CN101759780B - 可溶性肝抗原t细胞抗原表位及由其制备的检测试剂盒 - Google Patents
可溶性肝抗原t细胞抗原表位及由其制备的检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了自身免疫性肝炎的可溶性肝抗原T细胞抗原表位，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。T细胞抗原表位的认识和确定扩展了对这种疾病的认识角度；该抗原表位中的一种或多种的组合可用于制备检测自身免疫性肝炎试剂盒的应用。本发明所述的可溶性肝抗原T细胞抗原表位制备的试剂盒检测的敏感性和特异性均高于现有检测试剂盒水平。本发明所得到的可溶性肝抗原T细胞抗原表位方法简便准确，利用该表位制备的试剂盒成本低廉，且效果显著，具有很好的应用价值和市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种T细胞抗原表位，尤其涉及一种自身免疫性肝炎可溶性肝抗原T细胞表位及由其制备成的检测试剂盒，属于免疫学领域。
背景技术
抗原表位：免疫细胞通常难以识别整个抗原分子，而仅识别抗原大分子上的一个特定的部分，称为表位(epitope)或抗原决定簇(antigenicdeterminant)。因而表位代表了抗原分子上的一个免疫活性区，负责与免疫细胞表面的抗原受体或游离的抗体分子相结合。严格说来，抗体的特异性是针对表位而不是针对完整的抗原分子。T、B细胞往往识别抗原分子上的不同表位。
确定T细胞表位，对于研究疾病的发生过程和机理、提高疾病诊断能力、判断治疗效果以及研制新的治疗方法等都具有重要意义。在已知抗原一级结构的条件下，研究T细胞表位通常的策略是，根据抗原蛋白的氨基酸序列随机合成或连续合成一个或几个重叠氨基酸的一系列肽段，通过淋巴细胞功能实验确定可以被T细胞识别的肽段。这种方法的优点是鉴定的T细胞表位较可靠，且能发现一些不符合多肽结合基序(motif)的MHC结合抗原肽；缺点是盲目性大，浪费人力和物力，此外由于MHC分子高度的多态性也可能造成漏检。因此，在合成肽段之前，如果对其与MHC分子结合的可能性进行预测，先筛选出最有可能的一些抗原片段，这样不仅可减少工作量、节省花费，而且还能提高实验的成功率。在经费有限的情况下，它成为确定T细胞表位的首选方法。
而重叠肽技术与细胞功能分析方法相结合的方法不但可以直接筛查T细胞抗原表位，而且经计算机预测的抗原表位同样也需要用该方法进行验证。在诸多的细胞功能分析方法中，酶联斑点免疫方法是最为灵敏的方法，可以用来检测识别低频率EPITOPE的特异性免疫细胞。
自身免疫性肝炎(AIH)是迄今为止国内外公认比较难于确诊的一种肝病，特别是在中国，由于病毒性肝炎患者巨多，常常掩盖了AIH，许多AIH患者多年得不到确诊和正确的治疗，浪费大量财力物力，缩短了患者的生存期。AIH诊断的难点主要是缺乏特异性的诊断指标，它最常见的抗核抗体在很多疾病中都会阳性，而对自身免疫性肝炎并不能提供确诊的价值。而本专利研究的可溶性肝抗原(SLA)是近年来备受关注的AIH靶抗原之一，其对应的自身抗体SLA/LP抗体具有确定诊断的价值。Wies等报告2000例肝病患者中仅有AIH和AIH重叠综合症患者中出现抗SLA/LP阳性，认为其具有高度的AIH疾病特异性(100％)。经研究证实SLA/LP两者针对的是同一抗原性物质，即分子量为50KD细胞溶质分子UGA抑制物tRNA相关蛋白，此蛋白参与细胞硒蛋白(Selenprotein)的生物合成与调节，因此推测抗SLA/LP抗体可能对肝细胞有破坏作用。不容置疑，SLA/LP抗体与其相应的靶抗原一道不失为诠释AIH致病机制的有效途径，并由其高度的特异性而为AIH特异性诊断指标的开发提供了新的目标。
AIH患者自身抗体可在病情不同时期出现抗体滴度波动或抗体消失、重现等变化。这种变化在ANA或SMA均较为常见。在本研究中对SLA/LP抗体滴度与患者肝炎活动指标进行相关性分析，未发现SLA/LP抗体滴度与AIH肝脏炎症活动度的相关性；动态观察AIH患者在发病初期、病情缓解期及复发期SLA/LP抗体滴度消长情况，发现SLA/LP抗体滴度并未随病情的变化而变化。现有技术对自身免疫性肝炎自身抗体方面的检测均为体液免疫检测，如ELISA、免疫印迹法等检测手段，采用ELISA方法检测SLA/LP抗体的敏感性差，只为16.7％，且检测手段繁复。可见，SLA/LP抗体虽然是诊断AIH的特异性指标，但该抗体灵敏度较低，并且不反映AIH患者肝脏炎症程度及疾病状态。由此，我们将探索的思路集中在对SLA特异性T细胞免疫研究方面。
在自身免疫性肝炎研究领域现有的筛查T细胞抗原表位的技术方案为采用合成全序列肽段结合T细胞增殖试验，即在肽段的刺激下，观察细胞的增殖指数。其主要操作如下：
1、合成覆盖目标蛋白的全序列的重叠肽段，每相邻两条肽段有部分相同的氨基酸序列。
2、分离研究对象的外周血单个核细胞(PBMC)，在一定细胞浓度下，细胞接受不同肽段的刺激，共培养7天，以期待细胞增殖，氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。将细胞收集到玻璃纤维滤纸上，用β液闪仪检测，用增殖指数来判定细胞受刺激后的增殖情况。借以判定蛋白上有效的肽段。
该方案存在以下缺点：1、试验时间长，增加了污染假阳性的几率；2、细胞用量大，增加了实验成本；3、实验过程中未体现实验的重复性；4、实验不能同时提示细胞受刺激后细胞因子分泌情况；5、实验中需要放射性同位素，不环保；6、敏感性较差。
综上所述，目前存在的主要技术问题：
自身免疫性肝炎缺乏高特异性的诊断方式和指标。
目前诊断AIH的方法都是基于体液免疫的，缺乏细胞免疫研究在临床的应用。
针对SLA这种疾病靶抗原的T细胞免疫国内没有研究。
4.在观察T细胞功能方面采用的方法灵敏度较差。
发明内容
本发明的一个目的是提供自身免疫性肝炎可溶性肝抗原T细胞抗原表位，使人们可以从另一个角度(细胞免疫)认识这种疾病的规律，并且利用本发明提供的抗原表位制备成检测自身免疫性肝炎的试剂盒，具有很高的敏感性和特异性。
本发明另一发明目的是提供由该可溶性肝抗原T细胞抗原表位制备的检测自身免疫性肝炎的试剂盒。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
可溶性肝抗原T细胞抗原表位，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示。
上述抗原表位中的一种或几种的组合在制备检测自身免疫性肝炎试剂盒中的应用。
一种检测自身免疫性肝炎试剂盒，其含有上述的可溶性肝抗原T细胞抗原表位中的一种或多种的组合。上述的表位在制备试剂盒中为人工合成多肽。
上述检测自身免疫性肝炎试剂盒，该试剂盒还包括：96孔PVDF膜覆盖的ELISPOT板、IFN-γ包被抗体、生物素标记的IFN-γ检测抗体、亲和素标记的碱性磷酸酶、酶促反应底物、含10％胎牛血清的RPMI培养液、植物血凝素(PHA)作为阳性对照和PH7.2PBS。
上述的一种检测自身免疫性肝炎试剂盒，其中，可溶性肝抗原T细胞抗原表位组合终浓度为10μg/ml。
上述抗原表位的制备方法为：首先设计二维肽库，经肽库反应预测可能反应的单肽，然后进行单肽刺激PBMC进行确证实验；酶联免疫斑点法观察研究对象PBMC受SLA肽库/单肽刺激后IFN-γ分泌情况。
本发明技术方案的有益效果为：
经本发明制备得到的SLA 7条抗原表位，刺激外周血单个核细胞，结合ELISPOT方法，制备的试剂盒在检测自身免疫性肝炎(AIH)的时候(1)可以提高AIH的阳性率和确诊率，因为这一指标对AIH检测特异性非常高；现有技术敏感性只能达到16.7％，而本发明的敏感性可达到53.66％；并且本发明试剂盒的特异性高达98.57％。(2)有助于鉴别自身免疫性肝炎还是其他肝病引起的自身免疫反应，尤其是在我国最常见的乙型肝炎和丙型肝炎，也经常出现自身抗体，但是鉴别这两种情况非常关键，因为乙型丙型肝炎与AIH采用完全不同的治疗思路。本发明SLA特异性抗原表位的认识和检测可以协助临床做出明确的鉴别，有效的减少误诊误治。(3)本发明试剂盒检测指标可以作为临床治疗效果的观察指标，产生良好疗效者，SLA抗原表位的反应与疗效不佳者有明显区别。(4)由于SLA抗体具有高度疾病特异性(99％～100％)，因此，本发明所提供的SLA抗原表位的认识是研究自身免疫性肝炎发病机理的一个极好突破口。(5)本发明采用SLA抗原表位制备的检测试剂盒用于检测AIH的方法为细胞学检测。现有技术对AIH的检测一般采用体液检测，本领域技术人员长期以来一直无法正确认识细胞免疫在AIH诊断中的作用，特别是忽视了SLA特异性T细胞反应与临床诊断之间有可能存在的关系，并一直认为SLA可溶性抗原表位的合成是非常繁复的过程，制备过程中需要用到放射性物质，最终制备出可溶性抗原表位的几率极小，且功能性不强。本发明正是针对这种技术偏见做出的，经过实验设计出合理、简便快速的合成方法，最终得到的7条肽段制备检测试剂盒检测敏感度和特异度均有大幅度提升。
附图说明
图1为本发明合成的54条SLA序列肽p1-p54的ELISPOT反应结果图。
具体实施方式
实施例1
1、SLA合成肽的制备
采用重叠肽技术合成SLA序列肽，从人类基因文库中调取SLA蛋白基因序列，及其所对应的SLA蛋白氨基酸序列(NP722547，441个氨基酸)。设计重叠肽段：每条肽段长20个氨基酸，重叠12个氨基酸，共合成SLA序列肽54条，合成肽纯度＞75％。各肽段氨基酸序列如表1所示。
表1
| No. | 氨基酸位置 | 肽序列 |
| 1 | 1-20 | MDSNNFLGNCGVGEREGRVA |
| 2 | 9-28 | NCGVGEREGRVASALVARRH |
| 3 | 17-36 | GRVASALVARRHYRFIHGIG |
| 4 | 25-44 | ARRHYRFIHGIGRSGDISAV |
| 5 | 33-52 | HGIGRSGDISAVQPKAAGSS |
| 6 | 41-60 | ISAVQPKAAGSSLLNKITNS |
| 7 | 49-68 | AGSSLLNKITNSLVLDIIKL |
| 8 | 57-76 | ITNSLVLDIIKLAGVHTVAN |
| 9 | 65-84 | IIKLAGVHTVANCFVVPMAT |
| 10 | 73-92 | TVANCFVVPMATGMSLTLCF |
| 11 | 81-100 | PMATGMSLTLCFLTLRHKRP |
| 12 | 89-108 | TLCFLTLRHKRPKAKYIIWP |
| 13 | 97-116 | HKRPKAKYIIWPRIDQKSCF |
| 14 | 105-124 | IIWPRIDQKSCFKSMITAGF |
| 15 | 113-132 | KSCFKSMITAGFEPVVIENV |
| 16 | 121-140 | TAGFEPVVIENVLEGDELRT |
| 17 | 129-148 | IENVLEGDELRTDLKAVEAK |
| 18 | 137-156 | ELRTDLKAVEAKVQELGPDC |
| 19 | 145-164 | VEAKVQELGPDCILCIHSTT |
| 20 | 153-172 | GPDCILCIHSTTSCFAPRVP |
| 21 | 161-180 | HSTTSCFAPRVPDRLEELAV |
| 22 | 169-188 | PRVPDRLEELAVICANYDIP |
| 23 | 177-196 | ELAVICANYDIPHIVNNAYG |
| 24 | 185-204 | YDIPHIVNNAYGVQSSKCMH |
| 25 | 193-212 | NAYGVQSSKCMHLIQQGARV |
| 26 | 201-220 | KCMHLIQQGARVGRIDAFVQ |
| 27 | 209-228 | GARVGRIDAFVQSLDKNFMV |
| 28 | 217-236 | AFVQSLDKNFMVPVGGAIIA |
| 29 | 225-244 | NFMVPVGGAIIAGFNDSFIQ |
| 30 | 233-252 | AIIAGFNDSFIQEISKMYPG |
| 31 | 241-260 | SFIQEISKMYPGRASASPSL |
| 32 | 249-268 | MYPGRASASPSLDVLITLLS |
| 33 | 257-276 | SPSLDVLITLLSLGSNGYKK(L) |
| 34 | 265-284 | TLLSLGSNGYKKLLKERKEM |
| 35 | 273-292 | GYKKLLKERKEMFSYLSNQI |
| 36 | 281-300 | RKEMFSYLSNQIKKLSEAYN |
| 37 | 289-308 | SNQIKKLSEAYNERLLHTPH |
| 38 | 297-316 | EAYNERLLHTPHNPISLAMT |
| 39 | 305-324 | HTPHNPISLAMTLKTLDEHR |
| 40 | 313-332 | LAMTLKTLDEHRDKAVTQLG |
| 41 | 321-340 | DEHRDKAVTQLGSMLFTRQV |
| 42 | 329-348 | TQLGSMLFTRQVSGARVVPL |
| 43 | 337-356 | TRQVSGARVVPLGSMQTVSG |
| 44 | 345-364 | VVPLGSMQTVSGYTFRGFMS |
| 45 | 353-372 | TVSGYTFRGFMSHTNNYPCA |
| 46 | 361-380 | GFMSHTNNYPCAYLNAASAI |
| 47 | 369-388 | YPCAYLNAASAIGMKMQDVD |
| 48 | 377-396 | ASAIGMKMQDVDLFIKRLDR |
| 49 | 385-404 | QDVDLFIKRLDRCLKAVRKE |
| 50 | 393-412 | RLDRCLKAVRKERSKESDDN |
| 51 | 401-420 | VRKERSKESDDNYDKTEDVD |
| 52 | 409-428 | SDDNYDKTEDVDIEEMALKL |
| 53 | 417-436 | EDVDIEEMALKLDNVLLDTY |
| 54 | 422-441 | EEMALKLDNVLLDTYQDASS |
2、设计肽库(peptide Pool)：采用二维肽库设计。
设计肽库如下：每条肽分别在横向、纵向肽库中各出现一次。通过反应的横向肽库与纵向肽库的交叉，预测阳性反应单肽。共形成肽库15个，纵向肽库8个，横向肽库7个。每个肽库中任何一条单肽的浓度为20μg/ml。经肽库反应预测可能反应的单肽，然后进行单肽刺激PBMC进行确证实验。如表2所示；
表2二维肽库设计
| 横向肽号纵向 | Pool1 | Pool2 | Pool3 | Pool4 | Pool5 | Pool6 | Pool7 | Pool8 |
| Pool9 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 |
| PooL10 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | 16 |
| Pool11 | 17 | 18 | 19 | 20 | 21 | 22 | 23 | 24 |
| Pool12 | 25 | 26 | 27 | 28 | 29 | 30 | 31 | 32 |
| Pool13 | 33 | 34 | 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 40 |
| Pool14 | 41 | 42 | 43 | 44 | 45 | 46 | 47 | 48 |
| Pool15 | 49 | 50 | 51 | 52 | 53 | 54 | - | - |
3、酶联免疫斑点法(enzyme-linked immunospot assays，ELISPOT)观察研究对象PBMC受SLA肽库/单肽刺激后IFN-γ分泌情况。
ELISPOT实验流程如下：
第一日
包被ELISPOT板：1∶100比例将包被抗体(1-D1K)稀释于高压灭菌的PBS中，PH7.4。在生物安全柜中打开FLISPOT板，每孔加入50μl稀释的包被抗体，4℃过夜。
细胞复苏与计数
取入选对象冻存在液氮中的PBMC，迅速投入37℃水浴箱中，轻轻晃动，待冻存管中的液体达到半冰状态，移出水浴箱，迅速擦干管外水滴，将管内液体移到预加温的9ml牛血清中，离心1500rpm×5分钟，弃上清，弹起管底细胞团，向管中加入预加温的含有10％胎牛血清RPMI-164010ml，离心1500rpm×5分钟，弹起管底细胞团，加入含有10％胎牛血清的RPMI 5ml，取10μl与10μl 2％的台酚兰染色液混合，计数细胞数及存活率。其余细胞液放置37℃孵育箱中过夜。
第二日
弃去ELISPOT板中液体，用灭菌PBS洗板6次，每孔200μl；每孔加入含有10％胎牛血清的RPMI 200μl封闭，室温孵育1小时。
细胞准备：将37℃CO2孵箱中过夜的细胞取出，混匀，再次计数，计算细胞存活率；1500rpm×5分钟水平离心，弃去上清，轻轻弹起管底细胞团，加入适量R20液，将细胞浓度调整到4×106/ml，每孔加入细胞悬液50μl，再加入50μl的SLA肽，混匀。每例患者设一孔阳性对照，1-2孔阴性对照，植物血凝素PHA作为阳性对照，终浓度10ug/ml，阴性对照内用RPMI-1640代替SLA肽，其余所加试剂与其他实验孔相同。平移ELISPOT板置37℃，5％CO2细胞培养箱，过夜培养。
第三日
倾去ELISPOT板孔中细胞培养液，用含有0.05％TWEEN 20的PBS洗板6次，每孔200μl，每次洗板，弃去洗液后在洁净的纸巾上轻叩ELISPOT板，除去残余液体。按说明书要求比例稀释检测抗体，每孔加入稀释检测抗体50μl，室温孵育2-4小时。
弃去板中液体，洗板同上步，洗板6次，按说明书书要求比例加入稀释的生物素标记的碱性磷酸酶50μl，室温孵育45-60分钟。
洗板同上步。按水∶显色液(A∶B)：9.6∶0.4∶0.1∶0.1的比例配制显色液，每孔加入显色液100μl，待反应斑点不再增加、颜色不再变深，自来水洗板终止反应。
避光处自然晾干ELISPOT板，读板机统一条件下读板。
4、通过肽库筛选出的单肽再次经过ELISPOT验证，使制备结果具有重复性及严谨性。
54条SLA肽段中阳性频率大于25％的肽段包括：肽3 aa17-36(28.57％)、肽4aa25-44(64.29％)、肽9 aa65-84(28.57％)、肽11 aa81-100(42.86％)、肽12 aa89-108(64.28)、肽20 aa153-172(28.57％)，肽44 aa345-364(35.71％)，其中肽3与肽4、肽11与肽12为重叠肽。
54条SLA肽段中平均反应强度大于60SFU(斑点形成单位)/106PBMCs的肽段包括：肽3(SEQ ID No.1)、肽4(SEQ ID No.2)、肽9(SEQ ID No.3)、肽11(SEQ ID No.4)、肽20(SEQ ID No.5)、肽44(SEQ ID No.6)、肽52(SEQ ID No.7)。其中肽3、肽4、肽9、肽10、肽11、肽20、肽44反应强度与反应频率较为一致。而肽段12反应的阳性频率较高而反应强度稍弱，肽段52反应强度较强而反应的阳性频率较低，如图1所示。
实验同时验证上述SLA肽段可刺激T细胞产生IFN-γ，证明SLA借助Th1类细胞因子途径发挥免疫作用。
进一步对数据进行分析，发现SLA诱导的T细胞免疫反应强度及宽度与AIH患者的肝脏验证活动程度有正相关关系，这对研究AIH尚不明了的发病机制具有重要意义。
实施例2制备检测自身免疫性肝炎的试剂盒
试剂盒制备所需材料：
96孔PVDF膜覆盖的ELISPOT板
1、IFN-γ包被抗体
2、生物素标记的IFN-γ检测抗体
3、SLA肽段组合(终浓度10μg/ml)
由SEQ ID No.1至SEQ ID No.7组成。本发明具体实施方式为本发明最佳实施方式，试剂盒由7条肽段(SEQ ID No.1至SEQ ID No.7)组合，本发明所述7条肽段中的一条或多条(非七条)组合也是可以实现最终的检测结果的，但是较之7条肽段的组合方式所用实验试剂和离体全血量均需增加，因此本实施例为最佳实施方式，本发明并不受此限制。
4、亲和素标记的碱性磷酸酶
5、酶促反应底物
6、含10％胎牛血清的RPMI培养液
7、植物血凝素(PHA)作为阳性对照
8、PBS PH7.2
实施例3检测实验
(1)将混合的7条肽段(SEQ ID No.1至SEQ ID No.7)作为刺激外周血PBMC分泌IFN-Γ的刺激物；
(2)采用ELISPOT方法检测。这里的ELISPOT检测的具体步骤与实施例1中完全一致。
检测对象：
自身免疫性肝炎41例
原发性胆汁性肝硬化患者20例
病毒性肝炎患者，其中包括丙型肝炎10例，乙型肝炎20例
正常对照20例
检测结果：
41例AIH患者中22例(53.66％)呈现对SLA抗原表位混合肽段刺激呈阳性；
20例PBC患者中1例(5％)对SLA抗原表位混合肽段呈现弱阳性反应；
乙型肝炎与丙型肝炎患者无一例对SLA抗原表位肽池刺激起反应；
无一例正常对照对肽池的刺激起反应。检测结果见表3。
表3SLA抗原表位组合肽对AIH的检测结果
检测AIH的灵敏度可达53.66％，特异度可达98.57％，较SLA/LP抗体检测指标对AIH的灵敏度16.7％明显提高，并且保证了高度的特异度。因此其可作为AIH的检测指标。
对比例利用现有技术对上述受检者进行检测
检测对象(同实施例3)：
自身免疫性肝炎41例
原发性胆汁性肝硬化患者20例
病毒性肝炎患者，其中包括丙型肝炎10例，乙型肝炎20例
正常对照20例
检测方法：
1、免疫条带法检测SLA/LP抗体
将基因重组表达抗原包被于硝酸纤维薄膜上检测抗SLA/LP抗体。(试剂购自德国欧蒙公司)。
实验流程如下：
将血清1∶100稀释，取50μl加入样本反应区，室温平摇30min，
洗膜后加酶标记抗人IgG，室温平摇30min，
洗膜后加底物至加样板反应区，显色10min，流水终止反应，
用标准对照条带图观察特定区域条带，见清晰的强着色带判断为阳性结果。
2.ELISA方法检测抗SLA/LP抗体
试剂来源：ELISA检测试剂盒购置德国欧蒙公司。
实验流程：
①标本准备：取患者血清常温溶化，吸取5μl，PBS 1∶100稀释。
②加样：取预包被的酶联板，依次加入标准品、阴性对照品、阳性对照品及稀释的血清样本100μl/孔，室温孵育30分钟。
③洗板：弃去反应孔内液体，用300μl/孔PBS洗涤酶标板，静置30秒，洗涤3次。
④每孔加酶结合物100μl，室温孵育30分钟。
⑤洗板，方法同2。
⑥加底物100μl/孔，室温孵育15分钟
⑦加反应终止液100μl/孔
⑧测定：用酶标仪对空白孔调零，单波长450nm读取各孔OD值。
⑨结果判定：CUT OFF值为20RU/ML。
上述两种方法均为现有技术的体液免疫检测，在120例自身免疫性肝炎患者中共发现SLA/LP抗体阳性患者20例，SLA/LP抗体在自身免疫性肝炎患者中的阳性率为16.7％，而在原发胆汁性肝硬化及病毒性肝炎患者中未见该抗体检出。该抗体对AIH检测的灵敏度仅为16.7％。而实施例3中，本发明检测AIH的灵敏度可达53.66％，特异度可达98.57％。因此具有显著的进步。
序列表
<110>首都医科大学附属北京佑安医院
<120>可溶性肝抗原T细胞抗原表位及由其制备的检测试剂盒
<130>
<160>7
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>1
Ala Arg Arg His Tyr Arg Phe Ile His Gly Ile Gly Arg Ser Gly Asp
1 5 10 15
Ile Ser Ala Val
20
<210>2
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
Ile Ile Lys Leu Ala Gly Val His Thr Val Ala Asn Cys Phe Val Val
1 5 10 15
Pro Met Ala Thr
20
<210>3
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>3
Pro Met Ala Thr Gly Met Ser Leu Thr Leu Cys Phe Leu Thr Leu Arg
1 5 10 15
His Lys Arg Pro
20
<210>4
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>4
Thr Leu Cys Phe Leu Thr Leu Arg His Lys Arg Pro Lys Ala Lys Tyr
1 5 10 15
Ile Ile Trp Pro
20
<210>5
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>5
Gly Pro Asp Cys Ile Leu Cys Ile His Ser Thr Thr Ser Cys Phe Ala
1 5 10 15
Pro Arg Val Pro
20
<210>6
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>6
Val Val Pro Leu Gly Ser Met Gln Thr Val Ser Gly Tyr Thr Phe Arg
1 5 10 15
Gly Phe Met Ser
20
<210>7
<211>20
<212>PRT
<213>人工序列
<400>7
Ser Asp Asp Asn Tyr Asp Lys Thr Glu Asp Val Asp Ile Glu Glu Met
1 5 10 15
Ala Leu Lys Leu
20
Claims (9)
1.一种可溶性肝抗原T细胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。
2.一种可溶性肝抗原T细胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。
3.一种可溶性肝抗原T细胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.3所示。
4.一种可溶性肝抗原T细胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示。
5.一种可溶性肝抗原T细胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示。
6.一种可溶性肝抗原T细胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.6所示。
7.一种可溶性肝抗原T细胞抗原表位，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.7所示。
8.一种检测自身免疫性肝炎试剂盒，其特征在于，其含有权利要求1至7中所述的可溶性肝抗原T细胞抗原表位的组合，可溶性肝抗原T细胞抗原表位终浓度为10μg/ml。
9.根据权利要求8所述的一种检测自身免疫性肝炎试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：96孔PVDF膜覆盖的ELISPOT板、IFN-γ包被抗体、生物素标记的IFN-γ检测抗体、亲和素标记的碱性磷酸酶、酶促反应底物、含10％胎牛血清的RPMI培养液、植物血凝素作为阳性对照和PH7.2PBS。
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