JP2555117B2 - ヒトｂ親リンパ性ウイルス（ｈｂｌｖ）の試験方法 - Google Patents
ヒトｂ親リンパ性ウイルス（ｈｂｌｖ）の試験方法Info
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- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16511—Roseolovirus, e.g. human herpesvirus 6, 7
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Description
【発明の詳細な説明】 新しいヒトＢ親リンパ性ウイルス（HBLV）と命名され
たNDAウイルスは、リンパ増殖障害を有する患者の血液
リンパ球から単離された。このウイルスは形態学的には
ヘルペス族に属するが、HBLVは以下に示すように従来特
性化されていない。HBLVはAIDS及び非−AIDS患者におけ
る何等かの悪性と関連するが、しかし、AIDSの病原体で
あるヒトＴ−細胞親リンパ性ウイルスタイプIII（HTLV
−III）とは明確に異る。HBLVは大きい二本鎖DNAゲノム
を含有し、Ｂ細胞を選択的に感染するのに対し、一方、
HTLV−IIIは一本鎖RNAゲノムを含有し、Ｔ−細胞を選択
的に感染し、細胞溶解性である。
たNDAウイルスは、リンパ増殖障害を有する患者の血液
リンパ球から単離された。このウイルスは形態学的には
ヘルペス族に属するが、HBLVは以下に示すように従来特
性化されていない。HBLVはAIDS及び非−AIDS患者におけ
る何等かの悪性と関連するが、しかし、AIDSの病原体で
あるヒトＴ−細胞親リンパ性ウイルスタイプIII（HTLV
−III）とは明確に異る。HBLVは大きい二本鎖DNAゲノム
を含有し、Ｂ細胞を選択的に感染するのに対し、一方、
HTLV−IIIは一本鎖RNAゲノムを含有し、Ｔ−細胞を選択
的に感染し、細胞溶解性である。
HBLVウイルスのヌクレオキャプシドは162個のキャプ
ソマーを有する二十面体対称のものであり、脂質膜内に
エンベロープされている。このウイルスエンベロープの
外表面は短いとげで覆われている。エンベロープされた
ビリオンの直径は約180nmであり、ヌクレオキャプシド
は約100nmの直径である。キャプシドとエンベロープの
間の空間35〜40nmは非晶質物質で満たされている。ヌク
レオタクパク質核即ちヌクレオイドは約65nmの直径であ
り、場合に応じて桿状或いは非対称である。
ソマーを有する二十面体対称のものであり、脂質膜内に
エンベロープされている。このウイルスエンベロープの
外表面は短いとげで覆われている。エンベロープされた
ビリオンの直径は約180nmであり、ヌクレオキャプシド
は約100nmの直径である。キャプシドとエンベロープの
間の空間35〜40nmは非晶質物質で満たされている。ヌク
レオタクパク質核即ちヌクレオイドは約65nmの直径であ
り、場合に応じて桿状或いは非対称である。
一時細胞或いは帯血液細胞の感染は、感染後４〜10日
後に特徴的な大細胞を生成する。これらの細胞は小白血
球の２〜４培の直径であり、培養液中約１週間後に細胞
病源性及び細胞溶解性変化を示す。これらの細胞の核は
しばしば高度に回旋状であり、顕著な特徴なしに主に真
正染色質クロマチン及び仁形成体を含有する。殆んどの
感染細胞により多数のビリオンが放出される。
後に特徴的な大細胞を生成する。これらの細胞は小白血
球の２〜４培の直径であり、培養液中約１週間後に細胞
病源性及び細胞溶解性変化を示す。これらの細胞の核は
しばしば高度に回旋状であり、顕著な特徴なしに主に真
正染色質クロマチン及び仁形成体を含有する。殆んどの
感染細胞により多数のビリオンが放出される。
発明の概要及び背景 本発明はヒト血清におけるヒトＢ親リンパ性ウイルス
（HBLV）感染或いは抗体の検出及び診断を説明する。HB
LVの検出に用いられる好ましいアッセイはウエスタンブ
ロット或いは免疫螢光アッセイ（IFA）である。
（HBLV）感染或いは抗体の検出及び診断を説明する。HB
LVの検出に用いられる好ましいアッセイはウエスタンブ
ロット或いは免疫螢光アッセイ（IFA）である。
ヒトＢ親リンパ性ウイルス（HBLV）は、各種リンパ増
殖性障害を有する患者の末梢血液白血球から単離された
新たに発現されたDNAウイルスである。このHBLVウイル
スの超構造特性並びにその形態発生は、このウイルスを
ヘルペスウイルス族におくが、この族の如何なる公知の
ものとも類似性及び相違を有する。免疫電子顕微鏡研究
はウイルスが単離された患者はウイルスベロープ及びウ
イルスの内部成分の両者に高度に特異的な抗体を作るこ
とを示している。免疫学的、分子、生物学的及び宿主範
囲の研究はHBLVウイルスが従来説明されていないことを
示す。
殖性障害を有する患者の末梢血液白血球から単離された
新たに発現されたDNAウイルスである。このHBLVウイル
スの超構造特性並びにその形態発生は、このウイルスを
ヘルペスウイルス族におくが、この族の如何なる公知の
ものとも類似性及び相違を有する。免疫電子顕微鏡研究
はウイルスが単離された患者はウイルスベロープ及びウ
イルスの内部成分の両者に高度に特異的な抗体を作るこ
とを示している。免疫学的、分子、生物学的及び宿主範
囲の研究はHBLVウイルスが従来説明されていないことを
示す。
感染血液試料からの単核細胞の培養液は一次細菌或い
は帯血液細胞を用いた培養４〜10日後に相当数の特徴的
な大細胞を発達させる。電子顕微鏡分析はHBLVウイルス
粒子が大細胞中には存在するが、小リンパ球には不存在
であることを示す。この感染細胞は小リンパ球の直径の
２〜４培であり、如何なる初期の明瞭な細胞変成変化を
示さない。しかしながら、培養液中１週間後、細胞変成
及び細胞溶解変化が容易に観察可能となる。具体的に
は、感染細胞の核がしばしば高度に回旋状であり、クロ
マチンは主として真正染色質であり、及び顕著な特徴な
しに仁形成体を含有した。この細胞質はかなり大きいGo
lgi装置、異った大きさの小胞、顕著な粗い細胞質網状
構造の配列及び豊富なミトコンドリアを示す。これらの
細胞の一般的外観はリンパ起源の高度に多形増殖性芽球
のそれである。
は帯血液細胞を用いた培養４〜10日後に相当数の特徴的
な大細胞を発達させる。電子顕微鏡分析はHBLVウイルス
粒子が大細胞中には存在するが、小リンパ球には不存在
であることを示す。この感染細胞は小リンパ球の直径の
２〜４培であり、如何なる初期の明瞭な細胞変成変化を
示さない。しかしながら、培養液中１週間後、細胞変成
及び細胞溶解変化が容易に観察可能となる。具体的に
は、感染細胞の核がしばしば高度に回旋状であり、クロ
マチンは主として真正染色質であり、及び顕著な特徴な
しに仁形成体を含有した。この細胞質はかなり大きいGo
lgi装置、異った大きさの小胞、顕著な粗い細胞質網状
構造の配列及び豊富なミトコンドリアを示す。これらの
細胞の一般的外観はリンパ起源の高度に多形増殖性芽球
のそれである。
HBLVウイルスの主ため超構造特徴はヘルペスウイルス
族のそれと一致する。ヌクレオキャプシドは162個のキ
ャプソマーを有する二十面対称を有し、脂質膜内にエン
ベロープされている。このウイルスエンペロープの外表
面は短いとげで覆われている。エンベロープされたビリ
オンの直径は約180nmであり、ヌクレオキャプシドの直
径は約100nmである。キャプシドとエンベロープの間の
空間35〜40nmは主として非晶質物質で満たされている
（この構造はは幾つかのヘルペスウイルス類について説
明されている外被と同一であるように思われる）。ヌク
レオタンパク質核、即ちヌクレオイドは約65nm直径であ
る。場合に応じて、ヌクレオイドは桿状或いは非対称で
ある。
族のそれと一致する。ヌクレオキャプシドは162個のキ
ャプソマーを有する二十面対称を有し、脂質膜内にエン
ベロープされている。このウイルスエンペロープの外表
面は短いとげで覆われている。エンベロープされたビリ
オンの直径は約180nmであり、ヌクレオキャプシドの直
径は約100nmである。キャプシドとエンベロープの間の
空間35〜40nmは主として非晶質物質で満たされている
（この構造はは幾つかのヘルペスウイルス類について説
明されている外被と同一であるように思われる）。ヌク
レオタンパク質核、即ちヌクレオイドは約65nm直径であ
る。場合に応じて、ヌクレオイドは桿状或いは非対称で
ある。
細胞外ウイルスの特異的免疫標識化は、予備吸収され
た患者の血清及びヤギ内で産生されたヒトガンマグロブ
リンに対する抗血清を用いて超構造レベルで起こり、フ
ェリチン或いはペルオキシダーゼのいずれかを用いて標
識化される。殆んどの感染細胞により多数のビリオンが
放出され、細胞の表面に緊密なクラスターとして表わさ
れる。実質的に全てのビリオンはそれらの周縁で標識化
される。場合によっては、標識がビリオン中に侵入する
ことがあり、あるビリオンのエンベロープは無傷でな
く、患者の血清のあるものがウイルスの内部成分並びに
ウイルスエンベロープに対する抗体を含有することを示
している。
た患者の血清及びヤギ内で産生されたヒトガンマグロブ
リンに対する抗血清を用いて超構造レベルで起こり、フ
ェリチン或いはペルオキシダーゼのいずれかを用いて標
識化される。殆んどの感染細胞により多数のビリオンが
放出され、細胞の表面に緊密なクラスターとして表わさ
れる。実質的に全てのビリオンはそれらの周縁で標識化
される。場合によっては、標識がビリオン中に侵入する
ことがあり、あるビリオンのエンベロープは無傷でな
く、患者の血清のあるものがウイルスの内部成分並びに
ウイルスエンベロープに対する抗体を含有することを示
している。
本発明のHBLVウイルスはヒト血液帯細胞をHBLVで感染
することにより繁殖され、より詳細に具体的開示におい
て説明される。
することにより繁殖され、より詳細に具体的開示におい
て説明される。
図面の説明 第１図は顆粒状、核、及び細胞質免疫螢光染色を示す
HBLV−感染拡大細胞（感染後５日）、免疫螢光分析を示
す。バックグラウンド（矢印）内の小細胞は患者の血清
と反応しなかった。
HBLV−感染拡大細胞（感染後５日）、免疫螢光分析を示
す。バックグラウンド（矢印）内の小細胞は患者の血清
と反応しなかった。
第２図は、AIDS−関連リンパ腫を有する患者からの末
梢血液白血球及び細胞培養液中のHBLV−感染臍帯血液白
血球を示す。
梢血液白血球及び細胞培養液中のHBLV−感染臍帯血液白
血球を示す。
寄託の陳述 分子クローンpZVH14により例示される本発明の主題、
ヒトＢ親リンパ性ウイルスはメリーランド州ロックビル
のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Am
erican Type Culture Collection）にATCCNo.40247とし
て寄託されており、本願の許可後、30年間の期間或いは
その様な寄託物に対する最終要求後５年間或いは特許の
有効期間のうち最も長い期間の間維持される。この寄託
物は、培養物が寄託期間内に突然変異するか或いは生育
可能でなくなった場合には取替えられる。
ヒトＢ親リンパ性ウイルスはメリーランド州ロックビル
のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Am
erican Type Culture Collection）にATCCNo.40247とし
て寄託されており、本願の許可後、30年間の期間或いは
その様な寄託物に対する最終要求後５年間或いは特許の
有効期間のうち最も長い期間の間維持される。この寄託
物は、培養物が寄託期間内に突然変異するか或いは生育
可能でなくなった場合には取替えられる。
発明の具体的説明 本発明はヒトＢ親リンパ性ウイルス（HBLV）の単離及
び精製、感染血液血清のそのウイルスのin vitro試料の
診断及び検出及びHBLVに特異的に結合する抗体の検出よ
り構成される。好ましい実施態様においては、HBLV−感
染細胞を用いて免疫螢光アッセイ（IFA）及びウエスタ
ンブロットアッセイがウイルスが元々単離された六人の
患者中のHBLVに対する抗体を検出する。
び精製、感染血液血清のそのウイルスのin vitro試料の
診断及び検出及びHBLVに特異的に結合する抗体の検出よ
り構成される。好ましい実施態様においては、HBLV−感
染細胞を用いて免疫螢光アッセイ（IFA）及びウエスタ
ンブロットアッセイがウイルスが元々単離された六人の
患者中のHBLVに対する抗体を検出する。
ヒトＢ親リンパ性ウイルスは下記表１に示されるよう
な患者から単離された。
な患者から単離された。
本発明の一部を形成する免疫螢光アッセイも又新鮮な
組織培養液中及び培養末梢血液帯細胞中におけるHBLVの
検出及び新鮮なヒト帯血液リンパ球における感染の追跡
において用いられる。
組織培養液中及び培養末梢血液帯細胞中におけるHBLVの
検出及び新鮮なヒト帯血液リンパ球における感染の追跡
において用いられる。
HBLVのスクロース勾配精製。 ヘパリン化された末梢血
液白血球或いはヒト臍帯血液単核細胞をFicoll−Hypaqu
e中でバンド化し、PHA−Ｐ（５μg/ml）刺戟に引続き36
℃において48時間細胞培養液中において樹立した。細胞
を次いで10％ウシ胎児血清（56℃で30分間熱不活性化）
及び５μg/mlヒドロコーチゾンを補給したRPMI−1640中
で増殖させた。感染細胞から得られた凍結上都澄液を解
凍し、250ml管中に集め、Sorall GSAローター内で3500r
pmにて５℃で10分間回転させた。清澄化上澄液をSW28管
に移し、17,000rpmにて５℃で90分間回転及びペレット
化した。得られたペレットを10mM Tris−Cl pH7.4、10n
M NaCal、1mMEDTA（TNE）中で300μｌの容量まで再懸濁
させ、15〜60％スクロース勾配上に重層し、SW41ロータ
ー（Beckman）内で20,000rpmにて５℃で30分間回転させ
た。1mlの画分を勾配の頂部から集めた。各画分を10ml
に稀釈し、SW41ローター内で17,000rpmにて90分間回転
及びペレット化した。ペレットを300マイクロリッター
のTNE中に再懸濁させ、アリコートについてウイルスの
存在及びウイルス感染性についてアッセイを行った（EL
ISA及びウエスタンブロットにより）。ヒトＢ親リンパ
性ウイルスは両アッセイにより画分４〜９において容易
に検出され、ピークは画分５〜７にあった。各画分から
の核酸の抽出は画分５〜９における二本鎖DNAの存在を
示し、ピークは画分７にある。ウイルスは又SW41勾配ペ
レット中において電子顕微鏡により検出された。
液白血球或いはヒト臍帯血液単核細胞をFicoll−Hypaqu
e中でバンド化し、PHA−Ｐ（５μg/ml）刺戟に引続き36
℃において48時間細胞培養液中において樹立した。細胞
を次いで10％ウシ胎児血清（56℃で30分間熱不活性化）
及び５μg/mlヒドロコーチゾンを補給したRPMI−1640中
で増殖させた。感染細胞から得られた凍結上都澄液を解
凍し、250ml管中に集め、Sorall GSAローター内で3500r
pmにて５℃で10分間回転させた。清澄化上澄液をSW28管
に移し、17,000rpmにて５℃で90分間回転及びペレット
化した。得られたペレットを10mM Tris−Cl pH7.4、10n
M NaCal、1mMEDTA（TNE）中で300μｌの容量まで再懸濁
させ、15〜60％スクロース勾配上に重層し、SW41ロータ
ー（Beckman）内で20,000rpmにて５℃で30分間回転させ
た。1mlの画分を勾配の頂部から集めた。各画分を10ml
に稀釈し、SW41ローター内で17,000rpmにて90分間回転
及びペレット化した。ペレットを300マイクロリッター
のTNE中に再懸濁させ、アリコートについてウイルスの
存在及びウイルス感染性についてアッセイを行った（EL
ISA及びウエスタンブロットにより）。ヒトＢ親リンパ
性ウイルスは両アッセイにより画分４〜９において容易
に検出され、ピークは画分５〜７にあった。各画分から
の核酸の抽出は画分５〜９における二本鎖DNAの存在を
示し、ピークは画分７にある。ウイルスは又SW41勾配ペ
レット中において電子顕微鏡により検出された。
上記操作による新鮮な未凍結上澄液から精製されたウ
イルスを詳細な電子顕微鏡に用いた。
イルスを詳細な電子顕微鏡に用いた。
スクロース勾配画分のアリコートについて、pZVH14イ
ンサートをプローブとして用いるDNAドットブロット分
析によりHBLVの存在をアッセイすることができる。pZH1
4分子クローンはアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションから受理番号40247として得られる。
ンサートをプローブとして用いるDNAドットブロット分
析によりHBLVの存在をアッセイすることができる。pZH1
4分子クローンはアメリカン・タイプ・カルチャー・コ
レクションから受理番号40247として得られる。
免疫螢光アッセイ及びウエスタンブロットアッセイは
AIDS及び非AIDSのいずれの起源のＢ細胞リンパ腫を包む
各種造血悪性におけるHBLV感染及びHBLV抗体の検出のた
めの好ましいアッセイである。HBLV抗体の存在は次の病
気群において高められるが、しかし、本発明はこれらの
特定の病気に限定されるものではない： バーキッツリンパ腫； ホジキン病； 成人において「急性単球増加症−様症候群」として特
徴付けられるタホ湖に見られたものと同様な新たに説明
された感染病症候群； 及び、 カリブ及びアフリカ起源の子供において診断されたよ
うなALL。
AIDS及び非AIDSのいずれの起源のＢ細胞リンパ腫を包む
各種造血悪性におけるHBLV感染及びHBLV抗体の検出のた
めの好ましいアッセイである。HBLV抗体の存在は次の病
気群において高められるが、しかし、本発明はこれらの
特定の病気に限定されるものではない： バーキッツリンパ腫； ホジキン病； 成人において「急性単球増加症−様症候群」として特
徴付けられるタホ湖に見られたものと同様な新たに説明
された感染病症候群； 及び、 カリブ及びアフリカ起源の子供において診断されたよ
うなALL。
HBLVウイルス繁殖。 ヒト臍帯血液或いは末梢血液単核
細胞の感染を次のように細胞なしの伝達により行った； １） 新鮮な血液試料をRPMI−1640で1:1に稀釈し、Fic
oll勾配上で回転した（及びバンド化した）。
細胞の感染を次のように細胞なしの伝達により行った； １） 新鮮な血液試料をRPMI−1640で1:1に稀釈し、Fic
oll勾配上で回転した（及びバンド化した）。
２） バンド化された分子細胞を洗浄し、20％FCXS及び
RPMI−1640中のPHA−Ｐ（５μg/ml）及びHC（５μg/m
l）の存在下に培養液中に入れた。
RPMI−1640中のPHA−Ｐ（５μg/ml）及びHC（５μg/m
l）の存在下に培養液中に入れた。
３） 24時間後、ポリブレン（２μg/ml）を培養液に添
加し、及び48時間後細胞をペレット化した。
加し、及び48時間後細胞をペレット化した。
４） 新たに採取した或いは凍結感染培養上澄液の1ml
アリコールをペレットに添加し、しばしば撹拌しながら
37℃で１時間インキュベートした。
アリコールをペレットに添加し、しばしば撹拌しながら
37℃で１時間インキュベートした。
５） 新鮮な倍地〔RPMI−1640中10％FC及びHC（５μg/
ml）〕を次いで懸濁液に添加し、培養し、36℃でインキ
ュベートした。
ml）〕を次いで懸濁液に添加し、培養し、36℃でインキ
ュベートした。
６） 感染後、２〜10日以内に特徴的な拡大された屈折
性細胞が見えるようになる。上澄液を免疫螢光法及び培
養液の視覚観察により測定された感染のピークにおいて
採取し、更に伝達する。
性細胞が見えるようになる。上澄液を免疫螢光法及び培
養液の視覚観察により測定された感染のピークにおいて
採取し、更に伝達する。
細胞におけるHBLV感染の検出。 HBLV感染細胞を10％
FCS、５μg/ml HCを含有する倍地1640中に維持し、36℃
でインキュベートする。未感染細胞を同様に処理する
が、しかし、対照として用いられる。これらの細胞にお
けるHBLVの感染はIFAを用いてアッセイされる。小細胞
試料を異った時点で取出し、細胞をPBS中において洗
浄、HBLV抗体陽性血清及びHBSV抗体陰性血清で染色す
る。感染細胞はHBLV抗体による核における最初のIF染色
を示す大細胞である（第２図）。これらの陽性細胞は殆
んど拡大細胞である（第１図及び第２図参照）。対照細
胞はIF染色を示さない。
FCS、５μg/ml HCを含有する倍地1640中に維持し、36℃
でインキュベートする。未感染細胞を同様に処理する
が、しかし、対照として用いられる。これらの細胞にお
けるHBLVの感染はIFAを用いてアッセイされる。小細胞
試料を異った時点で取出し、細胞をPBS中において洗
浄、HBLV抗体陽性血清及びHBSV抗体陰性血清で染色す
る。感染細胞はHBLV抗体による核における最初のIF染色
を示す大細胞である（第２図）。これらの陽性細胞は殆
んど拡大細胞である（第１図及び第２図参照）。対照細
胞はIF染色を示さない。
HBLV抗体の検出。 （ａ）スクリーニング−HBLVに特異
的に結合する抗体は、抗原目標としてニトロセルロース
膜（Millitier 96ウエル形式）上に堆積された感染細胞
質の稀釈液を用いて便利に且つ高感度に測定される。ヒ
ト抗体の結合はアルカリホスファターゼ複合抗−ヒトIg
G及び標準的酸素化学を用いて定量される。細胞細胞質
の量及び試験抗体の稀釈率は陰性対照ヒト抗血清未感染
細胞細胞質を対照として用いる予備実験におけるシグナ
ル対ノイズ比の最適比により求められる。ウエル当り50
00個の細胞の等量及び1/400乃至1/1600の稀釈率の試験
抗体稀釈率が通常用いられる。感染細胞と同一起源の未
感染細胞よりなる対照ウエルは最高の特異性が必要とさ
れた場合に含まれる。
的に結合する抗体は、抗原目標としてニトロセルロース
膜（Millitier 96ウエル形式）上に堆積された感染細胞
質の稀釈液を用いて便利に且つ高感度に測定される。ヒ
ト抗体の結合はアルカリホスファターゼ複合抗−ヒトIg
G及び標準的酸素化学を用いて定量される。細胞細胞質
の量及び試験抗体の稀釈率は陰性対照ヒト抗血清未感染
細胞細胞質を対照として用いる予備実験におけるシグナ
ル対ノイズ比の最適比により求められる。ウエル当り50
00個の細胞の等量及び1/400乃至1/1600の稀釈率の試験
抗体稀釈率が通常用いられる。感染細胞と同一起源の未
感染細胞よりなる対照ウエルは最高の特異性が必要とさ
れた場合に含まれる。
（ｂ）ウエスタンブロット−感染細胞細胞質をSDS−PAG
Eにより分離し、標準的方法によりニトロセルロース膜
に移した。陰性対照血清及び陽性血清の感染及び非感染
細胞タンパク質への結合の比較は、感染細胞細胞質及び
ウイルス陽性血清についてのみ表わされる独特なバンド
の存在を示す。核、細胞質、及び細胞培養上澄液画分の
比較は細胞上澄液に最高濃度の抗原を示す。
Eにより分離し、標準的方法によりニトロセルロース膜
に移した。陰性対照血清及び陽性血清の感染及び非感染
細胞タンパク質への結合の比較は、感染細胞細胞質及び
ウイルス陽性血清についてのみ表わされる独特なバンド
の存在を示す。核、細胞質、及び細胞培養上澄液画分の
比較は細胞上澄液に最高濃度の抗原を示す。
間接免疫螢光アッセイ。 HBLVの単離、及び繁殖のため
の上記操作と共に、次のものはヒトＢ親リンパ性ウイル
スの後期ウイルスキャプシド抗原に対するIgG抗体を検
出するHBLVに対するアッセイである。
の上記操作と共に、次のものはヒトＢ親リンパ性ウイル
スの後期ウイルスキャプシド抗原に対するIgG抗体を検
出するHBLVに対するアッセイである。
ヒト帯血液（CB）単核細胞をPHA−Ｐ（５μg/ml）で4
8時間刺戟し、その後細胞をポリブレン（２μg/ml）で4
8時間処理する。一次ヒト脾臓細胞をPHA−Ｐで、次いで
Polypreneにより刺戟する。これらの細胞を次いで上記
の如くヒトＢ親リンパ性ウイルスで感染する。
8時間刺戟し、その後細胞をポリブレン（２μg/ml）で4
8時間処理する。一次ヒト脾臓細胞をPHA−Ｐで、次いで
Polypreneにより刺戟する。これらの細胞を次いで上記
の如くヒトＢ親リンパ性ウイルスで感染する。
HBLV液を感染CB細胞からそれらが＞25〜30％の巨大細
胞を示す時点で採取し、この細胞を次いで参照血清（陽
性及び陰性）を用いて間接免疫螢光アッセイにより試験
する。HBLV感染に対して陽性の一人の患者からの血清、
或いは強いIFA反応性を示すその他の血清はHBLVに対し
て＞1:80の力価を含む。この操作において用いられた陰
性血清はHBLVに対して抗体を有さない少なくとも二つの
血清である。未感染血液細胞は48時間PHA−Ｐ刺戟され
た。FITCアフィニティ精製抗ヒトIgG（Ｈ及びＬ）を1:1
5にてヤギ或いはウサギ中で調製した。ガラススライド
をテフロン被覆し、未被覆6mmのID円を有した。IF搭載
溶液を用いて細胞をガラススライドに固定した。
胞を示す時点で採取し、この細胞を次いで参照血清（陽
性及び陰性）を用いて間接免疫螢光アッセイにより試験
する。HBLV感染に対して陽性の一人の患者からの血清、
或いは強いIFA反応性を示すその他の血清はHBLVに対し
て＞1:80の力価を含む。この操作において用いられた陰
性血清はHBLVに対して抗体を有さない少なくとも二つの
血清である。未感染血液細胞は48時間PHA−Ｐ刺戟され
た。FITCアフィニティ精製抗ヒトIgG（Ｈ及びＬ）を1:1
5にてヤギ或いはウサギ中で調製した。ガラススライド
をテフロン被覆し、未被覆6mmのID円を有した。IF搭載
溶液を用いて細胞をガラススライドに固定した。
操 作。 HBLV＞25〜30％拡大巨大細胞＞10μ/ml）
で感染されたヒト帯血液細胞をPBS中（Ca++及びMg++な
し）で1000rpmにて30℃で３回洗浄した。洗浄細胞を、
退化細胞を除去するために、リンパ球分離培地中に入れ
た。洗浄細胞をCa++及びMg++を有するPBS中に懸濁させ
（×105個細胞/ml）、テフロンスライド上に堆積させ
た。同様に、未感染CB細胞をスライド上に堆積させ、感
染細胞と同様にして処理した。細胞を迅速に風乾し、次
いで冷アセトン（20℃に保たれた）中で室温において10
分間固定した。固定細胞を水分を避けるためにスライド
箱内にて−20℃にて保存した。全ての被試験血清は56℃
で1/2時間インキュベートし、次いで沈澱物質を避ける
ために分類した。血清を次いでシェーカー或いはロッカ
ーを用いて10分間隔でPBS（Ca++及びMg++なし）中で２
回の稀釈で1:10にて稀釈した。スライドを次いで風乾
し、FITC抗ヒトIgGをスライド上に堆積し、40分間イン
キュベートし、３回洗浄し、風乾し、及びカバースリッ
プを用いてIF搭載溶液を搭載した。搭載スライドは螢光
の損失なしに、この搭載溶液と共に４℃において１週間
保存される。
で感染されたヒト帯血液細胞をPBS中（Ca++及びMg++な
し）で1000rpmにて30℃で３回洗浄した。洗浄細胞を、
退化細胞を除去するために、リンパ球分離培地中に入れ
た。洗浄細胞をCa++及びMg++を有するPBS中に懸濁させ
（×105個細胞/ml）、テフロンスライド上に堆積させ
た。同様に、未感染CB細胞をスライド上に堆積させ、感
染細胞と同様にして処理した。細胞を迅速に風乾し、次
いで冷アセトン（20℃に保たれた）中で室温において10
分間固定した。固定細胞を水分を避けるためにスライド
箱内にて−20℃にて保存した。全ての被試験血清は56℃
で1/2時間インキュベートし、次いで沈澱物質を避ける
ために分類した。血清を次いでシェーカー或いはロッカ
ーを用いて10分間隔でPBS（Ca++及びMg++なし）中で２
回の稀釈で1:10にて稀釈した。スライドを次いで風乾
し、FITC抗ヒトIgGをスライド上に堆積し、40分間イン
キュベートし、３回洗浄し、風乾し、及びカバースリッ
プを用いてIF搭載溶液を搭載した。搭載スライドは螢光
の損失なしに、この搭載溶液と共に４℃において１週間
保存される。
スライドを免疫螢光スコープ上で読取り、陽性及び陰
性抗体力価を評点する。陽性血清は僅かに細胞内にドッ
ト状染色を有する拡大細胞の明緑色核染色を示した。陽
性細胞の数は感染度と共に変る。陰性血清は感染及び未
感染細胞の両者に染色を示さない同様に、陽性血清は未
感染細胞にIF染色を示さない。FITCのみでインキュベー
トされた細胞は感染及び未感染細胞に染色を示さない
（第1a参照）。HBLVに対する抗体の終点力価は最終稀釈
率における無染色或いは弱染色のいずれかに基づく。実
際の力価は僅かに染色した細胞を示す抗体の稀釈率及び
完全に陰性である引続く稀釈率に基づいて計算される。
性抗体力価を評点する。陽性血清は僅かに細胞内にドッ
ト状染色を有する拡大細胞の明緑色核染色を示した。陽
性細胞の数は感染度と共に変る。陰性血清は感染及び未
感染細胞の両者に染色を示さない同様に、陽性血清は未
感染細胞にIF染色を示さない。FITCのみでインキュベー
トされた細胞は感染及び未感染細胞に染色を示さない
（第1a参照）。HBLVに対する抗体の終点力価は最終稀釈
率における無染色或いは弱染色のいずれかに基づく。実
際の力価は僅かに染色した細胞を示す抗体の稀釈率及び
完全に陰性である引続く稀釈率に基づいて計算される。
ウイルス膜抗原を検出するために（第1b図）、HBLV感
染及び未感染生存細胞（非固定）を血清のない培地中で
３回洗浄し、患者の血清で４℃において30分間処理し
た。細胞を再び洗浄し、アフィニィ−精製FITC抗−ヒト
IgGで更に30分間処理し、培地中で洗浄し、及び上記膜
螢光性を検査した。斑点状表面螢光を示すHBLV感染細胞
を第2b図に示す。
染及び未感染生存細胞（非固定）を血清のない培地中で
３回洗浄し、患者の血清で４℃において30分間処理し
た。細胞を再び洗浄し、アフィニィ−精製FITC抗−ヒト
IgGで更に30分間処理し、培地中で洗浄し、及び上記膜
螢光性を検査した。斑点状表面螢光を示すHBLV感染細胞
を第2b図に示す。
以下の具体例は、例１に用いられた特定の試薬を含有
する診断試験キットが本発明の範囲内であることにおい
て、本発明の一面を説明するものである。
する診断試験キットが本発明の範囲内であることにおい
て、本発明の一面を説明するものである。
例 例1.各種病気を含有する血清におけるHBLV膜抗原（MA）
抗体の検出 細胞の調製において、HBLV感染された生きた帯血液
（CB）細胞（１×10/ml）を血清のない培地中において
２回洗浄した。同様に、PHA−Ｐ刺戟未感染CB細胞も又
洗浄して対照として用いた。
抗体の検出 細胞の調製において、HBLV感染された生きた帯血液
（CB）細胞（１×10/ml）を血清のない培地中において
２回洗浄した。同様に、PHA−Ｐ刺戟未感染CB細胞も又
洗浄して対照として用いた。
試薬：（ａ）ウイルスキャプシド抗体を含有する患者か
ら得られたHBLV−MA抗体；（ｂ）正常な健常供与者から
のHLBV陰性抗体；（ｃ）FITS抗ヒトIgG（A.P.）。
ら得られたHBLV−MA抗体；（ｂ）正常な健常供与者から
のHLBV陰性抗体；（ｃ）FITS抗ヒトIgG（A.P.）。
操作： （１） 洗浄されたHBLV感染及び未感染CB細胞を1000rp
mにおいて５分間遠心分離した。
mにおいて５分間遠心分離した。
（２） 遠心分離された細胞を＜５×105/mlの密度で血
清のない培地中に懸濁した。
清のない培地中に懸濁した。
（３） 懸濁細胞を各種稀釈率の未知の血清並びにその
他のHBLV陽性及び陰性参考血清に添加した。細胞を37℃
で45分或いは４℃で1/2時間インキュベートした。
他のHBLV陽性及び陰性参考血清に添加した。細胞を37℃
で45分或いは４℃で1/2時間インキュベートした。
（４） インキュベーション後、細胞を1000rpmで遠心
分離し、血清のない培地中で３回洗浄し、１×105/ml
の密度で再懸濁させ、及び再び小管内で遠心分離した。
遠心分離後、上澄液を廃棄し、FITC複合体を細胞に添加
した（複合体の1:15稀釈）。
分離し、血清のない培地中で３回洗浄し、１×105/ml
の密度で再懸濁させ、及び再び小管内で遠心分離した。
遠心分離後、上澄液を廃棄し、FITC複合体を細胞に添加
した（複合体の1:15稀釈）。
（５） 細胞を37℃で45分間、或いは４℃で1/2時間イ
ンキュベートした。
ンキュベートした。
（６） 細胞を血清のない培地で３回洗浄し、同一培地
中に１×105/mlの密度で再懸濁の状態に保った。
中に１×105/mlの密度で再懸濁の状態に保った。
（７） 懸濁細胞を含有する一滴をガラススライド上に
堆積し、ガラスカバースリップを細胞上に置き、膜螢光
性を検査した。
堆積し、ガラスカバースリップを細胞上に置き、膜螢光
性を検査した。
染色パターン。MA陽性細胞は完全な環或いは1/2の
環、或いはHBLV抗原を含有する細胞質の廻りのキャッピ
ングのいずれかの明るい緑がかった染色を示した（第1b
図）。死亡細胞は通常全細胞の黄色染色を帯びた。陰性
対照細胞は環の血清検出による如何なる染色、或いは試
験された血清の稀釈によるキャッピングもなく、それは
その稀釈率における抗体に対して陽性を表わした。
環、或いはHBLV抗原を含有する細胞質の廻りのキャッピ
ングのいずれかの明るい緑がかった染色を示した（第1b
図）。死亡細胞は通常全細胞の黄色染色を帯びた。陰性
対照細胞は環の血清検出による如何なる染色、或いは試
験された血清の稀釈によるキャッピングもなく、それは
その稀釈率における抗体に対して陽性を表わした。
例 ２ 例 ３ ヒト及びシミアンヘルペスウイルス類に対して調製さ
れたモノクローナル抗体及び超免疫血清を説明されるよ
うな間接免疫螢光操作によりHBLV感染細胞との反応性の
試験を行った。
れたモノクローナル抗体及び超免疫血清を説明されるよ
うな間接免疫螢光操作によりHBLV感染細胞との反応性の
試験を行った。
HBV及びHCMVに対するモノクローナル抗体は1:40の希
釈率で使用し、1:10の稀釈率の正常腹水でのHSV−Ｉ及
びII、VZV及びHVSは1:15及び1:10の稀釈率で用いた。ア
フリカミドリザル及びレーザスサルCMVに対する超免疫
血清は熱不活性化し（50℃ 30分）、及び10,000rpmで
清澄化させて1:10の稀釈率で用いた。示された血清に加
えて、EBV、CMV、HSV−Ｉ及びII、及びVZVに対する抗体
を含有するヒト血清も又HBLV感染細胞と反応しなかっ
た。CMVに対する抗体を含有するアフリカミドリザル及
びレーザスの血清は又HBLVで試験した際に陰性であっ
た。EBV及びHCMVに対するモノクローナル抗体、及び正
常マウスからの腹水はGary Pearson博士（ジョージタウ
ン大学医学校、ワシントンD.C.）からの贈物であった。
VZV及びHVSに対するモノクローナル抗体はNancy Chung
博士（ベイラー医科大学、ヒューストン、テキサス州）
及びJohn Dahlberg博士（NCI、ベセスダ、メリーランド
州）からそれぞれ得られた。HSV−Ｉ及びIIモノクロー
ナル抗体はDupoint（ボストン、マサチューセッツ州）
から購入した。精製アフリカミドリザル及びレーザスCM
Vに対する超免疫血清はAblashi博士よりウサギにおいて
予め調製された。
釈率で使用し、1:10の稀釈率の正常腹水でのHSV−Ｉ及
びII、VZV及びHVSは1:15及び1:10の稀釈率で用いた。ア
フリカミドリザル及びレーザスサルCMVに対する超免疫
血清は熱不活性化し（50℃ 30分）、及び10,000rpmで
清澄化させて1:10の稀釈率で用いた。示された血清に加
えて、EBV、CMV、HSV−Ｉ及びII、及びVZVに対する抗体
を含有するヒト血清も又HBLV感染細胞と反応しなかっ
た。CMVに対する抗体を含有するアフリカミドリザル及
びレーザスの血清は又HBLVで試験した際に陰性であっ
た。EBV及びHCMVに対するモノクローナル抗体、及び正
常マウスからの腹水はGary Pearson博士（ジョージタウ
ン大学医学校、ワシントンD.C.）からの贈物であった。
VZV及びHVSに対するモノクローナル抗体はNancy Chung
博士（ベイラー医科大学、ヒューストン、テキサス州）
及びJohn Dahlberg博士（NCI、ベセスダ、メリーランド
州）からそれぞれ得られた。HSV−Ｉ及びIIモノクロー
ナル抗体はDupoint（ボストン、マサチューセッツ州）
から購入した。精製アフリカミドリザル及びレーザスCM
Vに対する超免疫血清はAblashi博士よりウサギにおいて
予め調製された。
用いられた略号:HBLVはヒトＢ親リンパ性ウイルス;EB
Vはエプスタイン−バーウイルス;HCMV、ヒトサイトメガ
ロウイルス;HSVはヘルペスシンプレックスウイルス;VZV
はバリセラーゾスターウイルス;HVSはヘルペスウイルス
サイミリ;VCAはウイルスキャプシド抗原;MAは膜抗原。
Vはエプスタイン−バーウイルス;HCMV、ヒトサイトメガ
ロウイルス;HSVはヘルペスシンプレックスウイルス;VZV
はバリセラーゾスターウイルス;HVSはヘルペスウイルス
サイミリ;VCAはウイルスキャプシド抗原;MAは膜抗原。
HBLV感染帯血液単核細胞をHBLV陰性血清で染色したと
ころ免疫螢光のない相当な数の大細胞が得られた。結果
を表４に示す。
ころ免疫螢光のない相当な数の大細胞が得られた。結果
を表４に示す。
例 ４ 旧世界及び新世界の霊長類からの血清を説明されるよ
うな間接免疫螢光によりHBLVに対する抗体を試験した。
うな間接免疫螢光によりHBLVに対する抗体を試験した。
旧世界の霊長類からの血清のあるものは、p.Kanki博
士（ハーバード公衆衛生学校、ボストン、マサチューセ
ッツ州）からの贈物であった。全ての血清は56℃で30分
間不活性化され、遠心分離により清澄化してから用い
た。HBLV−感染帯血液白血球、P3HR−１（EBV−VCAを発
現する樹立細胞系）及びHSC−株IIにより感染されたフ
クロウザル肝臓細胞を比較のために用いた。感染細胞が
細胞変成効果を示した場合には、細胞をアセトン中に固
定してIFAに使用した。
士（ハーバード公衆衛生学校、ボストン、マサチューセ
ッツ州）からの贈物であった。全ての血清は56℃で30分
間不活性化され、遠心分離により清澄化してから用い
た。HBLV−感染帯血液白血球、P3HR−１（EBV−VCAを発
現する樹立細胞系）及びHSC−株IIにより感染されたフ
クロウザル肝臓細胞を比較のために用いた。感染細胞が
細胞変成効果を示した場合には、細胞をアセトン中に固
定してIFAに使用した。
３匹のフクロウザル及び１匹のワタボウシマーモセッ
トに予めHVSを接種した。これらの動物からの血清はヘ
ルペスウイルスアテレス（Herpesvirus ateles）と交叉
反応したHVS後期抗原に対する抗体を保有した。結果を
表５に示す。
トに予めHVSを接種した。これらの動物からの血清はヘ
ルペスウイルスアテレス（Herpesvirus ateles）と交叉
反応したHVS後期抗原に対する抗体を保有した。結果を
表５に示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 アブラシ，ダーラム ブイ. アメリカ合衆国メリーランド州、オルニ ー、バーンズレー、レーン、4117
Claims (3)
- 【請求項１】ヒトＢ新リンパ性ウイルス（HBLV）に感染
したと予想されるヒトの血清中の、HBLV膜抗原に特異的
な抗体の検出方法であって、 （ａ）HBLVまたはその画分を、被検ヒト血清からの抗体
と、HBLV抗原と抗体との結合が生じるようあらかじめ決
められた時間にわたり接触させ、そして （ｂ）HBLV抗体−抗原複合体の存在を検出する 工程を含んでなり、 ここで、このHBLVは、 （ａ）ヘルペスウイルスの形態学的特徴を保持し、 （ｂ）約110kbの二本鎖DNAゲノムであり、 （ｃ）ヒトＢ細胞を選択的に介して宿主に感染し、 （ｄ）そのヌクレオキャプシドは162個のキャプソメア
を有する20面体であり、脂質膜内にエンベロープされて
いる ことを特徴とするものである、方法。 - 【請求項２】ヒトＢ新リンパ性ウイルス（HBLV）に感染
したと予想されるヒトの血清中の、HBLV膜抗原に特異的
な抗体の検出方法であって、 （１） HBLV感染細胞を用意する工程であって、HBLV感
染細胞を、 （ａ） 無血清培地で洗浄し、 （ｂ） 無血清培地から分離し、そして （ｃ） 無血清培地に再懸濁することからなり、 （２） 再懸濁したHBLV感染細胞を、次の （ａ） 未知の血清試料、 （ｂ） 既知のHBLV抗体陰性血清、および （ｃ） 既知のHBLV抗体陽性血清、 のいずれかのアリコートと共にインキュベートして、分
離試料第一反応混合物、分離陰性コントロール第一反応
混合物、および分離陽性コントロール第一反応混合物と
を得て、 （３） 前記それぞれの第一反応混合物の上清から細胞
を分離して、細胞を得て、 （４） 前記の第一反応混合物から得た細胞を無血清培
地で洗浄し、 （５） 前記（４）で得た細胞を無血清培地に再懸濁
し、 （６） 前記（５）で得た再懸濁細胞を上清から分離
し、細胞を得て、 （７） 前記（６）で得た細胞を、無血清培地中で、蛍
光物質結合−抗ヒト免疫グロブリン抗体とインキュベー
トして、分離試料第二反応混合物、分離陰性コントロー
ル第二反応混合物、および分離陽性コントロール第二反
応混合物を得て、 （８） 前記それぞれの第二反応混合物の上清から細胞
を分離して、細胞を得て、 （９） 前記（８）で得た細胞を無血清培地に再懸濁
し、 （10） 前記（９）で得た第二反応混合物からのそれぞ
れの細胞について膜蛍光を調べ、 （11） 細胞を蛍光を、陰性コントロールおよび陽性コ
ントロールのそれと比較し、 （12） HBLVの膜抗原に対する抗体の存在非存在を、前
記（11）の細胞のの蛍光染色有無によって決定する 工程を含んでなり、 ここで、このHBLVは、 （ａ）ヘルペスウイルスの形態学的特徴を保持し、 （ｂ）約110kbの二本鎖DNAゲノムであり、 （ｃ）ヒトＢ細胞を選択的に介して宿主に感染し、 （ｄ）そのヌクレオキャプシドは162個のキャプソメア
を有する20面体であり、脂質膜内にエンベロープされて
いる ことを特徴とするものである、方法。 - 【請求項３】蛍光物質結合−抗ヒト免疫グロブリン抗体
がフルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合−抗
ヒト免疫グロブリン抗体である、請求の範囲第２項記載
の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US89546386A | 1986-08-11 | 1986-08-11 | |
| US895,463 | 1986-08-11 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02500242A JPH02500242A (ja) | 1990-02-01 |
| JP2555117B2 true JP2555117B2 (ja) | 1996-11-20 |
Family
ID=25404547
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62505064A Expired - Lifetime JP2555117B2 (ja) | 1986-08-11 | 1987-07-29 | ヒトｂ親リンパ性ウイルス（ｈｂｌｖ）の試験方法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0319542B1 (ja) |
| JP (1) | JP2555117B2 (ja) |
| CA (1) | CA1308651C (ja) |
| DE (1) | DE3788424T2 (ja) |
| IL (1) | IL83422A (ja) |
| WO (1) | WO1988001387A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE117022T1 (de) * | 1987-06-01 | 1995-01-15 | Baylor College Medicine | Expression der immunoaktiven proteine von menschlichem b-lymphotropikvirus. |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU583473B2 (en) * | 1983-04-27 | 1989-05-04 | President And Fellows Of Harvard College | Method and products for detection of human t cell leukemia virus |
| US4725669A (en) * | 1984-11-09 | 1988-02-16 | President And Fellows Of Harvard College | Assay for detecting infection by human T-cell lymphotropic virus-III |
-
1987
- 1987-07-29 JP JP62505064A patent/JP2555117B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-29 DE DE87905501T patent/DE3788424T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-29 WO PCT/US1987/001816 patent/WO1988001387A1/en active IP Right Grant
- 1987-07-29 EP EP87905501A patent/EP0319542B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-08-03 IL IL83422A patent/IL83422A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-08-11 CA CA000544217A patent/CA1308651C/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU612329B2 (en) | 1991-07-11 |
| CA1308651C (en) | 1992-10-13 |
| DE3788424T2 (de) | 1994-04-28 |
| EP0319542B1 (en) | 1993-12-08 |
| AU7852387A (en) | 1988-03-08 |
| EP0319542A4 (en) | 1990-11-28 |
| EP0319542A1 (en) | 1989-06-14 |
| DE3788424D1 (de) | 1994-01-20 |
| IL83422A (en) | 1992-07-15 |
| IL83422A0 (en) | 1988-01-31 |
| WO1988001387A1 (en) | 1988-02-25 |
| JPH02500242A (ja) | 1990-02-01 |
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