CN108226491A - 单核细胞增生李斯特菌llo胶体金的制备及初步应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供单核细胞增生李斯特菌LLO胶体金的制备及初步应用，抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，解决了可靠的LM单克隆抗体不易获得的问题，经多年多次传代，能稳定分泌单克隆抗体，它分泌的单克隆抗体，应用于胶体金法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌，具有良好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检。

Description

单核细胞增生李斯特菌LLO胶体金的制备及初步应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，确切地说是单核细胞增生李斯特菌LLO胶体金的制备及初步应用。
背景技术
单核细胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，LM)是最常见的食源性致病菌之一，WHO将其与大肠杆菌O157:H7、沙门氏菌以及金黄色葡萄球菌并列为20世纪90年代四大食源性致病菌。LM是李斯特菌属中致病力最强的细菌，也是唯一对人致病的、典型的胞内寄生菌，可穿越宿主三道屏障，从而导致严重的人畜共患传染病，如胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产等。孕妇、新生儿、老年人以及免疫功能缺陷者感染该菌后致死率达20-30％，新生儿等免疫力低下者的致死率高达70％。牛、马、羊、兔、鸡、猪等畜禽感染该菌后会造成严重的脑膜炎、坏死性心肌炎及坏死性肝炎，致死率为52-100％。近年来，食品感染LM而引起的召回或销毁事件也不断发生，给食品行业和国民经济造成了重大损失，已报道的2011年期间全球范围内的食品召回事件高达17起。为此在三十三届食品法典委员会会议上专门设立了《食品中产单核李斯特菌控制守则》等三个议题，许多国家将LM列为严重的食品污染菌和零检出项目。目前，我国对LM的检测主要采用传统的分离培养检测及鉴定、PCR、ELISA和全自动鉴定系统等检测技术，传统的分离培养与生化鉴定一般需要3-7天，检测周期长，操作繁琐；PCR技术需要提取核酸后进行扩增，DNA提取过程中易受到外源核酸的影响，同时食品中的杂质和杂菌均会抑制PCR扩增，造成假阴性的出现；国内市场没有专门针对LM的ELISA试剂盒，所以LM的ELISA检测均需购买国外进口试剂盒，这无疑增加了检测成本，限制了ELISA的广泛应用；全自动鉴定系统价格高昂，很难在基层实验室普及。而且以上检测都存在一个共同的问题——在实际样品的实测中，均需要对食品进行预培养，以期通过增菌过程来提高LM的数量，但这样无疑延长了检测时间，不适合食源性致病菌的快速检测。针对这一实际情况，建立一套专门针对食品中微量LM的灵敏、准确、特异、快速的检测技术，以保证病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检，是食品中微量致病菌检测亟待解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的是为了提高检测食品中微量LM的灵敏性、准确性、特异性问题，而提供单核细胞增生李斯特菌LLO胶体金的制备及初步应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
单核细胞增生李斯特菌LLO胶体金的制备及初步应用，包括如下步骤：
步骤(1)LLO的表达及纯化：
步骤(1.1)hly基因的扩增与克隆：
根据GenBank公布的标准菌株EGDehly基因序列(GenBank:M18970.1)，通过VectorNTI软件设计引物对hly-a/hly-b(hly-a-NdeI：hly-b-XhoI： )(扩增片段1533bp)，并在引物的5’端分别引入NdeI和XhoI的酶切位点(下划线斜体部分)；用高保真聚合酶KODPlusNeopolymerase扩增标准菌株EGDe的hly基因片段，经割胶回收纯化后，通过引入的限制性内切酶NdeI/XhoI，将hly片段连接至原核表达质粒pET30a中，转化入表达感受态细胞Rosetta中；重组质粒pET-30a-hly的鉴定采用靶基因hly的PCR扩增及NdeI/XhoI双酶切鉴定，同时送往北京华大基因科技股份有限公司测序，以确保无移码突变；
步骤(1.2)可溶性LLO的低温诱导表达及纯化：
将测序正确的阳性菌液接入含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时，加入IPTG(终浓度1mmol/L)16℃诱导表达5h，设置梯度摸索最佳诱导时间；将最佳诱导条件下表达的菌液经超声波裂解，分离上清与沉淀并进行SDS-PAGE分析；经镍螯合层析柱纯化获得目的蛋白，SDS-PAGE电泳分析其纯度，利用BCA法测定浓度后加甘油分装，-20℃备用；
步骤(2)抗LLO单克隆抗体的制备及纯化：
根据免疫程序，利用纯化后的重组His-LLO免疫6周龄Balb/c小鼠4次后，取血清抗体效价最高小鼠的脾细胞与杂交瘤细胞进行细胞融合，先后用含HAT和HT的细胞培养基对融合后的细胞进行筛选；间接ELISA检测杂交瘤细胞上清筛选阳性杂交瘤细胞，以His-LLO作为抗原，以杂交瘤细胞上清作为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP作为二抗进行间接ELISA，选出特异性高、敏感性好、细胞生长旺盛的阳性孔有限稀释；3-5次亚克隆后，将阳性单克隆细胞株扩大培养注入石蜡提前致敏的小鼠腹腔，制备腹水，ProtienA/G抗体纯化柱纯化，SDS-PAGE对纯化效果进行分析；
同时取细胞培养上清液，利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定LLO单克隆抗体的免疫球蛋白类型及亚型；
步骤(3)单克隆抗体的鉴定：
步骤(3.1)单克隆抗体效价及亲和力常数的测定：
采用间接ELISA方法测定腹水抗体效价；同时参考肖毅等文献所述方法进行LLO单克隆抗体亲和力常数测定，用2.5和1.25μg/mL的LLO进行包被，倍比稀释已知浓度的单克隆抗体进行间接ELISA测定，酶标仪读波长为450nm处的OD值，将平台期(抗体过量、抗原饱和，该区间内OD450值波动极小)的OD450值记为100％，并根据公式计算单克隆抗体亲和力常数：
Ka＝(n-1)/2(n*Ab1-Ab2)，n＝Ag2/Ag1
式中：Ag1、Ag2为两个不同的抗原包被质量浓度(μg/mL)；Ab1、Ab2为相应抗原包被浓度下OD450值为平台期一半时的对应的抗体摩尔浓度(μmol/mL)；
步骤(3.2)单克隆抗体特异性的测定
应用Westernblot对高亲和力单克隆抗体进行特异性鉴定，将LLO单克隆抗体分别与纯化LLO蛋白、产LLO的单增李斯特菌细菌培养上清液以及其他非单增李斯特菌菌株培养液(金黄色葡萄球菌SaA8、SaATCC25923、猪链球菌2型SS2HA9801、SS205ZYH33)SDS-PAGE，转膜后分别以腹水抗体作用来鉴定单克隆抗体与LLO的反应特异性；
步骤(4)胶体金试纸的研制：
步骤(4.1)胶体金探针的制备：
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，以LLO单克隆抗体标记胶体金，采用差速离心法纯化胶体金探针；
步骤(4.2)试纸的准备：
分别以单克隆抗体1D2D8和4D12C3及羊抗鼠IgG抗体作为试纸的检测线和质控线，包被硝酸纤维素(NC)，组装胶体金试纸条；
步骤(4.3)特异性试验：
利用实验室保存的单增李斯特菌菌株(EGDe、10403S和M7)、金黄色葡萄球菌菌株(A8和ATCC25923)、猪链球菌2型菌株(HA9801和05ZYH33)等革兰氏阳性菌进行胶体金试纸条的特异性试验，同时设PBS和培养基BHI阴性对照组；
步骤(4.4)敏感性试验：
调整单增李斯特菌M7过夜细菌培养液浓度为2.0×109CFU/mL，采用无菌PBS进行10倍梯度稀释，分别为2.0x108、2.0x107、2.0x106、2.0x105、2.0x104及2.0x103CFU/mL，分别经12000rpm离心10min后，取上清液，依次LLO胶体金的敏感性试验；
步骤(4.5)重复性试验：
取单增李斯特菌分离株M7纯过夜培养物，调整细菌浓度为3.0x109CFU/mL,每隔一周检测1次，共检测8次，进行LLO胶体金试剂条的重复性试验，同时设立培养基BHI阴性对照组；
步骤(4.6)稳定性试验：
将试纸条用塑料袋及铝箔密封，加干燥剂于4℃保存，每隔1周检测1次，检测其稳定性，共检测10次，同时设立培养基BHI阴性对照组；
步骤(4.7)人工模拟样品试验：
取市售冷冻虾仁、青占鱼各1g，加入8mL灭菌PBS，再加入1mL浓度为3.0x109CFU/mL、3.0x108CFU/mL、3.0x107CFU/mL、3.0x106CFU/mL、3.0x105CFU/mL和3.0x104CFU/mL的单增李斯特菌M7灭活菌悬液，充分振荡混匀后检测。
本发明提供了抗单核细胞增生李斯特菌单克隆抗体杂交瘤细胞株，解决了可靠的LM单克隆抗体不易获得的问题，经多年多次传代，能稳定分泌单克隆抗体，它分泌的单克隆抗体，应用于胶体金法检测食品中单核细胞增生李斯特氏菌，具有良好的灵敏性、特异性、稳定性和可重复性等优点。病原在浓度很低的情况下也能被检出，进一步提高检测灵敏度和检出率，严防漏检和误检。
附图说明
图1.重组质粒pET30a-hly的PCR鉴定；
图2.可溶性LLO蛋白的表达及Western Blot鉴定，其中：SDS-PAGE B.WesternBlotM：蛋白Marker；1：IPTG诱导空载体的菌体裂解物；2：IPTG诱导重组质粒转化菌的菌体裂解物之上清液；3.IPTG诱导重组质粒转化菌的菌体裂解物的沉淀样品；
图3.可溶性LLO蛋白的纯化，其中：M：蛋白Marker；1：400mM咪唑洗脱；2：200mM咪唑洗脱；3. 100mM咪唑洗脱；4. 50mM咪唑洗脱；5.过柱后；6.过柱前；
图4.BCA法测定LLO蛋白浓度；
图5.LLO单克隆抗体的特异性鉴定，其中：A.SDS-PAGE；B.Western-blot mAb1D2D8；C.Western-blot mAb 4G12C3M.蛋白Marker；1.纯化的LLO蛋白；2.Lm EGDe；3.LmM7；4.Lm 10403S；5.Sa A8；6.Sa ATCC25923；7.SS2HA9801；8.SS2 05ZYH33
图6.LLO胶体金试纸条的特异性试验，其中：1.单增李斯特菌M7；2.金黄色葡萄球菌Sa A8；3.金黄色葡萄球菌Sa ATCC25923；4.猪链球菌2型SS2HA9801；5.猪链球菌2型SS205ZYH33；6.PBS；7.BHI；
图7.LLO胶体金试纸条的敏感性试验，其中：1. 2.0x 109；2. 2.0x 108；3.2.0x107；4. 2.0x 106；5. 2.0x 105；；6. 2.0x 104；
图8.LLO胶体金试纸条的重复性试验，其中：1. 0h；2. 2周；3. 4周；4. 6周；5. 8周；6. 10周；7. 12周；8. 14周；9. 16周；10.阴性对照；
图9.LLO胶体金试纸条的稳定性试验，其中：1. 2周；2. 4周；3. 6周；4. 8周；5.10周；6. 12周；7. 14周；8. 16周；9. 18周；10. 20周；11.BHI。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。
请参阅图1-6本发明提供一种技术方案：单核细胞增生李斯特菌LLO胶体金的制备及初步应用，具体如下步骤：
1材料与方法
1.1材料
1.1.1主要器材
SpectraMaxM5酶标仪购自美国MolecularDevice公司；96孔ELISA酶标板、细胞培养板和细胞培养皿购自美国Corning公司。
1.1.2菌株,质粒，培养基，试剂，引物
原核表达质粒pET30a、Rosetta(DE3)感受态细胞由本实验室保存。单增李斯特菌标准菌株EGDe由丹麦哥本哈根大学Jakobsen教授惠赠，标准菌株10403S、消毒奶分离株M7系本实验室保存；特异性试验中涉及的金黄色葡萄球菌SaA8、SaATCC25923和2型猪链球菌SS2HA9801、SS205ZYH33系由实验室保存。李斯特菌培养基TSB-Y和BHI购自北京陆桥技术有限责任公司。KODPlusNeopolymerase和DNA连接酶LigationHighVer2.0购自东洋坊(上海)生物科技有限公司。DNAMarker、限制性内切酶NdeI、XhoI、连接酶购自TaKaRa宝生物(大连)公司。核酸电泳染料Goldview购自上海赛百盛基因技术有限公司；PCR产物纯化试剂盒、UNIQ-10胶回收试剂盒购于AXYGEN公司。卡那霉素、TaqDNA聚合酶、IPTG和咪唑购自北京鼎国生物技术有限责任公；ProtienA/G抗体纯化柱购自上海悦克生物科技有限公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠和羊抗兔IgG均购自天津三箭生物技术有限公司，TMB显色液购自北京泰天河生物技术有限公司。细胞培养基DMEM、RPMI1640(不含酚红)购自美国Gibco公司。引物由上海捷瑞生物有限公司合成。
1.1.3实验动物
6周龄BALB/c雌性小鼠购自浙江中医药大学实验动物中心。骨髓瘤细胞SP2/0等为本实验室保存。
1.2LLO的表达及纯化
1.2.1hly基因的扩增与克隆
根据GenBank公布的标准菌株EGDehly基因序列(GenBank:M18970.1)，通过VectorNTI软件设计引物对hly-a/hly-b(hly-a-NdeI：hly-b-XhoI： )(扩增片段1533bp)，并在引物的5’端分别引入NdeI和XhoI的酶切位点(下划线斜体部分)。用高保真聚合酶KODPlusNeopolymerase扩增标准菌株EGDe的hly基因片段，经割胶回收纯化后，通过引入的限制性内切酶NdeI/XhoI，将hly片段连接至原核表达质粒pET30a中，转化入表达感受态细胞Rosetta中。重组质粒pET-30a-hly的鉴定采用靶基因hly的PCR扩增及NdeI/XhoI双酶切鉴定，同时送往北京华大基因科技股份有限公司测序，以确保无移码突变。
1.2.2可溶性LLO的低温诱导表达及纯化
将测序正确的阳性菌液接入含有卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时，加入IPTG(终浓度1mmol/L)16℃诱导表达5h，设置梯度摸索最佳诱导时间。将最佳诱导条件下表达的菌液经超声波裂解，分离上清与沉淀并进行SDS-PAGE分析。经镍螯合层析柱纯化获得目的蛋白，SDS-PAGE电泳分析其纯度，利用BCA法测定浓度后加甘油分装，-20℃备用。
1.3抗LLO单克隆抗体的制备及纯化
根据免疫程序，利用纯化后的重组His-LLO免疫6周龄Balb/c小鼠4次后，取血清抗体效价最高小鼠的脾细胞与杂交瘤细胞进行细胞融合，先后用含HAT和HT的细胞培养基对融合后的细胞进行筛选。间接ELISA检测杂交瘤细胞上清筛选阳性杂交瘤细胞，以His-LLO作为抗原，以杂交瘤细胞上清作为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP作为二抗进行间接ELISA，选出特异性高、敏感性好、细胞生长旺盛的阳性孔有限稀释。3-5次亚克隆后，将阳性单克隆细胞株扩大培养注入石蜡提前致敏的小鼠腹腔，制备腹水，ProtienA/G抗体纯化柱纯化，SDS-PAGE对纯化效果进行分析。
同时取细胞培养上清液，利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定LLO单克隆抗体的免疫球蛋白类型及亚型。
1.4单克隆抗体的鉴定
1.4.1单克隆抗体效价及亲和力常数的测定
采用间接ELISA方法测定腹水抗体效价。同时参考肖毅等文献所述方法进行LLO单克隆抗体亲和力常数测定，用2.5和1.25μg/mL的LLO进行包被，倍比稀释已知浓度的单克隆抗体进行间接ELISA测定，酶标仪读波长为450nm处的OD值，将平台期(抗体过量、抗原饱和，该区间内OD450值波动极小)的OD450值记为100％，并根据公式计算单克隆抗体亲和力常数：
Ka＝(n-1)/2(n*Ab1-Ab2)，n＝Ag2/Ag1
式中：Ag1、Ag2为两个不同的抗原包被质量浓度(μg/mL)；Ab1、Ab2为相应抗原包被浓度下OD450值为平台期一半时的对应的抗体摩尔浓度(μmol/mL)。
1.4.2单克隆抗体特异性的测定
应用Westernblot对高亲和力单克隆抗体进行特异性鉴定，将LLO单克隆抗体分别与纯化LLO蛋白、产LLO的单增李斯特菌细菌培养上清液以及其他非单增李斯特菌菌株培养液(金黄色葡萄球菌SaA8、SaATCC25923、猪链球菌2型SS2HA9801、SS205ZYH33)SDS-PAGE，转膜后分别以腹水抗体作用来鉴定单克隆抗体与LLO的反应特异性。
1.5胶体金试纸的研制
1.5.1胶体金探针的制备
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，以LLO单克隆抗体标记胶体金，采用差速离心法纯化胶体金探针。
1.5.2试纸的准备
分别以单克隆抗体1D2D8和4D12C3及羊抗鼠IgG抗体作为试纸的检测线和质控线，包被硝酸纤维素(NC)，组装胶体金试纸条。
1.5.3特异性试验
利用实验室保存的单增李斯特菌菌株(EGDe、10403S和M7)、金黄色葡萄球菌菌株(A8和ATCC25923)、猪链球菌2型菌株(HA9801和05ZYH33)等革兰氏阳性菌进行胶体金试纸条的特异性试验，同时设PBS和培养基BHI阴性对照组。
1.5.4敏感性试验
调整单增李斯特菌M7过夜细菌培养液浓度为2.0×109CFU/mL，采用无菌PBS进行10倍梯度稀释，分别为2.0x108、2.0x107、2.0x106、2.0x105、2.0x104及2.0x103CFU/mL，分别经12000rpm离心10min后，取上清液，依次LLO胶体金的敏感性试验。
1.5.5重复性试验
取单增李斯特菌分离株M7纯过夜培养物，调整细菌浓度为3.0x109CFU/mL,每隔一周检测1次，共检测8次，进行LLO胶体金试剂条的重复性试验，同时设立培养基BHI阴性对照组。
1.5.6稳定性试验
将试纸条用塑料袋及铝箔密封，加干燥剂于4℃保存，每隔1周检测1次，检测其稳定性，共检测10次，同时设立培养基BHI阴性对照组。
1.5.7人工模拟样品试验
取市售冷冻虾仁、青占鱼各1g，加入8mL灭菌PBS，再加入1mL浓度为3.0x109CFU/mL、3.0x108CFU/mL、3.0x107CFU/mL、3.0x106CFU/mL、3.0x105CFU/mL和3.0x104CFU/mL的单增李斯特菌M7灭活菌悬液，充分振荡混匀后检测。
1.5.8实际海产品中LLO胶体金试剂条的初步应用
2016年12月至2017年9月采集杭州、宁波、舟山菜市场海产品样本(黄鱼、贻贝、虾仁)，共计500份样品(如下表2)。样品按照规定冷冻或冷藏保存，8h内送实验室检验，并按照GB4789.30-2010进行检测，同时用本实验室建立的PCR方法[]和本项目建立的胶体金检测方法进行检测，以比较三种方法之间的重合度。
表2.海产品中单增李斯特菌不同检测方法检出率比较
2结果
2.1重组质粒pET30a-hly的鉴定
将可疑重组质粒pET30a-hly进行hly片段的PCR扩增，能得到1500bp的条带，对其进行NdeI/XhoI双酶切后，能得到约1500bp和5400bp的片段，与预期条带大小相符。测序结果经DNAstarMegalign分析，与GenBank:M18970.1核苷酸的同源性为100％，无任何突变，可进行后续的诱导表达。
2.2融合蛋白LLO的表达及Western-blot分析
阳性转化子经IPTG(终浓度1mmol/L)16℃低温诱导表达12h后表达量理想，收集菌体超声波破碎后经SDS-PAGE发现LLO重组蛋白系可溶性表达，主要位于上清中。LLO重组蛋白大小在57KD左右，与预期相符。收集重组质粒Rosetta-pET30a-hly经IPTG16℃诱导12h后的菌体裂解上清，通过镍柱纯化获得高纯度的重组LLO蛋白。经BCA法测定，原核蛋白LLO的浓度为2mg/mL(图4)。
2.3单克隆抗体亚型鉴定与效价测定
经细胞融合与克隆筛选，共获得5株LLO单克隆抗体杂交瘤细胞，分别为1D2D8、4G12C3、6D11F10、8C8B9和9F1C5。其中6D11F10为IgG1亚型，而1D2D8、4G12C3、8C8B9和9F1C5为IgG2b亚型(表1)。
间接ELISA方法测定腹水抗体效价，1D2D8和4G12C3效价最高，均高于200000，8C8B9和6D11F10两株抗体效价接近，大于30000，而细胞株9F1C5抗体效价最低(<3000)，弃去(表1)。亲和常数4G12C3>1D2D8>6D11F10>8C8B9>9F1C5，分别为1.25×108、3.28×108、5.97×107、6.38×107、2.57×106L/mol，综合上述效价及亲和力结果，选择细胞株1D2D8和4G12C3进行后续胶体金试验。
表1.LLO单克隆抗体的亚型及效价
2.4单克隆抗体特异性的测定
LLO单克隆抗体与纯化的LLO蛋白、单增李斯特菌标准菌株EGDe、10403S及分离株M7上清液具有良好的反应性，而与金黄色葡萄球菌(SaA8和SaATCC25923)及猪链球菌2型细菌(SS2HA9801和SS205ZYH33)上清培养物均无交叉反应，表明LLO单抗特异性较好(图5)。
2.5胶体金试纸的研制
2.5.1特异性试验
如图6所示，本试纸条特异性较高，仅与单增李斯特菌分离株M7发生反应，不与金黄色葡萄球菌分离株A8、ATCC25923、2型猪链球菌SS2HA9801、SS205ZYH33等其它革兰氏阳性菌株发生交叉反应，阴性对照PBS和BHI均亦只有一条质控线，表明该试剂条特异性较高。
2.5.2敏感性试验
如图7所示，细菌浓度为2.0x108、2.0x107、2.0x106、2.0x105CFU/mL时均能被LLO胶体金试剂条检出，其中2.0x105CFU/mL条带较弱。而当细菌浓度为2.0x104CFU/mL，只有质控线(图7)，表明本试验建立的LLO胶体金试纸敏感性为2.0x105CFU/mL。
2.5.2重复性试验
如图8所示，8次(第16周)均能特异性地检出单增李斯特菌M7纯培养物，而阴性对照组只有质控条带，表明本实验建立的LLO试剂条具有较高的重复性。
2.5.3稳定性试验
结果表明,密封保存于4℃的LLO试纸条在保存20周后仍可特异地检出单增李斯特菌分离株M7培养上清液,而且敏感性没有显著降低(图9)，而培养基BHI阴性对照组只有质控条带，表明LLO胶体金试纸条稳定性较高。
2.5.4模拟样品试验
在人工污染样品中，当细菌浓度高于或等于3.0x105CFU/mL,可通过本研究研制的胶体金试纸条检出。因而在人工污染实验中，LLO检测的灵敏度为3.0x105CFU/mL，与纯细菌培养物检测结果基本一致。
2.5.5实际海产品中的初步应用
利用实验室之前建立的PCR鉴定体系和国家规定的标准方法GB4789.30-201，对500份样品进行检测。结果表明，PCR方法及国标方法结果一致，500份海产品样品中单增李斯特菌的检出率为2.20％(11/500)。采用本项目建立的胶体金试剂条检出率为2.00％(10/500)，敏感度略低于PCR及国标检测方法。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.单核细胞增生李斯特菌LLO胶体金的制备及初步应用，其特征在于，包括如下步骤：
步骤(1)LLO的表达及纯化：
步骤(1.1)hly基因的扩增与克隆：
根据GenBank公布的标准菌株EGDehly基因序列，通过VectorNTI软件设计引物对hly-a/hly-b(hly-a-NdeI：5’-ACTCATATGAAGGATGCATCTGCATTCAAT-3’；hly-b-XhoI：5’-TTACTCGAGTTCGATTGGATTATCTACTTTAT-3’，并在引物的5’端分别引入NdeI和XhoI的酶切位点；用高保真聚合酶KOD Plus Neo polymerase扩增标准菌株EGDe的hly基因片段，经割胶回收纯化后，通过引入的限制性内切酶NdeI/XhoI，将hly片段连接至原核表达质粒pET30a中，转化入表达感受态细胞Rosetta中；重组质粒pET-30a-hly的鉴定采用靶基因hly的PCR扩增及NdeI/XhoI双酶切鉴定，同时送往北京华大基因科技股份有限公司测序，以确保无移码突变；
步骤(1.2)可溶性LLO的低温诱导表达及纯化：
将测序正确的阳性菌液接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600为0.6时，加入IPTG16℃诱导表达5h，设置梯度摸索最佳诱导时间；将最佳诱导条件下表达的菌液经超声波裂解，分离上清与沉淀并进行SDS-PAGE分析；经镍螯合层析柱纯化获得目的蛋白，SDS-PAGE电泳分析其纯度，利用BCA法测定浓度后加甘油分装，-20℃备用；
步骤(2)抗LLO单克隆抗体的制备及纯化：
根据免疫程序，利用纯化后的重组His-LLO免疫6周龄Balb/c小鼠4次后，取血清抗体效价最高小鼠的脾细胞与杂交瘤细胞进行细胞融合，先后用含HAT和HT的细胞培养基对融合后的细胞进行筛选；间接ELISA检测杂交瘤细胞上清筛选阳性杂交瘤细胞，以His-LLO作为抗原，以杂交瘤细胞上清作为一抗，以羊抗鼠IgG-HRP作为二抗进行间接ELISA，选出特异性高、敏感性好、细胞生长旺盛的阳性孔有限稀释；3-5次亚克隆后，将阳性单克隆细胞株扩大培养注入石蜡提前致敏的小鼠腹腔，制备腹水，Protien A/G抗体纯化柱纯化，SDS-PAGE对纯化效果进行分析；
同时取细胞培养上清液，利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒鉴定LLO单克隆抗体的免疫球蛋白类型及亚型；
步骤(3)单克隆抗体的鉴定：
步骤(3.1)单克隆抗体效价及亲和力常数的测定：
采用间接ELISA方法测定腹水抗体效价；同时参考肖毅等文献所述方法进行LLO单克隆抗体亲和力常数测定，用2.5和1.25μg/mL的LLO进行包被，倍比稀释已知浓度的单克隆抗体进行间接ELISA测定，酶标仪读波长为450nm处的OD值，将平台期的OD450值记为100％，并根据公式计算单克隆抗体亲和力常数：
Ka＝(n-1)/2(n*Ab1-Ab2)，n＝Ag2/Ag1
式中：Ag1、Ag2为两个不同的抗原包被质量浓度；Ab1、Ab2为相应抗原包被浓度下OD450值为平台期一半时的对应的抗体摩尔浓度；
步骤(3.2)单克隆抗体特异性的测定
应用Western blot对高亲和力单克隆抗体进行特异性鉴定，将LLO单克隆抗体分别与纯化LLO蛋白、产LLO的单增李斯特菌细菌培养上清液以及其他非单增李斯特菌菌株培养液SDS-PAGE，转膜后分别以腹水抗体作用来鉴定单克隆抗体与LLO的反应特异性；
步骤(4)胶体金试纸的研制：
步骤(4.1)胶体金探针的制备：
采用柠檬酸钠还原法制备胶体金，以LLO单克隆抗体标记胶体金，采用差速离心法纯化胶体金探针；
步骤(4.2)试纸的准备：
分别以单克隆抗体1D2D8和4D12C3及羊抗鼠IgG抗体作为试纸的检测线和质控线，包被硝酸纤维素，组装胶体金试纸条；
步骤(4.3)特异性试验：
利用实验室保存的单增李斯特菌菌株、金黄色葡萄球菌菌株、猪链球菌2型菌株革兰氏阳性菌进行胶体金试纸条的特异性试验，同时设PBS和培养基BHI阴性对照组；
步骤(4.4)敏感性试验：
调整单增李斯特菌M7过夜细菌培养液浓度为2.0×109CFU/mL，采用无菌PBS进行10倍梯度稀释，分别为2.0x 108、2.0x 107、2.0x 106、2.0x 105、2.0x 104及2.0x 103CFU/mL，分别经12000rpm离心10min后，取上清液，依次LLO胶体金的敏感性试验；
步骤(4.5)重复性试验：
取单增李斯特菌分离株M7纯过夜培养物，调整细菌浓度为3.0x109CFU/mL,每隔一周检测1次，共检测8次，进行LLO胶体金试剂条的重复性试验，同时设立培养基BHI阴性对照组；
步骤(4.6)稳定性试验：
将试纸条用塑料袋及铝箔密封，加干燥剂于4℃保存，每隔1周检测1次，检测其稳定性，共检测10次，同时设立培养基BHI阴性对照组；
步骤(4.7)人工模拟样品试验：
取市售冷冻虾仁、青占鱼各1g，加入8mL灭菌PBS，再加入1mL浓度为3.0x109CFU/mL、3.0x108CFU/mL、3.0x107CFU/mL、3.0x106CFU/mL、3.0x105CFU/mL和3.0x104CFU/mL的单增李斯特菌M7灭活菌悬液，充分振荡混匀后检测。
2.根据权利要求1中所述的单核细胞增生李斯特菌LLO胶体金的制备及初步应用，其特征在于，步骤(3.1)中所述其他非单增李斯特菌菌株培养液是指金黄色葡萄球菌SaA8、SaATCC25923、猪链球菌2型SS2HA9801、SS2 05ZYH33。
3.根据权利要求1中所述的单核细胞增生李斯特菌LLO胶体金的制备及初步应用，其特征在于，步骤(4.3)中单增李斯特菌菌株为为EGDe、10403S和M7，金黄色葡萄球菌菌株为A8和ATCC25923，猪链球菌2型菌株为HA9801和05ZYH33。
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Application publication date: 20180629

Assignee: Zhejiang Shangguo New Energy Co.,Ltd.

Assignor: NINGBO College OF HEALTH SCIENCES

Contract record no.: X2022980027222

Denomination of invention: Preparation and preliminary application of LLO colloidal gold from Listeria monocytogenes

Granted publication date: 20201027

License type: Common License

Record date: 20221214