CN103509122A

CN103509122A - 一种cd3抗原及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN103509122A
Application number: CN201310440453.1A
Authority: CN
Inventors: 张敬; 王瑞; 钟慧; 李刚; 周鹏飞
Original assignee: YZY BIOPHARMA CO Ltd
Current assignee: Wuhan youzhiyou biopharmaceutical Co.,Ltd.
Priority date: 2013-09-23
Filing date: 2013-09-23
Publication date: 2014-01-15
Anticipated expiration: 2033-09-23
Also published as: CN103509122B

Abstract

本发明公开了一种CD3抗原及其制备方法和用途，其中，所述抗原包括：2个相同的连接肽，异亮氨酸拉链结构，CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D ECD或者CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G ECD；其中，所述2个相同的连接肽之间能够形成二硫键，所述异亮氨酸拉链结构由多肽链LZ1和多肽链LZ2形成；其中，所述抗原为由两个融合蛋白通过异亮氨酸氨酸拉链结构所形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，CD3E ECD的C端通过一个连接肽连接在多肽链LZ1的N端，构成融合蛋白CD3E ECD-LZ1，在第二个融合蛋白中，CD3D ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3D ECD-LZ2或者CD3G ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3G ECD-LZ2。

Description

一种CD3抗原及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及一种CD3抗原及其制备方法和在抗CD3抗体的研究中的用途。

背景技术

CD3是人免疫T细胞表面标记抗原，是由四种亚基（subunit）组成的六聚体，通过电荷吸附作用围绕在T细胞受体（T cell receptor，TCR）周围。CD3的四种亚基分别为CD3ε（CD3E）、CD3δ（CD3D）、CD3γ（CD3G）和CD3ζ（CD3Z），均为跨膜蛋白；并且CD3E与CD3D形成的二聚体、CD3E与CD3G形成的二聚体，通常可以作为抗CD3抗体的识别靶位点。

CD3E ECD为CD3E的胞外结构域（extra-cellular domain），CD3D ECD为CD3D的胞外结构域，CD3G ECD为CD3G的胞外结构域。

OKT3为一个商业化的抗CD3抗体，其靶点为CD3E和CD3G的二聚体的胞外区。OKT3不仅能够结合CD3，还具有激活T细胞的作用。有研究发现，只有当CD3E和CD3G形成了二聚体时才具有免疫原性，从而能被OKT3结合，而单独的CD3E或CD3G均无法被OKT3结合。

UCHT1是一个常用的抗CD3抗体，既能够识别CD3E和CD3D的二聚体的胞外结构域，也能识别CD3E和CD3G的二聚体的胞外结构域，而单独的CD3E、CD3D和CD3G胞外结构域均无法被UCHT1识别。

目前CD3抗原的制备方法有将CD3E ECD与CD3G ECD融合（CD3E-GECD fusion）；将CD3E ECD与CD3D ECD融合（CD3E-D ECD fusion）、将CD3E、CD3G和CE3D三种亚基的ECD与Fc片段融合（CD3E/G/D-Fc）；或者在融合蛋白的C端添加Flag标签（CD3E/G/D-Fc-Flag）或His标签（CD3E/G/D-Fc-His）等。CD3E-G ECD融合蛋白和CD3E-D ECD融合蛋白都采用原核表达，存在于包涵体中，纯化后需要进行复性，也有将CD3E/G/DECD分别用原核表达，纯化后将CD3E和CD3G或CD3D等比例混合进行复性；CD3E/G/D-Fc重组融合蛋白在293细胞中表达，具有免疫原性，能够被OKT3和UCHT1识别。

原核表达CD3抗原虽然产量高，但是需要进行复性步骤，最后能够得到的具有免疫原性的CD3只有最初产量的10%甚至更低；真核表达CD3E/G/D-Fc重组融合蛋白，也存在有CD3E-Fc、CD3D-Fc和CD3G-Fc同源二聚体（homodimer）以及CD3D-Fc-CD3G-Fc异二聚体等杂质蛋白。而采用在不同的Fc的C端带不同的标签，虽然在一定程度上提高了最后得到的异二聚体纯度，但是纯化过程中，需要进行至少三步亲和层析，损失也比较多。另外，抗原的Fc标签对于筛选同源的抗体存在很大的局限性，会产生很强的背景干扰。这种干扰同样也会影响到ELISA的实验结果。另外，使用带FC标签的抗原进行抗体筛选时，会出现特异针对标签很高亲和力的抗体，标签越长，出现此类抗体的比例越大，这对筛选结合CD3抗原的抗体产生一定的干扰。

由于目前CD3抗原及其制备方法中存在的上述缺点，有必要开发一种能够使CD3E和CD3D、CD3E和CD3G分别形成异二聚体的携带有非Fc片段蛋白标签的通过真核表达系统制备的新的CD3抗原及其制备方法。

发明内容

为此，本发明提出了一种可以解决上述问题的或至少能部分解决上述问题的一种CD3抗原，其中，所述抗原包括：2个相同的连接肽，异亮氨酸拉链结构，CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D ECD或者CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G ECD；

其中，所述2个相同的连接肽之间能够形成二硫键，所述异亮氨酸拉链结构由多肽链LZ1和多肽链LZ2形成；

其中，所述抗原为由两个融合蛋白通过异亮氨酸氨酸拉链结构所形成的异二聚体，在第一个融合蛋白中，CD3E ECD的C端通过一个连接肽连接在多肽链LZ1的N端，构成融合蛋白CD3E ECD-LZ1，在第二个融合蛋白中，CD3D ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3D ECD-LZ2或者CD3G ECD的C端通过另一个连接肽连接在多肽链LZ2的N端，构成融合蛋白CD3G ECD-LZ2。

其中，在所述融合蛋白中，多肽链LZ1和多肽链LZ2的C端分别连接有一个相同或不同的短肽标签；所述短肽标签选自由Flag、His、Myc和HA所组成的组中的一种或两种。

本发明还提供了一种CD3抗原的制备方法，所述方法包括：

（1）分别构建重组载体e和重组载体d，或者分别构建重组载体e和重组载体g；

（2）在真核细胞中转染重组载体e和d，或者转染重组载体e和g；

（3）利用亲和层析方法纯化获得CD3抗原CD3E/CD3D-LZ或者CD3E/CD3G-LZ；

其中，所述重组载体e含有融合蛋白CD3E ECD-LZ1的编码核苷酸序列；所述重组载体g含有融合蛋白CD3G ECD-LZ2的编码核苷酸序列；所述重组载体d含有融合蛋白CD3D ECD-LZ2的编码核苷酸序列。

本发明还提供了上述CD3抗原在抗CD3抗体的研究中的应用。

本发明还提供了上述CD3抗原在抗原抗体相互作用研究中的应用。

通过上述技术方案，本发明的CD3抗原具有如下优点：

（1）使用真核表达系统，不需要对蛋白进行复性；（2）使用短肽标签构建融合蛋白，简化了纯化步骤；（3）改造融合蛋白序列，使CD3E和CD3D、CD3E和CD3G能够分别形成异二聚体；（4）避免使用Fc标签，在进行抗体检测，如ELISA实验时减少背景干扰；（5）标签长度不超过70个氨基酸，在进行抗CD3抗体筛选时减少标签干扰；（6）与抗CD3的抗体OKT3，UCHT1，TRX4和L2K均能特异性结合；（7）所带的标签不同于各类IgG，可避免与各类二抗发生反应。

本发明所制备的CD3抗原可以用于抗CD3抗体的筛选、鉴定、检测，以及亲和力测定。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1为本发明所提供的CD3抗原的结构示意图。

图2为重组载体pcDNA3.1(+)Hygro-CD3E-LZ1的质粒图谱。

图3为重组载体pcDNA3.1(+)Hygro-CD3G-LZ2的质粒图谱。

图4为重组载体pcDNA3.1(+)Hygro-CD3D-LZ3的质粒图谱。

图5为用Western Blot方法对本发明所提供的抗原进行检测的结果图。

图6为用12%SDS-PAGE检测本发明CD3抗原的纯化效果的结果图。

图7为原核表达复性纯化后的CD3E/CD3D二聚体SDS-PAGE考染图。

图8为用Dot blot分析检测抗原1和2与抗体的结合活性的结果图。

图9为用ELISA方法检测本发明所提供的抗原与OKT3和UCHT1抗体的结合活性的结果图。

具体实施方式

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

本发明提供了一种CD3抗原，其特征在于所述抗原包括：2个相同的连接肽，异亮氨酸拉链结构，CD3的ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E ECD，以及CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D ECD或者CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G ECD；

在本发明所提供的CD3抗原中，所述CD3ε亚基CD3E的胞外结构域CD3E ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述CD3的δ亚基CD3D的胞外结构域CD3D ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述CD3的γ亚基CD3G的胞外结构域CD3G ECD的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明所提供的CD3抗原的结构如图1所示。

其中，在本发明所提供的CD3抗原中，所述多肽链LZ1与多肽链LZ2为一对不同的多肽链，均富含异亮氨酸。蛋白多肽之间通过间插在异亮氨酸中间的不同电荷的氨基酸进行正负电荷两两相互配对形成二聚体。

本发明中，所述多肽链LZ1与多肽链LZ2之间形成异亮氨酸拉链LZ；所述异亮氨酸拉链LZ使得融合蛋白CD3E ECD-LZ1与融合蛋白CD3DECD-LZ2形成异二聚体或者使得融合蛋白CD3E ECD-LZ1与融合蛋白CD3G ECD-LZ2形成异二聚体。

本发明中，所述多肽链LZ1和多肽链LZ2的长度相同为40-70个氨基酸。

其中，所述异亮氨酸拉链结构选自按照以下组合方式形成的异亮氨酸拉链结构中的一种：

组合A：SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列所编码的多肽链与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列所编码的多肽链所组成的异亮氨酸拉链结构；

组合B：SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列所编码的多肽链与SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列所编码的多肽链所组成的异亮氨酸拉链结构；

组合C：SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列所编码的多肽链与SEQ ID NO：9所示的氨基酸序列所编码的多肽链所组成的异亮氨酸拉链结构；

组合D：SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列所编码的多肽链与SEQ IDNO：11所示的氨基酸序列所编码的多肽链所组成的异亮氨酸拉链结构；

组合E：SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列所编码的多肽链与SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列所编码的多肽链所组成的异亮氨酸拉链结构；

组合F：SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列所编码的多肽链与SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列所编码的多肽链所组成的异亮氨酸拉链结构。

最为优选的，所述异亮氨酸拉链为组合A、C或E所形成的异亮氨酸拉链结构。

其中，在本发明中，对异亮氨酸拉链中的两条多肽链中的哪一条与CD3EECD连接并没有特别的要求，可以为两条多肽链中的任意一条，本发明中将与CD3E ECD连接的多肽链命名为LZ1，将与CD3D ECD或CD3G ECD连接的多肽链命名为LZ2。

在本发明所述的连接肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO：16-SEQ ID NO：19所示的序列中的一种。优选的，所述连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：16或SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。

其中，本发明所述的抗原还包括短肽标签，具体的，在所述融合蛋白中，多肽链LZ1和多肽链LZ2的C端分别连接有短肽标签；其作用为在蛋白的纯化过程中获得融合蛋白，LZ1与LZ的C末端连接的短肽标签的种类可以相同或不同，为了获得更好的纯化结果，所述短肽标签优选为不同种类的短肽标签，本发明中对不同短肽标签的组合方式没有特别的限制。

其中，本发明中，所述短肽标签可以选自由Flag、His、Myc和HA所组成的组中的一种或两种，最为优选的，所述短肽标签为His和HA。

本发明所提供的CD3抗原能够与抗CD3抗体特异性结合。其中，当所述抗原为CD3E ECD-LZ1与CD3D ECD-LZ2形成的异二聚体时，所述抗原能够与抗体UCHT1，TRX4，OKT3和L2K特异性结合，优选的，能与UCHT1或OKT3特异性结合。当所述抗原为CD3E ECD-LZ1与CD3G ECD-LZ2形成的异二聚体时，所述抗原能够与抗体UCHT1，TRX4，OKT3和L2K特异性结合，优选的，能与UCHT1或OKT3特异性结合。

本发明还提供了本发明所述的CD3抗原的制备方法，所述方法包括：

其中，所述重组载体e含有融合蛋白CD3E ECD-LZ1的编码核苷酸序列；所述重组载体g含有融合蛋白CD3G ECD-LZ2的编码核苷酸序列；所述重组载体d含有融合蛋白CD3D ECD-LZ2的编码核苷酸序列。在本发明所提供的CD3抗原的制备方法中，重组载体的构建方法没有特别的限定，可以采用本领域常用的重组载体的制备方法获得，例如可以按照《分子克隆实验指南第三版》中所介绍的方法构建重组载体。

在本发明所提供的方法中，所述重组载体e可以通过将融合蛋白CD3EECD-LZ1的编码核苷酸序列导入表达载体获得；所述重组载体d可以通过将融合蛋白CD3D ECD-LZ2的编码核苷酸序列导入表达载体获得；所述重组载体g可以通过将融合蛋白CD3G ECD-LZ2的编码核苷酸序列导入表达载体获得。

本发明中，对于表达载体的种类没有特别的限制，可以为本领域常用的真核表达载体，例如，所述表达载体可以为pcDNA3.1(+)Hygro、PSV2、CMV4或pCMVp-NEO-BAN等；优选的，所述表达载体为pcDNA3.1(+)Hygro真核表达载体。

具体的，所述重组载体的构建方法可以为，分别构建重组载体e、g和d。根据CD3E ECD，CD3G ECD，CD3D ECD和LZ基因序列及载体中的多克隆位点设计引物。其中CD3G ECD和带短肽标签的LZ1，CD3G ECD和带短肽标签的LZ2，CD3D ECD和连接肽和待短肽标签的LZ2间采用两次重叠延伸PCR法进行连接。纯化回收重叠延伸PCR的产物，利用双酶切方法将重叠PCR的产物分别插入表达载体中的多克隆位点，获得重组载体e，g和d。

在本发明中，PCR反应所应用的试剂可以为本领域常规使用的PCR反应试剂。

在本发明所提供的方法中，重叠延伸PCR法连接各片段的编码核苷酸序列的条件和试剂可以利用本领域常规的重叠延伸PCR方法的条件和试剂进行。

在本发明中，可以利用本领域常用的方法例如DNA片段回收试剂盒对PCR反应产物进行纯化回收。

本发明中，重组载体的转染和表达可以按照本领域常规的方法进行，用于表达所述重组载体的细胞优选为哺乳动物细胞，例如可以为HEK293、293E、293F、COS7或CHO-S细胞；最为优选的，为293F细胞。

在本发明的一种实施方式中，将重组载体e和g转染真核细胞后，重组载体e和g在宿主细胞中分别表达融合蛋白CD3E ECD-LZ1和CD3GECD-LZ2，CD3E ECD-LZ1和CD3G ECD-LZ2在宿主细胞内发生异二聚化，形成CD3抗原CD3E/CD3G-LZ。

在本发明的一种实施方式中，将重组载体e和d转染真核细胞后，重组载体e和d在宿主细胞中分别表达融合蛋白CD3E ECD-LZ1和CD3DECD-LZ2，CD3E ECD-LZ1和CD3D ECD-LZ2在宿主细胞内发生异二聚化，形成CD3抗原CD3E/CD3D-LZ。

在本发明所提供的方法中，对于抗原纯化的方法可以按照以下步骤进行：通过离心细胞培养液收集细胞培养液上清并用滤膜过滤去除细胞碎片，用结合缓冲液稀释上清液后将稀释后的上清液过亲和层析柱并用洗脱缓冲液洗脱获得CD3抗原。本发明中，可以利用SDS-PAGE对获得的抗原的纯度进行检测。

本发明还提供了CD3抗原在抗CD3抗体的筛选中的应用。例如，所述应用可以为：利用人体B细胞的抗体轻重链可变区的mRNA构建噬菌体展示文库，利用CD3抗原对该文库进行筛选，得到抗CD3的噬菌体，通过测序得到轻重链可变区序列。

本发明提供了CD3抗原在抗体亲和力测定的应用，可以利用ELISA法、Fortibio或Biacore方法对抗原和抗体的亲和力进行测定。

本发明还提供了上述CD3抗原在抗CD3抗体的鉴定和检测方面的应用。研究抗体与抗原作用位点，例如对抗体和抗原结合形成晶体结构进行分析。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，CD3E ECD，CD3G ECD和CD3D ECD基因的DNA片段均从Jurkat细胞（购自购自中科院典型培养物保藏委员会细胞库）中提取mRNA，然后逆转录PCR得到；LZ基因为合成引物DNA片段（购自Invitrogen）；

大肠杆菌TOP10，真核表达载体pcDNA3.1(+)Hygro和LB培养基购自Invitrogen公司。

Ni柱层析柱填料Histrap Fast Flow购自GE公司；

T4DNA连接酶，Pyrobest DNA聚合酶、限制性内切酶购自Takara公司；

氨苄青霉素购自Amersco公司；

质粒提取试剂盒、DNA片段回收试剂盒购自TianGen公司；

哺乳动物细胞株293F，培养基293freesytle和转染试剂293fectin购自Invitrogen公司；

5kD超滤浓缩管购自millipore公司；

鼠IgG抗His购自武汉三鹰公司；

辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG和羊抗人IgG二抗均购自Sigma公司；

磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，氯化钠和咪唑均购自国药。

本发明中CD3抗原与抗体的结合活性利用Dot blot分析方法进行测量。

本发明中CD3抗原与OKT3和UCHT1抗体的结合活性利用ELISA分析方法进行测量。

以下实施例中CD3抗原的收率的计算方法为利用rproteinA一步纯化得到的样品，根据分子量的差异，进行SDS-PAGE，对SDS-PAGE考染图的拍照图片进行泳道选取、条带选取和灰度分析，得到每一条带在该泳道的比例，从而计算出CD3抗原的收率。

在以下实施例中，亲和力是指抗体分子上一个抗原结合点与相应的抗原决定簇之间相适应而结合的强度，测试方法依照文献（细胞与分子免疫学杂志，2005，抗PH2SA单克隆抗体相对亲和力的测定）中记载的抗PH2SA单克隆抗体相对亲和力的测定方法进行。

实施例1

本实施例用于说明本发明所提供的CD3抗原的制备方法。

1、重组载体的构建

以pcDNA3.1(+)Hygro作为表达载体，构建CD3E EDC-LZ1表达载体和CD3G EDC-LZ2表达载体。根据CD3E ECD、CD3G ECD、连接肽和LZ基因序列及pcDNA3.1(+)Hygro载体中的多克隆位点设计扩增引物。分别用表1所示的引物序列通过PCR扩增CD3E ECD基因、CD3G ECD基因、连接肽、LZ基因的DNA片段具体如下：

（1）、引物：

表1

引物CD3EECD-F和CD3EECD-R用于扩增CD3E ECD基因片段；

引物CD3GECD-F和CD3GECD-R用于扩增CD3G ECD基因片段；

引物CD3DECD-F和CD3DECD-R用于扩增CD3D ECD基因片段；

引物Linker-F和Linker-R用于扩增连接肽1的编码核苷酸片段；

引物LZ1-F和LZ1-R用于扩增带His的LZ基因片段1（LZ1）；

引物LZ2-F和LZ2-R用于扩增带His的LZ基因片段2（LZ2）。

（2）、反应体系

共计：25μL

（3）、循环参数条件：

95℃5min；

95℃30sec，56℃30sec，72℃30sec，共25个循环；

72℃10min；

用DNA片段回收试剂盒纯化回收PCR产物，获得CD3E ECD基因、CD3G ECD基因、连接肽基因和组合A所示的异亮氨酸拉链结构（LZ1和LZ2）的基因的DNA片段。

用重叠延伸PCR法连接CD3E ECD和连接肽的条件为以纯化回收的CD3E ECD为模板并使用引物序列CD3E ECD-F和linker-R，其余试剂同常规PCR，按下列参数循环2次：95℃变性2min，55℃退火1min，72℃延伸1min；然后加入CD3E ECD正向引物和LZ1反向引物，按以下条件进行PCR反应，连接CD3E ECD和连接肽的编码核苷酸片段：

95℃5min；

95℃1min，56℃1min，72℃2min，共25个循环；

72℃10min；

得到的DNA片段为CD3E ECD-linker的编码核苷酸片段。

用重叠延伸PCR法连接CD3G ECD和连接肽以纯化回收的CD3G ECD为模板并使用引物CD3G ECD-F和linker-R，步骤同上，得到的DNA片段为CD3G-linker的编码核苷酸片段。

重叠延伸PCR法连接CD3E ECD-linker和LZ1的条件为以纯化回收的CD3E ECD-linker和LZ1为模板并使用引物CD3E ECD-F和LZ1-R，其余试剂同常规PCR，按下列参数循环2次：95℃变性2min，55℃退火1min，72℃延伸1min；然后加入CD3E ECD-F和LZ1-R：得到的DNA片段为CD3EECD-LZ1。

重叠延伸PCR法连接CD3G ECD-linker和LZ2的条件为以纯化回收的CD3G-linker和LZ2为模板并使用引物CD3G ECD-F和LZ2-R，步骤同上，得到的DNA片段为CD3G ECD-LZ2。

按以下条件进行PCR反应，连接CD3E ECD（或CD3G ECD）-linker和LZ1（或LZ2）片段：

95℃5min；

95℃1min，56℃1min，72℃2min，共25个循环；

72℃10min；

用DNA片段回收试剂盒纯化回收重叠延伸PCR产物，用NheI和BamHI双酶切片段并分别插入pcDNA3.1(+)Hygro载体中获得图谱如图2和图3所示重组载体pcDNA3.1(+)Hygro-CD3E-LZ1和pcDNA3.1(+)Hygro-CD3G-LZ2。

2、重组载体的质粒扩增

将重组载体pcDNA3.1(+)Hygro-CD3E-LZ1和重组载体pcDNA3.1(+)Hygro-CD3G-LZ2分别转化入大肠杆菌TOP10，涂平板并挑取单菌落接种于含100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养16小时，8000×g离心10min收集菌体。使用Tiangen去内毒素大提试剂盒抽提质粒。将质粒溶于1ml洗脱缓冲液EB中，再加入1.42ml异丙醇和0.42ml NaCl将质粒沉淀出来，弃上清，加70%乙醇0.5ml洗涤沉淀两次，弃上清后，在超净台中风干，加入灭菌的超纯水1ml，用酶标仪测浓度和OD260/280。

pcDNA3.1(+)Hygro-CD3E-LZ1的浓度为810微克/毫升，OD260/280为1.8；

pcDNA3.1(+)Hygro-CD3G-LZ2的浓度为920微克/毫升，OD260/280为1.8。

3、抗原在哺乳动物细胞293F中的转染、表达和检测。

转染前24小时，在125ml锥形瓶中接种3×10⁷的293F细胞，使用293freestyle培养基45ml，37℃5%CO₂温箱中培养。

转染时先取50微升的293fectin加入到2.5ml的OPtiMEM中，充分混匀后，室温孵育5分钟；同时将重组载体pcDNA3.1(+)Hygro-CD3E-LZ1和pcDNA3.1(+)Hygro-CD3G-LZ2按1:1的比例进行混合，总DNA的量为25微克，溶于2.5ml的OPtiMEM中。然后将DNA和293fectin悬液充分混合，总体积为5ml，室温孵育20分钟，然后将混合物全部加入锥形瓶中，混匀，37℃5%CO₂温箱中130rpm摇床培养5天。

收集细胞悬液，12000g离心5min收集上清，进行western blot检测，结果见图5。

4、CD3E/CD3G-LZ抗原的纯化。

2000g离心细胞培养液，收集上清并用0.22微米的滤膜过滤，过HistrapFast Flow镍柱，结合缓冲液配方为：9.5mM NaH₂PO₄+40.5mMNa₂HPO₄+20mM咪唑+500mM NaCl，pH7.0；

洗脱缓冲液配方为：9.5mM NaH₂PO₄+40.5mM Na₂HPO₄+500mM咪唑+500mM NaCl，pH7.0。洗脱蛋白质过5kD超滤浓缩管更换为PBS缓冲液。12%SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结果见图6。蛋白的收率和纯度见表2。

制备例2

采用与制备例1相同的方法制备CD3抗原，不同的是，用引物对CD3DECD-F（NheI）：5’-gcggctagcg ccaccatgga acatagcacg tttctc-3’；CD3D ECD-R：5’-gggccctctg ggctctgcgg ccgcatccag ctccacaca-3’扩增CD3D ECD的编码核酸序列；获得图谱如图4所示重组载体pcDNA3.1(+)Hygro-CD3D-LZ2；并将其与重组载体pcDNA3.1(+)Hygro-CD3E-LZ1共转染哺乳动物细胞293F中，获得抗原2，用western blot对抗原2进行检测，结果见图5。用12%SDS-PAGE检测纯化蛋白质，结果见图6。蛋白的收率和纯度见表3。

图5中M为protein marker；1为CD3E/CD3D-LZ表达上清；2为CD3E/CD3G-LZ表达上清；3为CD3E ECD-LZ1表达上清；4为CD3D ECDECD-LZ2表达上清；5为CD3G ECD-LZ2表达上清；6为空白对照；7为阳性对照。一抗为小鼠IgG抗His；二抗为羊抗鼠IgG带HRP标记。

图6中M为protein marker；1为纯化后的CD3E/CD3G-LZ；2和3为纯化后的CD3E/CD3D-LZ；样品1和3为非还原SDS-PAGE；样品2为还原SDS-PAGE。

制备例3-14

制备例3-14用于说明本发明所提供的CD3抗原的制备方法。

采用与实施例1相同的方法制备CD3抗原3-14，不同的是，CD3抗原中各片段的连接方式如表2所示，获得的CD3抗原的纯度和收率结果见表2。其中，连接肽选自：连接肽1的氨基酸序列为SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列；连接肽2的氨基酸序列为SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；连接肽3的氨基酸序列为SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列；连接肽4的氨基酸序列为SEQ ID NO：19所示的氨基酸序列。

表2

抗原	CD3G/CD3D	连接肽	异亮氨酸拉链	短肽标签	收率	纯度
							1	CD3G	1	A	His/His	90％	90％
2	CD3D	1	A	His/His	90％	90％
							3	CD3G	1	A	His/Flag	80%	90%
4	CD3G	1	A	Myc/HA	80%	90%
							5	CD3G	1	B	Flag/Flag	80%	80%
6	CD3G	1	C	Flag/Myc	70%	95%
							7	CD3G	2	D	Myc/Myc	85%	80%
8	CD3G	3	E	HA/HA	90%	90%
							9	CD3G	4	F	His/His	90%	80%
10	CD3D	1	B	Flag/HA	65%	95%
							11	CD3D	1	C	HA/HA	90%	85%
12	CD3D	2	D	His/Flag	60%	95%
							13	CD3D	3	E	His/HA	70%	95%
14	CD3D	4	F	His/Myc	75%	95%

对比例1

本对比例用于说明现有的CD3抗原的制备方法。

按照（PNAS，2004，Crystal Structure Of Human Cd3-ED DIMER INCOMPLEX WITH A Ucht1Single-Chain Antibody Fragment）中所记载的方法制备CD3抗原。

1、蛋白表达

分别将CD3E ECD和CD3D ECD的编码核苷酸序列构建到原核表达载体pET28a中，并分别转化进细胞BL21（DE3），各在1升rich培养基（(20g/liter tryptone10g/liter yeast extract5g/liter NaCl2%glycerol50mM K₂HPO₄10mM MgCl₂1%glucose100mg/liter ampicillin)中培养至对数生长期，然后加入终浓度1mM IPTG诱导表达2-4小时。10000xg离心30min，弃上清，将细胞沉淀重悬于含50mM Tris-HCl、25%sucrose、1mM EDTA、0.1%叠氮钠，10mM DTT且pH8.0的缓冲液中，同时加入Lysozyme（1mg/ml）、DNaseI（25μg/ml）和MgCl₂（5mM）。细胞裂解缓冲液含50mM Tris-HCl、1%（v/v）TritonX-100、1%（w/v）脱氧胆酸钠、100mM NaCl、0.1%叠氮钠，10mM DTT和pH8.0，使用时每毫升细胞悬液中加入2.5毫升裂解液。待溶液粘稠度降低后，加入10mM EDTA，冻融细胞悬液一次。加入终浓度10mM MgCl₂和10mM EDTA，高速离心弃上清。细胞沉淀重悬于含50mM Tris-HCl、0.5%TritonX-100、100mM NaCl、1mM EDTA、0.1%叠氮钠，1mM DTT和pH8.0的缓冲液中，然后离心弃上清，重复四次；最后得到的包涵体（inclusion bodies）重悬于含50mM Tris-HCl、1mM EDTA、0.1%叠氮钠、1mM DTT和pH8.0的缓冲液中，离心弃上清，沉淀溶于10毫升含25mM2-（N-morpholino）ethanesulfonic acid、8M尿素、10mM EDTA，0.1mM DTT和pH6.0的缓冲液中。140000xg超高速离心，取上清，得到变性的CD3E ECD和CD3D ECD，用BCA法测蛋白浓度。CD3E ECD浓度为9.8mg/ml，CD3D ECD浓度为9.6mg/ml。

2、蛋白复性

CD3E ECD和CD3D ECD各取20mg，混合后快速加入至100ml冰冷复性缓冲液（1M L-Arg、100mM Tris-pH8.3、2mM EDTA、3.6mM cystamine、6.7mM cysteamine），孵育48h。将复性蛋白混合液置入不低于10倍体积的透析液（10mM Tris，pH8.0）中透析两次，每次24h。使用DEAE阴离子交换层析柱（GE公司）和SEC柱进行蛋白纯化。纯化后的CD3E/CD3D抗原浓缩并换至1×PBS缓冲液中，BCA法测浓度为5mg/ml，产量为10mg。蛋白的收率为25重量%，纯度根据SDS-PAGE考染图（见图7，原核表达复性纯化后的CD3E/CD3D二聚体SDS-PAGE考染图。Marker为蛋白标记，样品为复性纯化后的CD3E/CD3D二聚体。）分析，二聚体比例不高于50%，另外含有30%的高聚体和20%的未聚合蛋白。

测试例1

本测试例用于说明本发明所提供的CD3抗原与抗体的结合活性。

采用Dot blot分析检测CD3抗原与抗体的结合活性。

将实施例1和2制得的抗原1和2的上清点在NC膜上，然后5%牛奶封闭1h，再分别用（A）OKT3（0.5微克/毫升）和（B）UCHT1（0.5微克/毫升）分别孵育1h，然后用羊抗鼠IgG带HRP二抗孵育1h，最后用TBST洗三次，曝光拍照。结果见图8。图8中Dot blot检测抗原抗体结合情况。1为空白对照；2为CD3E ECD-LZ1的上清；3为CD3G ECD-LZ2的上清；4为CD3D ECD-LZ2的上清；5为CD3E/CD3D-LZ的上清；6为CD3E/CD3G-LZ的上清；7为阳性对照。A组使用的一抗为OKT3，B组使用的一抗为UCHT1，二抗均为羊抗鼠IgG带HRP标记；C组使用的抗体为为羊抗鼠IgG带HRP标记，未添加一抗。

测试例2

本测试例用于说明本发明所提供的CD3抗原与OKT3和UCHT1抗体的结合活性。

将纯化的抗原以每孔100ng包被于酶标板4℃过夜。然后用PBS(+3%BSA)封闭，再分别将浓度为1ug/ml的OKT3，UCHT1，人IgG和鼠IgG加入到孔中，37度孵育1小时，用PBST洗板3次，加入羊抗鼠IgG带HRP标记二抗37度孵育半小时，PBST洗板3次，加入TMB室温孵育5分钟，用1M盐酸中止。在酶标仪中用450nm波长读板。结果见图9。

图9中CD3E/CD3D-LZ和CD3E/CD3G-LZ均为纯化后的样品，对照为购买的市售CD3抗原（CD3E/CD3D异二聚体带人IgG Fc标签购自SinoBiological Inc，货号CT026-H0323H）。使用的抗体：1为一抗是OKT3，二抗是羊抗鼠IgG带HRP标记抗体；2为一抗是UCHT1，二抗是羊抗鼠IgG带HRP标记抗体；3为一抗是鼠IgG，二抗是羊抗鼠IgG带HRP标记抗体；4为一抗是人IgG，二抗是羊抗人IgG带HRP标记抗体。

测试例3-16

测试例3-16用于说明本发明提供的CD3抗原1-14与抗CD3抗体的相对亲和力。测试方法依照文献（细胞与分子免疫学杂志，2005，抗PH2SA单克隆抗体相对亲和力的测定）中记载的抗PH2SA单克隆抗体相对亲和力的测定方法进行。

将纯化的抗原1-14分别以10ng/孔的用量包被于酶标板并在4度过夜。将待测的抗体OKT3从160nM开始以2倍稀释，连续稀释11个梯度到0.08nM。将总共12个不同浓度的OKT3溶液分别加入到包被CD3抗原1-14的酶标板中，37℃孵育1小时，用PBS洗板3次，加入羊抗鼠IgG带HRP标记二抗37℃孵育半小时，PBS洗板3次，加入TMB室温孵育5分钟，用1M盐酸中止。在酶标仪中用450nm波长读取结果。以抗体浓度为X轴，OD450光吸收为Y轴，绘制结合曲线，并计算出抗原1-14与OKT3的亲和力，结果见表3。

对比例2

对比例2用于说明现有的CD3抗原与抗CD3抗体的相对亲和力。

采用与测试例4-15相同的方法测试CD3抗原与抗CD3抗体OKT3和UCHT1的亲和力，不同的是，所使用的参考抗原CD3为市售的商品化CD3抗原CD3D&CD3E heterodimer protein（购自Sino Biological Inc，货号CT026-H0323H），计算出CD3D&CD3E heterodimer protein与UCHT1的相对亲和力，结果见表3。

表3.

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。