５週間に渡り毎週繰り返し行った。

（３）Ｔｅｓｔ結合抗体を単離するための細胞融合
２５週間の免疫後、免疫したウサギを安楽死させ、脾臓を摘出した。そしてここからＢ細胞を単離し、ミエローマ細胞と混ぜ、ＰＥＧ法によって細胞融合させ、融合細胞を回収して融合細胞用培地（Ｅ－ＲＤＦ＋１０％牛血清＋５％ ＢＭコンディムド＋ＨＡＴ）に懸濁し、４×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう細胞密度を調整した。その後、この細胞懸濁液を３８４ウェルプレートへまき、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境で培養した。

（４）Ｔｅｓｔ結合抗体のスクリーニング
融合細胞の培養後、培養上清中に分泌された抗体と抗原との反応性をＥＬＩＳＡ法によって下記の通り調べた。
（Ａ）抗ウサギ抗体を０．５μｇ／ｍｌとなるように炭酸緩衝液へ溶かし、この溶液をＥＬＩＳＡ用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ分注した。その後、このプレートを室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（Ｂ）ブロッキング緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で１回洗浄した。
（Ｃ）インキュベーション緩衝液を各ウェルに５０μｌずつ加えた。
（Ｄ）培養上清を各ウェルに２μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。なおこの時、次の工程で２種類の溶液を入れ比べてＴｅｓｔとの反応性を調べるため、培養上清が添加された同一プレートを２セット作成した。その後これらのプレートの各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。

（Ｅ）アルカリホスファターゼで標識されたＴｅｓｔが含まれるインキュベーション緩衝液を一つ目のプレートの各ウェルに５０μｌずつ加え、室温で１時間静置した。またもう一方のプレートには、アルカリホスファターゼで標識されたＴｅｓｔと何も標識されていないＴｅｓｔとが含まれるインキュベーション緩衝液を５０μｌずつ各ウェルに加え、室温で１時間静置した。その後これらのプレートの各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｆ）ＡＬＰ緩衝液を各ウェルに５０μｌ加え、３０分静置した。
（Ｇ）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６５ｎｍ）、抗原と反応性のある抗体が含まれるウェルを調べた。このようなスクリーニングにより、抗原と強く結合する抗体の含まれるウェルを同定した。そしてこのウェルから細胞を回収した。

（５）Ｔｅｓｔ結合抗体の遺伝子配列の取得
ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｃｒｏ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用い、回収した細胞からｍＲＮＡを精製した。その後、このｍＲＮＡをテンプレートとし、Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ ＲＴ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｃＤＮＡを合成した。次に、このｃＤＮＡをテンプレートとし、抗体のＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子をＰＣＲ法でそれぞれ増幅させた。その後、このＰＣＲ産物の遺伝子配列を解析し、Ｔｅｓｔと反応性のある抗体のＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子の全長配列を決定した。

（６）Ｔｅｓｔ結合抗体の発現・精製
クローニングしたＴｅｓｔ結合抗体のＨ鎖遺伝子とＬ鎖遺伝子とをＮｅｏｎ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）で動物細胞へトランスフェクションした。その後この細胞を動物細胞培養用培地（Ｅ－ＲＤＦ＋１０％ＦＣＳ）に懸濁し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境で培養した。トランスフェクションを行ってから３日後、この培養液に終濃度が５００μｇ／ｍｌとなるようＧ－４１８硫酸塩を添加した。そしてＧ－４１８硫酸塩を添加してからさらに４日後、この細胞を選択用培地（Ｅ－ＲＤＦ＋１０％ ＦＣＳ＋５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８硫酸塩）へ懸濁して３８４ウェルプレートへまき、限界希釈を実施した。限界希釈を実施してから５日後、下記のＥＬＩＳＡ法によって抗体を発現している細胞株が含まれるウェルを調べた。

（Ａ）抗ウサギ抗体を０．５μｇ／ｍｌとなるように炭酸緩衝液へ溶かし、この溶液をＥＬＩＳＡ用プレート（３８４ウェル）の各ウェルへ５０μｌずつ分注した。その後、このプレートを室温で１時間静置し、洗浄緩衝液で各ウェルを３回洗浄した。
（Ｂ）ブロッキング緩衝液を各ウェルに１００μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後、各ウェルを洗浄緩衝液で１回洗浄した。
（Ｃ）インキュベーション緩衝液を各ウェルに５０μｌずつ加えた。
（Ｄ）培養上清を各ウェルに２μｌずつ加えてから室温で１時間静置した。その後このプレートの各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｅ）アルカリホスファターゼで標識された抗ウサギ抗体が含まれるインキュベーション緩衝液を５０μｌずつ加え、室温で１時間静置した。その後このプレートの各ウェルを洗浄緩衝液で３回洗浄した。
（Ｆ）ＡＬＰ緩衝液を各ウェルに５０μｌ加え、３０分静置した。
（Ｇ）蛍光強度を測定し（Ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ３６０ｎｍ／Ｅｍｉｓｓｉｏｎ ４６５ｎｍ）、ウサギ抗体を発現する細胞が含まれるウェルを調べた。

ウサギ抗体が強く発現しているウェルを顕微鏡で観察し、ウェル内の細胞が単クローン化されている場所を調べた。そしてこのウェルから細胞を回収し、動物細胞培養用培地へ懸濁した。そしてこの細胞を３７℃、５％ ＣＯ_２の環境で再び培養した。その後この細胞を用いて上記限界希釈とＥＬＩＳＡを数回実施し、抗体発現細胞を単クローン化した。

単クローン化したＴｅｓｔ結合抗体発現細胞を無血清培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）に懸濁し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境で培養した。その後ここから培養上清を回収し、この培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（東ソー社製）に通してＴｅｓｔ結合抗体を精製した。競合法によるＴｅｓｔ濃度測定はこの精製抗体を用いて実験を行った。

（７）捕捉抗体単離用免疫抗原の調整
精製したＴｅｓｔ結合抗体を５０ｍｇ用意した。そしてこの抗体が溶けている緩衝液をダイジェスション緩衝液（２０ｍＭ リン酸ナトリウム、１０ｍＭ エチレンジアミン四酢酸ナトリウム、２０ｍＭ システイン、ｐＨ７．７）へ置換し、２０ｍｇ／ｍｌとなるよう濃度を調整した。この抗体溶液をダイジェスション緩衝液で平衡化した２．５ｍｌのパパイン固定化樹脂（ピアス社製）と混ぜ、３７℃で５時間反応させた。その後この反応液に１Ｍトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン緩衝液（ｐＨ８）を５ｍｌ加え、反応を止めた。次にこの反応液を１５０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を回収した。回収した上清をＰＢＳ緩衝液で平衡化した２．５ｍｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（東ソー社製）へ通し、素通りを回収した。さらにこのカラムへ２５ｍｌのＰＢＳ緩衝液を加えて洗い、この溶液も回収した。回収した素通りと洗浄液とを一つにまとめた後、ＰＢＳ緩衝液で平衡した２．５ｍｌの新たなＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（東ソー社製）へ通し、素通りを回収した。さらにこのカラムへ２５ｍｌのＰＢＳ緩衝液を加えて洗い、この溶液も回収した。回収した素通りと洗浄液とを一つにまとめて濃縮し、透析によって１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン緩衝液（ｐＨ７．５）へバッファーを交換した。このＦ（ａｂ）化されたＴｅｓｔ結合抗体を捕捉抗体単離用免疫抗原として利用した。

（８）捕捉抗体を単離するための実験動物への免疫
免疫動物としてマウス（雌、ＩＣＲ，４週齢）を用意した。１ｍｇ／ｍｌのＦ（ａｂ）化されたＴｅｓｔ結合抗体４ｍｌと、２０ｍＭのｔｅｓｔ溶液４０μｌとを混ぜ、室温で１時間放置した。そしてこの溶液とフロイントコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。この混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるマウスの腹腔に１００μｌずつ注入し、免疫した。
初回の免疫を行った１週間後、下記の通り再度免疫を行った。まず、１ｍｇ／ｍｌのＦ（ａｂ）化されたＴｅｓｔ結合抗体４ｍｌと、２０ｍＭのＴｅｓｔ溶液４０μｌとを混ぜ、室温で１時間放置した。そしてこの溶液とフロイントコンプリートアジュバンドの１：１混合溶液を調製した。この混合液を氷上で超音波にかけ、乳化させた。その後この溶液を用意してあるマウスの腹腔に１００μｌずつ注入し、免疫した。２回目の免疫以降は、フロイントインコンプリートアジュバンドを用いたこの免疫作業を８週間に渡り毎週繰り返し行った。

（９）捕捉抗体を単離するための細胞融合
８週間の免疫後、免疫したマウスを安楽死させ、脾臓を摘出した。そしてここからＢ細胞を単離し、ミエローマ細胞と混ぜ、電気融合法によって細胞融合させ、融合細胞を回収して融合細胞用培地（Ｅ－ＲＤＦ＋１０％牛血清＋５％ ＢＭコンディムド＋ＨＡＴ）に懸濁し、８×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌとなるよう細胞密度を調整した。その後、この細胞懸濁液を３８４ウェルプレートへまき、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境で培養した。

（１０）捕捉抗体のスクリーニング
融合細胞の培養後、培養上清中に分泌された抗体と、「ＴｅｓｔとＴｅｓｔ結合抗体との複合体」との反応性を既に報告されている手法に従って調べた（特許第６０３１９４４号公報）。その後ＴｅｓｔとＴｅｓｔ結合抗体との複合体に対して特異的に結合する抗体（捕捉抗体）が含まれるウェルから細胞を回収し、動物細胞培養用培地に懸濁して３７℃、５％ ＣＯ_２の環境で培養した。次にこの細胞を限界希釈し、捕捉抗体発現細胞株を単クローン化した。単クローン化した捕捉抗体発現細胞を無血清培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社製）に懸濁し、３７℃、５％ ＣＯ_２の環境で培養した。その後ここから培養上清を回収し、この培養上清をＰｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（東ソー社製）に通して捕捉抗体を精製した。

（１１）精製抗体の固定化と標識化
３．３ｍＭとなるようジメチルホルムアミドに溶解させた５－ＳＦＸ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社製）の溶液１０μｌを１ｍｇ／ｍｌ、１ｍｌの精製したＴｅｓｔ結合抗体溶液に加え、４℃で一昼夜反応させた。次に１６６．５ｍＭとなるようグリシンを蒸留水に溶かし、この溶液を先ほどの反応液に１００μｌ加えた。そしてこの反応液を大過剰のＰＢＳ緩衝液に対して透析した。サンドイッチ法によるＴｅｓｔ濃度測定には、このＴｅｓｔ結合抗体を固相に固定化して利用した。なお、固相としては磁性微粒子を使用した。
精製した捕捉抗体１００μｇをＡｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ－ＮＨ_２（同仁化学研究所社製）で標識した。サンドイッチ法によるＴｅｓｔ濃度測定にはアルカリホスファターゼで標識されたこの捕捉抗体を利用した。

（１２）競合法によるＴｅｓｔ濃度の測定（比較例）
競合法によるＴｅｓｔ濃度の測定を既に報告されている手法（特開２０２１－２３２２７号公報）に従って行った。そしてＴｅｓｔが全く含まれないキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｂ０）を１００％として、各キャリブレーター溶液（Ｃａｌ２～６）を加えた時のシグナル（Ｂ）をそれぞれ相対的な値［（Ｂ／Ｂ０）×１００］として算出した。その後Ｔｅｓｔ濃度を横軸（対数）、（Ｂ／Ｂ０）×１００（％）を縦軸にとり、各キャリブレーター溶液使用時の測定結果をプロットして検量線を作成した（図３）。実験の結果、各キャリブレーター溶液使用時のシグナル変化率はＣａｌ２：８．３％、Ｃａｌ３：２４．３％、Ｃａｌ４：５０．０％、Ｃａｌ５：６５．８％、Ｃａｌ６：８０．０％となった。

（１３）本発明の方法によるＴｅｓｔ濃度の測定
本発明法によるＴｅｓｔ濃度の測定を既に報告されている手法（特開２０２１－０８１３１７号公報）に従って行った。その測定原理を図４に示す。Ｔｅｓｔが全く含まれないキャリブレーター溶液（Ｃａｌ１）を加えた時のシグナル（Ｎ）を基準として、各キャリブレーター溶液（Ｃａｌ２～６）を加えた時のシグナル（Ｓ）をそれぞれ相対的な値［（Ｓ／Ｎ）］として算出した。その後Ｔｅｓｔ濃度を横軸（対数）、Ｓ／Ｎを縦軸にとり、各キャリブレーター溶液使用時の測定結果をプロットして検量線を作成した（図５）。実験の結果、各キャリブレーター溶液使用時のシグナル変化率はＣａｌ２：３４５８％、Ｃａｌ３：７２５６％、Ｃａｌ４：２０５６３％、Ｃａｌ５：２６９７３％、Ｃａｌ６：２７８７５％となった。以上の結果から、同じＴｅｓｔ濃度であっても本発明による方法では競合法よりも大きなシグナル変化が起こると確認できた。またこのことから、本発明による方法を用いることによって競合法よりも感度よくＴｅｓｔを検出できることも明らかになった。

Claims (5)

1. テストステロン（Ｔｅｓｔ）と結合することができる分子（Ｔｅｓｔ結合分子）と、ＴｅｓｔとＴｅｓｔ結合分子との複合体に対して特異的に結合することができる分子（捕捉分子）とを使用することを特徴とするＴｅｓｔ濃度の測定方法。
2. ＴｅｓｔとＴｅｓｔ結合分子との複合体の量を測定する、請求項１に記載の測定方法。
3. Ｔｅｓｔ結合分子が抗体である、請求項１又は請求項２に記載の測定方法。
4. 補足分子が抗体である、請求項１～３いずれか１項に記載の測定方法。
5. 酵素標識を用いてＴｅｓｔ濃度を測定する、請求項１～４いずれか１項に記載の測定方法。

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