CN102512664B - 一种神经生长因子组合物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种神经生长因子(NGF)组合物，主要由NGF、α-亚麻酸所组成。本发明该组合物制成的制剂中，每单位制剂中含：NGF5μg～400μg，α-亚麻酸0.5g～300mg，提供了一种进一步增强NGF疗效的药物。同时，结合微乳系统将所述组合物递送至神经系统，α-亚麻酸与微乳传递体发挥协同作用，大大提高了NGF进入血脑屏障的效率。

Description

一种神经生长因子组合物

技术领域

本发明涉及一种神经生长因子(NGF)的组合物，以及含可将该组合物递送至中枢神经系统的传递体的神经生长因子组合物，属于药物制剂领域。

背景技术

神经生长因子(Nerve Growth Factor，NGF)是一种小分子多肽类神经营养因子，具有较强的促细胞分裂功能，在神经发育、神经再生等诸多方面有重要作用，是迄今为止发现的唯一对损伤的神经再生修复机能有调节作用的生物活性因子。

近年来，NGF以其独特的作用机制和优势，在临床上得到广泛的应用，主要集中于以下几个方面：(1)中枢神经疾病(Central Nerve System，CNS)：急性脑血管意外、脊髓损伤、颅脑外伤、新生儿缺血缺氧性脑病及阿尔茨海默病(Alzheimer′s Disease，AD)等；(2)周围神经损伤及周围神经疾病(Peripheral Nerve System，PNS)：糖尿病性周围神经病变，面神经的损伤修复，有机磷中毒迟发性周围神经炎及坐骨神经损伤等；(3)眼部疾病：治疗神经营养性角膜溃疡、视神经炎、促进角膜创口愈合等。

α-亚麻酸是构成人体组织细胞的主要成分，它在人体内不能合成，必须从体外摄取。α-亚麻酸能够促进脑内核酸蛋白质及单胺类神经递质的合成，对于脑神经元、神经胶质细胞，神经传导突触的形成、生长、增殖、分化、成熟具有重要的作用，其可通过增进大脑神经膜、突触前后膜的通透性，使神经信息传递通路畅通，提高神经反射能力，进而增强人的思维能力、记忆能力、应激能力。

目前，临床上NGF通常采用肌肉注射方式给药。但，对于中枢神经疾病，由于血-脑屏障(BBB)的阻隔，采用这些传统方式给药，NGF或其组合物均很难穿透BBB而到达中枢。因此，如何将外源性NGF或其组合物高效的递送至中枢神经系统，成为其应用于中枢神经疾病治疗的关键。

理论上，采用侧脑室及大脑实质直接注射，可将NGF或其组合物有效的递送至中枢神经系统，但，由于手术具有创伤性、术后可能出现并发症以及费用偏高、病人依从性差等原因，不易在临床广泛应用。

微乳是一种有效的药物递送介质，具有血脑屏障开放作用，作为载体有助于药物递送至中枢神经系统。

但至今为止，还未有将NGF与α-亚麻酸联合应用治疗神经系统疾病，以及使用微乳系统运送NGF等小分子类药物进行药物递送的报道。

发明内容

为了弥补现有技术的缺陷，本发明将NGF与α-亚麻酸作为组合物联合应用，提供了一种进一步增强NGF疗效的药物。同时，结合微乳系统将所述组合物递送至神经系统，α-亚麻酸与微乳传递体发挥协同作用，大大提高了NGF进入血脑屏障的效率。

本发明的目的之一是提供一种神经生长因子(NGF)的组合物，将NGF与α-亚麻酸联合应用，以达到增强NGF治疗效果的目的。

本发明的另一目的是将神经生长因子组合物载附于微乳传递体，利用微乳传递这一有效药物递送介质改善神经生长因子的摄入效率，提高神经生长因子组合物的综合治疗效果。

本发明的另一目的是验证神经生长因子组合物微乳制剂的安全性和应用优势。

因而，第一方面，本发明提供了一种神经生长因子组合物，其中，所述组合物包括以下活性成分：

神经生长因子                    5μg～400μg

α-亚麻酸                       0.5mg～300mg

所述各活性成分含量为所述组合物在单位制剂中的含量。

优选地，所述组合物还包括微乳传递体，进行权利要求1所述组合物的递送。

优选地，所述微乳传递体包括乳化剂和助乳化剂。

优选地，单位制剂中所述微乳传递体具体组成为：

乳化剂   2.9mg～40mg

助乳化剂   1.6mg～50mg。

优选地，单位制剂中所述组合物包括：

优选地，所述乳化剂选自聚氧乙烯氢化蓖麻油、Polyxyl35蓖麻油、吐温-80、吐温-85、苄泽-35、泊洛沙姆-188中的一种或几种；所述助乳化剂选自辛癸酸甘油酯、油酸乙酯、聚乙二醇400、丙二醇、甘油、异丙醇、乙醇中的一种或几种。

优选地，单位制剂中所述微乳传递体具体组成为：

聚氧乙烯氢化蓖麻油      2.9mg

辛癸酸甘油酯            0.9mg

聚乙二醇400             0.7mg。

优选地，所述组合物还包括保护剂、缓冲剂。

优选地，单位制剂中所述保护剂的含量为3.0～35mg，所述缓冲剂能稳定所述组合物体系pH在5.5-7.5。

优选地，所述保护剂选自丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、杆菌肽中的一种或几种，所述缓冲剂选自醋酸盐、磷酸盐。

优选地，所述组合物还包括生物粘附剂。

优选地，单位制剂中所述生物粘附剂的含量为5～13mg。

优选地，所述生物粘附剂选自壳聚糖、透明质酸钠、β-环糊精及其衍生物、海藻酸盐、聚乙二醇、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种。

优选地，单位制剂中所述组合物还包括含量为0.146～9mg的抑菌剂。

优选地，所述抑菌剂选自苯甲醇、苯酚、苯扎氯铵、苯扎溴铵。

优选地，所述组合物为喷雾剂、冻干粉针剂、气雾剂、滴鼻剂、凝胶剂或膜剂等任一药学上常用剂型。

优选地，所述组合物的给药途径为鼻腔、眼部或注射用药。

附图说明

图1为制备实施例1微乳传递体的三元相图；

图2为试验例2中供试品给药0.5小时后各检测点递送至各组织中的浓度；

图3为试验例2中供试品给药1.0小时后各检测点递送至各组织中的浓度；

图4为试验例2中供试品给药2.0小时后各检测点递送至各组织中的浓度。

具体实施方式

本发明提供的第1个技术方案是，一种神经生长因子组合物，其主要由下述活性成分组合而成：

NGF                    5μg～400μg

α-亚麻酸              0.5mg～300mg

所述各活性成分为其在由该组合物制成的单位制剂中的含量组成。优选地，其中所述NGF的含量为50μg～400μg。

α-亚麻酸与NGF联合应用可产生协同作用，在修复损伤神经的同时，补充神经系统的结构性成分，促进神经元增殖和分化，调节中枢和外周神经元存活和轴突生长，从而可增强NGF的治疗效果。

本发明提供的第2个技术方案是对第1个技术方案的改进，改进之处在于，采用了微乳传递体作为递送介质，其中α-亚麻酸与微乳传递体发挥协同作用，对血脑屏障通透性有促进作用，可增加所述组合物在脑部的摄入。

本发明提供的第3个技术方案是对第2个技术方案的改进，改进之处在于，所述微乳传递体包含乳化剂和助乳化剂，将乳化剂与助乳化剂以适当比例组合即可形成性能优良的微乳。

优选地，单位制剂中所述微乳传递体具体组成为：

乳化剂      2.9mg～40mg

助乳化剂    1.6mg～50mg。

本发明提供的第4个技术方案是对第3个技术方案的改进，改进之处在于，所述乳化剂优选为聚氧乙烯氢化蓖麻油，助乳化剂优选为辛癸酸甘油酯、聚乙二醇400。以聚氧乙烯氢化蓖麻油、辛癸酸甘油酯、聚乙二醇400制得的微乳，液滴粒径小，粒度分布均匀，稳定性好，毒性小，具有良好的生物相容性。

优选技术方案，单位制剂中所述微乳传递体具体组成优选为：

聚氧乙烯氢化蓖麻油        2.9mg

辛癸酸甘油酯              0.9mg

聚乙二醇400               0.7mg。

本发明提供的第5个技术方案是对第2个技术方案的改进，改进之处在于，组合物微乳传递体的制剂中还包含保护剂。所述保护剂丙氨酸、甘氨酸、精氨酸组合物可对NGF起保护作用，提高了其稳定性。

本发明提供的第6个技术方案是对第2个技术方案的改进，改进之处在于，组合物微乳传递体的制剂中还包含稳定pH在5.5～7.5的缓冲剂。缓冲剂的使用，可使本组合物pH相对稳定，降低了pH波动所带来的不良影响，进一步提高了其稳定性。

本发明提供的第7个技术方案是对第2个技术方案的改进，改进之处在于，组合物微乳传递体的制剂中还可包含生物粘附剂。生物粘附剂壳聚糖的应用，可增加药物滞留于患处的时间，从而在一定程度上能改善药物通过鼻粘膜上皮层的渗透效果，对药物于脑部的摄入有一定的促进作用。本发明提供的第8个技术方案是对第2个技术方案的改进，改进之处在于，组合物微乳传递体的制剂中还可包含抑菌剂。抑菌剂的使用，有利于组合物的长期贮藏。

下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明不局限于以下实施例中的内容。

一、NGF组合物微乳制备实施例

制备实施例1NGF组合物微乳剂型的制备

处方	组成
		NGF	50μg/ml
丙氨酸	3.3mg/ml
		甘氨酸	3.3mg/ml
精氨酸	3.3mg/ml
		壳聚糖	5mg/ml
α-亚麻酸	0.5mg/ml

辛癸酸甘油酯	0.9mg/ml
		聚氧乙烯氢化蓖麻油	2.9mg/ml
聚乙二醇400	0.7mg/ml
		苯甲醇	9mg/ml
注射用水	适量

制备方法：①将壳聚糖溶于适量稀醋酸，备用；②称取处方量α-亚麻酸、辛癸酸甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇400、苯甲醇并混合均匀，备用；③将丙氨酸、甘氨酸、精氨酸溶于适量注射用水，备用；④取壳聚糖溶液和氨基酸溶液混合均匀，并用氢氧化钠调节pH至5.5；⑤将NGF加至溶液④混匀后，加至溶液②中，搅拌均匀，补充注射用水至足量，过滤即得。

制备实施例2 NGF组合物微乳剂型的制备

本实施例的处方组成如下表，制备方法同实施例1。

处方	组成
		NGF	100μg/ml
丙氨酸	6.6mg/ml
		甘氨酸	6.6mg/ml
精氨酸	6.6mg/ml
		壳聚糖	5mg/ml
α-亚麻酸	10mg/ml
		辛癸酸甘油酯	20mg/ml
吐温-80	40mg/ml
		丙二醇	30mg/ml
注射用水	适量

制备实施例3 NGF组合物微乳剂型的制备

本实施例的处方组成如下表，制备方法同实施例1。

处方	组成
		NGF	100μg/ml
丙氨酸	6.6mg/ml
		甘氨酸	6.6mg/ml
精氨酸	6.6mg/ml
		α-亚麻酸	10mg/ml
辛癸酸甘油酯	20mg/ml
		吐温-80	40mg/ml
丙二醇	30mg/ml
		注射用水	适量

制备实施例4 NGF组合物微乳剂型的制备

本实施例的处方组成如下表，制备方法同实施例1。

处方	组成
		NGF	5.0μg/ml
丙氨酸	1.0mg/ml
		甘氨酸	1.0mg/ml
精氨酸	1.0mg/ml
		壳聚糖	5mg/ml
α-亚麻酸	10mg/ml
		辛癸酸甘油酯	20mg/ml
吐温-80	40mg/ml
		丙二醇	30mg/ml
注射用水	适量

制备实施例5 NGF组合物微乳剂型的制备

本实施例的处方组成如下表：

处方	组成
		NGF	200μg/ml

丙氨酸	8.1mg/ml
		甘氨酸	8.1mg/ml
精氨酸	8.1mg/ml
		羟丙基甲基纤维素	10mg/ml
α-亚麻酸	100mg/ml
		维生素E	20mg/ml
辛癸酸甘油酯	5mg/ml
		吐温-85	40mg/ml
甘油	42mg/ml
		苯扎氯铵	0.146mg/ml
注射用水	适量

制备方法：①将羟丙甲基纤维素溶于适量注射用水，备用；②取处方量α-亚麻酸、维生素E、辛癸酸甘油酯、吐温-85、甘油混合均匀，备用；③将丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、苯扎氯铵溶于适量注射用水，备用；④将羟丙甲基纤维素溶液和③所述溶液混合均匀，并调节其pH至6.0；⑤将NGF加至溶液④混匀后，加至溶液②中，搅拌均匀，补充注射用水至足量，过滤即得。

制备实施例6 NGF组合物微乳剂型的制备

本实施例的处方组成如下表：

处方	组成
		NGF	300μg/ml
丙氨酸	10mg/ml
		甘氨酸	10mg/ml
精氨酸	10mg/ml
		杆菌肽	5mg/ml
壳聚糖	5mg/ml

羟丙基β环糊精	5mg/ml
		α-亚麻酸	200mg/ml
辛癸酸甘油酯	2.0mg/ml
		聚氧乙烯氢化蓖麻油	6.0mg/ml
聚乙二醇400	1.5mg/ml
		注射用水	适量

制备方法：①将壳聚糖溶于适量稀醋酸，备用；②取处方量α-亚麻酸、辛癸酸甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇400混合均匀，备用；③将丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、杆菌肽、羟丙基β环糊精溶于适量注射用水，备用；④将壳聚糖溶液和氨基酸溶液混合均匀，氢氧化钠溶液调节pH值6.5；⑤将NGF加至溶液④混匀后，加至溶液②中，搅拌均匀，补充注射用水至足量，过滤即得。

制备实施例7 NGF组合物微乳剂型的制备

本实施例的处方组成如下表：

处方	组成
		NGF	400μg/ml
杆菌肽	16mg/ml
		透明质酸钠	8mg/ml
羟丙基β环糊精	5mg/ml
		α-亚麻酸	300mg/ml
辛癸酸甘油酯	4mg/ml
		聚氧乙烯氢化蓖麻油	10mg/ml
聚乙二醇400	4mg/ml
		注射用水	适量

制备方法：①取处方量α-亚麻酸、辛癸酸甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇400混合均匀，备用；②将丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、杆菌肽、羟丙基β环糊精、透明质酸钠溶于适量注射用水，并用氢氧化钠溶液调节其pH至7.5；③将NGF加至溶液②混匀后，加至溶液①中，搅拌均匀，补充注射用水至足量，过滤即得。

制备实施例8 NGF组合物冻干粉针剂剂型的制备

处方组成如下表：

处方	组成
		NGF	50μg/ml
丙氨酸	3.3mg/ml
		甘氨酸	3.3mg/ml
精氨酸	3.3mg/ml
		壳聚糖	5mg/ml
α-亚麻酸	0.5mg/ml
		辛癸酸甘油酯	0.9mg/ml
聚氧乙烯氢化蓖麻油	2.9mg/ml
		聚乙二醇400	0.7mg/ml
甘露醇	5mg/ml
		注射用水	适量

制备方法：①按实施例1方法，加入甘露醇作为载体制备NGF组合物微乳；②将①所得微乳冷冻干燥，得NGF组合物微乳冻干粉末；③筛取100-400目的NGF组合物微乳冻干粉末，即得NGF组合物微乳冻干粉针。

二、本发明组合物微乳评价实施例制备的NGF组合物微乳的性能评价

微乳是由乳化剂、助乳化剂和水相以适当比例混合而形成的一种热力学稳定体系。乳化剂、助乳化剂的选择以及它们的处方比例，对性能优良微乳的形成起着至关重要的作用。

1、对实施例1制备的NGF组合物的性能进行评价，结果如下表所示：

	平均粒径/nm	PDI	Zeta电位/mv	pH	状态
						0周	31.5	0.113	-19.5	5.6	透明，泛蓝色乳光
1周	31.8	0.120	-18.6	5.5	透明，泛蓝色乳光
						3周	32.3	0.124	-18.8	5.7	透明，泛蓝色乳光
5周	33.1	0.125	-18.4	5.6	透明，泛蓝色乳光
						8周	33.6	0.131	-18.5	5.7	透明，泛蓝色乳光

2、对实施例2制备的NGF组合物微乳的性能进行评价，结果如下表所示：

	平均粒径/nm	PDI	Zeta电位/my	pH	状态
						0周	32.5	0.110	-19.6	5.7	透明，泛蓝色乳光
1周	31.5	0.125	-18.4	5.5	透明，泛蓝色乳光
						3周	32.0	0.114	-18.6	5.8	透明，泛蓝色乳光
5周	32.1	0.126	-18.5	5.6	透明，泛蓝色乳光
						8周	33.6	0.130	-18.5	5.5	透明，泛蓝色乳光

3、对实施例3制备的NGF组合物微乳的性能进行评价，结果如下表所示：

	平均粒径/nm	PDI	Zeta电位/my	pH	状态
						0周	32.2	0.113	-19.4	5.7	透明，泛蓝色乳光
1周	31.8	0.114	-18.0	5.8	透明，泛蓝色乳光
						3周	32.2	0.120	-18.3	5.6	透明，泛蓝色乳光
5周	32.4	0.124	-18.4	5.5	透明，泛蓝色乳光
						8周	33.0	0.129	-18.6	5.7	透明，泛蓝色乳光

由上表可知：实施例1～3处方所制备的NGF组合物透明、且泛蓝色乳光；平均粒径在35nm以下，粒径较小；粒度分布PDI在0.150以下，粒度分布均匀；Zeta电位较高，微乳体系稳定；pH在5.5～6.0之间，在8周时间内PH变化不大，均在鼻腔给药适宜范围内；8周内，本发明所得NGF组合物各主要质量指标均无明显变化，稳定性良好。

同时，也对实施例4、5、6处方所制备的NGF组合物进行了稳定性测定，均符合上述实施例的稳定性情况，上述数据说明本发明所选处方组成制备的NGF组合物性能优良。

本发明通过绘制不同辅料、不同处方比例下所形成的三元相图来进行微乳处方的筛选，，以制备实施例1为例，以聚氧乙烯氢化蓖麻油(RH40)、辛癸酸甘油酯(GTCC)和聚乙二醇400(PEG400)组合所得三元相图如附图1所示，此处方下所形成的微乳区域面积较大，易于得到性能优良的微乳。

三、比较实施例

比较实施例1-1普通NGF制剂的制备：

处方	组成
		NGF	50μg/ml
丙氨酸	3.3mg/ml
		甘氨酸	3.3mg/ml
精氨酸	3.3mg/ml
		壳聚糖	5mg/ml
苯甲醇	9mg/ml
		注射用水	适量

制备方法：①将壳聚糖溶于适量稀醋酸，并用氢氧化钠溶液调节其pH至5.5，备用；②取处方量丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、苯甲醇溶于适量注射用水，备用；③将①和②所得溶液混合，并加入处方量NGF，搅拌均匀，补充注射用水至足量，过滤即得。

比较实施例1-2普通NGF组合物制剂的制备：

处方	组成
		NGF	50μg/ml
丙氨酸	3.3mg/ml
		甘氨酸	3.3mg/ml
精氨酸	3.3mg/ml
		壳聚糖	5mg/ml
α-亚麻酸	0.5mg/ml
		聚氧乙烯氢化蓖麻油	3.5mg/ml
苯甲醇	9mg/ml
		注射用水	适量

制备方法：①将壳聚糖溶于适量稀醋酸，备用；②称取处方量α-亚麻酸、聚氧乙烯氢化蓖麻油、苯甲醇并混合均匀，备用；③将丙氨酸、甘氨酸、精氨酸溶于适量注射用水，备用；④取壳聚糖溶液和氨基酸溶液混合均匀，并用氢氧化钠调节pH至5.5；⑤将NGF加至溶液④混匀后，加至溶液②中，搅拌均匀，补充注射用水至足量，过滤即得。

比较实施例1-3NGF微乳的制备

制备方法同实施例1，处方组成如下表：

处方	组成
		NGF	50μg/ml
丙氨酸	3.3mg/ml
		甘氨酸	3.3mg/ml

精氨酸	3.3mg/ml
		壳聚糖	5mg/ml
辛癸酸甘油酯	0.9mg/ml
		聚氧乙烯氢化蓖麻油	2.9mg/ml
聚乙二醇400	0.7mg/ml
		苯甲醇	9mg/ml
注射用水	适量

比较实施例2至8NGF微乳制备

制备处方参见制备实施例2～8的NGF组合物微乳处方，将其中组分“α-亚麻酸”删除即可。每个制备实施例处方中删除“α-亚麻酸”后相对应于相应NGF微乳，如：

比较实施例2的处方为：

处方	组成
		NGF	100μg/ml
丙氨酸	6.6mg/ml
		甘氨酸	6.6mg/ml
精氨酸	6.6mg/ml
		壳聚糖	5mg/ml
辛癸酸甘油酯	20mg/ml
		吐温-80	40mg/ml
丙二醇	30mg/ml
		注射用水	适量

制备方法：①将壳聚糖溶于适量稀醋酸，备用；②称取处方量辛癸酸甘油酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、聚乙二醇400、苯甲醇并混合均匀，备用；③将丙氨酸、甘氨酸、精氨酸溶于适量注射用水，备用；④取壳聚糖溶液和氨基酸溶液混合均匀，并用氢氧化钠调节pH至5.5；⑤将NGF加至溶液④混匀后，加至溶液②中，搅拌均匀，补充注射用水至足量，过滤即得。

同理制备比较实施例3～8。

四、试验例

下面结合试验例对本发明的安全性和应用优势做进一步的说明。

试验例1NGF组合物微乳对鼻腔黏膜的毒性研究

按下述实验方案进行NGF组合物微乳对鼻腔黏膜的毒性研究，以生理盐水为阴性对照，1.0％去氧胆酸钠为阳性对照。

实验方案：健康雄性SD大鼠，体重200±20g，随机分成9组(每组5只)，分别为阴性对照生理盐水溶液组、阳性对照1.0％去氧胆酸钠组、普通NGF组合物(比较实施例2所得)、本发明NGF组合物微乳(实施例1～7所得)组。将大鼠用乙醚轻微麻醉后，各组分别经鼻腔给药，给药量0.1ml/100g，给药频率3次/日，连续给药7天。第8天股动脉放血处死大鼠，立即取鼻黏膜，生理盐水冲洗干净。取下黏膜置于中性福尔马林溶液中固定，脱水处理，石蜡包埋，切片3～5μm，经苏木精-伊红染色后于显微镜下观察鼻黏膜组织结构的改变。

实验结果见下表：

组别	黏膜上皮情况	炎症细胞浸润程度
			生理盐水	完整，未见变性坏死	少量浸润
1.0％去氧胆酸钠	完整性破坏，有变性坏死	较多浸润

普通NGF组合物	完整，未见明显变性坏死	少量浸润
			制备实施例1的产物	完整，未见明显变性坏死	少量浸润
制备实施例2的产物	完整，未见明显变性坏死	少量浸润
			制备实施例3的产物	完整，未见明显变性坏死	少量浸润
制备实施例4的产物	完整，未见明显变性坏死	少量浸润
			制备实施例5的产物	完整，未见明显变性坏死	少量浸润
制备实施例6的产物	完整，未见明显变性坏死	少量浸润
			制备实施例7的产物	完整，未见明显变性坏死	少量浸润

综合分析：由上表结果可知，普通NGF组合物和NGF组合物微乳经鼻给药后，鼻粘膜结构完整，未见明显变性坏死，仅有少量炎症细胞浸润，其对鼻粘膜的毒性与阴性对照生理盐水组几乎相当，且明显小于阳性对照1.0％去氧胆酸钠组，因此，本发明普通NGF组合物和NGF组合物微乳对鼻粘膜毒性小，安全性良好。

试验例2：NGF组合物微乳递药效率的研究

考察NGF组合物微乳经鼻给药后递送至中枢神经系统的效率，对照组为普通NGF。

实验方案：

取SD雄性大鼠120只，分为4组，分别为普通NGF(比较实施例1-1所得)组、普通NGF组合物(比较实施例1-2所得)、NGF微乳(比较实施例1-3所得)、NGF组合物微乳(实施例1所得)组。用15％乌拉坦麻醉后分离其单侧颈动脉和股静脉，颈动脉近心端结扎，远心端做颈动脉插管。同时做气管插管以维持呼吸，在暴露的食管上切一小口，将一聚乙烯管插入直通鼻腔后部，注入适当浓度的明胶做胶粘剂将鼻腭通道封死，以防给药后药液从鼻腔进入口腔流失。鼻腔给药部位为鼻孔内0.4cm处，给药剂量为每100g体重6μCi(20μg)¹²⁵I-NGF。双侧鼻孔给药，分别于给药30、60、120min后，用蠕动泵以0.5ml/min的流速通过颈动脉插管灌流生理盐水5min，继而剪断大鼠对侧颈静脉，以1.0ml/min的流速继续灌注10min，最后剪断对侧颈动脉，继续灌流15min。取脑组织各部分(海马、纹状体、嗅球、皮质、脑干、小脑)精确称重后，用γ计数仪计数1min，根据计数与NGF含量的标准曲线计算在脑组织各部分的药物的含量。

各组织中NGF含量的校正：血清和各组织中直接计数计算的药物含量既包括¹²⁵I-NGF的完整分子，也包括NGF解离的分子片段¹²⁵I-NGF-Fab，因此，需利用能够根据分子量辨别出NGF分子的SDS-PAGE电泳对组织中药物的含量进行校正，具体方法如下：

脑组织各部分用0.5％TritonX-100超声匀浆后制成30％脑组织悬液，10000r/min离心10min后取上清。精确取部分上清液，同一组动物的相同部分脑组织的上清液合并，40″C真空干燥，再用适量蒸馏水溶解，浓缩10-20倍。再次10000r/min离心10min后取上清。上清液行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，切取13000NGF示踪的凝胶条，及其分子量以下部分(＜13000)凝胶条γ计数1min，按下式计算校正因子：

Cpm13000(完整分子部分)表示NGF处凝胶条计数，Cpm＜13000表示13000以下凝胶条计数(片段部分)。

最终，各组织中NGF的含量为直接计数算得的数值乘相应的校正因子。

实验结果：普通NGF、普通NGF组合物、NGF微乳、NGF组合物微乳经鼻腔给药0.5小时、1.0小时、2.0小时后，NGF在海马(Hippocampus)、纹状体(Striatum)、嗅球(Olfactory bulb)、皮质(Cortex)、脑干(Brainstem)、小脑(Cerebellum)中的浓度(单位为ng/100mg)见附图2。

综合分析：由附图2可知，各时间点，NGF组合物微乳经鼻给药后，在嗅球、海马区和纹状体的药物浓度明显高于普通NGF、普通NGF组合物、NGF微乳，说明本发明NGF组合物微乳中，不仅微乳传递体具有很好的血脑屏障开放作用，能提高NGF递送至中枢神经系统效率，而且α-亚麻酸能进一步促进微乳传递体将NGF递送至中枢神经系统的效率，二者具有协同效应。

同理，将制备实施例2～8所得的NGF组合物微乳与比较实施例2～8不含“α-亚麻酸”的对应NGF微乳按照上述相同的实验方案进行比较研究，记录NGF微乳、NGF组合物微乳经鼻腔给药2.0小时后，NGF在海马(Hippocampus)、纹状体(Striatum)、嗅球(Olfactory bulb)、皮质(Cortex)、脑干(Brain stem)、小脑(Cerebellum)中的浓度(单位为ng/100mg)。具体结果如下表所示：

实施例	海马	纹状体	嗅球	皮质	脑干	小脑
							对比实施例2	7.51	7.03	35.64	3.18	2.37	4.03
制备实施例2	9.01	8.12	52.37	6.87	3.47	5.48
							对比实施例3	7.38	6.84	36.78	3.25	2.18	3.95
制备实施例3	8.85	8.06	51.38	7.03	3.65	5.13
							对比实施例4	7.56	6.96	34.95	3.31	2.35	3.87

制备实施例4	8.93	7.83	52.03	6.72	3.72	5.37
							对比实施例5	7.72	7.02	37.36	3.44	2.64	3.65
制备实施例5	9.15	8.13	53.69	6.86	3.82	5.24
							对比实施例6	7.63	7.14	35.98	3.41	2.57	3.38
制备实施例6	8.91	8.25	52.97	7.23	3.69	5.27
							对比实施例7	7.71	7.38	36.47	3.08	2.23	3.42
制备实施例7	9.34	8.46	53.08	7.14	3.54	5.37

由上可知，不仅微乳传递体具有很好的血脑屏障开放作用，能提高NGF递送至中枢神经系统效率，而且，令人惊奇的是α-亚麻酸能进一步促进微乳传递体将NGF递送至中枢神经系统的效率，二者具有协同效应。NGF组合物微乳能大幅提高NGF递送至中枢神经系统效率，在脑部神经疾病治疗中有更好的前景。

试验例3NGF组合物微乳经鼻给药对阿尔茨海默氏病的药效学研究

阿尔茨海默病(Alzheimer Disease，AD)是一种起病隐袭、具体原因可能涉及遗传因素、环境因素等多方面的神经系统退行性疾病，以基底前脑胆碱能神经元的退变为主要病理特征之一，其临床表现为进行性的记忆、理解、判断、定向等认知功能障碍，精神行为异常以及生活自理能力减退，是老年痴呆病中最常见的类型。目前，临床上尚无行之有效的治疗手段。

本试验例旨在进行NGF组合物微乳经鼻给药对阿尔茨海默氏病的药效学研究，以普通NGF、普通NGF组合物和NGF微乳为对照。

实验方案：

将阿尔茨海默氏病模型大鼠分为4组，分别为生理盐水组，普通NGF组(比较实施例1所得)，普通NGF组合物(比较实施例2所得)组，NGF微乳(比较实施例3所得)组，NGF组合物微乳(实施例1所得)组。给药量以NGF计均为10μg/100g体重，给药频率1次/日，连续给药7天。

1、水迷宫实验：(1)定位航行实验：将大鼠从四个入水点面向池壁放入水中，记录在2min内寻找平台的时间(逃避潜伏期)。每天上、下午各4次，连续5天。(2)空间探索实验：定位航行实验结束后撤除平台，然后将鼠任选一个入水点放入水中，测其2min内跨原平台所在位置的次数(穿环数)和在原平台所在象限游泳距离占游泳总距离的百分(原平台游泳距离)比。

2、Y迷宫检测：Y型迷宫，选用电压70V，电击延时2秒。训练大鼠学会分辨安全信号而主动逃避电击，训练以连续10次中有9次(90％)正确反应定为学会标准，记录每只大鼠达到学会标准所需的训练次数，训练次数少说明学习能力强。24小时后检测记忆力，以10次训练中的正确反应次数代表记忆保持能力的优劣。

实验结果：

1、水迷宫实验结果：(1)将每组大鼠每次潜伏期都与同组最后一次潜伏期做两两比较：普通NGF组、普通NGF组合物组、NGF微乳组和NGF组合物微乳组前三次潜伏期明显下降，从第四次开始，潜伏期趋于平稳，平稳后的普通NGF组平均潜伏期24秒，普通NGF组合物组23秒，NGF微乳组组20秒，NGF组合物微乳组18秒；而生理盐水组头二次潜伏期明显下降，从第三次开始，潜伏期趋于平稳，平均潜伏期45秒；表明普通NGF、普通NGF组合物、NGF微乳、NGF组合物微乳均能明显改善模型鼠的学习能力，但，以NGF组合物微乳的应用效果最好。(2)撤除平台后，生理盐水组大鼠在原平台象限游泳路线距离占总距离的26.23％，普通NGF组大鼠在原平台象限游泳路线距离占总距离的48.77％，普通NGF组合物组大鼠在原平台象限游泳路线距离占总距离的49.50％，NGF微乳组大鼠在原平台象限游泳路线距离占总距离的50.49％，NGF组合物微乳组大鼠在原平台象限游泳路线距离占总距离的51.53％；生理盐水组在原平台象限跨相应平台大鼠1.7次，普通NGF组大鼠5.5次，普通NGF组合物组大鼠5.7次，NGF微乳组大鼠6.2次，NGF组合物微乳组大鼠6.6次，表明各NGF组，尤其是NGF组合物微乳能够明显改善模型鼠的记忆能力。

2、Y迷宫检测结果见下表：

各组大鼠学习和记忆能力比较

组别	学习成绩	记忆能力
			生理盐水	82.5±6.1	3.6±0.1
普通NGF	65.1±3.9	6.6±0.6
			普通NGF组合物	62.5±3.2	7.0±0.3
NGF微乳	60.4±4.3	7.9±0.2
			NGF组合物微乳	58.7±1.4	8.5±0.4

由上表结果可知：各给药组与生理盐水组相比，均能提高受试动物的学习成绩和记忆能力，且以NGF组合物微乳组效果最优。

综合分析：由水迷宫实验和Y迷宫检测结果可知，普通NGF组合物在提高动物学习、记忆能力方面与普通NGF相比均具有一定的优越性，但二者的有益效果均低于NGF微乳；而将α-亚麻酸与NGF组合应用，并采用微乳传递技术给药，则更进一步提高了其治疗中枢神经系统疾病的效果。因此，本发明NGF组合物微乳与普通NGF、普通NGF组合物和NGF微乳相比具有良好的应用优势。

试验例4NGF组合物微乳对准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)术后角膜神经再生作用的研究

以普通NGF、普通NGF组合物和NGF微乳为对照，进行NGF组合物微乳对准分子激光原位角膜磨镶术(LASIK)术后角膜神经再生作用的研究。

实验方案：选取体检合格的比利时兔施行双侧LASIK手术，右眼为自身对照组，左眼为试验组。将手术成功的兔子随机分成4组，每组8只，共32只。所分4组中受试兔子左眼分别给以普通NGF(比较实施例1所得)、普通NGF组合物(比较实施例2所得)、NGF微乳(比较实施例3所得)、NGF组合物微乳(实施例1所得)，右眼均给生理盐水(NS组)。每组从术后第一天起给药，给药量20μl/次，每日2次，给药时间为6个月。在术前、术后0d、1d、14d、1m、3m、6m测定各组受试比利时兔眼角膜神经数量，角膜神经数量越多说明疗效越好。实验结果见下表：

LASIK术后各时间点角膜神经纤维数量

时间	NS	普通NGF	普通NGF组	NGF微乳	NGF组合物
						0d	42.32±1.0	42.15±2.0	42.28±1.21	42.39±1.21	41.36±1.38

1d	2.36±0.25	2.25±0.27	2.37±0.26	2.39±0.29	2.35±0.31
						14d	3.91±0.53	4.26±0.57	4.42±0.59	4.91±0.61	5.30±0.65
1m	6.81±0.22	7.03±0.61	7.17±0.60	7.41±0.66	8.91±0.65
						3m	13.49±2.0	16.72±1.9	19.22±2.00	26.13±2.05	30.15±2.12
6m	26.52±2.5	30.31±2.7	34.02±2.56	41.06±3.06	45.02±2.31

综合分析：由上表结果可知，1)与NS组相比，各给药组对LASIK术后角膜神经再生均具有积极的促进作用；2)普通NGF组合物组给药6m后，受试眼角膜神经纤维数量(34.02±2.56)高于普通NGF组(30.31±2.72)，表明α-亚麻酸与NGF可产生协同作用，将二者组合应用提高了NGF的治疗效果；3)NGF微乳组给药6m后，受试眼角膜神经纤维数量(41.06±3.06)明显高于普通NGF组合物组(34.02±2.56)和普通NGF组(30.31±2.72)，表明微乳传递体的应用改善了NGF的治疗效果；4)本发明NGF组合物微乳组给药6m后，受试眼角膜神经纤维数量(45.02±2.31)高于NGF微乳组(41.06±3.06)，说明本发明将α-亚麻酸与NGF组合，并采用微乳传递体技术进行递送，进一步提高了NGF对神经损伤修复的疗效。

在上述试验同时，还将制备实施例2～8所得的NGF组合物微乳与比较实施例2～8不含“α-亚麻酸”的对应NGF微乳按照上述相同的试验方案进行比较研究，比较6个月后角膜神经纤维数量，序号1代表比较实施例1与制备实施例1对应的产品的试验结果，以此类推。具体结果如下：

LASIK术后各时间点角膜神经纤维数量

序号

NGF微乳(比较实施例所得)

NGF组合物微乳(本发明)

1	40.06±2.30	45.18±2.28
			2	39.06±2.10	43.02±2.41
3	39.83±2.30	42.57±2.52
			4	40.12±2.14	42.96±2.01
5	39.40±1.66	43.17±1.31
			6	40.02±0.66	43.08±1.31
7	41.05±2.98	43.72±2.34

从上述数据可知，本发明NGF组合物微乳组给药6m后，受试眼角膜神经纤维数量均高于NGF微乳组，说明本发明将α-亚麻酸与NGF组合，并采用微乳传递体技术进行递送，进一步提高了NGF对神经损伤修复的疗效。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (21)

1.一种神经生长因子组合物，其特征在于，所述组合物包括以下活性成分：

神经生长因子     5μg～400μg

α-亚麻酸      0.5mg～300mg

所述各活性成分含量为所述组合物在单位制剂中的含量，所述组合物还包括微乳传递体，所述微乳传递体用于所述组合物的递送，其中，单位制剂中所述微乳传递体具体组成为：

乳化剂    2.9mg～40mg

助乳化剂  1.6mg～50mg；所述乳化剂选自聚氧乙烯氢化蓖麻油、Polyxyl35蓖麻油、吐温-80、吐温-85、苄泽-35、泊洛沙姆-188中的一种或几种；所述助乳化剂选自辛癸酸甘油酯、油酸乙酯、聚乙二醇400、丙二醇、甘油、异丙醇、乙醇中的一种或几种。

2.根据权利要求1所述的神经生长因子组合物，其特征在于，单位制剂中所述微乳传递体具体组成为：

聚氧乙烯氢化蓖麻油  2.9mg

辛癸酸甘油酯        0.9mg

聚乙二醇400         0.7mg。

3.根据权利要求1或2所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述组合物还包括保护剂和缓冲剂。

4.根据权利要求3所述的神经生长因子组合物，其特征在于，单位制剂中所述保护剂的含量为3.0～35mg，所述缓冲剂能稳定所述组合物体系pH在5.5～7.5。

5.根据权利要求3所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述保护剂选自丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、杆菌肽中的一种或几种，所述缓冲剂选自醋酸盐、磷酸盐。

6.根据权利要求1～2和4～5任一所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述组合物还包括生物粘附剂。

7.根据权利要求3所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述组合物还包括生物粘附剂。

8.根据权利要求6所述的神经生长因子组合物，其特征在于，单位制剂中所述生物粘附剂的含量为5～13mg。

9.根据权利要求7所述的神经生长因子组合物，其特征在于，单位制剂中所述生物粘附剂的含量为5～13mg。

10.根据权利要求6所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述生物粘附剂选自壳聚糖、透明质酸钠、β-环糊精及其衍生物、海藻酸盐、聚乙二醇、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种。

11.根据权利要求7所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述生物粘附剂选自壳聚糖、透明质酸钠、β-环糊精及其衍生物、海藻酸盐、聚乙二醇、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮中的一种或几种。

12.根据权利要求1～2、4～5和7～11任一所述的神经生长因子组合物，其特征在于，单位制剂中所述组合物还包括含量为0.146～9mg的抑菌剂。

13.根据权利要求3所述的神经生长因子组合物，其特征在于，单位制剂中所述组合物还包括含量为0.146～9mg的抑菌剂。

14.根据权利要求6所述的神经生长因子组合物，其特征在于，单位制剂中所述组合物还包括含量为0.146～9mg的抑菌剂。

15.根据权利要求12所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述抑菌剂选自苯甲醇、苯酚、苯扎氯铵、苯扎溴铵。

16.根据权利要求13～14任一所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述抑菌剂选自苯甲醇、苯酚、苯扎氯铵、苯扎溴铵。

17.根据权利要求1～2、4～5、7～11和13～15任一所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述组合物为喷雾剂、冻干粉针剂、气雾剂、滴鼻剂、凝胶剂或膜剂。

18.根据权利要求3所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述组合物为喷雾剂、冻干粉针剂、气雾剂、滴鼻剂、凝胶剂或膜剂。

19.根据权利要求6所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述组合物为喷雾剂、冻干粉针剂、气雾剂、滴鼻剂、凝胶剂或膜剂。

20.根据权利要求12所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述组合物为喷雾剂、冻干粉针剂、气雾剂、滴鼻剂、凝胶剂或膜剂。

21.根据权利要求16所述的神经生长因子组合物，其特征在于，所述组合物为喷雾剂、冻干粉针剂、气雾剂、滴鼻剂、凝胶剂或膜剂。