CN110268054A

CN110268054A - 切割事件转导方法和产品

Info

Publication number: CN110268054A
Application number: CN201780083453.7A
Authority: CN
Inventors: A·M·霍奇斯; R·查泰勒
Original assignee: Universal Biosensors Pty Ltd
Current assignee: Universal Biosensors Pty Ltd
Priority date: 2016-11-16
Filing date: 2017-11-16
Publication date: 2019-09-20
Also published as: WO2018090094A1; EP3541935A1; US20190360019A1; EP3541935A4

Abstract

本文中公开了并入借助分子切割事件而活化的酶介导反应步骤和/或级联放大方法的方法和产品，和检测测定法中切割过程的方法和产品，其中结合事件可以用来选择性地检测目的分析物。

Description

切割事件转导方法和产品

相关申请的交叉引用

本申请要求2016年11月16日提交的名为“切割事件转导方法”的美国临时申请号62/423,087的权益。前述文献的完整内容因而在通过引用的方式并入本文。

背景技术

在一些感知应用中，需要有能力在分子切割出现时检测。在现有技术方法和装置中，这可能是困难的，因为正在分析的样品的特性经常仅存在微小变化或不存在可检出变化。感知切割事件可以用于直接检测本身切割某分子的分析物，或作为目的分析物和读出信号之间化学反应链的部分间接地检测。现有技术中的直接检测例子是检测作为凝血反应的部分所生成的凝血酶。在现有技术方法和装置中，例如，通过切割释放电活性或有色种类的底物，检测到凝血酶。现有技术中的间接检测例子是其中待检测的DNA或RNA与其他链DNA杂交以形成复合体，称作MNAzyme，所述复合体可以切割含有RNA键的底物DNA链。可以例如，通过分离引起荧光信号生成的荧光基团和猝灭剂基团，检测到对底物DNA的切割。

当分析物种类的所需浓度处生成的信号太小，以致于不容易检检出时，这些现有技术方法可以遭遇缺少灵敏度困扰。因此需要找到放大这种信号的方式。传统使用的化学放大信号的方法是拥有酶介导的反应作为信号生成化学的部分。酶可以循环许多次并且因此响应于存在单个分子或事件发生而产生多个分子。导致所生成信号级联式增加的反应方案在放大来自低浓度分析物的信号方面特别有利。

本发明寻求通过提供有效并入借助分子切割事件而活化的酶介导反应步骤和/或级联放大方法的分子实体和方法，克服现有技术中的这个缺陷。还公开了在测定法中利用本发明或其他切割检测方法的新方法，其中结合事件用来选择性地检测目的分析物。

发明简述

本文中公开了并入借助分子切割事件而活化的酶介导反应步骤和/或级联放大方法的分子实体和方法，和检测测定法中切割过程的方法和产品，其中结合事件可以用来选择性地检测目的分析物。

本发明的一些实施方案涉及可以包含酶和酶抑制剂复合体的分子实体。酶抑制剂复合体可以包括结合至接头部分的抑制剂部分。接头部分可以有能力与酶系留并且可以有能力受切割剂切割。当接头部分与酶系留时，酶的活性可以受抑制；当接头部分遭切割时，酶的活性可以增加。酶的活性可以可逆。

本发明的一些实施方案涉及用于检测切割剂存在情况的分子实体。分子实体可以包括借助在切割剂存在下发挥切割作用的接头结合至可逆性酶抑制剂的酶。

在一些实施方案中，接头部分可以包含切割位点、远端侧和内侧。内侧和远端侧在切割位点的对面。抑制剂部分可以在内侧上的位置与接头部分连接并且接头部分可以有能力在远端侧上的位置借助反应性种类与酶连接。

在一些实施方案中，接头部分可以包括至少两个切割位点、中间区域和至少两个远离中间区域的侧部。切割位点可以位于每个远端侧和中间区域之间。抑制剂部分可以在中间区域内与接头部分连接并且接头部分能够在远端侧上的位置借助反应性种类与酶连接。在一些实施方案中，反应性种类能够与酶形成共价键。反应性种类能够直接或借助交联剂与酶形成共价键。在一些实施方案中，通过施加紫外线、交联剂、活化剂、催化剂、热或其他等，接头部分的远端可以连接至酶。

在一些实施方案中，抑制剂部分可以按照混有酶浓度的酶抑制剂复合体浓度与酶结合。这些浓度可以高于分析试剂中待用的抑制型酶复合体浓度。

在一些实施方案中，酶可以是氧化还原酶、切割酶，等。

在一些实施方案中，酶抑制剂复合体可以包含接头放大部分。接头部分可以有能力受切割剂切割。对接头部分的切割可以导致(i)酶活化和(ii)接头放大部分形成和活化，所述接头放大部分可以有能力切割第二接头部分或与其他组分接合时可以有能力切割第二接头部分。在一些实施方案中，当活化时，接头放大部分可以形成脱氧核酶或MNAzyme的一个或多个部分。在一些实施方案中，切割剂可以是目标分析物并且其中酶的活性生成读出信号。

本发明的一些实施方案涉及一种在分子中检测切割事件的方法，所述方法包括：(a)提供可以包含酶和具有接头部分的酶抑制剂复合体的分子实体，所述酶抑制剂复合体处于其中接头部分与酶系留并且酶的活性受抑制的状态；(b)使试样经历(a)；和(c)检测装置可读取信号。检测到装置可读取信号可以提示切割事件。在一些实施方案中，切割事件可以提示试样中存在分析物。在一些实施方案中，实体(a)可以包含于溶液中、试纸条上等。在一些实施方案中，检测步骤可以包括检测电压、电流、光学吸光度、颜色、荧光、化学发光或其他的变化。

本发明的一些实施方案涉及检测切割事件的试剂盒，所述试剂盒可以包含：(a)一个或多个反应室；和(b)包含酶复合体的分析试剂，所述酶复合体处于其中接头部分与酶系留并且酶的活性受抑制的状态。分析试剂可以处于溶液形式、干形式等。

本发明的一些实施方案涉及分子实体复合体，其可以包含：(a)载体，和(b)放大性复合体。放大性复合体可以包含在一个或多个位置与载体系留的接头部分。当接头部分与载体连接时，放大性复合体的活性可以受抑制。当接头部分遭切割时，放大性复合体的活性可以增加。在一些实施方案中，载体可以是大分子、珠、杆等。在一些实施方案中，接头部分可以通过共价键与载体连接。

本发明的一些实施方案涉及使用分子实体检测切割事件的试剂盒，所述试剂盒可以包含：(a)一个或多个反应室；和(b)包含抑制型酶复合体的分析试剂。

本发明的一些实施方案涉及一种检测切割事件的方法，所述方法包括：(a)使试样经历包含分子实体的溶液，所述分子实体包含酶和酶抑制剂复合体；(b)当放大性复合体的活性受抑制时，添加包含载体和放大性复合体的分子复合体；并且(c)检测装置可读取信号。检测到装置可读取信号可以提示切割事件。

本发明的一些实施方案涉及一种用于检测切割事件的方法，所述方法可以包括：(a)使试样经历包含脱氧核酶或MNAzyme底物的溶液，所述底物可以包含荧光基团和猝灭剂基团；(b)当放大性复合体的活性受抑制时，添加包含载体和放大性复合体的分子复合体；并且(c)检测荧光。检测到荧光可以提示切割事件。

本发明的一些实施方案涉及分子实体，其可以包含至少一个与一条或多条DNA链连接的结合部分。DNA链至少之一可以包含脱氧核酶或MNAzyme组分。在一些实施方案中，一条或多条DNA链可以在互补性DNA存在或检测室中温度升高时，从分子实体解离。在一些实施方案中，分子与结合部分结合可以导致分子实体存在于检测室中。

在一些实施方案中，一条或多条分支DNA链可以借助DNA主链与结合部分连接。在一些实施方案中，结合部分可以是抗体。在一些实施方案中，一条或多条分支DNA链可以与DNA主链连接。在一些实施方案中，脱氧核酶或MNAzyme组分可以与分支DNA链连接。

本发明的一些实施方案涉及一种用于检测结合事件的方法，所述方法可以包括(a)使试样经历包含分子实体的溶液，所述分子实体包含至少一个与一条或多条DNA链连接的结合部分；(b)将借助结合部分结合的分子实体与不借助结合部分结合的分子实体分离；(c)添加结合或未结合的分子实体至能够生成装置可读取信号的底物；和(d)检测装置可读取信号。检测到装置可读取信号可以提示包含结合部分的结合事件。

本发明的一些实施方案涉及检测切割事件的试剂盒，所述试剂盒可以包括(a)第一反应室和第二反应室；(b)包含分子实体的分析试剂，所述分子实体包含至少一个与一条或多条DNA链连接的结合部分；和(c)分析试剂，其包含抑制型酶复合体、放大性复合体、包含荧光基团和猝灭剂基团的脱氧核酶或MNAzyme底物中至少之一。第一反应室可以用于形成试样和(b)的混合物。第二反应室可以用于检测混合物中的装置可读取信号。

在第一实施方案中，能够可逆抑制酶活性的种类(抑制剂)与目的分析物存在下可以遭切割的一种或多种分子或其他种类(接头)连接。包含接头部分和抑制剂部分的构建体在本文中称作抑制剂复合体。抑制剂复合体可以与酶在相对高的浓度如此混合，从而抑制剂复合体与该酶自装配并抑制其活性。在一些实施方案中，抑制剂部分远端的接头部分的区域可以包含基团，所述基团可以与酶反应以与酶形成共价键或其他适当牢固的键。在抑制剂复合体已经与酶自装配期间或之后，远端的反应基团可以任选地活化，使其与酶形成键。以这种方式，抑制剂复合体在至少一个点借助远端反应基团并且在至少第二点借助抑制剂复合体的抑制剂部分与酶的装配或借助第二接头部分与酶系留。这形成抑制型酶构建体(参见图1)。

在一些实施方案中，可以纯化含有抑制型酶构建体的溶液，以酌情移除外部种类。为了在感知应用中使用抑制型酶构建体，可以将含有抑制型酶构建体的溶液引入感知系统中并且作为液体或溶液经干燥以留下干态抑制型酶构建体使用。在测定法中使用时，抑制型酶构建体的浓度可以低于当它形成时使用的浓度，例如，低于10至100000，例如，10、15、20、25、30、35、40、50、75、100、200、300、400、500、1000、2000、3000、4000、5000直至10000倍。在一些实施方案中，归因于抑制剂复合体借助接头与酶系留，抑制剂的局部浓度保持高，因此导致抑制剂持续抑制酶活性。在一些实施方案中，如果接头归因于分析物的存在遭切割，则抑制剂自由地从酶解离，原因在于本体溶液中抑制剂的浓度相对低。当接头遭切割时，使抑制的酶逆转并且酶变得有活性，因此它可以从其底物生成多个种类，最终生成装置可读取信号。以这种方式，切割事件选择性地导致可以作为生成装置可读取信号的部分使用的酶活化。

在第二实施方案中，酶抑制剂复合体的接头部分可以包含接头放大部分，其中当接头遭切割时，放大部分活化。在一些实施方案中，接头放大部分与酶接合时不处于活性构型，但是当接头遭切割时，它从酶释放并且变得有活性。放大部分的活性包括自行或与其他种类组合时切割完整接头的能力。以这种方式，放大部分能够导致在借助初始切割事件启动后，切割事件发生速率和切割剂浓度随时间推移指数增长。形成的切割剂可以起到以下作用：活化根据本文所述实施方案的抑制型酶构建体中的酶以生成装置可读取信号(参见图2)。

在第三实施方案中，根据本发明第二实施方案的抑制剂复合体不需要结合于或抑制酶。在这个实施方案中，抑制剂复合体可以与载体结合，所述载体起到防止接头的放大部分在结合状态下有活性的作用。与载体接合的复合体称作放大性复合体(参见图3)。根据这个实施方案，切割剂浓度的指数增长如它在第二实施方案中那样推进，但是在这个实施方案中，切割剂通过切割独立的信号生成种类，生成可读取信号。独立的信号生成种类可以是根据本发明第一实施方案的抑制型酶构建体。备选地，它可以是另一个种类，如现有技术中已知的包含荧光基团和猝灭剂基团的脱氧核酶或MNAzyme底物，其中当底物遭切割以使其与猝灭剂基团分离时，荧光基团开始发荧光。例如，如果难以同时满足第二实施方案的全部所要求特征，则这个实施方案可以有用。这个实施方案允许将放大性复合体的所要求特征独立于生成可读取信号所要求的特征加以优化。

在第四实施方案中，提供一种方法，其中借助所述方法，检测到切割事件可以与结合事件联系。在这个实施方案中，一条或多条DNA链可以与结合部分如抗体接合。至少一个和优选地多个拷贝的易化物DNA优选地是与接合于结合部分的DNA杂交。这在此处称作标记物构建体。在目的分析物存在下，标记物构建体与结合配偶体结合，导致游离型/结合型标记物构建体的比率变化。剩余的游离型或结合型标记物构建体可以暴露于其中标记物构建体中杂交的DNA可以充当切割构建体的条件，或用来完成切割构建体的装配(参见图4)。切割构建体随后可以起到活化根据本发明第一实施方案的抑制型酶构建体或根据第二实施方案的接合载体的放大构建体中酶的作用，或使用其他方法(如现有技术中描述的那些)生成装置可读取信号。

还公开了适合随本文公开的分子实体一起使用和/或实施所公开方法的装置。

附图说明

图1显示本发明示例性第一实施方案的示意图，其显示抑制型酶复合体的装配和测定法中酶的去抑制。

图2显示使用Partzyme的本发明示例性第二实施方案的示意图，其显示接头中纳入放大部分的抑制型酶复合体的装配、测定法中酶的去抑制和放大MNAzyme的形成。

图3显示本发明示例性第三实施方案的示意图，所述实施方案使用Partzyme作为与载体接合的接头的部分，所述示意图显示放大MNAzyme的形成。

图4显示本发明的示例性第四实施方案，其显示与分支和主链DNA杂交的多个易化物DNA拷贝，其中主链DNA接合至抗体。

发明详述

现有技术中存在已知用于检测因目的分析物存在和/或浓集而生成的信号的多种方法。这些方法均具有优点和缺点。对本文公开的一些实施方案有特别意义的是在信号生成途径中并入酶以放大信号的方法，其中可以在为了这种分析物的可用测定法所要求的浓度范围内，从分析物生成所述信号。这些酶可以是这些酶，它们直接生成可以用检测装置检测到并转化成输出的种类，或是生成以下种类的这些酶，所述种类进入最终导致可以用检测装置检测到的种类生成的其他反应。从检测种类产生的检测信号可以处于许多形式，例如，它可以是电压或电流、改变入射光或反射光信号的特征的颜色或浊度、借助例如荧光或化学发光的发射光信号。为简化起见，本公开将聚焦于能够产生可以检测到的种类的可能酶类型子集，但是，本领域技术人员将充分理解，本文公开的本发明实施方案适用于其中酶存在于信号生成途径中的任何应用。

在本文公开的本发明一些实施方案中，使用直接或间接生成电活性种类的酶。可以在电极处直接检测到酶反应底物或可以使用介体将酶反应的产物转化成电活性种类。现有技术中已知的这样两个酶类别是氧化还原酶类或切割酶类。前者氧化或还原它们的底物并且直接从底物或借助介体形成电活性种类。后者切割底物以产生电活性种类。连同电活性种类，这些酶一般还可以按照相似方式产生有色种类，其中对特定波长光的吸收可以用来检测由酶作用生成的种类。

合适的氧化还原酶的非限制性例子是葡萄糖氧化酶、FAD依赖性葡萄糖脱氢酶、PQQ依赖性葡萄糖脱氢酶、乳糖氧化酶和其他能够直接或借助介体产生电活性种类的酶。也可以适合的非氧化还原酶的非限制性例子是凝血酶、胰蛋白酶和其他可以切割底物的酶。通过切割例如肽键以释放可检测种类，这些酶可以用来生成电活性、有色、荧光或其他可检测种类。

对于本文公开的本发明实施方案合适的抑制剂包括可以按照某种方式与酶接合并且当接合时阻止或显著降低酶活性的那种。

抑制剂还可以包含至少一个接头或能够与至少一个接头接合。与抑制剂接合时，接头能够受到与存在分析物相关的切割机制切割并且含有能够与酶接合的部分。抑制剂复合体可以包括一个、两个或更多个接头以与酶形成一个或多个可切割的连接。具有多于一个接头的可能优点是更牢固地系留抑制剂部分并且因此增加其抑制能力。一个、两个或更多个接头是否为最佳取决于抑制剂与酶结合的强度及其抑制强度，以及可以切割接头以使酶去抑制的速率。通常，更多的接头可能对具有更少强烈结合作用的抑制剂有利。

接头的确切性质取决于切割种类。切割种类可以是如现有技术中已知的基于蛋白质的酶、脱氧核酶或MNAzyme，或能够切割底物的其他种类，其中接头包括针对选定切割种类的底物。对于基于蛋白质的酶如蛋白酶，接头可以包括具有适宜氨基酸序列的肽。对于脱氧核酶或MNAzyme，接头可以包括含有至少一个可由脱氧核酶或MNAzyme切割的RNA键的DNA序列。

抑制剂复合体可以借助系留基团与酶接合，所述系留基团优选地在抑制剂复合体的酶抑制剂部分远端，从而接头切割位点位于酶抑制剂部分和系留基团之间。这个基团的功能是将抑制剂复合体与酶系留。如果存在包含复合体的多个接头，则系留基团可以优选地存在于每个接头上。系留基团可以有能力与酶形成共价键或非共价键。优选地，但非必需，系留基团与酶的接合可以由外部刺激触发。可以响应于外部刺激形成共价接合的合适系留基团的非限制性例子包括UV活化的交联剂。这种基团的例子是ATFB(4-叠氮基-2,3,5,6-四氟苯甲酸，来自Life Technologies)。在紫外线下，芳基叠氮基在酶上接受C-H键插入以形成C-N键。如果需要，ATFB的琥珀酰亚胺酯可以用来将这种基团接合至接头上的伯胺基，以将系留基团与抑制剂复合体的其余部分接合。

除通过紫外线活化之外，其他可能的外部触发机制包括而不限于添加交联试剂、活化试剂、催化剂或施加热。可以添加的交联试剂的例子是1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)。这种试剂可以将羧基偶联至伯胺。可以在抑制剂复合体已经与酶装配之前、期间或之后，将EDC添加至抑制剂复合体和酶的混合物。在一些实施方案中，可以在已经允许抑制剂复合体与酶自装配后，添加EDC或其他合适的交联试剂。一旦添加，EDC例如可以将抑制剂复合体的远端上的伯胺与酶上的羧基偶联。备选地，抑制剂复合体的远端上的羧基可以与酶上的伯胺偶联。

不受外部刺激触发并且不形成共价键的系留基团的例子是设计成以高亲和力与酶结合的适配体。

在现有技术中存在可以在本文公开的实施方案中使用的酶的已知抑制剂。例如，Mannocci等人在Bioconjugate Chemistry,2010第21卷,第1836至1841页中，所述文献因而通过引用方式完整地并入，公开了胰蛋白酶的抑制剂，所述抑制剂可以形成在本文的实施方案中可用的抑制剂复合体的基础。这份论文描述了已经与DNA接合的多种设计成抑制胰蛋白酶的分子，作为能够便利地鉴定对胰蛋白酶显示亲和力的分子的机制。这些在所公开的形式下不适用，但可以通过至少用适合在本发明中作为接头的序列替换所公开的DNA序列，使其合适。也可以对抑制剂分子和/或DNA进行额外修饰，以便能够用远端系留基团修饰DNA并且能够在事先或随后接合系留基团的情况下，将DNA正确地接合至抑制部分。例如，如现有技术中已知，可以用胺基修饰相对于抑制剂部分的DNA的远端并且用适于“点击”化学的基团修饰DNA近端。例如可以用叠氮基、炔基、TCO(反-环辛烯)基、四嗪基或其他合适基团修饰DNA的近端。可以用DNA上修饰物的点击化学缀合物对修饰如Mannocci等人(所述文献因而通过引用方式完整地并入)中公开的抑制剂分子上的羧酸基，以在抑制剂分子和DNA之间形成键。备选地，可以用巯基修饰DNA的近端，并且在远端和抑制剂部分上的伯胺基包含可以与巯基反应以将抑制剂部分与DNA接合的马来酰亚胺基团。在DNA的远端上的伯胺可以与琥珀酰亚胺酯反应以将系留基团与DNA接合。

为了形成抑制型酶复合体，将酶与抑制剂复合体混合，因此至少抑制剂复合体的抑制剂部分将与酶自装配。这种混合物中酶和抑制剂复合体的浓度高到足以确保高比例的酶将与抑制剂复合体接合。一旦在所需位点接合，可以施加任选的外部刺激以引起系留基团与酶接合，因此令抑制剂复合体锚定就位。如果想要抑制在先前轮次的这种反应中未抑制的酶，则可以重复这个顺序一次或多次。如果外部刺激不用来将抑制剂复合体与酶系留，则系留基团将设计成当抑制剂部分与酶结合时与酶接合。

在一些实施方案中，在形成抑制型酶复合体后，优选应将它从外部种类如未结合的抑制剂复合体、未抑制的酶或作为形成过程的部分添加的其他反应物中纯化出来。例如，未结合的抑制剂复合体可以基于种类的大小与抑制型酶构建体分离。不与抑制剂复合体结合的酶可以通过以下方式与抑制型酶构建体分离：将抑制型酶构建体的抑制剂复合体部分选择性与结合介质结合以将它与无抑制剂复合体的酶分离。这可以包括常规分离手段如过滤、色谱、离心或磁性分离等。在已经进行任何所需的纯化后，抑制酶复合体做好准备用于测定法中。

为了用于测定法中，将抑制型酶复合体稀释，优选地在5和100000倍之间、或更优选地在10和10000倍之间或在100和5000倍之间或在500和1000倍之间。归因于存在至少一种包含系留基团和接头的系留物，在这个稀释过程后，抑制剂将不从酶解离达到显著程度。在这种情况下，明显的解离意味着这样的解离程度，其对酶而言大到足以在系留物完整时，产生大得不可接受的分析信号。在测定法中接头遭切割时，切割的抑制剂复合体将因稀释抑制型酶复合体而自酶解离到明显的程度，在该过程中使酶去抑制。在这种情况下，明显解离意指切割的抑制剂复合体充分地解离，从而酶可以在目的分析物浓度范围内，在目的分析物存在下产生数量大得可接受的信号生成种类。

例如，图1显示本发明示例性第一实施方案的示意图，其显示抑制酶复合体的装配和测定法中酶的去抑制。为了形成抑制酶复合体，将酶(1)与包含抑制剂部分(5)和接头部分(3)的抑制剂复合体(4)混合，因此至少抑制剂复合体(4)的抑制剂部分(5)将与酶(1)自装配。这种混合物中酶和抑制剂复合体的浓度高到足以确保高比例的酶将与抑制剂复合体接合。一旦在所需位点接合，可以施加任选的外部刺激以引起系留基团与酶接合，因此令抑制剂复合体锚定就位。在形成抑制型酶复合体后，可以将它从外部种类如未结合的抑制剂复合体、未抑制的酶或作为形成过程的部分添加的其他反应物等中纯化出来。在测定法中接头遭切割时，切割的抑制剂复合体将因稀释抑制型酶复合体而自酶解离到明显的程度，在该过程中使酶去抑制。在这种情况下，明显解离意指切割的抑制剂复合体充分地解离，从而酶可以在目的分析物浓度范围内，在目的分析物存在下产生数量大得可接受的信号生成种类。

根据本文公开的本发明第二实施方案，放大部分可以并入抑制剂复合体的接头部分中。例如，放大部分可以是这样的DNA序列，其可以作用为充当脱氧核酶或充当可与第二partzyme和易化物接合以形成MNAzyme的partzyme，如现有技术中已知。脱氧核酶或MNAzyme能够在正确条件下切割酶复合体的连接部分。例如，脱氧核酶需要二价阳离子如钙或镁的存在，以能够切割其底物，并且partzymes需要互补性partzyme和易化物DNA以及钙或镁的存在以发挥作用。通过确保在制备抑制酶复合体期间不存在为接头的脱氧核酶或partzyme部分能够切割底物必需的条件，可以避免过早切割抑制剂复合体的接头部分。

接头的放大部分可以如此安置，从而接头切割点在抑制剂部分远端的放大部分末端和接头与酶接合的点之间。以这种方式，当接头遭切割时，将释放放大部分连同抑制剂部分。如果放大部分包含脱氧核酶，则一旦释放，它可自由折叠成可以切割抑制剂复合体的接头部分的构象。如果放大部分包含partzyme，则一旦释放，它可以与互补性partzyme和易化物DNA组合，以形成可以切割抑制剂复合体的接头部分的MNAzyme。互补性partzyme和/或易化物DNA可以作为游离种类存在于测定溶液中，或它们之一或两者可以作为附加的酶抑制剂复合体中的备选性放大部分并入测定混合物中。可能有利的是，在目的分析物不存在的情况下抑制对接头的切割。

根据这个实施方案，对接头的切割同时地去抑制酶并且产生能够切割接头的其他种类。这导致切割事件发生的速率出现指数增长并且因此导致去抑制型酶的浓度随时间推移指数增长，并且从而能够级联放大由存在分析物引起的原始切割过程。

例如，图2显示使用Partzyme的本发明示例性第二实施方案的示意图，其显示接头(3)中纳入放大部分的抑制型酶复合体的装配、测定法中酶(1)的去抑制和放大MNAzyme(8)的形成。放大部分可以并入抑制剂复合体的接头部分(3)中。例如，如果放大部分包含partzyme(6a)，则一旦释放(例如，通过接头在测定法中遭起始物Partzyme和分析物DNA切割)，它可以与互补性partzyme(6b)和易化物DNA(7)组合，以形成放大MNAzyme(8)，后者可以切割更多系留物以产生级联。

根据本发明的本文公开的第三实施方案，根据第二实施方案的抑制剂复合体可以简化并且不结合于或不抑制酶。根据这个实施方案，抑制剂复合体可以替换为与载体结合的放大物/接头复合体，所述载体起到防止放大部分在结合状态下有活性的作用。载体可以是防止抑制剂复合体的放大部分有活性的任何东西。合适载体的例子包括但不限于可溶于分析流体中的大分子如蛋白质或其他聚合物；包含不溶于分析流体中的聚合物的珠、杆或其他形状如乳胶或聚苯乙烯珠、磁珠，或一般大于抑制剂复合体的其他种类。优选载体应足够地小，从而它可以自由地分散并且在测定溶液中高度可移动并具有巨大表面积以允许与任何存在的切割作用构建体轻易相互作用。载体也可以有能力与放大物/接头复合体的系留基团形成共价键或非共价键。根据这个实施方案，优选放大物/接头复合体在至少两个点系留，以帮助确保放大物/接头复合体的放大部分无活性。可以使用作为第一和第二实施方案的部分公开的方法，实现系留。另外，在这个实施方案中，预存的结合对子可以用来实现系留。例如，载体可以例如是链霉亲和素和系留性基团生物素，因而当混合时，放大物/接头复合体上的生物素与链霉亲和素的生物素结合位点结合，因此将抑制剂复合体与载体系留。

根据这个实施方案，不需要在复合体中具有与载体强烈接合的部分。例如，两个包含放大部分的接头部分可以直接或借助小的连接分子连接在一起，以形成放大物/接头复合体。任选地，抑制剂部分可以替换为通过被吸引至载体来辅助放大物/接头复合体与载体接合的部分(此处称作被动接合物)，但是不要求它以任何方式抑制载体的作用。总体上，抑制剂部分或被动接合物此处称作抑制剂或放大物/接头复合体的装配易化部分。与这个实施方案相关的增加的灵活性可以辅助找到均具有实施本文公开的本发明的所需特征的种类。

根据这个实施方案，切割剂浓度的指数增长如它在第二实施方案中那样推进，但是在这个实施方案中，切割剂通过切割独立的信号生成种类，生成可读取信号。独立的信号生成种类可以是根据第一实施方案的抑制型酶复合体。备选地，它可以是另一个种类，例如如现有技术中已知的包含荧光基团和猝灭剂基团的脱氧核酶或MNAzyme底物，其中当底物遭切割以使其与猝灭剂基团分离时，荧光基团开始发荧光。例如，如果难以同时满足文公开的第二实施方案的全部所要求特征，则这个实施方案可以有用。这个实施方案允许将包含放大部分的抑制剂复合体的所要求特征独立于生成可读取信号所要求的特征加以优化。

例如，图3显示使用Partzyme的本发明示例性第三实施方案的示意图，其中Partzyme(6a)是与载体(1)接合的接头的部分，所述示意图显示放大MNAzyme(8)的形成。放大物/接头复合体(9)是与载体(2)结合，所述载体起到防止放大部分在结合状态下有活性的作用。包含Partzyme(6a)的放大物/接头复合体(9)可以在至少两个点系留，以帮助确保放大物/接头复合体的放大部分无活性。遭切割时，放大物/接头复合体(9)解离并且可以例如与试剂中的易化物DNA(7)和第二Partzyme(6b)接合。切割剂浓度的指数增长如它在第二实施方案中那样推进，但是在这个实施方案中，切割剂通过切割独立的信号生成种类，生成可读取信号。独立的信号生成种类可以是根据本发明第一实施方案的抑制型酶复合体。

在第四实施方案中，公开了一种方法，借助所述方法，本发明的第一、第二和第三实施方案可以用来检测可以特异性参与结合事件的种类的存在。这个实施方案适于可以与第二部分或结合配偶体选择性结合的任何分析物。现有技术中熟知的选择性结合配偶体包括抗原和抗体，其中抗原一般是蛋白质，然而，其中一个结合配偶体是目的分析物并与结合配偶体选择性结合的任何情况适合在此使用。例如，结合配偶体可以是DNA的互补链，其中链之一是目的分析物。在一些实施方案中，DNA可以在表面(例如磁珠或金电极的表面)上固定化，其中固定的DNA可以与DNA分析物链的第一部分结合并且包含标记的结合复合体的结合部分可以与DNA分析物的第二部分结合，因而DNA分析物链在固定的DNA和标记的结合复合体之间形成桥。出于说明目的，在公开本发明的这个实施方案时，结合配偶体之一将称作分析物并且另一者(标记的结合复合体)将称作标记的抗体(L-Ab)。这个实施方案适用于竞争性测定法，其中分析物与固定的结合配偶体竞争与抗体结合。它还适用于夹心测定法，其中分析物在捕获抗体和标记的抗体之间引起夹心形成。在竞争性测定法中，量增加的分析物引起量增加的L-Ab游离于溶液中。在这种类型的测定法中，将游离的L-Ab与固定的L-Ab分离并且游离的L-Ab上的标记物用来生成信号。在夹心测定法中，量增加的分析物引起量增加的L-Ab夹心形成。在这个测定法中，可以在结构如磁珠上形成夹心，其中结合的L-Ab与游离L-Ab分离并且结合的L-Ab上的标记物用来生成信号。当标记的结合部分是与固定的DNA链借助分析物DNA链接合的DNA链时，这个实施方案特别适合。

根据这个实施方案，抗体上的标记物包含这样的种类，所述种类可以直接引起底物的切割或是可以引起底物切割的构建体的部分。优选地，标记物包含可以直接或间接地引起底物遭切割的至少一个DNA序列，此处称作切割性DNA。又一个优选的实施方案是其中标记物包含多个拷贝的切割性DNA。又一个优选的实施方案是其中标记物包含多个拷贝的可以作为脱氧核酶发挥作用的切割性DNA。最优选的实施方案是其中标记物包含多个拷贝的可以作为易化物DNA发挥作用的切割性DNA，所述易化物DNA可以与partzyme杂交以形成有功能的MNAzyme。

可以通过以下方式形成包含一个或许多拷贝的切割性DNA的标记物：将一个或多个切割性DNA拷贝与抗体直接接合；或优选地，使一个或多个切割性DNA拷贝与接合于抗体的主链DNA杂交；或更优选地，使多个切割性DNA拷贝与DNA分支杂交，所述DNA分支与接合于抗体的主链共价连接；或最优选地，使多个切割性DNA拷贝与DNA分支杂交，所述DNA分支转而与接合于抗体的主链DNA杂交。任选地，当使用主链时，多于一种抗体可以接合于主链。这种可以在给定浓度的分析物存在下，增加L-Ab与固定的捕获抗体结合的亲合力。最优选的实施方案的优点是多种切割性DNA拷贝可以在无需构建复杂分枝DNA序列的情况下并入L-Ab中。根据最优选的实施方案，单纯地通过混合在一起，DNA分支与DNA主链自装配并且切割性DNA拷贝借助DNA杂交与DNA分支自装配。

如果切割性DNA与DNA分支或主链杂交，互补性DNA序列优选地如此设计，从而切割性DNA可以与作为信号生成过程之部分的分支或主链DNA分离。作为信号生成过程之部分，可以例如通过升高温度,足以使切割性DNA与分支或主链DNA解链，做到这点。更优选地，作为信号生成过程的部分，可以提供互补性DNA序列，其与这样的切割性DNA节段结合，所述切割性DNA节段包含与分支或主链DNA结合的切割性DNA节段，因而该互补性DNA足够强烈地结合于切割性DNA，以使其从分支或主链DNA剥离，并且其中互补性DNA的结合不抑制切割性DNA的切割功能。最优选地，切割性DNA是MNAzyme的易化物DNA，并且互补性DNA是一种或两种结合于易化物DNA以使其从分支或主链DNA剥离的partzyme。随后可以与剥离过程同时形成MNAzyme。为了促进剥离过程，优选切割性DNA与分支或主链DNA如此杂交，从而切割性DNA的至少一个末端不被结合并且可以作为剥离性互补DNA的初始接合位点发挥作用。

例如，图4显示本发明的示例性第四实施方案，其显示与分支(10)和主链DNA(11)杂交的多个易化物DNA拷贝(7)，其中主链DNA接合至抗体(12)。

切割启动

在本文公开的实施方案中，借助目的分析物的存在启动切割。根据本发明的第一实施方案，借助分析物生成的初始切割剂是必需存在的唯一一种物质。

根据本发明的第二和第三实施方案，初始切割剂启动附加切割剂的级联生成。初始切割剂的性质取决于目的分析物。如果目的分析物具有其自身切割作用，例如蛋白酶如凝血酶或胰蛋白酶，则分析物本身可以充当初始切割剂。如果分析物例如是特定的DNA或RNA序列，则初始切割剂可以是MNAzyme，其中MNAzyme的易化物是目的分析物DNA或RNA序列并且如此形成的MNAzyme可以切割抑制剂复合体或放大物/接头复合体的接头部分。

根据本发明的第四实施方案，目的分析物引起易化物DNA和/或脱氧核酶存在于分析混合物中。如本发明的其他实施方案中所述，易化物DNA可以与partzyme组合以形成可以借助切割过程生成信号的MNAzyme。同时或备选地，如本发明的其他实施方案中所述，脱氧核酶可以借助切割过程生成信号。根据第四实施方案，目的分析物可以是引起结合事件发生的蛋白质、DNA或其他分子。

适合随本发明方法一起使用的装置

存在适合随一些或全部公开的分子实体和方法一起使用的多个装置。为了实施本发明的第一、第二或第三实施方案，可以使用至少一个反应室。分析试剂可以包括抑制型酶复合体、放大物/接头复合体、任选的帮助形成切割剂(例如，partzyme)的额外组分、酶的底物和任选地，酶的介体或其他种类，如上文公开的那些，以生成装置可读取信号。如果分析物具有其自身切割作用，则可以不需要附加的切割剂组分。如果酶能够直接形成可读取信号种类，则可以不需要附加的介体。试剂可以起初以溶液形式或以干燥形式存在或一些处于溶液形式并且一些处于干燥形式。随后可以添加含有分析物的溶液至反应室，以启动测定法。

反应室可以处于常规管或比色皿、微流体空间的形式或其他合适的形式。可以针对读出机制定制形式。例如，如果使用光学读出方法，则比色皿可以是最合适的形式。如果使用电化学读出方法，可以使用包含至少两个电极的微流体室。

为了实施本发明的第四实施方案，可以使用一个或两个反应室。如果使用一个室，含有分析物的溶液可以首先与试剂混合，以引起结合配偶体结合。结合的、标记的结合配偶体随后与游离的、标记的结合配偶体分离，并且通过添加检测试剂，分析留在室内的标记的结合配偶体。检测试剂包括对于使用此处对这个实施方案所公开的切割检测方法为必要的试剂。

如果使用两个反应室，则结合反应可以在一个室中推进并且检测反应在第二室中推进。这可能是有利的，因为它可以促进分离结合型和游离型标记的结合配偶体。例如，在第一室中，固定的结合配偶体和标记的结合配偶体可以被干燥或以液态形式存在。可以将含有分析物的溶液添加至这个室并且允许任何结合反应推进。在任何结合已经发生后，如果需要检测剩余的游离型标记的结合配偶体，则可以将等分量的上清液转移至第二室供检测。如果需要检测结合型标记的结合配偶体，则可以收集包含固定的结合配偶体的材料并转移至第二室。如果应检测剩余的游离型标记的结合配偶体，则固定的结合配偶体可以固定在第一室的表面上或在可以与第一室中上清液分离的表面上，例如聚合物或磁性粒子上。如果应检测固定的标记的结合配偶体，则固定的结合配偶体可以固定在可转移至第二室的表面(例如聚合物或磁性粒子的表面)上。如果使用聚合物粒子，可以例如通过使用过滤或离心，收集并洗涤它们，以移走含有游离型标记的结合配偶体的上清液。如果使用磁性粒子，可以例如通过使用磁场，收集并洗涤它们，以移走含有游离型标记的结合配偶体的上清液。可以将收集和洗涤的粒子通过吸入到转移装置(如移液器)转移至第二室，或使用其他手段，如通过毛细管流泵送或产生的液流或在磁性粒子情况下通过适当施加磁场，在各室之间移动。

第二室可以含有干燥形式或液态形式的检测试剂。检测试剂包括对于使用此处对本发明的这个实施方案所公开的切割检测方法为必要的试剂。

上文描述的本发明实施方案可以按照许多不同方式组合，以赋予许多应用中的实用性。为了更清晰地阐述可能的应用例子，对本发明的不同实施方案中利用的组分给予代码并且提供了列示可以组合以满足所述应用领域之要求的已编码要素的表。这些例子作为本发明实施方案的应用组合例子提出并且不意在限制本发明的范围。

为清晰起见，还提供下表以解释所列出的组分类型的意图和功能。

表1：

组分

抑制剂复合体的连接部分

T1–MNAzyme或脱氧核酶底物

T2–MNAzyme或脱氧核酶底物+放大部分

T3–T1和T2的混合物

T4–具有切割作用的其他酶的底物

T5–具有切割作用的其他酶的底物+MNAzyme或脱氧核酶底物+放大部分

抑制剂复合体的装配易化部分

A1–酶抑制剂

A2–空载体接合物或无接合物或抑制剂

抑制剂复合体的载体

C1–可以产生至少一种电活性种类的酶

C2–空载体大分子

C3–其他信号生成酶

信号生成物

S1–电活性种类+电极和电检测装置

S2–有色种类+光检测器

S3–切割荧光团/猝灭剂+荧光检测器

测定起始物源

I1–分析物DNA活化性起始物partzyme

I2–与Ab/DNA缀合物杂交的易化物DNA

I3–样品中具有切割作用的分析物酶

测定模式

F1–具有多个液体更换步骤的全部液体孔或比色皿型模式。在这个模式下，使用的全部试剂均可以是液体

F2–具有干燥检测试剂的外部液体预处理/结合步骤。在这种模式下，样品的某些预处理在检测室外部的液相中进行并且检测室中最初使用干燥的检测试剂

F3–装置内部具有干式检测的液体预处理。在这种模式下，任何样品预处理在液相中进行并集成至相同的装置中，所述装置包含具有最初干燥的检测试剂的检测室

F4–完全干的单室检测。该装置仅可以需要具有最初干燥的检测试剂的单室

应用

下文组合使用上文的代码以详述哪些组合的例子可以用于所列示应用。

表2

实施例

例举了本发明的实施方案并且在以下实施例中更详细地公开了附加实施方案，所述实施例不以任何方式意在限制本文所述的本发明任何实施方案的范围。

实施例1

构建抑制型酶复合体。

表3.分子种类的描述。

CL指交联剂

寡聚物指寡核苷酸

A部分.寡聚物-CL-抑制剂的合成

步骤1：抑制剂上的伯胺基与磺基-SMCC(4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸3-磺基-N-羟琥珀酰亚胺酯钠盐，SIGMA-)反应，以形成马来酰亚胺。抑制剂为过量，以确保反应结束后封闭磺基-SMCC上的全部NHS基团。

步骤2：使用过量的TCEP(三(2-羧乙基)膦盐酸盐，SIGMA-)，将修饰的寡聚物(IDT)上的二硫键还原成巯基。

步骤3：巯基封端的寡聚物与轻微过量的马来酰亚胺活化的抑制剂反应，以确保大部分的寡聚物与抑制剂分子交联。

步骤4：使用离心装置3K(Pall Corp.)纯化寡聚物-CL-抑制剂缀合物，以移除游离的未反应种类和副反应产物。移除滤液中的低MW物质，而缀合物留在在样品库中，因为它不穿过膜。

B部分.胰蛋白酶-CL-寡聚物-CL-抑制剂的合成

步骤1：胰蛋白酶(来自猪胰的胰蛋白酶，SIGMA-)按照充分抑制酶活性的浓度和比率与纯化的寡聚物-CL-抑制剂缀合物混合。

步骤2：将EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐，Thermo FisherScientific Inc.)添加至混合物以活化胰蛋白酶上可用的羧基，以便借助酰胺键形成，与修饰的寡聚物的末端伯胺直接反应。这形成抑制型酶复合体。

步骤3：使用离心装置30K(Pall Corp.)纯化抑制型酶复合体，以移除游离的未反应种类和副反应产物。所得到的产品做好准备用于分析中。

无论本文中他处作出的对特定文件任何单独提供的并入，本文中援引的全部参考文献，包括出版物、专利申请和专利均因而通过引用的方式完整并入并且至相同程度，如同单独和专门地指出通过引用的方式并入并且在本文中完整阐述每篇参考文献(至法律允许的最大程度)。

除非本文另外说明或与语境明显矛盾，否则将术语“a(一个)”和“an(一个)”和“the(该)”和相似指称的用途在描述本发明的语境下解释为涵盖单数和复数。

除非另外声明，否则本文中提供的全部确切值均代表相应的近似值(例如，相对于特定因子或测量所提供的全部确切的示例值可以视为还提供相应的近似测量，在适宜情况下，受“约”修饰)。提供的全部值范围意在包括范围的端点以及端点之间的值。

在此使用术语如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”结合一个或多个要素，对本发明任何方面或实施方案的描述意在为本发明的相似方面或实施方案提供支持，所述的相似方面或实施方案“由这个特定要素或这类特定要素组成”、“基本上由其组成”或“基本上包含”其，除非另外声明或明确相悖于语境(例如，除非另外声明或明确相悖于语境，本文中描述为包含特定要素的组合物应当理解为还描述了由该要素组成的组合物)。

全部标题和副标题在本文中仅出于便利而使用并且不应当以任何方式解释为限制本发明。

除非另外声明，否则本文中提供的任何和全部实施例或示例性表述(例如，“如”)的用途仅意在更好地说明本发明而不是对本发明的范围加以限制。本说明书中的语言均不应解释为表示任何未声明的要素对实施本发明为必需。

本文中援引和并入专利文献仅出于便利性而进行并且不反映对这类专利文献的有效性、可专利性和/或可实施性的任何观点。

本发明包括如适用法律所允许的对本文所附权利要求和/或方面中所述主题物的全部修改和等同物。

Claims

1.分子实体，包含：

a.酶，和

b.酶抑制剂复合体；

其中酶抑制剂复合体包含与接头部分连接的抑制剂部分；

其中接头部分能够与酶系留并且能够受切割剂切割

其中当接头部分与酶系留时，酶的活性受抑制；

其中当接头部分遭切割时，酶的活性增加。

2.根据权利要求1所述的分子实体，其中接头部分包含切割位点、远端侧和内侧，其中内侧和远端侧在切割位点的对面，其中抑制剂部分在内侧上的位置与接头部分连接并且接头部分能够在远端侧上的位置借助反应性种类与酶连接。

3.根据权利要求1所述的分子实体，其中接头部分包含至少两个切割位点，中间区域和至少两个远离中间区域的侧部，其中切割位点位于每个远端侧和中间区域之间，其中抑制剂部分在中间区域内与接头部分连接并且接头部分能够在远端侧上的位置借助反应性种类与酶连接。

4.根据权利要求2和3所述的分子实体，其中反应性种类能够直接或借助交联剂与酶形成共价键。

5.根据权利要求2和3所述的分子实体，其中通过施加紫外线、交联剂、活化剂、催化剂或热，接头部分的远端连接至酶。

6.根据权利要求2所述的分子实体，其中抑制剂部分以混有酶浓度的酶抑制剂复合体浓度与酶缔合；其中与分析试剂中待用的抑制型酶复合体浓度相比，所述浓度高。

7.根据权利要求1所述的分子实体，其中酶是氧化还原酶或切割酶。

8.根据权利要求1所述的分子实体，其中酶抑制剂复合体包含接头放大部分。

9.根据权利要求8所述的分子实体，其中接头部分能够受切割剂切割，其中对接头部分的切割导致(i)酶活化和(ii)接头放大部分形成和活化，所述接头放大部分能够切割第二接头部分或与其他组分接合时能够切割第二接头部分。

10.根据权利要求8所述的分子实体，其中当活化时，接头放大部分形成脱氧核酶或MNAzyme的一个或多个部分。

11.根据权利要求1所述的分子实体，其中切割剂是目标分析物并且其中酶的活性生成读出信号。

12.在分子中检测切割事件的方法，包括：

a.提供根据权利要求1所述的处于以下状态的实体，其中接头部分与酶系留并且酶的活性受抑制；

b.使试样经历(a)；和

c.检测装置可读取信号；

其中检出到装置可读取信号显示切割事件。

13.根据权利要求12所述的方法，其中切割事件提示试样中存在分析物。

14.根据权利要求12所述的方法，其中(a)的实体包含于溶液和或试纸条中。

15.根据权利要求12所述的方法，其中检测步骤包括检测电压、电流、光学吸光度、颜色、荧光或化学发光的变化。

16.使用根据权利要求1所述的实体检测切割事件的试剂盒，包含：

a.一个或多个反应室；和

b.分析试剂，其包含根据权利要求1所述的处于以下状态的酶复合体，其中接头部分与酶系留并且酶的活性受抑制，

其中分析试剂处于溶液形式或干形式。

17.分子实体复合体，包含：

a.载体，和

b.放大性复合体；

其中放大性复合体包含在一个或多个位置与载体系留的接头部分；

其中当接头部分与载体连接时，放大性复合体的活性受抑制；和

其中当接头部分遭切割时，放大性复合体的活性增加。

18.根据权利要求17所述的分子实体，其中载体选自大分子、珠和杆。

19.检测切割事件的方法，包括：

a.使试样经历包含分子实体的溶液，所述分子实体包含

i.酶；和

ii.酶抑制剂复合体；

b.当接头部分与载体连接并且放大性复合体的活性受抑制时；添加根据权利要求17所述的分子复合体，并且

c.检测装置可读取信号；

其中检出到装置可读取信号显示切割事件。

20.检测切割事件的方法，包括：

a.使试样经历包含脱氧核酶或MNAzyme的底物的溶液，所述底物包含荧光基团和猝灭剂基团；

b.当接头部分与载体连接并且放大性复合体的活性受抑制时；添加根据权利要求17所述的分子复合体，以及

c.检测荧光；

其中检测到荧光提示切割事件。

21.分子实体，包含至少一个与一条或多条DNA链连接的结合部分；其中DNA链至少之一包含脱氧核酶或MNAzyme组分，其中一条或多条DNA链可以在互补性DNA存在和/或检测室中温度升高时，从分子实体解离。

22.根据权利要求21所述的分子实体，其中分子与结合部分结合导致分子实体存在于检测室中。

23.根据权利要求21所述的分子实体，其中一条或多条分支DNA链借助DNA主链与结合部分连接。

24.根据权利要求21所述的分子实体，其中结合部分是抗体或DNA链。

25.根据权利要求21所述的分子实体，其中一条或多条分支DNA链与DNA主链连接并且其中脱氧核酶或MNAzyme组分与一条或多条分支DNA链连接。

26.检测结合事件的方法，包括：

a.使试样经历包含根据权利要求21所述的分子实体的溶液；

b.将借助结合部分结合的分子实体与不借助结合部分结合的分子实体分离；

c.添加结合或未结合的分子实体至能够生成装置可读取信号的底物；和

d.检测装置可读取信号。

其中检测到装置可读取信号提示包含结合部分的结合事件。

27.检测切割事件的试剂盒，包含：

a.第一反应室和第二反应室；

b.包含根据权利要求21所述的实体的分析试剂；

c.分析试剂，其包含抑制酶复合体、放大性复合体、包含荧光基团和猝灭剂基团的脱氧核酶或MNAzyme底物中至少之一；

其中第一反应室用于试样和(b)的混合物；

其中第二反应室用于检测混合物中的装置可读取信号。