CN102539770A

CN102539770A - 胶体金标记Hly基因单克隆抗体测定单核细胞增生性李斯特菌试剂盒

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Publication number: CN102539770A
Application number: CN2011104491808A
Authority: CN
Inventors: 何鑫; 贾芙蓉; 黄胜起; 赵丽纯; 何成彦
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2011-12-29
Filing date: 2011-12-29
Publication date: 2012-07-04

Abstract

一种胶体金标记Hly基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒，属于卫生学检验及医学检验技术领域，其特征是：1引物设计、2PCR扩增、3琼脂糖凝胶电泳的反应条件、4切下目的DNA片段、5应用热休克转化法、6SDS裂解法纯化试剂盒制备质粒、7蛋白的诱导表达、8SDS-PAGE电泳、9从SDS-PAGE电泳凝胶中切下所需条带、10胶体金的制备。有益效果是：改进了过去针对单一菌属单一抗原测定的局限性。抗体纯、效价高，提高了敏感度和准确度。对单增李斯特菌进行检测，同ELISA法和PCR法比较，免疫胶体金层析对李斯特菌的检测具有快速、便捷的优点。

Description

胶体金标记Hly基因单克隆抗体测定单核细胞增生性李斯特菌试剂盒

技术领域

本发明属于卫生学检验及医学检验技术领域。

背景技术

李斯特菌属L isteria分为2个群，7个种。第1群包括单核细胞增生性李斯特菌L.monocytogenes(简称单增李斯特菌)、伊氏李斯特菌L.ivanovii、无害李斯特菌L.innocua、韦氏李斯特菌L.welshm ei及塞氏李斯特菌L.seeligeri；第2群为较少见的格氏李斯特菌L.grayi和莫氏李斯特菌L.m urrayi.其中单增李斯特菌被认为是引起动物和人类李斯特菌病的主要致病菌.单增李斯特菌(Usteria monocytogenes，Lm)是一种短小的革兰阳性无芽胞杆菌，是一种人畜共患病的致病菌，可使人和动物患李斯特菌病。研究发现单增李斯特菌包括致病性、弱致病性和非致病性3种类型.单增李斯特菌能使人畜致病，造成猪、鸡等多种畜禽死亡。人感染后则主要表现为脑膜炎、败血症和单核细胞增多。婴幼儿、怀孕妇女和免疫耐受病人的感染死亡率可高达20％～30％。单增李斯特菌广泛存在于自然界中，人们食用的肉、奶、蛋、水产品、蔬菜以及冷冻食品等均有不同程度的污染，世界卫生组织(WHO)在关于单增李斯特菌食物中毒的报告中指出：4％～8％的水产品、5％～10％的奶及奶制品、15％以上的家禽、30％以上的肉制品及冷冻制品，均被该菌污染.食品中存在的单增李斯特菌对人类的食品安全存在较大威胁，是冷冻食品中威胁人类健康的主要病原菌之一。在美国李斯特菌被列为7种主要的食源性致死病菌之一，已经被WHO食品安全工作计划列为重点检测的食源性病菌之一。

单增李斯特菌是典型的胞内寄生菌，可在巨噬细胞和许多非吞噬细胞(如内皮细胞、上皮细胞和肝细胞)内增殖。单增李斯特菌的致病性涉及多个毒力因子，如溶血素(Listeriolysin O，简称LLO)、内化素、p60蛋白等。LLO是该菌侵染力的重要组成成分，是LM的主要毒力因子。LLO是一种能结合胆固醇、可被巯基活化的细胞溶解素，由hly基因编码的529个氨基酸组成，其中有25个氨基酸构成的信号肽序列。LLO能溶解宿主细胞吞噬泡膜，逃离噬菌体，进入胞浆，逃避吞噬体中杀菌物质的杀灭；此外还能在感染细胞内诱导信号传导和定向免疫应答中发挥重要作用。由于LLO所具有的独特生物学特性，已被用于构建各种减毒疫苗或核酸疫苗，且促进MHC-I类分子限制性免疫应答，增强了保护性抗原的免疫作用。

单增李斯特菌为需氧或兼性厌氧菌，生长温度为1～45℃，对不利环境具有比较强的耐受能力，在4℃冰箱中也可生长繁殖，在pH5.0～9.0的环境中，1年后仍可检出。这使其危害性更进一步增大。另外，单增李斯特菌病原体是定居在细胞内的，因此应用抗生素治疗李斯特菌病的效果不太理想。由李斯特菌引起的疾病及其食源性感染日益引起世界各国的重视，对该病原进行快速、灵敏、准确的检测是有效防治本病和保证食品卫生安全的重要手段。

本研究旨在克隆和表达单增李斯特菌的hly基因，研制基于溶血素的诊断用单克隆抗体，以对单增李斯特菌进行检验分析及制备基因工程疫苗奠定基础。国内的赵松波等人已经原核表达出溶血素(LLO)，也建立了LLO的间接ELISA检测方法，但是该方法在检测动物血清时容易出现假阴性。赵松波提出利用LLO单抗建立夹心ELISA可提高检测灵敏度，但相关工作未见报道。董慧和罗正等人已经制备了LLO单抗，但均未用于实际样品检测。早在1991年就有国外的学者用LM培养上清中纯化的蛋白免疫小鼠制备单抗，获得3株能抑制LLO溶血的单抗、1株能抑制LLO与红细胞膜结合的单抗以及2株能抑制与其他细胞膜结合的单抗。1999年Erdenlig等人同样得到了具有抑制LLO溶血作用的单克隆抗体，并用于鉴定所分离的李斯特菌是否为致病菌株。

经典的李斯特菌分离培养和鉴定技术需要1-2周时间，人力、物力花费大，不适应实际检验工作的需要。目前，对产单核李斯特菌快速检测方法的研究，绝大部分尚停留在实验室的研究阶段，很大程度局限于ELISA法和PCR法，而免疫胶体金层析为李斯特菌的检测具有快速、便捷的优点，可广泛应用于医院、商检、卫生、安检，也可用于家庭进行简易的检测。其良好的特异性，较高的灵敏度，可靠的重现性和稳定性，为产单核李斯特菌检测提供了一个更为理想的检测方法和思路。罗利新等所用抗体为产单核李斯特菌抗体(O链抗原Ⅰ/Ⅱ)，实验只针对单一血清型李斯特菌进行了研究，而产单核李斯特菌根据菌体(O)抗原和鞭毛(H)抗原分成13个血清型，所以实验针对李斯特全菌属不够完备。

综合以上的国内外研究资料可发现，单增李斯特菌的检测方法仍不够完备，现有的检测技术方法仍存在如下两个方面的不足：

1标本仍需48h的增菌培养。

2本方法仍只可对单增李斯特菌感染的标本进行阴性筛查，阳性标本的确定试验仍为细菌培养及生化反应的鉴定。

发明内容

本发明的目的是：提供一种胶体金标记Hly基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒，它将标记Hly基因单克隆抗体的免疫胶体金层析法用于快速检测单增李斯特菌，使用方便、操作简单、结果可靠。

本发明的技术方案是：

1引物设计：

L.monocytogenes Hly蛋白基因序列：

根据GenBank中的L.monocytogenes Hly蛋白基因序列，应用Primer Premier5.0，DNA Club和Oligo 6.0设计特异性引物P1和P2，预期扩增长度为1434bp。在NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看选择的酶切位点，在所要进行PCR的基因序列中是否存在；用Primer primer5把序列反向互补；在应用Oligo 6.0引物设计时，上下游引物全长输入；上游引物位点的确定为5’端模板第一个碱基前面的所有碱基(包括酶切位点+保护碱基)的负数值+1下游引物位点的确定为下游引物-酶切位点-保护性碱基＝A，序列全长-A+1＝下游引物位点。

上游引物：

5一‘AAGAggatccAGAGTGAAACCCATG一3’；

下游引物：

5一‘GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT一3’。

为下一步克隆需要，分别在上、下游引物中引入BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点

2PCR扩增：

参照TaKaRa公司的TaqTM PCR试剂盒。PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，扩增32个循环。预期片段大小1 600bp左右。

3琼脂糖凝胶电泳的反应条件：

用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，电压100V，电泳30min。

4切下目的DNA片段，用凝胶快速纯化回收试剂盒回收。将回收纯化的PCR产物与pMD18-T进行连接，并pMD18-T载体16℃12小时以上连接。制备感受态细胞：应用CaCl₂致敏法制备大肠杆菌感受态，接种JM109菌种，37℃，225rpm12小时振摇培养后，菌液在LB固体培养基上划线，37℃孵箱过夜培养，筛选单克隆。选一单菌落接种于5mLLB培养基中，12小时以上培养，培养物按1/100接种于LB培养基中，培养至A₆₀₀达0.45-0.55，用CaCl₂致敏大肠杆菌。具体如下：将菌液冰浴10min后，4℃，4000rpm离心20min，收集菌体，再加入冰冷的0.1M CaCl₂致敏液，悬浮菌体，冰浴10min，重新收集菌体后，加冰冷的0.1M CaCl₂，重悬菌体，加甘油至终浓度为15％，100μL/管分装，-70℃保存，用于转化。

5应用热休克转化法，将连接反应液加入100μL感受状态的细胞中，再加3μl DMSO以增加转化效率，冰浴30min后，42℃休克45s，然后迅速冰浴5min，再将转化产物加入LB液体培养基中复苏30min后，离心收集菌体，将其铺于含筛选抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温孵箱放置16h后观察转化效果。

6SDS裂解法纯化试剂盒制备质粒。用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行酶切鉴定及PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒，命名为pGEX-6P-1-Hly。用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行亚克隆，表达载体pGEX-6P-1和重组克隆载体pGEX-6P-1-Hly用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ切处理，琼脂糖凝胶电泳，线性表达载体用DNA快速纯化回收试剂盒回收，亚克隆片段用挤胶法回收，亚克隆载体与片段用T4 DNA连接酶连接，连接产物转化JM109感受态，提取质粒，鉴定阳性克隆。

7蛋白的诱导表达

用pGEX-6P-1重组质粒转化BL21受体菌，选择单克隆接种到5mL LB培养液里，按传统方式诱导表达，即37℃，225rpm振荡培养至A600达0.6-0.8，加IPTG至1mmol/L，对照组不加IPTG，3h后收集细菌。同时接种诱导菌种，提取质粒，BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切验证确含目的片段后，进行测序，测序正确后进行重组蛋白的后续实验。

8SDS-PAGE电泳

将诱导后菌液30mL 11000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，向菌体沉淀中加入2×SDS凝胶加样缓冲液1000μl，煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳，操作过程如下：

12％的分离胶15mL：水4.9mL、30％丙烯酰胺6.0mL、1.5mol/L Tris-HCl其pH 8.8的3.8mL、10％SDS 150mL、10％过硫酸铵150mL、TEMED 6mL，迅速灌注于两层玻璃板的间隙，在胶上小心覆盖一层蒸馏水，凝胶垂直置于室温，聚合完全后，倒出覆盖的水，用滤纸将水吸净。制备8mL积层胶：水5.5mL、30％丙烯酰胺1.3mL、1.0mol/L Tris-HCl其pH 6.8的1.0mL、10％SDS 80mL、10％过硫酸铵80mL、TEMED 8mL，直接注于分离胶上层，立即在积层胶中插入干净的Teflon梳子，小心避免形成气泡。积层胶聚合完全后，小心移出Teflon梳子，将凝胶固定于电泳装置上，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液25mmol/L Tris， 250mmol/L甘氨酸，0.1％SDS，上电泳样品及蛋白质Marker，电压200v电泳45min，电泳结束后凝胶加入考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后，将凝胶浸泡于水中，拍照记录。

9从SDS-PAGE电泳凝胶中切下所需条带，大约用两天时间将其冻干，并碾成粉末。用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定，制作蛋白标准曲线。595nm处比色。将抗原溶于生理盐水中，配制浓度为1μg/μl。免疫BALB/c小鼠。4-6周，加强免疫。

小鼠腹水的诱导：

取10周龄的健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，每只0.5ml，7-10天后，收集杂交瘤细胞，离心，去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度为3×10⁷个/ml，每只小鼠注射1ml。设阴性对照、盐水对照。约10天后，小鼠腹部增大，开始收集腹水。用12号针头扎入腹部，挤压，使腹水流出，收集至离心管，并使劲晃动离心管防止腹水凝结。1000转离心5分钟，吸取上清，注意去掉上面一层脂肪。分装，-20℃冻存。

10胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法并稍作改进制备胶体金。胶体金制备：取1％氯金酸溶液2.5ml加入到250ml容量瓶中，加双蒸水至标定刻度线，使氯金酸溶液的浓度为1‰，沸水浴10min，加入1％柠檬酸三钠溶液6.65ml。快速搅拌直至颜色彻底变为紫红色，继续沸水10min，取出。凉至室温后，用双蒸水恢复至原体积。置4℃冰箱保存备用。

测定胶体金在515nm波长具有最大吸收峰，确定胶体金直径大小为10nm。

胶体金探针制备：取新鲜制备的胶体金溶液50ml，加入0.2mol/L K₂CO3，调pH至8.2，置磁力搅拌器上调适量转速，然后加入适量的已纯化好的抗体。

使抗体浓度恰好在稳定蛋白质的最小量上。缓慢搅拌10min，加入牛血清白蛋白BSA，使BSA的终浓度为1％，继续搅拌10min。将上述胶体金一抗体一BSA液进行4000r/min离心20min，收集上清。将收集的上清进行4℃、10000r/min离心60min。弃上清，沉淀用含1％BSA的0.01mol/L。pH7.4PBS悬浮。同上4℃，10000r/min离心60min两次，最后将沉淀用5ml PBS-T溶解。并加入少量的Na₃N，4℃冰箱保存备用。

层析试纸条组装试纸条由吸水纤维、硝酸纤维膜、玻璃纤维和PVC板组成。

硝酸纤维膜处理：中段相隔5mm分别用羊抗鼠IgG对照线和单核李斯特菌抗体检测线划线，形成两条宽约1mm的线段，干燥后用含1％BSA的PBS封闭过夜，37℃干燥。

试纸条组装：取洁净PVC板，将处理好的硝酸纤维膜粘在PVC板中部合适位置；将2cm吸水纤维粘在PVC板上端并部分压在硝酸纤维膜上，0.8cm玻璃纤维粘在PVC板下端并部分压在硝酸纤维膜上，切成宽5mm的条带，即为层析试纸条；干燥剂密封冷冻保存。

本发明的有益效果是：1根据GeneBank中已发表的L.monocytogenes Hly蛋白基因序列，应用Primer Premier5.0，DNA Club和Oligo 6.0自行设计出引物。

2 LLO是该菌侵染力的重要组成成分，是LM的主要毒力因子，由Hly基因编码，对单核细胞增多性李氏杆菌Hly基因进行克隆和原核表达，改进了过去针对单一菌属单一抗原测定的局限性。3表达产物可溶性重组蛋白免疫动物BALB/c小鼠，制备杂交瘤细胞株，制备腹水抗体。抗体纯、效价高，同过去的方法比较，提高了敏感度和准确度。4胶体金标记单增李斯特菌抗体制备免疫层析检测试剂板，对单增李斯特菌进行检测，同ELISA法和PCR法比较，免疫胶体金层析对李斯特菌的检测具有快速、便捷的优点。

附图说明

图1Hly基因PCR产物电泳图

M：DNA markerDL2000

图2pGEX-6P-1-Hly重组蛋白SDS-PAGE电泳

M：蛋白质相对分子质量标准；

1：pGEX-6P-1-Hly重组质粒在BL21(DE3)pLysS中经IPTG诱导6h

图3重组蛋白的Westernblotting免疫蛋白印迹分析

M：蛋白质相对分子质量标准；

1：重组蛋白的Westernblotting免疫蛋白印迹分析表达的相对分子量大约72ku。

图4胶体金方法检测单增李斯特菌阴、阳性结果照片。

1胶体金方法检测单增李斯特菌阴性结果

2胶体金方法检测单增李斯特菌阳性结果

C：阳性对照线 T：检测线

具体实施方式

实施例1：

工艺条件：

第一步骤对单核细胞增多性李氏杆菌基因进行克隆和原核表达。

主要器材：

药品与试剂：菌种及质粒单增李斯特菌菌种(C54002株)、pMD18-T、pGEX-6P载体质粒为TAKARA公司产品。感受态细胞大肠杆菌JM109、BL21受体菌为Promega公司产品。酶及相关试剂Ex Taq聚合酶，限制性内切酶BamH Ⅰ、Xho Ⅰ及IPTG为大连宝生物工程有限公司产品。T4 DNA ligase为Promega公司产品。DNA快速纯化回收试剂盒、凝胶快速纯化回收试剂盒为大连宝生物工程有限公司产品。

实验方法：

一.基因组DNA的制备

按常规方法培养单核细胞增多性李氏杆菌，DNA快速纯化回收试剂盒

二.含L.monocytogenes Hly蛋白基因克隆载体的构建

2.1引物设计：

根据GenBank中已发表的L.monocytogenes Hly蛋白基因序列，应用Primer Premier5.0，DNAClub和Oligo 6.0设计特异性引物P1和P2，预期扩增长度为1434bp。上海生工生物工程技术服务有限公司制备。

NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看选择的酶切位点，在所要进行PCR的基因序列中是否存在；用Primer primer5把序列反向互补；在应用Oligo 6.0引物设计时，上下游引物全长输入；上游引物位点的确定为：5’端模板第一个碱基前面的所有碱基(包括酶切位点+保护碱基)的负数值+1下游引物位点的确定为：下游引物-酶切位点-保护性碱基＝A，序列全长-A+1＝下游引物位点。引物设计时候要考虑到序列的起始碱基和末尾碱基中是否包含起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)，如果有，要考虑是否需要删除或者保留。引物长度的选择要考虑到CG比例，酶切位点的选择要兼顾廉价，常用，而且要兼顾其加入后引物的GC比例变化；还要考虑到酶切位点的序列是否在PCR的全序列中出现，如果出现要选择其它酶切位点。前面适当加碱基调节GC比例，5’端照抄；3’端反向互补；保护性碱基和酶切位点加在引物前面。自身互补，二聚体(两个引物之间)＜6，负数值越大能量越大，退火温度越高，错配几率越小。

上游引物：

5一‘AAGAggatccAGAGTGAAACCCATG一3’；

下游引物：

5一‘GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT一3’。

2.2PCR扩增：

2.3琼脂糖凝胶电泳：

用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，电压100V，电泳30min。

2.4PCR产物回收：

切下目的DNA片段，用凝胶快速纯化回收试剂盒回收。

2.5PCR产物的克隆：

将回收纯化的PCR产物与pMD18-T进行连接，并pMD18-T载体16℃过夜连接。

2.6制备感受态细胞：

应用CaCl₂致敏法制备大肠杆菌感受态，接种JM109菌种，37℃，225rpm过夜振摇培养后，菌液在LB固体培养基上划线，37℃孵箱过夜培养，筛选单克隆。选一单菌落接种于5mLLB培养基中，过夜培养，培养物按1/100接种于LB培养基中，培养至A₆₀₀达0.45-0.55，用CaCl₂致敏大肠杆菌。具体如下：将菌液冰浴10min后，4℃，4000rpm离心20min，收集菌体，再加入冰冷的0.1M CaCl₂致敏液，悬浮菌体，冰浴10min，重新收集菌体后，加冰冷的0.1M CaCl₂，重悬菌体，加甘油至终浓度为15％，100μL/管分装，-70℃保存，用于转化。

2.7转化：

应用热休克转化法，将连接反应液加入100μL感受状态的细胞中，再加3μl DMSO以增加转化效率，冰浴30min后，42℃休克45s，然后迅速冰浴5min，再将转化产物加入LB液体培养基中复苏30min后，离心收集菌体，将其铺于含筛选抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温孵箱放置12～16h后观察转化效果。

2.8质粒DNA SDS裂解法纯化试剂盒制备质粒。

2.9鉴定：

用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行酶切鉴定及PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒，命名为pMD18-T-Hly。

2.10pMD18-T-Hly的序列测定：

将阳性重组质粒pMD18-T-Hly送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，并进行同源性比较。

三.原核表达载体pGEX-6P-Hly的构建与重组蛋白的表达和检测

3.1亚克隆：

用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行亚克隆，表达载体pGEX-6P和重组克隆载体pGEX-6P-Hly用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ切处理，琼脂糖凝胶电泳，线性表达载体用DNA快速纯化回收试剂盒回收，亚克隆片段用挤胶法回收，亚克隆载体与片段用T4DNA连接酶连接，连接产物转化JM109感受态，提取质粒，鉴定阳性克隆。

3.2蛋白的诱导表达

用pGEX-6P-Hly重组质粒转化BL21受体菌，选择单克隆接种到5mL LB培养液里，按传统方式诱导表达，即37℃，225rpm振荡培养至A600达0.6-0.8，加IPTG至1mmol/L，对照组不加IPTG，3h后收集细菌。同时接种诱导菌种，提取质粒，BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切验证确含目的片段后，上海生工测序，测序正确后进行重组蛋白的后续实验。

3.3重组蛋白的鉴定

3.3.1SDS-PAGE电泳

将诱导后菌液2mL 11000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，向菌体沉淀中加入2×SDS凝胶加样缓冲液200μl，煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳，操作过程如下：

12％的分离胶15mL：水4.9mL、30％丙烯酰胺6.0mL、1.5mol/L Tris-HCl(pH 8.8)3.8mL、10％SDS 150mL、10％过硫酸铵150mL、TEMED 6mL，迅速灌注于两层玻璃板的间隙，在胶上小心覆盖一层蒸馏水，凝胶垂直置于室温，聚合完全后，倒出覆盖的水，用滤纸将水吸净。制备8mL积层胶：水5.5mL、30％丙烯酰胺1.3mL、1.0mol/L Tris-HCl(pH 6.8)1.0mL、10％SDS 80mL、10％过硫酸铵80mL、TEMED 8mL，直接注于分离胶上层，立即在积层胶中插入干净的Teflon梳子，小心避免形成气泡。积层胶聚合完全后，小心移出Teflon梳子，将凝胶固定于电泳装置上，加入Tris-甘氨酸电泳缓冲液(25mmol/L Tris，250mmol/L甘氨酸，0.1％SDS)，上电泳样品及蛋白质Marker，电压200v电泳45min，电泳结束后凝胶加入考马斯亮蓝染色，脱色液脱色后，将凝胶浸泡于水中，拍照记录。见图2。

3.3.2Western blot 12％SDS-PAGE电泳marker两侧对称上样，一半凝胶染色、脱色，另一办用于western blot。戴手套剪6张Whatman 3MM滤纸和1张硝酸纤维素滤膜(Millipore HAWP)，大小略小于凝胶，切去滤膜一角作为标记。把硝酸纤维素滤膜浸入超纯水中5min以上，6张3MM滤纸浸于转移缓冲液，用蒸馏水淋洗石墨板，用滤纸揩干石墨板上的液滴，在阳极依次放3张3MM滤纸、硝酸纤维素滤膜、凝胶、3张3MM滤纸，各层精确对齐并不留气泡，正确安装电泳装置，根据凝胶面积按0.6mA/cm2接通电流，转膜2h后，凝胶染色、脱色观察转膜是否成功，硝酸纤维素滤膜4℃封闭过夜(封闭液为含5％[W/V]脱脂奶粉的PBS，按膜面积0.1mL/cm2的量加入)，然后向封闭液中按0.1mL/cm2的量加入第一抗体，室温缓慢摇动孵育2h，硝酸纤维素滤膜经250mL PBS洗涤3次后(每次5min)，转移到辣根过氧化物酶标记的二抗中，室温平缓摇动2h，同上洗涤后，移至显色液中(10mL的PBS中DAB 6mg，30％H2O2 10mL)，室温观察反应过程，蛋白带的颜色深度达到要求后即用清水略为漂洗，然后拍照。见图3。第二步骤单核细胞增多性李斯特菌的杂交瘤细胞制备和单克隆抗体生产和纯化

1.1.1从SDS-PAGE电泳凝胶中切下所需条带，大约用两天时间将其冻干，并碾成粉末。

1.1.2蛋白浓度测定(考马斯亮蓝法)

制作蛋白标准曲线。595nm处比色，得吸光度，查标准曲线，得到蛋白浓度。

1.2将抗原溶于生理盐水中，配制浓度为1μg/μl。免疫BALB/c小鼠。4-6周，加强免疫。

2融合实验

2.1培养骨髓瘤细胞NS-1

2.2制备饲养细胞：

取塑料管备用。拉颈处死小鼠，浸泡于75％酒精2-3分钟。将小鼠移入超净工作台上，以仰卧位固定在解刨板上，用眼科剪剪开胸部皮肤，用两手纵向拉开皮肤，暴露腹部，并用酒精棉球消毒腹膜。用滴管吸取HAT培养液注入腹腔，冲洗，吸出，注入预先准备好的塑料管中，反复做几次，取一定量小鼠腹腔巨噬细胞。将巨噬细胞接种于96孔板。置37℃、5％CO₂条件下培养。

2.3脾细胞制备：

拉颈处死免疫小鼠，用75％酒精浸泡消毒小鼠体表。在超净工作台内，无菌暴露腹腔，摘取脾脏，去除脂肪和结缔组织，用血清培养液冲洗。将脾脏移入盛有无血清培养液的匀浆器研磨。用无血清培养液冲洗，收集细胞悬液，以1000转离心5分钟，弃去上清液，悬浮于不完全培养液中，并记共多少毫升脾细胞。脾细胞计数，取1毫升脾细胞悬液，加1％冰醋酸(破碎红细胞)。

2.4细胞融合实验：

将骨髓瘤细胞与脾细胞1∶10的比例混合在一起，在50毫升塑料离心管内用不完全培养液洗一次，1100转，离心5分钟。弃去上清夜，用食指轻弹离心管底部，使细胞沉淀团块稍松散。一手均匀转动离心管，另一手用吸管边滴边加轻轻搅动，同时加入0.5ml-1ml，50％PEG作用，控制1分钟内加完。加预热的不完全培养液，终止PEG作用，每隔2分钟，分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml。离心，1000转，5分钟。弃上清，用含有小牛血清的培养液轻轻混悬，切记不能吹打，以免融合细胞散开。根据96孔板培养板数量，补加培养液。将融合细胞悬液加入含饲养细胞的96孔板，100ul/孔，37℃，5％CO₂孵箱培养。

3酶联免疫吸附试验(ELISA)：

3.1包被：

蛋白抗原按比例加包被液，每孔100ul，加96孔板，4℃放置过夜。PBS洗4次。(2毫升吐温/1LPBS水)。封闭：1％BSA(0.01g+100mlPBS)1小时。加阴性对照、阳性标本，每孔100ul。

3.2PBS 250ul/孔，洗三次。封闭：10％封闭液(1ml小牛血清+9mlPBS)，250ul/每孔，封闭1小时，-20℃保存备用。弃上清，PBS洗三次。一抗加阴性对照、阳性对照及需检测克隆上清标本，编号放置1小时，弃上清，PBS洗四次。二抗酶标抗体，2ul+5ml封闭液，放置1小时。PBS洗六次。底物溶液每孔100ul，避光放置30min。加终止液观察，酶标液读数。

4有限稀释法克隆杂交瘤细胞

4.1在已检测过的96孔培养板内将待克隆的孔作好标记。用吸管吹打孔内的细胞使其散开，从孔内吸出0.1ml细胞悬液到1ml杂交细胞培养液中计数。初次克隆时用HT培养液调整杂交瘤细胞密度到3-10个/ml。每块96孔培养板为10ml(第二次或第三次克隆可改用杂交细胞培养液)。将调好预定密度的细胞加到含饲养细胞的96孔培养板，每个孔加0.1ml。将96孔培养板置37℃、5％CO₂、饱和湿度的培养箱中培养。第四天用新培养液置换孔内1/2上清液。第七天至第九天，当孔底细胞集落在1-2mm大小时，吸出杂交瘤细胞生长孔的上清液。按抗体筛选方法检测上清液中的抗体。计算杂交瘤细胞的阳性孔比率。将抗体阳性的孔内细胞移到24孔培养板扩大培养2-4d。按以上步骤，将扩大培养后的阳性细胞再重复克隆2-4次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％为止。孔内的细胞即为克隆化后的杂交瘤细胞。将克隆化的杂交瘤细胞扩大培养后，以1000r/min离心5min。收集上清液做单克隆抗体鉴定，冻存沉淀的细胞备用。

5小鼠腹水的诱导：

取10周龄的健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，每只0.5ml.7-10天后，收集杂交瘤细胞，离心，去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度为3×10⁷个/ml，每只小鼠注射1ml。设阴性对照、盐水对照。约10天后，小鼠腹部增大，开始收集腹水。用12号针头扎入腹部，挤压，使腹水流出，收集至离心管，并使劲晃动离心管防止腹水凝结。1000转离心5分钟，吸取上清，注意去掉上面一层脂肪。分装，-20℃冻存。

6小鼠腹水单抗间接ELISA亚型分型实验

1离心处理样品，用PBS按照1000∶1比例稀释腹水样品与阴性对照样品(未免疫BalB/C小鼠腹水)。取100ul稀释腹水样品和阴性对照分别包被到ELISA板中，每种样品一列，每列6个孔，取PBS为空白对照；

2将ELISA板置于37℃孵育一小时；

3用PBST洗涤液洗涤ELISA板三次；

4用PBS按照10∶1比例稀释6个抗体亚型(分别为IgA，M，G1，2a，2b和G3)(SIGMA公司，货号为ISO-2)，将每种亚型抗体分别加入到空白孔，阴性对照孔和腹水样品孔中，每孔100ul；

5室温放置30分钟；

6用PBST洗涤液洗涤ELISA板三次；

7用含0.02％TWEEN-20的PBS按照500∶1的比例稀释HRP标记的马抗羊二抗(北京鼎国生物技术责任公司，货号：HD004-1)，并将其加入到18个孔中，每孔100ul；

8室温放置15分钟；

9用PBST洗涤液洗涤ELISA板三次；

10加入显色底物缓冲液每孔100微升(采用OPD显色系统，光吸收值为490nm)；

11室温避光放置10分钟；

12加终止液50ul；

13拍照，用酶标仪在490nm处读数记录。

实验结果讨论：

1∶10000稀释后的样品在490nm处有仍有吸收，而且样品与阴性比较差别明显的是IgM和IgG3。

7单克隆抗体的纯化：

小鼠腹水可通过亲和层析方法获得所需的纯化单克隆抗体.

第三步骤胶体金及胶体金探针的制备

1材料与方法

1.1试剂与仪器

氯金酸分析纯，1g装(国药集团化学试剂有限公司)；产单核李斯特菌抗体(O链抗原Ⅰ/Ⅱ)14 ms/ml×2ml装(购于日本生研公司)；检测标准产单核李斯特菌(34922)样品；硝酸纤维膜层析条带4cm×200cm(购于德国赛多利斯公司)；吸水纤维、玻璃纤维和PVC板(购于上海良信科技有限公司)。

1.2胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法并稍作改进制备胶体金。18～20nm胶体金制备：取1％氯金酸溶液2.5ml加入到250ml容量瓶中，加双蒸水至标定刻度线，使氯金酸溶液的浓度为1‰，沸水浴10min，加入1％柠檬酸三钠溶液6.65ml。快速搅拌直至颜色彻底变为紫红色，继续沸水10min，取出，凉至室温后，用双蒸水恢复至原体积。置4℃冰箱保存备用。

10nm直径大小的胶体金，在515nm波长具有最大吸收峰，通过比较各法制备的胶体金的可见光吸光度，分析其金颗粒大小和分布。

使抗体浓度恰好在稳定蛋白质的最小量上。缓慢搅拌10min，加入牛血清白蛋白(BSA)，使BSA的终浓度为1％，继续搅拌10min。将上述胶体金一抗体一BsA液进行4000r/min离心20min，收集上清。将收集的上清进行4℃、10000r/min离心60min。弃上清，沉淀用含1％BSA的0.01mol/L。pH7.4PBS悬浮。同上4℃，10000r/min离心60min两次，最后将沉淀用5ml PBS-T溶解。并加入少量的Na₃N，4℃冰箱保存备用。

层析试纸条组装试纸条由吸水纤维、硝酸纤维膜、玻璃纤维和PVC板组成。硝酸纤维膜处理：中段相隔5mm分别用羊抗鼠IgG(对照线)和单核李斯特菌抗体(检测线)划线，形成两条宽约1mm的线段，干燥后用含1％BSA的PBS封闭过夜，37℃干燥。

1.5检测

取待检样品培养48h，取0.1ml加入免疫胶体金离心管混合振荡10min，将层析试纸条插入离心管，可见混合液沿试纸条向上移，移行过程中与固定在硝酸纤维膜上的单核李斯特菌抗体和羊抗鼠IgG发生抗原抗体反应，并产生肉眼可见的红色条带，试验过程需10-20min。测定结果判断：阴性，仅对照线出现红色；阳性，对照线和检测线均出现红色。

本发明的试验效果评价：

2.1胶体金制备方法和条件

2.1检测灵敏度，并进行了10倍系列稀释。数据均低于食物中毒所需的菌种浓度。由此可见，对于常见的由于单增李斯特菌引起的中毒，可以通过此方法检测出来。

2.2特异性用自制的胶体金探针分别与沙门氏菌、志贺氏菌、大肠杆菌、非产肠毒素金葡菌以及其它菌共10株等进行检测，单增李斯特菌胶体金探针具有很的特异性，基本上不与其它菌产生非特异的交叉反应。

表1胶体金试剂盒特异性的观察

2.3本发明的效果：

2.3.1检测结果见表1。阳性待检样品中，均为两条红色线。阴性待检样品中，均为显示红色单一对照线。不确定样中，未发现有产单核李斯特菌的存在，均为显示红色单一对照线。

2.3.2灵敏度阳性待检样品每样3次进行检测，在不同稀释度的标样以及感染食物中，共检测24次，灵敏度达96％；稀释检测不明显时，需其它辅助方法检测予以确定。

表2结果：

+检测阳性；-检测阴性

2.3.3重现性不同批次生产的免疫胶体金具有良好的检测重现性，检测上无大的波动。

2，3.4稳定性将测试条3个月4℃保藏，与新制测试条进行检测对照，结果无显著性差异。

检测使用例1

检测分析结果选用阳性待检标准样为产单核李斯特菌，感染冷冻猪肉、牛奶、冰激凌，增菌器增菌培养2-4h，以及标准样各稀释度的标样；阴性对照样为自来水，不确定样为湖水，生活污水，动物粪便。

使用方法：

取待检样品0.1ml加入免疫胶体金离心管混合振荡10min，将层析试纸条插入离心，管，可见混合液沿试纸条向上移，移行过程中与固定在硝酸纤维膜上的单核李斯特菌抗体和羊抗鼠IgG发生抗原抗体反应，并产生肉眼可见的红色条带，全部试验过程仅需10-20min。

测定结果判断：阴性，仅对照线出现红色；阳性，对照线和检测线均出现红色。

检测使用例2

检测分析结果选用阳性待检标准样为产单核李斯特菌感染血、脑脊液及其它标本增菌器增菌培养2-4h，阴性对照样为盐水。

使用方法：

取待检样品0.1ml加入免疫胶体金离心管混合振荡10min，将层析试纸条插入离心，管，可见混合液沿试纸条向上移，移行过程中与固定在硝酸纤维膜上的单核李斯特菌抗体和羊抗鼠IgG发生抗原抗体反应，并产生肉眼可见的红色条带，试验过程需10-20min。

检测使用例3

检测分析结果选用阳性待检标准样为产单核李斯特菌，以盐水以不同稀释度进行稀释，阴性对照样为盐水。

使用方法：

Claims

1.一种胶体金标记Hly基因单克隆抗体测定单增李斯特菌试剂盒，其特征是：

a、引物设计

L.monocytogenes Hly蛋白基因序列

根据GenBank中的L.monocytogenes Hly蛋白基因序列，应用Primer Premier5.0，DNA Club和Oligo 6.0设计特异性引物P1和P2，预期扩增长度为1434bp；在NCBI GENEBANK中找到基因序列后，看选择的酶切位点，在所要进行PCR的基因序列中是否存在；用Primer primer5把序列反向互补；在应用Oligo 6.0引物设计时，上下游引物全长输入；上游引物位点的确定为5’端模板第一个碱基前面的所有碱基的负数值+1下游引物位点的确定为下游引物-酶切位点-保护性碱基＝A，序列全长-A+1＝下游引物位点；

上游引物

5一‘AAGAggatccAGAGTGAAACCCATG一3’；

下游引物

5一‘GGACctcgagAATTATTCGATTGGATT一3’；

b、PCR扩增

PCR反应条件为95℃预变性5min，94℃变性1min，53℃退火1min，72℃延伸2min，扩增32个循环；预期片段大小1 600bp；

c、琼脂糖凝胶电泳的反应条件

用1.0％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，电压100V，电泳30min；

d、切下目的DNA片段，用凝胶快速纯化回收试剂盒回收；将回收纯化的PCR产物与pMD18-T进行连接，并pMD18-T载体16℃12小时以上连接；制备感受态细胞，应用CaCl₂致敏法制备大肠杆菌感受态，接种JM109菌种，37℃，225rpm12小时振摇培养后，菌液在LB固体培养基上划线，37℃孵箱过夜培养，筛选单克隆；选一单菌落接种于5mLLB培养基中，12小时以上培养，培养物按1/100接种于LB培养基中，培养至A₆₀₀达0.45-0.55，用CaCl₂致敏大肠杆菌；

e、应用热休克转化法，将连接反应液加入100μL感受状态的细胞中，再加3μl DMSO以增加转化效率，冰浴30min后，42℃休克45s，然后迅速冰浴5min，再将转化产物加入LB液体培养基中复苏30min后，离心收集菌体，将其铺于含筛选抗生素的LB固体培养基上，37℃恒温孵箱放置16h后观察转化效果；

f、SDS裂解法纯化试剂盒制备质粒；用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行酶切鉴定及PCR鉴定，筛选出阳性重组质粒，命名为pGEX-6P-1-Hly；用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ进行亚克隆，表达载体pGEX-6P-1和重组克隆载体pGEX-6P-1-Hly用BamH Ⅰ和Xho Ⅰ切处理，琼脂糖凝胶电泳，线性表达载体用DNA快速纯化回收试剂盒回收，亚克隆片段用挤胶法回收，亚克隆载体与片段用T4DNA连接酶连接，连接产物转化JM109感受态，提取质粒，鉴定阳性克隆；

g、蛋白的诱导表达

用pGEX-6P-1重组质粒转化BL21受体菌，选择单克隆接种到5mL LB培养液里，按传统方式诱导表达，即37℃，225rpm振荡培养至A600达0.6-0.8，加IPTG至1mmol/L，对照组不加IPTG，3h后收集细菌；同时接种诱导菌种，提取质粒，BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切验证确含目的片段后，进行测序，测序正确后进行重组蛋白的后续实验；

h、SDS-PAGE电泳

将诱导后菌液30mL 11000rpm离心2min，弃上清，收集菌体，向菌体沉淀中加入2×SDS凝胶加样缓冲液1000μl，煮沸5min后进行SDS-PAGE电泳；

i、从SDS-PAGE电泳凝胶中切下所需条带，大约用两天时间将其冻干，并碾成粉末；用考马斯亮蓝法进行蛋白浓度测定，制作蛋白标准曲线；595nm处比色；将抗原溶于生理盐水中，配制浓度为1μg/μl；免疫BALB/c小鼠；4-6周，加强免疫；

小鼠腹水的诱导

取10周龄的健康BALB/c小鼠，腹腔注射灭菌液体石蜡，每只0.5ml，7-10天后，收集杂交瘤细胞，离心，去上清，加入不含血清的培养基，调节细胞密度为3×10⁷个/ml，每只小鼠注射1ml；设阴性对照、盐水对照；10天后，小鼠腹部增大，开始收集腹水；用12号针头扎入腹部，挤压，使腹水流出，收集至离心管，并使劲晃动离心管防止腹水凝结；1000转离心5分钟，吸取上清，注意去掉上面一层脂肪；分装，-20℃冻存；

j、胶体金的制备采用柠檬酸三钠还原法并稍作改进制备胶体金；胶体金制备，取1％氯金酸溶液2.5ml加入到250ml容量瓶中，加双蒸水至标定刻度线，使氯金酸溶液的浓度为1‰，沸水浴10min，加入1％柠檬酸三钠溶液6.65ml；快速搅拌直至颜色彻底变为紫红色，继续沸水10min，取出；凉至室温后，用双蒸水恢复至原体积；置4℃冰箱保存备用；

测定胶体金在515nm波长具有最大吸收峰，确定胶体金直径大小为10nm；

胶体金探针制备，取新鲜制备的胶体金溶液50ml，加入0.2mol/L K₂CO3，调pH至8.2，置磁力搅拌器上调适量转速，然后加入适量的已纯化好的抗体；

使抗体浓度恰好在稳定蛋白质的最小量上；缓慢搅拌10min，加入牛血清白蛋白BSA，使BSA的终浓度为1％，继续搅拌10min。将上述胶体金一抗体一BSA液进行4000r/min离心20min，收集上清；将收集的上清进行4℃、10000r/min离心60min；弃上清，沉淀用含1％BSA的0.01mol/L。pH7.4PBS悬浮；同上4℃，10000r/min离心60min两次，最后将沉淀用5ml PBS-T溶解；4℃冰箱保存备用；

层析试纸条组装试纸条由吸水纤维、硝酸纤维膜、玻璃纤维和PVC板组成；硝酸纤维膜处理，中段相隔5mm分别用羊抗鼠IgG对照线和单核李斯特菌抗体检测线划线，形成两条宽约1mm的线段，干燥后用含1％BSA的PBS封闭过夜，37℃干燥；

试纸条组装，取洁净PVC板，将处理好的硝酸纤维膜粘在PVC板中部合适位置；将2cm吸水纤维粘在PVC板上端并部分压在硝酸纤维膜上，0.8cm玻璃纤维粘在PVC板下端并部分压在硝酸纤维膜上，切成宽5mm的条带，即为层析试纸条；干燥剂密封冷冻保存。