JPH02284060A - 成人ｔ細胞白血病ウイルス感染診断薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、成人Ｔ細胞白血病（Ａｄｕｌｔ　Ｔｃｅｌｌ
ｌｅｕｋｅｍｉａ　；以下ＡＴＬと略記する）の病因で
ある成人Ｔ細胞白血病ウィルス（Ｈｕｍａｎ　Ｔｃｅｌ
ｌ　ｌｅｕｋｅｍｉａｖｉｒｕｓ−１；以下ＨＴＬＶ−
１と略記する）の、表存蛋白ｇｐ４６の抗体に対して抗
原性を有するポリペプチドを抗原として用いる新規な［
１ＴＬＶ−１感染診断薬に関する。

〔従来の技術〕

ＡＴＬは、成人が罹病する悪性の疾患であり、その病因
はＲＴＬＶ−Ｉの感染によるもので、感染者のうち０．
１％前後の頻度で発病することが知られている。この〇
ＴＬＶ−１の感染経路としては、輸血感染、母子感染、
性的感染等が知られており、）！ＴＬＶ−１ｇ染者を早
期発見し、こうした感染の防止に努めることが望まれて
いる。

従来、こうしたＨＴＬＶ−１感染診断薬としては、ＨＴ
ＬＶ　−１に感染した場合に血漿又は血清中に生ずる成
人Ｔ細胞白血病関連抗原に対する抗体の検出を、成人Ｔ
細胞白血病関連抗原産生細胞の可溶性細胞質蛋白及びＨ
ＴＬＶ　−１の可溶化処理蛋白から選ばれた少なくとも
１種（特開昭５８−１８７８６１号公報）、或いは該細
胞を界面活性剤により処理して得た抗原蛋白及びＨＴＬ
Ｖ−１ウィルス粒子を利用して行うもの（特開昭５９−
６２５２７号公報）が知られている。

しかしながら、該診断薬は、Ｔ細胞膜、核等、成人Ｔ細
胞白血病関連抗原以外の非特異的な反応を示す抗原をも
含んでおり、かかる抗原の非特異的免疫反応によりいわ
ゆる偽陽性の検体が生じ、ＨＴＬＶ−１感染の診断精度
が低下するという問題があった。

また、ＨＴＬＶ−１に対して抗原性を有するポリペプチ
ドを生産するために、）ＩＴＬＶ−１の外皮蛋白（ｅｎ
ｖｅｌｏｐｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　　；以下ｅｎＶ蛋白と
略記する）の遺伝子で組換えられた大腸菌を増殖させ、
産生ずるポリペプチドを回収する方法が試みられている
。

しかしながら、上記方法によって得られるポリペプチド
は、ＨＴＬＶ−１の抗体に対する抗原性が低いものであ
った。これは大腸菌等の細菌類内では産生ずるポリペプ
チドに対して、糖鎖付加反応等の修飾がないことによる
ものと推定される。

一方、診断薬として有用な蛋白の構造遺伝子をカイコ核
多角体病ウィルスＤＮＡの多角体蛋白構造遺伝子部分に
組み換えた組換えウィルスを、カイコ樹立培養細胞又は
カイコ生体中で増殖させるポリペプチドの製造方法が、
特開昭６２−２０８２７６号公報及び特開昭６１−９２
８８号公報において知られている。

ところが、これらの公報には、前記した＋１　Ｔ　Ｌ　
Ｖ■の抗原蛋白であるポリペプチドの製造に対して上記
の方法を適用することに関しては何の具体的な記載もな
い。かかる方法によるＨＴＬＶ−Ｉの抗原蛋白であるポ
リペプチドを製造するには、ＩＩＴＬＶＩの構造遺伝子
のいかなる部分によってカイコ核多角体病ウィルスＤＮ
Ａの多角体蛋白構造遺伝子を組換えるか、また、これに
よりポリペプチドの産生が可能であるか、更にはポリペ
プチドが得られた場合、該ポリペプチドがＨＴＬＶ−１
の抗体に対して抗原性を有するかどうかについては、更
に数多くの研究が必要であった。

また、本発明者等は、既にＢｍＮＰＶの多角体蛋白構造
遺伝子の一部が、ＨＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白遺伝子に由
来するＤＮＡのうち、ｐ２１をコードするＤＮＡを含み
且つ該Ｄ　Ｎ　Ａの５′末端から上流の１７塩基対以内
で切断された断片で組換えられた組換えウィルスをカイ
コ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染させ、該組換えウ
ィルスを増殖させることを特徴とするポリペプチドの製
造方法を提案した。

該製造方法で得られるポリペプチドは、ＨＴＬＶ−１の
膜中及び膜の内側に位置し、抗原性の高い蛋白であるｐ
２１を含むため、ＡＴＬ診断薬の抗原として有用である
。しかしながら、ＡＴＬの診断は該抗原を用いた診断薬
と検定血清との反応性を判定しただけでは十分ではない
。なぜならば、ＨＴＬシーＩのｅｎｖ蛋白は、上記ｐ２
１の他に表作蛋白であるｇｐ４６により構成されている
。そして、該ｇｐ４６は、蛋白自体の抗原性はｐ２１に
比して低いものである。

しかしながら、ＡＴＬ患者の血清の中には、いかなる理
由からか５〜１０％の割合でｇｐ４６を抗原として反応
させた場合しか陽性を示さないものが存在する。従って
、ＡＴＬの診断をより完全に行うためには、診断薬の抗
原としてはｐ２１だけでなくｇｐ４６も補足して用い、
ＨＴＬＶ−Ｉ抗体陽性および陰性を総合的に判定しなけ
ればならない。

〔発明が解決しようとする課題〕

本発明の課題は、上記従来技術の問題点を克服して、上
記ｇｐ４６に対する抗体に対して高い抗原性を有するポ
リペプチドを開発し、該ポリペプチドを抗原として用い
たＦ！ＴＬＶ−１感染の診断において極めて高怒度で精
度良く診断できる診断薬を提供することにある。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者等は、上記ｇｐ４６の抗体に対して抗原性を有
するポリペプチドを抗原とした診断薬を間発すべ（研究
を重ねた。その結果、ＨＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白遺伝子
に由来するＤＮＡを、該ＤＮＡの５′末端から下流のあ
る特定の範囲内で切断して得られる断片で、カイコ核多
角体病ウィルス（ＢｏｍｂｙｘＮｕｃｌｅａｒ　Ｐｏ１
ｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　Ｖｉｒｕｓ；以下、Ｂａ＋ＮＰＶ
と略記する）の多角体蛋白構造遺伝子の一部を組換えた
組換えウィルスを、カイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫
に感染することによって発現させたポリペプチドを抗原
として用いることで、かかる目的を達成し得ることを見
い出し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は、ＨＴＬＶ　　Ｉ　ｅｎｖ蛋白遺伝子に
由来するＤＮＡのうち、３ｇ　Ｄ　Ｎ　Ａの５′末端か
ら下流７３塩基対以上４９３塩基対以下の範囲内で切断
した、該切断部位から前記ＤＮＡの３′末端まテノ断片
（以下、ＨＴＬＶ−１５′−３’断片と略す）により、
ＢｍＮＰＶの多角体蛋白構造遺伝子の一部の組換えを行
い、次いで該組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞又は
カイコ幼虫に感染させて発現されたポリペプチド抗原と
するＩＩＴＬＶ−Ｉ　Ｗ染診断薬である。

本発明の診断薬において、抗原として用いるポリペプチ
ドは、上記１１ＴＬＶ−１５’　−３’断片により、Ｂ
ｍＮＰＶの多角体蛋白遺伝子の一部の組換えを行い、次
いで咳組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ
幼虫に感染させて発現されたものである。

以下、該ポリペプチドの製法について詳細に説明する。

１、組換えウィルスの製法 本発明において、上記ポリペプチドの製法に用いる組換
えウィルスの製法は特に制限されるものではない。代表
的な製法として、ＡＴＬ患者末梢血からリンパ球を分離
し、該リンパ球から抽出したＤＮＡよりＨＴＬｖ−１５
’　−３’断片を切り出し、これをカイコ発現系ベクタ
ー（ｐＢＦベクター）のクローニング部位に挿入して、
組換えベクターとし、次いで該ベクターを用いて）ＩＴ
ＬＶ−Ｉ　５’−３”断片をＢｍＮＰＶの多角体蛋白構
造遺伝子の一部と組換えることにより製造する方法が挙
げられる。

−Ｌ二」−ユ１ユ圓− 本発明において、ＨＴＬＶ−１５”−３”断片によって
組換えられるＢｍＮＰＶは、養蚕業者に広く知られてい
るものであり、前用、古沢らが単離した代表的な株とし
て１３株があり、この株のウィルスＤＮＡは、米国のＡ
ＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）にＡＴＣＣｋ４０１８Ｂとして
寄託されており、容易に入手し得る。又、ＢｓＮＰＶに
感染したカイコより公知の方法によって単離することも
できる。

上記ＢｗＮＰＶのＤＮＡは、第１図の制限酵素地図で表
わすことができる。

このＢｍＮＰＶ　　Ｄ　Ｎ　Ａのうち本発明において、
）ＩＴＬｖ−１５’　−３’断片によって組換えられる
部分は、第１図に示される多角体蛋白遺伝子のうちプロ
モータ一部分を除いた多角体蛋白構造遺伝子の一部分で
ある。

１−２１（ＴＬシー１５’−３’　　の′８ＨＴＬＶ−
１は遺伝子としてＲＮＡを持つレトロウィルスであり、
感染細胞内でこの遺伝子ＲＮＡに由来して合成されるＤ
ＮＡのｅｎｖ遺伝子を中心とする塩基配列としては、５
ｅｉｋｉ　らが　Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＩＪＳＡ　８０　
”　（１９８３）第３６２１頁で発表したものが知られ
ている。

上記塩基配列のうち、ＨＴＬシー１　ｅｎｖ蛋白遺伝子
に由来するＤＮＡとは、第３図に示す通り５１８０番目
から６６４３番目の配列をいう。即ち、この配列部分は
、１（ＴＬＶ　−１の表作蛋白であるｇｐ４６をコード
する５１８０番目から６１１５番目まテノ配列と、ＨＴ
ＬＶ−１の膜中及び膜の内側に位置する蛋白であるｐ２
１をコードする６１１６番目から６６４３番目までの配
列によって構成されている。

本発明において、ＨＴＬＶ−１５’　−３”断片の取得
方法は特に制限されない。代表的な方法にはＡＴＬ患者
末梢血中のリンパ球に所在するＤＮＡから該ＨＴＬＶ−
Ｉ　５　’　−３’断片を取得する方法が挙げられる。

代表的な方法を例示すれば、まず、ＡＴＬ患者末梢血か
らリンパ球を分離し、該リンパ球からＤＮＡを抽出し、
次いで制限酵素ＥｃｏＲＩで切断し、約２０キロ塩基対
断片を含むＤＮＡを得、該ＤＮＡをシャロン（ｃｔ＋ａ
ｒｏｎ）　　４　Ａベクターの１！ｃｏＲＩ制限酵素切
断部位に接続した後、ＦＩＴＬＶ−１のプロウィルスを
含むファージをスクリーニングで単離し、該プロウィル
スからｐＵＣベクターに代表される大腸菌のベクター系
を使用したサブ・クローニング及び制限酵素による切断
によりＨＴＬＶ−Ｉ　５”−３”断片を得る方法である
。

１１ＴＬＶ−１５’　−３’断片は、ＨＴＬＶ　−１ｅ
ｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５
′末端から下流７３塩基対以上４９３塩基対以下の範回
内で切断した、該切断部位から前記ＤＮＡの３゛末端ま
での断片であればすべて適用できる。該ＨＴＬＶ−１５
’　−３′断片を、前記５ｅｉｋｉらが発表している）
ＩＴＬＶ　−１ｅｒ１ｖ蛋白遺伝子配列で説明すると５
２５３番目から５６７３番目以内で切断され、該切断部
位から６６４３番目までの断片に相当する。即ち、ＨＴ
ＬＶ−１５’　−３’断片は、ＨＴＬＶ　　Ｉ　　ｅｎ
ｖ蛋白遺伝子のうち、ｇｐ４６をコードするＤＮＡ配列
部分の特定の一部とｐ２１をコードするＤＮＡ配列部分
より構成されている。

上記切断部位の好適なる部位を示せば、ＨＴＬＶｌ　ｅ
ｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡの５′末端から下流へ
４９４塩基対隔てた位置よりＣＧと配列しているＡｃｃ
ｆ制限酵素切断部位、或いは上記ＤＮＡの５′末端から
下流へ７４塩基対隔てた位置にＣと配列しているＰｖｕ
　ｎ制限酵素切断部位等が挙げられる。

また、該）ＩＴＬＶ−Ｉ　５　”　−３′断片は、後述
するカイコ発現系ベクターに挿入可能な大きさである限
り、上記切断部位、及びＨＴＬＶ−１遺゛伝子に由来す
るＤＮＡのうちｅｎｖ蛋白遺伝子の３゛末端より下流に
存在する任意の制限酵素切断部位で切断した断片に含ま
れた形で採取して用いるのが好適である。代表的なｅｎ
ｖ蛋白遺伝子の３′末端より下流に存在する制限酵素切
断部位としては、該３′末端から下流へ８７塩基対隔て
た位置よりＴＧＣＡと配列しているＰｓｔｌ制限酵素切
断部位等が挙げられる。

但し、本発明者等の知見によれば、組換えに用いる断片
は、上記）ＩＴＬＶ−１５’−３’断片を含んでいても
、ＨＴＬＶ　−Ｉ　　ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮ
Ａの５゛末端の下流７３塩基対より、上流の塩基配列を
含んでいる場合、後記する方法によりこの断片を用いて
得られたＢｍＮＰＶの組換えウィルスをカイコ樹立培養
細胞又はカイコ幼虫に感染してポリペプチドを産生しよ
うとしても、生産量が極度に低下してしまう。例えば、
ＨＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡの全
配列を用いた場合、ポリペプチドの合成はほとんど進行
しない。

また、組換えに用いる断片が、）ＩＴＬＶ　−１ｅｎν
蛋白遺伝子に由来するＤＮＡの５′末端の下流４９３塩
基対より、更に下流で切断したものである場合、得られ
るポリペプチドは、ｇｐ４６の抗体に対して抗原性を有
しなくなる。

従ッテ、本願発明（７）ＨＴＬＶ−１５’　−３′断片
は１１ＴＬＶ　−Ｉ　　ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤ
ＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末端から下流７３塩基対以
上４９３塩基対以下の範囲内で切断したものであること
が掻めて重要である。

本発明において、前記ＨＴＬＶ−１５”−３’断片は、
カイコ発現系ベクターに組換えられた後、該組換えベク
ターによりＢｍＮＰＶの多角体蛋白構造遺伝子の一部と
組換えて組換えウィルスとされる０組換えウィルス取得
のために使用するカイコ発現系ベクターとしては、ｐＢ
Ｆベクターが挙げられる。

ｐＢＦベクターは、第２図の制限酵素地図により特徴づ
けられるものである。即ちｐＢＦベクターは、ＢｍＮＰ
Ｖ　Ｄ　Ｎ　Ａの多角体蛋白遺伝子のプロモーター領域
と多角体蛋白構造遺伝子前後付近及び大腸菌のベクター
であるｐＵＣベクターの遺伝子とを含むベクターである
。

上記ｐＢＦベクターは、Ｘｂａｌ　　＋　ＥｃｏＲＩＳ
ｔｕｌ　　制限酵素切断部位のクローニング部位がある
。

かかるｐＢＦベクターは、そのクローニング部位の上流
に塩基配列ＡＴＧから始まる多角体蛋白構造遺伝子をど
の部位まで含んでいるかで種類があり、第４図に示すよ
うなｐＢＦ４〜ｐＢ、Ｆ１３３が存在している。

組換えベクターの製造においては、上記ベクターのうち
挿入するＩ（ＴＬＶ−１５″−３′断片部分とｐＢＦベ
クター上流部分とのリーディング・フレームが合うもの
であれば、どのベクターを使用してもよい。しかし、５
　’　−３’断片をカイコ樹立培養細胞及びカイコ幼虫
で効率よく発現できる組換えウィルスを作成するために
は、塩基配列ＡＴＧから開始されるＢｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ
　Ａ由来の多角体蛋白構造遺伝子の一部をコードした遺
伝子部分を多く含んでいるｐＢＦベクター、例えばｐＢ
Ｆ１２４゜ｐ　Ｂ　Ｆ１２９　、　　ｐ　Ｂ　Ｆ１３３
等のｐＢＦベクターを使用するのが望ましい。

上記ｐＢＦベクターへのＨＴＬＶ−１５’　−３’断片
の挿入は、ｐＢＦベクターのクローニング部位に存在す
るＥｃｏＲＩ　、　　Ｘｂａ　Ｉ　、　　Ｓｔｕ　Ｉ制
限酵素切断部位を利用して行なえばよい。ｐＢＦベクタ
ークローニング部位にＩＩＴＬＶ−１５′−３’断片を
挿入するには、ＤＮＡ合成又は大腸菌のベクター系であ
るｐＵＣベクターへの挿入、切断等の公知の手段により
、該断片の両端にＥｃｏＲＩ　、Ｘｂａ　Ｉ或いはＳｔ
ｕ？制限酵素切断部位を接続するか、該断片の５′端に
ＥｃｏＲｒ、３′端にＳｔｕ　Ｉ制限酵素切断部位を接
続するか、更には該断片の５′端にＸｂａ　Ｉ、３′端
に５ｔｕｌ制限酵素切断部位を接続するかのいずれかの
操作が一般に行われる。以上のうちでも、１１ＴＬＶ−
７５’−３’断片の両端にＥｃｏＲＩ或いはＸｂａ　Ｉ
制限酵素切断部位を接続する方法が好ましい。

そして５　’　−３’断片の両端にＥｃｏＲＩ制限酵素
切断部位を接続する場合、該断片はｐＢＦベクターをＥ
ｃｏＲＩ制限酵素で切断したものと接続する。又、ＨＴ
ＬＶ−１５’　−３’断片の両端ニｘｂａ■制限酵素切
断部位を接続した場合も同様に、該断片はｐＢＦベクタ
ーをＸｂａ　Ｉで切断したものと接続する。この場合接
続に際しては、予め制限酵素で切断したｐＢＦベクター
に対し、アルカリフォスファターゼ処理を行ない、ｐＢ
Ｆベクターのセルフライゲーシゴン（ｓｅｌｆｌｉｇａ
ｔｉｏｎ）を避けることが好ましい。

又、ＨＴＬＶ−１５’　−３’断片の５′端にＥｃｏＲ
丁、３′端にＳｔｕ　Ｉ制限酵素切断部位を接続する場
合、該断片は、ｐＢＦベクターをＥｃｏＲ１、Ｓｔｕ　
Ｉで切断したものと接続し、ＨＴＬＶ−Ｉ　　５’−３
’断片の５′端にＸｂａ　Ｉ、３′端にＳｔｕ　Ｉ制限
酵素切断部位を接続する場合、該断片は、ｐＢＦベクタ
ーをＸｂａｌ、５ｔｕＩで切断したものと接続すればよ
い。

かかる接続方法は、リガーゼを用いて公知の方法により
行うことができる。例えば制限酵素で切断されたｐＢＦ
ベクターのＤＮＡの量に対して、挿入すべき５′−３’
断片のＤＮＡ１ｌが３〜８倍量になるように調整し、例
えばＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて接続する方法である。

上記の’ＡＴＩ、’Ｊ−１５’　−３’断片を挿入した
ｐＢＦ’ベクターの分離及び確認は、下記の方法により
行うことができる。

即ち、分渭は前記の接続反応液をＪＭ１０９株（宝酒造
（株）製　Ｎｏ、９０５２）　、ＭＶ１１Ｂ４株（宝酒
造（株）製）で代表される大腸菌のコンピテントセルに
加え、公知の方法で大腸菌の形質転換を行ない、ｐＢＦ
ベクターがアンピシリン耐性遺伝子を含んでいることか
ら、形質転換後の液をアンピシリンを含んだＬＢ寒天培
地に接種し、室温以上の適当な温度、例えば３７°Ｃで
１２時間〜２０時間培養して出現するシングル・コロニ
ーを形質転換株として取得することによって行うことが
できる。

また、ＨＴＬＶ−ｒ　５　′−３’断片を挿入したｐＢ
Ｆベクターの確認は、形質転換株に存在する徂換えベク
ターボイリング法（ｂｏｉｌｉｎｇ法）或いはアルカリ
・リシス法（ａｌｋａｌｉ　Ｉｙｓｉｓ法）を用いてミ
ニ“プレバレージョン（ａ＋ｉｎｉ　ｐｒｅｐａｒａｔ
ｉｏｎ）　　シ、組換えベクター懸濁液を取得し、この
ようにして調製した組換えベクター懸濁液をＨＴＬＶ−
１５’　−３’断片が挿入されていることが確認できる
任意の制限酵素、例えばＥｃｏＲＩ　、　　Ｘｂａ　Ｉ
で切断し、切断物をアガロースゲル電気泳動し、エチジ
ウム・ブロマイドによる染色後、予想できる位置にバン
ドが存在するか否かを確認することによって行うことが
できる。尚、５”−３’断片の両端をＥｃｏＲＩ或いは
Ｘｂａ　Ｉ制限酵素切断部位にしたものをｐＢＦヘクタ
ーのＥｃｏＲｌ　、　　Ｘｂａ　Ｉ制限酵素切断部位に
挿入した組換えベクターの場合は、ｐＢＦベクターの上
流部分と挿入する５”−３”断片が正しい方向に結合し
ているかどうか確認できる制限酵素、例えば、Ｂａｎ＋
ＨＩ　、　　Ｘｈｏ　Ｉ等で切断し、その切断物を同様
にアガロースゲル電気泳動し、エチジウム・ブロマイド
による染色後、予想できる位置にバンドが存在するか否
かも同時に確認するとよい。

上記方法で形質転換株として分離した組換えベクターは
、該形質転換株を増殖させることにより、その量を増加
させて使用することが好ましい。例えば該組換えベクタ
ーを所有する形質転換株をアンピシリンを含んだＬＢ液
体培地に接種し、室温以上の適当な温度、例えば３７°
Ｃで１２時間〜２０時間振盪培養し、該培養物からアル
カリ・リシス法（ａｌｋａｌｉ　１ｙｓｉｓ法）を用い
てミデイアム・プレパレーシゴン（ｌＩｌｉｄｉｕｒｍ
　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）　シ、組換えベクター懸濁
液を取得することによって行うことができる。

取得した組換えベクターも前記した方法と同様な方法で
再度目的の組換えベクターであるか否かを確認すること
が好ましい。

得られた組換えベク外：Ｕ濁液は、アールエヌエース処
理（ＲＮａｓｅ処理）して組換えウィルス取得用の組換
えベクター懸濁液として使用することが好ましい。

ｌ−３−えウィルスの 本発明において、ＩＩＴＬＶ−１５’　−３’断片によ
って、多角体蛋白構造遺伝子の一部が組換えられた組換
えＢｍＮＰＶは、ＢｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ　Ａと前記組換え
ベクターとをカイコ樹立培養細胞にカルシウム沈澱法を
用いて、同時にトランスフェクション（コ・トランスフ
ェクション）し、組換えベクターとＢｍＮＰＶＤＮＡ間
の対立遺伝子を置き換えることにより取得することがで
きる。

上記のコ・トランスフェクションは、具体的には０．２
５　Ｍ塩化カルシウム及びキャリヤＤＮＡの存在下でＢ
ｍＮＰＶ　Ｄ　Ｎ　Ａと組換えベクターＤＮＡをモル比
１　：　１００になる様に混ぜ、その後、該混合液に、
０．２８　Ｍ塩化ナトリウムを含む）！　Ｅ　Ｐ　Ｅ　
Ｓ　緩衝液（ｐＨ７，１＞とリン酸緩衝液の混合液を添
加し、混和後、該混和液を８ｍ培養細胞中に添加すると
いう前用、古沢らの方法（特公昭６１−９２９７号）に
従って行なうことが望ましい。

コ・トランスフェクションした後、組換えウィルスを含
む反応液は室温付近の温度、例えば２７°Ｃで５〜６日
間培養し、培養後、培地を回収、遠心後、上清を組換え
ウィルスのクローニングに使用する。コ・トランスフェ
クションで得られた反応液の上清からの組換えウィルス
のクローニングは、プラークアッセイ法（Ｊ、　５ｅｒ
ｉｃ　Ｓｃｉ、　Ｊｐｎ。

ｄ　　５４７（１９８４）　　）やリミッティング・ダ
イリューション法により組換えウィルスを単離すること
によって行えばよい。どちらの方法を使用しても良いが
、操作法の容易さ、分離回数の少なくて済む点から、リ
ミッティング・ダイリューション法を使用する方が良好
である。

上記リミッティング・ダイリューション法を使用しての
組換えウィルスのクローニングは、コ・トランスフェク
ションで得られたウィルス液を希釈し、該ウィルス希釈
液と１×１０５〜１×ｌｏｈカイコ細胞数／　ｍ　１カ
イコ培養培地、好ましくはＴＣ−１０培地（第２表参照
）の濃度で調整しであるカイコ樹≠培養細胞液とを１：
ｌで混合することにより感染させ、この混合液をマイク
ロタイタートレー中のウェルへ注入し、室温付近の温度
、例えば２７°Ｃで培養し、培養２〜７日後、マイクロ
タイタートレー中のウェルを検鏡し、ウェル中で見られ
るカイコ細胞の形状、珍態で組換えウィルス存在の有無
を判定する。検鏡することで見い出されるカイコ細胞の
形態には、第５図に示すように３種類確認できる。

第５図におけるウィルスが感染した形態を示しているカ
イコ細胞で且つ該細胞内に多角体蛋白が検出されない細
胞のみが存在しているウェル中の培地を回収、遠心し、
その上清を回収することにより組換えウィルス液が得ら
れる。ウェル中に野生株であるＢｍＮＰＶと組換えウィ
ルスとが混在している場合は、該ウェル中の培地を回収
し、リミッティング・グイリュージョンを繰り返し行な
い、組換えウィルスを分離することが好ましい。

■、ポリペプチドの製造 カイコ 本発明において組換えウィルスを感染させるカイコ樹立
培養細胞としては、ＢｍＮＰＶが増殖できるカイコ樹立
培養細胞であれば、どの細胞でも良い。

ＢｍＮＰＶが増殖可能なカイコ樹立培養細胞には、Ｖｏ
ｌｋｍａｎ、　Ｌ、Ｅ、、　ａｎｄ　Ｇｏｌｄｓｍｉｔ
ｈ、　Ｐ、Ａ、　（１９８２）：＾ｐｐ１．　Ｅｎｖｉ
ｒｏｎ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ＋、、　４４．２２７−２
３３に示されているＢ１１Ｉ−Ｎ、（八ＴＣＣＮＣＬｃ
ＲＬ−８９１０）および前田らがＢｍ−Ｎよりクローニ
ングしたＢｍ−Ｎ２　、Ｂｍ−Ｎ４のようなセルライン
が知られている。８ｍＮＰＶの増殖の良さ、扱いやすさ
の点で、Ｂｍ−８４カイコ樹立培養細胞を使用するのが
適当である。又、感染に用いるカイコ樹立培養細胞は、
公知の培養条件、例えば、１０％小牛脂児血清を含むＴ
’Ｃ−１０培地で２７°Ｃ，４日間の条件で、培養した
ものを使用するのが適当である。

本発明において、目的とするポリペプチドは、前記組換
えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染
させ、増殖させることによって発現される。該組換えウ
ィルスのカイコ樹立培養細胞への感染方法は、公知の方
法が特に制限なく使用される。例えば、準備したカイコ
樹立培養細胞の培養液を容器に入れ、該細胞を容器の底
面に沈着させた後、該容器の底面に付着しているカイコ
樹立培養細胞がはがれないように古い培養液を抜き取り
、安定剤としての牛胎児血清をカイコ培養培地を添加し
、該培養物にｍ換えウィルスを滴下する方法を用いるの
が一般的である。組換えウィルスの増殖は、組換えウィ
ルスを感染させた後、室温付近の温度、例えば、２７゛
Ｃで数日間培養することによって行うことができる。

培養後、感染したカイコ樹立培養細胞培養物は、遠心分
離した後、沈澱した細胞は、ＩＩＴＬシー１　　ｅｎν
蛋白の発現確認及び１（且Ｖｌｅｎｖ蛋白の精製に使用
し、また、上清はカイコ幼虫に感染させる組換えウィル
ス液として使用してもよい。

また、組換えウィルスをカイコ幼虫に感染させる方法も
特に制限されない。一般に、感染させるカイコ幼虫は、
カイコ５令幼虫を使用するのが好ましい。カイコ幼虫へ
の感染は、前記のカイコ樹立培養細胞への感染で上清と
して得られるウィルス力価を高めたｍ換えウィルス液又
は該操作を行なわない組換えウィルス液を経皮的に１０
〜１００μｌ程注入することで行なうことができる。組
換えウィルスを感染させた後、感染カイコを飼育するこ
とで、姐換えウィルスを増殖させ、多角体蛋白とＨＴＬ
Ｖ−１ｅｎｖ蛋白の特定部の融合蛋白がカイコ幼虫の脂
肪体内に蓄積される。

カイコの飼育方法は、特に制限されないが、桑の葉或い
は桑の葉をホモジェネートし、滅藺後凍結乾燥したペー
スト様試料（協同試料（株）社製等）に蒸留水を浸した
ちのいずれかを与え、室温付近の温度、例えば、２７°
Ｃで培養する一般的な方法を採用すればよい。

飼育期間は、カイコ幼虫が死亡する直前まで行なうこと
が好ましい。感染させる組換えウィルス液のウィルスの
力価で飼育期間は多少異なるが、感染して３日〜５日後
を飼育期間の目安とすることができる。

上記のカイコ幼虫から、脂肪体を取り出し、該脂肪体を
特定のＨＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白発現の確認および該Ｈ
ＴＬシー１　　ｅｎｖ蛋白の精製に用いる。

上記脂肪体の取得方法は、組換えウィルスを感染したカ
イコ幼虫を牛腸を切らないように注意深く表皮を切るこ
とで解剖し、牛腸等の器官を除去後、スパチュラ等で下
腹部に蓄積している脂肪体をかき取ることにより取得す
る方法が推奨される。

本発明において、前記方法で得られた岨換えウィルス感
染カイコ樹立培養細胞及び組換えウィルス感染カイコ幼
虫の脂肪体からポリペプチドを分離する方法は特に制限
されないが、例えば、ＰＢＳ緩衝液等の中性緩衝液に該
カイコ樹立培養細胞又は脂肪体を顕濁し、ソニケーショ
ンによる分散後、尿素水溶液を添加して再度ソニケーシ
ョンした後、遠心分離し、沈澱物を回収する方法が好適
である。

また、上記のポリペプチドはｐＢＦベクターの有す多角
体蛋白遺伝子部分の発現による多角体蛋白の一部と）Ｉ
ＴＬＶ−Ｉ　５　”　−３’断片部分の発現によるＦＩ
ＴＬシー１　ｅｎｖ蛋白の特定部の融合蛋白である。

そして、ＨＴＬＶ−Ｉ　　５　”　−３”断片は、前述
した通りｇｐ４６の特定の一部をコードするＤＮＡ配列
部分とｐ２１をコードするＤＮＡ配列部分により構成さ
れている。しかしながら、上記ポリペプチドの分子量は
、１５〜３５ｋｄであり、上記ＤＮＡ配列から予測され
るものより２２１の分子量分だけ小さいものである。そ
して、後述する実施例から明らかな様に、本発明で得ら
れるポリペプチドは、抗多角体蛋白抗体及び！（ＴＬＶ
−１患者血清とは良好に抗原−抗体反応をおこすが、正
常人血清及びｐ２１に対するモノクロナール抗体とは抗
原−抗体反応をおこさない。即ち、該ポリペプチドにお
いて含有されるｆｉＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白は、Ｉ（Ｔ
ＬＶ−Ｔ　５　′−３′断片のうち、上記ｇｐ４６に関
するＤＮＡ配列部分のみの発現物で、ｇｐ４６の抗体に
対して良好な抗原性を有するものである。

尚、得られた該ポリペプチドはそのまま或いは必要に応
じて、化学的あるいは酵素的方法を組合わせて多角体蛋
白部分を除くことにより、更に精製して本発明の診断薬
の抗原として使用される。

多角体蛋白を除く方法を具体的に示せば、多角体蛋白と
）ＩＴＬＶ　−１ｅｎν蛋白部分の接合部付近のアミノ
酸配列を認識する蛋白質分解酵素を使用してその部分を
切断後、ゲル濾過等の分子量の違いを利用した精製手段
で精製するのが良好である。

次に、以上の製法により得られたポリペプチドを抗原に
用いたＨＴＬＶ−１感染者の診断薬について説明する。

即ち、本発明の診断薬は、上記ポリペプチドを抗原とし
、被検液中から該抗原と抗原−抗体反応を生じるｇｐ４
６に対する抗体を、検出することでＨ且シー■への感染
を診断するものである。従って、本発明の診断薬は、Ａ
ＴＬ患者だけでなく、ＩＩＴＬシー■に感染した結果、
該ｇＭ６に対する抗体を保有している未発病者をも診断
するものである。また、上記被検液には、例えばＨＴＬ
Ｖ−Ｉへの感染の診断を所望する検体者より常法に従い
採血した血液から分離された血漿又は血清、或いはこれ
を適当なペプチドを抗原として利用する限り特に制限さ
れることなく公知の免疫学的試験法が採用できる。

好適に採用される方法を例示すると、不溶性担体粒子に
上記ポリペプチドを感作し、抗原−抗体反応によって生
じる該担体粒子の凝集反応を検出する方法及びエンザイ
ムイムノアッセイ法等が挙げられる。また、製造した上
記ポリペプチドが微量であったり、精製不十分である場
合には、ウェスタンプロット法により検出することが好
ましい。

以下、上記した各検出法について説明する。

まず、上記凝集反応を検出する方法において、該凝集反
応は、マイクロタイタープレートのウェル中での粒子の
凝集状態を観察するマイクロタイター法、或いは凝集反
応の進行に伴い減少する測定系の透過率を測定する方法
等の公知の担体粒子凝集物の観察、定量方法により検出
できる。また、用いられる不溶性担体粒子は、抗原−抗
体反応に使用される公知のものが特に躍定されることな
く使用される。好適に使用されるものを例示すると、ヒ
ト　ヒツジ、ニワトリ等の動物赤血球、ポリスチレン、
スチレン−ブタジェン共重合体、ポリグリシジルメタク
リレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタク
リレート、ポリカーボネート等の乳化重合により得られ
る有機高分子ラテックス、無機化合物粒子が重合体層で
被覆された複合重合体粒子、ガラスピーズ、シラスポー
ラスガラな、シリカ、アルミナ等の無機有機粒子が挙げ
られる。このうち、マイクロタイター法の実施に際して
は、特開昭６２−２８６５３３号公報に記載される複合
重合体粒子が、高い単粒子性を有し、非特異的な反応も
少ない為好ましい。上記不溶性担体粒子の平均粒子径は
、０．５〜３．Ｏｌ！ｍ、好ましくは１．０〜２．０μ
ｍのものが用いられる。上記不溶性担体粒子にポリペプ
チドを感作する方法は、特に限定されることなく公知の
抗原感作方法が実施できる。好適な方法を例示すると、
タンニン酸、ゲルタールアルデヒド、ビスジアゾベンジ
ジン、トリレンジイソシアネート　ジクロロニトロヘン
ゼン、カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム等のカ
ップリング剤を用いた化学的結合法、又は物理的吸着法
等が挙げられる。また、不溶性担体粒子−粒子当りに感
作されるポリペプチド量は、ポリペプチド（■）／不溶
性担体粒子の表面積（ｍ２）の比が０．１〜１０■／ｍ
Ｈの範囲にあることが好ましい。

次に、エンザイムイムノアッセイ法は、固相に感作させ
た上記ポリペプチドと反応した被検液中合させた酵素標
識抗体を用いた直接法２間接法等により検出することで
実施できる。使用される固相は、ポリスチレン、ポリカ
ーボネートポリブロビレンおよびポリビニール製等のマ
イクロタイタープレート　ビーズ、スティック、試験管
等の物理的吸着に供される公知の固相が何ら制限される
ことなく使用され、このうち特に市販されるエンザイム
イムノアッセイ用マイクロタイタープレートを用いるこ
とが好ましい。該固相へのポリペプチドの感作は、ポリ
ペプチドを０．０１〜０．１Ｍのリン酸緩衝液に懸濁し
、４〜３７°Ｃで１時間以上放置することで実施できる
。また、固相に感作させるポリペプチド量は、ポリペプ
チド（ｍｇ）／固相の表面積（、”）の比が０．５〜５
０■／ＩＩ２の範囲にあることが好ましい。使用する酵
素標識抗体は、ヒト抗体と反応性を有し、標識酵素が化
学結合したものであれば特に限定されず、例えば市販さ
れるアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ等の酵素で標識されたヤギ抗ヒトＩ
ｇＧ抗体、マウス抗ヒトＩｇＧ抗体ヤギ抗ヒトＩｇ？Ｉ
抗体、マウス抗ヒトＩｇＧ抗体等が使用できる。検出に
用いられる基質は、上記酵素標識抗体に標識された酵素
に応じて適宜使用すれば良く、例えば該酵素としてアル
カリフォスファターゼを選択した場合においては、ｐ−
ニトロフェニルフォスフェート等を使用すれば良い。尚
、測定に際し、被検液である血漿又は血清は、原液い。

また、ウェスタンプロット法は、例えば、Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６．４
３５０（１９７９）においてＴｏｂｔｎ等が提案する公
知の方法に準じて実施する上記文献に記載されるラジオ
オートグラフィー蛍光免疫法及びエンザイムイムノアッ
セイが特に限定されることな〈実施できる。しかしなが
ら、簡便さと保存性の面から上記エンザイムイムノアッ
セイの直接法又は間接法を実施することが好ましい。転
写に用いる膜は、ウェスタンプロットに使用される公知
のものが特に限定されることなく使用できる。好適に使
用されるものを例示すれば、ニトロセルロース膜、ナイ
ロン膜、ポリビニリデンジフルオライド膜、ジアゾ化ア
ミノベンジルオキシメチル膜、ジアゾ化アミノフェニル
チオエーテル膜、ジエチルアミノエチル膜等が挙げられ
、このうちニトロセルロース膜を用いるのが好ましい。

（発明の効果］ て良好な抗原性を有すものである。従って、本発明の診
断薬は、ＨＴＬＶ−Ｉ感染の診断を高感度で行うことが
できる。また、）ＩＴＬＶ−Ｉ感染者の血漿又は血清の
中には、５〜１０％の割合でｇｐ４６を抗原として反応
させた場合しか陽性を示さないものが存在するから、上
記結果をＪ）２１の抗体に対して抗原性を有するポリペ
プチドを抗原に用いた場合の判定結果に補足させること
により、より確実なＨＴＬＶ−Ｉへの感染の診断を行う
ことが可能である。

また、他の非特異的免疫反応を生ずる抗原を含んでいな
いため、ＨＴＬＶ　−１に感染していないにもかかわら
ず陽性としての結果となる偽陽性の被検体を生ずること
なく、ＨＴＬＶ−１感染者の診断を行うことができる。

従って、本発明の診断薬は、例えば輸血における供血者
を被検液として診断すること等により、ＨＴＬＶ−１感
染者を発見しＨＴＬＶ−Ｉへの感染の防止を行うことが
でき、産業上の利用価値は極めて大きいものである。

〔実施例］ 製造例１ （ＨＴＬＶ　　Ｉ　ｅｎｖ蛋白遺伝子由来のＤＮＡの取
得）ＡＴＬ患者末梢血１０ｍｌから公知の方法に従いリ
ンパ球を分離し、該リンパ球をプロテインナーゼＫ（シ
グマ社製ＰＯ３９０）で処理した後、フェノール・クロ
ロホルム抽出エタノール沈澱を行いＡＴＬ患者由来のリ
ンパ球のＤＮＡ　　１ｍｇを得た。

該ＤＮＡ　１０μｇを第４表Ｎｏ、　１に示す組成の溶
液中でＥｃｏＲＩ制限酵素（全酒造（株）製　Ｎｏ、１
０４０）により切断し、エタノール沈澱後、ＴＥ１″１
衝液２００ｕｊ２に溶解した。

そして該溶液を、シー１糖密度勾配遠心（ショ糖１０〜
４０％ｗｔ／ｖｏｌ　、　２６００Ｏｒｐｍ　、　　１
８時間）にかけ、アガロースゲル電気泳動による確認で
２０キロ塩基対に相当するＤＮＡ断片を得た。次にこの
ＤＮＡ断片１．０μｇをシャロン４Ａベクター（ベクタ
ーＤＮＡ、＠佳之　講談社　１９８６参照）のＥｃｏＲ
Ｉ制限酵素切断部位への接続を行い、シャロン４Ａベク
ターに存在するＥｃｏＲＩ切断部位に該ＤＮＡ断片を挿
入した。この接続は、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（全酒造（株
）製　Ｎα２０１１）を用い、接続反応は、第５表に示
すような組成の溶液中で、１５°Ｃ１１２時間行なった
。次いで、得られたＤＮＡについてイン・ビトロ・パッ
ケージングを行なった後、処理液を遠心分離（７０００
ｒｐｍ、　２時間）し、上清をプラークハイブリダイゼ
ーション用の組換えファージ液とした。該組換えファー
ジ液を指示菌ＬＥ３９２　（全酒造（株）製）に感染し
、プラークを形成した後、３Ｚｐでラベルしたｌ！ＴＬ
Ｖ−１ｐｏｌＤＮＡ含有断片をプローブにプラークハイ
ブリダイゼーションを行ない、ＨＴＬＶ−１遺伝子由来
のＤＮＡを含むファージを単離した。得られた組換えフ
ァージを、第４表Ｎｏ、　１に示す組成の溶液中で、Ｈ
ｉｎｄｌＩｌ　（全酒造（株）製）、ＥｃｏＲＩ（全酒
造（株）製　Ｎ（１１０４０）制限酵素により切断し、
ＨＴＬ’／−■遺伝子由来のＤＮＡのうちｅｎｖ−ｐｘ
−ＬＴＲ領域に相当し、かつＨＴＬＶ　−Ｉ　　ｅｎｖ
蛋白をコードするＤＮＡを含む約３．９キロ塩基対のＤ
ＮＡ断片を４００μｇ得た。そして、大腸菌用ベクター
ｐＵＣ１９（全酒造（株）製　Ｎα３２１９）を同様な
条件下でＨｉｎｄ　ｍ　、　ＥｃｏＲＩ制限酵素により
切断し、切断部位への上記ＤＮＡ断片の接続反応を行な
った。得られた接続反応液は、後述する、ＩＩＴＬＶ−
１５′−３′断片を含むＡｃｃ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片
ＤＮＡと、ｐＬｌｃ１８の接続反応液と同様に、大腸菌
ＪＭ１０９　（全酒造（株）製　Ｎ１１９０５２）の形
質転換、ミニ・プレバレージョン、そしてミデイアム・
プレバレージョンへと続く一連の操作に使用した。以上
の操作の結果、ＨＴＬＶ　−１ｅｎｖ−ｐｘ−ＬＴＲ領
域遺伝子に由来するＤＮＡ断片がｐＨｃ１９に正しい方
向で挿入している組換えベクターＰＩＩＴ　３．９　Ｋ
ｂ／　ｐｌＪ（：１９を４００μｇ得た。

上記組換えベクターＰＩＮＴ　３．９Ｋｂ／ｐＵｃ１９
２００μｇを、第４表Ｎへ３に示す組成の溶液中で、Ｐ
ｓｔＩ（全酒造（株）製　Ｎｏ、１０７３）　、　ｌ１
ｉｎｄｌＩＩ　（全酒造（株）製　Ｎ（Ｌ１０６０）を
使用して、切断し、ＨｉｎｄＩ［ＩＰｓｔｌ断片（約１
７００塩基対）を得る。

一方、大腸菌ベクターｐＨｃ１９を第４表隨１に示す組
成の溶液中でＳａ！　１　（全酒造（株）製　Ｎ（Ｌ１
０８０）を使用して切断し、マングビーン・ヌクレアー
ゼ（全酒造（株）　　Ｎｏ、２４２０）処理後、接続し
、Ａｃｃ　Ｉ＋Ｓａｌ　Ｉ　、　Ｈｉｎｃｆｆ制限酵素
切断部位のないｐＵｃ１９を得た。次に、該ｐＵｃ１９
を第４表Ｎα２に示す組成溶液中でｔｌｉｎｄＩ［Ｉ、
　　Ｐｓｔｌを使用して切断し、該ベクターの旧ｎｄ［
［、Ｐｓｔｌ切断部位に上記旧ｎｄｌｕ−Ｐｓｔｌ断片
を接続した。

次いで、接続反応液を大腸菌、ＪＭ１０９の形質転換、
ミニプレバレージョンと続く一連の操作に使用し、Ｈｉ
ｎｄＩ［−Ｐｓｔ　Ｉ断片が上記ｐＵｃ１９ベクターに
正しい方向で挿入している組換えｐｔｌｃ１９ベクター
を４００ｕｇ得た。更に、第４表Ｎα２に示す組成の溶
液中で、組換えｐＵｃ１９ベクターをＡｃｃｌ（全酒造
（株）製　Ｎα１００１）　、　　Ｘｂａｌ　（全酒造
（株）製ｋ１０９３）を使用して切断し、ＨＴＬＶ　−
１ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来するＤＮＡのうち後半部分に
相当するＡｃｅ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片（約１０６０塩
基対）取得した。

一方、組換えベクターＰＨＴ　３．９　Ｋ　ｂ　／ｐＵ
ｃ１９．２００μｇを、第４表胤５に示す組成の溶液中
でＮｃｏ　１　！Ｉ］＊酵素（全酒造（株）製　Ｎ（１
１１６０）を使用して切断し、Ｎｃｏ　Ｉ　−Ｎｃｏ　
Ｉ断片（約６１０塩基対）を得た。一方、大腸菌ベクタ
ーｐｌＪｃ１Ｂ　　（全酒造（株）製　Ｎα３２１８）
を第４表毘３に示す組成の溶液中で旧ｎｃＩＩ制限酵素
（全酒造（株）製　Ｎα１０５９）で切断し、該ベクタ
ーの旧ｎｃｌｌ制限酵素部位に上記Ｎｃｏ　Ｉ　−Ｎｃ
ｏ　Ｔ断片をフィルイン・ライゲーションによって、接
続した。次いで、接続反応液を、大腸菌ＪＭ１０９の形
質転換、ミニ・プレバレーション、そしてミデイアム・
プレバレージョンと続く一連の操作に使用し、Ｎｃｏｌ
　Ｉ　−Ｎｃｏｌ　Ｉ断片が上記ρＵＣｌ３ベクターに
正しい方向で挿入している組換えｐＵｃ１８ベクターを
４００μｇ得た。該ベクターを第４表Ｎｏ、　６に示す
組成の溶液中で、Ｘｂａ　Ｉ　、　Ａｃｃ　Ｉ制限酵素
で切断し、！ＩＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白遺伝子に由来す
るＤＮＡの前半部分に相当するＸｂａ　ｒ　−Ａｃｃ　
Ｉ断片（約５００塩基対）を得た。

次いで、大腸菌ベクターであるｐＵｃ１ｉ９（全酒造（
株）製　Ｎα３３１９）を第４表Ｎｏ、　６に示した組
成の溶液中でＸｂａ　Ｉ制限酵素（全酒造（株）製　Ｎ
α１０９３　）により切断し、得られたベクターと上記
Ａｃｃ　Ｔ　−Ｘｂａ　Ｉ断片及びＸｂａ　ｒ　−Ａｃ
ｃ　Ｔ断片との接続を行なった。そして、接続反応液を
大腸菌ＪＭ１０９の形質転換、ミニ・プレバレージョン
、そしてミデイアム・プレバレージョンへと続く一連の
操作に使用し、ＨＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白遺伝子由来の
ＤＮＡがｐＵｃ１１９ベクターに正しい方向で挿入して
いる組換えベクターｅｎｖ／ｐＵｃ１１９．　２００　
ｕ　ｇを得た。

以上の工程を第６図に示す。

（ＩＪＩ換、えベクターの製造） 前記の方法で得られた組換えベクターｅｎν／ｐＵｃ１
１９．２００μｇを第４表Ｎα６に示す組成の溶液に溶
解し、次いでＸｂａ　Ｉ制限酵素を断続的に９時間添加
していき、切断反応を行なった。アガロースゲル電気泳
動により該切断反応の終了を確認後、更にこの反応液に
Ａｃｃ　Ｉ制限酵素を断続的に４時間添加していき、切
断反応を行なった。

切断後、フェノール抽出、エタノール沈澱を順次行なっ
た後、沈澱したＤＮＡをＴＥ緩衝液（ｐＨ８，０）に溶
解し、該ＤＮＡ溶解液をアガロースゲル電気泳動した。

そしてＨＴＬＶ−Ｉ　　５　’　−３’断片を含むＡｃ
ｃ　Ｉ　−Ｘｂａ　ｒ断片に相当するバンド部分の寒天
片を切り出し、電気泳動による溶出によって該断片を抽
出した。次いで、抽出液を更にフェノール抽出し、エタ
ノール沈澱してＨＴＬＶ−１５’３′３′断含むＡｃｃ
　Ｔ　−Ｘｂａ　Ｉ断片を得た。

ここで、該Ａｃｃ　Ｉ−Ｘｂａ　Ｉ断片に含有されるＨ
ＴＬＶ−１５”−３′断片は、ＨＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋
白遺伝子に由来するＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末端
から下流４９３塩基対で切断した、該切断部位から前記
ＤＮＡの３′末端までのものである。

一方、大腸菌用ベクターｐＵｃ１１Ｂ　（全酒造（株）
製　Ｎα３３１８）　ｌ　０８ｇを第４表Ｎｎ　１に示
す組成の溶液に溶解し、次いでＥｃｏＲｒ制限酵素を断
続的に９時間添加していき、切断反応を行なった。

次いで得られた反応液をアルカリフォスファターゼ懸濁
液（全酒造（株）製　Ｎα２１２０）　１μ２により、
６０°Ｃで３０分間反応させた。アルカリフォスファク
ーゼ反応停止後、該反応液をフェノール抽出、エタノー
ル沈澱し、ＥｃｏＲＩ制限酵素で切断されたｐｔｌｃ１
１８を得た。

そして、ｇ９　ベクタ０．２　ｕ　ｇと前記ＨＴＬＶ−
Ｉ５’３′断片を含むＡｃｃ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｉ断片０
．２５　ｕ　ｇを、第５表に示す溶液中で混合し、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼを用いて、１６“Ｃ，３時間以上、フィ
ルインライゲーションを行なった。

そして該操作により得られた接続反応液２５μ！を大腸
菌Ｊ旧０９のコンピテントセル懸濁液２００μ２に添加
し、氷上で３０分放置した。その後、４２°Ｃで２分間
ヒート・ショックし、更に、室温に戻した後、ＬＢ液体
培地８００μｌを添加し、３７°Ｃで１時間おだやかに
振盪培養した。

該液体培地１００μｌを、アンピシリン１００μｇ　／
　ｍ　ｌを含むＬＢ寒天培地１５ｍｊ２／プレートに接
種後、３７°Ｃで１２時間培養した。培養後出用したシ
ングルコロニー２０個を取す出し、それぞれをアンピシ
リン３０μｇ　／　ｍ　ｌ含むＬＢ液体培地１５ｍ１に
接種し、３７°Ｃで８時間培養した。それぞれの液体培
地から１ｍｊ２ずっ採取し、各採取培地中の大腸菌内に
所在するプラスミドをミニ・プレバレーシコン法により
抽出した。得られた各プラスミドのそれぞれを、Ｅｃｏ
ＲＩ制限酵素及びＢａａ＋ＨＩ制限酵素（全酒造（株）
製　ｋｌｏｌｏ）により切断反応を行った。反応後、各
反応液をアガロースゲル電気泳動し、ＨＴＬＶ−１５′
−３′断片を含むＡｃｃ　Ｉ　−Ｘｂａ　Ｔ断片はｐＵ
ｃｌｌＢに正しい方向で挿入しているプラスミドを確認
した。

このＴＩ！認したプラスミドを所有している大腸菌が存
在する前記液体培地から０．２　ｍ　ｌを採取し、アン
ピシリン１１００ｕ／ｍｊ２を含むＬＢ液体培地５０ｍ
ｆに接種後、３７°Ｃで１２時間培養した。

得られた液体培地中の大腸菌内に所在するプラスミドを
ミデイアム・プレバレージョン法により抽出し、組換え
ベクターＡｃｃ　Ｉ　　Ｅｎｖ（１０００）／ｐＬｌｃ
１１８４００μｇを得た。

該組換えベクターＡｃｃ　Ｉ　　Ｅｎｖ（１０００）／
ｐＨｃ１１８２００μｇをＥｃｏＲ１制限酵素により、
前記と同様の切断条件で切断した。得られた切断物を前
記アガロースゲル電気泳動することで、）ＩＴＬシー１
５’３′断片を含むＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ断片（約
１０００　ｂｐ）０．１５μｇを得た。

又、カイコの発現系ベクターρＢＦ１２４．１０μｇを
ＥｃｏＲｌ制限酵素により、前記と同様な切断条件で切
断し、次いでアルカリフォスフプターゼ処理した。

上記）ＩＴＬＶ−１５’−３’断片を含むＥｃｏＲＩ　
　ＥｃｏＲｌＤＮＡ断片】、２５μｇとＥｃｏＲｌ制限
酵素で切断されたｐＢＦ１２４　０．２μｇを混合し、
Ｔ４ＤＮＡリガーゼにより前述と同様な方法で接続反応
を行なつた。

そして、前記と同様な方法により、この接続反応液を用
いた大腸菌ＪＭ１０９の形質転換及び、該形質転換菌の
分離を行なった。次いで、分離された各培養物ごとで一
連のミニ・プレバレージョン操作を実施し、それぞれの
液体培地の一部からプラスミドを抽出した。

次いで、各プラスミドに対して、ＥｃｏＲｌ制限酵素及
びＢａｍＨｌ制限酵素による切断反応を行い、アガロー
スゲル電気泳動により、ＨＴＬＶ−１５’　−３’断片
を含むＥｃｏＲＩ　−ＥｃｏＲＩ　Ｄ　Ｎ　ＡがｐＢＦ
１２４に正しい方向に挿入されているプラスミドを確認
した。

このＴＪｌｉＰａしたプラスミドを所有している大腸菌
が存在する液体培地から０．２　ｍ　ｌを採取し、アン
ピシリン３０μｇ　／　ｍ　１を含むＬＢ液体培地５０
ｍ１に接種後、３７°Ｃで１２時間培養した。

該液体培地中の大腸菌内に存在するプラスミドをミデイ
アム・プレバレージョン法により抽出し、組換えベクタ
ーＡｃｃｌ　　Ｅｎｖ（１０００）／ｐＢＦ！２４２０
０　ｐｇを得た。この組換えベクターＡｃｃ　Ｉ　　Ｅ
ｎｖ（１０００）’／ρＢＦ１２４はＥ、ｃｏｌｉに導
入し、得られる微生物をＥ、ｃｏｌｉ　　Ａｃｃ　Ｉ　
　Ｅｎｖ（１０００）／　ｐＢＦ１２４として工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託した。寄託番号は微工研
菌寄第１０２９２号（ＦＥＲＭ−ｐ１０２９２）である
。

以上の工程を第７図に示す。

（組換えウィルスの製造） ＢｍＮＰｖＴ３株のウィルスＤＮＡと前記組換えベクタ
ーＡｃｃ　Ｉ　　Ｅｎｖ（１０００）／ｐＢＦ１２４と
が１　：　１００のモル比に調合された第１表の組成液
１２４５μｌを、第１表の組成液■　２５５μ２と混合
した。

第　　　１　　　表 生じた？Ａ濁液０．５　ｍ　ＱをＴＣＩＯ（第２表）の
培地のカイコ樹立培養細胞ＢｍＮＡ液（４Ｘ１０’Ｂｍ
ｃｅｌｌｓ／　ｍｌ）５　ｍｌに加え、２７°Ｃ２２０
時間の培養により、Ａｃｃ　Ｉ　　Ｅｎｖ（１０００）
／ｐＢＰ１２４とＢｍＮＰＶＤＮＡのカイコ樹立細胞へ
の導入を行った。得られた培養物は、更にＴＣ−１０培
地の交換を行った後、２７°Ｃで６日間培養した。次い
でこの培養物を遠心分離（１５００ｒｐｍ、　　１０分
間）し、得られた上清を組換えウィルスのクローニング
用反応液とした。

該クローニング用反応液をＴＣ−１０培地で１０−’、
　１０−’、　１０−’に希釈し、それぞれ１０ｍ２の
希釈反応液とした。該希釈反応液に対して、それぞれカ
イコ樹立培養細胞８ｍＮ４液（１０’　Ｂｍｃｅｌｌｓ
／ｍｌ＞　１０ｍＩ！を混合し、該混合液を２００μｆ
ｆｉずつ９６穴のマイクロタイター・トレーの中に分注
し、２７°Ｃで４日間培養した。４日間培養後、マイク
ロタイター・トレーを検鏡し、細胞表面が粗く変形しウ
ィルスが感染した形態を示しているカイコ樹立培養細胞
で且つ該細胞内に多角体蛋白が検出されないウェルを見
い出し、そこから培養物を回収した。得られた培養物を
遠心分離（１５００ｒｐｍ、　１０分）し、上清１５０
ｕｆｆｉを組換えウィルスのポリペプチド発現用反応液
とした。該ポリペプチド発現用反応液は、プラーク検定
でｌＸｌ０’ＰＦＵ／ｍｊ！の力価を示す組換えウィル
ス液であった。

尚、上記Ｔ（、−１０の培地は第２表の培地９００ｍｆ
をｐＨ６，３０〜６．３５に調整し、濾過滅菌後、牛胎
児血清１００ｍｆを添加することにより調製される。

第 表 培−ｊＬＪＬ−皮 ａＣＩ Ｃｆｆ１ ＣａＣｆｚ　　・　２ＨｚＯ ＭｇＣｆ　２　　・　６Ｈ２０ ＭｇＣｆ、　　・　７Ｈ２０ Ｔｒｙｐｔｏｓｅ Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｎｅ Ｓｏｌｎ　　Ａ” ５ｏｌｎ　　Ｂ” ５ｏｌｎ　　Ｃ”” ８．０ で全量９００ｍｆとする ０、５ｇ ２．８７ｇ １、３２　ｇ ２．２８ｇ ２、７８　ｇ ２．０ｇ ０．３ｇ １００　　　ｍｌ １００　　　ｍｌ 　　　ｍｌ −ｙ±Ｌ灯１１皮 Ｌ−Ａｒｇｉｎｍｅ Ｌ−Ａｓｐａｔｉｃ　ａｃｉｄ Ｌ−＾ｓｐａｒａｇｉｎｅ　−ＨＩ３ しＡｌａｎｉｎｅ β−Ａｌａｎｉｎｅ Ｌ−Ｇ１ｕｔａａ＋ｉｃ　ａｃｉｄ Ｌ−Ｇ１ｕｔａ糟１ｎｅ Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｌ−旧５ｔｉｄｉｎｅ Ｌ−１ｓｏｌｅｕｃｉｎｅ Ｌ−Ｌｅｕｃｉｎｅ Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ−ＩＣＩ Ｌ−Ｍｅｔｈｉｏｕｉｎｅ Ｌ−Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｌ−Ｐｈｅｎｙｌａ　ａｎｆｎｅ ＤＬ−Ｓｅｒｕｎｅ Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎａ＋ｅ ５、７９　ｇ ３．５ｇ ３．９８ｇ ２．２５ｇ ２．０ｇ ６．０ｇ ３．０ｇ ６．５ｇ ２５．０ｇ ０．５ｇ ０、７５　ｇ ６、２５　ｇ ０．５ｇ ３．５ｇ １．５ｇ １１．０ｇ １、７５　ｇ ご’５ｏｌｎ　Ｂ（７）、１吸 Ｌ−Ｃｙｓｔｉｎｅ Ｌ−Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｅ Ｈ，０で全量１０００ｍ　ｌとする ０、　２５　ｇ １．０ 二二士壮し以λ」戚 Ｔｈｉａｍｉｎｅ−ＨＣｆ Ｒｉｂｏ目ａｖｉｎｅ Ｄ−Ｃａ　　ｐａｎｔｏｔｈｅｎａｔｅＰｒｙｄｏｘｉ
ｎｅ　　−ＨＣｆ Ｐａｒａ−ａｍｉｎｏｂｅｎｚｏｉｃ　　ａｃｉｄＦｏ
ｌｉｃ　　ａｃｉｄ Ｎｉｃｏｔｉｎｉｃ　　ａｃｉｄ Ｉｓｏ−１ｕｏｓｉｔｏｌ １ｏｔｉｎ ２、０　ｍ　ｇ ２、０　ｍ　ｇ ２、０　ｍ　ｇ ２、０　ｍ　ｇ ２、０　ｍ　ｇ ２、０　ｍ　ｇ ２．０ｍｇ ２、０　ｍ　ｇ １、０　ｍ　ｇ Ｂ２０で全量１０００ｍ　ｌとする （ポリペプチドの製造） 上記ポリペプチド発現用反応’１１１１００　ｕ　ｅを
カイコ樹立培養細胞８ｍＮ４液（１０５Ｂｍｃｅｌｌｓ
／ｍ　ｌ　）３０ｍｆに添加し、２７°Ｃ，５日間培養
した。５日間培養後、培養物を回収し、遠心分離（１５
００ｒｐｍ、　１５分）した。

沈澱物（ウィルス成熟細胞）をＰ　Ｂ　Ｓ　Ｉｌｌ液液
洗浄し５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩｌ（ｐｔ！７．４　
）　４００　ｕ　１に懸濁、ソニケーション後、遠心分
離（８０００ｒｐｍ２０分）した。沈澱物として得られ
たポリペプチド９０μｇにレムリ緩衝液２００μｌを添
加、懸濁したものを、煮沸し、遠心した上清をＳＤＳゲ
ル電気泳動の試料とした。

ＳＤＳゲル電気泳動の結果、この試料は、約２０ｋｄの
位置にバンドが検出された。（第８図に図示）この分子
量は、予測される、ｐＢＰ１２４の有する多角体蛋白遺
伝子部分がコードする多角体蛋白部分（約４．５　ｋ　
ｄ　）とＨＴＬＶ−１５”　−３’断片がコードするＨ
ＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白部分く約３５．５　ｋ　ｄ　）
の合計分子量よりも、ｐ２１の分子量分（約２０ｋｄ）
だけ小さいものである。なお、第８図は、８ｍ細胞内で
のＨＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白発現をＳＤＳゲル電気泳動
で確認したものである。第８図において１ａｎｅ　１は
サイズマーカー、１ａｎｅ　２は非感染カイコ細胞の蛋
白、１ａｎｅ　３はＡｃｃ　Ｉ　　Ｅｎｖ（１０００）
／ｐＢＦ１２４を使用した組換えウィルスを感染したカ
イコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。

一次抗体として、正常人血清、抗多角体蛋白抗体、ＨＴ
ＬＶ−Ｉ　Ｐ　２１に対するモノクロナール抗体、及び
患者血清を使用したウェスタン・プロット実験の結果、
該２０ｋｄのポリペプチドが抗多角体蛋白抗体、患者血
清に対しては陽性で、正常人血清、ＨＴＬＶ−１ｐ２１
に対するモノクロナール抗体に対しては陰性であること
を確認した（第９図に図示）。この結果は該ポリペプチ
ドが、多角体蛋白部分と、ＨＴＬＶ　−１ｇｐ４６の抗
体に対して抗原性を有する部分の融合蛋白であることを
示している。

尚、第９図はＢ１１細胞内でのＨＴＬＶ　−Ｉ　　ｅｎ
ｖ蛋白発現をウェスタン・プロット法で１ｉ１！認した
ものである。

１ａｎｅ　１はサイズマーカー、１ａｎｅ　２〜１ａｎ
ｅ　５は抗原としてＡｃｃ　Ｉ　　Ｅｎｖ（１０００）
／ｐＢＦ１２４を使用したＮｉ換えウィルスを感染した
カイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。

ウェスタン・プロッティングは、第３表に示した一次抗
体及び二次抗体を使用して、アビジン、ビオチンを基質
としたペルオキシダーゼによる呈色反応で行なった。

（）内は希釈率を示した 製造例２ 製造例１で得たポリペプチド発現用反応液１００μにを
カイコ樹立培養細胞液（１０５Ｂｍｃｅｌｌｓ／ｍ　ｆ
２．　）３０ｍ／！に添加し、２７°Ｃ，５日間培養し
た。５日間培養後、培養物を回収し遠心分離（１５００
ｒｐｍ。

１５分）した、上清を０．　ｌ　ｍ　ｌずつ５令１日目
のカイコ１００匹にそれぞれ経皮的に注入し、２５°Ｃ
で５日間、全集のペースト片を与えて飼育後、解剖し、
脂肪体を集めた。該脂肪体にＰＢＳ緩衝液１０ｍ１を加
え懸濁し、ソニケーション後、遠心分１１ｉＩ　（８０
００ｒｐｍ、　　２０分）し、沈澱物５ｍ！！、を取得
した。該沈澱物を再度ソニケーションし、Ｂｉｏ−ＲＡ
Ｄプロティン・アッセイにより、ポリペプチド量を測定
した結果７．５　ｍ　ｇであった。

ポリペプチド量測定後、５０μ！をレムリ緩衝液５０μ
２に懸濁し、煮沸し、遠心した上清をＳＤＳゲル電気泳
動の試料°とした。

ＳＤＳ電気泳動の結果、分子量約２０ｋｄの位置にバン
ドが検出された。製造例１と同じウェスタン・プロット
実験を行い、この２０ｋｄのポリペプチドが多角体蛋白
部分と）ＩＴＬＶ　−１ｇｐ４６の抗体に対して抗原性
を有する部分とを含む融合蛋白であることを確認した。

製造例３ 製造例１の（組換えベクターの製造）において、組換え
ベクターｅｎｖ／ｐＨｃ１１９のＸｂａ　Ｉ制限酵素に
よる切断後の更なる切断をＰνｕＩＩ制限酵素（宝酒造
（株）製　Ｎａ１０７６Ｂ）　ニより行なイＨＴＬＶ−
１５’−３′断片を含むＰｖｕ　ｎ　−Ｘｂａ　１断片
を得た以外は、製造例１と同様の方法を実施した。ここ
で、該Ｐｖｕ　ＩＩ　−Ｘｂａ　１断片に含有されるＨ
ＴＬＶ−１５−３’断片は、ＨＴＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白
遺伝子に由来するＤＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末端か
ら下流７３塩基対で切断され、該切断部位から上記ＤＮ
Ａの３′末端までのものである。尚、Ｐｖｕ　ＩＩ制限
酵素の切断反応は、第４表阻４に示す組成の溶液中で行
なった。また、上記操作で得られるカイコの発現系ベク
ター　ｐＢＦ１２４　ニＨＴＬＶ−１５’　−３’断片
が挿入された組換えベクターＰｖｕＩＩ　ｔ！ｎｖ（１
５００）／ｐＢＦ１２４は、該ベクターをＥ、ｃｏｌｉ
に導入し、得られる微生物をＥ、ｃｏｌｉ　　Ｐｖｕ　
ＩＩ　Ｅｎｖ（１５００）／ｐＢＦ１２４として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託した。寄託番号は、微
工研菌寄第１０２９３号（ＰＥＲＭ−Ｐ１０２９３）で
ある。

上記操作の結果、ｌμｇのポリペプチドを得た。

ＳＤＳ電気泳動の結果、このポリペプチドは、分子量約
３２．５　ｋｃｌの位置にバンドが検出された。また、
実施例１と同じウェスタン・プロット実Ｕを行いこのポ
リペプチドが、多角体蛋白部分とＩＩＴＬＶ−Ｉｇｐ４
６の抗体に対して抗原性を有する部分の融合蛋白である
ことを確認した（第１０図に回示）。

製造例４ 製造例３に於いて得られるポリペプチド発現用反応液を
用い、製造例２と同様な方法によりポリペプチドを取得
した。得られたポリペプチドは７５μｇで、ＳＯ３電気
泳動の結果、このポリペプチドは、分子量約３２．５　
ｋ　ｄの位置にバンドが検出された。また、製造例１と
同じウェスタン・プロット実験を行い、このポリペプチ
ドが、多核体蛋白部分とＩＩＴＬＶ−１ｇｐ４６の抗体
に対して抗原性を有する部分の融合蛋白であることを確
認した。

第 表 第　　　５　　　表 ５０　ｍ　Ｍ　　　Ｔｒｉｓ−ＩＣＲ（ｐＨ７，４）１
０　ｍＭ　　　ＭｇＣｊ！　ｚ ｌ　０　ｍＭ　　　ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（Ｄ
ＴＴ）１ｍＭ　　　ＡＴＰ 実施例１ 特開昭６２−２８６５３３号公報実施例１の方法に従っ
て、複合重合体粒子を製造した。即ち、撹拌機付きガラ
ス製フラスコ中にメタノール２８００ｃｃ、アンモニア
水（２５重量％）６１６ｃｃ、水酸化ナトリウム水溶液
（５モル／１）２１ｃｃを加え１０°Ｃに保った後に、
テトラエチルシリケートのメタノール溶液（２２％）　
１４２８ｃｃを攪拌しながら２５．５　ｃｃ／ｈｒの滴
下速度で添加して反応した。その後シリカ粒子を大量の
メタノール中でデカンテーションを繰り返して精製した
。

得られたシリカ粒子を沈降させ、上澄をのぞき、蒸留水
を加え、分散させ、さらに沈降させる操作を２回繰り返
し、粒子を洗浄した後、分散濃度１０ｗｔ％になるよう
に蒸留水を添加し、シリカ分散液を得た。

攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、上記
で得られたシリカ分散液１００ｍｆｆ１を加えて４０°
Ｃに保ち、窒素雰囲気下、攪拌下にロアミリモルのグリ
セロールメタクリレートと過硫酸カリウムを２．９ミリ
モル／ｌとなるように添加した。次いで４０″Ｃに保温
し撹拌下４時間重合を行った。重合後、遠心分離で上澄
を捨て、沈澱した複合重合体粒子を蒸留水に再分散させ
た。この操作を６回繰り返し、沈澱を洗浄し、精製した
複合重合体粒子を得た。

次いで、該複合重合体粒子の０．０２Ｍ　　ＰＢＳ緩衝
液（ｐＨ７，２＞への５％分散液を、前記製造例２に従
って得たポリペプチドが１０μｇ　／　ｍ　ｌの濃度で
１％ＳＤＳ含有Ｉ　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＦＩＣｊ！　（ｐ）
１７．４　）緩衝液に懸濁している懸濁液と等量混合し
た。室温下で１時間の放置後、０．０２Ｍ　　ＰＢＳｉ
衝液（ｐＨ７，２）を用いた遠心分離により粒子の洗浄
を行い、得られたポリペプチド感作粒子が５％濃度で分
散した溶液を調合した。

ＡＴＬ患者血清、正常ヒト血清、全身性エリテマトーデ
ス患者血清、原発性胆汁性肝硬変患者血清、リウマチ患
者血清のそれぞれの被検液につき、２倍希釈液を原液と
し倍数希釈法に従ってリン酸緩衝液（ｐ）１７．２）を
用いた希釈を行い１．昏希釈液をマイクロタイタープレ
ートのウェル中に２５μｌずつ加えた。次いで、前記調
合した感作粒子溶液を、該ウェル中に２５μ２ずつ加え
ていき、３分間の攪拌の後室温下で放置した。３０分後
、粒子の凝集状態を観察し各被検液ごとで、粒子リング
が明らかに大きく、リング内に凝集粒子が膜状に広がっ
ているものが認められるウェルにおける希釈液の最高希
釈倍数をもとめ、鋭敏性を評価した。そして、抗体価が
８以上になる被検液を陽性であると診断した。以上の結
果を第６表に示す。

第　　　６　　　表 実施例２ 製造例２に従って得たポリペプチドの代わりに製造例４
に従って得たポリペプチドを用いる以外は、実施例１と
同様な方法で、各被検液のＨＴＬＶＩ感染の診断を行な
った。診断結果は、実施例１と同一のものが得られた。

比較例Ｉ ＭＴ−２細胞（Ｇａｎｎ　７２巻９８９頁１９８１年参
照）を１０％仔ウシ血清を含むＲＰＭＩ　１６４０培地
（ＭＡＢ社製　Ｎα５３０−０５８９１　）で３７°Ｃ
にて３日間培養した。その後、該培養上清を１１０００
０ｒｐ、３０分間遠心分離し、上清を回収し、該回収し
た上清を１００，０００ｇで２時間超遠心分離し、沈渣
を得た。

該沈渣を、０．０１　Ｍ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｉ　緩衝液（
ｐＨ７，４）（１００ｍＭ　ＮａＣ１１０ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡを含む）で溶解した後、３０．ＯＯＯｒｐｍ　１時
間遠心分離し、該上清を回収した、２０〜６５％のシボ
糖密度勾配液を作成し、それに上記上清を層積し、３０
．００Ｏｒｐｍで１８時間超遠心処理し、ＭＴ−２細胞
の可溶性細胞質蛋白液を得た。次いで、製造例２で得た
ポリペプチドに変えて、上記可溶性細胞質蛋白を用いる
以外は、実施例１と同様な方法で、各被検液の）ＩＴＬ
Ｖ−１感染の診断を行なった。結果を第７表に示す。

第 表 実施例３ 製造例２に従って得たポリペプチドを、０Ｄ２８゜値が
０．４となるように１％ＳＤＳ含有Ｉ　Ｍ　ＴｒｉｓＨ
ＣＩ　（ｐＨ７，４）緩衝液に希釈し、エンザイムイム
ノアッセイ用マイクロタイターのカップに１５０μ２加
えた。４°Ｃで１夜間放置し、その後排液し、脱イオン
水にてカップを洗浄した。こうして得られたポリペプチ
ドが感作したエンザイムイムノアッセイ用マイクロタイ
ターのカップに、実施例１で使用した各種被検液のＰＢ
Ｓ緩衝液による１００倍希釈液を１００μ！加えた。３
７°Ｃで１時間放置した後、脱イオン水にてカップを洗
浄し、抗ヒ）１ｇＧ抗体−アルカリホスファターゼコン
ジュゲートのリン酸緩衝液溶液１００μｌを加えた。３
７°Ｃで１時間放置後、脱イオン水にてカップを洗浄し
、！質（ｐ−ニトロフェニルフォスフェートを４ｍｇ／
ｍｊ２となるように４　ｍ　Ｍ　ＭｇＣｌ　ｚ含有炭酸
緩衝液（ｐＨ９，５）に溶解したもの）１００μｌを加
えた。３７°Ｃで１時間放置後、Ｉ　Ｎ　ＮａＯＨ１０
０ｕＮを加えて反応を停止し、００４゜、値を求めた。

該ＯＤ４゜、値が０．０７以上となるものを、陽性の被
検液であると診断したところ、実施例１と同一の診断結
果が得られた。

実施例４ 製造例１に従って得たポリペプチドのＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行った後、実施例１で用いた各
種被検液の３％牛アルブミン含有リン酸緩衝液（ｐｌ＋
７．２　）による１０倍希釈液を一次抗体として、エン
ザイムイムノアンセイによるウェスタン・プロット実験
を行なった。尚、転写用膜には、ニトロセルロース膜を
使用し、二次抗体には、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒ
トＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ社製　Ｎ１１５０−０４１０−
０６）とペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＭ　　（
Ｖｅｃｔｏｒ社製　Ｎ（１５０−０４１００３）の１：
１混合液を使用した。また、呈色液には、０．０５ｎｏ
ｌ　　Ｔｒｉｓ−）ＩＣ！　緩衝液（ｐＨ７，２）　２
０ｍ　（１３，３′−ジアミノベンジジン４塩酸塩１０
ｍｇ。

３０％過酸化水素水１０μ２の組成のペルオキシダーゼ
用呈色液を使用した。呈色してバンドが認められたもの
の、−次抗体に使用した被検液を、陽性と診断したとこ
ろ、実施例１と同一の診断結果が得られた。

実施例５ 製造例１に従って得たポリペプチドの代わりに、製造例
３に従って得たポリペプチドを用いる以外は、実施例４
と同様なウェスタン・プロット法を実施して、各被検液
の１（ＴＬＶ−Ｉ感染の診断を行なった。診断結果は、
実施例１と同一のものが得られた。

【図面の簡単な説明】

第１図はカイコ核多角体病ウィルスのＤＮＡの制限酵素
地図、第２図はｐＢＦベクターの制限酵素地図、第３回
はＨＴＬＶ　−Ｉ　　ｅｎν蛋白の遺伝子およびアミノ
酸配列図、第４図はｐＢＦベクターの種類、第５図はカ
イコ核多角体病ウィルスおよび組変えウィルスが感染し
たカイコ細胞、第６図は１（ＴＬＶ　−Ｉ　　ｅｎｖ蛋
白遺伝子由来のＤＮＡの調整法、第７図は組変えベクタ
ーの調整法、第８図はカイコ樹立培養細胞内で発現した
ポリペプチドをＳＤＳゲル電気泳動で確認した写真、第
９図および第１０図はカイコ樹立培養細胞内でのｔ（Ｔ
ＬＶ　−１ｅｎｖ蛋白発現をウェスタン・プロット法で
確認した写真をそれぞれ示す。 Ｈｄ　ｍ　・・・Ｈｉｎｄ　［［、Ｎ−Ｎｃｏ　Ｉ　、
　Ａｃ−”　Ａｃｃ　Ｉ　ＸＥｃ−・・ＥｃｃＲ【、Ｓ
ｐ・・・５ｐｈ１１Ｓａ・・・Ｓａｌ【、旧ｆｌ−Ｈｉ
ｎｃＩｌ、Ｂ　−・・Ｂａｍｆｌ　Ｉ、Ｘ−Ｘｂａ　Ｉ
　、Ｐｖ−Ｐｖｕ　ＩＩ特許出願人　　徳山曹達°株式
会社 １図 第２ 第５Ｂ 〜くν盲に 手 続 補 正 一午 （方式） ％式％ １、事件の表示 特！ｍｌ平１−２０１３４１号 ２、発明の名称 成人Ｔ細胞白血病つィルス感染診衛薬 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住　所　　　山口県徳山市御影町１番１号同 発送日 平成１年１２月２６日

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 成人Ｔ細胞白血病ウィルス外皮蛋白遺伝子に由来するＤ
   ＮＡのうち、該ＤＮＡの５′末端から下流７３塩基対以
   上４９３塩基対以下の範囲内で切断した、該切断部位か
   ら前記ＤＮＡの３′末端までの断片により、カイコ核多
   角体病ウィルスの多角体蛋白構造遺伝子の一部の組換え
   を行い、次いで該組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞
   またはカイコ幼虫に感染させて発現されたポリペプチド
   を抗原とする成人Ｔ細胞白血病ウィルス感染診断薬。