JPH02284060A - 成人t細胞白血病ウイルス感染診断薬 - Google Patents

成人t細胞白血病ウイルス感染診断薬

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JPH02284060A
JPH02284060A JP1201341A JP20134189A JPH02284060A JP H02284060 A JPH02284060 A JP H02284060A JP 1201341 A JP1201341 A JP 1201341A JP 20134189 A JP20134189 A JP 20134189A JP H02284060 A JPH02284060 A JP H02284060A
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博 丹生谷
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勤 小倉
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、成人T細胞白血病(Adult Tcell
leukemia ;以下ATLと略記する)の病因で
ある成人T細胞白血病ウィルス(Human Tcel
l leukemiavirus−1;以下HTLV−
1と略記する)の、表存蛋白gp46の抗体に対して抗
原性を有するポリペプチドを抗原として用いる新規な[
1TLV−1感染診断薬に関する。
〔従来の技術〕
ATLは、成人が罹病する悪性の疾患であり、その病因
はRTLV−Iの感染によるもので、感染者のうち0.
1%前後の頻度で発病することが知られている。この〇
TLV−1の感染経路としては、輸血感染、母子感染、
性的感染等が知られており、)!TLV−1g染者を早
期発見し、こうした感染の防止に努めることが望まれて
いる。
従来、こうしたHTLV−1感染診断薬としては、HT
LV −1に感染した場合に血漿又は血清中に生ずる成
人T細胞白血病関連抗原に対する抗体の検出を、成人T
細胞白血病関連抗原産生細胞の可溶性細胞質蛋白及びH
TLV −1の可溶化処理蛋白から選ばれた少なくとも
1種(特開昭58−187861号公報)、或いは該細
胞を界面活性剤により処理して得た抗原蛋白及びHTL
V−1ウィルス粒子を利用して行うもの(特開昭59−
62527号公報)が知られている。
しかしながら、該診断薬は、T細胞膜、核等、成人T細
胞白血病関連抗原以外の非特異的な反応を示す抗原をも
含んでおり、かかる抗原の非特異的免疫反応によりいわ
ゆる偽陽性の検体が生じ、HTLV−1感染の診断精度
が低下するという問題があった。
また、HTLV−1に対して抗原性を有するポリペプチ
ドを生産するために、)ITLV−1の外皮蛋白(en
velope protein  ;以下enV蛋白と
略記する)の遺伝子で組換えられた大腸菌を増殖させ、
産生ずるポリペプチドを回収する方法が試みられている
しかしながら、上記方法によって得られるポリペプチド
は、HTLV−1の抗体に対する抗原性が低いものであ
った。これは大腸菌等の細菌類内では産生ずるポリペプ
チドに対して、糖鎖付加反応等の修飾がないことによる
ものと推定される。
一方、診断薬として有用な蛋白の構造遺伝子をカイコ核
多角体病ウィルスDNAの多角体蛋白構造遺伝子部分に
組み換えた組換えウィルスを、カイコ樹立培養細胞又は
カイコ生体中で増殖させるポリペプチドの製造方法が、
特開昭62−208276号公報及び特開昭61−92
88号公報において知られている。
ところが、これらの公報には、前記した+1 T L 
V■の抗原蛋白であるポリペプチドの製造に対して上記
の方法を適用することに関しては何の具体的な記載もな
い。かかる方法によるHTLV−Iの抗原蛋白であるポ
リペプチドを製造するには、IITLVIの構造遺伝子
のいかなる部分によってカイコ核多角体病ウィルスDN
Aの多角体蛋白構造遺伝子を組換えるか、また、これに
よりポリペプチドの産生が可能であるか、更にはポリペ
プチドが得られた場合、該ポリペプチドがHTLV−1
の抗体に対して抗原性を有するかどうかについては、更
に数多くの研究が必要であった。
また、本発明者等は、既にBmNPVの多角体蛋白構造
遺伝子の一部が、HTLV −1env蛋白遺伝子に由
来するDNAのうち、p21をコードするDNAを含み
且つ該D N Aの5′末端から上流の17塩基対以内
で切断された断片で組換えられた組換えウィルスをカイ
コ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染させ、該組換えウ
ィルスを増殖させることを特徴とするポリペプチドの製
造方法を提案した。
該製造方法で得られるポリペプチドは、HTLV−1の
膜中及び膜の内側に位置し、抗原性の高い蛋白であるp
21を含むため、ATL診断薬の抗原として有用である
。しかしながら、ATLの診断は該抗原を用いた診断薬
と検定血清との反応性を判定しただけでは十分ではない
。なぜならば、HTLシーIのenv蛋白は、上記p2
1の他に表作蛋白であるgp46により構成されている
。そして、該gp46は、蛋白自体の抗原性はp21に
比して低いものである。
しかしながら、ATL患者の血清の中には、いかなる理
由からか5〜10%の割合でgp46を抗原として反応
させた場合しか陽性を示さないものが存在する。従って
、ATLの診断をより完全に行うためには、診断薬の抗
原としてはp21だけでなくgp46も補足して用い、
HTLV−I抗体陽性および陰性を総合的に判定しなけ
ればならない。
〔発明が解決しようとする課題〕
本発明の課題は、上記従来技術の問題点を克服して、上
記gp46に対する抗体に対して高い抗原性を有するポ
リペプチドを開発し、該ポリペプチドを抗原として用い
たF!TLV−1感染の診断において極めて高怒度で精
度良く診断できる診断薬を提供することにある。
〔課題を解決するための手段〕
本発明者等は、上記gp46の抗体に対して抗原性を有
するポリペプチドを抗原とした診断薬を間発すべ(研究
を重ねた。その結果、HTLV −1env蛋白遺伝子
に由来するDNAを、該DNAの5′末端から下流のあ
る特定の範囲内で切断して得られる断片で、カイコ核多
角体病ウィルス(BombyxNuclear Po1
yhedrosis Virus;以下、Ba+NPV
と略記する)の多角体蛋白構造遺伝子の一部を組換えた
組換えウィルスを、カイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫
に感染することによって発現させたポリペプチドを抗原
として用いることで、かかる目的を達成し得ることを見
い出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、HTLV  I env蛋白遺伝子に
由来するDNAのうち、3g D N Aの5′末端か
ら下流73塩基対以上493塩基対以下の範囲内で切断
した、該切断部位から前記DNAの3′末端まテノ断片
(以下、HTLV−15′−3’断片と略す)により、
BmNPVの多角体蛋白構造遺伝子の一部の組換えを行
い、次いで該組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞又は
カイコ幼虫に感染させて発現されたポリペプチド抗原と
するIITLV−I W染診断薬である。
本発明の診断薬において、抗原として用いるポリペプチ
ドは、上記11TLV−15’ −3’断片により、B
mNPVの多角体蛋白遺伝子の一部の組換えを行い、次
いで咳組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ
幼虫に感染させて発現されたものである。
以下、該ポリペプチドの製法について詳細に説明する。
1、組換えウィルスの製法 本発明において、上記ポリペプチドの製法に用いる組換
えウィルスの製法は特に制限されるものではない。代表
的な製法として、ATL患者末梢血からリンパ球を分離
し、該リンパ球から抽出したDNAよりHTLv−15
’ −3’断片を切り出し、これをカイコ発現系ベクタ
ー(pBFベクター)のクローニング部位に挿入して、
組換えベクターとし、次いで該ベクターを用いて)IT
LV−I 5’−3”断片をBmNPVの多角体蛋白構
造遺伝子の一部と組換えることにより製造する方法が挙
げられる。
−L二」−ユ1ユ圓− 本発明において、HTLV−15”−3”断片によって
組換えられるBmNPVは、養蚕業者に広く知られてい
るものであり、前用、古沢らが単離した代表的な株とし
て13株があり、この株のウィルスDNAは、米国のA
TCC(American Type Cu1ture
Collection)にATCCk4018Bとして
寄託されており、容易に入手し得る。又、BsNPVに
感染したカイコより公知の方法によって単離することも
できる。
上記BwNPVのDNAは、第1図の制限酵素地図で表
わすことができる。
このBmNPV  D N Aのうち本発明において、
)ITLv−15’ −3’断片によって組換えられる
部分は、第1図に示される多角体蛋白遺伝子のうちプロ
モータ一部分を除いた多角体蛋白構造遺伝子の一部分で
ある。
1−21(TLシー15’−3’  の′8HTLV−
1は遺伝子としてRNAを持つレトロウィルスであり、
感染細胞内でこの遺伝子RNAに由来して合成されるD
NAのenv遺伝子を中心とする塩基配列としては、5
eiki らが Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 IJSA 80 
” (1983)第3621頁で発表したものが知られ
ている。
上記塩基配列のうち、HTLシー1 env蛋白遺伝子
に由来するDNAとは、第3図に示す通り5180番目
から6643番目の配列をいう。即ち、この配列部分は
、1(TLV −1の表作蛋白であるgp46をコード
する5180番目から6115番目まテノ配列と、HT
LV−1の膜中及び膜の内側に位置する蛋白であるp2
1をコードする6116番目から6643番目までの配
列によって構成されている。
本発明において、HTLV−15’ −3”断片の取得
方法は特に制限されない。代表的な方法にはATL患者
末梢血中のリンパ球に所在するDNAから該HTLV−
I 5 ’ −3’断片を取得する方法が挙げられる。
代表的な方法を例示すれば、まず、ATL患者末梢血か
らリンパ球を分離し、該リンパ球からDNAを抽出し、
次いで制限酵素EcoRIで切断し、約20キロ塩基対
断片を含むDNAを得、該DNAをシャロン(ct+a
ron)  4 Aベクターの1!coRI制限酵素切
断部位に接続した後、FITLV−1のプロウィルスを
含むファージをスクリーニングで単離し、該プロウィル
スからpUCベクターに代表される大腸菌のベクター系
を使用したサブ・クローニング及び制限酵素による切断
によりHTLV−I 5”−3”断片を得る方法である
11TLV−15’ −3’断片は、HTLV −1e
nv蛋白遺伝子に由来するDNAのうち、該DNAの5
′末端から下流73塩基対以上493塩基対以下の範回
内で切断した、該切断部位から前記DNAの3゛末端ま
での断片であればすべて適用できる。該HTLV−15
’ −3′断片を、前記5eikiらが発表している)
ITLV −1er1v蛋白遺伝子配列で説明すると5
253番目から5673番目以内で切断され、該切断部
位から6643番目までの断片に相当する。即ち、HT
LV−15’ −3’断片は、HTLV  I  en
v蛋白遺伝子のうち、gp46をコードするDNA配列
部分の特定の一部とp21をコードするDNA配列部分
より構成されている。
上記切断部位の好適なる部位を示せば、HTLVl e
nv蛋白遺伝子に由来するDNAの5′末端から下流へ
494塩基対隔てた位置よりCGと配列しているAcc
f制限酵素切断部位、或いは上記DNAの5′末端から
下流へ74塩基対隔てた位置にCと配列しているPvu
 n制限酵素切断部位等が挙げられる。
また、該)ITLV−I 5 ” −3′断片は、後述
するカイコ発現系ベクターに挿入可能な大きさである限
り、上記切断部位、及びHTLV−1遺゛伝子に由来す
るDNAのうちenv蛋白遺伝子の3゛末端より下流に
存在する任意の制限酵素切断部位で切断した断片に含ま
れた形で採取して用いるのが好適である。代表的なen
v蛋白遺伝子の3′末端より下流に存在する制限酵素切
断部位としては、該3′末端から下流へ87塩基対隔て
た位置よりTGCAと配列しているPstl制限酵素切
断部位等が挙げられる。
但し、本発明者等の知見によれば、組換えに用いる断片
は、上記)ITLV−15’−3’断片を含んでいても
、HTLV −I  env蛋白遺伝子に由来するDN
Aの5゛末端の下流73塩基対より、上流の塩基配列を
含んでいる場合、後記する方法によりこの断片を用いて
得られたBmNPVの組換えウィルスをカイコ樹立培養
細胞又はカイコ幼虫に感染してポリペプチドを産生しよ
うとしても、生産量が極度に低下してしまう。例えば、
HTLV −1env蛋白遺伝子に由来するDNAの全
配列を用いた場合、ポリペプチドの合成はほとんど進行
しない。
また、組換えに用いる断片が、)ITLV −1enν
蛋白遺伝子に由来するDNAの5′末端の下流493塩
基対より、更に下流で切断したものである場合、得られ
るポリペプチドは、gp46の抗体に対して抗原性を有
しなくなる。
従ッテ、本願発明(7)HTLV−15’ −3′断片
は11TLV −I  env蛋白遺伝子に由来するD
NAのうち、該DNAの5′末端から下流73塩基対以
上493塩基対以下の範囲内で切断したものであること
が掻めて重要である。
本発明において、前記HTLV−15”−3’断片は、
カイコ発現系ベクターに組換えられた後、該組換えベク
ターによりBmNPVの多角体蛋白構造遺伝子の一部と
組換えて組換えウィルスとされる0組換えウィルス取得
のために使用するカイコ発現系ベクターとしては、pB
Fベクターが挙げられる。
pBFベクターは、第2図の制限酵素地図により特徴づ
けられるものである。即ちpBFベクターは、BmNP
V D N Aの多角体蛋白遺伝子のプロモーター領域
と多角体蛋白構造遺伝子前後付近及び大腸菌のベクター
であるpUCベクターの遺伝子とを含むベクターである
上記pBFベクターは、Xbal  + EcoRIS
tul  制限酵素切断部位のクローニング部位がある
かかるpBFベクターは、そのクローニング部位の上流
に塩基配列ATGから始まる多角体蛋白構造遺伝子をど
の部位まで含んでいるかで種類があり、第4図に示すよ
うなpBF4〜pB、F133が存在している。
組換えベクターの製造においては、上記ベクターのうち
挿入するI(TLV−15″−3′断片部分とpBFベ
クター上流部分とのリーディング・フレームが合うもの
であれば、どのベクターを使用してもよい。しかし、5
 ’ −3’断片をカイコ樹立培養細胞及びカイコ幼虫
で効率よく発現できる組換えウィルスを作成するために
は、塩基配列ATGから開始されるBmNPV D N
 A由来の多角体蛋白構造遺伝子の一部をコードした遺
伝子部分を多く含んでいるpBFベクター、例えばpB
F124゜p B F129 、  p B F133
等のpBFベクターを使用するのが望ましい。
上記pBFベクターへのHTLV−15’ −3’断片
の挿入は、pBFベクターのクローニング部位に存在す
るEcoRI 、  Xba I 、  Stu I制
限酵素切断部位を利用して行なえばよい。pBFベクタ
ークローニング部位にIITLV−15′−3’断片を
挿入するには、DNA合成又は大腸菌のベクター系であ
るpUCベクターへの挿入、切断等の公知の手段により
、該断片の両端にEcoRI 、Xba I或いはSt
u?制限酵素切断部位を接続するか、該断片の5′端に
EcoRr、3′端にStu I制限酵素切断部位を接
続するか、更には該断片の5′端にXba I、3′端
に5tul制限酵素切断部位を接続するかのいずれかの
操作が一般に行われる。以上のうちでも、11TLV−
75’−3’断片の両端にEcoRI或いはXba I
制限酵素切断部位を接続する方法が好ましい。
そして5 ’ −3’断片の両端にEcoRI制限酵素
切断部位を接続する場合、該断片はpBFベクターをE
coRI制限酵素で切断したものと接続する。又、HT
LV−15’ −3’断片の両端ニxba■制限酵素切
断部位を接続した場合も同様に、該断片はpBFベクタ
ーをXba Iで切断したものと接続する。この場合接
続に際しては、予め制限酵素で切断したpBFベクター
に対し、アルカリフォスファターゼ処理を行ない、pB
Fベクターのセルフライゲーシゴン(selfliga
tion)を避けることが好ましい。
又、HTLV−15’ −3’断片の5′端にEcoR
丁、3′端にStu I制限酵素切断部位を接続する場
合、該断片は、pBFベクターをEcoR1、Stu 
Iで切断したものと接続し、HTLV−I  5’−3
’断片の5′端にXba I、3′端にStu I制限
酵素切断部位を接続する場合、該断片は、pBFベクタ
ーをXbal、5tuIで切断したものと接続すればよ
い。
かかる接続方法は、リガーゼを用いて公知の方法により
行うことができる。例えば制限酵素で切断されたpBF
ベクターのDNAの量に対して、挿入すべき5′−3’
断片のDNA1lが3〜8倍量になるように調整し、例
えばT4DNAリガーゼを用いて接続する方法である。
上記の’ATI、’J−15’ −3’断片を挿入した
pBF’ベクターの分離及び確認は、下記の方法により
行うことができる。
即ち、分渭は前記の接続反応液をJM109株(宝酒造
(株)製 No、9052) 、MV11B4株(宝酒
造(株)製)で代表される大腸菌のコンピテントセルに
加え、公知の方法で大腸菌の形質転換を行ない、pBF
ベクターがアンピシリン耐性遺伝子を含んでいることか
ら、形質転換後の液をアンピシリンを含んだLB寒天培
地に接種し、室温以上の適当な温度、例えば37°Cで
12時間〜20時間培養して出現するシングル・コロニ
ーを形質転換株として取得することによって行うことが
できる。
また、HTLV−r 5 ′−3’断片を挿入したpB
Fベクターの確認は、形質転換株に存在する徂換えベク
ターボイリング法(boiling法)或いはアルカリ
・リシス法(alkali Iysis法)を用いてミ
ニ“プレバレージョン(a+ini preparat
ion)  シ、組換えベクター懸濁液を取得し、この
ようにして調製した組換えベクター懸濁液をHTLV−
15’ −3’断片が挿入されていることが確認できる
任意の制限酵素、例えばEcoRI 、  Xba I
で切断し、切断物をアガロースゲル電気泳動し、エチジ
ウム・ブロマイドによる染色後、予想できる位置にバン
ドが存在するか否かを確認することによって行うことが
できる。尚、5”−3’断片の両端をEcoRI或いは
Xba I制限酵素切断部位にしたものをpBFヘクタ
ーのEcoRl 、  Xba I制限酵素切断部位に
挿入した組換えベクターの場合は、pBFベクターの上
流部分と挿入する5”−3”断片が正しい方向に結合し
ているかどうか確認できる制限酵素、例えば、Ban+
HI 、  Xho I等で切断し、その切断物を同様
にアガロースゲル電気泳動し、エチジウム・ブロマイド
による染色後、予想できる位置にバンドが存在するか否
かも同時に確認するとよい。
上記方法で形質転換株として分離した組換えベクターは
、該形質転換株を増殖させることにより、その量を増加
させて使用することが好ましい。例えば該組換えベクタ
ーを所有する形質転換株をアンピシリンを含んだLB液
体培地に接種し、室温以上の適当な温度、例えば37°
Cで12時間〜20時間振盪培養し、該培養物からアル
カリ・リシス法(alkali 1ysis法)を用い
てミデイアム・プレパレーシゴン(lIlidiurm
 preparation) シ、組換えベクター懸濁
液を取得することによって行うことができる。
取得した組換えベクターも前記した方法と同様な方法で
再度目的の組換えベクターであるか否かを確認すること
が好ましい。
得られた組換えベク外:U濁液は、アールエヌエース処
理(RNase処理)して組換えウィルス取得用の組換
えベクター懸濁液として使用することが好ましい。
l−3−えウィルスの 本発明において、IITLV−15’ −3’断片によ
って、多角体蛋白構造遺伝子の一部が組換えられた組換
えBmNPVは、BmNPV D N Aと前記組換え
ベクターとをカイコ樹立培養細胞にカルシウム沈澱法を
用いて、同時にトランスフェクション(コ・トランスフ
ェクション)し、組換えベクターとBmNPVDNA間
の対立遺伝子を置き換えることにより取得することがで
きる。
上記のコ・トランスフェクションは、具体的には0.2
5 M塩化カルシウム及びキャリヤDNAの存在下でB
mNPV D N Aと組換えベクターDNAをモル比
1 : 100になる様に混ぜ、その後、該混合液に、
0.28 M塩化ナトリウムを含む)! E P E 
S 緩衝液(pH7,1>とリン酸緩衝液の混合液を添
加し、混和後、該混和液を8m培養細胞中に添加すると
いう前用、古沢らの方法(特公昭61−9297号)に
従って行なうことが望ましい。
コ・トランスフェクションした後、組換えウィルスを含
む反応液は室温付近の温度、例えば27°Cで5〜6日
間培養し、培養後、培地を回収、遠心後、上清を組換え
ウィルスのクローニングに使用する。コ・トランスフェ
クションで得られた反応液の上清からの組換えウィルス
のクローニングは、プラークアッセイ法(J、 5er
ic Sci、 Jpn。
d  547(1984)  )やリミッティング・ダ
イリューション法により組換えウィルスを単離すること
によって行えばよい。どちらの方法を使用しても良いが
、操作法の容易さ、分離回数の少なくて済む点から、リ
ミッティング・ダイリューション法を使用する方が良好
である。
上記リミッティング・ダイリューション法を使用しての
組換えウィルスのクローニングは、コ・トランスフェク
ションで得られたウィルス液を希釈し、該ウィルス希釈
液と1×105〜1×lohカイコ細胞数/ m 1カ
イコ培養培地、好ましくはTC−10培地(第2表参照
)の濃度で調整しであるカイコ樹≠培養細胞液とを1:
lで混合することにより感染させ、この混合液をマイク
ロタイタートレー中のウェルへ注入し、室温付近の温度
、例えば27°Cで培養し、培養2〜7日後、マイクロ
タイタートレー中のウェルを検鏡し、ウェル中で見られ
るカイコ細胞の形状、珍態で組換えウィルス存在の有無
を判定する。検鏡することで見い出されるカイコ細胞の
形態には、第5図に示すように3種類確認できる。
第5図におけるウィルスが感染した形態を示しているカ
イコ細胞で且つ該細胞内に多角体蛋白が検出されない細
胞のみが存在しているウェル中の培地を回収、遠心し、
その上清を回収することにより組換えウィルス液が得ら
れる。ウェル中に野生株であるBmNPVと組換えウィ
ルスとが混在している場合は、該ウェル中の培地を回収
し、リミッティング・グイリュージョンを繰り返し行な
い、組換えウィルスを分離することが好ましい。
■、ポリペプチドの製造 カイコ 本発明において組換えウィルスを感染させるカイコ樹立
培養細胞としては、BmNPVが増殖できるカイコ樹立
培養細胞であれば、どの細胞でも良い。
BmNPVが増殖可能なカイコ樹立培養細胞には、Vo
lkman、 L、E、、 and Goldsmit
h、 P、A、 (1982):^pp1. Envi
ron、 Microbio+、、 44.227−2
33に示されているB11I−N、(八TCCNCLc
RL−8910)および前田らがBm−Nよりクローニ
ングしたBm−N2 、Bm−N4のようなセルライン
が知られている。8mNPVの増殖の良さ、扱いやすさ
の点で、Bm−84カイコ樹立培養細胞を使用するのが
適当である。又、感染に用いるカイコ樹立培養細胞は、
公知の培養条件、例えば、10%小牛脂児血清を含むT
’C−10培地で27°C,4日間の条件で、培養した
ものを使用するのが適当である。
本発明において、目的とするポリペプチドは、前記組換
えウィルスをカイコ樹立培養細胞又はカイコ幼虫に感染
させ、増殖させることによって発現される。該組換えウ
ィルスのカイコ樹立培養細胞への感染方法は、公知の方
法が特に制限なく使用される。例えば、準備したカイコ
樹立培養細胞の培養液を容器に入れ、該細胞を容器の底
面に沈着させた後、該容器の底面に付着しているカイコ
樹立培養細胞がはがれないように古い培養液を抜き取り
、安定剤としての牛胎児血清をカイコ培養培地を添加し
、該培養物にm換えウィルスを滴下する方法を用いるの
が一般的である。組換えウィルスの増殖は、組換えウィ
ルスを感染させた後、室温付近の温度、例えば、27゛
Cで数日間培養することによって行うことができる。
培養後、感染したカイコ樹立培養細胞培養物は、遠心分
離した後、沈澱した細胞は、IITLシー1  enν
蛋白の発現確認及び1(且Vlenv蛋白の精製に使用
し、また、上清はカイコ幼虫に感染させる組換えウィル
ス液として使用してもよい。
また、組換えウィルスをカイコ幼虫に感染させる方法も
特に制限されない。一般に、感染させるカイコ幼虫は、
カイコ5令幼虫を使用するのが好ましい。カイコ幼虫へ
の感染は、前記のカイコ樹立培養細胞への感染で上清と
して得られるウィルス力価を高めたm換えウィルス液又
は該操作を行なわない組換えウィルス液を経皮的に10
〜100μl程注入することで行なうことができる。組
換えウィルスを感染させた後、感染カイコを飼育するこ
とで、姐換えウィルスを増殖させ、多角体蛋白とHTL
V−1env蛋白の特定部の融合蛋白がカイコ幼虫の脂
肪体内に蓄積される。
カイコの飼育方法は、特に制限されないが、桑の葉或い
は桑の葉をホモジェネートし、滅藺後凍結乾燥したペー
スト様試料(協同試料(株)社製等)に蒸留水を浸した
ちのいずれかを与え、室温付近の温度、例えば、27°
Cで培養する一般的な方法を採用すればよい。
飼育期間は、カイコ幼虫が死亡する直前まで行なうこと
が好ましい。感染させる組換えウィルス液のウィルスの
力価で飼育期間は多少異なるが、感染して3日〜5日後
を飼育期間の目安とすることができる。
上記のカイコ幼虫から、脂肪体を取り出し、該脂肪体を
特定のHTLV −1env蛋白発現の確認および該H
TLシー1  env蛋白の精製に用いる。
上記脂肪体の取得方法は、組換えウィルスを感染したカ
イコ幼虫を牛腸を切らないように注意深く表皮を切るこ
とで解剖し、牛腸等の器官を除去後、スパチュラ等で下
腹部に蓄積している脂肪体をかき取ることにより取得す
る方法が推奨される。
本発明において、前記方法で得られた岨換えウィルス感
染カイコ樹立培養細胞及び組換えウィルス感染カイコ幼
虫の脂肪体からポリペプチドを分離する方法は特に制限
されないが、例えば、PBS緩衝液等の中性緩衝液に該
カイコ樹立培養細胞又は脂肪体を顕濁し、ソニケーショ
ンによる分散後、尿素水溶液を添加して再度ソニケーシ
ョンした後、遠心分離し、沈澱物を回収する方法が好適
である。
また、上記のポリペプチドはpBFベクターの有す多角
体蛋白遺伝子部分の発現による多角体蛋白の一部と)I
TLV−I 5 ” −3’断片部分の発現によるFI
TLシー1 env蛋白の特定部の融合蛋白である。
そして、HTLV−I  5 ” −3”断片は、前述
した通りgp46の特定の一部をコードするDNA配列
部分とp21をコードするDNA配列部分により構成さ
れている。しかしながら、上記ポリペプチドの分子量は
、15〜35kdであり、上記DNA配列から予測され
るものより221の分子量分だけ小さいものである。そ
して、後述する実施例から明らかな様に、本発明で得ら
れるポリペプチドは、抗多角体蛋白抗体及び!(TLV
−1患者血清とは良好に抗原−抗体反応をおこすが、正
常人血清及びp21に対するモノクロナール抗体とは抗
原−抗体反応をおこさない。即ち、該ポリペプチドにお
いて含有されるfiTLV −1env蛋白は、I(T
LV−T 5 ′−3′断片のうち、上記gp46に関
するDNA配列部分のみの発現物で、gp46の抗体に
対して良好な抗原性を有するものである。
尚、得られた該ポリペプチドはそのまま或いは必要に応
じて、化学的あるいは酵素的方法を組合わせて多角体蛋
白部分を除くことにより、更に精製して本発明の診断薬
の抗原として使用される。
多角体蛋白を除く方法を具体的に示せば、多角体蛋白と
)ITLV −1enν蛋白部分の接合部付近のアミノ
酸配列を認識する蛋白質分解酵素を使用してその部分を
切断後、ゲル濾過等の分子量の違いを利用した精製手段
で精製するのが良好である。
次に、以上の製法により得られたポリペプチドを抗原に
用いたHTLV−1感染者の診断薬について説明する。
即ち、本発明の診断薬は、上記ポリペプチドを抗原とし
、被検液中から該抗原と抗原−抗体反応を生じるgp4
6に対する抗体を、検出することでH且シー■への感染
を診断するものである。従って、本発明の診断薬は、A
TL患者だけでなく、IITLシー■に感染した結果、
該gM6に対する抗体を保有している未発病者をも診断
するものである。また、上記被検液には、例えばHTL
V−Iへの感染の診断を所望する検体者より常法に従い
採血した血液から分離された血漿又は血清、或いはこれ
を適当なペプチドを抗原として利用する限り特に制限さ
れることなく公知の免疫学的試験法が採用できる。
好適に採用される方法を例示すると、不溶性担体粒子に
上記ポリペプチドを感作し、抗原−抗体反応によって生
じる該担体粒子の凝集反応を検出する方法及びエンザイ
ムイムノアッセイ法等が挙げられる。また、製造した上
記ポリペプチドが微量であったり、精製不十分である場
合には、ウェスタンプロット法により検出することが好
ましい。
以下、上記した各検出法について説明する。
まず、上記凝集反応を検出する方法において、該凝集反
応は、マイクロタイタープレートのウェル中での粒子の
凝集状態を観察するマイクロタイター法、或いは凝集反
応の進行に伴い減少する測定系の透過率を測定する方法
等の公知の担体粒子凝集物の観察、定量方法により検出
できる。また、用いられる不溶性担体粒子は、抗原−抗
体反応に使用される公知のものが特に躍定されることな
く使用される。好適に使用されるものを例示すると、ヒ
ト ヒツジ、ニワトリ等の動物赤血球、ポリスチレン、
スチレン−ブタジェン共重合体、ポリグリシジルメタク
リレート、アクロレイン−エチレングリコールジメタク
リレート、ポリカーボネート等の乳化重合により得られ
る有機高分子ラテックス、無機化合物粒子が重合体層で
被覆された複合重合体粒子、ガラスピーズ、シラスポー
ラスガラな、シリカ、アルミナ等の無機有機粒子が挙げ
られる。このうち、マイクロタイター法の実施に際して
は、特開昭62−286533号公報に記載される複合
重合体粒子が、高い単粒子性を有し、非特異的な反応も
少ない為好ましい。上記不溶性担体粒子の平均粒子径は
、0.5〜3.Ol!m、好ましくは1.0〜2.0μ
mのものが用いられる。上記不溶性担体粒子にポリペプ
チドを感作する方法は、特に限定されることなく公知の
抗原感作方法が実施できる。好適な方法を例示すると、
タンニン酸、ゲルタールアルデヒド、ビスジアゾベンジ
ジン、トリレンジイソシアネート ジクロロニトロヘン
ゼン、カルボジイミド類、キノン類、塩化クロム等のカ
ップリング剤を用いた化学的結合法、又は物理的吸着法
等が挙げられる。また、不溶性担体粒子−粒子当りに感
作されるポリペプチド量は、ポリペプチド(■)/不溶
性担体粒子の表面積(m2)の比が0.1〜10■/m
Hの範囲にあることが好ましい。
次に、エンザイムイムノアッセイ法は、固相に感作させ
た上記ポリペプチドと反応した被検液中合させた酵素標
識抗体を用いた直接法2間接法等により検出することで
実施できる。使用される固相は、ポリスチレン、ポリカ
ーボネートポリブロビレンおよびポリビニール製等のマ
イクロタイタープレート ビーズ、スティック、試験管
等の物理的吸着に供される公知の固相が何ら制限される
ことなく使用され、このうち特に市販されるエンザイム
イムノアッセイ用マイクロタイタープレートを用いるこ
とが好ましい。該固相へのポリペプチドの感作は、ポリ
ペプチドを0.01〜0.1Mのリン酸緩衝液に懸濁し
、4〜37°Cで1時間以上放置することで実施できる
。また、固相に感作させるポリペプチド量は、ポリペプ
チド(mg)/固相の表面積(、”)の比が0.5〜5
0■/II2の範囲にあることが好ましい。使用する酵
素標識抗体は、ヒト抗体と反応性を有し、標識酵素が化
学結合したものであれば特に限定されず、例えば市販さ
れるアルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、グル
コースオキシダーゼ等の酵素で標識されたヤギ抗ヒトI
gG抗体、マウス抗ヒトIgG抗体ヤギ抗ヒトIg?I
抗体、マウス抗ヒトIgG抗体等が使用できる。検出に
用いられる基質は、上記酵素標識抗体に標識された酵素
に応じて適宜使用すれば良く、例えば該酵素としてアル
カリフォスファターゼを選択した場合においては、p−
ニトロフェニルフォスフェート等を使用すれば良い。尚
、測定に際し、被検液である血漿又は血清は、原液い。
また、ウェスタンプロット法は、例えば、Proc。
Natl、 Acad、 Sci、 USA 76.4
350(1979)においてTobtn等が提案する公
知の方法に準じて実施する上記文献に記載されるラジオ
オートグラフィー蛍光免疫法及びエンザイムイムノアッ
セイが特に限定されることな〈実施できる。しかしなが
ら、簡便さと保存性の面から上記エンザイムイムノアッ
セイの直接法又は間接法を実施することが好ましい。転
写に用いる膜は、ウェスタンプロットに使用される公知
のものが特に限定されることなく使用できる。好適に使
用されるものを例示すれば、ニトロセルロース膜、ナイ
ロン膜、ポリビニリデンジフルオライド膜、ジアゾ化ア
ミノベンジルオキシメチル膜、ジアゾ化アミノフェニル
チオエーテル膜、ジエチルアミノエチル膜等が挙げられ
、このうちニトロセルロース膜を用いるのが好ましい。
(発明の効果] て良好な抗原性を有すものである。従って、本発明の診
断薬は、HTLV−I感染の診断を高感度で行うことが
できる。また、)ITLV−I感染者の血漿又は血清の
中には、5〜10%の割合でgp46を抗原として反応
させた場合しか陽性を示さないものが存在するから、上
記結果をJ)21の抗体に対して抗原性を有するポリペ
プチドを抗原に用いた場合の判定結果に補足させること
により、より確実なHTLV−Iへの感染の診断を行う
ことが可能である。
また、他の非特異的免疫反応を生ずる抗原を含んでいな
いため、HTLV −1に感染していないにもかかわら
ず陽性としての結果となる偽陽性の被検体を生ずること
なく、HTLV−1感染者の診断を行うことができる。
従って、本発明の診断薬は、例えば輸血における供血者
を被検液として診断すること等により、HTLV−1感
染者を発見しHTLV−Iへの感染の防止を行うことが
でき、産業上の利用価値は極めて大きいものである。
〔実施例] 製造例1 (HTLV  I env蛋白遺伝子由来のDNAの取
得)ATL患者末梢血10mlから公知の方法に従いリ
ンパ球を分離し、該リンパ球をプロテインナーゼK(シ
グマ社製PO390)で処理した後、フェノール・クロ
ロホルム抽出エタノール沈澱を行いATL患者由来のリ
ンパ球のDNA  1mgを得た。
該DNA 10μgを第4表No、 1に示す組成の溶
液中でEcoRI制限酵素(全酒造(株)製 No、1
040)により切断し、エタノール沈澱後、TE1″1
衝液200uj2に溶解した。
そして該溶液を、シー1糖密度勾配遠心(ショ糖10〜
40%wt/vol 、 2600Orpm 、  1
8時間)にかけ、アガロースゲル電気泳動による確認で
20キロ塩基対に相当するDNA断片を得た。次にこの
DNA断片1.0μgをシャロン4Aベクター(ベクタ
ーDNA、@佳之 講談社 1986参照)のEcoR
I制限酵素切断部位への接続を行い、シャロン4Aベク
ターに存在するEcoRI切断部位に該DNA断片を挿
入した。この接続は、T4DNAリガーゼ(全酒造(株
)製 Nα2011)を用い、接続反応は、第5表に示
すような組成の溶液中で、15°C112時間行なった
。次いで、得られたDNAについてイン・ビトロ・パッ
ケージングを行なった後、処理液を遠心分離(7000
rpm、 2時間)し、上清をプラークハイブリダイゼ
ーション用の組換えファージ液とした。該組換えファー
ジ液を指示菌LE392 (全酒造(株)製)に感染し
、プラークを形成した後、3Zpでラベルしたl!TL
V−1polDNA含有断片をプローブにプラークハイ
ブリダイゼーションを行ない、HTLV−1遺伝子由来
のDNAを含むファージを単離した。得られた組換えフ
ァージを、第4表No、 1に示す組成の溶液中で、H
indlIl (全酒造(株)製)、EcoRI(全酒
造(株)製 N(11040)制限酵素により切断し、
HTL’/−■遺伝子由来のDNAのうちenv−px
−LTR領域に相当し、かつHTLV −I  env
蛋白をコードするDNAを含む約3.9キロ塩基対のD
NA断片を400μg得た。そして、大腸菌用ベクター
pUC19(全酒造(株)製 Nα3219)を同様な
条件下でHind m 、 EcoRI制限酵素により
切断し、切断部位への上記DNA断片の接続反応を行な
った。得られた接続反応液は、後述する、IITLV−
15′−3′断片を含むAcc I −Xba I断片
DNAと、pLlc18の接続反応液と同様に、大腸菌
JM109 (全酒造(株)製 N119052)の形
質転換、ミニ・プレバレージョン、そしてミデイアム・
プレバレージョンへと続く一連の操作に使用した。以上
の操作の結果、HTLV −1env−px−LTR領
域遺伝子に由来するDNA断片がpHc19に正しい方
向で挿入している組換えベクターPIIT 3.9 K
b/ plJ(:19を400μg得た。
上記組換えベクターPINT 3.9Kb/pUc19
200μgを、第4表Nへ3に示す組成の溶液中で、P
stI(全酒造(株)製 No、1073) 、 l1
indlII (全酒造(株)製 N(L1060)を
使用して、切断し、HindI[IPstl断片(約1
700塩基対)を得る。
一方、大腸菌ベクターpHc19を第4表隨1に示す組
成の溶液中でSa! 1 (全酒造(株)製 N(L1
080)を使用して切断し、マングビーン・ヌクレアー
ゼ(全酒造(株)  No、2420)処理後、接続し
、Acc I+Sal I 、 Hincff制限酵素
切断部位のないpUc19を得た。次に、該pUc19
を第4表Nα2に示す組成溶液中でtlindI[I、
  Pstlを使用して切断し、該ベクターの旧nd[
[、Pstl切断部位に上記旧ndlu−Pstl断片
を接続した。
次いで、接続反応液を大腸菌、JM109の形質転換、
ミニプレバレージョンと続く一連の操作に使用し、Hi
ndI[−Pst I断片が上記pUc19ベクターに
正しい方向で挿入している組換えptlc19ベクター
を400ug得た。更に、第4表Nα2に示す組成の溶
液中で、組換えpUc19ベクターをAccl(全酒造
(株)製 Nα1001) 、  Xbal (全酒造
(株)製k1093)を使用して切断し、HTLV −
1env蛋白遺伝子に由来するDNAのうち後半部分に
相当するAce I −Xba I断片(約1060塩
基対)取得した。
一方、組換えベクターPHT 3.9 K b /pU
c19.200μgを、第4表胤5に示す組成の溶液中
でNco 1 !I]*酵素(全酒造(株)製 N(1
1160)を使用して切断し、Nco I −Nco 
I断片(約610塩基対)を得た。一方、大腸菌ベクタ
ーplJc1B  (全酒造(株)製 Nα3218)
を第4表毘3に示す組成の溶液中で旧ncII制限酵素
(全酒造(株)製 Nα1059)で切断し、該ベクタ
ーの旧ncll制限酵素部位に上記Nco I −Nc
o T断片をフィルイン・ライゲーションによって、接
続した。次いで、接続反応液を、大腸菌JM109の形
質転換、ミニ・プレバレーション、そしてミデイアム・
プレバレージョンと続く一連の操作に使用し、Ncol
 I −Ncol I断片が上記ρUCl3ベクターに
正しい方向で挿入している組換えpUc18ベクターを
400μg得た。該ベクターを第4表No、 6に示す
組成の溶液中で、Xba I 、 Acc I制限酵素
で切断し、!ITLV −1env蛋白遺伝子に由来す
るDNAの前半部分に相当するXba r −Acc 
I断片(約500塩基対)を得た。
次いで、大腸菌ベクターであるpUc1i9(全酒造(
株)製 Nα3319)を第4表No、 6に示した組
成の溶液中でXba I制限酵素(全酒造(株)製 N
α1093 )により切断し、得られたベクターと上記
Acc T −Xba I断片及びXba r −Ac
c T断片との接続を行なった。そして、接続反応液を
大腸菌JM109の形質転換、ミニ・プレバレージョン
、そしてミデイアム・プレバレージョンへと続く一連の
操作に使用し、HTLV −1env蛋白遺伝子由来の
DNAがpUc119ベクターに正しい方向で挿入して
いる組換えベクターenv/pUc119. 200 
u gを得た。
以上の工程を第6図に示す。
(IJI換、えベクターの製造) 前記の方法で得られた組換えベクターenν/pUc1
19.200μgを第4表Nα6に示す組成の溶液に溶
解し、次いでXba I制限酵素を断続的に9時間添加
していき、切断反応を行なった。アガロースゲル電気泳
動により該切断反応の終了を確認後、更にこの反応液に
Acc I制限酵素を断続的に4時間添加していき、切
断反応を行なった。
切断後、フェノール抽出、エタノール沈澱を順次行なっ
た後、沈澱したDNAをTE緩衝液(pH8,0)に溶
解し、該DNA溶解液をアガロースゲル電気泳動した。
そしてHTLV−I  5 ’ −3’断片を含むAc
c I −Xba r断片に相当するバンド部分の寒天
片を切り出し、電気泳動による溶出によって該断片を抽
出した。次いで、抽出液を更にフェノール抽出し、エタ
ノール沈澱してHTLV−15’3′3′断含むAcc
 T −Xba I断片を得た。
ここで、該Acc I−Xba I断片に含有されるH
TLV−15”−3′断片は、HTLV −1env蛋
白遺伝子に由来するDNAのうち、該DNAの5′末端
から下流493塩基対で切断した、該切断部位から前記
DNAの3′末端までのものである。
一方、大腸菌用ベクターpUc11B (全酒造(株)
製 Nα3318) l 08gを第4表Nn 1に示
す組成の溶液に溶解し、次いでEcoRr制限酵素を断
続的に9時間添加していき、切断反応を行なった。
次いで得られた反応液をアルカリフォスファターゼ懸濁
液(全酒造(株)製 Nα2120) 1μ2により、
60°Cで30分間反応させた。アルカリフォスファク
ーゼ反応停止後、該反応液をフェノール抽出、エタノー
ル沈澱し、EcoRI制限酵素で切断されたptlc1
18を得た。
そして、g9 ベクタ0.2 u gと前記HTLV−
I5’3′断片を含むAcc I −Xba I断片0
.25 u gを、第5表に示す溶液中で混合し、T4
DNAリガーゼを用いて、16“C,3時間以上、フィ
ルインライゲーションを行なった。
そして該操作により得られた接続反応液25μ!を大腸
菌J旧09のコンピテントセル懸濁液200μ2に添加
し、氷上で30分放置した。その後、42°Cで2分間
ヒート・ショックし、更に、室温に戻した後、LB液体
培地800μlを添加し、37°Cで1時間おだやかに
振盪培養した。
該液体培地100μlを、アンピシリン100μg /
 m lを含むLB寒天培地15mj2/プレートに接
種後、37°Cで12時間培養した。培養後出用したシ
ングルコロニー20個を取す出し、それぞれをアンピシ
リン30μg / m l含むLB液体培地15m1に
接種し、37°Cで8時間培養した。それぞれの液体培
地から1mj2ずっ採取し、各採取培地中の大腸菌内に
所在するプラスミドをミニ・プレバレーシコン法により
抽出した。得られた各プラスミドのそれぞれを、Eco
RI制限酵素及びBaa+HI制限酵素(全酒造(株)
製 klolo)により切断反応を行った。反応後、各
反応液をアガロースゲル電気泳動し、HTLV−15′
−3′断片を含むAcc I −Xba T断片はpU
cllBに正しい方向で挿入しているプラスミドを確認
した。
このTI!認したプラスミドを所有している大腸菌が存
在する前記液体培地から0.2 m lを採取し、アン
ピシリン1100u/mj2を含むLB液体培地50m
fに接種後、37°Cで12時間培養した。
得られた液体培地中の大腸菌内に所在するプラスミドを
ミデイアム・プレバレージョン法により抽出し、組換え
ベクターAcc I  Env(1000)/pLlc
118400μgを得た。
該組換えベクターAcc I  Env(1000)/
pHc118200μgをEcoR1制限酵素により、
前記と同様の切断条件で切断した。得られた切断物を前
記アガロースゲル電気泳動することで、)ITLシー1
5’3′断片を含むEcoRI −EcoRI断片(約
1000 bp)0.15μgを得た。
又、カイコの発現系ベクターρBF124.10μgを
EcoRl制限酵素により、前記と同様な切断条件で切
断し、次いでアルカリフォスフプターゼ処理した。
上記)ITLV−15’−3’断片を含むEcoRI 
 EcoRlDNA断片】、25μgとEcoRl制限
酵素で切断されたpBF124 0.2μgを混合し、
T4DNAリガーゼにより前述と同様な方法で接続反応
を行なつた。
そして、前記と同様な方法により、この接続反応液を用
いた大腸菌JM109の形質転換及び、該形質転換菌の
分離を行なった。次いで、分離された各培養物ごとで一
連のミニ・プレバレージョン操作を実施し、それぞれの
液体培地の一部からプラスミドを抽出した。
次いで、各プラスミドに対して、EcoRl制限酵素及
びBamHl制限酵素による切断反応を行い、アガロー
スゲル電気泳動により、HTLV−15’ −3’断片
を含むEcoRI −EcoRI D N AがpBF
124に正しい方向に挿入されているプラスミドを確認
した。
このTJliPaしたプラスミドを所有している大腸菌
が存在する液体培地から0.2 m lを採取し、アン
ピシリン30μg / m 1を含むLB液体培地50
m1に接種後、37°Cで12時間培養した。
該液体培地中の大腸菌内に存在するプラスミドをミデイ
アム・プレバレージョン法により抽出し、組換えベクタ
ーAccl  Env(1000)/pBF!2420
0 pgを得た。この組換えベクターAcc I  E
nv(1000)’/ρBF124はE、coliに導
入し、得られる微生物をE、coli  Acc I 
 Env(1000)/ pBF124として工業技術
院微生物工業技術研究所に寄託した。寄託番号は微工研
菌寄第10292号(FERM−p10292)である
以上の工程を第7図に示す。
(組換えウィルスの製造) BmNPvT3株のウィルスDNAと前記組換えベクタ
ーAcc I  Env(1000)/pBF124と
が1 : 100のモル比に調合された第1表の組成液
1245μlを、第1表の組成液■ 255μ2と混合
した。
第   1   表 生じた?A濁液0.5 m QをTCIO(第2表)の
培地のカイコ樹立培養細胞BmNA液(4X10’Bm
cells/ ml)5 mlに加え、27°C220
時間の培養により、Acc I  Env(1000)
/pBP124とBmNPVDNAのカイコ樹立細胞へ
の導入を行った。得られた培養物は、更にTC−10培
地の交換を行った後、27°Cで6日間培養した。次い
でこの培養物を遠心分離(1500rpm、  10分
間)し、得られた上清を組換えウィルスのクローニング
用反応液とした。
該クローニング用反応液をTC−10培地で10−’、
 10−’、 10−’に希釈し、それぞれ10m2の
希釈反応液とした。該希釈反応液に対して、それぞれカ
イコ樹立培養細胞8mN4液(10’ Bmcells
/ml> 10mI!を混合し、該混合液を200μf
fiずつ96穴のマイクロタイター・トレーの中に分注
し、27°Cで4日間培養した。4日間培養後、マイク
ロタイター・トレーを検鏡し、細胞表面が粗く変形しウ
ィルスが感染した形態を示しているカイコ樹立培養細胞
で且つ該細胞内に多角体蛋白が検出されないウェルを見
い出し、そこから培養物を回収した。得られた培養物を
遠心分離(1500rpm、 10分)し、上清150
uffiを組換えウィルスのポリペプチド発現用反応液
とした。該ポリペプチド発現用反応液は、プラーク検定
でlXl0’PFU/mj!の力価を示す組換えウィル
ス液であった。
尚、上記T(、−10の培地は第2表の培地900mf
をpH6,30〜6.35に調整し、濾過滅菌後、牛胎
児血清100mfを添加することにより調製される。
第 表 培−jLJL−皮 aCI Cff1 CaCfz  ・ 2HzO MgCf 2  ・ 6H20 MgCf、  ・ 7H20 Tryptose L−glutamine Soln  A” 5oln  B” 5oln  C”” 8.0 で全量900mfとする 0、5g 2.87g 1、32 g 2.28g 2、78 g 2.0g 0.3g 100   ml 100   ml    ml −y±L灯11皮 L−Arginme L−Aspatic acid L−^sparagine −HI3 しAlanine β−Alanine L−G1utaa+ic acid L−G1uta糟1ne Glycine L−旧5tidine L−1soleucine L−Leucine L−Lysine−ICI L−Methiouine L−Proline L−Phenyla anfne DL−Serune L−Threona+e 5、79 g 3.5g 3.98g 2.25g 2.0g 6.0g 3.0g 6.5g 25.0g 0.5g 0、75 g 6、25 g 0.5g 3.5g 1.5g 11.0g 1、75 g ご’5oln B(7)、1吸 L−Cystine L−Tryptophane H,0で全量1000m lとする 0、 25 g 1.0 二二士壮し以λ」戚 Thiamine−HCf Ribo目avine D−Ca  pantothenatePrydoxi
ne  −HCf Para−aminobenzoic  acidFo
lic  acid Nicotinic  acid Iso−1uositol 1otin 2、0 m g 2、0 m g 2、0 m g 2、0 m g 2、0 m g 2、0 m g 2.0mg 2、0 m g 1、0 m g B20で全量1000m lとする (ポリペプチドの製造) 上記ポリペプチド発現用反応’111100 u eを
カイコ樹立培養細胞8mN4液(105Bmcells
/m l )30mfに添加し、27°C,5日間培養
した。5日間培養後、培養物を回収し、遠心分離(15
00rpm、 15分)した。
沈澱物(ウィルス成熟細胞)をP B S Ill液液
洗浄し50mM Tris−HCIl(pt!7.4 
) 400 u 1に懸濁、ソニケーション後、遠心分
離(8000rpm20分)した。沈澱物として得られ
たポリペプチド90μgにレムリ緩衝液200μlを添
加、懸濁したものを、煮沸し、遠心した上清をSDSゲ
ル電気泳動の試料とした。
SDSゲル電気泳動の結果、この試料は、約20kdの
位置にバンドが検出された。(第8図に図示)この分子
量は、予測される、pBP124の有する多角体蛋白遺
伝子部分がコードする多角体蛋白部分(約4.5 k 
d )とHTLV−15” −3’断片がコードするH
TLV −1env蛋白部分く約35.5 k d )
の合計分子量よりも、p21の分子量分(約20kd)
だけ小さいものである。なお、第8図は、8m細胞内で
のHTLV −1env蛋白発現をSDSゲル電気泳動
で確認したものである。第8図において1ane 1は
サイズマーカー、1ane 2は非感染カイコ細胞の蛋
白、1ane 3はAcc I  Env(1000)
/pBF124を使用した組換えウィルスを感染したカ
イコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。
一次抗体として、正常人血清、抗多角体蛋白抗体、HT
LV−I P 21に対するモノクロナール抗体、及び
患者血清を使用したウェスタン・プロット実験の結果、
該20kdのポリペプチドが抗多角体蛋白抗体、患者血
清に対しては陽性で、正常人血清、HTLV−1p21
に対するモノクロナール抗体に対しては陰性であること
を確認した(第9図に図示)。この結果は該ポリペプチ
ドが、多角体蛋白部分と、HTLV −1gp46の抗
体に対して抗原性を有する部分の融合蛋白であることを
示している。
尚、第9図はB11細胞内でのHTLV −I  en
v蛋白発現をウェスタン・プロット法で1i1!認した
ものである。
1ane 1はサイズマーカー、1ane 2〜1an
e 5は抗原としてAcc I  Env(1000)
/pBF124を使用したNi換えウィルスを感染した
カイコ細胞の蛋白を電気泳動したものである。
ウェスタン・プロッティングは、第3表に示した一次抗
体及び二次抗体を使用して、アビジン、ビオチンを基質
としたペルオキシダーゼによる呈色反応で行なった。
()内は希釈率を示した 製造例2 製造例1で得たポリペプチド発現用反応液100μにを
カイコ樹立培養細胞液(105Bmcells/m f
2. )30m/!に添加し、27°C,5日間培養し
た。5日間培養後、培養物を回収し遠心分離(1500
rpm。
15分)した、上清を0. l m lずつ5令1日目
のカイコ100匹にそれぞれ経皮的に注入し、25°C
で5日間、全集のペースト片を与えて飼育後、解剖し、
脂肪体を集めた。該脂肪体にPBS緩衝液10m1を加
え懸濁し、ソニケーション後、遠心分11iI (80
00rpm、  20分)し、沈澱物5m!!、を取得
した。該沈澱物を再度ソニケーションし、Bio−RA
Dプロティン・アッセイにより、ポリペプチド量を測定
した結果7.5 m gであった。
ポリペプチド量測定後、50μ!をレムリ緩衝液50μ
2に懸濁し、煮沸し、遠心した上清をSDSゲル電気泳
動の試料°とした。
SDS電気泳動の結果、分子量約20kdの位置にバン
ドが検出された。製造例1と同じウェスタン・プロット
実験を行い、この20kdのポリペプチドが多角体蛋白
部分と)ITLV −1gp46の抗体に対して抗原性
を有する部分とを含む融合蛋白であることを確認した。
製造例3 製造例1の(組換えベクターの製造)において、組換え
ベクターenv/pHc119のXba I制限酵素に
よる切断後の更なる切断をPνuII制限酵素(宝酒造
(株)製 Na1076B) ニより行なイHTLV−
15’−3′断片を含むPvu n −Xba 1断片
を得た以外は、製造例1と同様の方法を実施した。ここ
で、該Pvu II −Xba 1断片に含有されるH
TLV−15−3’断片は、HTLV −1env蛋白
遺伝子に由来するDNAのうち、該DNAの5′末端か
ら下流73塩基対で切断され、該切断部位から上記DN
Aの3′末端までのものである。尚、Pvu II制限
酵素の切断反応は、第4表阻4に示す組成の溶液中で行
なった。また、上記操作で得られるカイコの発現系ベク
ター pBF124 ニHTLV−15’ −3’断片
が挿入された組換えベクターPvuII t!nv(1
500)/pBF124は、該ベクターをE、coli
に導入し、得られる微生物をE、coli  Pvu 
II Env(1500)/pBF124として工業技
術院微生物工業技術研究所に寄託した。寄託番号は、微
工研菌寄第10293号(PERM−P10293)で
ある。
上記操作の結果、lμgのポリペプチドを得た。
SDS電気泳動の結果、このポリペプチドは、分子量約
32.5 kclの位置にバンドが検出された。また、
実施例1と同じウェスタン・プロット実Uを行いこのポ
リペプチドが、多角体蛋白部分とIITLV−Igp4
6の抗体に対して抗原性を有する部分の融合蛋白である
ことを確認した(第10図に回示)。
製造例4 製造例3に於いて得られるポリペプチド発現用反応液を
用い、製造例2と同様な方法によりポリペプチドを取得
した。得られたポリペプチドは75μgで、SO3電気
泳動の結果、このポリペプチドは、分子量約32.5 
k dの位置にバンドが検出された。また、製造例1と
同じウェスタン・プロット実験を行い、このポリペプチ
ドが、多核体蛋白部分とIITLV−1gp46の抗体
に対して抗原性を有する部分の融合蛋白であることを確
認した。
第 表 第   5   表 50 m M   Tris−ICR(pH7,4)1
0 mM   MgCj! z l 0 mM   dithiothreitol(D
TT)1mM   ATP 実施例1 特開昭62−286533号公報実施例1の方法に従っ
て、複合重合体粒子を製造した。即ち、撹拌機付きガラ
ス製フラスコ中にメタノール2800cc、アンモニア
水(25重量%)616cc、水酸化ナトリウム水溶液
(5モル/1)21ccを加え10°Cに保った後に、
テトラエチルシリケートのメタノール溶液(22%) 
1428ccを攪拌しながら25.5 cc/hrの滴
下速度で添加して反応した。その後シリカ粒子を大量の
メタノール中でデカンテーションを繰り返して精製した
得られたシリカ粒子を沈降させ、上澄をのぞき、蒸留水
を加え、分散させ、さらに沈降させる操作を2回繰り返
し、粒子を洗浄した後、分散濃度10wt%になるよう
に蒸留水を添加し、シリカ分散液を得た。
攪拌機付きガラス製フラスコを窒素置換した後に、上記
で得られたシリカ分散液100mff1を加えて40°
Cに保ち、窒素雰囲気下、攪拌下にロアミリモルのグリ
セロールメタクリレートと過硫酸カリウムを2.9ミリ
モル/lとなるように添加した。次いで40″Cに保温
し撹拌下4時間重合を行った。重合後、遠心分離で上澄
を捨て、沈澱した複合重合体粒子を蒸留水に再分散させ
た。この操作を6回繰り返し、沈澱を洗浄し、精製した
複合重合体粒子を得た。
次いで、該複合重合体粒子の0.02M  PBS緩衝
液(pH7,2>への5%分散液を、前記製造例2に従
って得たポリペプチドが10μg / m lの濃度で
1%SDS含有I M Tris−FICj! (p)
17.4 )緩衝液に懸濁している懸濁液と等量混合し
た。室温下で1時間の放置後、0.02M  PBSi
衝液(pH7,2)を用いた遠心分離により粒子の洗浄
を行い、得られたポリペプチド感作粒子が5%濃度で分
散した溶液を調合した。
ATL患者血清、正常ヒト血清、全身性エリテマトーデ
ス患者血清、原発性胆汁性肝硬変患者血清、リウマチ患
者血清のそれぞれの被検液につき、2倍希釈液を原液と
し倍数希釈法に従ってリン酸緩衝液(p)17.2)を
用いた希釈を行い1.昏希釈液をマイクロタイタープレ
ートのウェル中に25μlずつ加えた。次いで、前記調
合した感作粒子溶液を、該ウェル中に25μ2ずつ加え
ていき、3分間の攪拌の後室温下で放置した。30分後
、粒子の凝集状態を観察し各被検液ごとで、粒子リング
が明らかに大きく、リング内に凝集粒子が膜状に広がっ
ているものが認められるウェルにおける希釈液の最高希
釈倍数をもとめ、鋭敏性を評価した。そして、抗体価が
8以上になる被検液を陽性であると診断した。以上の結
果を第6表に示す。
第   6   表 実施例2 製造例2に従って得たポリペプチドの代わりに製造例4
に従って得たポリペプチドを用いる以外は、実施例1と
同様な方法で、各被検液のHTLVI感染の診断を行な
った。診断結果は、実施例1と同一のものが得られた。
比較例I MT−2細胞(Gann 72巻989頁1981年参
照)を10%仔ウシ血清を含むRPMI 1640培地
(MAB社製 Nα530−05891 )で37°C
にて3日間培養した。その後、該培養上清を11000
0rp、30分間遠心分離し、上清を回収し、該回収し
た上清を100,000gで2時間超遠心分離し、沈渣
を得た。
該沈渣を、0.01 M Tris−HCi 緩衝液(
pH7,4)(100mM NaC110mM  ED
TAを含む)で溶解した後、30.OOOrpm 1時
間遠心分離し、該上清を回収した、20〜65%のシボ
糖密度勾配液を作成し、それに上記上清を層積し、30
.00Orpmで18時間超遠心処理し、MT−2細胞
の可溶性細胞質蛋白液を得た。次いで、製造例2で得た
ポリペプチドに変えて、上記可溶性細胞質蛋白を用いる
以外は、実施例1と同様な方法で、各被検液の)ITL
V−1感染の診断を行なった。結果を第7表に示す。
第 表 実施例3 製造例2に従って得たポリペプチドを、0D28゜値が
0.4となるように1%SDS含有I M TrisH
CI (pH7,4)緩衝液に希釈し、エンザイムイム
ノアッセイ用マイクロタイターのカップに150μ2加
えた。4°Cで1夜間放置し、その後排液し、脱イオン
水にてカップを洗浄した。こうして得られたポリペプチ
ドが感作したエンザイムイムノアッセイ用マイクロタイ
ターのカップに、実施例1で使用した各種被検液のPB
S緩衝液による100倍希釈液を100μ!加えた。3
7°Cで1時間放置した後、脱イオン水にてカップを洗
浄し、抗ヒ)1gG抗体−アルカリホスファターゼコン
ジュゲートのリン酸緩衝液溶液100μlを加えた。3
7°Cで1時間放置後、脱イオン水にてカップを洗浄し
、!質(p−ニトロフェニルフォスフェートを4mg/
mj2となるように4 m M MgCl z含有炭酸
緩衝液(pH9,5)に溶解したもの)100μlを加
えた。37°Cで1時間放置後、I N NaOH10
0uNを加えて反応を停止し、004゜、値を求めた。
該OD4゜、値が0.07以上となるものを、陽性の被
検液であると診断したところ、実施例1と同一の診断結
果が得られた。
実施例4 製造例1に従って得たポリペプチドのSDSポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動を行った後、実施例1で用いた各
種被検液の3%牛アルブミン含有リン酸緩衝液(pl+
7.2 )による10倍希釈液を一次抗体として、エン
ザイムイムノアンセイによるウェスタン・プロット実験
を行なった。尚、転写用膜には、ニトロセルロース膜を
使用し、二次抗体には、ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒ
トIgG(Vector社製 N1150−0410−
06)とペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトIgM  (
Vector社製 N(150−041003)の1:
1混合液を使用した。また、呈色液には、0.05no
l  Tris−)IC! 緩衝液(pH7,2) 2
0m (13,3′−ジアミノベンジジン4塩酸塩10
mg。
30%過酸化水素水10μ2の組成のペルオキシダーゼ
用呈色液を使用した。呈色してバンドが認められたもの
の、−次抗体に使用した被検液を、陽性と診断したとこ
ろ、実施例1と同一の診断結果が得られた。
実施例5 製造例1に従って得たポリペプチドの代わりに、製造例
3に従って得たポリペプチドを用いる以外は、実施例4
と同様なウェスタン・プロット法を実施して、各被検液
の1(TLV−I感染の診断を行なった。診断結果は、
実施例1と同一のものが得られた。
【図面の簡単な説明】
第1図はカイコ核多角体病ウィルスのDNAの制限酵素
地図、第2図はpBFベクターの制限酵素地図、第3回
はHTLV −I  enν蛋白の遺伝子およびアミノ
酸配列図、第4図はpBFベクターの種類、第5図はカ
イコ核多角体病ウィルスおよび組変えウィルスが感染し
たカイコ細胞、第6図は1(TLV −I  env蛋
白遺伝子由来のDNAの調整法、第7図は組変えベクタ
ーの調整法、第8図はカイコ樹立培養細胞内で発現した
ポリペプチドをSDSゲル電気泳動で確認した写真、第
9図および第10図はカイコ樹立培養細胞内でのt(T
LV −1env蛋白発現をウェスタン・プロット法で
確認した写真をそれぞれ示す。 Hd m ・・・Hind [[、N−Nco I 、
 Ac−” Acc I XEc−・・EccR【、S
p・・・5ph11Sa・・・Sal【、旧fl−Hi
ncIl、B −・・Bamfl I、X−Xba I
 、Pv−Pvu II特許出願人  徳山曹達°株式
会社 1図 第2 第5B 〜くν盲に 手 続 補 正 一午 (方式) %式% 1、事件の表示 特!ml平1−201341号 2、発明の名称 成人T細胞白血病つィルス感染診衛薬 3、補正をする者 事件との関係 特許出願人 住 所   山口県徳山市御影町1番1号同 発送日 平成1年12月26日

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 成人T細胞白血病ウィルス外皮蛋白遺伝子に由来するD
    NAのうち、該DNAの5′末端から下流73塩基対以
    上493塩基対以下の範囲内で切断した、該切断部位か
    ら前記DNAの3′末端までの断片により、カイコ核多
    角体病ウィルスの多角体蛋白構造遺伝子の一部の組換え
    を行い、次いで該組換えウィルスをカイコ樹立培養細胞
    またはカイコ幼虫に感染させて発現されたポリペプチド
    を抗原とする成人T細胞白血病ウィルス感染診断薬。
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