CN116568338A - 改进的aav介导的x连锁视网膜劈裂症治疗 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了改进的重组AAV治疗，其用于治疗X连锁视网膜劈裂症(XLRS)。这些治疗旨在施用于对象，例如人对象，包括诊断出或患有XLRS的人。

Description

改进的AAV介导的X连锁视网膜劈裂症治疗
相关申请
本申请要求于2020年7月29日提交的美国临时申请No.63/058,437的申请日的权益，其全部内容通过引用并入。
政府支持
本发明是在美国国立卫生研究院(NATional Institutes of Health)授予的R01EY024280的政府支持下完成的。政府对本发明享有一定的权利。
背景技术
视网膜劈裂症是遗传病症，其特征在于视网膜分裂成两层。该病症有两种形式。更常见的形式，通常已知为老年性视网膜劈裂症，通常发生在中年或中年以上，并且可影响男性和女性二者。更罕见的形式，X连锁视网膜劈裂症(X-linked retinoschisis，XLRS)在出生时就存在，并且影响男孩和年轻男性。XLRS的主要症状是用眼镜也无法改善的视力受损。虽然一些患有XLRS的人在其一生中可经历进行性视力损失，但其他人在其一生中可具有相对稳定的视力。XLRS是称为黄斑变性的较广泛病症的一种类型，因为其主要影响黄斑。XLRS在美国和欧盟影响了约30,000名男性。没有针对XLRS患者的可用治疗。然而，已报道表面多唑胺和经口乙酰唑胺的使用降低囊性空间和中央凹厚度，同时提高视敏度。
发明内容
本公开内容提供了用于治疗XLRS的改进的rAAV治疗。这些治疗旨在施用于对象，例如人对象，包括被诊断出或患有XLRS的人的眼。所公开的rAAV载体可在向对象施用之后提供改善的视网膜结构和功能。所公开的载体可提供对视网膜劈裂症症状的改善或逆转，例如部分或完全逆转。
所公开的载体包含新的合成人RS1转基因。在一些实施方案中，所公开的载体的人RS1转基因(或异源核酸)缺乏5’和3’非翻译区或UTR。在一些实施方案中，转基因包含相对于野生型序列的突变，该突变不导致任何氨基酸变化(即，沉默突变)。本公开内容还提供了光感受器特异性启动子(例如人视紫红质启动子)和AAV衣壳的用途，该AAV衣壳在视网膜下注射之后显示出增强的侧向扩散并且显示出改善的视网膜转导效率。
因此，本公开内容提供了可包裹到病毒颗粒(例如AAV颗粒)中的核酸载体，其包含由启动子(例如人视紫红质激酶(hGRK1)启动子)可操作地控制的合成人RS1转基因序列。先前已确定，hGRK1启动子介导非人灵长类视网膜中有效的光感受器特异性表达。所公开的核酸载体可包含侧翼是RS1转基因的AAV反向末端重复。所公开的核酸载体可包含侧翼是包含RS1转基因的多核苷酸的AAV反向末端重复。
XLRS是由X染色体上称为RS1的基因的突变引起的，RS1编码称为视网膜劈裂蛋白(retinoschisin)的蛋白质。视网膜劈裂蛋白是由光感受器和双极细胞表达和分泌的结构蛋白，该蛋白与视网膜中许多细胞的表面强且特异性地结合。该蛋白用作黏合剂(adhesive)以保持视网膜的层的结构完整性。在没有正常的视网膜劈裂蛋白的情况下，视网膜的层分裂，细胞间通信中断，并且视网膜细胞以及最终视力损失。XLRS患者通常表现为其视网膜的视网膜电图(ERG)测量中的b波减弱。具有无义突变的患者通常比具有错义突变的患者患更严重的疾病。
视网膜劈裂蛋白(RS1)在视网膜发育期间在整个神经视网膜中表达。在发育并到成年之后，其由光感受器表达。其是分泌蛋白，主要定位于视杆和视锥光感受器的内段(inner segment，IS)，并在较小程度上，定位于外网层。RS1包含允许其形成同八聚体复合物的网柄菌凝素(discoidin)结构域。RS1的确切分子功能仍未解决。RS1已显示出与视网膜特异性Na/K+ATP酶直接相互作用，并被认为用作这些ATP酶活性的调节因子。RS1与L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channel，LTCC)相互作用，并可有助于LTCC在光感受器-双极细胞突触处的功能。
目前正在评价基于基因治疗的方法对于XLRS治疗的治疗潜力。特别地，已报道了在动物模型中评估改造成表达RS1的腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)载体的潜在安全性和有效性的研究。数个研究已利用视网膜劈裂蛋白同源物(RS1h)敲除小鼠作为临床相关模型。在该模型中，可通过光学相干断层成像(optical coherence tomography，OCT)观察到劈裂病变，并且可通过视网膜电描记术观察到视网膜功能的降低。
然而，最近的基因治疗临床试验未能显示出生物活性或治疗效力，由于不良炎性应答而终止。只有当携带RS1的rAAV颗粒在光感受器中成功转导并表达转基因时，XLRS小鼠模型中AAV介导的基因治疗才成功，但当RS1表达限于任何其他视网膜细胞类型(例如米勒细胞(Muller cell)或视网膜神经节细胞)时则不成功。在这些情况下，最迟7月龄的治疗干预能够防止进一步的光感受器变性。因此，仍然需要可用于X连锁视网膜劈裂症的眼部基因治疗治疗的新的AAV载体。
通过使用病毒传递治疗性遗传物质，基因治疗领域已取得了重大进展。由于AAV载体的低免疫原性和对非分裂细胞进行有效转导的能力，作为用于基因治疗的高效病毒载体的腺相关病毒已吸引了相当多的关注。AAV已显示可感染多种细胞和组织类型，并且在过去十年中取得了重大进展，使这种病毒系统适用于人基因治疗。重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virUs，rAAV)载体已成功用于人疾病的多种临床前动物模型的体内基因转移，并已成功用于广泛多种治疗性基因的长期表达。AAV载体当靶向免疫特权位点时(例如，用于莱贝尔先天性黑蒙(Leber’s congenial amaurosis)的眼部递送)，也在人中产生了长期的临床益处。这种载体的一个主要优点是其相对低的免疫谱，仅引起有限的炎症响应，并且在某些情况下，甚至指导对转基因产物的免疫耐受。尽管如此，当靶向非免疫特权器官时，由于针对病毒衣壳的抗体和CD8+T细胞响应，治疗效率在人中被限制，而在动物模型中，也报道了对转基因产物的适应性响应。
AAV已成为将治疗性基因靶向视网膜的首选载体。天然存在的和合成的AAV二者均已被鉴定为显示视网膜嗜性。AAV衣壳血清型44.9有效地转导多种细胞类型，包括唾液腺细胞、肝细胞和不同类型的神经元(例如，皮层细胞、嗅球细胞、脑干细胞和小脑Purkinje细胞)。AAV44.9表现出与AAV9相当的体内生物分布。这种衣壳的脑室内注射已显示出在皮层、嗅球、小脑、脉络丛和脑干中的转导水平与AAV9观察到的那些相似。此外，抗体中和研究表明，与AAV2相比，AAV44.9中和抗体的频率较低。并且AAV44.9的聚糖阵列研究已表明衣壳与末端含葡萄糖分子的结合。
本公开内容的发明人已使用合理的设计方法通过将第531位残基处的谷氨酸诱变为天冬氨酸来设计新变体。这种新的血清型变体AAv44.9(E531D)在视网膜下注射的小鼠和猕猴中进行了评价。已经假设在对应于AAV2衣壳中E530位的位置(例如AAVrh.8和AAV44.9中的531位)处的氨基酸置换会改变转导效率。发现并入AAV44.9(E531D)衣壳变体的rAAV颗粒能够在视网膜下注射之后高效转导视杆、视锥和视网膜色素上皮(“RPE”)。此外，AAV44.9(E531D)表现出增强的侧向扩散，转导视网膜下注射泡(bleb)外侧的光感受器和视网膜色素上皮。AAV44.9(E531D)的增强的效力和侧向扩散使该变体成为靶向视网膜的基因治疗的有前途的载体。
本发明人已将新的AAV44.9(E531D)衣壳以及其他AAV衣壳应用于向对象递送编码视网膜劈裂蛋白的RS1异源核酸的情况下。本公开内容提供了RS1核酸以用于并入到rAAV载体中，所述RS1核酸在去除人RS1的5’和3’非翻译区之后仅包含RS1基因的编码区或cDNA。本公开内容的人RS1转基因还可在编码区中包含一个或更多个(例如，四个)沉默突变，其不导致编码的人视网膜劈裂蛋白序列中的突变。RS1转基因可包含与野生型RS1基因的天然Kozak序列不同的经优化的Kozak基因序列。在一些实施方案中，CpG岛已从编码序列中去除。在一些实施方案中，任何所公开的rAAV载体的RS1转基因已针对人表达进行了密码子优化。
在一些方面中，提供了所公开的rAAV载体的视网膜下施用。当需要在视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)或光感受器(photoreceptor，PR)中转基因表达时，通常使用AAV的视网膜下注射。视网膜下注射产生暂时的大泡性脱离，将光感受器外段与RPE层隔开。通常来说，对象中的视网膜下注射泡会在接下来的数天内消退。视网膜下注射可能对光感受器有一些有害影响，可想象，这样的影响在已经因疾病受损的视网膜中更为严重。特别地，XLRS患者视网膜中劈裂腔的存在表明需要探索视网膜下注射的替代方法，因为这些视网膜更易于脱离。然而，施用到玻璃体中(玻璃体内注射)呈现出其自身的挑战，包括观察到的稀释效应、内界膜(inner limiting membrane，ILM)屏障的存在以及严重的炎症，这是由于与递送至视网膜下空间时相比，通过该途径递送时AAV向外周循环的生物分布提高。因此，本领域仍然需要向XLRS患者的视网膜进行经视网膜下施用基因治疗，同时使不良作用(例如视网膜脱离)最小化。
本公开内容的一些方面涉及包含经修饰的AAV44.9衣壳或AAV5衣壳的rAAV颗粒和载体，其用于在眼中治疗XLRS的症状和病症。在一些具体实施方案中，本公开内容提供了包含AAV44.9(E531D)衣壳的颗粒，该衣壳在视网膜下注射到中央凹之后表现出增强的侧向扩散，其中使中央凹的脱离最小化。因此，在一些实施方案中，本公开内容提供了包含含有VP1、VP2和/或VP3蛋白的衣壳的rAAV颗粒，其中rAAV颗粒还包含含有异源核酸的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容提供了衣壳蛋白，例如VP1、VP2或VP3衣壳蛋白，其分别包含SEQ ID NO：1、2或3中任一者的氨基酸序列。可使用其他AAV载体，例如AAV2载体，例如AAV2(4pMut)ΔHS以及本文所述的其他载体。
因此，在一些方面中，本公开内容提供了用于在哺乳动物对象的一种或更多种光感受器细胞中表达人RS1核酸区段的方法，其中所述方法包括向对象的一只或两只眼经视网膜下或玻璃体内施用本文所述的rAAV颗粒。在一些具体实施方案中，施用是通过视网膜下注射。
在一些方面中，本公开内容提供了包含多核苷酸的重组AAV(rAAV)载体，所述多核苷酸包含编码视网膜劈裂蛋白(例如，人视网膜劈裂蛋白)的异源核酸和一种或更多种另外的元件(例如转录后调节元件)。在一些实施方案中，元件包含剪接供体区。在一些实施方案中，元件包含剪接受体区。在一些实施方案中，元件包含SV40内含子。在一些实施方案中，元件包含多腺苷酸化信号序列。在一些实施方案中，元件包含启动子。非限制性示例性启动子包括视紫红质激酶启动子、视紫红质启动子、IRBP启动子、嵌合人视网膜劈裂蛋白-IRBP增强子(RS/IRPB)、红/绿视锥视蛋白启动子、视锥抑制蛋白启动子、嵌合IRBP增强子-视锥转导蛋白启动子、鸡β肌动蛋白启动子和截短的嵌合鸡β肌动蛋白(smCBA)启动子。在一些实施方案中，元件包含WPRE元件。在一些实施方案中，元件包含一个或更多个反向末端重复序列。在一些实施方案中，元件包含填充序列(stuffer sequence)。在多个实施方案中，所述载体的异源核酸不包含编码人视网膜劈裂蛋白的(野生型)基因(或cDNA)的5’非翻译区(untranslated region，UTR)。人视网膜劈裂蛋白基因的5’非翻译区可包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：39的核酸序列(AGTTCAGTAAGGTAGAGCTTTGGCCGAGGACGAGGGGAAG)。在一些实施方案中，所述异源核酸不包含人视网膜劈裂蛋白的3’非翻译区。人视网膜劈裂蛋白的3’非翻译区可包含以下或由以下组成：SEQ ID NO：40的核酸序列
在一些方面中，rAAV载体包含含有异源核酸的多核苷酸，所述异源核酸包含与SEQID NO：8的核苷酸序列具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少92％同一性、至少92.5％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、98％同一性或99％同一性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含异源核酸，所述异源核酸包含与SEQ ID NO：8具有至少92.5％同一性。在一些具体的实施方案中，多核苷酸包含与SEQ IDNO：8具有至少98％同一性。在一些实施方案中，异源核酸包含与SEQ ID NO：8的核苷酸序列的不同之处在于5、10、15、20、25或超过25个核苷酸的序列。在一些实施方案中，异源核酸包含SEQ ID NO：8的序列。
在一些实施方案中，异源核酸可包含SEQ ID NO：9所示的序列。多核苷酸可包含SEQ ID NO：10的序列。多核苷酸可包含编码myc标签(例如，c-myc标签)的核酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸包含能够在哺乳动物眼的一种或更多种光感受器或视网膜色素上皮细胞中表达异源核酸的启动子。rAAV颗粒可包含含有至少第一多核苷酸的多核苷酸，所述第一多核苷酸包含与编码治疗剂的至少第一异源核酸可操作地连接的PR或RPE细胞特异性启动子，持续有效地在哺乳动物的一个或更多个PR细胞或RPE细胞中产生治疗剂的时间。在一些具体实施方案中，启动子是视紫红质激酶启动子，例如人视紫红质激酶(hGRK1)启动子。
在一些方面中，本公开内容提供了包含本文所述的任何rAAV载体的rAAV颗粒。在一些实施实施方案中，在rAAV颗粒中包裹rAAV载体的衣壳包含AAV44.9衣壳、AAV44.9(E531D)衣壳、AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)衣壳、AAV44.9(Y446F+E531D)衣壳、AAV44.9(T492V+E531D)衣壳、AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)、AAV44.9(Y731F)衣壳、AAV5衣壳或其变体、AAV2(4pMut)ΔHS衣壳或AAV8(Y447F+Y733F+T494V)衣壳。在一些具体实施方案中，rAAV颗粒包含AAV44.9(E531D)衣壳。本公开内容还提供了包含本文公开的任何rAAV颗粒的组合物。本公开内容还提供了包含本文公开的任何rAAV颗粒的细胞(例如哺乳动物细胞)。
在一些方面中，本公开内容提供了转导哺乳动物光感受器细胞或视网膜色素上皮细胞的方法，所述方法包括向哺乳动物的一只或两只眼施用本文公开的任何rAAV颗粒或rAAV颗粒的组合物。还提供了用于治疗或改善哺乳动物(例如人)中的XLRS的方法，所述方法包括向哺乳动物的一只或两只眼以足以在哺乳动物中治疗或改善视网膜劈裂症的一种或更多种症状的量施用本文公开的任何rAAV颗粒或组合物。在一些实施方案中，所公开的方法包括向哺乳动物的一只或两只眼的中央凹进行视网膜下施用。在一些具体实施方案中，在视网膜下施用之后使中央凹的脱离最小化。在一些实施方案中，任何所公开的方法a)保护一个或更多个光感受器细胞，b)恢复层状视网膜结构，c)恢复一种或更多种视杆和/或视锥介导的功能，d)完全或部分恢复一只或两只眼的视觉行为，或e)其任意组合。在一些具体实施方案中，任何所公开的方法均恢复层状视网膜结构和/或降低或消除劈裂病变。
附图说明
以下附图构成本说明书的一部分并被包括在内以表明本公开内容的某些方面。结合附图通过参考以下描述可更好地理解本发明，其中相同的附图标记表示相同的元件，并且其中：
图1示出了AAV44.9-hGRK1-GFP和AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFP在视网膜下注射的猕猴中表现出增强的侧向扩散和效力。载体以1×1012vG/mL递送。给药当天泡的初始边界和所得GFP表达的边界以白色虚线勾勒。相同的脉管系统以加粗的深色线突出显示以供参考。
图2示出了在猕猴中中央凹外(extrafoveal)视网膜下注射AAV44.9-hGRK1-GFP(1×1012vG/mL)之后产生的三个视网膜下注射泡的光学相干断层成像(OCT)扫描(参见左侧的阴性对比眼底图像)，总共90μL的载体体积。OCT允许对视网膜结构(例如劈裂病变)进行纵向的体内评估。
图3示出了中央凹外视网膜下注射AAV44.9-hGRK1-GFP之后猕猴视网膜的OCT图像。SLO图像(左上)中的箭头指示在图的下部中的扫描中显示的视网膜切片的位置。切片针对视锥抑制蛋白和DAPI进行染色。在每个区域中绘制表达GFP的视杆/视锥的百分比。ONL，外核层；INL，内核层；GCL，神经节细胞层。在该图中和整个附图中，针对天然GFP的染色用圆圈表示，针对视锥抑制蛋白的染色用三角形表示，并且针对DAP的染色用方形表示。
图4示出了中央凹外视网膜下注射AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFP之后猕猴视网膜的OCT图像，三个泡总共90μL的载体体积。SLO图像(左上)中的箭头指示图的下部中的扫描中显示的视网膜切片的位置。切片针对视锥抑制蛋白和DAPI进行染色。在每个区域中绘制表达GFP的视杆/视锥的百分比。
图5A至5D示出了在中央凹外视网膜下注射AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFP和AAV44.9-hGRK1-GFP之后猕猴视网膜的中央凹旁(parafoveal)区域的代表性OCT图像。比例尺为A＝40微米，B＝20微米。
图6A和6B示出了这些注射之后猕猴视网膜的中央凹周围(perifoveal)区域的代表性OCT图像。
图7示出了视网膜下注射的示意图。
图8A至8C示出了在Nrl-GFP小鼠中视网膜下注射(subretinal injection，SRI)之后AAV载体的转导谱。(图8A)在以2×1012vg/mL注射之后第4周取得的代表性荧光眼底图像(图8A，顶行)和视网膜横切片(图8A，中间行和底行)中的AAV介导的mCherry表达。在C57BL6J小鼠中视网膜下注射(SRI)之后AAV44.9(E531D)-IRBP/GNAT2-GFP的转导谱。(图8B)注射2×1012vg/mL(递送2×109vg)之后6周，将视网膜横切片用针对视锥抑制蛋白的抗体染色并用DAPI复染。(图8C)*进行了Kruskal-Wallis检验，然后进行了事后Dunn检验以进行组之间的成对比较。对于非视杆(rod)值：H＝44.912，df＝6，P＜0.001。对于视杆值：H＝85.546，df＝6，P＜0.001。比例尺为A、B＝50微米。RPE-视网膜色素上皮，ONL-外核层，INL-内核层，GCL-神经节细胞层。
图9A至9E示出了多个月的自然史视网膜电图测量(ERG)。图9A示出了1个月时的自然史ERG。图9B示出了2个月时的自然史ERG。图9C示出了3个月时的自然史ERG。图9D示出了4个月时的自然史ERG。图9E示出了5个月时的自然史ERG。
图10示出了1至5个月的自然史ERG汇总。
图11示出了RS1 KO小鼠中劈裂病变的定量。视网膜劈裂腔的程度使用BioptigenOCT分析并由Diver软件促进。八(8)个点由3×3网格指定。中心点是不存在腔的视神经(optical nerve，ON)。0.5mm(500μm)段内劈裂腔的存在、丰度和尺寸用于产生评分。扫描和相应评分的实例以及用于因素评分的观察的描述在图12中示出。
图12示出了用于劈裂腔严重程度的分级系统(0至4)，其中0等同于无劈裂腔，并且4是最高的腔计数。
图13示出了视网膜劈裂腔计数的图。腔评分在2至3个月达到峰值并随后随时间改善。
图14示出了与自然史免疫组织化学(IHC)测定相关的OCT测量和劈裂活性评分。将1月龄小鼠视网膜切片用针对RS1的单克隆抗体染色。RS1表达定位于雌性杂合和野生型雄性小鼠中光感受器的内/外段连接处，而在雄性和雌性RS1 KO小鼠中则不存在。
图15A至15F示出了用于本公开内容的示例性载体的六个盒的示意图。示例性载体包括：AAV-hGRK1-hRS1syn，其从第一ITR的5’端到第二ITR的3’端的长度为1723bp(图15A)；AAV-CBA-hRS1syn，其从第一ITR的5’端到第二ITR的3’端的长度为2977bp(图15B)；AAV-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，其从第一ITR的5’端到第二ITR的3’端的长度为2311bp(图15C)；pTR-X001-3p，其从第一ITR的5’端到第二ITR的3’端的长度为4534bp(图15D)；pTR-X001-5p，其从第一ITR的5’端到第二ITR的3’端的长度为4528bp(图15E)；和pTR-X002-3p，其从第一ITR的5’端到第二ITR的3’端的长度为4549bp(图15F)。pTR-GRK1-hRS1syn包装在AAV5和AAV44.9(E531D)中。pTR-CBA-hRS1syn载体质粒(pTR-UF11骨架)包装在AAV5中以用作对照。
图16示出了OCT测量(注射之后1个月)。
图17A示出了中试AAV-RS1研究的数据。测试注射：视网膜劈裂腔评分(注射之后1个月)。在所有经处理的眼中，劈裂腔完全消退。图17B示出了中试AAV-RS1研究的数据。视网膜下AAV-hRS1注射之后1个月示出的ERG。初步结论：hGRK1启动子驱动治疗性RS1表达，并且AAV44.9(E531D)载体构建体是治疗性的。
图18A至18C示出了OCT每月数据。图18A示出了1个月时和2个月时的OCT每月数据。图18B示出了3个月时和4个月时的OCT每月数据。图18C示出了5个月时和6个月时的OCT每月数据。
图19示出了左眼相对于右眼的OCT数据。
图20示出了一个月时的ERG测量。
图21示出了两个月时的ERG。
图22示出了三个月时的ERG。
图23示出了四个月时的ERG。
图24示出了五个月时的ERG。
图25示出了六个月时的ERG。
图26示出了注射的病毒相对于载剂的b波的统计分析。注射之后1个月时的第6组和第7组的ERG。
图27示出了经注射的眼的b波的统计分析。
图28示出了注射AAV44.9(E531D)的眼的b波的统计分析。
图29示出了注射AAV5的眼的b波的统计分析。
图30示出了注射病毒相对于空载剂的暗视a波的统计分析。
图31示出了注射之后4个月的IHC测量。
图32示出了用包含经填充的盒的rAAV44.9(E531D)处理的RS1KO小鼠中视网膜结构的恢复。用载剂或包含以下盒的rAAV44.9(E531D)载体处理的RS1KO小鼠中的劈裂腔评分的定量：X001、X001-3p、X001-5p或X002-3p。除注射之后1个月的X001-5p之外，所有载体在两个时间点均改善了视网膜劈裂症评分。对经处理的眼的标称描述性统计显著性用双因素ANOVA与Tukey事后检验确定。
图33A至33B示出了用包含经填充的盒的rAAV44.9(E531D)处理的RS1KO小鼠中视网膜功能的恢复。在一只眼中视网膜下注射载剂或包含以下盒的rAAV44.9(E531D)之后1个月和2个月测量的RS1KO小鼠的平均最大暗视(左)和明视(右)b波振幅：X001、X001-3p、X001-5p或X002-3p。载体以1×108vg(图33A)或5×108vg(图33B)施用。与未经处理的对照眼相比，用所有载体处理的眼中的视网膜功能得到改善。对每个个体数据集的标称描述性统计显著性用双因素ANOVA和Tukey事后检验确定，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001。
图34A至34B示出了用rAAV44.9(E531D)-X002-3p处理的RS1KO小鼠的视网膜中的RS1表达。来自在一只眼中用仅载剂(顶部)或包含X002-3p盒的rAAV44.9(E531D)处理的RS1KO小鼠的代表性视网膜横切片。载体以1×108vg(图34A)或5×108vg(图34B)给药。对侧未经处理的眼在底行中示出。所有视网膜均用针对RS1的抗体染色(三角形)，并用DAPI复染(方形)。
具体实施方式
本公开内容提供了用于施用rAAV颗粒以用于治疗XLRS的新的rAAV载体、组合物、方法。这些载体旨在用于将包含合成的视网膜劈裂蛋白基因的治疗剂递送至哺乳动物对象，例如人对象。有利地，本文所公开的rAAV颗粒施用的新方法在转导哺乳动物眼的视网膜并且特别是在体内转导光感受器(PR)和视网膜色素上皮(RPE)细胞方面具有改善的效率。具体地，所公开的rAAV载体和组合物能够在载体注射部位之外侧向扩散，这将导致完整以及劈裂(裂)视网膜二者的有效转导，同时利用相对小体积或剂量的AAV载体。因此，所公开的方法可降低由于在劈裂病变附近的手术干预而发生另外损伤的风险，同时确保实现高效的光感受器转导。因此，所公开的方法可提供视网膜劈裂蛋白(RS1)基因向光感受器的安全且有效的递送。本公开内容还提供了包含任何所公开的rAAV载体的细胞，例如宿主细胞。
在一些具体实施方案中，该治疗剂的递送a)保护一个或更多个光感受器(PR)细胞，b)恢复层状视网膜结构，c)恢复一种或更多种视杆和/或视锥介导的功能，d)完全或部分恢复一只或两只眼的视觉行为，或e)其任意组合。在一些实施方案中，在将rAAV颗粒初始施用到哺乳动物的一只或两只眼中之后，治疗剂的产生在一个或更多个光感受器细胞或者一个或更多个RPE细胞中基本上持续至少六个月的时间段。
在一些实施方案中，提供了包含被包裹到rAAV颗粒中的异源核酸的多核苷酸。在一些具体实施方案中，向对象施用异源核酸以提供功能性蛋白质，例如人视网膜劈裂蛋白(RS1)，以完全或部分恢复对象(例如人)的光感受器功能以及恢复层状视网膜结构，即降低劈裂病变。在一些实施方案中，通过向对象(例如，向患有XLRS的人)施用本文所公开的包含异源核酸的rAAV颗粒使对象的靶编码序列的一个或两个等位基因沉默。
在一些方面中，本公开内容提供了包含rAAV颗粒和可药用载体、赋形剂、稀释剂和/或缓冲剂的组合物。在一些方面中，本公开内容提供了转导RPE和光感受器细胞以在对象中调节异源核酸(或转基因)表达的方法，所述方法包括向对象(例如人对象)施用包含如本文所述的rAAV的颗粒和可药用载体、赋形剂、稀释剂、缓冲剂及其任意组合的组合物。在一些方面中，本公开内容提供了在对象中治疗XLRS的方法，所述方法包括向对象的眼施用组合物。
在一些方面中，本公开内容提供了治疗视网膜疾病的组合物和用于制备用于治疗视网膜疾病的药物的组合物。在一些方面中，本公开内容提供了包含如本文所述的rAAV颗粒的组合物，用于通过向哺乳动物的一只或两只眼经视网膜下或玻璃体内施用来治疗。
在一些方面中，相对于提供的标准临床剂量，以降低的剂量施用所公开的rAAV载体。在一个非限制性实例中，施用是视网膜下的(参见图7)。一些研究表明施用高剂量的AAV颗粒引起炎症。在过度炎症和肝病发作之后的少数临床试验中，全身施用高剂量的靶向肝、神经元和/或肌肉的AAV颗粒导致对象死亡。尽管在小鼠模型中对视网膜下递送的AAV-RS1载体进行了强有力的概念验证研究，但第一临床试验利用了玻璃体内(intravitreally，IVT)递送的AAV，因为风险：效益比排除了使用视网膜下注射来治疗XLRS。随着术中光学相干断层成像(OCT)的出现，外科医生可严格控制载体的放置。特别地，可将载体注射到劈裂病变之外的区域。可在注射部位之外侧向扩散的AAV载体将导致完整以及劈裂视网膜区域二者的有效转导。
所公开的rAAV载体利用表现出提高的侧向扩散和高转导效率的衣壳变体，例如AAV44.9(E531D)和其他AAV44.9变体。由AAV44.9(E531D)介导的高效率和侧向扩散允许较小的注射泡体积，从而通过限制脱离区域而进一步降低风险。因此，使用任何所公开的rAAV载体可在对象(例如人对象)中促进实现治疗作用所必需的眼部施用的泡体积和/或剂量的降低。所公开的rAAV载体的施用方法可使得向不包含病变或相对完整的视网膜(例如，XLRS患者的视网膜)的区域进行靶向的视网膜下注射能够实现。这些方法可通过使用术中OCT来指导玻璃体视网膜外科医生放置泡来促进。
因此，所公开的rAAV颗粒可以以小于250μL、小于200μL、小于175μL、小于150μL、小于125μL、小于100μL、小于90μL、小于75μL、小于50μL或小于45μL的注射泡体积来施用。在一些实施方案中，以一剂向对象的视网膜递送0.0001mL至10mL(例如0.0001mL、0.001mL、0.01mL、0.1mL、1mL、10mL)。在一些实施方案中，向视网膜施用5×1010至1×1012个载体基因组(vector genome，vg)/mL的剂量。在本文所提供的实施例的非人灵长类实验中，向灵长类视网膜经视网膜下施用总共90μL(每个30μL的3个单独注射泡)(参见实施例1)。这些体积显著小于AAV基因治疗的标准临床应用中使用的体积。例如，以300μL视网膜下注射递送Luxturna(voretigene neparvovec-rzyl)(一种rAAV-RPE65载体)。因此，在一些实施方案中，任何所公开的载体的单次视网膜下注射可实现治疗作用。在一些实施方案中，不多于3至5次视网膜下注射可实现治疗作用。在一些实施方案中，可施用总体积范围为30μL至300μL或更优选30μL至150μL的所公开的rAAV颗粒或其组合物的视网膜下注射。在一些具体实施方案中，可施用泡体积范围为10μL至10μL的3次视网膜下注射。
合成的RS1序列
在一些实施方案中，本公开内容的任何多核苷酸的异源核酸具有与SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列具有至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的序列。相对于野生型RS1的cDNA，该合成的RS1转基因缺乏5’和3’非翻译区。该序列在本文中称为“hRS1syn”。SEQ ID NO：8的长度为684个核苷酸(nucleotide，nt)。在一些实施方案中，异源核酸与SEQ ID NO：8的核苷酸序列的不同之处在于5、10、15、20、25或超过25个核苷酸。
在多个实施方案中，本公开内容的任何多核苷酸的异源核酸不包含编码人视网膜劈裂蛋白的(野生型)基因(或cDNA)的5’非翻译区(UTR)。在一些实施方案中，异源核酸不包含人视网膜劈裂蛋白基因的3’UTR。在多个实施方案中，异源核酸不包含人视网膜劈裂蛋白基因的3’UTR或5’UTR。在多个实施方案中，异源核酸不包含人视网膜劈裂蛋白基因的3’UTR或5’UTR的截短形式。在一些实施方案中，异源核酸不包含野生型RS1cDNA。在一些实施方案中，异源核酸由RS1编码区组成。
在一些实施方案中，异源核酸包含SEQ ID NO：8、9或10中任一者的核酸序列。
编码合成的人视网膜劈裂蛋白1(RS1)转基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：8)如下所示。起始密码子加下划线；并且终止密码子为粗体。
在包含与查询核酸序列具有至少例如95％“同一性”的核苷酸序列的核酸分子(例如，异源核酸或转基因)的情况下，预期除了主题核酸分子序列可包含最多5个核苷酸改变/查询序列的每100个核苷酸之外，主题核酸分子的核苷酸序列与查询序列相同。换句话说，为了获得具有与参考(查询)序列至少95％同一的核苷酸序列的启动子，在主题序列中可插入、缺失最多5％的核苷酸，或用另外的核苷酸替换最多5％的核苷酸。参考序列的这些改变可发生在参考序列的5’或3’端处或那些位置之间的任意处，单独散布在参考序列中的核苷酸之间或散布在参考序列内的一个或更多个连续组中。
实际上，任何特定的核酸分子是否与例如合成的RS1cDNA的核苷酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性，可使用已知的计算机程序常规地确定。用于确定查询序列(本公开内容的序列)和主题序列之间的最佳整体匹配的优选方法(也称为全局序列比对)可使用由Pearson和Lipman(1988)描述的FASTA程序分析以及基于Brutlag et al.(Comp.App.Biosci.6：237-245(1990))的算法的blastn计算机程序和FASTDB确定。在序列比对中，查询序列和主题序列要么都是核苷酸序列，要么都是氨基酸序列。所述全局序列比对的结果表示为百分比同一性。FASTDB氨基酸比对中使用的优选参数是：矩阵＝PAM 0，k-元组＝2，错配罚分＝1，加入罚分＝20，随机化组长度＝0，截止分数＝1，窗口大小＝序列长度，空位罚分＝5，空位尺寸罚分＝0.05，窗口大小＝500或主题氨基酸序列的长度，以较短者为准。
核苷酸是否匹配/对齐由FASTDB序列比对的结果确定。然后从通过上述FASTDB程序使用指定参数计算的百分比同一性中减去该百分比，以获得最终的百分比同一性评分。该最终百分比同一性评分用于本公开内容的目的。对于相对于查询序列在5’和/或3’端处截短的主题序列，通过计算位于查询序列5’或3’的查询序列的与相应的主题核苷酸不匹配/对齐的核苷酸数量来校正百分比同一性，作为查询序列总碱基的百分比。
在一些实施方案中，包含如本文所述的任何多核苷酸(例如SEQ ID NO：8至10的多核苷酸)的载体可包含紧邻起始密码子序列(即，ATG)5’的Kozak序列。在一些实施方案中，该Kozak序列包含GCCGCCACC(SEQ ID NO：41)的核酸序列。在一些实施方案中，任何所公开的载体的Kozak序列(例如，SEQ ID NO：31至35中所示的那些)包含具有相对于SEQ ID NO：41不同的1、2或3个核苷酸的Kozak序列。在一些实施方案中，这些Kozak序列中的任一者构成核糖体进入位点。
在一些实施方案中，如本文所述的多核苷酸可包含具有相对于SEQ ID NO：7至10和15至17中任一者(例如，SEQ ID NO：8至10、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17)所示的序列不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸的核酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的多核苷酸可包含具有相对于SEQ ID NO：8、9和10中任一者的序列不同的1至10(例如，5或9)个核苷酸的核酸序列。这些差异相对于SEQ ID NO：7至10和15至17中任一者的序列可包括已插入、缺失或替换的核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸相对于SEQ ID NO：7至10和15至17中任一者包含5’或3’端处的截短。在一些实施方案中，所公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO：7至10和15至17中任一者的序列共有的约50、约75、约100、约125、约150、约175或约180个核苷酸的区段。在一些实施方案中，所公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO：16和17中任一者的序列共有的约50、约75、约100、约125、约150、约175、约180、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000个或超过约1000个核苷酸的区段。
在一些实施方案中，所公开的多核苷酸在不存在CpG岛的序列区域中包含与SEQID NO：8至10、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17中任一者共有的约50、75或更多个核苷酸的区段。本公开内容的多核苷酸可包含不导致编码的RS1蛋白序列中的突变的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或超过12个沉默突变。在一些实施方案中，所公开的多核苷酸相对于野生型RS1序列可包含30至40个沉默突变。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：8至10、SEQ IDNO：16和SEQ ID NO：17的任何序列在同一性上变化最多30％(即，具有至少70％的同一性)的异源核酸编码与野生型RS1蛋白具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽。在一些实施方案中，相对于SEQ ID NO：8至10、SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：17的任何序列在同一性上变化最多30％的异源核酸编码与SEQ ID NO：12至14的任何序列具有至少90％氨基酸序列同一性的多肽。
在一些实施方案中，本公开内容的任何rAAV载体的异源核酸具有与SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的序列。异源核酸可包含SEQ ID NO：9。编码已针对人表达进行密码子优化并且其中CpG岛已被消除的合成人视网膜劈裂蛋白1(RS1)转基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：9)如下所示。起始密码子加下划线；并且终止密码子为粗体。
CpG岛是在5’→3’方向上包含大量胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸重复的基因组的区域。在哺乳动物基因组中，CpG岛通常延伸300至3000个碱基对。CpG二核苷酸中的胞嘧啶可并且通常通过细胞表观遗传机制被甲基化以形成5-甲基胞嘧啶。这些胞嘧啶的甲基化降低了出现这些岛的任何基因(例如，RS1基因)的编码区的表达。在一些实施方案中，任何所公开的多核苷酸包含中断三十六个CpG二核苷酸实例的突变(例如，沉默突变)。
在一些实施方案中，rAAV载体的多核苷酸包含myc标记的多核苷酸。在一些实施方案中，本公开内容的任何rAAV核酸载体的异源核酸具有与SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列具有至少80％同一性、至少75％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的序列。异源核酸可包含SEQ ID NO：10。编码合成myc标记的人视网膜劈裂蛋白1(RS1)转基因的核苷酸序列(SEQ ID NO：10)如下所示。起始密码子加下划 线；并且终止密码子为粗体。
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在多个实施方案中，包含异源核酸的rAAV载体编码人视网膜劈裂蛋白1(RS1)蛋白或其变体。由SEQ ID NO：8至10的每个核苷酸序列分别编码的RS1蛋白变体的氨基酸序列在以下示出为SEQ ID NO：12至14。在一些实施方案中，编码的RS1蛋白是由SEQ ID NO：12的氨基酸序列限定的人视网膜劈裂蛋白。在一些实施方案中，编码的RS1蛋白可包含具有相对于SEQ ID NO：12至14中任一者的序列不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸的序列。在一些实施方案中，编码的RS1蛋白可包含具有相对于SEQ ID NO：12不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸的序列。这些差异可包括相对于SEQ ID NO：12至14中任一者的序列已插入、缺失或替换的氨基酸。在一些实施方案中，所公开的rAAV载体编码具有与SEQ ID NO：12至14的任何氨基酸序列具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少92.5％同一性、至少95％同一性、至少98％、至少99％同一性或100％同一性的氨基酸序列的蛋白质。
人合成RS1
CpG岛经消除的人合成RS1
人合成myc标记的RS1；C-myc标签加下划线
在一些实施方案中，包含异源核酸(例如，RS1)的核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为1700个核苷酸(nt或碱基对(base pair，(bp))至约5000、约4550、约4549、约4535、约4534、约4528、约4525、约4500、约3200、约3000、约2977、约2900、约2800、约2311、约2300、约1725、约1723个，或约1700个核苷酸。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约1700至约1800(例如，约1723)个核苷酸(例如，图15A)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2900至约3100(例如，约2977)个核苷酸(例如，图15B)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2200至约2400(例如，约2311)个核苷酸(例如，图15C)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4534)个核苷酸(例如，图15D)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4528)个核苷酸(例如，图15E)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4700(例如，约4549)个核苷酸(例如，图15F)。在一些实施方案中，包含异源核酸的核酸载体包含与SEQ ID NO：16至17和31至35中任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，包含异源核酸的核酸载体包含SEQ ID NO：16至17和31至35中任一者的序列。
在一些实施方案中，如本文所述的多核苷酸可包含具有相对于SEQ ID NO：31至35中任一者所示的序列不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个核苷酸的核酸序列。这些差异可包括相对于SEQ ID NO：31至35中任一者的序列已插入、缺失或替换的核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸包含相对于SEQ ID NO：31至35中任一者的5’或3’端处的截短。在一些实施方案中，所公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO：31至35中任一者的序列共有的约50、约75、约100、约125、约150、约175个或约180个核苷酸的区段。在一些实施方案中，所公开的多核苷酸包含与SEQ ID NO：31至35中任一者的序列共有的约50、约75、约100、约125、约150、约175、约180、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000或超过约1000个核苷酸的区段。
剪接供体、剪接受体区和内含子
在一些实施方案中，核酸载体包含内含子。在一些实施方案中，核酸载体包含独立于内含子的剪接供体和剪接受体区。
在一些实施方案中，核酸载体包含SV40内含子。在一些实施方案中，SV40内含子包含SV40剪接供体区。在一些实施方案中，SV40内含子包含SV40剪接受体区。在一些实施方案中，SV40内含子包含SV40剪接供体和剪接受体区(SV40SD/SA)(例如，参见图15A至15B和15D至15F)。
SV40内含子的长度为99个核苷酸。Ostedgaard et al.首次报道AAV表达盒中启动子和转基因之间SV40内含子的存在使肺癌细胞中转基因表达(同时在CMV启动子和增强子的控制下)为两倍高(PNAS 2005；102(8)：2952-2957)。最近，表明将SV40内含子定位在非病毒载体中的表达盒下游导致报道转基因的最高水平表达(在中国仓鼠卵巢细胞中)。参见Xuet al.，J.Cell.Mol.Med.Vol 22，No 4(2018)：2231-2239。在所公开的rAAV载体的一些实施方案中，SV40内含子位于异源核酸的下游(3’)。在一些实施方案中，SV40内含子位于异源核酸的上游(5’)。
在一些实施方案中，SV40内含子包含与SEQ ID NO：20具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，SV40内含子包含与SEQ ID NO：20具有至少90％或95％同一性的序列。在一些实施方案中，SV40内含子包含SEQ ID NO：20：
在一些实施方案中，SV40内含子包含与SEQ ID NO：20的序列共有的约50、约75、约80、约85、约95或约99个核苷酸的区段。
在一些实施方案中，核酸载体包含小鼠微小病毒(minute virus of mice，MVM)内含子。例如，MVM内含子具有序列
或者与SEQ ID NO：21约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列。
在一些实施方案中，核酸载体包含外显子1剪接位点。在一些实施方案中，核酸载体包含内含子1剪接位点。
在一些实施方案中，包含异源核酸和内含子、剪接受体位点和/或剪接供体位点(例如，SV40内含子)的核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为1700个核苷酸(nt或碱基对(bp))至约5000、约4550、约4549、约4535、约4534、约4528、约4525、约4500、约3200、约3000、约2977、约2900、约2800、约2311、约2300、约1725、约1723个，或约1700个核苷酸。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约1700至约1800(例如，约1723)个核苷酸(例如，图15A)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2900至约3100(例如，约2977)个核苷酸(例如，图15B)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2200至约2400(例如，约2311)个核苷酸(例如，图15C)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4534)个核苷酸(例如，图15D)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4528)个核苷酸(例如，图15E)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4700(例如，约4549)个核苷酸(例如，图15F)。在一些实施方案中，包含异源核酸和内含子、剪接受体位点和/或剪接供体位点(例如，SV40内含子)的核酸载体包含与SEQ ID NO：16至17和31至35中任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，包含异源核酸和内含子、剪接受体位点和/或剪接供体位点(例如，SV40内含子)的核酸载体包含SEQ ID NO：16至17和31至35中任一者的序列。
启动子
在一些实施方案中，rAAV颗粒内的多核苷酸包含对待引入rAAV颗粒的宿主类型(例如，细菌、真菌、植物或动物)具有特异性的调节序列，例如转录起始密码子和终止密码子以及翻译起始密码子和终止密码子。优选地，rAAV颗粒内的核酸分子包含对宿主的属具有特异性的调节序列。最优选地，该分子包含对宿主的种具有特异性的调节序列。rAAV颗粒内的多核苷酸可包含在宿主细胞中提供一种或更多种异源核酸表达的表达控制序列，例如启动子、增强子、多腺苷酸化信号、转录终止子、内部核糖体进入位点(intemal ribosomeentry site，IRES)等。示例性表达控制序列是本领域已知的。在一些实施方案中，异源核酸与指导该异源核酸在光感受器细胞或视网膜色素上皮细胞中表达的一个或更多个调节序列可操作地连接。
在一些实施方案中，任何所公开的rAAV载体的多核苷酸包含能够在哺乳动物眼的一种或更多种光感受器或视网膜色素上皮细胞中表达核酸序列的启动子。在一些具体实施方案中，本公开内容提供了与编码治疗剂的至少一种第一异源核酸序列可操作地连接的PR或RPE细胞特异性启动子。示例性PR或RPE细胞特异性启动子可包含a)光感受器特异性启动子(在视杆和视锥细胞中具有活性)，例如，IRBP启动子(hIRPB、IRBP、IRBP241)、视紫红质激酶启动子(hGRK1、GRK1、GRK、RK)和/或嵌合人视网膜劈裂蛋白IRBP增强子(RS/IRPB)；视锥形特异性启动子，例如，红/绿视锥视蛋白启动子(其可包含2.1kb(PR2.1)形式或1.7kb(PR1.7)形式，参见美国专利公开No.2018/0112231，通过引用并入本文)、视锥抑制蛋白启动子(hCAR、CAR)、嵌合IRBP增强子-视锥转导蛋白启动子(IRBP/GNAT2、IRBPe-GNAT2)；视杆特异性启动子，例如人视紫红质启动子(RHO、RHOP等)、人NRL启动子(NRL)；或RPE特异性启动子，例如RPE65或Bestrophin/VMD2(BEST1、BEST、VMD2)。在一些实施方案中，启动子是光感受器特异性启动子，例如IRBP启动子(hIRPB，IRBP，IRBP241)。在一些实施方案中，启动子是视杆特异性启动子，例如人视紫红质启动子(RHO，RHOP)。
在一些示例性实施方案中，多核苷酸包含hGRK1启动子。在一些实施方案中，多核苷酸包含CBA启动子。在一些实施方案中，多核苷酸包含截短的嵌合CBA-CMV启动子(smCBA)启动子，其包含CMV增强子和截短的CBA启动子。
包含hGRK1启动子的本公开内容的示例性载体包括AAV-CBA-hRS1syn(图15A)、AAV-hGRK1-hRS1syn-WPREsf(图15C)、pTR-X001-3p(图15D)、pTR-X001-5p(图15E)和pTR-X002-3p(图15F)。包含smCBA启动子的本公开内容的示例性载体是AAV-CBA-hRS1syn(图15B)。
在一些实施方案中，任何所公开的rAAV载体的启动子包含与以下SEQ ID NO：7中所示的hGRK1启动子的序列具有至少95％、至少98％、至少99％或100％同一性的核苷酸序列：
在一些实施方案中，本公开内容提供了与至少第一多核苷酸可操作地连接的组成型启动子，其可包含视紫红质、syn1(突触蛋白)、CMV、CBA、CB、smCBA、CBh或EF1-α启动子。
在一些实施方案中，包含异源核酸和启动子的核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为1700个核苷酸(nt或碱基对(bp))至约5000、约4550、约4549、约4535、约4534、约4528、约4525、约4500、约3200、约3000、约2977、约2900、约2800、约2311、约2300、约1725、约1723个，或约1700个核苷酸。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约1700至约1800(例如，约1723)个核苷酸(例如，图15A)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2900至约3100(例如，约2977)个核苷酸(例如，图15B)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2200至约2400(例如，约2311)个核苷酸(例如，图15C)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4534)个核苷酸(例如，图15D)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4528)个核苷酸(例如，图15E)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4700(例如，约4549)个核苷酸(例如，图15F)。在一些实施方案中，包含异源核酸和启动子的核酸载体包含与SEQ ID NO：16至17和31至35中任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，包含异源核酸和启动子的核酸载体包含SEQ ID NO：16至17和31至35中任一者的序列。
转录后调节元件
在一些实施方案中，核酸载体包含转录后调节序列。在一些实施方案中，核酸载体包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(woodchuck hepatitis virus post-transcriptionregulatory element，WPRE)。多核苷酸可包含WPRE元件，例如包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列的WPRE元件。在一些实施方案中，WPRE元件位于异源核酸的3’。在一些实施方案中，WPRE元件位于异源核酸的5’。
在一些实施方案中，核酸载体包含WPRE。在一些情况下，WPRE是WPREsf序列，其中“sf’后缀表示施用安全。在一些实施方案中，任何所公开的rAAV载体的多核苷酸包含与SEQID NO：15的核苷酸序列具有至少95％、98％或99％同一性的WPRE元件。在一些实施方案中，多核苷酸包含SEQ ID NO：15的序列。
WPREsf
在一些实施方案中，包含异源核酸和转录后调节元件的核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为1700个核苷酸(nt或碱基对(bp))至约5000、约4550、约4549、约4535、约4534、约4528、约4525、约4500、约3200、约3000、约2977、约2900、约2800、约2311、约2300、约1725、约1723个，或约1700个核苷酸。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约1700至约1800(例如，约1723)个核苷酸(例如，图15A)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2900至约3100(例如，约2977)个核苷酸(例如，图15B)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2200至约2400(例如，约2311)个核苷酸(例如，图15C)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4534)个核苷酸(例如，图15D)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4528)个核苷酸(例如，图15E)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4700(例如，约4549)个核苷酸(例如，图15F)。在一些实施方案中，包含异源核酸和转录后调节元件的核酸载体包含与SEQ ID NO：16至17和31至35中任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，包含异源核酸和转录后调节元件的核酸载体包含SEQ ID NO：16至17和31至35中任一者的序列。
多腺苷酸化(Polyadenylation，polyA)信号序列
在一些实施方案中，核酸载体包含多腺苷酸化(polyA)信号序列。在一些实施方案中，多腺苷酸化信号选自牛生长因子激素(bovine growth factor hormone，bGH)多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号、人生长因子激素(human growth factor hormone，hGH)多腺苷酸化信号和兔β珠蛋白(rabbit beta-globin，rbGlob)多腺苷酸化信号。
在一些实施方案中，载体包含bGH polyA信号。在一些实施方案中，载体包含SV40polyA信号。
在一些实施方案中，载体包含与SEQ ID NO：19具有至少80％、85％、90％、92.5％、95％、98％或99％同一性的核酸序列的bGH polyA信号。在一些实施方案中，任何所公开的载体的polyA信号包含SEQ ID NO：19的核酸序列。
bGH polyA信号：
在一些实施方案中，包含异源核酸和polyA信号的核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为1700个核苷酸(nt或碱基对(bp))至约5000、约4550、约4549、约4535、约4534、约4528、约4525、约4500、约3200、约3000、约2977、约2900、约2800、约2311、约2300、约1725、约1723个，或约1700个核苷酸。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约1700至约1800(例如，约1723)个核苷酸(例如，图15A)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2900至约3100(例如，约2977)个核苷酸(例如，图15B)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2200至约2400(例如，约2311)个核苷酸(例如，图15C)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4534)个核苷酸(例如，图15D)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4528)个核苷酸(例如，图15E)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4700(例如，约4549)个核苷酸(例如，图15F)。在一些实施方案中，包含异源核酸和polyA信号的核酸载体包含与SEQ ID NO：16至17、31至35中任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，包含异源核酸和polyA信号的核酸载体包含SEQ ID NO：16至17、31至35中任一者的序列。
末端重复
在一些实施方案中，核酸载体包含一个或更多个末端重复。在一些实施方案中，核酸载体包含第一反向末端重复(inverted terminal repeat，ITR)和第二反向末端重复(ITR)。在一些实施方案中，反向末端重复包含与SEQ ID NO：22或23具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，反向末端重复包含SEQ ID NO：22或23。在一些实施方案中，反向末端重复包含与SEQ ID NO：24或25具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，反向末端重复包含SEQ ID NO：24或25。
反向末端重复(例如，第一ITR)
反向末端重复(例如，第一ITR)
反向末端重复(例如，第二ITR)
反向末端重复(例如，第二ITR)
在一些实施方案中，包含异源核酸和末端重复的核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为1700个核苷酸(nt或碱基对(bp))至约5000、约4550、约4549、约4535、约4534、约4528、约4525、约4500、约3200、约3000、约2977、约2900、约2800、约2311、约2300、约1725、约1723个，或约1700个核苷酸。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约1700至约1800(例如，约1723)个核苷酸(例如，图15A)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2900至约3100(例如，约2977)个核苷酸(例如，图15B)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约2200至约2400(例如，约2311)个核苷酸(例如，图15C)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4534)个核苷酸(例如，图15D)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4600(例如，约4528)个核苷酸(例如，图15E)。在一些实施方案中，核酸载体从第一ITR的5’开始至第二ITR的3’端的长度为约4400至约4700(例如，约4549)个核苷酸(例如，图15F)。在一些实施方案中，包含异源核酸和末端重复的核酸载体包含与SEQ ID NO：16、17和31至35中任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，包含异源核酸和末端重复的核酸载体包含SEQ ID NO：16、17和31至35中任一者的序列。
填充序列
在一些实施方案中，本公开内容的rAAV载体包含一个或更多个填充序列。在一些实施方案中，“填充”序列是指增加rAAV载体长度的通用惰性非编码序列。在一些实施方案中，填充序列增加任何所公开的rAAV载体的长度，使得盒接近wtAAV基因组大小(例如，从ITR到ITR约4.8kb)。
在一些实施方案中，核酸填充序列的长度为约100至约5000个核碱基。在一些实施方案中，核酸填充序列的长度为约100至约5000、约100至约4000、约100至约3000或约100至约2000个核碱基。在一些实施方案中，核酸填充序列的长度为约100至约5000、约500至约5000、约1000至约5000、约2000至约5000或约3000至约5000个核碱基。在一些实施方案中，核酸填充序列的长度为约1000至约5000、约1050至约4500或约2000至约3000个核碱基。在一些实施方案中，核酸填充序列的长度为约2822个核碱基。在一些实施方案中，核酸填充序列的长度为约2820个核碱基。在一些实施方案中，核酸填充序列的长度为约2249个核碱基。在一些实施方案中，核酸填充序列的长度为约2235个核碱基。在一些实施方案中，核酸填充序列的长度为约2219个核碱基。
在一些实施方案中，包含核酸填充序列的盒(从第一ITR的开端至第二ITR的末端)的长度为约2000至约5000个核碱基。在一些实施方案中，包含核酸填充序列的盒的长度为约3000至约5000、约3500至约5000、约4000至约5000、约4100至约5000、约4200至约5000、约4300至约5000、约4400至约5000、约4500至约5000、约4000至约4900、约4100至约4900、约4200至约4900、约4300至约4900、约4400至约4900、约4000至约4800、约4100至约4800、约4200至约4800、约4300至约4800、约4400至约4800、约4000至约4700、约4100至约5000、约4200至约4700、约4300至约4700、约4400至约4700、约4000至约4600、约4100至约4600、约4200至约4600、约4300至约4600、约4400至约4600、约4000至约4500、约4100至约4500、约4200至约4500、约4300至约4500、或约4400至约4500个核碱基。在一些实施方案中、包含核酸填充序列的盒的长度为约4500、4510、4520、4530、4540、4550、4560、4570、4580、4590或5000个核碱基。在一些实施方案中，包含核酸填充序列的盒的长度为约4534个核碱基。在一些实施方案中，包含核酸填充序列的盒的长度为约4528个核碱基。在一些实施方案中，包含核酸填充序列的盒的长度为约4549个核碱基。
在一些实施方案中，核酸填充序列包含与SEQ ID NO：26至30中任一者具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，核酸填充序列包含与SEQ ID NO：26至30中任一者具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，核酸填充序列包含与SEQ ID NO：26至30中任一者具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
在一些实施方案中，核酸填充序列包含与SEQ ID NO：26至30中任一者的以下位的碱基具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列：第1-100，2-101，3-102，4-103，5-104，6-105，7-106，8-107，9-108，10-109，11-110，12-111，13-112，14-113，15-114，16-115，17-116，18-117，19-118，20-119，21-120，22-121，23-122，24-123，25-124，26-125，27-126，28-127，29-128，30-129，31-130，32-131，33-132，34-133，35-134，36-135，37-136，38-137，39-138，40-139，41-140，42-141，43-142，44-143，45-144，46-145，47-146，48-147，49-148，50-149，51-150，52-151，53-152，54-153，55-154，56-155，57-156，58-157，59-158，60-159，61-160，62-161，63-162，64-163，65-164，66-165，67-166，68-167，69-168，70-169，71-170，72-171，73-172，74-173，75-174，76-175，77-176，78-177，79-178，80-179，81-180，82-181，83-182，84-183，85-184，86-185，87-186，88-187，89-188，90-189，91-190，92-191，93-192，94-193，95-194，96-195，97-196，98-197，99-198，100-199，101-200，102-201，103-202，104-203，105-204，106-205，107-206，108-207，109-208，110-209，111-210，112-211，113-212，114-213，115-214，116-215，117-216，118-217，119-218，120-219，121-220，122-221，123-222，124-223，125-224，126-225，127-226，128-227，129-228，130-229，131-230，132-231，133-232，134-233，135-234，136-235，137-236，138-237，139-238，140-239，141-240，142-241，143-242，144-243，145-244，146-245，147-246，148-247，149-248，150-249，151-250，152-251，153-252，154-253，155-254，156-255，157-256，158-257，159-258，160-259，161-260，162-261，163-262，164-263，165-264，166-265，167-266，168-267，169-268，170-269，171-270，172-271，173-272，174-273，175-274，176-275，177-276，178-277，179-278，180-279，181-280，182-281，183-282，184-283，185-284，186-285187-286，188-287，189-288，190-289，191-290，192-291，193-292，194-293，195-294，196-295，197-296，198-297，199-298，200-299，201-300，202-301，203-302，204-303，205-304，206-305，207-306，208-307，209-308，210-309，211-310，212-311，213-312，214-313，215-314，216-315，217-316，218-317，219-318，220-319，221-320，222-321，223-322，2224-323，225-324，226-325，227-326，228-327，229-328，230-329，231-330，232-331，233-332，234-333，235-334，236-335，237-336238-337，239-338，240-339，241-340，242-341，243-342，244-343，245-344，246-345，247-346，248-347，249-348，250-349，251-350，252-351，253-352，254-353，255-354，256-355，257-356，258-357，259-358，260-359，261-360，262-361，263-362，264-363，265-364，266-365，267-366，268-367，269-368，270-369，271-370，272-371，273-372，274-373，275-374，276-375，277-376，278-377，279-378，280-379，281-380，282-381，283-382，284-383，285-384，286-385，287-386，288-387，289-388，290-389，291-390，292-391，293-392，294-393，295-394，296-395，297-396，298-397，299-398，300-399，301-400，302-401，303-402，304-403，305-404，306-405，307-406，308-407，309-408，310-409，311-410，312-411，313-412，314-413，315-414，316-415，317-416，318-417，319-418，320-419，321-420，322-421，323-422，324-423，325-424，326-425，327-426，328-427，329-428，330-429，331-430，332-431，333-432，334-433，335-434，336-435，337-436，338-437，339-438，340-439，341-440，342-441，343-442，344-443，345-444，346-445，347-446，348-447，349-448，350-449，351-450，352-451，353-452，354-453，355-454，356-455，357-456，358-457，359-458，360-459，361-460，362-461，363-462，364-463，365-464，366-465，367-466，368-467，369-468，370-469，371-470，372-471，373-472，374-473，375-474，376-475，377-476，378-477，379-478，380-479，381-480，382-481，383-482，384-483，385-484，386-485，387-486，388-487，389-488，390-489，391-490，392-491，393-492，394-493，395-494，396-495，397-496，398-497，399-498，400-499，401-500，402-501，403-502，404-503，405-504，406-505，407-506，408-507，409-508，410-509，411-510，412-511，413-512，414-513，415-514，416-515，417-516，418-517，419-518，420-519，421-520，422-521，423-522，424-523，425-524，426-525，427-526，428-527，429-528，430-529，431-530，432-531，433-532，434-533，435-534，436-535，437-536，438-537，439-538，440-539，441-540，442-541，443-542，444-543，445-544，446-545，447-546，448-547，449-548，450-549，451-550，452-551，453-552，454-553，455-554，456-555，457-556，458-557，459-558，460-559，461-560，462-561，463-562，464-563，465-564，466-565，467-566，468-567，469-568，470-569，471-570，472-571，473-572，474-573，475-574，476-575，477-576，478-577，479-578，480-579，481-580，482-581，483-582，484-583，485-584，486-585，487-586，488-587，489-588，490-589491-590，492-591，493-592，494-593，495-594，496-595，497-596，498-597，499-598，500-599，501-600，502-601，503-602，504-603，505-604，506-605，507-606，508-607，509-608510-609，511-610，512-611，513-612，514-613，515-614，516-615，517-616，518-617，519-618，520-619，521-620，522-621，523-622，524-623，525-624，526-625，527-626，528-627，529-628，530-629，531-630，532-631，533-632，534-633，535-634，536-635，537-636，538-637，539-638，540-639，541-640，542-641，543-642，544-643，545-644，546-645，547-646，548-647，549-648，550-649，551-650，552-651，553-652，554-653，555-654，556-655，557-656，558-657，559-658，560-659，561-660，562-661，563-662，564-663，565-664，566-665，567-666，568-667，569-668，570-669，571-670，572-671，573-672，574-673，575-674，576-675，577-676，578-677，579-678，580-679，581-680，582-681，583-682，584-683，585-684，586-685，587-686，588-687，589-688，590-689，591-690，592-691，593-692，594-693，595-694，596-695，597-696，598-697，599-698，600-699，601-700，602-701，603-702，604-703，605-704，606-705，607-706，608-707，609-708，610-709，611-710，612-711，613-712，614-713，615-714，616-715，617-716，618-717，619-718，620-719，621-720，622-721，623-722，624-723，625-72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0-1790，1691-1791，1692-1792，1693-1793，1694-1794，1695-1795，1696-1796，1697-1797，1698-1798，1699-1799，1700-1800，1701-1801，1702-1802，1703-1803，1704-1804，1705-1805，1706-1806，1707-1807，1708-1808，1709-1809，1710-1810，1711-1811，1712-1812，1713-1813，1714-1814，1715-1815，1716-1816，1717-1817，1718-1818，1719-1819，1720-1820，1721-1821，1722-1822，1723-1823，1724-1824，1725-1825，1726-1826，1727-1827，1728-1828，1729-1829，1730-1830，1731-1831，1732-1832，1733-1833，1734-1834，1735-1835，1736-1836，1737-1837，1738-1838，1739-1839，1740-1840，1741-1841，1742-1842，1743-1843，1744-1844，1745-1845，1746-1846，1747-1847，1748-1848，1749-1849，1750-1850，1751-1851，1752-1852，1753-1853，1754-1854，1755-1855，1756-1856，1757-1857，1758-1858，1759-1859，1760-1860，1761-1861，1762-1862，1763-1863，1764-1864，1765-1865，1766-1866，1767-1867，1768-1868，1769-1869，1770-1870，1771-1871，1772-1872，1773-1873，1774-1874，1775-1875，1776-1876，1777-1877，1778-1878，1779-1879，1780-1880，1781-1881，1782-1882，1783-1883，1784-1884，1785-1885，1786-1886，1787-1887，1788-1888，1789-1889，1790-1890，1791-1891，1792-1892，1793-1893，1794-1894，1795-1895，1796-1896，1797-1897，1798-1898，1799-1899，1800-1900，1801-1901，1802-1902，1803-1903，1804-1904，1805-1905，1806-1906，1807-1907，1808-1908，1809-1909，1810-1910，1811-1911，1812-1912，1813-1913，1814-1914，1815-1915，1816-1916，1817-1917，1818-1918，1819-1919，1820-1920，1821-1921，1822-1922，1823-1923，1824-1924，1825-1925，1826-1926，1827-1927，1828-1928，1829-1929，1830-1930，1831-1931，1832-1932，1833-1933，1834-1934，1835-1935，1836-1936，1837-1937，1838-1938，1839-1939，1840-1940，1841-1941，1842-1942，1843-1943，1844-1944，1845-1945，1846-1946，1847-1947，1848-1948，1849-1949，1850-1950，1851-1951，1852-1952，1853-1953，1854-1954，1855-1955，1856-1956，1857-1957，1858-1958，1859-1959，1860-1960，1861-1961，1862-1962，1863-1963，1864-1964，1865-1965，1866-1966，1867-1967，1868-1968，1869-1969，1870-1970，1871-1971，1872-1972，1873-1973，1874-1974，1875-1975，1876-1976，1877-1977，1878-1978，1879-1979，1880-1980，1881-1981，1882-1982，1883-1983，1884-1984，1885-1985，1886-1986，1887-1987，1888-1988，1889-1989，1890-1990，1891-1991，1892-1992，1893-1993，1894-1994，1895-1995，1896-1996，1897-1997，1898-1998，1899-1999，1900-2000，1901-2001，1902-2002，1903-2003，1904-2004，1905-2005，1906-2006，1907-2007，1908-2008，1909-2009，1910-2010，1911-2011，1912-2012，1913-2013，1914-2014，1915-2015，1916-2016，1917-2017，1918-2018，1919-2019，1920-2020，1921-2021，1922-2022，1923-2023，1924-2024，1925-2025，1926-2026，1927-2027，1928-2028，1929-2029，1930-2030，1931-2031，1932-2032，1933-2033，1934-2034，1935-2035，1936-2036，1937-2037，1938-2038，1939-2039，1940-2040，1941-2041，1942-2042，1943-2043，1944-2044，1945-2045，1946-2046，1947-2047，1948-2048，1949-2049，1950-2050，1951-2051，1952-2052，1953-2053，1954-2054，1955-2055，1956-2056，1957-2057，1958-2058，1959-2059，1960-2060，1961-2061，1962-2062，1963-2063，1964-2064，1965-2065，1966-2066，1967-2067，1968-2068，1969-2069，1970-2070，1971-2071，1972-2072，1973-2073，1974-2074，1975-2075，1976-2076，1977-2077，1978-2078，1979-2079，1980-2080，1981-2081，1982-2082，1983-2083，1984-2084，1985-20851986-2086，1987-2087，1988-2088，1989-2089，1990-2090，1991-2091，1992-2092，1993-2093，1994-2094，1995-2095，19962096，1997-2097，1998-2098，1999-2099，2000-2100，2001-2101，2002-2102，2003-2103，2004-2104，2005-2105，2006-2106，2007-2107，2008-2108，2009-2109，2010-2110，2011-2111，2012-2112，2013-2113，2014-2114，2015-2115，2016-2116，2017-2117，2018-2118，2019-2119，2020-2120，2021-2121，2022-2122，2023-2123，2024-2124，2025-2125，2026-2126，2027-2127，2028-2128，2029-2129，2030-21302031-2131，2032-2132，2033-2133，2034-2134，2035-2135，2036-2136，2037-2137，2038-2138，2039-2139，2040-2140，2041-2141，2042-2142，2043-2143，2044-2144，2045-2145，2046-2146，2047-2147，2048-2148，2049-2149，2050-2150，2051-2151，2052-2152，2053-2153，2054-2154，2055-2155，2056-2156，2057-2157，2058-2158，2059-2159，2060-21602061-2161，2062-21622063-2163，2064-2164，2065-2165，2066-2166，2067-2167，2068-2168，2069-2169，2070-2170，2071-2171，2072-2172，2073-2173，2074-2174，2075-2175，2076-2176，2077-21772078-2178，2079-2179，2080-2180，2081-2181，2082-2182，2083-2183，2084-2184，2085-2185，2086-2186,2087-2187，2088-2188，2089-2189，2090-2190，2091-2191，2092-2192，2093-2193，2094-2194，2095-2195，2096-2196，2097-2197，2098-2198，2099-2199，2100-2200，2101-2201，2102-2202，2103-2203，2104-2204，2105-2205，2106-2206，2107-22072108-2208，2109-2209，2110-2210，2111-2211，2112-2212，2113-2213，2114-2214，2115-2215，2116-2216，2117-2217，2118-2218，2119-2219，2120-2220，2121-2221，2122-22222123-2223，2124-2224，2125-2225，2126-2226，2127-2227，2128-2228，2129-2229，2130-2230，2131-2231，2132-2232，2133-2233，2134-2234，或2135-2235位。
因此，本文提供了rAAV载体，其包含含有编码人视网膜劈裂蛋白的核酸和填充序列的多核苷酸。在一些实施方案中，填充序列的长度为约1000个核苷酸至约4000个核苷酸。在一些实施方案中，填充序列的长度为约2000个核苷酸至约3500、约3200、约3000、约2900或约2800个核苷酸。在一些实施方案中，填充序列的长度为约2500个核苷酸至约3000个核苷酸。在一些实施方案中，填充序列的长度为约2800个核苷酸。
在一些实施方案中，包含异源核酸和填充序列的核酸载体包含与SEQ ID NO：16至17、31至35中任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。在一些实施方案中，包含异源核酸和填充序列的核酸载体包含SEQ ID NO：31至34中任一者的序列。
在一些实施方案中，AAV载体包含第一ITR和第二ITR，并且第一ITR与第二ITR之间的AAV载体长度(即，“ITR之间的长度”)为约2000个核苷酸至约6000个核苷酸。在一些实施方案中，这样的AAV载体包含填充序列。在一些实施方案中，第一ITR与第二ITR之间的AAV载体长度为约3000个核苷酸至约5000个核苷酸。在一些实施方案中，第一ITR与第二ITR之间的AAV载体长度为约4000个核苷酸至约5000个核苷酸。ITR之间的该长度可以为约4500个核苷酸。
在一些实施方案中，异源核酸和填充序列的总长度为约2000个核苷酸至约5000个核苷酸。在一些实施方案中，该总长度为约2500个核苷酸至约4500、约4200、约4000、约3800、约3700、约3600或约3500个核苷酸。在一些实施方案中，填充序列的长度为约3500个核苷酸。
在一些实施方案中，填充序列位于编码人视网膜劈裂蛋白的异源核酸的下游(3’)。在一些实施方案中，填充序列位于polyA序列的上游(5’)。在一些实施方案中，填充序列位于polyA序列的3’。在一些实施方案中，填充序列位于两个AAV ITR序列之间。
填充序列
＞填充子(stuffer)1(2822bp)(SEQ ID NO：26)
/>
＞填充子2(2820bp)(SEQ ID NO：27)
＞填充子3(2249bp)(SEQ ID NO：28)
＞填充子4(2235bp)(SEQ ID NO：29)
＞填充子5(2219bp)(SEQ ID NO：30)
示例性AAV载体
在一些实施方案中，本文提供了核酸载体，其包含异源核酸(例如，其编码视网膜劈裂蛋白)和一种或更多种另外的元件。在一些实施方案中，另外的元件包含内含子。在一些实施方案中，另外的元件包含剪接供体区。在一些实施方案中，另外的元件包含剪接受体区。在一些实施方案中，另外的元件包含启动子。在一些实施方案中，另外的元件包含polyA信号。在一些实施方案中，另外的元件包含一个或更多个末端重复。在一些实施方案中，另外的元件包含WPRE元件。在一些实施方案中，另外的元件包含上述元件中的两个或更多个。
因此，本公开内容中描述的示例性rAAV载体可包含以下结构中的任一者：AAV-hGRK1-hRS1syn，AAV-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV-hGRK1-GFP，AAV-pTR-X001-3p，AAV-pTR-X001-5p，AAV-pTR-X002-3p，AAV-pTR-X002-3pSR，AAV-pTR-X001和AAV-pTR-X002。
编码RS1蛋白的示例性载体可包含以下中的任一者：AAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn，AAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)-hGRK1-hRS1syn，AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV44.9(Y446F+E531D)-hGRK1-hRS1syn，AAV44.9(Y446F+E531D)-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV44.9(T492V+E531D)-hGRK1-hRS1syn，AAV44.9(T492V+E531D)-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV44.9-hGRK1-hRS1syn，AAV44.9-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV44.9(Y731F)-hGRK1-hRS1syn，AAV44.9(Y731F)-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV5-hGRK1-hRS1syn，AAV5-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV2(4pMut)ΔHS-hGRK1-hRS1syn，AAV2(4pMut)ΔHS-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV8(Y447F+Y733F+T494V)-hGRK1-hRS1syn或AAV8(Y447F+Y733F+T494V)-hGRK1-hRS1syn-WPREsf。
在某些实施方案中，示例性载体包含AAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn，AAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn-WPREsf，AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)-hGRK1-hRS1syn或AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)-hGRK1-hRS1syn-WPREsf。
在某些实施方案中，载体包含AAV44.9-pTR-X001-3p。在某些实施方案中，载体包含AAV44.9-pTR-X001-5p。在某些方案中，载体包含AAV44.9-pTR-X002-3p。在某些实施方案中，载体包含AAV44.9-pTR-X002-3pSR。在某些实施方案中，载体包含AAV44.9-pTR-X001。在某些实施方案中，载体包含AAV44.9-pTR-X002。
在某些实施方案中，载体包含AAV44.9(E531D)-pTR-X001-3p。在某些实施方案中，载体包含AAV-44.9(E531D)-pTR-X001-5p。在某些实施方案中，载体包含AAV44.9(E531D)-pTR-X002-3p。在某些实施方案中，载体包含AAV44.9(E531D)-pTR-X002-3pSR。在某些实施方案中，载体包含AAV44.9(E531D)-pTR-X001。在某些实施方案中，载体包含AAV44.9(E531D)-pTR-X002。
在某些实施方案中，载体包含AAV2-pTR-X001-3p。在某些实施方案中，载体包含AAV2-pTR-X001-5p。在某些实施方案中，载体包含AAV2-pTR-X002-3p。在某些实施方案中，载体包含AAV2-pTR-X002-3pSR。在某些实施方案中，载体包含AAV2-pTR-X001。在某些实施方案中，载体包含AAV2-pTR-X002。
在某些实施方案中，载体包含AAV2(4pMut)ΔHS-pTR-X001-3p。在某些实施方案中，载体包含AAV2(4pMut)ΔHS-pTR-X001-5p。在某些实施方案中，载体包含AAV2(4pMut)ΔHS-pTR-X002-3p。在某些实施方案中，载体包含AAV2(4pMut)ΔHS-pTR-X002-3pSR。在某些实施方案中，载体包含AAV2(4pMut)ΔHS-pTR-X001。在某些实施方案中，载体包含AAV2(4pMut)ΔHS-pTR-X002。
包含报道转基因(例如，GFP)的其他示例性载体可包含以下中的任一者：AAV44.9(Y731F)-hGRK1-GFP、AAV44.9(E531D)-IRBP/GNAT2-hGFP、AAV44.9(Y731F)-IRBP/GNAT2-hGFP。
在一些实施方案中，AAV载体包含与SEQ ID NO：31具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。例如，AAV载体包含SEQ ID NO：31。
在一些实施方案中，AAV载体包含与SEQ ID NO：32具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。例如，AAV载体包含SEQ ID NO：32。
在一些实施方案中，AAV载体包含与SEQ ID NO：33具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。例如，AAV载体包含SEQ ID NO：33。
在一些实施方案中，AAV载体包含与SEQ ID NO：34具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。例如，AAV载体包含SEQ ID NO：34。
在一些实施方案中，AAV载体包含与SEQ ID NO：35具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。例如，AAV载体包含SEQ ID NO：35。
在一些实施方案中，AAV载体包含与SEQ ID NO：33具有约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。例如，AAV载体包含SEQ ID NO：33。
在一些实施方案中，AAV载体具有以下结构：5’ITR-启动子-内含子和/或剪接供体和/或剪接受体-hRS1编码序列-polyA-填充子-3’ITR。启动子可以是hGRK1启动子。启动子可以是CBA或smCBA启动子。polyA序列可以是bGH polyA序列。内含子和/或剪接供体和/或剪接受体可以是SV40内含子。
在一些实施方案中，AAV载体具有以下结构：5’ITR-填充子一启动子-内含子和/或剪接供体和/或剪接受体-hRS1编码序列-polyA-3’ITR。启动子可以是hGRK1启动子。启动子可以是CBA或smCBA启动子。polyA序列可以是bGH polyA序列。内含子和/或剪接供体和/或剪接受体可以是SV40内含子。
在一些实施方案中，AAV载体具有以下结构：5’ITR-启动子-内含子和/或剪接供体和/或剪接受体-hRS1编码序列-转录后调节元件-polyA-填充子-3’ITR。启动子可以是hGRK1启动子。启动子可以是CBA或smCBA启动子。polyA序列可以是bGH polyA序列。内含子和/或剪接供体和/或剪接受体可以是SV40内含子。转录后调节元件可以是WPRE元件。
在一些实施方案中，AAV载体具有以下结构：5’ITR-启动子-内含子和/或剪接供体和/或剪接受体-hRS1编码序列-polyA-3’ITR。启动子可以是hGRK1启动子。启动子可以是CBA或smCBA启动子。polyA序列可以是bGH polyA序列。内含子和/或剪接供体和/或剪接受体可以是SV40内含子。
在一些实施方案中，AAV载体具有以下结构：5’ITR-启动子-内含子和/或剪接供体和/或剪接受体-hRS1编码序列-转录后调节元件-polyA-3’ITR。启动子可以是hGRK1启动子。启动子可以是CBA或smCBA启动子。polyA序列可以是bGH polyA序列。内含子和/或剪接供体和/或剪接受体可以是SV40内含子。转录后调节元件可以是WPRE元件。
所公开的rAAV载体可包含与SEQ ID NO：16或17的核苷酸序列具有至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、98％同一性或99％同一性的核苷酸序列。在一些实施方案中，载体包含SEQ ID NO：16或17的核苷酸序列。在一些具体实施方案中，本公开内容提供了包含AAV-hGRK1-hRS1syn结构的rAAV载体，所述结构包含下面提供的SEQ ID NO：16的核苷酸序列。SEQ ID NO：16的长度为1740个核苷酸(nt)。在一些具体实施方案中，本公开内容提供了包含AAV-hGRK1-hRS1syn-WPREsf结构的rAAV载体，所述结构包含以下提供的SEQ ID NO：17的核苷酸序列。SEQ ID NO：17的长度为2320个核苷酸(nt)。
在一些实施方案中，本公开内容的示例性rAAV载体包含以下结构：5’ITR-启动子-SV40内含子-hRS1编码序列-polyA-填充子-3’ITR。在一些实施方案中，本公开内容的示例性rAAV载体包含以下结构：5’ITR-启动子-SV40内含子-hRS1编码序列-polyA-3’ITR。在一些实施方案中，本公开内容的示例性rAAV载体包含以下结构：5’ITR-启动子-SV40内含子-hRS1编码序列-WPREsf-polyA-填充子-3’ITR。在一些实施方案中，本公开内容的示例性rAAV载体包含以下结构：5’ITR-启动子-SV40内含子-hRS1编码序列WPREsf-polyA-3’ITR。根据这些结构中的任一种的载体的启动子可以是hGRK1启动子。根据这些结构中的任一种的载体的启动子可以是CBA或smCBA启动子。根据这些结构中的任一种的载体的polyA序列可以是bGH polyA序列。在以下构建体中，一种或更多种经修饰的Kozak序列用斜体表示。
pTR-X001-3p(ITR-ITR序列-4534bp)
/>
/>
pTR-X001-5p(ITR-ITR序列-4528bp)
/>
/>
pTR-X002-3p(ITR-ITR序列-4549bp)
/>
/>
pTR-X001(ITR-ITR序列-1723bp)
pTR-X002(ITR-ITR序列-2311bp)
pTR-X002-3pSR(ITR-ITR序列-4549bp)
/>
/>
AAV-hGRK1-hRS1syn
AAV-hGRK1-hRS1syn-WPREsf
衣壳变体
在一些实施方案中，本公开内容提供了来源于多种不同血清型的改进的rAAV颗粒，包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10及其组合。在一些具体实施方案中，衣壳包含AAV5或AAV44.9(E531D)。在一些实施方案中，衣壳可包含AAV2的变体、AAV5的变体、AAV7的变体、AAV8的变体或AAV9的变体。在一些实施方案中，衣壳包含AAV44.9(E531D)，AAV2(4pMut)AHS，AAV44.9，AAVrh.8，AAVrh.8R，AAVrh.10，AAVrh.74，AAV2TT，AAV2HBKO，AAV8(Y447F+Y733F+T494V)或AAVAnc80。在一些实施方案中，衣壳包含AAV2、AAV6或者来源于AAV2或AAV6的衣壳变体。因此，在一些实施方案中，衣壳包含AAV2(7m8)，AAV-DJ，AAV2/2-MAX，AAVSHh10，AAVSHh10Y，AAV3，AAV3b，AAVLK03，AAV7BP2，AAV1(E531K)，AAV6(D532N)，AAV6-3pmut，AAV2G9或其元件。
在一些具体实施方案中，本公开内容提供了包含衣壳血清型AAV44.9的衣壳变体的rAAV颗粒。在一些实施方案中，所公开的颗粒包含衣壳蛋白AAV44.9(E531D)。如本文实施例中所述，发现AAV44.9(E531D)相对于未经修饰的AAV44.9和AAVrh.8介导改善的视网膜转导，并且两个种类的转导均显著高于基准衣壳(例如，基于AAV5和AAV8的载体)。因此，本公开内容提供了包含AAV44.9(E531D)血清型的衣壳蛋白的rAAV颗粒以及相关组合物和方法。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含例如编码治疗剂或诊断剂的异源核酸。异源核酸可以为单链(single-stranded，ss)或自身互补(self-complementary，sc)AAV核酸载体的形式，例如单链或自身互补重组病毒基因组的形式。
本公开内容还提供了具有AAV44.9衣壳的rAAV颗粒，所述衣壳包含E531D替换和一种或更多种另外的替换，例如残基446位的Y-F突变、残基492位的T-V突变或两者。因此，本公开内容提供了包含AAV44.9(T492V+E531D)衣壳、AAV44.9(Y446F+E531D)衣壳或AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)衣壳的rAAV颗粒以及相关的组合物和方法。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含AAV44.9衣壳的rAAV颗粒。通过视网膜下注射，这种衣壳可非常适合于介导改善的视网膜组织转导。本发明人已经发现，玻璃体内注射AAV44.9颗粒可能不能对视网膜细胞进行有效转导。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含AAV2(4pMut)ΔHS衣壳的rAAV颗粒。AAV2(4pMut)ΔHS衣壳经表明在灵长类视网膜中介导增强的侧向扩散，并显示出有效的光感受器转导。本公开内容还提供了包含AAV8(Y733F)和AAV8(Y447F+Y733F+T494V)衣壳变体的颗粒。
本公开内容的一些方面涉及包含AAV44.9(E531D)衣壳的载体，该衣壳在视网膜下注射到中央凹之后表现出增强的侧向扩散，其中使中央凹的脱离(例如，暂时性大泡状脱离)最小化。在一些实施方案中，本公开内容提供了衣壳蛋白，例如VP1、VP2或VP3衣壳蛋白，其包含SEQ ID NO：1、2和/或3的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了包含含有VP1、VP2和/或VP3蛋白的衣壳的rAAV颗粒，其中该rAAV颗粒还包含含有异源核酸的多核苷酸。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含含有VP1、VP2和/或VP3蛋白的衣壳，其中VP1蛋白包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列，VP2蛋白包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列，和/或VP3蛋白包含SEQ ID NO：3的氨基酸序列，并且其中AAV还包含含有异源核酸的多核苷酸。多核苷酸的侧翼可以是一个或更多个反向末端重复(ITR)序列。
在一些实施方案中，本公开内容提供了衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO：1、2或3中任一者具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少92.5％同一性、至少95％同一性、98％同一性或99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本公开内容提供了包含SEQ ID NO：1、2和/或3的氨基酸序列的衣壳蛋白。在一些具体实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的衣壳(AAV44.9(E531D)衣壳VP1)。在一些实施方案中，本公开内容提供了衣壳蛋白，其包含与SEQ ID NO：18具有至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少92.5％同一性、至少95％同一性、98％同一性或99％同一性的氨基酸序列。在一些具体实施方案中，提供了包含SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列的衣壳(AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)衣壳VP1)。在一些实施方案中，所公开的衣壳可包含具有相对于SEQ ID NO：1至3和18中任一者的序列不同的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18个氨基酸的序列。这些差异可包括相对于SEQ ID NO：1至3和18中任一者的序列已插入、缺失或替换的氨基酸。
在一些实施方案中，本公开内容提供了核酸，例如质粒或病毒载体，其包含SEQ IDNO：4的核酸序列(其编码AAV44.9(E531D)VP1)。在一些实施方案中，本公开内容提供了核酸，例如质粒或病毒载体，其包含SEQ ID NO：5的核酸序列(其编码AAV44.9(E531D)VP2)。在一些实施方案中，本公开内容提供了核酸，例如质粒或病毒载体，其包含SEQ ID NO：6的核酸序列(其编码AAV44.9(E531D)VP3)。在一些实施方案中，病毒载体是重组腺相关病毒(rAAV)载体。在一些实施方案中，rAAV载体是自身互补的。在一些实施方案中，核酸包含在细胞(例如哺乳动物或昆虫细胞)内。
如本文所述，AAV44.9衣壳蛋白中的所有替换均基于SEQ ID NO：1中所示的VP1氨基酸序列。如本领域技术人员所理解的，本文在VP1序列中描述的所有替换同样适用于VP2和VP3蛋白的序列。以下提供了SEQ ID NO：1至8和18的序列。
SEQ ID NO：1-AAV44.9(E531D)VP1氨基酸序列
SEQ ID NO：2-AAV44.9(E531D)VP2氨基酸序列
SEQ ID NO：3-AAV44.9(E531D)VP3氨基酸序列
SEQ ID NO：18-AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)VP1氨基酸序列
SEQ ID NO：4-AAV44.9(E531D)VP1核酸序列
SEQ ID NO：5-AAV44.9(E531D)VP2核酸序列
SEQ ID NO：6-AAV44.9(E531D)vP3核酸序列
在一些实施方案中，将AAV-DJ衣壳与本公开内容的rAAV载体结合使用。AAV-DJ包含7个氨基酸插入到AAV2衣壳的HSPG结合结构域中，并且在玻璃体内注射之后在Muller细胞中具有高表达效率。在一些实施方案中，将AAV2(7m8)与本公开内容的rAAV载体结合使用。AAV2(7m8)衣壳与AAV-DJ密切相关。在一些实施方案中，AAV2/2-MAX衣壳包含五个点突变，Y272F、Y444F、Y500F、Y730F、T491V。在一些实施方案中，AAVSHh10和AAV6(D532N)衣壳是AAV6的衍生物。在一些实施方案中，AAV6-3pmut是(也称为AAV6(TM6)和AAV6(Y705+Y731F+T492V))。
在一些实施方案中，与所公开的rAAV载体结合使用的衣壳是包含野生型AAV2衣壳的氨基酸残基处的非天然氨基酸替换的衣壳。在一些实施方案中，非天然氨基酸替换包含Y272F、Y444F、T491V、Y500F、Y700F、Y704F、Y730F或其组合中的一种或更多种。在一些实施方案中，衣壳包含SEQ ID NO：6中所示的野生型AAV6衣壳的氨基酸残基处的非天然氨基酸替换。在一些实施方案中，非天然氨基酸替换包含Y445F、Y705F、Y731F、T492V、S663V或其组合中的一种或更多种。在一些实施方案中，衣壳包含AAV2的变体AAV2G9。
在一些实施方案中，衣壳包含在野生型AAV8衣壳的氨基酸残基533处的非天然氨基酸替换。在一些实施方案中，非天然氨基酸替换是E533K、Y733F或其组合。在一些实施方案中，衣壳包含AAV8的变体AAV7BP2。
在一些实施方案中，衣壳包含野生型AAV2衣壳的非天然氨基酸替换。在一些实施方案中，衣壳包含以下中的一种或更多种：
(a)Y444F；
(b)Y444F+Y500F+Y730F；
(c)Y272F+Y444F+Y500F+Y730F；
(d)Y444F+Y500F+Y730F+T491V；或
(e)Y272F+Y444F+Y500F+Y730F+T491V或在野生型AAV1、AAV3、AAV4、AAV5、AAV7、AAV9或AAV10衣壳蛋白中任一者与其对应的等同氨基酸位置。
在一些实施方案中，衣壳包含野生型AAV6衣壳的非天然氨基酸替换。在一些实施方案中，衣壳包含以下中的一种或更多种：
(a)Y445F；
(b)Y705F+Y731F；
(c)T492V；
(d)Y705F+Y731F+T492V；
(e)S663V；或
(f)S663V+T492V。
在多个实施方案中，rAAV颗粒包含以下衣壳，即，AAV2的衣壳变体之一：DGE-DF(也称为‘V1V4VR-V’)、P2-V2、P2-V3和ME-B(Y-F+T-V)。DGE-DF衣壳变体包含在野生型AAV2 VP1的氨基酸492、493、494、499、和500位处的天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸。P2-V2衣壳变体包含在AAV2 VP1的263、490、492、499、500和530位处的丙氨酸、苏氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸和天冬氨酸。P2-V3衣壳变体包含在AAV2 VP1的263、264、444、451、454、455、459、527和531位处的天冬酰胺、丙氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、缬氨酸、苏氨酸、精氨酸、天冬氨酸和天冬氨酸。ME-B(Y-F+T-V)衣壳变体包含分别在AAV2 VP1的492、493、494、499和500位处的天冬氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和苯丙氨酸，AAV2 VP1的546至556位处的SAAGADXAXDS，以及以下替换：Y272F、Y444F和T491V。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含选自AAV6(3pMut)，AAV2(quadYF+T-V)或AAV2(trpYF)的衣壳。在一些实施方案中，rAAV颗粒包含国际专利公开No.WO2018/156654中描述的任何衣壳变体，所述国际专利公开通过引用并入本文。
在一些实施方案中，AAV颗粒包含来自AAV2的一个或更多个衣壳，例如AAV2(4pMut)ΔHS衣壳。下面提供了AAV2(4pMut)ΔHS的示例性衣壳序列(SEQ ID NO：36至38)。
SEQ ID NO：36-AAV2(4pMut)ΔHS VP1氨基酸序列
SEQ ID NO：37-AAV2(4pMut)ΔHS VP2氨基酸序列
SEQ ID NO：38-AAV2(4pMut)ΔHS VP3氨基酸序列
如图8A至8C中所示，评价注射之后4周和6周在Nrl-GFP小鼠视网膜中视网膜下注射的rAAV载体的转导谱。使用流式细胞术来确定转导效率。如图8C中所示，cector介导的GFP表达和视锥抑制蛋白共定位，表明所评价的AAV44.9、AAV44.9(Y731F)、AAV44.9(E531D)、AAVrh.8和AAV8(Y733F)衣壳有效地转导视锥光感受器。
评价了与自然史研究相关的OCT测量值和劈裂活性评分。将1月龄小鼠视网膜切片用RS1单克隆抗体染色(阴影)，如图14中所示。RS1表达在雌性杂合小鼠和野生型雄性小鼠中定位于光感受器的内段/外段连接处，而在雄性RS1 KO小鼠和雌性RS1 KO小鼠中则不存在。在内侧视网膜中观察到劈裂腔。
载体
本文描述了重组AAV载体。在一些实施方案中，本文所述的载体是自身互补rAAV(self-complementary rAAV，scAAV)载体。在一些实施方案中，载体是单链(ss)载体。在一些实施方案中，载体以足以治疗或改善所治疗疾病或病症的一种或更多种症状的量和持续的时间通过一次或更多次施用感染性腺相关病毒颗粒、rAAV病毒体或多个感染性rAAV颗粒而向一只或两只眼提供。
在一些方面中，本文描述了用于向有此需要的哺乳动物提供治疗有效量的选定的治疗剂(例如，合成人RS1)的方法。在一些实施方案中，治疗剂在插入到重组AAV核酸载体中的异源核酸或转基因中编码。在一些实施方案中，核酸载体包含一种或更多种异源核酸，其包含编码与启动子(例如，hGRK1启动子)可操作地连接的目的蛋白质或多肽的序列，其中一种或更多种转基因在每侧的侧翼是ITR序列。所公开的核酸载体可包含在包含RS1异源核酸(转基因)和其他调节元件的多核苷酸的侧翼的AAV反向末端重复。在一些实施方案中，所公开的核酸载体包含在包含RS1异源核酸、SV40内含子、WPREsf元件和polyA信号序列的多核苷酸的侧翼的AAV ITR。在一些实施方案中，载体包含在包含RS1异源核酸、SV40内含子、WPREsf元件、填充序列和polyA序列的多核苷酸的侧翼的AAV ITR。
ITR序列可来源于任何AAV血清型(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)或可来源于多于一种血清型。在一些实施方案中，第一血清型的ITR序列来源于AAV2、AAV5、AAV7、AAV8或AAV9。在一些实施方案中，ITR序列来源于AAV2或AAV5。在一些实施方案中，ITR序列与衣壳(例如，AAV5ITR序列和AAV5衣壳等)具有相同的血清型。
ITR序列和包含ITR序列的质粒在本领域是已知的并且可商购获得(参见例如可从Vector Biolabs，Philadelphia，PA；Cellbiolabs，San Diego，CA；Agilent Technologies，Santa Clara，Ca；和Addgene，Cambridge，MA获得的产品和服务；并且基因递送至骨骼肌导致治疗性蛋白质的持续表达和全身递送。在一些实施方案中，核酸载体包含pTR-UF-11质粒骨架，其是包含AAV2ITR的质粒。该质粒可商购获自美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection)(ATCC MBA-331)。
在一些方面中，本文所述的rAAV载体可包含多种(两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种或十种)异源核酸。在某些实施方案中，多种异源核酸包含在单个多核苷酸分子上。可使用多种异源核酸，例如，以纠正或改善由多亚基蛋白质引起的基因缺陷。在多个实施方案中，不同的异源核酸可用于编码蛋白质的每个亚基，或用于编码不同的肽或蛋白质。当编码蛋白质亚基的核酸的尺寸较大时，例如对于免疫球蛋白、血小板来源的生长因子或肌养蛋白，这是期望的。为了使细胞产生多亚基蛋白质，将细胞用包含不同亚基中的每一个的rAAV颗粒感染。或者，蛋白质的不同亚基可由相同的核酸序列编码。在多个实施方案中，单个异源核酸包含编码每个亚基的核酸，其中针对每个亚基的核酸被内部核酶进入位点(internal ribozyme entry site，IRES)隔开。当编码每个亚基的核酸的尺寸较小时，例如编码亚基的核酸和IRES的总尺寸小于5千碱基时，这是期望的。
作为IRES的一个替代方案，核酸可被编码2A肽的序列隔开，该肽在翻译后事件中自我切割。该2A肽显著小于IRES，使其非常适合在空间为限制因素的情况下使用。更常见的是，当异源核酸很大时，由多亚基组成，或两个异源核酸被共同递送，或携带所期望的一种或更多种异源核酸或亚基的rAAV颗粒被共同施用以允许它们在体内多连体化(concatamerize)以形成单个载体基因组。在这样的实施方案中，第一rAAV颗粒可携带表达单个异源核酸的表达盒，并且第二rAAV颗粒可携带表达不同异源核酸的表达盒以在宿主细胞中共表达。然而，选定的异源核酸可编码任何生物活性产物或其他产物，例如对于研究所期望的产物。
在一些方面中，可将rAAV载体针对人表达进行密码子优化。在一些实施方案中，rAAV载体可具有经修饰的Kozak核酸序列，其提供在靶细胞例如PR细胞中增强的转导或适应性。Kozak序列包括翻译起始密码子(ATG)和位于起始密码子5’端的核苷酸段。
治疗方法和制剂
在一些实施方案中，提供了涉及在有此需要的哺乳动物中提供治疗有效量的选定的治疗剂的方法，所述方法包括向哺乳动物的一只或两只眼施用一定量的本文所述的rAAV颗粒；并且持续有效地为哺乳动物提供治疗有效量的选定治疗剂的一段时间。
在某些实施方案中，哺乳动物被怀疑患有X连锁视网膜劈裂症、处于发生X连锁视网膜劈裂症的风险之中或已被诊断出X连锁视网膜劈裂症。
在一些实施方案中，提供了用于对哺乳动物光感受器细胞或视网膜色素上皮细胞进行转导的方法，所述方法包括向哺乳动物的一只或两只眼施用本文所述的rAAV颗粒。在一些具体实施方案中，提供了用于在哺乳动物的一种或更多种光感受器细胞中表达多核苷酸的方法，所述方法包括向哺乳动物的一只或两只眼经视网膜下或玻璃体内施用本文所述的rAAV颗粒或其组合物持续有效地在哺乳动物的一个或更多个PR或RPE细胞中产生治疗剂的一段时间，其中rAAV颗粒包含含有至少第一多核苷酸的多核苷酸，所述第一多核苷酸包含与编码治疗剂的至少第一异源核酸序列可操作地连接的PR或RPE细胞特异性启动子。
在一些具体实施方案中，向对象施用替代编码序列以提供功能性蛋白质，例如RS1蛋白，以例如完全或部分恢复对象(例如，人)的光感受器功能。在一些实施方案中，通过向对象(例如，向患有显性视锥-视杆营养不良的人)施用包含本文所公开的异源核酸的rAAV颗粒来沉默对象的目标编码序列的一个或两个等位基因。在一些具体实施方案中，通过施用本文公开的rAAV颗粒来沉默或抑制一个或更多个靶编码序列的内源性突变等位基因。
在一些实施方案中，哺乳动物是人对象。在一些实施方案中，哺乳动物是非人灵长类对象。非人灵长类对象的非限制性实例包括猕猴(例如，食蟹猴或恒河猴)、狨猴、绢毛猴、蜘蛛猴、枭猴、长尾黑颚猴(vervet monkey)、松鼠猴、狒狒、大猩猩、黑猩猩和猩猩。其他示例性对象包括家养动物，例如狗和猫；家畜，例如马、牛、猪、绵羊、山羊和鸡；以及其他动物，例如小鼠、大鼠、豚鼠和仓鼠。
在某些实施方案中，提供了用于向哺乳动物的中央凹(例如，中央凹视锥细胞)视网膜下施用本文所述的rAAV颗粒或其组合物的方法。在一些具体实施方案中，在视网膜下施用期间和/或之后使中央凹的脱离最小化。在一些具体实施方案中，在中央凹没有任何脱离的情况下进行rAAV颗粒的视网膜下施用。
在一些实施方案中，向细胞或对象施用的rAAV颗粒的剂量可为约106至1014vg/mL(或颗粒/mL)或103至1015vg/mL，或在其任一范围之间的任何值，例如，约106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014vg/mL。在一些具体实施方案中，rAAV颗粒以5×1010vg/mL的量来施用。在一些实施方案中，rAAV颗粒以1×1011vg/mL的量来施用。在一些实施方案中，rAAV颗粒以1×1012vg/mL的量来施用。在一些实施方案中，向对象施用的rAAV颗粒的剂量可为约106至1014vg/mL或103至1015vg/mL，或在其任一范围之间的任何值，例如如约106、107、108、109、1010、1011、1012、1013或1014vg/mL。在一些实施方案中，施用高于1013vg/mL的rAAV颗粒。根据实现所治疗的特定疾病、障碍或病症的治疗所需要的，rAAV颗粒可以以单剂量施用或者分为两次或更多次施用。
在一些具体实施方案中，rAAV颗粒滴度范围为5×1010至1×1012vg/ml。在一些实施方案中，rAAV颗粒滴度可为1×1010、2.5×1010、5×1010、1×1011、2.5×1011、5×1011、1×1012、2.5×1012、5×1012、1×1013、2.5×1013、或5×1013vg/mL。在一些实施方案中，颗粒滴度小于5×1010vg/mL。在一些实施方案中，通过本文描述的方法(例如，经视网膜下或玻璃体内)施用rAAV颗粒。在一些实施方案中，经视网膜下施用颗粒。
根据实现所治疗的特定疾病、障碍或病症的治疗所需要的，rAAV颗粒可以以单剂量施用或者分为两次或更多次施用(例如，多至三次视网膜下注射泡)。在一些实施方案中，将1至500微升的本申请中描述的组合物(例如，其包含rAAV颗粒)向对象的一只或两只眼施用。例如，在一些实施方案中，可向每只眼施用约10、约30、约45、约50、约75、约90、约100、约200微升。在一些具体实施方案中，可施用3次视网膜下注射，每次以泡体积计为10μL至100μL。然而，应理解的是，在一些实施方案中可施用更小或更大的体积。
在一些实施方案中，本公开内容提供了本文所公开的一种或更多种基于rAAV的组合物在可药用溶液中的制剂用于单独或与一种或更多种其他治疗方式组合施用于细胞或动物，并且特别是用于人细胞、组织和影响人的疾病的治疗。
本文所述的rAAV颗粒也可与其他药剂例如蛋白质或多肽或多种药物活性剂组合施用，包括治疗性多肽、生物活性片段或其变体的一次或更多次全身施用或局部施用。在一些具体实施方案中，所述rAAV颗粒可与一种或更多种碳酸酐酶抑制剂(carbonicanhydrase inhibitor，CAI)组合施用。在一些实施方案中，它们可与任何CAI乙酰唑胺、二氯磺胺(也称为双氯非那胺(diclofenamide))、醋甲唑胺(methazolamide)、多佐胺(dorzolamide)、布林佐胺(brinzolamide)、依索唑胺(ethoxzolamide)和唑尼沙胺(zonisamide)。对于也可包含的其他组分几乎没有限制，只要该另外药剂在与靶细胞或宿主组织接触时不会引起明显的不利影响即可。因此，在特定情况下，rAAV颗粒可根据需要与多种其他药剂一起递送。这样的组合物可从宿主细胞或其他生物学来源中纯化，或作为替代，可如本文所述进行化学合成。
在一些实施方案中，本文描述了本文所述的rAAV载体、病毒颗粒、组合物和(宿主)细胞在制备用于诊断、预防、治疗或改善XLRS的至少一种或更多种症状的药物中的用途。在一些实施方案中，所述方法包括向有此需要的哺乳动物的一只或两只眼的玻璃体以足以在受影响的哺乳动物的一只或两只眼中诊断、预防、治疗或减轻这样的疾病、功能障碍、病症、异常状况、缺陷、损伤或创伤的一种或更多种症状的量和持续时间直接施用一种或更多种的所述载体、病毒颗粒、细胞、组合物或其中的多者。在多个实施方案中，哺乳动物是人对象。
在一些实施方案中，本文描述了在用于治疗XLR的药物的制备中可用于治疗XLR的组合物，其包含一种或更多种所述的rAAV载体、颗粒、组合物和宿主细胞。在一些实施方案中，组合物包含至少第一可药用赋形剂，以用于制备涉及治疗性施用这样的rAAV颗粒或载体的药物和方法。在一些实施方案中，药物制剂适合于玻璃体内施用到人或其他哺乳动物的一只或两只眼中。
在一些实施方案中，本文描述了所述rAAV载体和组合物用于在人光感受器或RPE细胞中治疗或改善XLRS症状的方法和用途。在一些实施方案中，所公开的方法和用途包括向有此需要的对象的一只或两只眼以足以在受影响的哺乳动物中治疗或改善这样的缺陷的症状的量和持续时间经玻璃体内或视网膜下施用一种或更多种所述颗粒载体、颗粒、宿主细胞或组合物。在一些实施方案中，方法包括预防性治疗怀疑患有这样的病症的动物，或向在诊断之后或症状发作之前处于发生这样的病症的风险之中的那些动物施用这样的组合物。
药物组合物和细胞
在一些方面中，本公开内容考虑了包含颗粒的宿主细胞，所述颗粒并入AAV44.9(E531D)衣壳、编码AAV44.9(E531D)衣壳的核酸或如本文所述的rAAV颗粒。这样的宿主细胞包括哺乳动物宿主细胞，其中人宿主细胞是优选的，并且可例如在细胞或组织培养物中分离。在一些实施方案中，宿主细胞是眼的细胞。
在一些实施方案中，提供了组合物，其包含如本文所述的rAAV颗粒(例如，其包含AAV44.9(E531D)衣壳)以及任选地可药用载体、赋形剂、稀释剂和/或缓冲剂。在一些实施方案中，本文所述的组合物可施用于需要治疗的哺乳动物(或对象)。在一些实施方案中，对象已患有或怀疑患有视网膜劈裂症。在一些实施方案中，对象具有一个或更多个内源突变等位基因(例如，其与眼或视网膜的疾病、障碍或病症(例如视网膜劈裂症)相关，或者引起眼或视网膜的疾病、障碍或病症(例如视网膜劈裂症))。
可药用赋形剂和载体溶液的配制是本领域技术人员公知的，开发用于在多种治疗方案(包括例如视网膜下、玻璃体内、肠胃外、静脉内、鼻内、关节内和肌内施用和制剂)中使用本文所述的特定组合物的合适的给药和治疗方案也是本领域技术人员公知的。
通常来说，这些制剂可包含至少约0.1％的治疗剂(例如rAAV颗粒)或更多，但是一种或更多种活性成分的百分比当然可变化并且可方便地为总制剂的重量或体积的约1％或2％至约70％或80％或更多。自然地，可以以在化合物的任何给定单位剂量中将获得合适剂量的方式来制备每种治疗上有用组合物中治疗剂(例如，rAAV颗粒)的量。制备这样的药物制剂领域的技术人员将考虑诸如溶解度、生物利用度、生物学半衰期、施用途径、产品保存期以及其他药理学考虑的因素，并且因此多种剂量和治疗方案可以是期望的。
在某些情况下，视网膜下、眼内、玻璃体内、肠胃外、皮下、静脉内、脑室内、肌内、鞘内、经口、腹膜内、通过经口或鼻吸入、或通过经由直接注射而直接注射到一种或更多种细胞、组织或器官中来在本文中公开的适当配制的药物组合物中递送如本文所述的rAAV颗粒(例如包含AAV44.9(E531D)衣壳)将是期望的。
适用于注射用途(例如，包含如本文所述的rAAV颗粒)的组合物的药物形式包括无菌水溶液或分散体。在一些实施方案中，该形式是无菌的并且在存在容易可注射性的程度上是流体。在一些实施方案中，该形式在制造和储存条件下是稳定的，并且被保存以抵抗微生物(例如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散介质，其包含例如水、盐水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物、和/或植物油。可维持适当的流动性，例如通过使用包衣(例如卵磷脂)、通过在分散体的情况下维持所需的粒径以及通过使用表面活性剂来进行。
术语“载体”是指与本文所述的rAAV颗粒一起施用的稀释剂、佐剂、赋形剂或载剂。这样的药用载体可以是无菌液体，例如水和油，包括以下那些：石油，例如矿物油；植物油，例如花生油、大豆油和芝麻油；动物油；或合成来源的油。盐水溶液以及葡萄糖和甘油水溶液也可用作液体载体。
本公开内容的组合物可通过多种途径递送至眼。其可以眼内、通过表面施用于眼或通过眼内注射到例如玻璃体(玻璃体内注射)或视网膜下(视网膜下注射)光感受器间空间来递送。在一些实施方案中，其被递送至视杆光感受器细胞。作为替代，其可通过插入或注射到眼周围的组织中而局部递送。其可通过经口途径或通过皮下、静脉内或肌内注射全身递送。作为替代，其可通过导管或通过植入物递送，其中这样的植入物由多孔、无孔或凝胶材料(包括膜，例如硅橡胶膜或纤维、可生物降解的聚合物或蛋白质性材料)制成。其可在病症发作之前施用以防止其发生，例如在对眼进行手术期间，或在病理病症发作之后立即或在急性或长期病症发生期间施用。
对于可注射水溶液的施用，例如，如果需要的话，可将溶液适当地缓冲，并且首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等张。这些特定的水溶液特别适合于静脉内、肌内、玻璃体内、皮下和腹膜内施用。在这方面，根据本公开内容，本领域技术人员将知道可使用的无菌水性介质。例如，可将一个剂量溶解在1ml等张NaCl溶液中，然后添加至1000ml皮下灌注流体中或注射在建议的输注部位(参见例如“Remington′s Pharmaceutical Sciences”第15版，第1035-1038和1570-1580页)。根据所治疗对象的状况，必然发生剂量的一些变化。在任何情况下，负责施用的人员决定用于个体对象的合适剂量。此外，对于人施用，制剂应符合例如FDA生物学标准所所要求的无菌性、热原性以及一般安全性和纯度标准。
无菌可注射溶液可通过将所需量的如本文所述的rAAV颗粒引入合适的溶剂(其根据需要具有上文列举的数种其他成分)中然后过滤灭菌来制备。通常来说，通过将多种经灭菌的活性成分引入无菌载剂中来制备分散体，所述无菌载剂包含基础分散介质和需要的来自以上列举的那些的其他成分。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥技术，该技术由其经预先无菌过滤溶液产生活性成分加上任何另外期望成分的粉末。
组合物(例如，包含如本文所述的rAAV颗粒)的量和施用这样的组合物的时间将在受益于本教导的技术人员的范围内。然而，很可能可通过单次施用实现治疗有效量的所公开组合物的施用，例如单次注射足够数量的rAAV颗粒以为接受这种治疗的患者提供治疗益处。作为替代，在一些情况下，在相对较短或相对延长的时间段内提供组合物的多次或连续施用可以是期望的，这可由监督这样的组合物的施用的医疗人员决定。
在一些实施方案中，在施用本申请中所述的一种或更多种组合物之后，可保持或恢复(例如部分或全部地)视觉敏锐度。在一些实施方案中，在施用本申请中所述的一种或更多种组合物后，一个或更多个光感受器细胞或者一个或更多个RPE细胞可部分或全部保存，和/或者一种或更多种视杆和/或视锥介导的功能可部分或全部恢复。
“治疗”疾病如该术语在本文所用是指降低对象经历的疾病、障碍或病症(例如视杆-视锥营养不良)的至少一种体征或症状的频率或严重程度。通常将上述组合物以有效量(即能够产生理想结果的量)施用于对象。理想结果将取决于所施用的活性剂。例如，rAAV颗粒的有效量可以是能够将异源核酸转移至宿主器官、组织或细胞的颗粒量。
可通过标准药学方法使用培养物中的细胞或实验动物确定LD50(将该群体的50％致死的剂量)来确定本公开内容方法中使用的组合物的毒性和效力。毒性和效力之间的剂量比是治疗指数，并且其可表示为比例LD50/ED50。表现出大治疗指数的那些组合物是优选的。虽然可使用表现出毒性副作用的那些，但应注意设计使这样的副作用的潜在损害最小化的递送系统。本文所述的组合物的剂量通常在包括ED50且具有很少或没有毒性的范围内。根据所采用的剂型和所使用的施用途径，剂量可在此范围内变化。
产生rAAV颗粒的方法
用于产生和使用假型化rAAV载体的方法是本领域中已知的(参见，例如Duan etal.，J.Virol.，75：7662-7671，2001；Halbert et al.，J.Virol.，74：1524-1532，2000；Zolotukhin et al.，Methods，28：158-167，2002；以及Auricchio et al.，Hum.Molec.Genet.，10：3075-3081，2001)。产生rAAV颗粒和异源核酸的方法也是本领域中已知的并且是市售的(参见，例如Zolotukhin et al.Production and purification ofserotype 1，2，and 5 recombinant adeno-associated viral vectors.Methods 28(2002)158-167；以及美国专利公开号US 2007/0015238和US2012/0322861，其通过引用整体并入本文；以及可从ATCC和Cell Biolabs，Inc.获得的质粒和试剂盒)。例如，可将包含异源核酸序列的质粒与一种或更多种辅助质粒(例如包含rep基因(例如编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因(编码VP1、VP2和VP3，包括如本文所述的经修饰的VP3区域)组合并转染或永久整合到生产细胞系中，使得rAAV颗粒可包装并随后纯化。
在一些实施方案中，一种或更多种辅助质粒包括包含rep基因和cap基因(例如，编码如本文所述的rAAV衣壳蛋白)的第一辅助质粒和包含E1a基因、E1b基因、E4基因、E2a基因和VA基因的第二辅助质粒。在一些实施方案中，rep基因是源自AAV2的rep基因，并且cap基因源自AAV44.9且可包含对该基因的修饰以产生如本文所述的经修饰的衣壳蛋白。辅助质粒和制备这样的质粒的方法是本领域中已知的并且是市售的(参见，例如来自PlasmidFactory，Bielefeld，Germany的pDM、pDG、pDP1rs、pDP2rs、pDP3rs、pDP4rs、pDP5rs、pDP6rs、pDG(R484E/R585E)和pDP8.ape质粒；其他产品和服务，其可获自Vector Biolabs，Philadelphia，PA；Cellbiolabs，San Diego，CA；Agilent Technologies，Santa Clara，Ca；和Addgene，Cambridge，MA；pxx6；Grimm et al.(1998)，Novel Tools for Production andPurification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors，Human Gene Therapy，Vol.9，2745-2760；Kem，A.et al.(2003)，Identification of a Heparin-Binding Motifon Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids，Journal of Virology，Vol.77，11072-11081.；Grimm et al.(2003)，Helper Virus-Free，Optically Controllable，and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to6，Molecular Therapy，Vol.7，839-850；Kronenberg et al.(2005)，A ConformationalChange in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure ofHidden VP1 N Termini，Journal of Virology，Vol.79，5296-5303；以及Moullier，P.andSnyder，R.O.(2008)，International efforts for recombinant adeno-associatedviral vector reference standards，Molecular Therapy，Vol.16，1185-1188)。
接下来描述一种示例性的非限制性rAAV颗粒产生方法。产生或获得一种或更多种辅助质粒，其包含期望AAV血清型的rep和cap ORF以及在其天然启动子的转录控制下的腺病毒VA、E2A(DBP)和E4基因。cap ORF还可包含一个或更多个修饰以产生如本文所述的经修饰的衣壳蛋白。利用辅助质粒和包含本文所述核酸载体的质粒，通过CaPO4介导的转染、脂质或聚合物分子如聚乙烯亚胺(PEI)转染HEK293细胞(可获自)。然后将HEK293细胞孵育至少60小时以允许rAAV颗粒产生。作为替代地，在另一个实例中，用包含异源核酸序列的单一重组杆状病毒感染基于Sf9的稳定生产细胞系。作为另一替代方案，在另一个实例中，用包含异源核酸序列的HSV和任选地包含如本文所述的rep和cap ORF以及在其天然启动子的转录控制下的腺病毒VA、E2A(DBP)和E4基因的一种或更多种辅助HSV感染HEK293或BHK细胞系。然后可将HEK293、BHK或Sf9细胞孵育至少60小时以允许rAAV颗粒产生。然后可使用本领域中已知或本文所述的任何方法，例如通过碘克沙醇逐步梯度、CsCl梯度、色谱或聚乙二醇(PEG)沉淀来纯化rAAV颗粒。
在多个实施方案中，使用碘克沙醇逐步梯度纯化方法。可将载体包装到哺乳动物细胞(例如，HEK293T细胞)中并通过碘克沙醇梯度离心纯化，然后进行缓冲液交换并浓缩到BSS/Tween缓冲液中。可添加亲和捕获步骤。
实施例
包括以下实施例以表明本发明的一些优选实施方案。本领域技术人员应当理解，在下文的实施例中公开的技术代表了发明人发现的在本发明的实践中很好地发挥作用的技术，并且因此可被认为构成其实践的优选模式。然而，根据本公开内容，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可在所公开的具体实施方案中进行许多改变，并且仍然获得类似或类似的结果。
实施例1-在猕猴中视网膜下施用编码报道基因的AAV载体之后增强的侧向扩散和中央凹转导
进行了在视网膜下注射的小鼠和猕猴中并入AAV44.9(E531D)衣壳变体的载体和颗粒相对于基准载体、密切相关的AAVrh.8和未经修饰的AAV44.9的性能的评价。已确定人视紫红质激酶(hGRK1)启动子在非人灵长类视杆和视锥中具有专属活性。因此，评价了hGRK1启动子在改进的AAV44.9(E531D)载体中驱动猕猴眼中绿色荧光蛋白(greenfluorescent protein，GFP)报道子表达的能力。还评价了从初始泡边界横向扩散的程度。
中央凹旁区域是环绕中央凹的眼区域，距中央注视点约4度偏心率。中央凹旁具有最高密度的视杆，同时还含有大量视锥。它是视锥和视杆为主的视网膜之间的过渡区，在其中变性从外层进行到内层视网膜的疾病(例如视网膜色素变性(retinitis pigmentosa，RP))的情况下是重要的。中央凹周围区域是环绕中央凹旁的区域，代表黄斑的最外带。像中央凹旁一样，中央凹周围在像RP的其中视网膜退化从周边开始并进展到中央视网膜的疾病的进展中具有重要作用。中央凹周围是在RP中黄斑经历变性的第一区域。
将两种rAAV载体AAV44.9-hGRK1-GFP和AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFP经视网膜下施用于猕猴眼。载体以1×1012vg/mL的浓度递送。还将对照载体AAV5-hGRK1-GFP施用于眼。
并入经修饰的和未经修饰的AAV44.9载体二者的颗粒在视网膜下注射的猕猴对象中表现出增强的侧向扩散和效力(参见图1)。泡的初始边界和所产生的GFP表达的边界在图1中以自色虚线勾勒出轮廓。相同的脉管系统以加粗的深色线突出显示以供参考。AAV44.9(E531D)介导的GFP表达在注射之后1周可见。AAV44.9和AAV44.9(E531D)二者在1×1012vg/mL剂量下在灵长类视网膜中均具有良好的耐受性。对照载体AAV5介导仍然隔离在初始注射泡内的GFP限制。
在猕猴对象中进行了AAV44.9-hGRK1-GFP(浓度为1×1012vg/mL)的中央凹外视网膜下注射。光学相干断层成像(OCT)扫描揭示在注射过程中中央凹没有脱离(图2)。即使中央凹没有脱离，这种中央凹外视网膜下注射也转导了甚至98％的中央凹视锥和100％的中央视杆(参见图3的右上方)。衣壳表现出增强的侧向扩散，因为泡的边界相对于初始边界扩大。
还从注射了AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFP的猕猴眼中捕获了图像。单眼定性分析揭示约50％的中央凹视锥转导由AAV44.9(E531D)介导。
AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFP的总共90μL体积的3次视网膜下注射(每次30μL)在猕猴眼中央凹外的上部、颞侧和下部视网膜中进行。视网膜切片用抗视锥抑制蛋白的抗体染色，三个不知情观察者在穿过中央凹窝的单个平面上对5个视网膜区域中的GFP阳性视锥和视杆进行计数。该施用的结果示出在图4中。OCT扫描揭示在注射期间中央凹没有脱离(参见图4的右图)。
这些结果表明，AAV44.9(E531D)-hGRK1-GFP在猕猴中的中央凹外视网膜下注射在没有中央凹脱离的情况下表现出显著的中央视锥和视杆细胞的转导。外围的视杆和视锥也被非常有效地转导。因此，中央凹外视网膜下注射导致整个中央凹区域上的高效转导。
如图5A至5D所示，该注射之后对中央凹旁的检查揭示，AAV44.9(E531D)颗粒转导位于中央凹窝的鼻侧和颞侧二者的中央凹旁视锥。然而，值得注意的是，用未经修饰的AAV44.9未实现中央凹旁视锥转导。这一发现是令人感兴趣的，至少因为i)中央凹旁视锥对通过多种AAV衣壳变体的转导具有抵抗力，以及ii)由于老化和遗传性视网膜疾病引起的最早的结构和功能丧失通常发生在中央凹旁区域。尽管它们在该区域转导视锥的能力不同，但经修饰和未经修饰的AAV44.9载体将中央凹旁视杆有效地转导到基本相同的程度。
如图6A至6B所示，对中央凹周围的检查揭示了类似的模式：并入AAV44.9(E531D)衣壳的颗粒转导中央凹周围视锥，但未经修饰的AAV44.9不转导。在该区域中两种衣壳均有效地转导了中央凹周围视杆。中央凹周围包围中央凹旁。
这些结果表明，由改进的AAV44.9(E531D)衣壳变体载体提供的增强的转导侧向扩散可允许在中央凹旁区域进行视网膜下注射以产生中央凹细胞的转导，同时避免在人对象中诱发中央凹脱离的有害影响。他们进一步表明了在AAV颗粒的总注射体积低至90μL(每次30μL的3次注射泡)的情况下，可实现增强的侧向扩散和转导。
材料和方法
载体产生
使用基于三重转染质粒的系统，在接种于双层细胞工厂(1,272cm2细胞生长面积)的贴壁HEK293T中将包含驱动mCherry的截短的嵌合CMV-鸡β肌动蛋白(smCBA)启动子(sc-smCBA-mCherry)的自身互补AAV构建体包装到AAV44.9、AAV44.9(Y731F)、AAV44.9(E531D)、AAV5和AAV8(Y733F)中。收获细胞并通过连续的冻融循环裂解细胞。裂解物内的病毒通过碘克沙醇密度梯度进行纯化，并进行缓冲液交换至补充有Tween 20(0.014％)的Alcon BSS中。病毒通过qPCR相对于标准进行滴定并储存在-80℃下。Y731F和E531D置换向AAV44.9衣壳的添加通过AAV2rep-44.9cap质粒的定点诱变完成，并通过Sanger测序确定。包含驱动绿色荧光蛋白(GFP)的视锥特异性IRBPe-GNAT2嵌合启动子的另外的构建体包装在AAV44.9和AAV44.9变体载体中。
体外转导测定
ARPE-19(人视网膜色素上皮细胞系)和661W(小鼠视锥细胞系)细胞以1.0×104个细胞/孔的浓度接种于96孔板中。第二天，细胞以10,000p/细胞感染。感染之后三天，在固定曝光下进行荧光显微镜检查，分离细胞并使用流式细胞术通过荧光来定量报道蛋白表达(mCherry)。通过将平均mCherry荧光乘以阳性细胞数来计算mCherry表达。图表仅代表表达水平减去细胞水平。
注射
将1μL中2×109vg的含载体溶液经玻璃体内或视网膜下递送至猕猴视网膜。在每个实验中至少分析了6只接受成功注射的眼。
眼底检查
在注射之后4周，使用Micron III相机(Phoenix Research Laboratories，Pleasanton，CA)进行眼底检查。分别采集明场和红色荧光图像以使视网膜健康和mCherry表达可视化。实验之间的曝光设置是恒定的，并在附图说明中指出。
通过流式细胞术测量视网膜转导
收获每组群4至6个Nrl-GFP眼的神经视网膜(具有从视网膜手动剥离的RPE)并用木瓜蛋白酶解离。对经处理的解离的视网膜和未经处理的对照进行流式细胞术，以量化对GFP(视杆光感受器)、mCherry(由rAAV转导的非视杆视网膜神经元)或二者(由rAAV转导的视杆光感受器)呈阳性的细胞百分比。由每个载体转导的视杆和非视杆神经视网膜细胞的百分比分别进行平均。
组织制备和免疫染色
注射之后4周，将眼摘除，在4℃下在新鲜制备的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的4％多聚甲醛(PFA)中固定过夜。去除角膜和晶状体，将眼杯在30％蔗糖溶液中在4℃下孵育过夜。将眼包埋在低温恒温器化合物中并在-80℃下冷冻。使用低温恒温器(Leica Microsystem，Buffalo Grove，IL)切割切片(12μm厚)并转移到载玻片上。视网膜冷冻切片用1×磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗，用0.5％Triton-X100和1％牛血清白蛋白(BSA)各封闭1小时，然后在4℃下用小鼠单克隆抗视锥抑制蛋白抗体(1∶1000，由Clay Smith博士惠赠)孵育过夜。第二天用1×PBS冲洗载玻片，然后在室温下用Alexa Fluor驴抗小鼠二抗(1∶500)在1×PBS中孵育1小时，并用DAPI复染。使用共聚焦激光扫描显微镜(Leica TCS SP8)和荧光显微镜(EVOS)获取图像。
实施例2-视网膜劈裂症小鼠的自然史研究
对RS1敲除(knockout，KO)小鼠进行了5个月的自然史研究以确定小鼠表现出XLRS的特征表型。通过ERG观察小鼠的异常视网膜功能，并且通过OCT测量视网膜结构中的劈裂形成。在每个月底进行测量，持续五个月。参见图9A至9E和图10至13。将评分进行平均以生成单个视网膜的总体腔评分。将小鼠分组到以下组群中：
●雄性Rs1半合子(Rs1-/y)KO(患病)
●雌性Rs1纯合KO(患病)
●雄性Rs1+/y野生型(正常)
●雌性Rs1+/-杂合子(正常)
将单个组群的小鼠在1月龄时处死，并通过免疫组织化学针对表达视网膜劈裂蛋白(RS1)对其视网膜进行评价。结果在图18A至18C和20中示出。
为了解释OCT结果，使用针对劈裂腔严重程度的分级系统(0至4)，其中0等于无劈裂腔并且4是最高的腔计数。针对研究的5个月中的每月的OCT测量和劈裂腔评分图在图17A和图18A至18C中示出。分级系统限定如下：
0：无劈裂腔；1：单独的劈裂腔；2：多个小劈裂腔；3：具有一些连通的多个中等劈裂腔；4：具有一些连通的大且多的劈裂腔
自然史研究表明，RS1 KO小鼠的腔评分在2至3个月时达到峰值，并随后随时间而改善。IHC测量表明RS1表达在雌性杂合和野生型雄性小鼠中定位于光感受器的内段/外段连接处，而在雄性和雌性Rs1 KO小鼠中不存在。
实施例3-AAV衣壳在合成hRS1向视网膜劈裂症小鼠的视网膜下递送中的治疗效力的评价
在五个月的研究中评价了多剂量rAAV颗粒中的多种AAV衣壳(包括AAV44.9(E531D))相对于AAV5衣壳在视网膜和RPE中的生物分布。将包含所评价衣壳之一的rAAV颗粒施用于Rs1敲除小鼠。
将颗粒以1μL的5×1012个载体基因组(vector genome，VG)/mL的剂量施用于四个组群中的每一个中的四只小鼠。因此，总共5×109个载体基因组递送至每只动物。将颗粒通过视网膜下注射施用到OD眼中，并且不处理对侧眼。
评价了表达合成人合成人RS1转基因的rAAV载体的视网膜下注射是否可以为RS1敲除(RS1 KO)小鼠提供治疗效力。该合成转基因是经截短的，缺乏5’和3’非翻译区(UTR)，使得其仅包含RS1的编码区。该转基因的核苷酸序列在上面作为SEQ ID NO：8提供。在一些实验中，转基因是经myc标记的(参见SEQ ID NO：10的核苷酸序列)。
在另一些实验中，合成转基因还具有已从编码序列中去除的四个CpG岛，并且合成转基因针对人表达进行了密码子优化(参见SEQ ID NO：10的核苷酸序列)。
对数种不同的衣壳针对在PR中诱导最强的生物分布进行了评价。将rAAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1和rAAV5-hGRK1-hRS1载体施用于RS1 KO小鼠，其恢复了视网膜功能和结构。这两种衣壳都具有可操作地控制hRS1转基因的hGRK1启动子。将结果与用基准载体rAAV5-CBA-hRS1处理的RS1 KO小鼠中的结果和对侧(OS)未经处理的眼的结果(在所有组中)进行比较。
包含携带hGRK1-hRS1的AAV44.9(E531D)衣壳的病毒颗粒成功转导了光感受器细胞并在这些细胞中提供了治疗水平的人视网膜劈裂蛋白。令人惊讶的是，视网膜劈裂腔早在rAAV注射之后一个月在所有经处理的眼中完全消退。同样，早在rAAV注射之后一个月，在所有经处理的眼中视网膜功能都显著改善。表1(下)示出了来自第1至4组的小鼠中的6个月ERG和OCT数据，以及来自第6和第7组的小鼠中的4个月ERG和OCT数据。“vg”＝载体基因组；“-N*”表示用于IHC的死亡或处死的动物数量(N)。
确定了人视紫红质激酶启动子(hGRK1)为在经处理眼的PR中介导治疗水平的人RS1表达的最强评价启动子。
另外，在RS1-KO缺陷小鼠(半合子Rs1-/y雄性)中进行了1个月的概念验证(proof-of-concept，POC)研究，该研究评价了视网膜下递送的AAV5或AAV44.9(E531D)(其包含驱动hRS1syn基因的hGRK1或泛CBA启动子)对视网膜和功能结构的影响。在出生后第25天(P25)施用单剂量(2.3×1012vg/mL；2.3×109vg/眼)的rAAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn、rAAV5-hGRK1-hRS1syn或AAV5-CBA-hRS1syn。选择P25时间点，因为其对应于不成熟的成人(青少年早期)，在该时间点预期XLRS患者将接受治疗。对侧眼保持未注射。注射之后在1个月，分别通过光学相干断层成像(OCT)和视网膜电图(ERG)评估视网膜结构和功能。此后立即对小鼠实施安乐死，并将来自所有组中的小鼠的两只眼收集、固定、冷冻保护并用免疫组织化学进行评价。图16示出了通过OCT分析在注射之后1个月时经rAAV处理的RS1-KO小鼠中视网膜结构的恢复(在用所有三种载体处理的RS1-KO小鼠中劈裂腔完全消退)。此外，相对于未注射的对照，在用所有载体处理的RS1-KO小鼠眼中视杆和视锥介导的视网膜功能得到改善。免疫组织化学分析揭示了在经处理的视网膜横切片中的光感受器内段中存在RS1表达。对侧未经处理的眼不存在RS1表达。这些结果表明两种衣壳rAAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn、rAAV5-hGRK1-hRS1syn都是有效的，并且在用包含光感受器特异性hGRK1启动子和遍在CBA启动子处理之后的结局是类似的。使用hGRK1对预期靶标(光感受器)的有限表达进行了进一步的研究，从而通过避免脱靶表达来提供另外的安全特征。1个月时的相关ERG测量在图17B中示出。左眼和右眼的OCT数据的比较在图19中示出。
在POC研究之后，在RS1-KO小鼠中进行了6个月的药理学研究，以评价单次视网膜下施用包含驱动hRS1syn基因的hGRK1启动子的AAV5或AAV44.9(E531D)衣壳(分别为rAAV5-hGRK1-hRS1syn或rAAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn)之后视网膜结构和功能的剂量响应改善。将小鼠在P24和P26之间在一只眼中以低(1.4×1011vg/ml；1.4×108vg/眼)、中(4.7×1011vg/ml；4.7×108vg/ml)或高(1.4×1012vg/ml；1.4×109vg/眼)剂量经视网膜下注射载剂AAV5或AAV44.9(E531D)。对侧眼保持未注射。在6个月的过程中每月分别通过OCT和ERG评估视网膜结构和功能。注射之后6个月时实施安乐死之后，将视网膜冷冻切片并通过免疫组织化学评价RS1表达。
OCT分析揭示了在注射之后一个月时开始用两种载体以所有剂量处理的RS1-KO小鼠中劈裂腔稳定消退。观察到明显的剂量响应，因为观察到与在低剂量组中相比，在两个较高剂量组群中视网膜劈裂症评分较低。用两种载体以所有剂量(包括低剂量)处理之后，还观察到视杆和视锥介导的ERG功能二者均显著改善。对于暗视b波振幅，观察到经rAAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn处理的动物与经载剂处理的动物之间存在显著差异的时间点的数目从以低剂量处理的动物的3个时间点(2、5、6个月)、以中剂量处理的动物的4个时间点(2、3、5、6个月)提高到以高剂量处理的动物的所有6个时间点。对明视b波振幅进行了类似的观察。这些数据表明rAAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn在校正RS1-KO小鼠视网膜功能方面存在剂量响应。在注射了rAAV5-hGRK1-hRS1syn的动物中看到类似的观察结果。免疫组织化学分析揭示了在来自经处理的RS1-KO小鼠眼的视网膜横切片中的光感受器内段中存在RS1表达。对侧未经处理的眼和仅用载剂处理的眼均不存在RS1表达。
第1至6个月中每个月的ERG测量结果分别在图20至25中示出。由第6组和第7组的ERG测量确定的经注射病毒相对于载体的b波的统计分析在图26至30中示出。注射之后在第4个月时间点的IHC测量在图31中示出。
总之，这些研究结果表明，1)在RS1-KO小鼠中，rAAV5和rAAV44.9(E531D)载体的视网膜下注射在一定剂量范围具有相当的效力，2)在RS1-KO小鼠中，观察到rAAV44.9(E531D)-hGRK1-hRS1syn和rAAV5-hGRK1-hRS1syn二者均与结构和功能缺陷的校正之间存在剂量响应关系。确定了最小有效剂量(minimal effective dose，MED)为约1.4×1011vg/ml(1.4×108vg/眼)。此外，3)光感受器特异性hGRK1启动子在经处理小鼠中驱动治疗水平的RS1表达。
另外的研究评价了在具有和不具有诱导的视网膜劈裂症的非人灵长类中具有最佳衣壳的rAAV颗粒的剂量范围转导和生物分布。另外的研究将涉及施用具有土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)的克隆AAV-hGRK1-hRS1载体，其中WPRE施用是安全的(“WPREsf”)。预想，该构建体将导致RS1的更高表达，使得能够降低载体剂量以进一步改善这些眼部基因治疗的安全性谱。
表1.小鼠中的ERG/OCT数据
实施例4-具有填充序列的含hRS1的rAAV载体的评价
进行本研究以评价经优化的含hRS1的AAV44.9(E531D)载体，其基因组尺寸有助于有效包装。目标是确定至少与rAAV44.9(E531D)-X001一样有效的构建体。
由于pTR-X001的包装尺寸小(1723bp)，并且可能进行异源基因组包装，因此设计了数种新的构建体，其盒尺寸接近AAV的天然携带能力(约4.7Kb ITR至ITR盒)。这通过添加插入在载体盒hGRK1-hRS1syn-bGH polyA内的5’(X001-5p)或3’(X001-3p)(分别为pTR-X001-5p和pTR-X001-3p)的惰性填充序列实现。从头合成填充DNA(Genscript，NJ)。另外，产生了并入位于hRS1syn和bGH polyA之间的土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)的形式(pTR-X002-3p)。所用WPRE的突变形式先前已并入在用于其他眼部基因治疗临床试验的AAV载体中。所有构建体均包含相同的hGRK1启动子、SV40 SD/SA和bGH polyA信号序列。通过包装这些表达盒产生rAAV44.9(E531D)载体，并且载体基因组的尺寸范围为4534至4549个核苷酸。所评价的多个构建体在图15D至15F示出。
使用两种载体剂量进行了3个月的非临床研究，以测试RS1-KO小鼠中视网膜结构/功能的恢复。“未填充”载体pTR-X001(rAAV44.9(E531D)-X001)包括在内作为比较对照，该载体在较早描述的RS1-KO小鼠研究中挽救了视网膜结构/功能。
表2示出了盒选择研究设计的总结。将RS1-KO小鼠在一只眼中经视网膜下注射载剂(第1组)、rAAV44.9(E531D)-X001(第2和3组)、rAAV44.9(E531D)-X001-3p(第4和5组)、rAAV44.9(E531D)-X001-5p(第6和7组)或rAAV44.9(E531D)-X002-3p(第8和9组)载体。载体以以下递送：1.0×1011vg/mL，1.0×108vg/眼(第2、4、6、8组)；或5.0×1011vg/mL，5.0×108vg/眼(第3、5、7、9组)。对侧眼保持未注射。在注射之后约1个月和2个月时分别通过OCT和ERG评估视网膜结构和功能。注射之后约3个月时对动物实施安乐死。安乐死之后，将视网膜冷冻切片并通过免疫组织化学针对RS1表达进行评价。
表1.研究设计
OCT分析揭示了在经载体处理的眼中劈裂腔消退(图32)。除了用低剂量的rAAV44.9(E531D)-X001-5p处理并在注射之后1个月评价的眼之外，在两个时间点在载剂和载体处理的眼之间视网膜劈裂症评分存在统计学上显著的差异。在1×1011vg/mL(1.0×108vg/眼)的浓度下，相对于仅注射载剂的眼，rAAV44.9(E531D)-X002-3p导致视杆和视锥介导的功能的显著改善(图33A)。在5×1011vg/mL(5.0×108vg/眼)的较高浓度下，所有三种填充构建体相对于经载剂注射的对照赋予了视网膜功能的显著改善(图33B)。在该较高剂量下，观察到注射携带填充与未填充构建体的rAAV44.9(E531D)的眼之间的ERG振幅没有显著差异。
免疫组织化学分析揭示了在来自用rAAV44.9(E531D)-X002-3p处理的RS1-KO小鼠眼的视网膜光感受器内段中存在RS1表达。对侧未经处理的眼和仅用载剂处理的眼中不存在RS1表达(图34A和34B)。
实施例5-用pTR-X002-3pSR治疗XLRS
用本申请的载体(包括pTR-X002-3pSR)在RS1-KO小鼠中进行多种药理学研究。这些研究确定了由AAV44.9(E531D)衣壳介导的光感受器转导和由光感受器特异性hGRK1启动子驱动的RS1表达以剂量依赖性方式稳定地恢复了RS1-KO小鼠的视网膜结构和功能。
pTR-X002-3pSR包含在人视紫红质激酶(hGRK1)启动子的转录控制下的RS1 cDNA用于在视杆和视锥光感受器中特异性表达。hGRK1启动子与SV40剪接供体/剪接受体偶联，后者在去除SV40内含子之后促进mRNA转运至胞质。通过在紧接hRS1syn起始密码子之前并入共有Kozak序列，翻译得到增强。合成人RS1基因相对于NCBI参考序列包含四个沉默变化，并且仅限于编码区。该载体还包含土拨鼠肝炎病毒翻译后调节元件(WPRE)的mut6形式以增强RS1蛋白的表达。该WPRE包含旨在消除推定的X蛋白ORF表达的突变。表达盒还包含牛生长激素多腺苷酸化信号(bGH poly A)。由于具有用于异源包装潜力的启动子-治疗性载体的包装尺寸小(1723bp)，插入惰性载体盒填充序列以达到4549bp(ITR至ITR)的盒尺寸。将该盒包装到pTR-X002-3pSR中并且显示出与RS1-KO小鼠模型中未填充盒相比的效力改善。载体基因组的示意图在图15F中示出，并且从ITR到ITR的序列作为SEQ ID NO：33提供。序列元件的描述在表3中示出。
表3.pTR-X002-3pSR盒元件的描述
# 特征 开始 结束 名称 描述
1 区域 1 145 ITR AAv2反向末端重复
2 区域 165 456 hGRK1启动子 人视紫红质激酶启动子
3 区域 457 620 SV40 SD/SA 猿猴病毒40剪接受体/供体和内含子
4 区域 654 662 Kozak 共有Kozak序列
5 基因 663 I337 hRS1syn 人视网膜劈裂蛋白I开放阅读框
6 区域 1339 1925 WPRE 土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件
7 区域 1927 2155 bGH PolyA 牛生长激素多腺苷酸化信号
8 区域 2156 4389 载体填充子 惰性载体填充DNA序列
9 区域 4405 4549 ITR AAV2反向末端重复
将pTR-X002-3pSR与AAV衣壳变体AAV44.9(E531D)一起施用，以在眼中向光感受器引入人视网膜膜劈裂蛋白(RS1)基因，以在患有X连锁视网膜劈裂症(XLRS)的患者中恢复或减轻视觉恶化。AAV44.9(E531D)比基准衣壳更有效，并且不同于其他AAV，AAV44.9(E531D)在经视网膜下注射的食蟹猴中有效地转导中央凹旁视锥，并且能够转导黄斑/中央凹而不需要脱离。另外，辅助质粒可用于向细胞提供来自腺病毒5型的E2a、E4和VA RNA辅助基因，以产生支持载体而不需要野生型病毒共感染。示例性辅助质粒可以是商业来源的，例如，来自Aldvron(Fargo，ND)。
另外的实施方案
应当理解，本文中描述的实施例和实施方案仅用于举例说明目的，本领域技术人员可根据其提出多种修改或变化，并且这些修改或变化包括在本申请的精神和范围内和所附权利要求书的范围内。本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利，均通过引用并入于此，其程度就如同每篇参考文献被单独且具体地指示为通过引用并入并在本文中整体阐述一样。除非在本文中另有说明，否则本文对数值范围的引用仅旨在用作单独提及落入该范围内的每个单独值的速记方法，并且将每个单独值并入说明书中，就好像其在本文中单独引用一样。除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则在本文中使用例如“包含”、“具有”、“包括”或“包含”的关于一个或更多个元素的术语对本发明的任何方面或实施方案的描述旨在为“由一个或更多个特定元素组成”、“基本上由一个或更多个特定元素组成”或“基本上包含一个或更多个特定元素”的本发明类似方面或实施方案提供支持(例如，本文描述为包含特定元素的组合物应理解为也描述了由该元素组成的组合物，除非另有说明或与上下文明显矛盾)。
根据本公开内容，本文公开和要求保护的所有组合物和方法可在没有过度实验的情况下制备和实施。虽然本发明的组合物和方法已经根据一些优选实施方案进行了描述，但对于本领域技术人员来说明显的是，在不脱离本发明的概念、精神和范围的情况下，可对本文所述的组合物和方法以及方法的步骤或步骤顺序进行变化。更具体地，明显的是，某些化学和/或生理学相关的药剂可替代本文所述的药剂，同时将获得相同或类似的结果。所有这些对本领域技术人员来说明显的类似替代和修改都被认为在所附权利要求书所限定的本发明的精神、范围和概念之内。
以下编号的实施方案旨在是示例性的：
1.腺相关病毒(AAV)载体，其包含含有以下的多核苷酸：编码视网膜劈裂蛋白的异源核酸和SV40内含子。
2.实施方案1所述的AAV载体，其中所述SV40内含子包含剪接供体区和/或剪接受体区。
3.实施方案1或2所述的AAV载体，其中所述SV40内含子包含与SEQ ID NO：20的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
4.实施方案1或2所述的AAV载体，其中所述SV40内含子包含SEQ ID NO：20的核酸序列。
5.实施方案1至4中任一个所述的AAV载体，其中所述视网膜劈裂蛋白是人视网膜劈裂蛋白。
6.实施方案1至5中任一个所述的AAV载体，其中所述异源核酸不包含人视网膜劈裂蛋白的5’非翻译区。
7.实施方案6所述的AAV载体，其中所述5’非翻译区包含SEQ ID NO：39的核酸序列。
8.实施方案1至7中任一个所述的AAV载体，其中所述核酸不包含人视网膜劈裂蛋白的3’非翻译区。
9.实施方案8所述的AAV载体，其中所述3’非翻译区包含SEQ ID NO：40的核酸序列。
10.重组AAV(rAAV)载体，其包含含有异源核酸的多核苷酸，所述异源核酸包含与SEQ ID NO：8的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、92.5％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
11.实施方案1至10中任一个所述的rAAV载体，其中所述异源核酸包含SEQ ID NO：8、9或10所示的核酸序列。
12.实施方案1至11中任一个所述的rAAV载体，其中所述异源核酸与指导所述异源核酸在光感受器细胞或视网膜色素上皮细胞中表达的一种或更多种调节元件可操作地连接。
13.实施方案1至12中任一个所述的rAAV载体，其中所述视网膜劈裂蛋白包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
14.实施方案1至13中任一个所述的rAAV载体，其中所述视网膜劈裂蛋白包含SEQID NO：12的氨基酸序列。
15.实施方案1至14中任一个所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸包含启动子。
16.实施方案15所述的rAAV载体，其中所述启动子选自视紫红质激酶启动子、视紫红质启动子、IRBP启动子、嵌合人视网膜劈裂蛋白-IRBP增强子(RS/IRPB)、红/绿视锥视蛋白启动子、视锥抑制蛋白启动子、嵌合IRBP增强子-视锥转导蛋白启动子、鸡β肌动蛋白启动子和截短的嵌合鸡β肌动蛋白(smCBA)启动子。
17.实施方案15或16所述的rAAV载体，其中所述启动子是视紫红质激酶启动子。
18.实施方案15至17中任一个所述的rAAV载体，其中所述启动子是人视紫红质激酶(hGRK1)启动子。
19.实施方案15至18中任一个所述的rAAV载体，其中所述启动子包含与SEQ IDNO：7具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
20.实施方案15至18中任一个所述的rAAV载体，其中所述启动子包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
21.实施方案1至20中任一个所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸包含WPRE元件。
22.实施方案21所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件包含与SEQ ID NO：15具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列，或包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列。
23.实施方案21或22所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件位于所述异源核酸的3’。
24.实施方案1至23中任一个所述的rAAV载体，其中所述载体是自身互补的。
25.实施方案1至24中任一个所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸的侧翼是一个或更多个反向末端重复(ITR)。
26.实施方案25所述的rAAV载体，其中所述一个或更多个ITR序列包含第一ITR序列和第二ITR序列。
27.实施方案26所述的rAAV载体，其中所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO：22至23中任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
28.实施方案26或27所述的rAAV载体，其中所述第一ITR序列包含SEQ ID NO：22至23中任一者的核酸序列。
29.实施方案26至28中任一个所述的rAAV载体，其中所述第二ITR序列包含与SEQID NO：24至25中任一者具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
30.实施方案26至29中任一个所述的rAAV载体，其中所述第二ITR序列包含SEQ IDNO：24至25中任一者的核酸序列。
31.实施方案1至30中任一个所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸还包含多腺苷酸化信号。
32.实施方案31所述的rAAV载体，其中所述多腺苷酸化信号选自牛生长因子激素多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号、人生长因子激素多腺苷酸化信号和rbGlob多腺苷酸化信号。
33.实施方案32所述的rAAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含牛生长因子多腺苷酸化信号。
34.实施方案31至33中任一个所述的rAAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO：19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
35.实施方案31至34中任一个所述的rAAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含SEQID NO：19。
36.实施方案1至35中任一个所述的rAAV载体，其中所述载体包含与SEQ ID NO：16、17和31至35中任一者的核苷酸序列具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
37.实施方案1至36中任一个所述的rAAV载体，其中所述载体包含SEQ ID NO：16、17和31至35中任一者的核苷酸序列中的任一种。
38.实施方案1至37中任一个所述的rAAV载体，其中所述SV40内含子位于所述异源核酸的5’。
39.实施方案1至38中任一个所述的rAAV载体，其中所述SV40内含子位于所述启动子的3’。
40.实施方案1至39中任一个所述的rAAV载体，其中所述SV40内含子位于所述启动子和所述异源核酸之间。
41.实施方案1至40中任一个所述的rAAV载体，其中所述SV40内含子位于所述异源核酸的3’。
42.AAV载体，其包含含有异源核酸的多核苷酸，所述异源核酸编码与视紫红质激酶启动子可操作地连接的视网膜劈裂蛋白。
43.实施方案42所述的rAAV载体，其中所述启动子是人视紫红质激酶(hGRK1)启动子。
44.实施方案42或实施方案43所述的AAV载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO：7具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
45.实施方案42至44中任一个所述的AAV载体，其中所述启动子包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
46.实施方案42至45中任一个所述的AAV载体，其包含多腺苷酸化信号。
47.实施方案46所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号选自牛生长因子激素多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号、人生长因子激素多腺苷酸化信号和rbGlob多腺苷酸化信号。
48.实施方案47所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含牛生长因子多腺苷酸化信号。
49.实施方案46至48中任一个所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO：19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
50.实施方案46至49中任一个所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含SEQID NO：19。
51.实施方案42至50中任一个所述的AAV载体，其包含一个或更多个ITR。
52.实施方案51所述的AAV载体，其中所述一个或更多个ITR包含第一ITR序列和第二ITR序列。
53.实施方案52所述的AAV载体，其中所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO：22至23具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
54.实施方案52或53所述的AAV载体，其中所述第一ITR序列包含SEQ ID NO：22至23的核酸序列。
55.实施方案52至54中任一个所述的AAV载体，其中所述第二ITR序列包含与SEQID NO：24至25具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
56.实施方案52至55中任一个所述的AAV载体，其中所述第二ITR序列包含SEQ IDNO：24至25的核酸序列。
57.实施方案42至56中任一个所述的rAAV载体，其包含WPRE元件。
58.实施方案57所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件包含与SEQ ID NO：15具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
59.实施方案58所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列。
60.实施方案57至59中任一个所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件位于所述异源核酸的3’。
61.AAV载体，其包含含有异源核酸和多腺苷酸化信号的多核苷酸，所述异源核酸编码视网膜劈裂蛋白。
62.实施方案61所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号选自牛生长因子激素多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号、人生长因子激素多腺苷酸化信号和rbGlob多腺苷酸化信号。
63.实施方案62所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含牛生长因子多腺苷酸化信号。
64.实施方案61至63中任一个所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO：19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
65.实施方案61至64中任一个所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含SEQID NO：19。
66.实施方案61至65中任一个所述的AAV载体，其包含一个或更多个ITR。
67.实施方案66所述的AAV载体，其中所述一个或更多个ITR包含第一ITR序列和第二ITR序列。
68.实施方案67所述的AAV载体，其中所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO：22至23具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
69.实施方案67或68所述的AAV载体，其中所述第一ITR序列包含SEQ ID NO：22至23的核酸序列。
70.实施方案67至69中任一个所述的AAV载体，其中所述第二ITR序列包含与SEQID NO：24至25具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
71.实施方案67至70中任一个所述的AAV载体，其中所述第二ITR序列包含SEQ IDNO：24至25的核酸序列。
72.实施方案61至71中任一个所述的rAAV载体，其包含WPRE元件。
73.实施方案72所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件包含与SEQ ID NO：15具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
74.实施方案73所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列。
75.实施方案72至74中任一个所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件位于所述异源核酸的3’。
76.实施方案61至75中任一个所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸包含启动子。
77.实施方案76所述的rAAV载体，其中所述启动子选自视紫红质激酶启动子、视紫红质启动子、IRBP启动子、RS/IRPB启动子、红/绿视锥视蛋白启动子、视锥抑制蛋白启动子、嵌合IRBP增强子-视锥转导蛋白启动子、鸡β肌动蛋白启动子和smCBA启动子。
78.实施方案76所述的AAV载体，其中所述启动子是视紫红质激酶启动子。
79.实施方案78所述的rAAV载体，其中所述启动子是人视紫红质激酶(hGRK1)启动子。
80.实施方案76至79中任一个所述的AAV载体，其中所述启动子包含与SEQ ID NO：7具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
81.实施方案76至80中任一个所述的AAV载体，其中所述启动子包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
82.AAV载体，其包含i)多核苷酸，所述多核苷酸包含编码视网膜劈裂蛋白的异源核酸，和ii)一个或更多个ITR。
83.实施方案82所述的AAV载体，其中所述一个或更多个ITR包含第一ITR序列和第二ITR序列。
84.实施方案83所述的AAV载体，其中所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO：22至23具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
85.实施方案83或84所述的AAV载体，其中所述第一ITR序列包含SEQ ID NO：22至23的核酸序列。
86.实施方案83至85中任一个所述的AAV载体，其中所述第二ITR序列包含与SEQID NO：24至25具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
87.实施方案83至86中任一个所述的AAV载体，其中所述第二ITR序列包含SEQ IDNO：24至25的核酸序列。
88.实施方案82至87中任一个所述的AAV载体，其包含多腺苷酸化信号。
89.实施方案88所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号选自牛生长因子激素多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号、人生长因子激素多腺苷酸化信号和rbGlob多腺苷酸化信号。
90.实施方案89所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含牛生长因子多腺苷酸化信号。
91.实施方案88至90中任一个所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO：19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
92.实施方案88至91中任一个所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含SEQID NO：19。
93.实施方案82至92中任一个所述的rAAV载体，其包含WPRE元件。
94.实施方案93所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件包含与SEQ ID NO：15具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
95.实施方案94所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列。
96.实施方案93至95中任一个所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件位于所述异源核酸的3’。
97.实施方案82至96中任一个所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸包含启动子。
98.实施方案97所述的rAAV载体，其中所述启动子选自视紫红质激酶启动子、视紫红质启动子、IRBP启动子、RS/IRPB启动子、红/绿视锥视蛋白启动子、视锥抑制蛋白启动子、嵌合IRBP增强子-视锥转导蛋白启动子、鸡β肌动蛋白启动子和smCBA启动子。
99.实施方案97所述的AAV载体，其中所述启动子是视紫红质激酶启动子。
100.实施方案99所述的rAAV载体，其中所述启动子是人视紫红质激酶(hGRK1)启动子。
101.实施方案97至100中任一个所述的AAV载体，其中所述启动子包含与SEQ IDNO：7具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
102.实施方案97至101中任一个所述的AAV载体，其中所述启动子包含SEQ ID NO：7的核酸序列。
103.AAV载体，其包含i)多核苷酸，所述多核苷酸包含编码视网膜劈裂蛋白的异源核酸，和ii)WPRE元件。
104.实施方案103所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件包含与SEQ ID NO：15具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
105.实施方案104所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件包含SEQ ID NO：15的核苷酸序列。
106.实施方案103至105中任一个所述的rAAV载体，其中所述WPRE元件位于所述异源核酸的3’。
107.实施方案103至106中任一个所述的AAV载体，其包含一个或更多个ITR。
108.实施方案107所述的AAV载体，其中所述一个或更多个ITR包含第一ITR序列和第二ITR序列。
109.实施方案108所述的AAV载体，其中所述第一ITR序列包含与SEQ ID NO：22至23具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
110.实施方案108或109所述的AAV载体，其中所述第一ITR序列包含SEQ ID NO：22至23的核酸序列。
111.实施方案108至110中任一个所述的AAV载体，其中所述第二ITR序列包含与SEQ ID NO：24至25具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
112.实施方案108至111中任一个所述的AAV载体，其中所述第二ITR序列包含SEQID NO：24至25的核酸序列。
113.实施方案103至112中任一个所述的AAV载体，其包含多腺苷酸化信号。
114.实施方案113所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号选自牛生长因子激素多腺苷酸化信号、SV40多腺苷酸化信号、人生长因子激素多腺苷酸化信号和rbGlob多腺苷酸化信号。
115.实施方案114所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含牛生长因子多腺苷酸化信号。
116.实施方案113至115中任一个所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含与SEQ ID NO：19具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
117.实施方案113至116中任一个所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含SEQ ID NO：19。
118.实施方案103至117中任一个所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸包含启动子。
119.实施方案118所述的rAAV载体，其中所述启动子选自视紫红质激酶启动子、视紫红质启动子、IRBP启动子、RS/IRPB启动子、红/绿视锥视蛋白启动子、视锥抑制蛋白启动子、嵌合IRBP增强子-视锥转导蛋白启动子、鸡β肌动蛋白启动子和smCBA启动子。
120.实施方案118所述的AAV载体，其中所述启动子是视紫红质激酶启动子。
121.实施方案118至120中任一个所述的rAAV载体，其中所述启动子是人视紫红质激酶(hGRK1)启动子。
122.实施方案118至121中任一个所述的AAV载体，其中所述启动子包含与SEQ IDNO：7具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。
123.实施方案118至122中任一个所述的AAV载体，其中所述启动子包含SEQ IDNO：7的核酸序列。
124.实施方案42至123中任一个所述的AAV载体，其中所述多核苷酸还包含SV40内含子。
125.实施方案124所述的AAV载体，其中所述SV40内含子包含剪接供体区和/或剪接受体区。
126.实施方案124或125所述的AAV载体，其中所述SV40内含子包含与SEQ ID NO：20的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
127.实施方案126所述的AAV载体，其中所述SV40内含子包含SEQ ID NO：20的核酸序列。
128.实施方案42至127中任一个所述的AAV载体，其中所述视网膜劈裂蛋白是人视网膜劈裂蛋白。
129.实施方案42至128中任一个所述的AAV载体，其中所述异源核酸不包含人视网膜劈裂蛋白的5’非翻译区。
130.实施方案129所述的AAV载体，其中所述5’非翻译区包含SEQ ID NO：39的核酸序列。
131.实施方案42至130中任一个所述的AAV载体，其中所述核酸不包含人视网膜劈裂蛋白的3’非翻译区。
132.实施方案131所述的AAV载体，其中所述3’非翻译区包含SEQ ID NO：40的核酸序列。
133.实施方案42至132中任一个所述的rAAV颗粒，其中所述异源核酸包含SEQ IDNO：8、9或10所示的核酸序列。
134.实施方案42至133中任一个所述的AAV载体，其中所述视网膜劈裂蛋白包含与SEQ ID NO：12的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
135.实施方案42至134中任一个所述的AAV载体，其中所述视网膜劈裂蛋白包含SEQ ID NO：12的氨基酸序列。
136.实施方案42至135中任一个所述的AAV载体，其中所述多核苷酸包含剪接供体区和/或剪接受体区。
137.实施方案1至136中任一个所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含第一ITR和第二ITR，并且所述第一ITR与所述第二ITR之间的AAV载体长度为约2000个核苷酸至约6000个核苷酸。
138.实施方案137所述的AAV载体，其中所述第一ITR与所述第二ITR之间的AAV载体长度为约3000个核苷酸至约5000个核苷酸。
139.实施方案138所述的AAV载体，其中所述第一ITR与所述第二ITR之间的AAV载体长度为约4000个核苷酸至约5000个核苷酸。
140.实施方案139所述的AAV载体，其中所述第一ITR与所述第二ITR之间的AAV载体长度为约4500个核苷酸。
141.实施方案1至140中任一个所述的AAV载体，其中所述AAV载体包含填充序列。
142.AAV载体，其包含含有以下的多核苷酸：编码人视网膜劈裂蛋白的核酸，和填充序列。
143.实施方案141或142所述的AAV载体，其中所述填充序列的长度为约1000个核苷酸至约4000个核苷酸。
144.实施方案141至143中任一个所述的AAV载体，其中所述填充序列的长度为2000个核苷酸至约3000个核苷酸。
145.实施方案141至144中任一个所述的AAV载体，其中所述填充序列的长度为约2800个核苷酸。
146.实施方案141至144中任一个所述的AAV载体，其中所述填充序列的总长度为约2200个核苷酸。
147.实施方案141至146中任一个所述的AAV载体，其中所述填充序列包含与SEQID NO：26至30中任一者的至少100个连续碱基约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列。
148.实施方案141至147中任一个所述的AAV载体，其中所述填充序列位于所述异源核酸的3’。
149.实施方案141至147中任一个所述的AAV载体，其中所述填充序列位于所述异源核酸的5’。
150.实施方案141至149中任一个所述的AAV载体，其中所述填充序列位于ITR序列之间。
151.核酸填充序列，其包含与SEQ ID NO：26至30中任一者的至少100个连续碱基约或至少约80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的序列。
152.AAV载体，其包含实施方案151所述的核酸填充序列。
153.AAV颗粒，其包含实施方案1至152中任一个所述的AAV载体以及衣壳。
154.实施方案153所述的AAV颗粒，其中所述衣壳选自AAV44.9(E531D)、AAV44.9(T492V+E531D)、AAV44.9(Y446F+E531D)、和AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)、AAV5及其变体、AAV7及其变体、AAV8及其变体、AAV9及其变体、AAV2(4pMut)AHS、AAV44.9、AAV8(Y447F+Y733F+T494V)、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.74、AAV2TT、AAV2HBKO、AAVAnc80、DGE-DF、P2-V2、P2-V3和ME-B(Y-F+T-V)。
155.实施方案153所述的AAV颗粒，其中所述AAV衣壳选自AAV44.9(E531D)、AAV44.9(T492V+E531D)、AAV44.9(Y446F+E531D)和AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)。
156.实施方案153所述的AAV颗粒，其中所述AAV衣壳是AAV44.9(E531D)。
157.实施方案153所述的AAV颗粒，其中所述AAV衣壳选自DGE-DF、P2-V2、P2-V3和ME-B(Y-F+T-V)。
158.实施方案153所述的AAV颗粒，其中所述AAV衣壳包含AAV5衣壳蛋白或其变体。
159.组合物，其包含实施方案153至158中任一个所述的AAV颗粒以及可药用载体、缓冲剂、稀释剂或赋形剂或者其任意组合。
160.细胞，其包含实施方案1至152中任一个所述的AAV载体、实施方案153至158中任一个所述的AAV颗粒或实施方案159所述的组合物。
161.用于对细胞进行转导的方法，所述方法包括向所述细胞施用实施方案1至152中任一个所述的AAV载体、实施方案153至158中任一个所述的AAV颗粒或实施方案159所述的组合物。
162.实施方案160或161所述的方法，其中所述细胞是光感受器细胞。
163.实施方案160或161所述的方法，其中所述细胞是视网膜色素上皮(RPE)细胞。
164.用于在哺乳动物中治疗X连锁视网膜劈裂症(XLRS)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物施用实施方案1至152中任一个所述的AAV载体、实施方案153至158中任一个所述的AAV颗粒、实施方案159所述的组合物或实施方案160所述的细胞。
165.实施方案164所述的方法，其中所述施用是向所述哺乳动物的一只或两只眼施用。
166.实施方案164或165所述的方法，其中施用步骤包括向所述哺乳动物的一只或两只眼进行玻璃体内施用或视网膜下施用。
167.实施方案164至166中任一个所述的方法，其中施用体积为30μL至150μL的所述载体、所述颗粒或所述组合物。
168.实施方案167所述的方法，其中施用体积为约90μL的所述载体、所述颗粒或所述组合物。
169.实施方案164至168中任一个所述的方法，其中所述颗粒以5×1010至1×1012个载体基因组(vg)/mL的量施用。
170.实施方案164至169中任一个所述的方法，其中施用步骤包括a)保护一个或更多个光感受器细胞，b)恢复层状视网膜结构，c)恢复一种或更多种视杆和/或视锥介导的功能，d)完全或部分恢复一只或两只眼的视觉行为，或e)其任意组合。
171.实施方案164至170中任一个所述的方法，其中所述哺乳动物是人。

Claims (55)

1.腺相关病毒(AAV)载体，其包含含有以下的多核苷酸：(i)编码视网膜劈裂蛋白的异源核酸，和(ii)内含子、剪接供体区、剪接受体区或者其两者或更多者的任意组合。
2.权利要求1所述的AAV载体，其包含所述内含子，其中所述内含子包含剪接供体区和/或剪接受体区。
3.权利要求1或2所述的AAV载体，其包含所述内含子，其中所述内含子包含与SEQ IDNO：20或21的核酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
4.权利要求3所述的AAV载体，其中所述内含子包含SEQ ID NO：20或21的核酸序列。
5.权利要求1至4中任一项所述的AAV载体，其包含所述内含子，其中所述内含子包含SV40内含子。
6.权利要求1至5中任一项所述的AAV载体，其包含转录后调节元件。
7.AAV载体，其包含含有以下的多核苷酸：(i)编码视网膜劈裂蛋白的异源核酸，和(ii)转录后调节元件。
8.权利要求6或权利要求7所述的AAV载体，其中所述转录后调节元件包含土拨鼠肝炎病毒转录后调节元件(WPRE)。
9.权利要求6至8中任一项所述的rAAV载体，其中所述转录后调节元件包含与SEQ IDNO：15具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
10.权利要求6至9中任一项所述的rAAV载体，其中所述转录后调节元件位于所述异源核酸的3’。
11.权利要求1至10中任一项所述的AAV载体，其中所述视网膜劈裂蛋白是人视网膜劈裂蛋白。
12.权利要求1至11中任一项所述的AAV载体，其中所述异源核酸不包含人视网膜劈裂蛋白的5’非翻译区。
13.权利要求12所述的AAV载体，其中所述5’非翻译区包含SEQ ID NO：39的核酸序列。
14.权利要求1至13中任一项所述的AAV载体，其中所述核酸不包含人视网膜劈裂蛋白的3’非翻译区。
15.权利要求14所述的AAV载体，其中所述3’非翻译区包含SEQ ID NO：40的核酸序列。
16.权利要求1至15中任一项所述的AAV载体，其中所述异源核酸包含与SEQ ID NO：8的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
17.重组AAV(rAAV)载体，其包含含有异源核酸的多核苷酸，所述异源核酸包含与SEQID NO：8的核苷酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
18.权利要求17所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸包含转录后调节元件。
19.权利要求18所述的rAAV载体，其中所述转录后调节元件包含与SEQ ID NO：15具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
20.权利要求18或19所述的rAAV载体，其中所述转录后调节元件位于所述异源核酸的3’。
21.权利要求1至20中任一项所述的rAAV载体，其中所述异源核酸包含与SEQ ID NO：8的核苷酸序列的不同之处在于5、10、15、20、25或超过25个核苷酸的序列。
22.权利要求1至21中任一项所述的rAAV载体，其中所述异源核酸包含SEQ ID NO：8所示的序列。
23.权利要求1至22中任一项所述的rAAV载体，其中所述异源核酸包含SEQ ID NO：9所示的序列。
24.权利要求1至23中任一项所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO：10的序列。
25.权利要求1至24中任一项所述的rAAV载体，其中所述异源核酸与指导所述异源核酸在光感受器细胞或视网膜色素上皮细胞中表达的一种或更多种调节元件可操作地连接。
26.权利要求1至25中任一项所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸包含能够在哺乳动物眼的一种或更多种光感受器或视网膜色素上皮细胞中表达所述核酸序列的启动子。
27.权利要求26所述的rAAV载体，其中所述启动子选自视紫红质激酶启动子、视紫红质启动子、IRBP启动子、嵌合人视网膜劈裂蛋白-IRBP增强子(RS/IRPB)、红/绿视锥视蛋白启动子、视锥抑制蛋白启动子、嵌合IRBP增强子-视锥转导蛋白启动子、鸡β肌动蛋白启动子和截短的嵌合鸡β肌动蛋白(smCBA)启动子。
28.权利要求26或27所述的rAAV载体，其中所述启动子是人视紫红质激酶(hGRK1)启动子。
29.权利要求1至28中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体是自身互补的。
30.权利要求1至29中任一项所述的rAAV载体，其中所述多核苷酸的侧翼是一个或更多个反向末端重复(ITR)序列。
31.权利要求30所述的AAV载体，其中所述一个或更多个ITR序列包含与SEQ ID NO：22至25具有至少80％、85％、90％、92％、95％、98％或99％同一性的核酸序列。
32.权利要求30或31所述的AAV载体，其中所述一个或更多个ITR序列包含SEQ ID NO：22至25的核酸序列。
33.权利要求1至32中任一项所述的AAV载体，其还包含多腺苷酸化信号。
34.权利要求33所述的AAV载体，其中所述多腺苷酸化信号包含牛生长因子多腺苷酸化信号。
35.权利要求1至34中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体包含与SEQ ID NO：16、17和31至35中任一者的核苷酸序列具有至少95％、98％或99％同一性的核苷酸序列。
36.权利要求1至35中任一项所述的rAAV载体，其中所述载体包含SEQ ID NO：16、17和31至35中任一者的核苷酸序列。
37.重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含衣壳，其中所述rAAV颗粒还包含权利要求1至36中任一项所述的rAAV载体。
38.权利要求37所述的rAAV颗粒，其中所述衣壳包含AAV44.9(E531D)衣壳。
39.权利要求37所述的rAAV颗粒，其中所述衣壳包含含有SEQ ID NO：1至6、18和36至38中任一者的氨基酸序列的蛋白质。
40.重组腺相关病毒(rAAV)颗粒，其包含AAV44.9(E531D)衣壳和权利要求1至36中任一项所述的rAAV载体。
41.权利要求37所述的rAAV颗粒，其中所述衣壳包含以下衣壳蛋白中的任一者：AAV44.9(T492V+E531D)、AAV44.9(Y446F+E531D)和AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)。
42.权利要求37所述的rAAV颗粒，其中所述衣壳包含以下衣壳蛋白中的任一者：AAV5及其变体、AAV7及其变体、AAV8及其变体、AAV9及其变体、AAV2(4pMut)ΔHS、AAV44.9、AAV8(Y447F+Y733F+T494V)、AAVrh.8、AAVrh.8R、AAVrh.10、AAVrh.74、AAV2TT、AAV2HBKO和AAVAnc80。
43.权利要求37所述的rAAV颗粒，其中所述衣壳包含AAV5衣壳蛋白或其变体。
44.权利要求37所述的rAAV颗粒，其中所述衣壳蛋白包含AAV44.9(Y446F+T492V+E531D)。
45.组合物，其包含多个权利要求37至44中任一项所述的rAAV颗粒，还包含一种或更多种可药用载体、缓冲剂、稀释剂或赋形剂。
46.细胞，其包含权利要求1至36中任一项所述的rAAV载体或权利要求37至44中任一项所述的rAAV颗粒。
47.权利要求46所述的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
48.用于对哺乳动物光感受器细胞或视网膜色素上皮细胞进行转导的方法，所述方法包括向哺乳动物的一只或两只眼施用权利要求37至44中任一项所述的rAAV颗粒或权利要求45所述的组合物。
49.用于在哺乳动物中治疗或改善X连锁视网膜劈裂症(XLRS)的方法，所述方法包括向所述哺乳动物的一只或两只眼以足以在所述哺乳动物中治疗或改善所述视网膜劈裂症的一种或更多种症状的量经视网膜下施用权利要求37至44中任一项所述的rAAV颗粒或权利要求45所述的组合物。
50.权利要求49所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
51.权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述颗粒以5×1010至1×1012个载体基因组(vg)/mL的量施用。
52.权利要求48至51中任一项所述的方法，其中施用步骤a)保护一个或更多个光感受器细胞，b)恢复层状视网膜结构，c)恢复一种或更多种视杆和/或视锥介导的功能，d)完全或部分恢复一只或两只眼的视觉行为，或e)其任意组合。
53.权利要求48至52中任一项所述的方法，其中施用步骤恢复层状视网膜结构。
54.权利要求48至53中任一项所述的方法，其中施用步骤包括向所述哺乳动物的一只或两只眼的中央凹进行视网膜下施用。
55.权利要求54所述的方法，其中使所述中央凹的脱离最小化。
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