CN102250234A

CN102250234A - 一种与兔出血症病毒vp60蛋白相结合的蛋白及其应用

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Publication number: CN102250234A
Application number: CN2011101569247A
Authority: CN
Inventors: 刘家森; 曲连东; 郭东春; 姜骞; 林欢
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2011-06-13
Filing date: 2011-06-13
Publication date: 2011-11-23
Anticipated expiration: 2031-06-13
Also published as: CN102250234B

Abstract

本发明公开了一种与兔出血症病毒VP60蛋白相结合的蛋白及其应用，其特征在于至少包含如SEQ ID NO：1所示的序列。在发明中，通过酵母双杂交技术，从兔肝脏组织cDNA文库中钓取得到与兔出血症病毒结构蛋白VP60相互作用的膜突蛋白MSN。通过免疫共沉淀试验，体外验证了该蛋白具有和病毒粒子相互结合的功能，纯化的MSN蛋白可以抑制8个血凝单位的病毒抗原对人“O”型血红细胞的凝集作用。以该蛋白质与兔出血症病毒室温内孵育，经口服、滴鼻接种RHDV抗体阴性兔，8天后兔仍然存活，外表健康，病理解剖及切片检查各脏器也无异常。病毒感染兔，于3日内死亡。可见该蛋白可以用于制备治疗兔出血症的药物中。

Description

一种与兔出血症病毒VP60蛋白相结合的蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种可以与兔出血症病毒外壳蛋白VP60相互结合的蛋白质及其应用，特别涉及一种膜突蛋白MSN，及其在制备治疗兔出血症药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术

兔出血症(Rabbit Hemorrhagic Disease，RHD)，俗称“兔瘟”(Rabbit Plague)，是由兔出血症病毒(Rabbit Hemorrhagic Disease Virus，RHDV)引起的急性、烈性、接触性传染病，以肝坏死、实质脏器水肿、呼吸系统及全身多器官淤血及出血性变化为主要特征，对养兔业通常造成毁灭性的打击。VP60作为病毒的唯一外壳蛋白，历经毒株20多年的流行，仍然保持着高度的同源性，其在疾病的感染和宿主免疫方面具有重要的作用。

病毒在肝脏内快速大量繁殖，导致致死性肝炎的发生，表明肝脏组织中存在多种与兔出血症病毒相互作用的蛋白，因此从兔肝脏中筛选兔出血症病毒VP60蛋白的相互作用蛋白，在本病的预防、治疗等方面具有重要意义。

膜突蛋白(Moesin，MSN)，在细小病毒、逆转录病毒以及慢病毒(艾滋病病毒)的繁殖、传播中具有重要作用，但是MSN其是否能够参与RHDV的的繁殖和传播尚无报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题之一是提供一种可用于制备兔出血症药物的蛋白质或核酸，本发明的一种与兔出血症病毒VP60蛋白相互结合的蛋白，其特征在于至少包含如SEQ ID NO：1所示的序列；

经测序以及序列比对分析发现，该蛋白为一种膜突蛋白MSN，而目前尚没有将膜突蛋白MSN用于治疗兔出血症的报道；

优选的，所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了编码以上所述蛋白的核苷酸序列；

优选的，所述的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

本发明还涉及了含有所述的核苷酸序列的重组载体、含有所述的重组载体的宿主菌，宿主菌可为大肠杆菌(大肠埃希氏菌，Escherichia coli)BL21(DE3)。

本发明所要解决的技术问题之二是提供一种治疗兔出血症的药物组合物，包括有效剂量的所述的蛋白和药学上接受的载体；及

一种治疗兔出血症的药物组合物，包括有效剂量的所述的核苷酸序列和药学上接受的载体

本发明所要解决的技术问题之三是提供以上所述的蛋白在制备治疗兔出血症药物中的应用；及

所述的核苷酸序列在制备治疗兔出血症药物中的应用。

本发明所要解决的技术问题是通过以下方法实现的：

1、从兔肝脏组织cDNA文库中钓取得到与兔出血症病毒结构蛋白VP60相互作用的蛋白

在本项研究中，通过酵母双杂交技术，从兔肝脏组织cDNA文库中钓取得到与兔出血症病毒结构蛋白VP60相互作用的蛋白。经测序以及序列比对分析发现，该蛋白为膜突蛋白MSN(XM_002720059.1)。

2、膜突蛋白MSN蛋白的主要编码基因片段的克隆及表达

克隆了MSN蛋白的主要编码基因片段(687nt-2156nt)，长1470bp。将此段基因序列连接到表达载体pET30a中，获得重组质粒pMSN，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得了重组MSN蛋白，该蛋白氨基酸序列长490aa，分子量约57.5kD。

3、膜突蛋白MSN蛋白与病毒粒子结合的体外验证

通过免疫共沉淀试验，体外验证了MSN蛋白具有和病毒粒子相互结合的功能，纯化的MSN蛋白在1.15μg的条件下，可以抑制8个血凝单位的病毒抗原对人“O”型血红细胞的凝集作用。

4、膜突蛋白MSN蛋白病毒中和试验

以该蛋白质与16倍半数致死剂量的RHDV室温内孵育60min，经口服、滴鼻接种RHDV抗体阴性兔，8天后兔仍然存活，外表健康，病理解剖及切片检查各脏器也无异常。病毒感染兔，于3日内死亡。该膜突蛋白MSN可以用于RHDV的感染中的防治。

附图说明

图1为重组膜突蛋白MSN蛋白对RHDV的血凝抑制效果；

图2为病理切片观察结果；

图3为血凝试验结果；

图4为兔肝酵母cDNA文库插入片段的琼脂糖凝胶电泳图；

1-20：PCR产物；M：DL2000Marker

图5为重组质粒pGBKT7-VP60的PCR鉴定图；

1：DL10,000Marker；2：pGBKT7-VP60的PCR鉴定；3：水对照

图6为重组质粒pGBKT7-VP60的酶切鉴定图；

1：酶切pGBKT7-VP60质粒产物；2：DL10,000Marker

图7为Y187(pGBKT7-VP60)与AH109(pGADT7)的融合产物在QDO平板上生长情况；

A：阳性对照；B：阳性对照(QDO-X-α-gal)；C：阴性对照；D：融合产物

图8为1酵母双杂交阳性克隆的筛选；

图9为PCR扩增兔膜突蛋白MSN主要编码基因电泳图；

图10为pMSN经EcoRI+XhoI酶切鉴定结果；

图11为大肠杆菌中表达重组MSN蛋白(A：对照阴性菌，B：表达的MSN蛋白，C表达的不溶性的MSN蛋白)

图12为RHDV病毒粒子纯化结果(A：电镜观察B：SDS-PAGE凝胶电泳)；

图13为免疫沉淀试验结果(1、阳性对照；2、阴性对照；3、CO-IP结果；4、蛋白质marker)；

具体实施方式

下面通过药理性及临床观察实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1膜突蛋白MSN蛋白与病毒粒子的体外结合

RHDV病毒粒子作为具有凝集人血“O”型红细胞的特性，以1.15μg重组MSN蛋白与8个血凝单位的病毒粒子，室温孵育45min，可抑制病毒粒子的血凝活性，而对照组BSA无血凝抑制活性，结果如表1，图1所示。

表1重组膜突蛋白MSN蛋白对RHDV的血凝抑制效价(单位：μg)

实施例2膜突蛋白MSN蛋白病毒中和试验

取10只RHDV抗体阴性兔，随即分成两组，每组5只。第一组中和组：16倍半数致死剂量(LD50)的RHDV病毒粒子，与56μg重组MSN蛋白混合，该混合物室温孵育60min后，经口腔、滴鼻接种。第二组阴性对照组：经口腔、滴鼻直接接种16倍半数致死剂量(LD50)的RHDV病毒粒子。在8天的观察期内，中和组5只兔全部存活，外表健康，迫杀后经病理解剖及切片检查各脏器也无异常(如图2所示)，肝脏组织研磨液的人“O”血红细胞凝集效价为20，判为阴性。阴性对照组5只兔于3日内相继死亡，肝脏组织研磨液的人“O”血红细胞凝集效价为10Log2，阳性，结果如表2所示，血凝试验结果如图3所示。

表2攻毒后结果

实验例1从兔肝脏组织cDNA文库中钓取得到与兔出血症病毒结构蛋白VP60相互作用的蛋白

酵母双杂交法钓取与兔出血症病毒VP60蛋白相互作用的蛋白，本研究中所用的寡核苷酸引物，如表3所示：

引物名称	引物序列
		VP60上游引物	5`-CCGGAATTCATGGAGGGCAAAACCCGCACA-3`(EcoR I)
VP60下游引物	5`-ACGCGTCGACTTATCAGACATAAGAAAAGC-3`(Sal I)
		CDSIII Primer	5′-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3′)*
SMARTIII Oligo	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3′)
		5′PCR Primer	5′-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3′
3′PCR Primer	5′-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3′
		AD-5`primer	5`-CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC-3`
AD-3`primer	5`-GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT-3`

1方法

1.1RNA的提取

采用Qiagen RNA提取试剂盒提取兔肝组织RNA，将RNA用RNase-free水稀释2倍后紫外线分光光度计检测RNA纯度，读取OD260、OD280、OD230、OD260/OD280比值、OD260/OD230比值及RNA浓度数值。非变性凝胶电泳查看RNA的完整性。

1.2ds cDNA的合成

根据Clonteh公司的cDNA文库构建及筛选试剂盒说明分别进行第一链cDNA和双链cDNA的合成，取5μL PCR产物进行1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳。

1.3cDNA的纯化及回收

将cDNA纯化柱颠倒数次重悬凝胶基质，保持纯化柱直立，断去末端，放入2ml收集管中，去掉顶盖，700g离心5min，以平衡缓冲液平衡基质。将纯化柱放入一新1.5ml离心管中，将双链cDNA(ds cDNA)加入基质平面中心，700g离心5min，收集的离心管中液体即为纯化的ds DNA。

1.4酵母文库的获得及文库质量鉴定

1.4.1ds cDNA大规模转化AH109制备文库

1)在一个无菌15mL的离心管中混合如下成分(每加入一种成分后都要混匀)：

2)加入2.5mL现配PEG/LiAC溶液，30℃放置45min。每15min混匀一次；

3)加入160μL无菌DMSO，混匀，42℃水浴20min。每10min混匀一次；

4)700g离心5min，弃上清，沉淀重悬于3mL YPD Plus液体培养基中；

5)30℃，240r/min振荡培养90min，700g离心5min；

6)弃上清，沉淀重悬至15mL 0.9％NaCl重悬。

1.4.2酵母文库的培养、回收及鉴定

1)取转化产物各200μL匀涂至150mm SD/-Leu平皿上，共用约100个平皿；

2)各取100μL的1∶10、1∶100、1∶1000和1∶10000稀释度的酵母悬液均匀涂至2个100mm SD/-Leu平皿上；

3)30℃培养3-6d，等待克隆长出。计数各稀释度平板上的单克隆数目，以计算转化效率，只有当转化效率高于1×10⁶转化子/3μg pGADT7-Rec时才能收集文库用于筛选；

转化效率＝(菌落个数×总的涂板体积)/(稀释参数×该板涂板体积)

4)把150mm平皿放4℃冷却3-4hr；

5)加5mL预冷冰冻培养基至每个平皿中；

6)用玻璃棒将平皿上的菌落刮取下来，再用移液器反复吹吸几次把平皿上的菌落全部洗下来(收集菌落时弃去有霉菌产生的区域)；

7)将100个平皿的洗液收集到一块，混合均匀；

8)用血细胞计算器计算细胞密度，公式如下：

细胞密度＝显微镜下细胞数/4×10⁴×稀释倍数

如果细胞密度小于2×10⁷cells/mL，则离心后用较少的冰冻培养基重悬使细胞密度达到2×10⁷cells/mL以上。细胞密度符合要求后分装成1mL每管，-70℃保存；

9)将吸取1μL文库原液，加入含有1mL 0.9％NaCl的1.5mL离心管中，轻轻混匀，此为稀释液A(Dilu.A，1∶10³)。由Dilu.A中吸取1μL，再加入1mL 0.9％NaCl中，轻轻混匀，此为稀释液B(Dilu.B，1∶10⁶)。由Dilu.B中吸取20μL稀释成200μL记为稀释液C(Dilu.C，1∶10⁷)，将稀释液A、B及C平均涂布2个SD/-Leu平板上。30℃倒置培养至菌落长出，计算平板上单克隆菌落数，确定待扩增的cDNA文库滴度：

文库滴度(cfu/mL)＝(平均菌落数/铺板体积)×稀释倍数

10)文库插入片段大小的鉴定

随机从文库中挑取20个酵母克隆分别加入到SD/-Leu液体培养基中，30℃振摇培养约24hr后，取酵母菌液作为PCR模板，体系如下：

反应参数：94℃7min；94℃30s，68℃3min，30个循环；68℃3min。PCR程序结束后取10μL进行1.2％琼脂糖凝胶电泳。

11)文库EST序列的获取及分析

随机挑选50个阳性克隆，提取酵母质粒后PCR扩增插入片段，将目的片段纯化后送Invitrogen公司测序，将测序结果去掉载体序列及不准确碱基后登录NCBI网站进行Blastn比对。

1.5诱饵质粒pGBKT7-VP60的构建及鉴定

质粒pMD18-T-VP60(a)1∶100稀释后做为模板进PCR扩增，反应参数：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min，共30个循环；72℃10min，PCR产物经EcoR I+Sal I双酶切后连接到酵母穿梭表达载体pGBKT7，转化大肠杆菌DH5α中。挑取重组菌落，经PCR和酶切鉴定正确后，送上海Invitrogen公司进行序列测定，并将测序结果用利用NCBI在线工具进行分析：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/。

1.6酵母双杂交诱饵载体Y187(pGBKT7-VP60)的构建和鉴定

1.6.1pGBKT7-VP60转化Y187

取一个1.5mL离心管，加入0.1μg pGBKT7-VP60质粒DNA与0.1mg Herring testis carrier DNA，混匀，转化酵母Y187。用omega酵母质粒提取试剂盒提取酵母质粒，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α中，提取大肠杆菌质粒，酶切及PCR鉴定。

1.6.2诱饵自激活活性的检测

将经过鉴定的含诱饵质粒的Y187(pGBKT7-VP60)酵母菌分别划线于SD/-Trp/X-α-Gal，SD/-His/-Trp/X-α-Gal，SD/-Ade/-Trp/X-α-Gal平板，30℃培养3-5d。观察含诱饵质粒的Y187生长情况，判断诱饵能否单独启动报告基因的表达。

1.6.3诱饵蛋白毒性的检测

分别挑取转入了pGBKT7空载体的酵母Y187(pGBKT7)，和转入了诱饵质粒的酵母Y187(pGBKT7-VP60)单菌落到SD/-Trp液体培养基中240r/min振摇培养24hr，检测A600值进行生长速度的比较。

1.7文库的筛选

1.7.1酵母交配

挑取新鲜含重组子的酵母Y187(pGBKT7-VP60)菌落(＞2mm)，用1mL SD/-Trp充分混匀后移至含50mL SD/-Trp的250mL容量的锥形瓶内，30℃240r/min振摇培养20hr后，测其A600值，并用红细胞计数板对酵母细胞进行计数；将1mL AH109酵母文库(≥2×10⁷cells)室温水浴融化；将5mLY187诱饵菌(≥1×10⁹cells/mL)与融化了的AH109酵母文库加入到无菌的2L烧瓶中，混匀；加入45mL2×YPDA/Kan(50μg/mL)，混匀；30℃，50r/min培养约20-24hr；交配20hr后，显微镜下观察交配液中的结合体，并继续培养4hr；交配液移至无菌离心管中，1,000g×10min，弃上清；用2×YPDA/Kan(50μg/mL)冲洗锥形瓶两次(25mL/次)后的洗涤液重悬沉淀；1,000g离心10min，弃上清；离心管内沉淀用10mL 0.5×YPDA重悬。

1.7.2表达相互作用蛋白的二倍体的筛选

1)从交配产物中取12μL按1∶10、1∶1000、1∶10000连续稀释，每个稀释度分别取100μL接种至SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu平板以计算交配效率，将剩余约11mL重悬液按每个平板200μL接种至150mm QDO平板，倒置于30℃恒温培养箱内继续培养；待平板上的克隆长出后，计数SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp/-Leu平板上的菌落数以计算交配效率；

活力(cfu/mL)＝克隆数/(涂板体积×稀释参数)

2)在SD/-Leu上的活力为AH109配子活力；在SD/-Trp上的活力为Y187配子活力；在SD/-Leu/-Trp活力为二倍体活力；交配效率＝每毫升二倍体克隆数/每毫升限制配体克隆数×100％

3)在QDO-X-α-Gal平板背面画出约1mm²的十字方格，将Ade⁺，His⁺阳性的克隆(＞2mm的白色酵母菌落)分别转移到QDO-X-α-Gal平板上的方格内进行蓝白斑筛选；

4)挑选出蓝色酵母菌落再次接种于QDO-X-α-Gal平板上，并编号；

5)将两次筛选阳性的菌落转移到QDO液体培养基中，30℃振摇培养约24hr后提取酵母质粒；

6)以酵母质粒为模板，pGADT7-Rec载体上序列为引物进行PCR扩增；

1.7.3酵母双杂交系统的回复性验证

将前面的实验过程中筛出的文库质粒转化到Y187酵母菌，验证其自激活活性和毒性作用，同时将诱饵重组质粒pGBKT7-VP60转化到AH109酵母中，再将两者一对一进行酵母交配实验以验证阳性克隆与VP60蛋白的相互作用。

1.7.4回复验证后的阳性克隆测序及生物信息学分析

将酵母双杂交系统的回复性验证的阳性质粒送上海生工测序。经过验证的23个克隆经过测序，查看测序图谱，将测序序列超过800bp及PloyA序列后面出现的不正确碱基去掉，另外用DNAStar软件除去两端载体序列从而获得有效的ESTs序列。用DNAStar软件中的Seqman II将筛选出的阳性克隆进行归类分析，只有一条基因归一个群的用该克隆的编号表示，有两条以上序列的用contig表示。将归类后的序列利用Blastx进行同源性分析、比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，对比数据库主要为Genbank、EMBL、DDBJ中的所有非冗余序列。

2结果

2.1肝脏组织RNA的提取

总RNA的A260/A280值为2.061，在RNA纯度的判定标准(A260/A280＝1.9-2.1)范围内；A260/A230＝2.18，在标准范围内(A260/A230＝2.0-2.5)，由此说明所提取的RNA中所含残留的盐分较少。分光光度计测量的RNA浓度为216μg/mL。

非变性琼脂糖凝胶电泳结果显示28S rRNA、18S rRNA条带明亮，其亮度的比值大于2.0，5S条带几乎看不见说明RNA几乎没有降解。表明提取的组织总RNA比较完整，符合实验要求。

2.2ds cDNA的合成及纯化

提取的组织总RNA经反转录后用LD-PCR的方法合成ds cDNA，将ds cDNA运用纯化柱去掉其中所含的酶等杂质，同时去掉200bp以下的片段，1.2％琼脂糖凝胶电泳表明纯化后的ds cDNA文库弥散分布于约0.2-2.5kb之间，接近1kb的区域有密集的条带，该区段为高丰度表达基因。

2.3文库细胞总数和文库滴度

用玻璃棒将所有菌落从平板上收集到一起，共约300mL，混匀后用红细胞计数板计数，10-4稀释度可见细胞数为39个，按照红细胞计数板计数公式：

细胞密度＝显微镜下细胞数/4×10⁴×稀释倍数＝39/4×10⁴×10⁴＝9.75×10⁸cells/mL

吸取100μL文库稀释液涂布在SD/-Leu平板上，3天后可见10^-7平板上菌落个数分别为24和30个克隆，则：

文库滴度(cfu/mL)＝(菌落数/铺板体积)×稀释倍数＝(27cfu/0.1mL)×10^-7＝2.7×10⁹cfu/mL

2.4文库插入片段大小分析

随机挑选的20个SD/-Leu平板上的阳性克隆，以AD-5`primer与AD-3`primer为引物进行PCR扩增，1.2％琼脂糖凝胶电泳显示：挑取的克隆几乎都有外源片段的存在，插入片段长短不一，主要分布在0.5-2.0kb，平均大约1.0kb左右，重组率约为100％(如图4所示)。

2.5诱饵质粒的构建和鉴定

回收酶切的VP60片段后，将其连接到同样酶切的pGBKT7载体上，提取PCR阳性pGBKT7-VP60质粒，酶切可产生约1800bp和7300bp两条带，测序表明以正确的阅读框构建到载体pGBKT7中(如图5、图6所示)。

2.6Y187(pGBKT7-VP60)与AH109(pGADT7)的融合

将Y187(pGBKT7-VP60)与AH109(pGADT7)进行小量酵母交配后QDO平板上未见酵母生长，同时，阴性对照未见菌落生长，阳性对照在QDO平板上有圆形白色菌落产生，将其划线到QDO平板上生长态势良好，划线到QDO-X-α-gal平板上变为蓝色(如图7所示)。

2.7文库的筛选

将酵母交配液涂布到QDO平板上，30℃倒置培养约7d后挑取平板上的菌落(＞2mm)到新的QDO-X-α-Gal平板上，继续培养，以阳性对照为参照，培养36hr后将变蓝的菌落重新接种到新的QDO-X-α-Gal平板方格内进行蓝白斑筛选，共获得23个蓝色克隆(如图8所示)。

2.8Y187(AD文库载体)与AH109(pGBKT7-VP60)的交配实验

Y187(AD文库载体)与AH109(pGBKT7-VP60)各挑取一单克隆，接种至0.5mL2×YPDA中，总共23支，30℃50r/min×24hr后用0.5×YPDA按1∶10稀释后取100μL 接种至到QDO/X-α-Gal平板，倒置，30℃培养。五天后，23个平板内出现数量不等的蓝白斑。表明在酵母双杂交系统五轮筛选出的23个文库质粒为真阳性文库质粒。

在本项研究中，通过酵母双杂交技术，从兔肝脏组织cDNA文库中钓取得到与兔出血症病毒结构蛋白VP60相互作用的蛋白。经测序以及序列比对分析发现，其中之一为膜突蛋白MSN(XM_002720059.1)。

实验例2膜突蛋白MSN蛋白的主要编码基因片段的克隆及表达

设计一对引物，分别引入酶切位点，上游：5’CGG AAT TCA CCA TGG ATG CAG AGC TGG AG(EcoR I)3’，下游：5’CCG CTC GAG GGC CAT AGC ATC AGC CCG(Xho I)3’，以兔肝组织cDNA为模板，PCR扩增兔MSN蛋白的主要编码片段，约1470bp(如图9所示)。测序结果表明，该片段位于主要编码序列687nt-2156nt之间，序列如SEQ：NO.2所示。

以限制性内切酶EcoR I和Xho I酶切PCR产物和表达载体pET30a，回收目的片段。经T4DNA连接酶处理，将膜突蛋白MSN片段链接于表达载体pET30a上，获得重组质粒pMSN。再次经内切酶EcoR I和Xho I酶切鉴定，表达质粒pMSN构建成功，酶切鉴定结果如图10所示。

表达质粒pMSN转化大肠杆菌BL21(DE3)，该菌种(BL21(DE3)pMSN)为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，保藏在保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院中科院微生物研究所，菌种保藏编号为：CGMCC No.4679，菌种保藏时间为：2011年3月16日。挑取菌落，接种LB培养基(卡那霉素抗性)培养，经IPTG诱导后，经鉴定表达出目的蛋白膜突蛋白MSN，该蛋白约57.5kD(如图11所示)，编码氨基酸序列长490aa，序列如SEQ：NO.1所示。

实验例3膜突蛋白MSN与病毒粒子结合的体外验证

采用常规方法纯化RHDV病毒，经电镜观察、凝胶电泳获得了高纯度的病毒(图12所示)。

体外免疫共沉淀试验，检测重组膜突蛋白MSN蛋白与病毒粒子的相互作用。以兔出血症病毒多克隆抗体作为捕获抗体，捕获病毒粒子与重组膜突蛋白MSN复合物，以重组膜突蛋白MSN抗体检测到特异性的信号。

膜突蛋白MSN免疫共沉淀(CO-IP)试验：

1、轻轻混匀ProteinA/G-Agarose，取40μL至预冷的EP管中，200μL冷裂解Buffer洗涤平衡Agarose beads，置于冰上；

2、400μL冷裂解Buffer稀释14μL VP60单克隆抗体，加入EP管中，室温，在振荡器上低速振荡1-2h后，4℃，1000r/m离心3min，收集上清作SDS-PAGE分析；

3、Agarose beads沉淀用400μL裂解Buffer洗涤3次，弃去上清；

4、向Agarose beads沉淀中加入20μL纯化的RHDV，置于4℃振荡器上低速振荡过夜，次日，4℃，1000r/m离心3min，收集上清作SDS-PAGE分析，同上洗涤3次；

5、向Agarose beads沉淀中加入200μL纯化的膜突蛋白MSN，于4℃振荡器上低速振荡过夜，次日，4℃，1000r/m离心3min，收集上清作SDS-PAGE分析，同上洗涤3次；

6、用100μL 1×SDS loading buffer重悬Agarose beads沉淀，煮沸10min，-20℃保存；

7、取6步中SDS-PAGE样品，经12％蛋白胶进行SDS-PAGE，作Western Blotting分析，纯化的膜突蛋白MSN蛋白为阳性对照，为结合RHDV的Agarosebeads为阴性对照。

(PVDF膜经5％脱脂乳4℃过夜封闭，次日，TBST洗3遍，每次5min，用His-Tag小鼠单克隆抗体孵育，37℃作用1h，TBST洗3遍，每次5min，加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育1h，TBST洗3遍，每次5min，最后用DAB显色液显色，观察结果(图13所示：1、阳性对照；2、阴性对照；3、CO-IP结果；4、蛋白质marker)。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims

1.一种与兔出血症病毒VP60蛋白相结合的蛋白，其特征在于所述的蛋白至少包含如SEQ ID NO：1所示的序列。

2.如权利要求1所述的与兔出血症病毒VP60蛋白相结合的蛋白，其特征在于所述蛋白为膜突蛋白。

3.如权利要求1所述的与兔出血症病毒VP60蛋白相结合的蛋白，其特征在于所述蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.编码权利要求1-3任一项所述的蛋白的核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列如SEQID NO：2所示。

6.一种含有权利要求4或5所述的核苷酸序列的重组载体及含有该重组载体的宿主菌。

7.一种治疗兔出血症的药物组合物，其特征在于包括有效剂量的权利要求1-3任一项所述的蛋白和药学上接受的载体。

8.一种治疗兔出血症的药物组合物，其特征在于包括有效剂量的权利要求4或5所述的核苷酸序列和药学上接受的载体。

9.权利要求1-3任一项所述的蛋白在制备治疗兔出血症药物中的应用。

10.权利要求4或5所述的核苷酸序列在制备治疗兔出血症药物中的应用。