JP2023535956A - 改善されたｘ連鎖性網膜分離症のａａｖ媒介療法 - Google Patents

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Abstract

本開示は、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）の処置のための改善された組換えＡＡＶ療法を提供する。これらの療法は、ＸＬＲＳと診断されたまたはこれを罹患したヒトを含むヒト対象等の対象への投与のために設計されている。

Description

関連出願
本出願は、その全内容が参照により組み込まれる２０２０年７月２９日出願の米国仮出願第６３／０５８，４３７号の出願日の便益を主張する。
政府援助
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１ ＥＹ０２４２８０の下の政府援助によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
網膜分離症は、網膜が２層に分離することによって特徴付けられる遺伝的状態である。この障害には２つの形態がある。より一般的な形態は一般に老人性網膜分離症として知られており、典型的には中年以降で発症し、男性と女性の両方を冒し得る。より稀な形態であるＸ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）は出生時に存在し、少年と若い男性を冒す。ＸＬＲＳの主な症状は眼鏡では改善できない視力障害である。ＸＬＲＳを有する一部の人々はその生涯を通して視力低下の進行を経験することがあるが、他の人々はその生涯を通して比較的安定した視力を有し得る。ＸＬＲＳは一次的には黄斑を冒すので、黄斑変性と呼ばれるより広い障害の１つのタイプである。ＸＬＲＳは米国および欧州連合で約３万人の男性を冒している。ＸＬＲＳの患者に利用可能な処置はない。しかし、視力の同時増大を伴う嚢胞スペースおよび網膜窩の厚みの低減における局所ドルゾラミドおよび経口アセタゾラミドの使用が報告されている。
本開示は、ＸＬＲＳの処置のための改善されたｒＡＡＶ療法を提供する。これらの療法は、ＸＬＲＳと診断されたまたはこれを罹患したヒトを含むヒト対象等の対象の眼への投与のために設計されている。開示したｒＡＡＶベクターは、対象への投与の後で改善された網膜構造および機能を提供し得る。開示したベクターは、網膜分離症の症状の改善または逆行、例えば部分的なまたは完全な逆行を提供し得る。
開示したベクターは、新規な合成ヒトＲＳ１トランスジーンを含む。一部の実施形態では、開示したベクターのヒトＲＳ１トランスジーン（または異種核酸）は、５’および３’の非翻訳領域、即ちＵＴＲを欠いている。一部の実施形態では、トランスジーンは、野生型の配列に対してアミノ酸の変化をもたらさない変異を含む（即ち沈黙の変異である）。本開示はまた、ヒトロドプシンプロモーター等の受容体特異的プロモーター、ならびに改善された網膜形質導入効率を表し、網膜下注射の後で増強された側方展開を示すＡＡＶカプシドの使用を提供する。
したがって、本開示は、ＡＡＶ粒子等のウイルス粒子の中にカプシド化することができる、ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーター等のプロモーターによって作動可能に制御される合成ヒトＲＳ１トランスジーン配列を含む核酸ベクターを提供する。ｈＧＲＫ１プロモーターが非ヒト霊長類の網膜における効率的な光受容体特異的発現を媒介することが既に究明されていた。開示した核酸ベクターは、ＲＳ１トランスジーンに隣接するＡＡＶ逆位末端反復を含み得る。開示した核酸ベクターは、ＲＳ１トランスジーンを含むポリヌクレオチドに隣接するＡＡＶ逆位末端反復を含み得る。
ＸＬＲＳは、レチノシシンと呼ばれるタンパク質をコードするＲＳ１と呼ばれるＸ染色体の上の遺伝子における突然変異によって惹起される。レチノシシンは光受容体細胞および双極細胞によって発現および分泌され、網膜中の多くの細胞の表面に強力かつ特異的に結合する構造タンパク質である。このタンパク質は、網膜の層の構造的一体性を維持する接着剤として働く。正常なレチノシシンタンパク質がないと、網膜の層が分離し、細胞間コミュニケーションが破壊され、網膜細胞および最終的には視力が失われる。ＸＬＲＳの患者は、典型的にはその網膜の網膜電図（ＥＲＧ）測定におけるｂ波の減少を呈する。ナンセンス突然変異を有する患者は一般に、ミスセンス突然変異を有する患者より重篤な疾患を有する。
レチノシシン（ＲＳ１）は、網膜の発達の間、神経網膜の全体で発現される。発達の後、成人期に入れば、レチノシシンは光受容体によって発現される。これは主として杆体および錐体の光受容体の内部セグメント（ＩＳ）に局在化し、それより少なく外網状層に局在化する分泌型タンパク質である。ＲＳ１は、ホモオクタマー複合体を形成することを可能にするディスコイジンドメインを含む。ＲＳ１の正確な分子的機能は解明されないままである。ＲＳ１は網膜特異的Ｎａ／Ｋ＋ＡＴＰアーゼと直接相互作用することが示されており、これらのＡＴＰアーゼ活性のモジュレーターとして働くと考えられている。ＲＳ１はＬ型の電圧ゲートされたカルシウムチャネル（ＬＴＣＣ）と相互作用し、光受容体と双極細胞とのシナプスにおけるＬＴＣＣの機能を促進し得る。
ＸＬＲＳの処置のための遺伝子療法に基づくアプローチの治療可能性が、現在評価されている。特に、動物モデルにおいてＲＳ１を発現するように操作されたアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの潜在的な安全性および有効性を評価する研究が報告されている。いくつかの研究は、臨床的に関連するモデルとしてレチノシシンホモログ（Ｒｓ１ｈ）ノックアウトマウスを利用している。このモデルでは、分離病変が光干渉断層撮影（ＯＣＴ）によって観察され、網膜機能の低下が網膜電図によって観察される。
しかし、最近の遺伝子療法の臨床試験は生物活性または治療有効性を示すことができず、不都合な炎症応答のために終了している。ＸＬＲＳのマウスモデルにおけるＡＡＶ媒介遺伝子療法は、ＲＳ１を運搬するｒＡＡＶ粒子が光受容体に成功裡に形質導入されてトランスジーンを発現した場合にのみ成功したが、ＲＳ１の発現がミュラー細胞または網膜神経節細胞等の他のいずれかの網膜細胞型に限定された場合には成功しなかった。これらの場合には、月齢７か月と遅い治療介入は、光受容体のさらなる変性を防止することができる。したがって、Ｘ連鎖性網膜分離症の眼科遺伝子療法処置において使用できる新規なＡＡＶベクターに対するニーズが残っている。
遺伝子療法の分野における主な進歩は、治療用遺伝子材料を送達するためにウイルスを使用することによって達成されてきた。ＡＡＶベクターは、その免疫原性が低いことおよび非分割細胞に効果的に形質導入できることから、遺伝子療法のための高度に効果的なウイルスベクターとしてかなり注目されてきた。ＡＡＶは種々の細胞および組織の型に感染することが示されており、ヒトの遺伝子療法における使用のためにこのウイルス系を適合させるための顕著な発展がこの１０年間でなされてきた。組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターは、ヒト疾患の多数の前臨床動物モデルにおけるインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）遺伝子導入に成功裡に使用され、多種の治療用遺伝子の長期の発現に成功裡に使用されてきた。ＡＡＶベクターはまた、免疫特権部位を標的とする場合、例えばＬｅｂｅｒの先天的黒内障のための眼科デリバリーにおいて、ヒトにおける長期の臨床的恩恵を生じてきた。このベクターの主な利点は、その免疫プロファイルが比較的低いこと、限定的な炎症応答しか誘発しないこと、およびある場合にはトランスジーン産生物に対する免疫耐容を方向付けさえすることである。それにも関わらず、非免疫特権臓器を標的とする場合には、治療有効性はヒトにおいてウイルスカプシドに対する抗体およびＣＤ８＋Ｔ細胞の応答のために限定的であり、一方動物モデルではトランスジーン産生物に対する適合応答も報告されている。
ＡＡＶは、網膜に対する標的治療用遺伝子の選択すべきベクターになっている。網膜向性を呈する天然存在と合成の両方のＡＡＶが同定されている。ＡＡＶカプシド血清型４４．９は、唾液腺細胞、肝細胞、および様々な型の神経細胞（例えば皮質、嗅球、脳幹の細胞、および小脳のプルキンエ細胞）を含むいくつかの細胞型に効率的に形質導入される。ＡＡＶ４４．９は、ＡＡＶ９と同程度のインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）生体内分布を呈する。このカプシドの脳室内注射は、皮質、嗅球、小脳、脈絡叢、および脳幹においてＡＡＶ９で観察された形質導入レベルと同様の形質導入レベルを示している。さらに、抗体中和研究によって、ＡＡＶ４４．９に対する中和抗体はＡＡＶ２と比較して頻度が低いことが示唆された。またＡＡＶ４４．９のグリカンアレイ研究によって、末端グルコース含有分子へのカプシドの結合が示唆されている。
本開示の発明者らは、残基５３１のグルタミン酸をアスパラギン酸に変異させることによって新たな変異体を操作する合理的な設計アプローチを使用した。この新たな血清型変異体であるＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）を、網膜下注射したマウスおよびマカクにおいて評価した。ＡＡＶ２カプシドのＥ５３０位に対応する位置、例えばＡＡＶｒｈ．８およびＡＡＶ４４．９の５３１位におけるアミノ酸置換は形質導入の効率を変化させると仮定した。ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシド変異体を組み込んだｒＡＡＶ粒子は、網膜下注射の後で、杆体、錐体、および網膜色素上皮（「ＲＰＥ」）に高度に効率的な形質導入が可能であることが見出された。さらに、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）は側方展開の増大を呈し、網膜下注射疱の外側の光受容体および網膜色素上皮に形質導入された。ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）の能力および側方展開の増大により、この変異体は網膜を標的とする遺伝子療法のための有望なベクターとなる。
本発明者らは、レチノシシンをコードするＲＳ１異種核酸の対象へのデリバリーに関して、新規なＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシド、ならびにその他のＡＡＶカプシドを適用した。本開示は、ヒトＲＳ１の５’および３’の非翻訳領域を除去した後の、ＲＳ１遺伝子のコーディング領域またはｃＤＮＡのみを含む、ｒＡＡＶベクターに組み込むためのＲＳ１核酸を提供する。本開示のヒトＲＳ１トランスジーンは、コードされたヒトレチノシシンタンパク質配列に変異をもたらさない１つまたは複数（例えば４つ）のサイレント変異をコーディング領域の中に含んでもよい。ＲＳ１トランスジーンは、野生型ＲＳ１遺伝子の天然のＫｏｚａｋ配列と異なる最適化されたＫｏｚａｋ配列を含んでよい。一部の実施形態では、ＣｐＧアイランドがコード配列から除去されている。一部の実施形態では、開示したｒＡＡＶベクターのいずれかのＲＳ１トランスジーンは、ヒトでの発現のためにコドン最適化されている。
一部の態様では、開示したｒＡＡＶベクターの網膜下投与が提供される。ＡＡＶの網膜下注射は一般に、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または光受容体（ＰＲ）におけるトランスジーンの発現が必要な場合に使用される。網膜下注射は一次的な水疱の剥離を創成し、光受容体の外部セグメントをＲＰＥ層から分離する。典型的には、網膜下注射疱は対象においてその後の数日間で消散する。網膜下注射は光受容体に対していくつかの有害な影響を有する恐れがあり、そのような影響はおそらく既に疾患によって傷害を受けている網膜においてより重篤である。特にこれらの網膜はより剥離しやすい傾向にあるので、ＸＬＲＳ患者の網膜における分離内腔の存在は、網膜下注射に代わる手段を探索する必要があることを示唆している。しかし、硝子体への投与（硝子体内注射）は、網膜下スペースに送達した場合と比較してこの経路を介して送達した場合の、観察された希釈効果、内境界膜（ＩＬＭ）バリアの存在、およびＡＡＶの末梢循環への生体内分布の増大による重篤な炎症を含むそれ自体の課題を提起する。したがって、網膜剥離等の有害効果を最小にしつつ、ＸＬＲＳ患者の網膜に遺伝子療法を網膜下投与する当技術におけるニーズが残っている。
本開示の一部の態様は、眼におけるＸＬＲＳの症状および状態の処置のための改変されたＡＡＶ４４．９カプシドまたはＡＡＶ５カプシドを含むｒＡＡＶ粒子およびベクターに関する。特定の実施形態では、本開示は、網膜窩への網膜下注射の後で増強された側方展開を呈するＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドを含む粒子を提供し、網膜窩の剥離が最小化される。したがって、一部の実施形態では、本開示は、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供し、ｒＡＡＶ粒子は異種核酸を含むポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、本開示は、それぞれ配列番号１、２、または３のいずれか１つのアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質、例えばＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質を提供する。さらなるＡＡＶベクター、例えばＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳならびに本明細書に記載した他のもの等のＡＡＶ２ベクターを利用してもよい。
したがって、一部の態様では、本開示は、哺乳動物対象の１つまたは複数の光受容体細胞におけるヒトＲＳ１核酸セグメントを発現する方法を提供し、本方法は、本明細書に記載したｒＡＡＶ粒子を対象の一眼または両眼の網膜下または硝子体内に投与することを含む。特定の実施形態では、投与は網膜下注射による。
一部の態様では、本開示は、レチノシシンタンパク質（例えばヒトレチノシシンタンパク質）をコードする異種核酸および１つまたは複数のさらなるエレメント、例えば転写後制御エレメントを含むポリヌクレオチドを含む組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターを提供する。一部の実施形態では、エレメントはスプライスドナー領域を含む。一部の実施形態では、エレメントはスプライスアクセプター領域を含む。一部の実施形態では、エレメントはＳＶ４０イントロンを含む。一部の実施形態では、エレメントはポリアデニル化シグナル配列を含む。一部の実施形態では、エレメントはプロモーターを含む。プロモーターの非限定的な例には、ロドプシンキナーゼプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＩＲＢＰプロモーター、キメラヒトレチノシシン－ＩＲＢＰエンハンサー（ＲＳ／ＩＲＰＢ）、赤／緑コーンオプシンプロモーター、コーンアレスチンプロモーター、キメラＩＲＢＰエンハンサー－コーントランスデューシンプロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーター、および切断されたキメラニワトリベータアクチン（ｓｍＣＢＡ）プロモーターが含まれる。一部の実施形態では、エレメントはＷＰＲＥエレメントを含む。一部の実施形態では、エレメントは１つまたは複数の逆位末端反復配列を含む。一部の実施形態では、エレメントはスタッファー配列を含む。種々の実施形態では、ベクターの異種核酸は、ヒトレチノシシンをコードする（野生型）遺伝子（またはＤＮＡ）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含まない。ヒトレチノシシン遺伝子の５’非翻訳領域は、配列番号３９（ＡＧＴＴＣＡＧＴＡＡＧＧＴＡＧＡＧＣＴＴＴＧＧＣＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＧＡＡＧ）の核酸配列を含むか、それからなってよい。一部の実施形態では、異種核酸は、ヒトレチノシシンの３’非翻訳領域を含まない。ヒトレチノシシンの３’非翻訳領域は、配列番号４０
(TGCCTGCCTCAGCTCGGCGCCTGCCAGGGGGTGACTGGCACAGAGCGGGCCGTAGGGGACCCCCTCACACACCACCGAGATGGACAGGGCTATATTTCGCAAAGCAATTGTAACTGCAGTGCTGGGTAGATAATTTTTTTTTTTTTAAGATATAGCTTTCTGATTTCAATGAAATAAAAATGAACTTATTCCCCACTCAGGGCCAGAGAAAGTCAGAACAAAGAAAATGTCCCCGAAACGAATTTTCTTACAAAAGCCTAAGTAGCAGGGGTAATTTTCTGCTCATTTTTTGTCTCAGTGATACTGTGAAAGGTGCAGTCTCAGGGGAACACAAAGCAGCCCTGATAATTTGAAAATTCATTTGCTTTACCACATTCAAGACAGAAACATACAGTTTCCTAAAGCCTGGCTTTGAATGCAGAAGGGAGCAGCTCCTCCTAGTTAAGTTTCCACTAAATCATCGCCAAAGAGGACTTCAGAGCCCTGGGGAGGCAGCTGAGGGTCTCAAGGGTGACTGGGTGGCAGGGATGAGTGCGGTGGGTGAGAATCCCGGTGCCCTGAGAGGCTATACGTGACAAATGACCAAAAGCCCAAGGTAGGGGAGTTTCCTCTGCTCACAGTTCTTACCTTCAAGGCGGATCTGGGCTTCCACCCTCATGAACACAGGGATTGGGGAGGGACCAGAGCGCCCAATACACACAGCTCCATTATGCAATCCATTCCAGCAAATTCCCCGTGTCTGTGGTCACCATTTAGGTGATCATACAGGACAGGCTGCACATCTCAGTATATGTAGGGACCCCAAATGACCACAACACAGTACAATTGCCCTTTACCTAGGGCTACCATTTCCTAGCAAACCAAACATAGTTCGAGAACAGCTGGCCCAGGAGCTACCACTGGCTACTCAGAGGAGGCTCATTAGCTGGCTACATGCTTCGCAGGAAGTGGGAAGGACTCACATCATAAAAAGGACCATGTAGCTTTTTCCCTGAAAGCTTCTCACCCTCCACCCTCTGCCTTGCAATACGCAAACTGCGCCTGCTCCTGAAAAGCTCTCTGGGAAGGAATGGGCCTGGCTTTCCGTTCCTGGAGGCGGCGCCTTAGATTGGGAGGCCTCATTGGCCACTTAGAGCGCAGCCTGAGTTTCCAGGCCCCTTCCTGGGAGAGGCTGTTAACACGGGGGAGGGGCAGGAGAGGGATATGGAGAGCAGGTGGTGGAATCAGAGGACGAGGCTGCTCTAAAGACTGTTCTGGCCCCAGACACAGGGTAGTCTTTGCTAGCAGCTCATTTCCGAGTTACTTTTCATTTTCAAATGCCAAGGCAAGTGACTAGACTCGCGCTAATACAGTGCTGGACAACACATTCACCTTTTCTGTGAACAGGCAGCCTTCTAAAAGCCCCAAACATCCTTCTTGATGCTTTGGGGGCTCAATTATTTTATATCCAACCCAGCATCTTTCTAGTCCCTATGCTGTATGCTTGAACTTCGGAAAATGCTTTTCCCCGCCCAATCTTCTCTCAAATATAAACACATCACACAGGGTGTTGGGGGTGGGGGGGGGGGGTGGGGGGACTTATCCCTGGCCTTAGGACACAGGACAAATCTATTTTGGATAGAAATGCCTGAACAGAGACCCTTATTTGGAAAGGTGAATTAACTTTGGTCACGACATGGACTGTCAGACAAAATGGCAGTATCCTAAGAGTTAAGGCACATCAAACACAGGAGTCGAGAGAGTGCAGTTCAGGGAAAAAGGAGAGGAGGAAACAGTGAGGCAGGGAGAAAGGCTTTCCAAATAAGAGTTCATGTTGGAAACTTTTGTCACGGCTTTATTGAGATTAAGTTCACATACAATTTGTATCCATTTAAAGTGTACAATTTGATGACTTTTGGTATATTCAGAGTTGTGCAACCATTATCACTAGATCAATTTTAGAAAGTTTATCACCCCAAAGAGAAATCCTGCACCCATCAGCCAACACTCCCCAACCCATCGGCCACCCCAAGCCCTCTGCAACCACGAATCGACTGTCTCTGTAGATTGGCCTTCTGGACGTTCTACATAAATGAAATCATATAGTATGTGGTATTTCGTGACTGGCTTCTTTCACTTAGCATAGTGTTTTAAAGTTCATCCACGTTATAACATGTGTATCACTATGTCACTTGTCACTCCTTTTTATTGCTGAACATCATTGTTCAGTATCATGTCAAGAGCACATTGTTATTTATCCATTCATCCATTGATGGATATTTGGGTTTCCACTCTTTAGCTATTATGAATAATGCTGCTATGAACATTTGTGTATAA)の核酸配列を含むか、それからなってよい。
一部の態様では、ｒＡＡＶベクターは、配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９２％の同一性、少なくとも９２．５％の同一性、少なくとも９３％の同一性、少なくとも９４％の同一性、少なくとも９５％の同一性、９８％の同一性、または９９％の同一性を有する配列を含む異種核酸を含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号８と少なくとも９２．５％の同一性を含む異種核酸を含む。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号８と少なくとも９８％の同一性を含む。一部の実施形態では、異種核酸は、配列番号８のヌクレオチド配列と５、１０、１５、２０、２５ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドを超えて異なる配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸は配列番号８の配列を含む。
一部の実施形態では、異種核酸は配列番号９で説明される配列を含み得る。ポリヌクレオチドは配列番号１０の配列を含み得る。ポリヌクレオチドはｍｙｃタグ（例えばｃ－ｍｙｃタグ）をコードする核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、哺乳動物の眼の１つまたは複数の光受容体または網膜色素上皮細胞中で異種核酸を発現することができるプロモーターを含む。ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の１つもしくは複数のＰＲ細胞またはＲＰＥ細胞中で治療剤を産生するために効果的な時間、治療剤をコードする少なくとも第１の異種核酸に作動可能に連結されたＰＲ細胞またはＲＰＥ細胞に特異的なプロモーターを含む少なくとも第１のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含み得る。特定の実施形態では、プロモーターはロドプシンキナーゼプロモーター、例えばヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターである。
一部の態様では、本開示は、本明細書に記載したｒＡＡＶベクターのいずれかを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子中のｒＡＡＶベクターをカプシド化するカプシドは、ＡＡＶ４４．９カプシド、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシド、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）カプシド、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｅ５３１Ｄ）カプシド、ＡＡＶ４４．９（Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）カプシド、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ４４．９（Ｙ７３１Ｆ）カプシド、ＡＡＶ５カプシドまたはそれらの変異体、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳカプシド、またはＡＡＶ８（Ｙ４４７Ｆ＋Ｙ７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）カプシドを含む。特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドを含む。本開示はまた、本明細書で開示したｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む組成物を提供する。本開示はまた、本明細書で開示したｒＡＡＶ粒子のいずれかを含む細胞（例えば哺乳動物細胞）を提供する。
一部の態様では、本開示は、哺乳動物の光受容体細胞または網膜色素上皮細胞に形質導入する方法を提供し、本方法は、本明細書で開示したｒＡＡＶ粒子またはｒＡＡＶ粒子を含む組成物のいずれかを哺乳動物の一眼または両眼に投与することを含む。哺乳動物（例えばヒト）におけるＸＬＲＳを処置または改善する方法、哺乳動物における網膜分離症の１つまたは複数の症状を処置または改善するために十分な量で、本明細書で開示したｒＡＡＶ粒子または組成物のいずれかを哺乳動物の一眼または両眼に投与することを含む方法も提供される。一部の実施形態では、開示した方法は、哺乳動物の一眼または両眼の網膜窩への網膜下投与を含む。特定の実施形態では、網膜下投与の後の網膜窩の剥離は最小化される。一部の実施形態では、開示した方法のいずれかは、ａ）１つもしくは複数の光受容体細胞を維持するか、ｂ）層状の網膜構造を修復するか、ｃ）杆体および／または錐体に媒介される１つもしくは複数の機能を修復するか、ｄ）一眼もしくは両眼の視覚行動を完全にもしくは部分的に修復するか、またはｅ）それらの任意の組合せである。特定の実施形態では、開示した方法のいずれかは、層状の網膜構造を修復し、および／または分離病変を低減もしくは除去する。
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに示すために含まれている。本発明は、同じ要素に対して同じ参照番号が付された添付の図面と併せて以下の説明を参照することにより、より良く理解され得る。
図１は、ＡＡＶ４４．９－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰおよびＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰが、網膜下に注入されたマカクザルにおける高められた水平展開および力価を示していることを示す。ベクターは、１×１０１２ｖｇ／ｍＬにおいてデリバリーされた。投薬の日のブレブの初期境界および結果として生じるＧＦＰ発現の境界が、白い点線で表されている。同じ脈管構造が、参考のために太く暗い線で強調表示されている。 図２は、マカクザルにおけるＡＡＶ４４．９－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰ（１ｘ１０１２ｖｇ／ｍＬ）の網膜下への注入後の、合計で９０μＬのベクター容量の、作り出された３つの網膜下注入ブレブの光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）スキャン（左側のネガティブ・コントラスト眼底画像を参照されたい）を示す。ＯＣＴは、スキーシス病斑などの網膜構造の縦方向のインビボ評価を可能にする。 図３は、ＡＡＶ４４．９－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰの中心窩外網膜下への注入後の、マカクザルの網膜のＯＣＴ画像を示す。ＳＬＯ画像（左上）の矢印は、図の下部でのスキャンにおいて示された網膜断面の位置を示す。断面は、錐体アレスチン（ｃｏｎｅ ａｒｒｅｓｔｉｎ）およびＤＡＰＩに対して染色された。ＧＦＰを発現する桿体（ｒｏｄ）／錐体の割合が、各ゾーンにおいてプロットされている。ＯＮＬは外顆粒層；ＩＮＬは内顆粒層；ＧＣＬは神経節細胞層である。この図および図面全体を通して、陰性ＧＦＰに対する染色は丸で示されており、錐体アレスチンに対する染色は三角で示されており、ならびにＤＡＰに対する染色は四角で示されている。 図４は、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰの中心窩外網膜下への注入後のマカクザルの網膜のＯＣＴ画像を示しており、３つのブレブは、合計で９０μＬのベクター量である。ＳＬＯ画像（左上）の矢印は、図の下部でのスキャンにおいて示された網膜断面の位置を示す。断面は、錐体アレスチン（ｃｏｎｅ ａｒｒｅｓｔｉｎ）およびＤＡＰＩに対して染色された。ＧＦＰを発現する桿体／錐体の割合が、各ゾーンにおいてプロットされている。 図５Ａ～５Ｄは、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰおよびＡＡＶ４４．９－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰの中心窩外網膜下への注入後の、マカクザルの網膜の傍中心窩領域の代表的ＯＣＴ画像を示す。目盛りバーは、Ａ＝４０マイクロメートル、Ｂ＝２０マイクロメートルである。 図６Ａおよび６Ｂは、注入後の、マカクザルの網膜の周中心窩領域の代表的ＯＣＴ画像を示す。 図７は、網膜下注入の概略図を示す。 図８Ａ～８Ｃは、Ｎｒｌ－ＧＦＰマウスにおける網膜下注入（ＳＲＩ）後の、ＡＡＶベクターの形質導入プロファイルを示す（図８Ａ）。２×１０１２ｖｇ／ｍＬの注入の４週間後に撮影された、代表的眼底画像におけるＡＡＶ媒介性ｍＣｈｅｒｒｙ発現（図８Ａ、上の段）および網膜断面図（図８Ａ、中央および下の段）。Ｃ５７ＢＬ６Ｊマウスにおける網膜下注入（ＳＲＩ）後の、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２－ＧＦＰの形質導入プロファイル。（図８Ｂ）２×１０１２ｖｇ／ｍＬ（２ｘ１０９ｖｇがデリバリーされた）の注入の６週間後に、網膜の断面を、錐体アレスチンに対して抗体で染色し、ならびにＤＡＰＩで対比染色した。（図８Ｃ）＊クラスカル－ワリス検定を実施し、その後、グループ間の対比比較を行うためにｐｏｓｔ ｈｏｃ Ｄｕｎｎ検定を実施した。非桿体値の場合：Ｈ＝４４．９１２、ｄｆ＝６、Ｐ＜０．００１である。桿体値の場合：Ｈ＝８５．５４６、ｄｆ＝６、Ｐ＜０．００１である。Ａ、Ｂにおける目盛りバー＝５０マイクロメートルである。ＲＰＥ－網膜色素上皮、ＯＮＬ－外顆粒層、ＩＮＬ－内顆粒層、ＧＣＬ－神経節細胞層。 図９Ａ～９Ｅは、様々な月数での自然歴網膜電図測定（ＥＲＧ）を示す。図９Ａは、１か月での自然歴ＥＲＧを示す。図９Ｂは、２か月での自然歴ＥＲＧを示す。図９Ｃは、３か月での自然歴ＥＲＧを示す。図９Ｄは、４か月での自然歴ＥＲＧを示す。図９Ｅは、５か月での自然歴ＥＲＧを示す。 図１０は、自然歴ＥＲＧの１～５か月のまとめを示す。 図１１は、Ｒｓ１ＫＯマウスにおけるスキーシス病斑の定量化を示す。網膜分離腔の程度を、Ｂｉｏｐｔｉｇｅｎ ＯＣＴを使用して分析し、Ｄｉｖｅｒソフトウェアによって促進した。８つのスポットが、３×３グリッドによって指定される。中央のスポットは、腔が存在しない場合の視神経（ＯＮ）である。０．５ｍｍ（５００μｍ）セグメント内のスキーシス腔の存在、存在量、および大きさを使用して、スコアを作製した。スキャンおよび対応するスコアならびにスコアをファクターするために使用した観察の説明が図１２に示される。 図１２は、スキーシス腔の程度（０～４）に対する採点システムを示しており、０は、スキーシス腔が存在しないことを表し、４は、最も高い腔カウントであることを表す。 図１３は、網膜分離腔カウントのグラフを示す。腔スコアは、２～３か月でピークに達し、時間と共に改善する。 図１４は、ＯＣＴ測定および自然歴免疫組織学（ＩＨＣ）アッセイに関連するスキーシス活性スコアを示す。１か月齢のマウスの網膜部分をＲＳ１に対するモノクローナル抗体で染色した。ＲＳ１発現は、ヘテロ接合雌マウスおよび野生型雄マウスにおける内部／外部セグメント接合部に局在化しており、ならびに、雄および雌ＲＳ１ ＫＯマウスには存在しない。 図１５Ａ～１５Ｆは、本開示の例示的ベクターに対する６つのカセットの概略図を示す。例示的ベクターとしては、第１のＩＴＲの５’末端から第２のＩＴＲの３’末端までの１７２３ｂｐの長さを有するＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ（図１５Ａ）、第１のＩＴＲの５’末端から第２のＩＴＲの３’末端までの２９７７ｂｐの長さを有するＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＲＳ１ｓｙｎ（図１５Ｂ）、第１のＩＴＲの５’末端から第２のＩＴＲの３’末端までの２３１１ｂｐの長さを有するＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ（図１５Ｃ）、第１のＩＴＲの５’末端から第２のＩＴＲの３’末端までの４５３４ｂｐの長さを有するｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐ（図１５Ｄ）、第１のＩＴＲの５’末端から第２のＩＴＲの３’末端までの４５２８ｂｐの長さを有するｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐ（図１５Ｅ）、および、第１のＩＴＲの５’末端から第２のＩＴＲの３’末端までの４５４９ｂｐの長さを有するＴＲ－Ｘ００２－３ｐ（図１５Ｆ）が挙げられる。ｐＴＲ－ＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎを、ＡＡＶ５およびＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）にパッケージした。ｐＴＲ－ＣＢＡ－ｈＲＳ１ｓｙｎベクタープラスミド（ｐＴＲ－ＵＦ１骨格）を、対照として機能させるためにＡＡＶ５にパッケージした。 図１６は、ＯＣＴ測定（注入の１か月後）を示す。 図１７Ａは、パイロットＡＡＶ－ＲＳ１研究のためのデータを示す。試験注入：網膜分離腔スコア（注入の１か月後）。スキーシス腔は、全ての治療された眼において完全に取り除かれた。図１７Ｂは、パイロットＡＡＶ－ＲＳ１研究のためのデータを示す。ＥＲＧは、網膜下ＡＡＶ－ｈＲＳ１注入の１か月後を示す。予備的結論：ｈＧＲＫ１プロモーターは、治療ＲＳ１発現を駆動し、ならびにＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ベクター化構築物は、治療的である。 図１８Ａ～１８Ｃは、ＯＣＴの月データを示す。図１８Ａは、１か月および２か月でのＯＣＴ月データを示す。図１８Ｂは、３か月および４か月でのＯＣＴ月データを示す。図１８Ｃは、５か月および６か月でのＯＣＴ月データを示す。 図１９は、左眼対右眼のＯＣＴデータを示す。 図２０は、１か月でのＥＲＧ測定を示す。 図２１は、２か月でのＥＲＧを示す。 図２２は、３か月でのＥＲＧを示す。 図２３は、４か月でのＥＲＧを示す。 図２４は、５か月でのＥＲＧを示す。 図２５は、６か月でのＥＲＧを示す。 図２６は、注入されたウイルス対ビヒクルのｂ波の統計分析を示す。注入の１か月後のグループ６および７のＥＲＧを示す。 図２７は、注入された眼のｂ波の統計分析を示す。 図２８は、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）を注入された眼のｂ波の統計分析を示す。 図２９は、ＡＡＶ５を注入された眼のｂ波の統計分析を示す。 図３０は、空のビヒクルに対する注入されたウイルスの暗順応ａ波の統計分析を示す。 図３１は、注入の４週間後のＩＨＣ測定を示す。 図３２は、詰められたカセットを含むｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）で治療されたＲＳ１ＫＯマウスにおける網膜構造の回復を示す。ビヒクルあるいは以下のカセット：Ｘ００１、Ｘ００１－３ｐ、Ｘ００１－５ｐ、またはＸ００２－３ｐを含むｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ベクターのどちらかで処置されたＲＳ１ＫＯマウスにおけるスキーシス腔の定量化。注入後１か月でのＸ００１－５ｐを除いて、全てのベクターは、両方の時点での網膜分離スコアを向上させた。名目上の記述的統計有意性は、治療された眼のＴｕｋｅｙの事後検定による二元配置分散分析によって特定した。 図３３Ａ～３３Ｂは、詰められたカセットを含むｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）で治療されたＲＳ１ＫＯマウスにおける網膜機能の回復を示す。ビヒクルあるいは以下のカセット：Ｘ００１、Ｘ００１－３ｐ、Ｘ００１－５ｐ、またはＸ００２－３ｐを含むｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）のどちらかによる眼において、網膜下注入の１か月後および２か月後に測定したＲＳ１ＫＯマウスにおける暗順応（左）および明順応（右）の平均最大ｂ波振幅。ベクターは、１×１０８ｖｇ（図３３Ａ）または５×１０８ｖｇ（図３３Ｂ）のどちらかで投与した。全てのベクターで治療された眼の網膜機能は、未治療の対照眼より向上した。名目上の記述的統計有意性は、各個別のデータセットに対するＴｕｋｅｙの事後検定による二元配置分散分析によって特定した。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１である。 図３４～３４Ｂは、ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００２－３ｐで処置されたＲＳ１ＫＯマウスの網膜におけるＲＳ１発現を示す。ビヒクルあるいはＸ００２－３ｐカセットを含むｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）のどちらかのみで処置された眼（上側）におけるＲＳ１ＫＯマウスの代表的網膜断面図。ベクターは、１×１０８ｖｇ（図３４Ａ）または５×１０８ｖｇ（図３４Ｂ）のどちらかで投与した。反対側の未処置の眼は、下の段に示される。全ての網膜は、ＲＳ１に対する抗体で染色し（三角形）、ならびにＤＡＰＩで対比染色した（正方形）。
本開示は、ＸＬＲＳの処置のためのｒＡＡＶ粒子の投与のための新規なｒＡＡＶベクター、組成物、方法を提供する。これらのベクターは、哺乳動物対象、例えばヒト対象への合成レチノシシン遺伝子を含む治療剤のデリバリーのために設計されている。有利なことに、本明細書で開示したｒＡＡＶ粒子投与の新規な方法によって、哺乳動物の眼の網膜への形質導入、特に光受容体（ＰＲ）および網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞へのインビボでの形質導入の効率が改善された。具体的には、開示したｒＡＡＶベクターおよび組成物は、ベクターの注射の部位を超えて側方展開することができ、それにより、比較的少ない容量または用量のＡＡＶベクターを利用しつつ、無傷のならびに分離（スプリット）した網膜への両方における効率的な形質導入をもたらすことができる。したがって、開示した方法は分離病変の付近の手術介入によって生じるさらなる損傷のリスクを低減し得る一方、高効率の光受容体の形質導入が達成されることを保証する。即ち、開示した方法は光受容体へのレチノシシン（ＲＳ１）遺伝子の安全かつ効率的なデリバリーを提供し得る。本開示はまた、開示したｒＡＡＶベクターのいずれかを含む宿主細胞等の細胞を提供する。
特定の実施形態では、この治療剤のデリバリーは、ａ）１つもしくは複数の光受容体（ＰＲ）細胞を維持するか、ｂ）層状の網膜構造を修復するか、ｃ）杆体および／または錐体に媒介される１つもしくは複数の機能を修復するか、ｄ）一眼もしくは両眼の視覚行動を完全にもしくは部分的に修復するか、またはｅ）それらの任意の組合せである。一部の実施形態では、治療剤の産生は、哺乳動物の一眼または両眼へのｒＡＡＶ粒子の最初の投与の後、実質的に少なくとも６か月の期間、１つもしくは複数の光受容体細胞または１つもしくは複数のＲＰＥ細胞の中に存続している。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の中にカプシド化された異種核酸を含むポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態では、異種核酸は機能性タンパク質、例えばヒトレチノシシン（ＲＳ１）を提供するために対象に投与され、対象（例えばヒト）への光受容体機能を例えば完全にまたは部分的に修復し、ならびに層状網膜構造を修復し、即ち分離病変を低減する。一部の実施形態では、対象の標的コード配列の１つまたは両方の対立遺伝子は、本明細書で開示した異種核酸を含むｒＡＡＶ粒子を対象（例えばＸＬＲＳに罹患したヒト）に投与することによって不活化される。
一部の態様では、本開示は、ｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、および／または緩衝剤を含む組成物を提供する。一部の態様では、本開示は、対象における異種核酸（またはトランスジーン）の発現をモジュレートするためにＲＰＥ細胞および光受容体細胞に形質導入する方法を提供し、本方法は、本明細書に記載したｒＡＡＶ粒子および薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、緩衝剤、およびそれらの任意の組合せを含む組成物を対象、例えばヒト対象に投与することを含む。一部の態様では、本開示は対象におけるＸＬＲＳを処置する方法を提供し、本方法は、対象の眼に組成物を投与することを含む。
一部の態様では、本開示は、網膜疾患の処置における使用のための組成物および網膜疾患を処置するための医薬の製造における使用のための組成物を提供する。一部の態様では、本開示は、哺乳動物の一眼または両眼の網膜下または硝子体内に投与することによる処置における使用のための本明細書に記載したｒＡＡＶ粒子を含む組成物を提供する。
一部の態様では、標準的な臨床用量と比較して低減された用量における開示したｒＡＡＶベクターの投与が提供される。非限定的な例では、投与は網膜下である（図７参照）。いくつかの研究は、高用量のＡＡＶ粒子の投与が炎症を惹起することを示唆している。肝、神経、および／または筋肉を標的とする高用量のＡＡＶ粒子の全身投与は、少数の臨床試験において過度の炎症および肝疾患の発症に続く対象の死をもたらした。網膜下送達されたＡＡＶ－ＲＳ１ベクターについてのマウスモデルでの概念研究の強力な証明にも関わらず、リスクとベネフィットの比によってＸＬＲＳの処置のための網膜下注射の使用が除外されたために、最初の臨床試験には硝子体内（ＩＶＴ）送達ＡＡＶが利用された。手術中の光干渉断層撮影（ＯＣＴ）の出現により、ベクターの配置は外科医によって厳密に制御することができる。特に、ベクターは分離病変を超える区域に注射することができる。注射部位を超えて側方展開することができるＡＡＶベクターは、無傷のおよび分離した網膜の区域の両方における効率的な形質導入をもたらすことになる。
開示したｒＡＡＶベクターは、増大した側方展開および高い形質導入効率を呈するカプシド変異体、例えばＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）およびその他のＡＡＶ４４．９変異体を利用している。ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）によって媒介される高い効率および側方展開により、注射疱の容量を小さくすることが可能になり、それにより、剥離区域を制限することによってリスクがさらに低減される。したがって、開示したｒＡＡＶベクターのいずれかの使用により、対象、例えばヒト対象における治療効果を達成するために必要な眼科投与のための疱の容量および／または用量の低減を容易にすることができる。開示したｒＡＡＶベクターの投与の方法によって、病変を含まないか比較的無傷の網膜（例えばＸＬＲＳ患者の網膜）の区域を網膜下注射の標的とすることが可能になる。これらの方法は、硝子体網膜の外科医による疱の設置をガイドする手術中のＯＣＴの使用によって容易になり得る。
したがって、開示したｒＡＡＶ粒子は、２５０μｌ未満、２００μｌ未満、１７５μｌ未満、１５０μｌ未満、１２５μｌ未満、１００μｌ未満、９０μｌ未満、７５μｌ未満、５０μｌ未満、または４５μｌ未満の注射疱容量で投与してよい。一部の実施形態では、０．０００１ｍＬ～１０ｍＬ（例えば０．０００１ｍＬ、０．００１ｍＬ、０．０１ｍＬ、０．１ｍＬ、１ｍＬ、１０ｍＬ）が一用量で対象の網膜に送達される。一部の実施形態では、５×１０１０～１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの用量が網膜に投与される。本明細書で提供する実施例の非ヒト霊長類実験では、全量９０μＬ（それぞれ３０μＬの３つの個別の注射疱）を霊長類の網膜に網膜下投与した（実施例１参照）。これらの容量は、ＡＡＶ遺伝子療法の標準的な臨床応用で使用される容量より実質的に小さい。例えば、ｒＡＡＶ－ＲＰＥ６５ベクターであるルクスツルナ（Ｌｕｘｔｕｒｎａ）（ｖｏｒｅｔｉｇｅｎｅ ｎｅｐａｒｖｏｖｅｃ－ｒｚｙｌ）は、３００μＬの網膜下注射で送達されている。したがって、一部の実施形態では、開示したベクターのいずれかの単回の網膜下注射が治療効果を達成し得る。一部の実施形態では、３～５回を超えない網膜下注射が治療効果を達成し得る。一部の実施形態では３０μＬ～３００μＬ、またはより好ましくは３０μＬ～１５０μＬの全容量の範囲の開示したｒＡＡＶ粒子またはその組成物の網膜下注射が投与され得る。特定の実施形態では、それぞれ１０μＬ～１０μＬの疱容量の範囲の３回の網膜下注射が投与され得る。
合成ＲＳ１配列
一部の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドのいずれかの異種核酸は、配列番号８で説明されるヌクレオチド配列と少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有する配列を有する。この合成ＲＳ１トランスジーンは、野生型ＲＳ１のｃＤＮＡと比較して５’および３’の非翻訳領域を欠いている。この配列は本明細書で「ｈＲＳ１ｓｙｎ」と称される。配列番号８の長さは６８４ヌクレオチド（ｎｔ）である。一部の実施形態では、異種核酸は、配列番号８のヌクレオチド配列と５、１０、１５、２０、２５ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドを超えて異なる。
種々の実施形態では、本開示のポリヌクレオチドのいずれかの異種核酸は、ヒトレチノシシンをコードする（野生型）遺伝子（またはｃＤＮＡ）の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）を含まない。一部の実施形態では、異種核酸は、ヒトレチノシシン遺伝子の３’ＵＴＲを含まない。種々の実施形態では、異種核酸は、ヒトレチノシシン遺伝子の３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲを含まない。種々の実施形態では、異種核酸は、ヒトレチノシシン遺伝子の３’ＵＴＲまたは５’ＵＴＲの切断されたバージョンを含まない。一部の実施形態では、異種核酸は、野生型ＲＳ１ ｃＤＮＡを含まない。一部の実施形態では、異種核酸は、ＲＳ１コーディング領域からなる。
一部の実施形態では、異種核酸は、配列番号８、９、または１０のいずれか１つの核酸配列を含む。
合成ヒトレチノシシン１（ＲＳ１）トランスジーンをコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を以下に示す。開始コドンには下線を付し、停止コドンは太字で示している。
ｈＲＳ１ｓｙｎ：
Figure 2023535956000002
 （配列番号８）
クエリー核酸配列と少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するヌクレオチド配列を含む核酸分子（例えば異種核酸分子またはトランスジーン）によって、対象の核酸分子のヌクレオチド配列は、対象の核酸分子配列がクエリー配列のそれぞれ１００ヌクレオチドあたり５つまでのヌクレオチドの変更を含み得ることを除いてクエリー配列と同一であることを意図している。換言すれば、参照（クエリー）配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するプロモーターを得るために、対象配列中のヌクレオチドの５％までは挿入、欠失、または別のヌクレオチドによって置換してよい。参照配列のこれらの変更は、参照配列の５’もしくは３’末端で、または参照配列中のヌクレオチドの中で個別にもしくは参照配列中の１つもしくは複数の連続するグループの中に散在するこれらの位置の間の任意の場所で生じ得る。
実際問題として、いずれの特定の核酸分子が例えば合成ＲＳ１ ｃＤＮＡのヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるか否かは、伝統的には既知のコンピュータープログラムを使用して決定することができる。クエリー配列（本開示の配列）と対象配列との間の最良の全体の一致を決定するための好ましい方法はグローバル配列アラインメントとも称され、Pearson and Lipman (1988)によって記述されたＦＡＳＴＡプログラム解析ならびにBrutlag et al. (Comp. App. Biosci. 6:237-245 (1990))のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢおよびｂｌａｓｔｎコンピュータープログラムを使用して決定することができる。配列アラインメントにおいてクエリー配列および対象配列は、いずれもヌクレオチド配列またはいずれもアミノ酸配列である。前記グローバル配列アラインメントの結果は同一性パーセントとして表される。ＦＡＳＴＤＢアミノ酸アラインメントで使用される好ましいパラメーターは、マトリックス＝ＰＡＭ ０、ｋ－ｔｕｐｌｅ＝２、ミスマッチペナルティ＝１、ジョイニングペナルティ＝２０、ランダム化グループ長さ＝０、カットオフスコア＝１、ウィンドウサイズ＝配列長さ、ギャップペナルティ＝５、ギャップサイズペナルティ＝０．０５、ウィンドウサイズ＝５００または対象アミノ酸配列の長さのいずれか短い方である。
ヌクレオチドがマッチ／アラインしているか否かは、ＦＡＳＴＤＢ配列アラインメントの結果によって判定される。次いでこのパーセンテージを、特定したパラメーターを使用する上記ＦＡＳＴＤＢプログラムによって計算した同一性パーセントから差し引き、最終の同一性パーセントスコアに到達する。この最終の同一性パーセントスコアが、本開示の目的のために使用されるものである。クエリー配列に対して５’および／または３’の末端で切断された対象配列については、クエリー配列に対して５’または３’に位置し、対応する対象ヌクレオチドとマッチ／アラインしないクエリー配列のヌクレオチドの数を、クエリー配列の全塩基のパーセントとして計算することによって、同一性パーセントを補正する。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチド（例えば配列番号８～１０のポリヌクレオチド）のいずれかを含むベクターは、開始コドン配列（即ちＡＴＧ）の直近の５’のＫｏｚａｋ配列を含み得る。一部の実施形態では、このＫｏｚａｋ配列はＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号４１）の核酸配列を含む。一部の実施形態では、開示したベクターのいずれかのＫｏｚａｋ配列（例えば配列番号３１～３５で説明される配列）は、配列番号４１に対して異なる１つ、２つ、または３つのヌクレオチドを有するＫｏｚａｋ配列を含む。一部の実施形態では、これらのＫｏｚａｋ配列のいずれかは、リボソーマル進入部位を構成する。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、配列番号７～１０および１５～１７、例えば配列番号８～１０、１６、および１７のいずれか１つで説明される配列に対して異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドを有する核酸配列を含み得る。一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、配列番号８、９、および１０のいずれか１つの配列に対して異なる１～１０（例えば５または９）ヌクレオチドを有する核酸配列を含み得る。これらの相違は、配列番号７～１０および１５～１７のいずれか１つの配列に対して挿入、欠失、または置換されたヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号７～１０および１５～１７のいずれか１つに対して５’または３’末端に切断を含む。一部の実施形態では、開示したポリヌクレオチドは、配列番号７～１０および１５～１７のいずれか１つの配列と共通に約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約１８０ヌクレオチドのストレッチを含む。一部の実施形態では、開示したポリヌクレオチドは、配列番号１６および１７のいずれか１つの配列と共通に約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約１８０、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、または約１０００ヌクレオチドを超えるストレッチを含む。
一部の実施形態では、開示したポリヌクレオチドは、ＣｐＧアイランドが存在しない配列の領域の中の配列番号８～１０、１６、および１７のいずれか１つと共通に約５０、７５、またはそれを超えるヌクレオチドのストレッチを含む。本開示のポリヌクレオチドは、コードされたＲＳ１タンパク質配列中に変異をもたらさない１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１２を超えるサイレント変異を含み得る。一部の実施形態では、開示したポリヌクレオチドは、野生型ＲＳ１配列に対して３０～４０のサイレント変異を含み得る。一部の実施形態では、配列番号８～１０、１６、および１７の配列のいずれかに対して３０％まで同一性が変動する（即ち少なくとも７０％の同一性を有する）異種核酸は、野生型ＲＳ１タンパク質に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、配列番号８～１０、１６、および１７の配列のいずれかに対して３０％まで同一性が変動する異種核酸は、配列番号１２～１４の配列のいずれかに対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターのいずれかの異種核酸は、配列番号９で説明されるヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有する配列を有する。異種核酸は配列番号９を含み得る。ヒトでの発現のためにコドン最適化され、ＣｐＧアイランドが除去された合成ヒトレチノシシン１（ＲＳ１）トランスジーンをコードするヌクレオチド配列（配列番号９）を以下に示す。開始コドンには下線を付し、停止コドンは太字で示している。
Figure 2023535956000003
 （配列番号９）
ＣｐＧアイランドは、５’から３’の方向に多数のシトシン－グアニンジヌクレオチドリピートを含むゲノムの領域である。哺乳動物のゲノムでは、ＣｐＧアイランドは通常、３００～３０００塩基対にわたって延在している。ＣｐＧジヌクレオチドの中のシトシンは、５－メチルシトシンを形成する細胞の遺伝子外機構によってメチル化される可能性があり、しばしばメチル化されている。これらのシトシンのメチル化は、これらのアイランドが出現するいずれの遺伝子（例えばＲＳ１遺伝子）のコーディング領域の発現も低減させる。一部の実施形態では、開示したポリヌクレオチドのいずれかは、ＣｐＧジヌクレオチドの３６の事例を中断する変異（例えばサイレント変異）を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターのポリヌクレオチドは、ｍｙｃタグ付けされたポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶ核酸ベクターのいずれかの異種核酸は、配列番号１０で説明されるヌクレオチド配列と少なくとも８０％の同一性、少なくとも７５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有する配列を有する。異種核酸は配列番号１０を含み得る。合成のｍｙｃタグ付けされたヒトレチノシシン１（ＲＳ１）トランスジーンをコードするヌクレオチド配列（配列番号１０）を下に示す。開始コドンには下線を付し、停止コドンは太字で示している。
Figure 2023535956000004
 （配列番号１０）
種々の実施形態では、異種核酸を含むｒＡＡＶベクターは、ヒトレチノシシン１（ＲＳ１）タンパク質またはその変異体をコードする。それぞれ配列番号８～１０のヌクレオチド配列のそれぞれによってコードされるＲＳ１タンパク質変異体のアミノ酸配列を、配列番号１２～１４として下に示す。一部の実施形態では、コードされるＲＳ１タンパク質は配列番号１２のアミノ酸配列によって定義されるヒトレチノシシンタンパク質である。一部の実施形態では、コードされるＲＳ１タンパク質は、配列番号１２～１４のいずれか１つの配列に対して異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８アミノ酸を有する配列を含み得る。一部の実施形態では、コードされるＲＳ１タンパク質は、配列番号１２に対して異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８アミノ酸を有する配列を含み得る。これらの相違は、配列番号１２～１４のいずれか１つの配列に対して挿入、欠失、または置換されたアミノ酸を含み得る。一部の実施形態では、開示したｒＡＡＶベクターは、配列番号１２～１４のアミノ酸配列のいずれかに対して少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９２．５％の同一性、少なくとも９５％の同一性、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする。
ヒト合成ＲＳ１
MSRKIEGFLLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQGGPNALWSAGATSLDCIPECPYHKPLGFESGEVTPDQITCSNPEQYVGWYSSWTANKARLNSQGFGCAWLSKFQDSSQWLQIDLKEIKVISGILTQGRCDIDEWMTKYSVQYRTDERLNWIYYKDQTGNNRVFYGNSDRTSTVQNLLRPPIISRFIRLIPLGWHVRIAIRMELLECVSKCA（配列番号１２）
ＣｐＧアイランドを除去したヒト合成ＲＳ１
MSRKIEGFLLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQGGPNALWSAGATSLDCIPECPYHKPLGFESGEVTPDQITCSNPEQYVGWYSSWTANKARLNSQGFGCAWLSKFQDSSQWLQIDLKEIKVISGILTQGRCDIDEWMTKYSVQYRTDERLNWIYYKDQTGNNRVFYGNSDRTSTVQNLLRPPIISRFIRLIPLGWHVRIAIRMELLECVSKCA（配列番号１３）
ｍｙｃタグ付けされたヒト合成ＲＳ１；Ｃ－ｍｙｃタグには下線を付している。
MSRKIEGFLLLLLFGYEATLGLSEQKLISEEDLSTEDEGEDPWYQKACKCDCQGGPNALWSAGATSLDCIPECPYHKPLGFESGEVTPDQITCSNPEQYVGWYSSWTANKARLNSQGFGCAWLSKFQDSSQWLQIDLKEIKVISGILTQGRCDIDEWMTKYSVQYRTDERLNWIYYKDQTGNNRVFYGNSDRTSTVQNLLRPPIISRFIRLIPLGWHVRIAIRMELLECVSKCA（配列番号１４）
一部の実施形態では、異種核酸を含む核酸ベクター（例えばＲＳ１）は、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、１７００ヌクレオチド（ｎｔ、または塩基対（ｂｐ））～約５０００、約４５５０、約４５４９、約４５３５、約４５３４、約４５２８、約４５２５、約４５００、約３２００、約３０００、約２９７７、約２９００、約２８００、約２３１１、約２３００、約１７２５、約１７２３、または約１７００ヌクレオチドの長さを有している。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約１７００～約１８００（例えば約１７２３）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ａ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２９００～約３１００（例えば約２９７７）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｂ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２２００～約２４００（例えば約２３１１）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｃ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５３４）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｄ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５２８）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｅ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４７００（例えば約４５４９）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｆ）。一部の実施形態では、異種核酸を含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７および３１～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸を含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７および３１～３５のいずれか１つの配列を含む。
一部の実施形態では、本明細書に記載したポリヌクレオチドは、配列番号３１～３５のいずれか１つで説明される配列に対して異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ヌクレオチドを有する核酸配列を含み得る。これらの相違は、配列番号３１～３５のいずれか１つの配列に対して挿入、欠失、または置換されたヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３１～３５のいずれか１つに対して５’または３’末端に切断を含む。一部の実施形態では、開示したポリヌクレオチドは、配列番号３１～３５のいずれか１つの配列と共通に約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、または約１８０ヌクレオチドのストレッチを含む。一部の実施形態では、開示したポリヌクレオチドは、配列番号３１～３５のいずれか１つの配列と共通に約５０、約７５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約１８０、約２００、約３００、約４００、約５００、約６００、約７００、約８００、約９００、約１０００、または約１０００ヌクレオチドを超えるストレッチを含む。
スプライスドナー、スプライスアクセプター領域、およびイントロン
一部の実施形態では、核酸ベクターはイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸ベクターはイントロンとは独立のスプライスドナーおよびスプライスアクセプター領域を含む。
一部の実施形態では、核酸ベクターはＳＶ４０イントロンを含む。一部の実施形態では、ＳＶ４０イントロンはＳＶ４０スプライスドナー領域を含む。一部の実施形態では、ＳＶ４０イントロンはＳＶ４０スプライスアクセプター領域を含む。一部の実施形態では、ＳＶ４０イントロンはＳＶ４０スプライスドナーおよびスプライスアクセプター領域（ＳＶ４０ ＳＤ／ＳＡ）を含む（例えば図１５Ａ～１５Ｂおよび図１５Ｄ～１５Ｆを参照）。
ＳＶ４０イントロンの長さは９９ヌクレオチドである。ＡＡＶ発現カセットの中のプロモーターとトランスジーンとの間のＳＶ４０イントロンの存在がＣＭＶプロモーターおよびエンハンサーの制御下で肺癌細胞におけるトランスジーンの発現を２倍に増加させることが、Ostedgaard et al.によって最初に報告された（PNAS 2005; 102(8): 2952-2957）。最近、非ウイルスベクターにおいて発現カセットの下流にＳＶ４０イントロンを位置させることによって最高レベルのレポータートランスジーンの発現がもたらされる（チャイニーズハムスター卵巣細胞で）ことが示された。Xu et al.、J. Cell. Mol. Med. Vol 22、No 4 (2018): 2231-2239を参照されたい。開示したｒＡＡＶベクターの一部の実施形態では、ＳＶ４０イントロンは異種核酸の下流（３’）に位置している。一部の実施形態では、ＳＶ４０イントロンは異種核酸の上流（５’）に位置している。
一部の実施形態では、ＳＶ４０イントロンは、配列番号２０と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＳＶ４０イントロンは、配列番号２０と少なくとも９０％または９５％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、ＳＶ４０イントロンは配列番号２０：
TCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACを含む。一部の実施形態では、ＳＶ４０イントロンは、配列番号２０の配列と共通に約５０、約７５、約８０、約８５、約９５、または約９９ヌクレオチドのストレッチを含む。
一部の実施形態では、核酸ベクターは、マウスの微小ウイルス（ＭＶＭ）イントロンを含む。例えば、配列
AAGAGGTAAGGGTTTAAGGGATGGTTGGTTGGTGGGGTATTAATGTTTAATTACCTGGAGCACCTGCCTGAAATCACTTTTTTTCAGGTTGG（配列番号２１）または配列番号２１と約もしくは少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の配列を有するＭＶＭイントロン。
一部の実施形態では、核酸ベクターは、エクソン１スプライス部位を含む。一部の実施形態では、核酸ベクターは、イントロン１スプライス部位を含む。
一部の実施形態では、異種核酸ならびにイントロン、スプライスアクセプター部位、および／またはスプライスドナー部位（例えばＳＶ４０イントロン）を含む核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、１７００ヌクレオチド（ｎｔ、または塩基対（ｂｐ））～約５０００、約４５５０、約４５４９、約４５３５、約４５３４、約４５２８、約４５２５、約４５００、約３２００、約３０００、約２９７７、約２９００、約２８００、約２３１１、約２３００、約１７２５、約１７２３、または約１７００ヌクレオチドの長さを有している。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約１７００～約１８００（例えば約１７２３）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ａ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２９００～約３１００（例えば約２９７７）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｂ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２２００～約２４００（例えば約２３１１）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｃ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５３４）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｄ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５２８）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｅ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４７００（例えば約４５４９）ヌクレオチドの長さを有している（例えば図１５Ｆ）。一部の実施形態では、異種核酸ならびにイントロン、スプライスアクセプター部位、および／またはスプライスドナー部位（例えばＳＶ４０イントロン）を含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７および３１～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸ならびにイントロン、スプライスアクセプター部位、および／またはスプライスドナー部位（例えばＳＶ４０イントロン）を含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７および３１～３５のいずれか１つの配列を含む。
プロモーター
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子中のポリヌクレオチドは、ｒＡＡＶ粒子が導入される宿主の型（例えば細菌、真菌、植物、または動物）に特異的な、転写および翻訳の開始および停止のコドン等の制御配列を含む。好ましくは、ｒＡＡＶ粒子中の核酸分子は、宿主の属に特異的な制御配列を含む。最も好ましくは、分子は宿主の種に特異的な制御配列を含む。ｒＡＡＶ粒子中のポリヌクレオチドは、宿主細胞中での異種核酸の発現を提供するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）等の発現制御配列を含み得る。例示的な発現制御配列は当技術で公知である。一部の実施形態では、異種核酸は、光受容体細胞または網膜色素上皮細胞における異種核酸の発現を指令する１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。
一部の実施形態では、開示したｒＡＡＶベクターのいずれかのポリヌクレオチドは、哺乳動物の眼の１つまたは複数の光受容体または網膜色素上皮細胞において核酸配列を発現することができるプロモーターを含む。特定の実施形態では、本開示は、治療剤をコードする少なくとも第１の異種核酸配列に作動可能に連結されたＰＲ細胞またはＲＰＥ細胞に特異的なプロモーターを提供する。例示的なＰＲまたはＲＰＥ細胞特異的プロモーターは、ａ）光受容体特異的プロモーター（杆体および錐体細胞において活性）、例えばＩＲＢＰプロモーター（ｈＩＲＰＢ、ＩＲＢＰ、ＩＲＢＰ２４１）、ロドプシンキナーゼプロモーター（ｈＧＲＫ１、ＧＲＫ１、ＧＲＫ、ＲＫ）、および／またはキメラヒトレチノシシン－ＩＲＢＰエンハンサー（ＲＳ／ＩＲＰＢ）；錐体特異的プロモーター、例えば赤／緑錐体オプシンプロモーター（これは２．１ｋｂ（ＰＲ２．１）バージョンまたは１．７ｋｂ（ＰＲ１．７）バージョンを含んでよい。参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１８／０１１２２３１を参照）、錐体アレスチンプロモーター（ｈＣＡＲ、ＣＡＲ）、キメラＩＲＢＰエンハンサー－錐体トランスデューシンプロモーター（ＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２、ＩＲＢＰｅ－ＧＮＡＴ２）；杆体特異的プロモーター、例えばヒトロドプシンプロモーター（ＲＨＯ、ＲＨＯＰ、その他)、ヒトＮＲＬプロモーター（ＮＲＬ）；またはＲＰＥ特異的プロモーター、例えばＲＰＥ６５またはベストロフィン／ＶＭＤ２（ＢＥＳＴ１、ＢＥＳＴ、ＶＭＤ２）を含み得る。一部の実施形態では、プロモーターは、ＩＲＢＰプロモーター（ｈＩＲＰＢ、ＩＲＢＰ、ＩＲＢＰ２４１)等の光受容体特異的プロモーターである。一部の実施形態では、プロモーターは、ヒトロドプシンプロモーター（ＲＨＯ、ＲＨＯＰ）等の杆体特異的プロモーターである。
例示的な実施形態では、ポリヌクレオチドはｈＧＲＫ１プロモーターを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＣＢＡプロモーターを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは切断されたキメラＣＢＡ－ＣＭＶプロモーター（ｓｍＣＢＡ）を含み、これはＣＭＶエンハンサーおよび切断されたＣＢＡプロモーターを含む。
ｈＧＲＫ１プロモーターを含む本開示の例示的なベクターには、ＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ（図１５Ａ）、ＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ（図１５Ｃ）、ｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐ（図１５Ｄ）、ｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐ（図１５Ｅ）、およびｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐ（図１５Ｆ）が含まれる。ｓｍＣＢＡプロモーターを含む本開示の例示的なベクターは、ＡＡＶ－ＣＢＡ－ｈＲＳ１ｓｙｎ（図１５Ｂ）である。
一部の実施形態では、開示したｒＡＡＶベクターのいずれかのプロモーターは、配列番号７：
GGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGC（配列番号７）で説明されるｈＧＲＫ１プロモーターの配列と少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるヌクレオチド配列を含む。
一部の実施形態では、本開示は、ロドプシン、ｓｙｎｌ（シナプシン）、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＣＢ、ｓｍＣＢＡ、ＣＢｈ、またはＥＦ１－アルファプロモーターを含み得る少なくとも第１のポリヌクレオチドに作動可能に連結された構成的プロモーターを提供する。
一部の実施形態では、異種核酸およびプロモーターを含む核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、１７００ヌクレオチド（ｎｔ、または塩基対（ｂｐ））～約５０００、約４５５０、約４５４９、約４５３５、約４５３４、約４５２８、約４５２５、約４５００、約３２００、約３０００、約２９７７、約２９００、約２８００、約２３１１、約２３００、約１７２５、約１７２３、または約１７００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約１７００～約１８００（例えば約１７２３）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ａ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２９００～約３１００（例えば約２９７７）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｂ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２２００～約２４００（例えば約２３１１）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｃ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５３４）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｄ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５２８）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｅ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４７００（例えば約４５４９）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｆ）。一部の実施形態では、異種核酸およびプロモーターを含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７、３１～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸およびプロモーターを含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７、３１～３５のいずれか１つの配列を含む。
転写後制御エレメント
一部の実施形態では、核酸ベクターは転写後制御配列を含む。一部の実施形態では、核酸ベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）を含む。ポリヌクレオチドは、ＷＰＲＥエレメント、例えば配列番号１５のヌクレオチド配列を含むＷＰＲＥエレメントを含み得る。一部の実施形態では、ＷＰＲＥエレメントは異種核酸の３’に位置している。一部の実施形態では、ＷＰＲＥエレメントは異種核酸の５’に位置している。
一部の実施形態では、核酸ベクターはＷＰＲＥを含む。一部の例では、ＷＰＲＥはＷＰＲＥｓｆ配列であり、ここで添え字「ｓｆ」は投与に安全であることを示す。一部の実施形態では、開示したｒＡＡＶベクターのいずれかのポリヌクレオチドは、配列番号１５のヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９８％、または９９％の同一性を有するＷＰＲＥエレメントを含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは配列番号１５の配列を含む。
ＷＰＲＥｓｆ配列：
TCGACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGC（配列番号１５）
一部の実施形態では、異種核酸および転写後制御エレメントを含む核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、１７００ヌクレオチド（ｎｔ、または塩基対（ｂｐ））～約５０００、約４５５０、約４５４９、約４５３５、約４５３４、約４５２８、約４５２５、約４５００、約３２００、約３０００、約２９７７、約２９００、約２８００、約２３１１、約２３００、約１７２５、約１７２３、または約１７００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約１７００～約１８００（例えば約１７２３）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ａ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２９００～約３１００（例えば約２９７７）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｂ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２２００～約２４００（例えば約２３１１）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｃ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５３４）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｄ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５２８）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｅ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４７００（例えば約４５４９）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｆ）。一部の実施形態では、異種核酸および転写後制御エレメントを含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７および３１～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸および転写後制御エレメントを含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７および３１～３５のいずれか１つの配列を含む。
ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列
一部の実施形態では、核酸ベクターは、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含む。一部の実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、ウシ増殖因子ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ヒト増殖因子ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、およびウサギベータグロビン（ｒｂＧｌｏｂ）ポリアデニル化シグナルから選択される。
一部の実施形態では、ベクターはｂＧＨポリＡシグナルを含む。一部の実施形態では、ベクターはＳＶ４０ポリＡシグナルを含む。
一部の実施形態では、ベクターは配列番号１９と少なくとも８０％、８５％、９０、９２．５％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を有するｂＧＨポリＡシグナルを含む。一部の実施形態では、開示したベクターのいずれかのポリＡシグナルは、配列番号１９の核酸配列を含む。
ｂＧＨポリＡシグナル：
Figure 2023535956000005
 （配列番号１９）
一部の実施形態では、異種核酸およびポリＡシグナルを含む核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、１７００ヌクレオチド（ｎｔ、または塩基対（ｂｐ））～約５０００、約４５５０、約４５４９、約４５３５、約４５３４、約４５２８、約４５２５、約４５００、約３２００、約３０００、約２９７７、約２９００、約２８００、約２３１１、約２３００、約１７２５、約１７２３、または約１７００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約１７００～約１８００（例えば約１７２３）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ａ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２９００～約３１００（例えば約２９７７）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｂ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２２００～約２４００（例えば約２３１１）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｃ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５３４）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｄ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５２８）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｅ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４７００（例えば約４５４９）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｆ）。一部の実施形態では、異種核酸およびポリＡシグナルを含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７、３１～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸およびポリＡシグナルを含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７、３１～３５のいずれか１つの配列を含む。
ターミナルリピート
一部の実施形態では、核酸ベクターは１つまたは複数のターミナルリピートを含む。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１の逆位末端反復（ＩＴＲ）および第２の逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。一部の実施形態では、逆位末端反復は、配列番号２２または２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、逆位末端反復は配列番号２２または２３を含む。一部の実施形態では、逆位末端反復は配列番号２４または２５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、逆位末端反復は配列番号２４また２５を含む。
逆位末端反復（例えば第１のＩＴＲ）
GGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT（配列番号２２）
逆位末端反復（例えば第１のＩＴＲ）
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT（配列番号２３）
逆位末端反復（例えば第２のＩＴＲ）
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCC（配列番号２４）
逆位末端反復（例えば第２のＩＴＲ）
AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA（配列番号２５）
一部の実施形態では、異種核酸およびターミナルリピートを含む核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、１７００ヌクレオチド（ｎｔ、または塩基対（ｂｐ））～約５０００、約４５５０、約４５４９、約４５３５、約４５３４、約４５２８、約４５２５、約４５００、約３２００、約３０００、約２９７７、約２９００、約２８００、約２３１１、約２３００、約１７２５、約１７２３、または約１７００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約１７００～約１８００（例えば約１７２３）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ａ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２９００～約３１００（例えば約２９７７）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｂ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約２２００～約２４００（例えば約２３１１）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｃ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５３４）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｄ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４６００（例えば約４５２８）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｅ）。一部の実施形態では、核酸ベクターは、第１のＩＴＲの５’開始から第２のＩＴＲの３’末端まで、約４４００～約４７００（例えば約４５４９）ヌクレオチドの長さを有する（例えば図１５Ｆ）。一部の実施形態では、異種核酸およびターミナルリピートを含む核酸ベクターは、配列番号１６、１７、および３１～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸およびターミナルリピートを含む核酸ベクターは、配列番号１６、１７、および３１～３５のいずれか１つの配列を含む。
スタッファー配列
一部の実施形態では、本開示のｒＡＡＶベクターは、１つまたは複数のスタッファー配列を含む。一部の実施形態では、「スタッファー」配列は、ｒＡＡＶベクターの長さを増大させる一般的で不活性な非コード配列を意味する。一部の実施形態では、スタッファー配列は開示したｒＡＡＶベクターのいずれかの長さを増大させ、それにより、カセットはｗｔＡＡＶのゲノムサイズ（例えばＩＴＲからＩＴＲまで約４．８ｋｂ）に近くなる。
一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１００～約５０００核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１００～約５０００、約１００～約４０００、約１００～約３０００、または約１００～約２０００核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１００～約５０００、約５００～約５０００、約１０００～約５０００、約２０００～約５０００、または約３０００～約５０００核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、約１０００～約５０００、約１０５０～約４５００、または約２０００～約３０００核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、約２８２２核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、約２８２０核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、約２２４９核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、約２２３５核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、約２２１９核酸塩基の長さを有する。
一部の実施形態では、核酸スタッファー配列を含むカセット（第１のＩＴＲの開始から第２のＩＴＲの末端まで）は、約２０００～約５０００核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列を含むカセットは、約３０００～約５０００、約３５００～約５０００、約４０００～約５０００、約４１００～約５０００、約４２００～約５０００、約４３００～約５０００、約４４００～約５０００、約４５００～約５０００、約４０００～約４９００、約４１００～約４９００、約４２００～約４９００、約４３００～約４９００、約４４００～約４９００、約４０００～約４８００、約４１００～約４８００、約４２００～約４８００、約４３００～約４８００、約４４００～約４８００、約４０００～約４７００、約４１００～約５０００、約４２００～約４７００、約４３００～約４７００、約４４００～約４７００、約４０００～約４６００、約４１００～約４６００、約４２００～約４６００、約４３００～約４６００、約４４００～約４６００、約４０００～約４５００、約４１００～約４５００、約４２００～約４５００、約４３００～約４５００、または約４４００～約４５００核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列を含むカセットは、約４５００、４５１０、４５２０、４５３０、４５４０、４５５０、４５６０、４５７０、４５８０、４５９０、または５０００核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列を含むカセットは、約４５３４核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列を含むカセットは、約４５２８核酸塩基の長さを有する。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列を含むカセットは、約４５４９核酸塩基の長さを有する。
一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号２６～３０のいずれか１つと約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の配列を含む。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号２６～３０のいずれか１つと約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の配列を含む。一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号２６～３０のいずれか１つと約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の配列を含む。
一部の実施形態では、核酸スタッファー配列は、配列番号２６～３０のいずれか１つの塩基１～１００、２～１０１、３～１０２、４～１０３、５～１０４、６～１０５、７～１０６、８～１０７、９～１０８、１０～１０９、１１～１１０、１２～１１１、１３～１１２、１４～１１３、１５～１１４、１６～１１５、１７～１１６、１８～１１７、１９～１１８、２０～１１９、２１～１２０、２２～１２１、２３～１２２、２４～１２３、２５～１２４、２６～１２５、２７～１２６、２８～１２７、２９～１２８、３０～１２９、３１～１３０、３２～１３１、３３～１３２、３４～１３３、３５～１３４、３６～１３５、３７～１３６、３８～１３７、３９～１３８、４０～１３９、４１～１４０、４２～１４１、４３～１４２、４４～１４３、４５～１４４、４６～１４５、４７～１４６、４８～１４７、４９～１４８、５０～１４９、５１～１５０、５２～１５１、５３～１５２、５４～１５３、５５～１５４、５６～１５５、５７～１５６、５８～１５７、５９～１５８、６０～１５９、６１～１６０、６２～１６１、６３～１６２、６４～１６３、６５～１６４、６６～１６５、６７～１６６、６８～１６７、６９～１６８、７０～１６９、７１～１７０、７２～１７１、７３～１７２、７４～１７３、７５～１７４、７６～１７５、７７～１７６、７８～１７７、７９～１７８、８０～１７９、８１～１８０、８２～１８１、８３～１８２、８４～１８３、８５～１８４、８６～１８５、８７～１８６、８８～１８７、８９～１８８、９０～１８９、９１～１９０、９２～１９１、９３～１９２、９４～１９３、９５～１９４、９６～１９５、９７～１９６、９８～１９７、９９～１９８、１００～１９９、１０１～２００、１０２～２０１、１０３～２０２、１０４～２０３、１０５～２０４、１０６～２０５、１０７～２０６、１０８～２０７、１０９～２０８、１１０～２０９、１１１～２１０、１１２～２１１、１１３～２１２、１１４～２１３、１１５～２１４、１１６～２１５、１１７～２１６、１１８～２１７、１１９～２１８、１２０～２１９、１２１～２２０、１２２～２２１、１２３～２２２、１２４～２２３、１２５～２２４、１２６～２２５、１２７～２２６、１２８～２２７、１２９～２２８、１３０～２２９、１３１～２３０、１３２～２３１、１３３～２３２、１３４～２３３、１３５～２３４、１３６～２３５、１３７～２３６、１３８～２３７、１３９～２３８、１４０～２３９、１４１～２４０、１４２～２４１、１４３～２４２、１４４～２４３、１４５～２４４、１４６～２４５、１４７～２４６、１４８～２４７、１４９～２４８、１５０～２４９、１５１～２５０、１５２～２５１、１５３～２５２、１５４～２５３、１５５～２５４、１５６～２５５、１５７～２５６、１５８～２５７、１５９～２５８、１６０～２５９、１６１～２６０、１６２～２６１、１６３～２６２、１６４～２６３、１６５～２６４、１６６～２６５、１６７～２６６、１６８～２６７、１６９～２６８、１７０～２６９、１７１～２７０、１７２～２７１、１７３～２７２、１７４～２７３、１７５～２７４、１７６～２７５、１７７～２７６、１７８～２７７、１７９～２７８、１８０～２７９、１８１～２８０、１８２～２８１、１８３～２８２、１８４～２８３、１８５～２８４、１８６～２８５、１８７～２８６、１８８～２８７、１８９～２８８、１９０～２８９、１９１～２９０、１９２～２９１、１９３～２９２、１９４～２９３、１９５～２９４、１９６～２９５、１９７～２９６、１９８～２９７、１９９～２９８、２００～２９９、２０１～３００、２０２～３０１、２０３～３０２、２０４～３０３、２０５～３０４、２０６～３０５、２０７～３０６、２０８～３０７、２０９～３０８、２１０～３０９、２１１～３１０、２１２～３１１、２１３～３１２、２１４～３１３、２１５～３１４、２１６～３１５、２１７～３１６、２１８～３１７、２１９～３１８、２２０～３１９、２２１～３２０、２２２～３２１、２２３～３２２、２２４～３２３、２２５～３２４、２２６～３２５、２２７～３２６、２２８～３２７、２２９～３２８、２３０～３２９、２３１～３３０、２３２～３３１、２３３～３３２、２３４～３３３、２３５～３３４、２３６～３３５、２３７～３３６、２３８～３３７、２３９～３３８、２４０～３３９、２４１～３４０、２４２～３４１、２４３～３４２、２４４～３４３、２４５～３４４、２４６～３４５、２４７～３４６、２４８～３４７、２４９～３４８、２５０～３４９、２５１～３５０、２５２～３５１、２５３～３５２、２５４～３５３、２５５～３５４、２５６～３５５、２５７～３５６、２５８～３５７、２５９～３５８、２６０～３５９、２６１～３６０、２６２～３６１、２６３～３６２、２６４～３６３、２６５～３６４、２６６～３６５、２６７～３６６、２６８～３６７、２６９～３６８、２７０～３６９、２７１～３７０、２７２～３７１、２７３～３７２、２７４～３７３、２７５～３７４、２７６～３７５、２７７～３７６、２７８～３７７、２７９～３７８、２８０～３７９、２８１～３８０、２８２～３８１、２８３～３８２、２８４～３８３、２８５～３８４、２８６～３８５、２８７～３８６、２８８～３８７、２８９～３８８、２９０～３８９、２９１～３９０、２９２～３９１、２９３～３９２、２９４～３９３、２９５～３９４、２９６～３９５、２９７～３９６、２９８～３９７、２９９～３９８、３００～３９９、３０１～４００、３０２～４０１、３０３～４０２、３０４～４０３、３０５～４０４、３０６～４０５、３０７～４０６、３０８～４０７、３０９～４０８、３１０～４０９、３１１～４１０、３１２～４１１、３１３～４１２、３１４～４１３、３１５～４１４、３１６～４１５、３１７～４１６、３１８～４１７、３１９～４１８、３２０～４１９、３２１～４２０、３２２～４２１、３２３～４２２、３２４～４２３、３２５～４２４、３２６～４２５、３２７～４２６、３２８～４２７、３２９～４２８、３３０～４２９、３３１～４３０、３３２～４３１、３３３～４３２、３３４～４３３、３３５～４３４、３３６～４３５、３３７～４３６、３３８～４３７、３３９～４３８、３４０～４３９、３４１～４４０、３４２～４４１、３４３～４４２、３４４～４４３、３４５～４４４、３４６～４４５、３４７～４４６、３４８～４４７、３４９～４４８、３５０～４４９、３５１～４５０、３５２～４５１、３５３～４５２、３５４～４５３、３５５～４５４、３５６～４５５、３５７～４５６、３５８～４５７、３５９～４５８、３６０～４５９、３６１～４６０、３６２～４６１、３６３～４６２、３６４～４６３、３６５～４６４、３６６～４６５、３６７～４６６、３６８～４６７、３６９～４６８、３７０～４６９、３７１～４７０、３７２～４７１、３７３～４７２、３７４～４７３、３７５～４７４、３７６～４７５、３７７～４７６、３７８～４７７、３７９～４７８、３８０～４７９、３８１～４８０、３８２～４８１、３８３～４８２、３８４～４８３、３８５～４８４、３８６～４８５、３８７～４８６、３８８～４８７、３８９～４８８、３９０～４８９、３９１～４９０、３９２～４９１、３９３～４９２、３９４～４９３、３９５～４９４、３９６～４９５、３９７～４９６、３９８～４９７、３９９～４９８、４００～４９９、４０１～５００、４０２～５０１、４０３～５０２、４０４～５０３、４０５～５０４、４０６～５０５、４０７～５０６、４０８～５０７、４０９～５０８、４１０～５０９、４１１～５１０、４１２～５１１、４１３～５１２、４１４～５１３、４１５～５１４、４１６～５１５、４１７～５１６、４１８～５１７、４１９～５１８、４２０～５１９、４２１～５２０、４２２～５２１、４２３～５２２、４２４～５２３、４２５～５２４、４２６～５２５、４２７～５２６、４２８～５２７、４２９～５２８、４３０～５２９、４３１～５３０、４３２～５３１、４３３～５３２、４３４～５３３、４３５～５３４、４３６～５３５、４３７～５３６、４３８～５３７、４３９～５３８、４４０～５３９、４４１～５４０、４４２～５４１、４４３～５４２、４４４～５４３、４４５～５４４、４４６～５４５、４４７～５４６、４４８～５４７、４４９～５４８、４５０～５４９、４５１～５５０、４５２～５５１、４５３～５５２、４５４～５５３、４５５～５５４、４５６～５５５、４５７～５５６、４５８～５５７、４５９～５５８、４６０～５５９、４６１～５６０、４６２～５６１、４６３～５６２、４６４～５６３、４６５～５６４、４６６～５６５、４６７～５６６、４６８～５６７、４６９～５６８、４７０～５６９、４７１～５７０、４７２～５７１、４７３～５７２、４７４～５７３、４７５～５７４、４７６～５７５、４７７～５７６、４７８～５７７、４７９～５７８、４８０～５７９、４８１～５８０、４８２～５８１、４８３～５８２、４８４～５８３、４８５～５８４、４８６～５８５、４８７～５８６、４８８～５８７、４８９～５８８、４９０～５８９、４９１～５９０、４９２～５９１、４９３～５９２、４９４～５９３、４９５～５９４、４９６～５９５、４９７～５９６、４９８～５９７、４９９～５９８、５００～５９９、５０１～６００、５０２～６０１、５０３～６０２、５０４～６０３、５０５～６０４、５０６～６０５、５０７～６０６、５０８～６０７、５０９～６０８、５１０～６０９、５１１～６１０、５１２～６１１、５１３～６１２、５１４～６１３、５１５～６１４、５１６～６１５、５１７～６１６、５１８～６１７、５１９～６１８、５２０～６１９、５２１～６２０、５２２～６２１、５２３～６２２、５２４～６２３、５２５～６２４、５２６～６２５、５２７～６２６、５２８～６２７、５２９～６２８、５３０～６２９、５３１～６３０、５３２～６３１、５３３～６３２、５３４～６３３、５３５～６３４、５３６～６３５、５３７～６３６、５３８～６３７、５３９～６３８、５４０～６３９、５４１～６４０、５４２～６４１、５４３～６４２、５４４～６４３、５４５～６４４、５４６～６４５、５４７～６４６、５４８～６４７、５４９～６４８、５５０～６４９、５５１～６５０、５５２～６５１、５５３～６５２、５５４～６５３、５５５～６５４、５５６～６５５、５５７～６５６、５５８～６５７、５５９～６５８、５６０～６５９、５６１～６６０、５６２～６６１、５６３～６６２、５６４～６６３、５６５～６６４、５６６～６６５、５６７～６６６、５６８～６６７、５６９～６６８、５７０～６６９、５７１～６７０、５７２～６７１、５７３～６７２、５７４～６７３、５７５～６７４、５７６～６７５、５７７～６７６、５７８～６７７、５７９～６７８、５８０～６７９、５８１～６８０、５８２～６８１、５８３～６８２、５８４～６８３、５８５～６８４、５８６～６８５、５８７～６８６、５８８～６８７、５８９～６８８、５９０～６８９、５９１～６９０、５９２～６９１、５９３～６９２、５９４～６９３、５９５～６９４、５９６～６９５、５９７～６９６、５９８～６９７、５９９～６９８、６００～６９９、６０１～７００、６０２～７０１、６０３～７０２、６０４～７０３、６０５～７０４、６０６～７０５、６０７～７０６、６０８～７０７、６０９～７０８、６１０～７０９、６１１～７１０、６１２～７１１、６１３～７１２、６１４～７１３、６１５～７１４、６１６～７１５、６１７～７１６、６１８～７１７、６１９～７１８、６２０～７１９、６２１～７２０、６２２～７２１、６２３～７２２、６２４～７２３、６２５～７２４、６２６～７２５、６２７～７２６、６２８～７２７、６２９～７２８、６３０～７２９、６３１～７３０、６３２～７３１、６３３～７３２、６３４～７３３、６３５～７３４、６３６～７３５、６３７～７３６、６３８～７３７、６３９～７３８、６４０～７３９、６４１～７４０、６４２～７４１、６４３～７４２、６４４～７４３、６４５～７４４、６４６～７４５、６４７～７４６、６４８～７４７、６４９
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２０、１２２１～１３２１、１２２２～１３２２、１２２３～１３２３、１２２４～１３２４、１２２５～１３２５、１２２６～１３２６、１２２７～１３２７、１２２８～１３２８、１２２９～１３２９、１２３０～１３３０、１２３１～１３３１、１２３２～１３３２、１２３３～１３３３、１２３４～１３３４、１２３５～１３３５、１２３６～１３３６、１２３７～１３３７、１２３８～１３３８、１２３９～１３３９、１２４０～１３４０、１２４１～１３４１、１２４２～１３４２、１２４３～１３４３、１２４４～１３４４、１２４５～１３４５、１２４６～１３４６、１２４７～１３４７、１２４８～１３４８、１２４９～１３４９、１２５０～１３５０、１２５１～１３５１、１２５２～１３５２、１２５３～１３５３、１２５４～１３５４、１２５５～１３５５、１２５６～１３５６、１２５７～１３５７、１２５８～１３５８、１２５９～１３５９、１２６０～１３６０、１２６１～１３６１、１２６２～１３６２、１２６３～１３６３、１２６４～１３６４、１２６５～１３６５、１２６６～１３６６、１２６７～１３６７、１２６８～１３６８、１２６９～１３６９、１２７０～１３７０、１２７１～１３７１、１２７２～１３７２、１２７３～１３７３、１２７４～１３７４、１２７５～１３７５、１２７６～１３７６、１２７７～１３７７、１２７８～１３７８、１２７９～１３７９、１２８０～１３８０、１２８１～１３８１、１２８２～１３８２、１２８３～１３８３、１２８４～１３８４、１２８５～１３８５、１２８６～１３８６、１２８７～１３８７、１２８８～１３８８、１２８９～１３８９、１２９０～１３９０、１２９１～１３９１、１２９２～１３９２、１２９３～１３９３、１２９４～１３９４、１２９５～１３９５、１２９６～１３９６、１２９７～１３９７、１２９８～１３９８、１２９９～１３９９、１３００～１４００、１３０１～１４０１、１３０２～１４０２、１３０３～１４０３、１３０４～１４０４、１３０５～１４０５、１３０６～１４０６、１３０７～１４０７、１３０８～１４０８、１３０９～１４０９、１３１０～１４１０、１３１１～１４１１、１３１２～１４１２、１３１３～１４１３、１３１４～１４１４、１３１５～１４１５、１３１６～１４１６、１３１７～１４１７、１３１８～１４１８、１３１９～１４１９、１３２０～１４２０、１３２１～１４２１、１３２２～１４２２、１３２３～１４２３、１３２４～１４２４、１３２５～１４２５、１３２６～１４２６、１３２７～１４２７、１３２８～１４２８、１３２９～１４２９、１３３０～１４３０、１３３１～１４３１、１３３２～１４３２、１３３３～１４３３、１３３４～１４３４、１３３５～１４３５、１３３６～１４３６、１３３７～１４３７、１３３８～１４３８、１３３９～１４３９、１３４０～１４４０、１３４１～１４４１、１３４２～１４４２、１３４３～１４４３、１３４４～１４４４、１３４５～１４４５、１３４６～１４４６、１３４７～１４４７、１３４８～１４４８、１３４９～１４４９、１３５０～１４５０、１３５１～１４５１、１３５２～１４５２、１３５３～１４５３、１３５４～１４５４、１３５５～１４５５、１３５６～１４５６、１３５７～１４５７、１３５８～１４５８、１３５９～１４５９、１３６０～１４６０、１３６１～１４６１、１３６２～１４６２、１３６３～１４６３、１３６４～１４６４、１３６５～１４６５、１３６６～１４６６、１３６７～１４６７、１３６８～１４６８、１３６９～１４６９、１３７０～１４７０、１３７１～１４７１、１３７２～１４７２、１３７３～１４７３、１３７４～１４７４、１３７５～１４７５、１３７６～１４７６、１３７７～１４７７、１３７８～１４７８、１３７９～１４７９、１３８０～１４８０、１３８１～１４８１、１３８２～１４８２、１３８３～１４８３、１３８４～１４８４、１３８５～１４８５、１３８６～１４８６、１３８７～１４８７、１３８８～１４８８、１３８９～１４８９、１３９０～１４９０、１３９１～１４９１、１３９２～１４９２、１３９３～１４９３、１３９４～１４９４、１３９５～１４９５、１３９６～１４９６、１３９７～１４９７、１３９８～１４９８、１３９９～１４９９、１４００～１５００、１４０１～１５０１、１４０２～１５０２、１４０３～１５０３、１４０４～１５０４、１４０５～１５０５、１４０６～１５０６、１４０７～１５０７、１４０８～１５０８、１４０９～１５０９、１４１０～１５１０、１４１１～１５１１、１４１２～１５１２、１４１３～１５１３、１４１４～１５１４、１４１５～１５１５、１４１６～１５１６、１４１７～１５１７、１４１８～１５１８、１４１９～１５１９、１４２０～１５２０、１４２１～１５２１、１４２２～１５２２、１４２３～１５２３、１４２４～１５２４、１４２５～１５２５、１４２６～１５２６、１４２７～１５２７、１４２８～１５２８、１４２９～１５２９、１４３０～１５３０、１４３１～１５３１、１４３２～１５３２、１４３３～１５３３、１４３４～１５３４、１４３５～１５３５、１４３６～１５３６、１４３７～１５３７、１４３８～１５３８、１４３９～１５３９、１４４０～１５４０、１４４１～１５４１、１４４２～１５４２、１４４３～１５４３、１４４４～１５４４、１４４５～１５４５、１４４６～１５４６、１４４７～１５４７、１４４８～１５４８、１４４９～１５４９、１４５０～１５５０、１４５１～１５５１、１４５２～１５５２、１４５３～１５５３、１４５４～１５５４、１４５５～１５５５、１４５６～１５５６、１４５７～１５５７、１４５８～１５５８、１４５９～１５５９、１４６０～１５６０、１４６１～１５６１、１４６２～１５６２、１４６３～１５６３、１４６４～１５６４、１４６５～１５６５、１４６６～１５６６、１４６７～１５６７、１４６８～１５６８、１４６９～１５６９、１４７０～１５７０、１４７１～１５７１、１４７２～１５７２、１４７３～１５７３、１４７４～１５７４、１４７５～１５７５、１４７６～１５７６、１４７７～１５７７、１４７８～１５７８、１４７９～１５７９、１４８０～１５８０、１４８１～１５８１、１４８２～１５８２、１４８３～１５８３、１４８４～１５８４、１４８５～１５８５、１４８６～１５８６、１４８７～１５８７、１４８８～１５８８、１４８９～１５８９、１４９０～１５９０、１４９１～１５９１、１４９２～１５９２、１４９３～１５９３、１４９４～１５９４、１４９５～１５９５、１４９６～１５９６、１４９７～１５９７、１４９８～１５９８、１４９９～１５９９、１５００～１６００、１５０１～１６０１、１５０２～１６０２、１５０３～１６０３、１５０４～１６０４、１５０５～１６０５、１５０６～１６０６、１５０７～１６０７、１５０８～１６０８、１５０９～１６０９、１５１０～１６１０、１５１１～１６１１、１５１２～１６１２、１５１３～１６１３、１５１４～１６１４、１５１５～１６１５、１５１６～１６１６、１５１７～１６１７、１５１８～１６１８、１５１９～１６１９、１５２０～１６２０、１５２１～１６２１、１５２２～１６２２、１５２３～１６２３、１５２４～１６２４、１５２５～１６２５、１５２６～１６２６、１５２７～１６２７、１５２８～１６２８、１５２９～１６２９、１５３０～１６３０、１５３１～１６３１、１５３２～１６３２、１５３３～１６３３、１５３４～１６３４、１５３５～１６３５、１５３６～１６３６、１５３７～１６３７、１５３８～１６３８、１５３９～１６３９、１５４０～１６４０、１５４１～１６４１、１５４２～１６４２、１５４３～１６４３、１５４４～１６４４、１５４５～１６４５、１５４６～１６４６、１５４７～１６４７、１５４８～１６４８、１５４９～１６４９、１５５０～１６５０、１５５１～１６５１、１５５２～１６５２、１５５３～１６５３、１５５４～１６５４、１５５５～１６５５、１５５６～１６５６、１５５７～１６５７、１５５８～１６５８、１５５９～１６５９、１５６０～１６６０、１５６１～１６６１、１５６２～１６６２、１５６３～１６６３、１５６４～１６６４、１５６５～１６６５、１５６６～１６６６、１５６７～１６６７、１５６８～１６６８、１５６９～１６６９、１５７０～１６７０、１５７１～１６７１、１５７２～１６７２、１５７３～１６７３、１５７４～１６７４、１５７５～１６７５、１５７６～１６７６、１５７７～１６７７、１５７８～１６７８、１５７９～１６７９、１５８０～１６８０、１５８１～１６８１、１５８２～１６８２、１５８３～１６８３、１５８４～１６８４、１５８５～１６８５、１５８６～１６８６、１５８７～１６８７、１５８８～１６８８、１５８９～１６８９、１５９０～１６９０、１５９１～１６９１、１５９２～１６９２、１５９３～１６９３、１５９４～１６９４、１５９５～１６９５、１５９６～１６９６、１５９７～１６９７、１５９８～１６９８、１５９９～１６９９、１６００～１７００、１６０１～１７０１、１６０２～１７０２、１６０３～１７０３、１６０４～１７０４、１６０５～１７０５、１６０６～１７０６、１６０７～１７０７、１６０８～１７０８、１６０９～１７０９、１６１０～１７１０、１６１１～１７１１、１６１２～１７１２、１６１３～１７１３、１６１４～１７１４、１６１５～１７１５、１６１６～１７１６、１６１７～１７１７、１６１８～１７１８、１６１９～１７１９、１６２０～１７２０、１６２１～１７２１、１６２２～１７２２、１６２３～１７２３、１６２４～１７２４、１６２５～１７２５、１６２６～１７２６、１６２７～１７２７、１６２８～１７２８、１６２９～１７２９、１６３０～１７３０、１６３１～１７３１、１６３２～１７３２、１６３３～１７３３、１６３４～１７３４、１６３５～１７３５、１６３６～１７３６、１６３７～１７３７、１６３８～１７３８、１６３９～１７３９、１６４０～１７４０、１６４１～１７４１、１６４２～１７４２、１６４３～１７４３、１６４４～１７４４、１６４５～１７４５、１６４６～１７４６、１６４７～１７４７、１６４８～１７４８、１６４９～１７４９、１６５０～１７５０、１６５１～１７５１、１６５２～１７５２、１６５３～１７５３、１６５４～１７５４、１６５５～１７５５、１６５６～１７５６、１６５７～１７５７、１６５８～１７５８、１６５９～１７５９、１６６０～１７６０、１６６１～１７６１、１６６２～１７６２、１６６３～１７６３、１６６４～１７６４、１６６５～１７６５、１６６６～１７６６、１６６７～１７６７、１６６８～１７６８、１６６９～１７６９、１６７０～１７７０、１６７１～１７７１、１６７２～１７７２、１６７３～１７７３、１６７４～１７７４、１６７５～１７７５、１６７６～１７７６、１６７７～１７７７、１６７８～１７７８、１６７９～１７７９、１６８０～１７８０、１６８１～１７８１、１６８２～１７８２、１６８３～１７８３、１６８４～１７８４、１６８５～１７８５、１６８６～１７８６、１６８７～１７８７、１６８８～１７８８、１６８９～１７８９、１６９０～１７９０、１６９１～１７９１、１６９２～１７９２、１６９３～１７９３、１６９４～１７９４、１６９５～１７９５、１６９６～１７９６、１６９７～１７９７、１６９８～１７９８、１６９９～１７９９、１７００～１８００、１７０１～１８０１、１７０２～１８０２、１７０３～１８０３、１７０４～１８０４、１７０５～１８０５、１７０６～１８０６、１７０７～１８０７、１７０８～１８０８、１７０９～１８０９、１７１０～１８１０、１７１１～１８１１、１７１２～１８１２、１７１３～１８１３、１７１４～１８１４、１７１５～１８１５、１７１６～１８１６、１７１７～１８１７、１７１８～１８１８、１７１９～１８１９、１７２０～１８２０、１７２１～１８２１、１７２２～１８２２、１７２３～１８２３、１７２４～１８２４、１７２５～１８２５、１７２６～１８２６、１７２７～１８２７、１７２８～１８２８、１７２９～１８２９、１７３０～１８３０、１７３１～１８３１、１７３２～１８３
２、１７３３～１８３３、１７３４～１８３４、１７３５～１８３５、１７３６～１８３６、１７３７～１８３７、１７３８～１８３８、１７３９～１８３９、１７４０～１８４０、１７４１～１８４１、１７４２～１８４２、１７４３～１８４３、１７４４～１８４４、１７４５～１８４５、１７４６～１８４６、１７４７～１８４７、１７４８～１８４８、１７４９～１８４９、１７５０～１８５０、１７５１～１８５１、１７５２～１８５２、１７５３～１８５３、１７５４～１８５４、１７５５～１８５５、１７５６～１８５６、１７５７～１８５７、１７５８～１８５８、１７５９～１８５９、１７６０～１８６０、１７６１～１８６１、１７６２～１８６２、１７６３～１８６３、１７６４～１８６４、１７６５～１８６５、１７６６～１８６６、１７６７～１８６７、１７６８～１８６８、１７６９～１８６９、１７７０～１８７０、１７７１～１８７１、１７７２～１８７２、１７７３～１８７３、１７７４～１８７４、１７７５～１８７５、１７７６～１８７６、１７７７～１８７７、１７７８～１８７８、１７７９～１８７９、１７８０～１８８０、１７８１～１８８１、１７８２～１８８２、１７８３～１８８３、１７８４～１８８４、１７８５～１８８５、１７８６～１８８６、１７８７～１８８７、１７８８～１８８８、１７８９～１８８９、１７９０～１８９０、１７９１～１８９１、１７９２～１８９２、１７９３～１８９３、１７９４～１８９４、１７９５～１８９５、１７９６～１８９６、１７９７～１８９７、１７９８～１８９８、１７９９～１８９９、１８００～１９００、１８０１～１９０１、１８０２～１９０２、１８０３～１９０３、１８０４～１９０４、１８０５～１９０５、１８０６～１９０６、１８０７～１９０７、１８０８～１９０８、１８０９～１９０９、１８１０～１９１０、１８１１～１９１１、１８１２～１９１２、１８１３～１９１３、１８１４～１９１４、１８１５～１９１５、１８１６～１９１６、１８１７～１９１７、１８１８～１９１８、１８１９～１９１９、１８２０～１９２０、１８２１～１９２１、１８２２～１９２２、１８２３～１９２３、１８２４～１９２４、１８２５～１９２５、１８２６～１９２６、１８２７～１９２７、１８２８～１９２８、１８２９～１９２９、１８３０～１９３０、１８３１～１９３１、１８３２～１９３２、１８３３～１９３３、１８３４～１９３４、１８３５～１９３５、１８３６～１９３６、１８３７～１９３７、１８３８～１９３８、１８３９～１９３９、１８４０～１９４０、１８４１～１９４１、１８４２～１９４２、１８４３～１９４３、１８４４～１９４４、１８４５～１９４５、１８４６～１９４６、１８４７～１９４７、１８４８～１９４８、１８４９～１９４９、１８５０～１９５０、１８５１～１９５１、１８５２～１９５２、１８５３～１９５３、１８５４～１９５４、１８５５～１９５５、１８５６～１９５６、１８５７～１９５７、１８５８～１９５８、１８５９～１９５９、１８６０～１９６０、１８６１～１９６１、１８６２～１９６２、１８６３～１９６３、１８６４～１９６４、１８６５～１９６５、１８６６～１９６６、１８６７～１９６７、１８６８～１９６８、１８６９～１９６９、１８７０～１９７０、１８７１～１９７１、１８７２～１９７２、１８７３～１９７３、１８７４～１９７４、１８７５～１９７５、１８７６～１９７６、１８７７～１９７７、１８７８～１９７８、１８７９～１９７９、１８８０～１９８０、１８８１～１９８１、１８８２～１９８２、１８８３～１９８３、１８８４～１９８４、１８８５～１９８５、１８８６～１９８６、１８８７～１９８７、１８８８～１９８８、１８８９～１９８９、１８９０～１９９０、１８９１～１９９１、１８９２～１９９２、１８９３～１９９３、１８９４～１９９４、１８９５～１９９５、１８９６～１９９６、１８９７～１９９７、１８９８～１９９８、１８９９～１９９９、１９００～２０００、１９０１～２００１、１９０２～２００２、１９０３～２００３、１９０４～２００４、１９０５～２００５、１９０６～２００６、１９０７～２００７、１９０８～２００８、１９０９～２００９、１９１０～２０１０、１９１１～２０１１、１９１２～２０１２、１９１３～２０１３、１９１４～２０１４、１９１５～２０１５、１９１６～２０１６、１９１７～２０１７、１９１８～２０１８、１９１９～２０１９、１９２０～２０２０、１９２１～２０２１、１９２２～２０２２、１９２３～２０２３、１９２４～２０２４、１９２５～２０２５、１９２６～２０２６、１９２７～２０２７、１９２８～２０２８、１９２９～２０２９、１９３０～２０３０、１９３１～２０３１、１９３２～２０３２、１９３３～２０３３、１９３４～２０３４、１９３５～２０３５、１９３６～２０３６、１９３７～２０３７、１９３８～２０３８、１９３９～２０３９、１９４０～２０４０、１９４１～２０４１、１９４２～２０４２、１９４３～２０４３、１９４４～２０４４、１９４５～２０４５、１９４６～２０４６、１９４７～２０４７、１９４８～２０４８、１９４９～２０４９、１９５０～２０５０、１９５１～２０５１、１９５２～２０５２、１９５３～２０５３、１９５４～２０５４、１９５５～２０５５、１９５６～２０５６、１９５７～２０５７、１９５８～２０５８、１９５９～２０５９、１９６０～２０６０、１９６１～２０６１、１９６２～２０６２、１９６３～２０６３、１９６４～２０６４、１９６５～２０６５、１９６６～２０６６、１９６７～２０６７、１９６８～２０６８、１９６９～２０６９、１９７０～２０７０、１９７１～２０７１、１９７２～２０７２、１９７３～２０７３、１９７４～２０７４、１９７５～２０７５、１９７６～２０７６、１９７７～２０７７、１９７８～２０７８、１９７９～２０７９、１９８０～２０８０、１９８１～２０８１、１９８２～２０８２、１９８３～２０８３、１９８４～２０８４、１９８５～２０８５、１９８６～２０８６、１９８７～２０８７、１９８８～２０８８、１９８９～２０８９、１９９０～２０９０、１９９１～２０９１、１９９２～２０９２、１９９３～２０９３、１９９４～２０９４、１９９５～２０９５、１９９６～２０９６、１９９７～２０９７、１９９８～２０９８、１９９９～２０９９、２０００～２１００、２００１～２１０１、２００２～２１０２、２００３～２１０３、２００４～２１０４、２００５～２１０５、２００６～２１０６、２００７～２１０７、２００８～２１０８、２００９～２１０９、２０１０～２１１０、２０１１～２１１１、２０１２～２１１２、２０１３～２１１３、２０１４～２１１４、２０１５～２１１５、２０１６～２１１６、２０１７～２１１７、２０１８～２１１８、２０１９～２１１９、２０２０～２１２０、２０２１～２１２１、２０２２～２１２２、２０２３～２１２３、２０２４～２１２４、２０２５～２１２５、２０２６～２１２６、２０２７～２１２７、２０２８～２１２８、２０２９～２１２９、２０３０～２１３０、２０３１～２１３１、２０３２～２１３２、２０３３～２１３３、２０３４～２１３４、２０３５～２１３５、２０３６～２１３６、２０３７～２１３７、２０３８～２１３８、２０３９～２１３９、２０４０～２１４０、２０４１～２１４１、２０４２～２１４２、２０４３～２１４３、２０４４～２１４４、２０４５～２１４５、２０４６～２１４６、２０４７～２１４７、２０４８～２１４８、２０４９～２１４９、２０５０～２１５０、２０５１～２１５１、２０５２～２１５２、２０５３～２１５３、２０５４～２１５４、２０５５～２１５５、２０５６～２１５６、２０５７～２１５７、２０５８～２１５８、２０５９～２１５９、２０６０～２１６０、２０６１～２１６１、２０６２～２１６２、２０６３～２１６３、２０６４～２１６４、２０６５～２１６５、２０６６～２１６６、２０６７～２１６７、２０６８～２１６８、２０６９～２１６９、２０７０～２１７０、２０７１～２１７１、２０７２～２１７２、２０７３～２１７３、２０７４～２１７４、２０７５～２１７５、２０７６～２１７６、２０７７～２１７７、２０７８～２１７８、２０７９～２１７９、２０８０～２１８０、２０８１～２１８１、２０８２～２１８２、２０８３～２１８３、２０８４～２１８４、２０８５～２１８５、２０８６～２１８６、２０８７～２１８７、２０８８～２１８８、２０８９～２１８９、２０９０～２１９０、２０９１～２１９１、２０９２～２１９２、２０９３～２１９３、２０９４～２１９４、２０９５～２１９５、２０９６～２１９６、２０９７～２１９７、２０９８～２１９８、２０９９～２１９９、２１００～２２００、２１０１～２２０１、２１０２～２２０２、２１０３～２２０３、２１０４～２２０４、２１０５～２２０５、２１０６～２２０６、２１０７～２２０７、２１０８～２２０８、２１０９～２２０９、２１１０～２２１０、２１１１～２２１１、２１１２～２２１２、２１１３～２２１３、２１１４～２２１４、２１１５～２２１５、２１１６～２２１６、２１１７～２２１７、２１１８～２２１８、２１１９～２２１９、２１２０～２２２０、２１２１～２２２１、２１２２～２２２２、２１２３～２２２３、２１２４～２２２４、２１２５～２２２５、２１２６～２２２６、２１２７～２２２７、２１２８～２２２８、２１２９～２２２９、２１３０～２２３０、２１３１～２２３１、２１３２～２２３２、２１３３～２２３３、２１３４～２２３４、または２１３５～２２３５と約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一の配列を含む。
したがって、ヒトレチノシシンタンパク質をコードする核酸およびスタッファー配列を含むポリヌクレオチドを含むｒＡＡＶベクターが本明細書で提供される。一部の実施形態では、スタッファー配列は約１０００ヌクレオチド～約４０００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、スタッファー配列は約２０００ヌクレオチド～約３５００、約３２００、約３０００、約２９００、または約２８００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、スタッファー配列は約２５００ヌクレオチド～約３０００ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態では、スタッファー配列は約２８００ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、異種核酸およびスタッファー配列を含む核酸ベクターは、配列番号１６～１７、３１～３５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。一部の実施形態では、異種核酸およびスタッファー配列を含む核酸ベクターは、配列番号３１～３４のいずれか１つの配列を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲを含み、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲとの間のＡＡＶベクターの長さ（即ち「ＩＴＲの間の長さ」）は、約２０００ヌクレオチド～約６０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、そのようなＡＡＶベクターはスタッファー配列を含む。一部の実施形態では、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲとの間のＡＡＶベクターの長さは、約３０００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、第１のＩＴＲと第２のＩＴＲとの間のＡＡＶベクターの長さは、約４０００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドである。ＩＴＲの間のこの長さは、約４５００ヌクレオチドであってよい。
一部の実施形態では、異種核酸とスタッファー配列の全長は、約２０００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、この全長は約２５００ヌクレオチド～約４５００、約４２００、約４０００、約３８００、約３７００、約３６００、または約３５００ヌクレオチドである。一部の実施形態では、スタッファー配列は約３５００ヌクレオチドの長さを有する。
一部の実施形態では、スタッファー配列は、ヒトレチノシシンタンパク質をコードする異種核酸の下流（３’）に位置している。一部の実施形態では、スタッファー配列はポリＡ配列の上流（５’）に位置している。一部の実施形態では、スタッファー配列はポリＡ配列の３’に位置している。一部の実施形態では、スタッファー配列は２つのＡＡＶ ＩＴＲ配列の間に位置している。
スタッファー配列
＞スタッファー１（２８２２ｂｐ）（配列番号２６）
cgattcgagtgagcagaccacatgatgattggtattctccctgaagaaagaatgtcagcaaggagtatctgaagtccgaccaagcctagaatccgcccggttcttatttgctgaagtaatactgttgtcaagtcagctacagggagtggtccctgcctggagtttgaagggctgtcaaagacattgtggtcacttactcaagtggtaaattccttacagactggactgcagttaagggtgataacgctactactaggacaagggtatccttgatcctgtggatctgtagtgacctgagactgtcaaggtatggtgagtatgacccttgaccctttccaacggttgtaaccgtgggcgctgtcaaatctgattaaccactactaggatagaatttggcagagctactgaaatggttacctggtcaagagactggcccacagcataagggcgagcaagacgatgctcagattaactaagtgaccgaagtatcctagatggtccactaccagcaaatgtgtcagacctccctcagttggtagtacaatgtatccttctagtcgcgacttattatatcgacgagcttatgtgtaagagaccagattctttgtaacctgacacttgagttcaaggtgtgtagtaggagagtgcaaaccctgaagcaacagtagccgaaccgggtcgaggacctagcgttgattgactttgtctggtgtatcctgtaaatttctccaatcgagatcgaggtaaagtggacctcacaggactttatcaaacaacagagttaatacctcaaatctctcgctgatatatgtgacaaattcattgcgtcacttatcgcagctatgttcggtcagcatattctggcgaacacccacgctgcagttcgacaaggatagtatctggcgctctcgcccaattcaagcacgcgaattactctattaacttgttgtctcttgtgtatatcataatcaattcctcctagttagtgattgaagacgaccgtgcacttggctgccttgatgcagaccacttcttgtggccggcacaccctataatagagatgtgataaataacttagctggactgtagttatttcgtcctagggattctgacgggtgcaaatcactaagtgtctttggtattgggtctgtaacaatgttgagaactgtggtgtatgtacgaacgatgtgatctgtagactacagcacagggtattgctgtttcgcaccagtgtgacacttgtgtggctgtcctctgtgctatagcgccgtatatcttatgcaggttgtatagcccaacgactgtttaggtacgtccgtataagaataggagtgctacactctacattgaatctatccagagagagttctgtagaattaggtgacgaacaaatctacgcgataggaaggagagacctggttgtcccaagggccgtgggtatgatgtttagtacaactaggaggctctaggtgtattggttgttggtcacgtagtgtccctacttggtcaggactaaagtttgtcagtgaactctctactattattcatcgaacctgtggtcgtcggcggtctgatatatgctcggtagattgcccgacaggacgtgaaggagcctaactattaaagcactctaactagcctatcgtaacaacttatattgggtatttgggtacgacggtgtactggaaatctatctaattcttctgatcgtatatcgggtcgtatattgatttatgacggaccgaccactcacgcggtccgatacgcggtagcgctatccaggaccctcttatgaattggtatcaatagattgtggaacttgttgcgtacactacagaatgtctttgcaaagaatgccaaattacaagctatagtcctcccactatactgcttcgtgactccaactagggtagttatagttgttcaagactggtactctgttaccaattagtagcgatattgtgtgggatactggtgtctgtcatacgagaactgggagtagcgctgtaaattctaaatagtcacactgttccagctggacgaccgctgtgtactctttgtagaaactcactgcggcttccacttatgagatttggttataggtcacaaagtggcagtccagttgcaggtctcttgttgtaatatgactggattgaattgactaggaagacgtagtctgttcttgttaggtccgacgtggtcccaatttgcttatccaatatgaggtcctagttagcagtcgctccgaggtcgaaatagatacccttgtggtttcgtagattgtctgattcgcaacaatatcctgctaatcaatctacggaaacaccgcttcagaggaagattgcgacggacagaagagtcagtttcggctgcttgtggtttggcctaatataaagattacttacggcttaggtatactgcacatcctccggccttgtttggtgcttgagattggtgcgcatatatgtaaggtgctatcgtatccgcctccagtacttgatcttgtcctgcggctttagggctgcttatccctccagcggtccaacctctgaagggtcaggccatacttcacctcctttgtctaggattctgttccgaatttccggtctgggtcatgtactctcaccatcgagtgtagggagacgattctcgtaacagccgtagccgaatcactttcacttgagtctatgggttgtgcctgagttctagcttagtatttaacaacggcgtcggtccaaagacggtacacacttaaccatagtgaacgaatgaaacagtaatcgctccaggttggcgcgccttgcatgctggggagagatctg
＞スタッファー２（２８２０ｂｐ）（配列番号２７）
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＞スタッファー３（２２４９ｂｐ）（配列番号２８）
cagtggtccctgcctggagtttgaagggctgtcaaagacattgtggtcacttactcaagtggtaaattccttacagactggactgcagttaagggtgataacgctactactaggacaagggtatccttgatcctgtggatctgtagtgacctgagactgtcaaggtatggtgagtatgacccttgaccctttccaacggttgtaaccgtgggcgctgtcaaatctgattaaccactactaggatagaatttggcagagctactgaaatggttacctggtcaagagactggcccacagcataagggcgagcaagacgatgctcagattaactaagtgaccgaagtatcctagatggtccactaccagcaaatgtgtcagacctccctcagttggtagtacaatgtatccttctagtcgcgacttattatatcgacgagcttatgtgtaagagaccagattctttgtaacctgacacttgagttcaaggtgtgtagtaggagagtgcaaaccctgaagcaacagtagccgaaccgggtcgaggacctagcgttgattgactttgtctggtgtatcctgtaaatttctccaatcgagatcgaggtaaagtggacctcacaggactttatcaaacaacagagttaatacctcaaatctctcgctgatatatgtgacaaattcattgcgtcacttatcgcagctatgttcggtcagcatattctggcgaacacccacgctgcagttcgacaaggatagtatctggcgctctcgcccaattcaagcacgcgaattactctattaacttgttgtctcttgtgtatatcataatcaattcctcctagttagtgattgaagacgaccgtgcacttggctgccttgatgcagaccacttcttgtggccggcacaccctataatagagatgtgataaataacttagctggactgtagttatttcgtcctagggattctgacgggtgcaaatcactaagtgtctttggtattgggtctgtaacaatgttgagaactgtggtgtatgtacgaacgatgtgatctgtagactacagcacagggtattgctgtttcgcaccagtgtgacacttgtgtggctgtcctctgtgctatagcgccgtatatcttatgcaggttgtatagcccaacgactgtttaggtacgtccgtataagaataggagtgctacactctacattgaatctatccagagagagttctgtagaattaggtgacgaacaaatctacgcgataggaaggagagacctggttgtcccaagggccgtgggtatgatgtttagtacaactaggaggctctaggtgtattggttgttggtcacgtagtgtccctacttggtcaggactaaagtttgtcagtgaactctctactattattcatcgaacctgtggtcgtcggcggtctgatatatgctcggtagattgcccgacaggacgtgaaggagcctaactattaaagcactctaactagcctatcgtaacaacttatattgggtatttgggtacgacggtgtactggaaatctatctaattcttctgatcgtatatcgggtcgtatattgatttatgacggaccgaccactcacgcggtccgatacgcggtagcgctatccaggaccctcttatgaattggtatcaatagattgtggaacttgttgcgtacactacagaatgtctttgcaaagaatgccaaattacaagctatagtcctcccactatactgcttcgtgactccaactagggtagttatagttgttcaagactggtactctgttaccaattagtagcgatattgtgtgggatactggtgtctgtcatacgagaactgggagtagcgctgtaaattctaaatagtcacactgttccagctggacgaccgctgtgtactctttgtagaaactcactgcggcttccacttatgagatttggttataggtcacaaagtggcagtccagttgcaggtctcttgttgtaatatgactggattgaattgactaggaagacgtagtctgttcttgttaggtccgacgtggtcccaatttgcttatccaatatgaggtcctagttagcagtcgctccgaggtcgaaatagatacccttgtggtttcgtagattgtctgattcgcaacaatatcctgctaatcaatctacggaaacaccgcttcagaggaagattgcgacggacagaagagtcaggcgcgccttgcatgctggggagagatctg
＞スタッファー４（２２３５ｂｐ）（配列番号２９）
cagtggtccctgcctggagtttgaagggctgtcaaagacattgtggtcacttactcaagtggtaaattccttacagactggactgcagttaagggtgataacgctactactaggacaagggtatccttgatcctgtggatctgtagtgacctgagactgtcaaggtatggtgagtatgacccttgaccctttccaacggttgtaaccgtgggcgctgtcaaatctgattaaccactactaggatagaatttggcagagctactgaaatggttacctggtcaagagactggcccacagcataagggcgagcaagacgatgctcagattaactaagtgaccgaagtatcctagatggtccactaccagcaaatgtgtcagacctccctcagttggtagtacaatgtatccttctagtcgcgacttattatatcgacgagcttatgtgtaagagaccagattctttgtaacctgacacttgagttcaaggtgtgtagtaggagagtgcaaaccctgaagcaacagtagccgaaccgggtcgaggacctagcgttgattgactttgtctggtgtatcctgtaaatttctccaatcgagatcgaggtaaagtggacctcacaggactttatcaaacaacagagttaatacctcaaatctctcgctgatatatgtgacaaattcattgcgtcacttatcgcagctatgttcggtcagcatattctggcgaacacccacgctgcagttcgacaaggatagtatctggcgctctcgcccaattcaagcacgcgaattactctattaacttgttgtctcttgtgtatatcataatcaattcctcctagttagtgattgaagacgaccgtgcacttggctgccttgatgcagaccacttcttgtggccggcacaccctataatagagatgtgataaataacttagctggactgtagttatttcgtcctagggattctgacgggtgcaaatcactaagtgtctttggtattgggtctgtaacaatgttgagaactgtggtgtatgtacgaacgatgtgatctgtagactacagcacagggtattgctgtttcgcaccagtgtgacacttgtgtggctgtcctctgtgctatagcgccgtatatcttatgcaggttgtatagcccaacgactgtttaggtacgtccgtataagaataggagtgctacactctacattgaatctatccagagagagttctgtagaattaggtgacgaacaaatctacgcgataggaaggagagacctggttgtcccaagggccgtgggtatgatgtttagtacaactaggaggctctaggtgtattggttgttggtcacgtagtgtccctacttggtcaggactaaagtttgtcagtgaactctctactattattcatcgaacctgtggtcgtcggcggtctgatatatgctcggtagattgcccgacaggacgtgaaggagcctaactattaaagcactctaactagcctatcgtaacaacttatattgggtatttgggtacgacggtgtactggaaatctatctaattcttctgatcgtatatcgggtcgtatattgatttatgacggaccgaccactcacgcggtccgatacgcggtagcgctatccaggaccctcttatgaattggtatcaatagattgtggaacttgttgcgtacactacagaatgtctttgcaaagaatgccaaattacaagctatagtcctcccactatactgcttcgtgactccaactagggtagttatagttgttcaagactggtactctgttaccaattagtagcgatattgtgtgggatactggtgtctgtcatacgagaactgggagtagcgctgtaaattctaaatagtcacactgttccagctggacgaccgctgtgtactctttgtagaaactcactgcggcttccacttatgagatttggttataggtcacaaagtggcagtccagttgcaggtctcttgttgtaatatgactggattgaattgactaggaagacgtagtctgttcttgttaggtccgacgtggtcccaatttgcttatccaatatgaggtcctagttagcagtcgctccgaggtcgaaatagatacccttgtggtttcgtagattgtctgattcgcaacaatatcctgctaatcaatctacggaaacaccgcttcagaggaagattgcgacggacagaagagtcaggcgcgccttgcatgc
＞スタッファー５（２２１９ｂｐ）（配列番号３０）
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ＡＡＶベクターの例
一部の実施形態では、異種核酸（例えばレチノシシンタンパク質をコードする）および１つまたは複数のさらなるエレメントを含む核酸ベクターが本明細書で提供される。一部の実施形態では、さらなるエレメントはイントロンを含む。一部の実施形態では、さらなるエレメントはスプライスドナー領域を含む。一部の実施形態では、さらなるエレメントはスプライスアクセプター領域を含む。一部の実施形態では、さらなるエレメントはプロモーターを含む。一部の実施形態では、さらなるエレメントはポリＡシグナルを含む。一部の実施形態では、さらなるエレメントは１つまたは複数のターミナルリピートを含む。一部の実施形態では、さらなるエレメントはＷＰＲＥエレメントを含む。一部の実施形態では、さらなるエレメントは上記のエレメントの２つ以上を含む。
したがって、本開示に記載した例示的なｒＡＡＶベクターは、以下の構造：ＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰ、ＡＡＶ－ｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐ、ＡＡＶ－ｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐ、ＡＡＶ－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐ、ＡＡＶ－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲ、ＡＡＶ－ｐＴＲ－Ｘ００１、およびＡＡＶ－ｐＴＲ－Ｘ００２のいずれか１つを含み得る。ＲＳ１タンパク質をコードする例示的なベクターは、以下：ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ４４．９（Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ４４．９（Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ４４．９－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ４４．９－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ４４．９（Ｙ７３１Ｆ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ４４．９（Ｙ７３１Ｆ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ５－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ５－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ８（Ｙ４４７Ｆ＋Ｙ７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、またはＡＡＶ８（Ｙ４４７Ｆ＋Ｙ７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆのいずれかを含み得る。ある特定の実施形態では、例示的なベクターは、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、またはＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆを含む。
ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９－ｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９－ｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９－ｐＴＲ－Ｘ００１を含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９－ｐＴＲ－Ｘ００２を含む。
ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ－４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｐＴＲ－Ｘ００１を含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｐＴＲ－Ｘ００２を含む。
ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２－ｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２－ｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２－ｐＴＲ－Ｘ００１を含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２－ｐＴＲ－Ｘ００２を含む。
ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ－ｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ－ｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ－ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲを含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ－ｐＴＲ－Ｘ００１を含む。ある特定の実施形態では、ベクターはＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ－ｐＴＲ－Ｘ００２を含む。
レポータートランスジーン（例えばＧＦＰ）を含むさらなる例示的なベクターは、以下：ＡＡＶ４４．９（Ｙ７３１Ｆ）－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰ、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２－ｈＧＦＰ、ＡＡＶ４４．９（Ｙ７３１Ｆ）－ＩＲＢＰ／ＧＮＡＴ２－ｈＧＦＰのいずれかを含み得る。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号３１と約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。例えば、ＡＡＶベクターは配列番号３１を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号３２と約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。例えば、ＡＡＶベクターは配列番号３２を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号３３と約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。例えば、ＡＡＶベクターは配列番号３３を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号３４と約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。例えば、ＡＡＶベクターは配列番号３４を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号３５と約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。例えば、ＡＡＶベクターは配列番号３５を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、配列番号３３と約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む。例えば、ＡＡＶベクターは配列番号３３を含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは以下のアーキテクチャ：５’ＩＴＲ－プロモーター－イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター－ｈＲＳ１コード配列－ポリＡ－スタッファー－３’ＩＴＲを有する。プロモーターはｈＧＲＫ１プロモーターであってよい。プロモーターはＣＢＡまたはｓｍＣＢＡプロモーターであってよい。ポリＡ配列はｂＧＨポリＡ配列であってよい。イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプターはＳＶ４０イントロンであってよい。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは以下のアーキテクチャ：５’ＩＴＲ－スタッファー－プロモーター－イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター－ｈＲＳ１コード配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを有する。プロモーターはｈＧＲＫ１プロモーターであってよい。プロモーターはＣＢＡまたはｓｍＣＢＡプロモーターであってよい。ポリＡ配列はｂＧＨポリＡ配列であってよい。イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプターはＳＶ４０イントロンであってよい。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは以下のアーキテクチャ：５’ＩＴＲ－プロモーター－イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター－ｈＲＳ１コード配列－転写後制御エレメント－ポリＡ－スタッファー－３’ＩＴＲを有する。プロモーターはｈＧＲＫ１プロモーターであってよい。プロモーターはＣＢＡまたはｓｍＣＢＡプロモーターであってよい。ポリＡ配列はｂＧＨポリＡ配列であってよい。イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプターはＳＶ４０イントロンであってよい。転写後制御エレメントはＷＰＲＥエレメントであってよい。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは以下のアーキテクチャ：５’ＩＴＲ－プロモーター－イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター－ｈＲＳ１コード配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを有する。プロモーターはｈＧＲＫ１プロモーターであってよい。プロモーターはＣＢＡまたはｓｍＣＢＡプロモーターであってよい。ポリＡ配列はｂＧＨポリＡ配列であってよい。イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプターはＳＶ４０イントロンであってよい。
一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは以下のアーキテクチャ：５’ＩＴＲ－プロモーター－イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプター－ｈＲＳ１コード配列－転写後制御エレメント－ポリＡ－３’ＩＴＲを有する。プロモーターはｈＧＲＫ１プロモーターであってよい。プロモーターはＣＢＡまたはｓｍＣＢＡプロモーターであってよい。ポリＡ配列はｂＧＨポリＡ配列であってよい。イントロンおよび／またはスプライスドナーおよび／またはスプライスアクセプターはＳＶ４０イントロンであってよい。転写後制御エレメントはＷＰＲＥエレメントであってよい。
開示したｒＡＡＶベクターは、配列番号１６または１７のヌクレオチド配列と少なくとも７５％の同一性、少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９５％の同一性、９８％の同一性、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含み得る。一部の実施形態では、ベクターは配列番号１６または１７のヌクレオチド配列を含む。特定の実施形態では、本開示は、以下に提供する配列番号１６のヌクレオチド配列を含むＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ構造を含むｒＡＡＶベクターを提供する。配列番号１６の長さは１７４０ヌクレオチド（ｎｔ）である。特定の実施形態では、本開示は、以下に提供する配列番号１７のヌクレオチド配列を含むＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ構造を含むｒＡＡＶベクターを提供する。配列番号１７の長さは２３２０ヌクレオチド（ｎｔ）である。
一部の実施形態では、本開示の例示的なｒＡＡＶベクターは以下のアーキテクチャ：５’ＩＴＲ－プロモーター－ＳＶ４０イントロン－ｈＲＳ１コード配列－ポリＡ－スタッファー－３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、本開示の例示的なｒＡＡＶベクターは以下のアーキテクチャ：５’ＩＴＲ－プロモーター－ＳＶ４０イントロン－ｈＲＳ１コード配列－ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、本開示の例示的なｒＡＡＶベクターは以下のアーキテクチャ：５’ＩＴＲ－プロモーター－ＳＶ４０イントロン－ｈＲＳ１コード配列－ＷＰＲＥｓｆ－ポリＡ－スタッファー－３’ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、本開示の例示的なｒＡＡＶベクターは以下のアーキテクチャ：５’ＩＴＲ－プロモーター－ＳＶ４イントロン－ｈＲＳ１コード配列－ＷＰＲＥｓｆ－ポリＡ－３’ＩＴＲを含む。これらのアーキテクチャのいずれかによるベクターのプロモーターは、ｈＧＲＫ１プロモーターであってよい。これらのアーキテクチャのいずれかによるベクターのプロモーターは、ＣＢＡまたはｓｍＣＢＡプロモーターであってよい。これらのアーキテクチャのいずれかによるベクターのポリＡ配列は、ｂＧＨポリＡ配列であってよい。以下のコンストラクトにおいて、１つまたは複数の改変されたＫｏｚａｋ配列はイタリックで示している。
ｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐ（ＩＴＲ－ＩＴＲ配列－４５３４ｂｐ）
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGGTACCGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGCCACCATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCATGGTATCAAAAAGCCTGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGCATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATCCGATTCGAGTGAGCAGACCACATGATGATTGGTATTCTCCCTGAAGAAAGAATGTCAGCAAGGAGTATCTGAAGTCCGACCAAGCCTAGAATCCGCCCGGTTCTTATTTGCTGAAGTAATACTGTTGTCAAGTCAGCTACAGGGAGTGGTCCCTGCCTGGAGTTTGAAGGGCTGTCAAAGACATTGTGGTCACTTACTCAAGTGGTAAATTCCTTACAGACTGGACTGCAGTTAAGGGTGATAACGCTACTACTAGGACAAGGGTATCCTTGATCCTGTGGATCTGTAGTGACCTGAGACTGTCAAGGTATGGTGAGTATGACCCTTGACCCTTTCCAACGGTTGTAACCGTGGGCGCTGTCAAATCTGATTAACCACTACTAGGATAGAATTTGGCAGAGCTACTGAAATGGTTACCTGGTCAAGAGACTGGCCCACAGCATAAGGGCGAGCAAGACGATGCTCAGATTAACTAAGTGACCGAAGTATCCTAGATGGTCCACTACCAGCAAATGTGTCAGACCTCCCTCAGTTGGTAGTACAATGTATCCTTCTAGTCGCGACTTATTATATCGACGAGCTTATGTGTAAGAGACCAGATTCTTTGTAACCTGACACTTGAGTTCAAGGTGTGTAGTAGGAGAGTGCAAACCCTGAAGCAACAGTAGCCGAACCGGGTCGAGGACCTAGCGTTGATTGACTTTGTCTGGTGTATCCTGTAAATTTCTCCAATCGAGATCGAGGTAAAGTGGACCTCACAGGACTTTATCAAACAACAGAGTTAATACCTCAAATCTCTCGCTGATATATGTGACAAATTCATTGCGTCACTTATCGCAGCTATGTTCGGTCAGCATATTCTGGCGAACACCCACGCTGCAGTTCGACAAGGATAGTATCTGGCGCTCTCGCCCAATTCAAGCACGCGAATTACTCTATTAACTTGTTGTCTCTTGTGTATATCATAATCAATTCCTCCTAGTTAGTGATTGAAGACGACCGTGCACTTGGCTGCCTTGATGCAGACCACTTCTTGTGGCCGGCACACCCTATAATAGAGATGTGATAAATAACTTAGCTGGACTGTAGTTATTTCGTCCTAGGGATTCTGACGGGTGCAAATCACTAAGTGTCTTTGGTATTGGGTCTGTAACAATGTTGAGAACTGTGGTGTATGTACGAACGATGTGATCTGTAGACTACAGCACAGGGTATTGCTGTTTCGCACCAGTGTGACACTTGTGTGGCTGTCCTCTGTGCTATAGCGCCGTATATCTTATGCAGGTTGTATAGCCCAACGACTGTTTAGGTACGTCCGTATAAGAATAGGAGTGCTACACTCTACATTGAATCTATCCAGAGAGAGTTCTGTAGAATTAGGTGACGAACAAATCTACGCGATAGGAAGGAGAGACCTGGTTGTCCCAAGGGCCGTGGGTATGATGTTTAGTACAACTAGGAGGCTCTAGGTGTATTGGTTGTTGGTCACGTAGTGTCCCTACTTGGTCAGGACTAAAGTTTGTCAGTGAACTCTCTACTATTATTCATCGAACCTGTGGTCGTCGGCGGTCTGATATATGCTCGGTAGATTGCCCGACAGGACGTGAAGGAGCCTAACTATTAAAGCACTCTAACTAGCCTATCGTAACAACTTATATTGGGTATTTGGGTACGACGGTGTACTGGAAATCTATCTAATTCTTCTGATCGTATATCGGGTCGTATATTGATTTATGACGGACCGACCACTCACGCGGTCCGATACGCGGTAGCGCTATCCAGGACCCTCTTATGAATTGGTATCAATAGATTGTGGAACTTGTTGCGTACACTACAGAATGTCTTTGCAAAGAATGCCAAATTACAAGCTATAGTCCTCCCACTATACTGCTTCGTGACTCCAACTAGGGTAGTTATAGTTGTTCAAGACTGGTACTCTGTTACCAATTAGTAGCGATATTGTGTGGGATACTGGTGTCTGTCATACGAGAACTGGGAGTAGCGCTGTAAATTCTAAATAGTCACACTGTTCCAGCTGGACGACCGCTGTGTACTCTTTGTAGAAACTCACTGCGGCTTCCACTTATGAGATTTGGTTATAGGTCACAAAGTGGCAGTCCAGTTGCAGGTCTCTTGTTGTAATATGACTGGATTGAATTGACTAGGAAGACGTAGTCTGTTCTTGTTAGGTCCGACGTGGTCCCAATTTGCTTATCCAATATGAGGTCCTAGTTAGCAGTCGCTCCGAGGTCGAAATAGATACCCTTGTGGTTTCGTAGATTGTCTGATTCGCAACAATATCCTGCTAATCAATCTACGGAAACACCGCTTCAGAGGAAGATTGCGACGGACAGAAGAGTCAGTTTCGGCTGCTTGTGGTTTGGCCTAATATAAAGATTACTTACGGCTTAGGTATACTGCACATCCTCCGGCCTTGTTTGGTGCTTGAGATTGGTGCGCATATATGTAAGGTGCTATCGTATCCGCCTCCAGTACTTGATCTTGTCCTGCGGCTTTAGGGCTGCTTATCCCTCCAGCGGTCCAACCTCTGAAGGGTCAGGCCATACTTCACCTCCTTTGTCTAGGATTCTGTTCCGAATTTCCGGTCTGGGTCATGTACTCTCACCATCGAGTGTAGGGAGACGATTCTCGTAACAGCCGTAGCCGAATCACTTTCACTTGAGTCTATGGGTTGTGCCTGAGTTCTAGCTTAGTATTTAACAACGGCGTCGGTCCAAAGACGGTACACACTTAACCATAGTGAACGAATGAAACAGTAATCGCTCCAGGTTGGCGCGCCTTGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA（配列番号３１）
ｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐ（ＩＴＲ－ＩＴＲ配列－４５２８ｂｐ）
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGATTCGAGTGAGCAGACCACATGATGATTGGTATTCTCCCTGAAGAAAGAATGTCAGCAAGGAGTATCTGAAGTCCGACCAAGCCTAGAATCCGCCCGGTTCTTATTTGCTGAAGTAATACTGTTGTCAAGTCAGCTACAGGGAGTGGTCCCTGCCTGGAGTTTGAAGGGCTGTCAAAGACATTGTGGTCACTTACTCAAGTGGTAAATTCCTTACAGACTGGACTGCAGTTAAGGGTGATAACGCTACTACTAGGACAAGGGTATCCTTGATCCTGTGGATCTGTAGTGACCTGAGACTGTCAAGGTATGGTGAGTATGACCCTTGACCCTTTCCAACGGTTGTAACCGTGGGCGCTGTCAAATCTGATTAACCACTACTAGGATAGAATTTGGCAGAGCTACTGAAATGGTTACCTGGTCAAGAGACTGGCCCACAGCATAAGGGCGAGCAAGACGATGCTCAGATTAACTAAGTGACCGAAGTATCCTAGATGGTCCACTACCAGCAAATGTGTCAGACCTCCCTCAGTTGGTAGTACAATGTATCCTTCTAGTCGCGACTTATTATATCGACGAGCTTATGTGTAAGAGACCAGATTCTTTGTAACCTGACACTTGAGTTCAAGGTGTGTAGTAGGAGAGTGCAAACCCTGAAGCAACAGTAGCCGAACCGGGTCGAGGACCTAGCGTTGATTGACTTTGTCTGGTGTATCCTGTAAATTTCTCCAATCGAGATCGAGGTAAAGTGGACCTCACAGGACTTTATCAAACAACAGAGTTAATACCTCAAATCTCTCGCTGATATATGTGACAAATTCATTGCGTCACTTATCGCAGCTATGTTCGGTCAGCATATTCTGGCGAACACCCACGCTGCAGTTCGACAAGGATAGTATCTGGCGCTCTCGCCCAATTCAAGCACGCGAATTACTCTATTAACTTGTTGTCTCTTGTGTATATCATAATCAATTCCTCCTAGTTAGTGATTGAAGACGACCGTGCACTTGGCTGCCTTGATGCAGACCACTTCTTGTGGCCGGCACACCCTATAATAGAGATGTGATAAATAACTTAGCTGGACTGTAGTTATTTCGTCCTAGGGATTCTGACGGGTGCAAATCACTAAGTGTCTTTGGTATTGGGTCTGTAACAATGTTGAGAACTGTGGTGTATGTACGAACGATGTGATCTGTAGACTACAGCACAGGGTATTGCTGTTTCGCACCAGTGTGACACTTGTGTGGCTGTCCTCTGTGCTATAGCGCCGTATATCTTATGCAGGTTGTATAGCCCAACGACTGTTTAGGTACGTCCGTATAAGAATAGGAGTGCTACACTCTACATTGAATCTATCCAGAGAGAGTTCTGTAGAATTAGGTGACGAACAAATCTACGCGATAGGAAGGAGAGACCTGGTTGTCCCAAGGGCCGTGGGTATGATGTTTAGTACAACTAGGAGGCTCTAGGTGTATTGGTTGTTGGTCACGTAGTGTCCCTACTTGGTCAGGACTAAAGTTTGTCAGTGAACTCTCTACTATTATTCATCGAACCTGTGGTCGTCGGCGGTCTGATATATGCTCGGTAGATTGCCCGACAGGACGTGAAGGAGCCTAACTATTAAAGCACTCTAACTAGCCTATCGTAACAACTTATATTGGGTATTTGGGTACGACGGTGTACTGGAAATCTATCTAATTCTTCTGATCGTATATCGGGTCGTATATTGATTTATGACGGACCGACCACTCACGCGGTCCGATACGCGGTAGCGCTATCCAGGACCCTCTTATGAATTGGTATCAATAGATTGTGGAACTTGTTGCGTACACTACAGAATGTCTTTGCAAAGAATGCCAAATTACAAGCTATAGTCCTCCCACTATACTGCTTCGTGACTCCAACTAGGGTAGTTATAGTTGTTCAAGACTGGTACTCTGTTACCAATTAGTAGCGATATTGTGTGGGATACTGGTGTCTGTCATACGAGAACTGGGAGTAGCGCTGTAAATTCTAAATAGTCACACTGTTCCAGCTGGACGACCGCTGTGTACTCTTTGTAGAAACTCACTGCGGCTTCCACTTATGAGATTTGGTTATAGGTCACAAAGTGGCAGTCCAGTTGCAGGTCTCTTGTTGTAATATGACTGGATTGAATTGACTAGGAAGACGTAGTCTGTTCTTGTTAGGTCCGACGTGGTCCCAATTTGCTTATCCAATATGAGGTCCTAGTTAGCAGTCGCTCCGAGGTCGAAATAGATACCCTTGTGGTTTCGTAGATTGTCTGATTCGCAACAATATCCTGCTAATCAATCTACGGAAACACCGCTTCAGAGGAAGATTGCGACGGACAGAAGAGTCAGTTTCGGCTGCTTGTGGTTTGGCCTAATATAAAGATTACTTACGGCTTAGGTATACTGCACATCCTCCGGCCTTGTTTGGTGCTTGAGATTGGTGCGCATATATGTAAGGTGCTATCGTATCCGCCTCCAGTACTTGATCTTGTCCTGCGGCTTTAGGGCTGCTTATCCCTCCAGCGGTCCAACCTCTGAAGGGTCAGGCCATACTTCACCTCCTTTGTCTAGGATTCTGTTCCGAATTTCCGGTCTGGGTCATGTACTCTCACCATCGAGTGTAGGGAGACGATTCTCGTAACAGCCGTAGCCGAATCACTTTCACTTGAGTCTATGGGTTGTGCCTGAGTTCTAGCTTAGTATTTAACAACGGCGTCGGTCCAAAGACGGTACACACTTAACCATAGTGAACGAATGAAACAGTAATCGCTCCAGGTTAAGAACTATTGGTACCGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGCCACCATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCATGGTATCAAAAAGCCTGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGCATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA（配列番号３２）
ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐ（ＩＴＲ－ＩＴＲ配列－４５４９ｂｐ）
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGGTACCGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGCCACCATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCATGGTATCAAAAAGCCTGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGCATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGAGTCGACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATCCAGTGGTCCCTGCCTGGAGTTTGAAGGGCTGTCAAAGACATTGTGGTCACTTACTCAAGTGGTAAATTCCTTACAGACTGGACTGCAGTTAAGGGTGATAACGCTACTACTAGGACAAGGGTATCCTTGATCCTGTGGATCTGTAGTGACCTGAGACTGTCAAGGTATGGTGAGTATGACCCTTGACCCTTTCCAACGGTTGTAACCGTGGGCGCTGTCAAATCTGATTAACCACTACTAGGATAGAATTTGGCAGAGCTACTGAAATGGTTACCTGGTCAAGAGACTGGCCCACAGCATAAGGGCGAGCAAGACGATGCTCAGATTAACTAAGTGACCGAAGTATCCTAGATGGTCCACTACCAGCAAATGTGTCAGACCTCCCTCAGTTGGTAGTACAATGTATCCTTCTAGTCGCGACTTATTATATCGACGAGCTTATGTGTAAGAGACCAGATTCTTTGTAACCTGACACTTGAGTTCAAGGTGTGTAGTAGGAGAGTGCAAACCCTGAAGCAACAGTAGCCGAACCGGGTCGAGGACCTAGCGTTGATTGACTTTGTCTGGTGTATCCTGTAAATTTCTCCAATCGAGATCGAGGTAAAGTGGACCTCACAGGACTTTATCAAACAACAGAGTTAATACCTCAAATCTCTCGCTGATATATGTGACAAATTCATTGCGTCACTTATCGCAGCTATGTTCGGTCAGCATATTCTGGCGAACACCCACGCTGCAGTTCGACAAGGATAGTATCTGGCGCTCTCGCCCAATTCAAGCACGCGAATTACTCTATTAACTTGTTGTCTCTTGTGTATATCATAATCAATTCCTCCTAGTTAGTGATTGAAGACGACCGTGCACTTGGCTGCCTTGATGCAGACCACTTCTTGTGGCCGGCACACCCTATAATAGAGATGTGATAAATAACTTAGCTGGACTGTAGTTATTTCGTCCTAGGGATTCTGACGGGTGCAAATCACTAAGTGTCTTTGGTATTGGGTCTGTAACAATGTTGAGAACTGTGGTGTATGTACGAACGATGTGATCTGTAGACTACAGCACAGGGTATTGCTGTTTCGCACCAGTGTGACACTTGTGTGGCTGTCCTCTGTGCTATAGCGCCGTATATCTTATGCAGGTTGTATAGCCCAACGACTGTTTAGGTACGTCCGTATAAGAATAGGAGTGCTACACTCTACATTGAATCTATCCAGAGAGAGTTCTGTAGAATTAGGTGACGAACAAATCTACGCGATAGGAAGGAGAGACCTGGTTGTCCCAAGGGCCGTGGGTATGATGTTTAGTACAACTAGGAGGCTCTAGGTGTATTGGTTGTTGGTCACGTAGTGTCCCTACTTGGTCAGGACTAAAGTTTGTCAGTGAACTCTCTACTATTATTCATCGAACCTGTGGTCGTCGGCGGTCTGATATATGCTCGGTAGATTGCCCGACAGGACGTGAAGGAGCCTAACTATTAAAGCACTCTAACTAGCCTATCGTAACAACTTATATTGGGTATTTGGGTACGACGGTGTACTGGAAATCTATCTAATTCTTCTGATCGTATATCGGGTCGTATATTGATTTATGACGGACCGACCACTCACGCGGTCCGATACGCGGTAGCGCTATCCAGGACCCTCTTATGAATTGGTATCAATAGATTGTGGAACTTGTTGCGTACACTACAGAATGTCTTTGCAAAGAATGCCAAATTACAAGCTATAGTCCTCCCACTATACTGCTTCGTGACTCCAACTAGGGTAGTTATAGTTGTTCAAGACTGGTACTCTGTTACCAATTAGTAGCGATATTGTGTGGGATACTGGTGTCTGTCATACGAGAACTGGGAGTAGCGCTGTAAATTCTAAATAGTCACACTGTTCCAGCTGGACGACCGCTGTGTACTCTTTGTAGAAACTCACTGCGGCTTCCACTTATGAGATTTGGTTATAGGTCACAAAGTGGCAGTCCAGTTGCAGGTCTCTTGTTGTAATATGACTGGATTGAATTGACTAGGAAGACGTAGTCTGTTCTTGTTAGGTCCGACGTGGTCCCAATTTGCTTATCCAATATGAGGTCCTAGTTAGCAGTCGCTCCGAGGTCGAAATAGATACCCTTGTGGTTTCGTAGATTGTCTGATTCGCAACAATATCCTGCTAATCAATCTACGGAAACACCGCTTCAGAGGAAGATTGCGACGGACAGAAGAGTCAGGCGCGCCTTGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA（配列番号３３）
ｐＴＲ－Ｘ００１（ＩＴＲ－ＩＴＲ配列－１７２３ｂｐ）
GGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGGTACCGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGCCACCATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCATGGTATCAAAAAGCCTGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGCATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCC（配列番号３４）
ｐＴＲ－Ｘ００２（ＩＴＲ－ＩＴＲ配列－２３１１ｂｐ）
GGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGGTACCGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGCCACCATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCATGGTATCAAAAAGCCTGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGCATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGAGTCGACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCC（配列番号３５）
ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲ（ＩＴＲ－ＩＴＲ配列－４５４９ｂｐ）
TTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGGTACCGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGCCACCATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCATGGTATCAAAAAGCCTGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGCATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGAGTCGACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATCCAGTGGTCCCTGCCTGGAGTTTGAAGGGCTGTCAAAGACATTGTGGTCACTTACTCAAGTGGTAAATTCCTTACAGACTGGACTGCAGTTAAGGGTGATAACGCTACTACTAGGACAAGGGTATCCTTGATCCTGTGGATCTGTAGTGACCTGAGACTGTCAAGGTATGGTGAGTATGACCCTTGACCCTTTCCAACGGTTGTAACCGTGGGCGCTGTCAAATCTGATTAACCACTACTAGGATAGAATTTGGCAGAGCTACTGAAATGGTTACCTGGTCAAGAGACTGGCCCACAGCATAAGGGCGAGCAAGACGATGCTCAGATTAACTAAGTGACCGAAGTATCCTAGATGGTCCACTACCAGCAAATGTGTCAGACCTCCCTCAGTTGGTAGTACAATGTATCCTTCTAGTCGCGACTTATTATATCGACGAGCTTATGTGTAAGAGACCAGATTCTTTGTAACCTGACACTTGAGTTCAAGGTGTGTAGTAGGAGAGTGCAAACCCTGAAGCAACAGTAGCCGAACCGGGTCGAGGACCTAGCGTTGATTGACTTTGTCTGGTGTATCCTGTAAATTTCTCCAATCGAGATCGAGGTAAAGTGGACCTCACAGGACTTTATCAAACAACAGAGTTAATACCTCAAATCTCTCGCTGATATATGTGACAAATTCATTGCGTCACTTATCGCAGCTATGTTCGGTCAGCATATTCTGGCGAACACCCACGCTGCAGTTCGACAAGGATAGTATCTGGCGCTCTCGCCCAATTCAAGCACGCGAATTACTCTATTAACTTGTTGTCTCTTGTGTATATCATAATCAATTCCTCCTAGTTAGTGATTGAAGACGACCGTGCACTTGGCTGCCTTGATGCAGACCACTTCTTGTGGCCGGCACACCCTATAATAGAGATGTGATAAATAACTTAGCTGGACTGTAGTTATTTCGTCCTAGGGATTCTGACGGGTGCAAATCACTAAGTGTCTTTGGTATTGGGTCTGTAACAATGTTGAGAACTGTGGTGTATGTACGAACGATGTGATCTGTAGACTACAGCACAGGGTATTGCTGTTTCGCACCAGTGTGACACTTGTGTGGCTGTCCTCTGTGCTATAGCGCCGTATATCTTATGCAGGTTGTATAGCCCAACGACTGTTTAGGTACGTCCGTATAAGAATAGGAGTGCTACACTCTACATTGAATCTATCCAGAGAGAGTTCTGTAGAATTAGGTGACGAACAAATCTACGCGATAGGAAGGAGAGACCTGGTTGTCCCAAGGGCCGTGGGTATGATGTTTAGTACAACTAGGAGGCTCTAGGTGTATTGGTTGTTGGTCACGTAGTGTCCCTACTTGGTCAGGACTAAAGTTTGTCAGTGAACTCTCTACTATTATTCATCGAACCTGTGGTCGTCGGCGGTCTGATATATGCTCGGTAGATTGCCCGACAGGACGTGAAGGAGCCTAACTATTAAAGCACTCTAACTAGCCTATCGTAACAACTTATATTGGGTATTTGGGTACGACGGTGTACTGGAAATCTATCTAATTCTTCTGATCGTATATCGGGTCGTATATTGATTTATGACGGACCGACCACTCACGCGGTCCGATACGCGGTAGCGCTATCCAGGACCCTCTTATGAATTGGTATCAATAGATTGTGGAACTTGTTGCGTACACTACAGAATGTCTTTGCAAAGAATGCCAAATTACAAGCTATAGTCCTCCCACTATACTGCTTCGTGACTCCAACTAGGGTAGTTATAGTTGTTCAAGACTGGTACTCTGTTACCAATTAGTAGCGATATTGTGTGGGATACTGGTGTCTGTCATACGAGAACTGGGAGTAGCGCTGTAAATTCTAAATAGTCACACTGTTCCAGCTGGACGACCGCTGTGTACTCTTTGTAGAAACTCACTGCGGCTTCCACTTATGAGATTTGGTTATAGGTCACAAAGTGGCAGTCCAGTTGCAGGTCTCTTGTTGTAATATGACTGGATTGAATTGACTAGGAAGACGTAGTCTGTTCTTGTTAGGTCCGACGTGGTCCCAATTTGCTTATCCAATATGAGGTCCTAGTTAGCAGTCGCTCCGAGGTCGAAATAGATACCCTTGTGGTTTCGTAGATTGTCTGATTCGCAACAATATCCTGCTAATCAATCTACGGAAACACCGCTTCAGAGGAAGATTGCGACGGACAGAAGAGTCAGGCGCGCCTTGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAA（配列番号３３）
ＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ
GGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGGTACCGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGCCACCATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCATGGTATCAAAAAGCCTGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGCATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGAGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACC（配列番号１６）
ＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ＷＰＲＥｓｆ
GGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCTCAGATCTGAATTCGGTACCGGGCCCCAGAAGCCTGGTGGTTGTTTGTCCTTCTCAGGGGAAAAGTGAGGCGGCCCCTTGGAGGAAGGGGCCGGGCAGAATGATCTAATCGGATTCCAAGCAGCTCAGGGGATTGTCTTTTTCTAGCACCTTCTTGCCACTCCTAAGCGTCCTCCGTGACCCCGGCTGGGATTTAGCCTGGTGCTGTGTCAGCCCCGGTCTCCCAGGGGCTTCCCAGTGGTCCCCAGGAACCCTCGACAGGGCCCGGTCTCTCTCGTCCAGCAAGGGCAGGGACGGGCCACAGGCCAAGGGCTCTAGAGGATCCGGTACTCGAGGAACTGAAAAACCAGAAAGTTAACTGGTAAGTTTAGTCTTTTTGTCTTTTATTTCAGGTCCCGGATCCGGTGGTGGTGCAAATCAAAGAACTGCTCCTCAGTGGATGTTGCCTTTACTTCTAGGCCTGTACGGAAGTGTTACTTCTGCTCTAAAAGCTGCGGAATTGTACCCGCGGCCGCCACCATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCATGGTATCAAAAAGCCTGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGCATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGAGTCGACCTCTGGATTACAAAATTTGTGAAAGATTGACTGGTATTCTTAACTATGTTGCTCCTTTTACGCTATGTGGATACGCTGCTTTAATGCCTTTGTATCATGCTATTGCTTCCCGTATGGCTTTCATTTTCTCCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCTCTTTATGAGGAGTTGTGGCCCGTTGTCAGGCAACGTGGCGTGGTGTGCACTGTGTTTGCTGACGCAACCCCCACTGGTTGGGGCATTGCCACCACCTGTCAGCTCCTTTCCGGGACTTTCGCTTTCCCCCTCCCTATTGCCACGGCGGAACTCATCGCCGCCTGCCTTGCCCGCTGCTGGACAGGGGCTCGGCTGTTGGGCACTGACAATTCCGTGGTGTTGTCGGGGAAATCATCGTCCTTTCCTTGGCTGCTCGCCTGTGTTGCCACCTGGATTCTGCGCGGGACGTCCTTCTGCTACGTCCCTTCGGCCCTCAATCCAGCGGACCTTCCTTCCCGCGGCCTGCTGCCGGCTCTGCGGCCTCTTCCGCGTCTTCGCCTTCGCCCTCAGACGAGTCGGATCTCCCTTTGGGCCGCCTCCCCGCGTCGACTAGAGCTCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGAGAGATCTGAGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACC（配列番号１７）
カプシド変異体
一部の実施形態では、本開示はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０およびそれらの組合せを含むがそれに限定されないいくつかの異なる血清型に由来する改善されたｒＡＡＶ粒子を提供する。特定の実施形態では、カプシドはＡＡＶ５またはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）を含む。一部の実施形態では、カプシドはＡＡＶ２の変異体、ＡＡＶ５の変異体、ＡＡＶ７の変異体、ＡＡＶ８の変異体、またはＡＡＶ９の変異体を含み得る。一部の実施形態では、カプシドはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ２ＴＴ、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、ＡＡＶ８（Ｙ４４７Ｆ＋Ｙ７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）、またはＡＡＶＡｎｃ８０を含む。一部の実施形態では、カプシドはＡＡＶ２、ＡＡＶ６、またはＡＡＶ２もしくはＡＡＶ６に由来するカプシド変異体を含む。したがって、一部の実施形態では、カプシドはＡＡＶ２（７ｍ８）、ＡＡＶ－ＤＪ、ＡＡＶ２／２－ＭＡＸ、ＡＡＶＳＨｈ１０、ＡＡＶＳＨｈ１０Ｙ、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶ７ＢＰ２、ＡＡＶ１（Ｅ５３１Ｋ）、ＡＡＶ６（Ｄ５３２Ｎ）、ＡＡＶ６－３ｐｍｕｔ、ＡＡＶ２Ｇ９、またはそれらのエレメントを含む。
特定の実施形態では、本開示はカプシド血清型ＡＡＶ４４．９のカプシド変異体を含むｒＡＡＶ粒子を提供する。一部の実施形態では、開示した粒子はカプシドタンパク質ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）を含む。本明細書の実施例に記載したように、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）は未改変のＡＡＶ４４．９およびＡＡＶｒｈ．８と比較して改善された網膜形質導入および両方の種においてベンチマークカプシド（例えばＡＡＶ５およびＡＡＶ８に基づくベクター）より有意に高い形質導入を媒介することが見出された。したがって、本開示は、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）血清型のカプシドタンパク質を含むｒＡＡＶ粒子ならびに関連する組成物および方法を提供する。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、例えば治療剤または診断薬をコードする異種核酸を含む。異種核酸は、一本鎖（ｓｓ）または自己相補性（ｓｃ）のＡＡＶ核酸ベクター、例えば一本鎖または自己相補性の組換えウイルスゲノムの形態であってよい。
本開示はさらに、Ｅ５３１Ｄ置換および１つまたは複数のさらなる置換、例えば残基４４６におけるＹ－Ｆ変異、残基４９２におけるＴ－Ｖ変異、またはその両方を含むＡＡＶ４４．９カプシドを有するｒＡＡＶ粒子を提供する。したがって、本開示は、ＡＡＶ４４．９（Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）カプシド、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｅ５３１Ｄ）カプシド、またはＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）カプシドを含むｒＡＡＶ粒子、ならびに関連する組成物および方法を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ４４．９カプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。このカプシドは、網膜下注射による網膜組織の改善された形質導入を媒介するために極めて好適であり得る。本発明者らは、ＡＡＶ４４．９粒子の硝子体内注射は効果的に網膜細胞に形質導入され得ないことを発見した。
一部の実施形態では、本開示は、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳカプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供する。ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳカプシドは霊長類の網膜において増強された側方展開を媒介し、効率的な光受容体形質導入を呈することが示された。本開示はまた、ＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）およびＡＡＶ８（Ｙ４４７Ｆ＋Ｙ７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）カプシド変異体を含む粒子を提供する。
本開示の態様は、網膜窩への網膜下注射の後で増強された側方展開を呈するＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドを含むベクターに関し、網膜窩の剥離（例えば一時的な水疱の剥離）が最小化される。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１、２、および／または３のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質、例えばＶＰ１、ＶＰ２、またはＶＰ３カプシドタンパク質を提供する。
一部の実施形態では、本開示は、ＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質を含むカプシドを含むｒＡＡＶ粒子を提供し、ｒＡＡＶ粒子は異種核酸を含むポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はＶＰ１、ＶＰ２、および／またはＶＰ３タンパク質を含むカプシドを含み、ＶＰ１タンパク質は配列番号１のアミノ酸配列を含み、ＶＰ２タンパク質は配列番号２のアミノ酸配列を含み、および／またはＶＰ３タンパク質は配列番号３のアミノ酸配列を含み、ＡＡＶは異種核酸を含むポリヌクレオチドをさらに含む。ポリヌクレオチドに１つまたは複数の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が隣接していてもよい。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号１、２、または３のいずれかと少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９２．５％の同一性、少なくとも９５％の同一性、９８％の同一性、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は配列番号１、２、および／または３のアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を提供する。特定の実施形態では、配列番号１で説明されるアミノ酸配列を含むカプシドが提供される（ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドＶＰ１）。一部の実施形態では、本開示は、配列番号１８と少なくとも８０％の同一性、少なくとも８５％の同一性、少なくとも９０％の同一性、少なくとも９２．５％の同一性、少なくとも９５％の同一性、９８％の同一性、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むカプシドタンパク質を提供する。特定の実施形態では、配列番号１８で説明されるアミノ酸配列を含むカプシドが提供される（ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）カプシドＶＰ１）。一部の実施形態では、開示したカプシドは、配列番号１～３および１８のいずれか１つの配列に関して異なる１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８アミノ酸を有する配列を含み得る。これらの相違は、配列番号１～３および１８のいずれか１つの配列に関して挿入、欠失、または置換されたアミノ酸を含み得る。
一部の実施形態では、本開示は、配列番号４の核酸配列を含む核酸、例えばプラスミドまたはウイルスベクター（これはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ１をコードする）を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号５の核酸配列を含む核酸、例えばプラスミドまたはウイルスベクター（これはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ２をコードする）を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号６の核酸配列を含む核酸、例えばプラスミドまたはウイルスベクター（これはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ３をコードする）を提供する。一部の実施形態では、ウイルスベクターは組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターである。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは自己相補性である。一部の実施形態では、核酸は細胞、例えば哺乳動物または昆虫の細胞の中に含まれる。
本明細書に記載したＡＡＶ４４．９カプシドタンパク質における全ての置換は、配列番号１で説明されるＶＰ１アミノ酸配列に基づいている。当業者には認識されるように、ＶＰ１配列において本明細書に記載した全ての置換は、ＶＰ２およびＶＰ３タンパク質の配列に等しく適用可能である。配列番号１～８および１８の配列を以下に提供する。
配列番号１－ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ１アミノ酸配列
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPLGEPPAAPSGLGPNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMASQARNWVPGPSYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDDDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号２－ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ２アミノ酸配列
MAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPLGEPPAAPSGLGPNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMASQARNWVPGPSYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDDDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号３：ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ３アミノ酸配列
MASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMASQARNWVPGPSYRQQRVSTTTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDDDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号１８－ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ１アミノ酸配列
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWDLKPGAPKPKANQQKQDDGRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNAADAAALEHDKAYDQQLKAGDNPYLRYNHADAEFQERLQEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEGAKTAPGKKRPVEQSPQEPDSSSGIGKTGQQPAKKRLNFGQTGDTESVPDPQPLGEPPAAPSGLGPNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISNGTSGGSTNDNTYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTTNEGTKTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQALGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYFLVRTQTTGTGGTQTLAFSQAGPSSMASQARNWVPGPSYRQQRVSTVTNQNNNSNFAWTGAAKFKLNGRDSLMNPGVAMASHKDDDDRFFPSSGVLIFGKQGAGNDGVDYSQVLITDEEEIKATNPVATEEYGAVAINNQAANTQAQTGLVHNQGVIPGMVWQNRDVYLQGPIWAKIPHTDGNFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPADPPLTFNQAKLNSFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYYKSTNVDFAVNTEGVYSEPRPIGTRYLTRNL
配列番号４－ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ１核酸配列
ATGGCTGCCGATGGTTATCTTCCAGATTGGCTCGAGGACAACCTCTCTGAGGGCATTCGCGAGTGGTGGGACTTGAAACCTGGAGCCCCGAAACCCAAAGCCAACCAGCAAAAGCAGGACGACGGCCGGGGTCTGGTGCTTCCTGGCTACAAGTACCTCGGACCCTTCAACGGACTCGACAAGGGGGAGCCCGTCAACGCGGCGGACGCAGCGGCCCTCGAGCACGACAAGGCCTACGACCAGCAGCTCAAAGCGGGTGACAATCCGTACCTGCGGTATAACCACGCCGACGCCGAGTTTCAGGAGCGTCTGCAAGAAGATACGTCTTTTGGGGGCAACCTCGGGCGAGCAGTCTTCCAGGCCAAGAAGCGGGTTCTCGAACCTCTCGGTCTGGTTGAGGAAGGCGCTAAGACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAGTCACCCCAAGAACCAGACTCCTCATCGGGCATCGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCCCCCTCAGGTCTGGGACCTAATACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGCACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAAGTCACGACGAACGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAATCTCACCAGCACCGTGCAGGTCTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTACCGTACGTGCTAGGATCAGCTCACCAGGGATGTCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGGTTCCTCAGTACGGTTATCTAACTCTGAACAATGGCAGCCAGGCCCTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTTCAGTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAAAGCCTGGACAGGCTGATGAATCCCCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGGTCAGAACGCAGACAACCGGGACTGGAGGGACGCAGACTCTGGCATTCAGCCAAGCAGGCCCTAGCTCAATGGCCAGCCAGGCTAGAAACTGGGTGCCCGGACCGAGCTACCGGCAGCAGCGCGTCTCCACGACAACCAACCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCTGGACGGGAGCTGCCAAATTTAAACTGAACGGCCGAGACTCTCTAATGAACCCCGGCGTGGCCATGGCTTCACACAAGGATGACGATGACCGGTTCTTCCCTTCTAGCGGGGTCCTGATTTTCGGCAAGCAAGGAGCCGGGAATGATGGAGTGGATTACAGCCAAGTGCTGATTACAGATGAGGAAGAAATCAAGGCTACCAACCCCGTGGCAACAGAGGAATATGGAGCAGTGGCCATCAACAACCAGGCCGCTAATACGCAGGCGCAGACCGGACTCGTGCACAACCAGGGGGTGATTCCCGGCATGGTGTGGCAGAACAGAGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCGTCTCCCCTGATGGGCGGCTTTGGACTGAAGCACCCGCCTCCTCAAATTCTCATCAAGAACACACCGGTTCCAGCGGACCCGCCGCTTACCTTCAACCAGGCCAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATCGAGTGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAACACGGAAGGAGTGTATAGCGAGCCTCGCCCCATTGGCACGCGCTACCTCACCCGTAATCTGTAA
配列番号５－ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ２核酸配列
ACGGCTCCTGGAAAGAAGAGACCGGTAGAGCAGTCACCCCAAGAACCAGACTCCTCATCGGGCATCGGCAAGACAGGCCAGCAGCCCGCTAAAAAGAGACTCAATTTTGGTCAGACTGGCGACACAGAGTCAGTCCCCGACCCACAACCTCTCGGAGAACCTCCAGCAGCCCCCTCAGGTCTGGGACCTAATACAATGGCTTCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGCACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAAGTCACGACGAACGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAATCTCACCAGCACCGTGCAGGTCTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTACCGTACGTGCTAGGATCAGCTCACCAGGGATGTCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGGTTCCTCAGTACGGTTATCTAACTCTGAACAATGGCAGCCAGGCCCTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTTCAGTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAAAGCCTGGACAGGCTGATGAATCCCCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGGTCAGAACGCAGACAACCGGGACTGGAGGGACGCAGACTCTGGCATTCAGCCAAGCAGGCCCTAGCTCAATGGCCAGCCAGGCTAGAAACTGGGTGCCCGGACCGAGCTACCGGCAGCAGCGCGTCTCCACGACAACCAACCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCTGGACGGGAGCTGCCAAATTTAAACTGAACGGCCGAGACTCTCTAATGAACCCCGGCGTGGCCATGGCTTCACACAAGGATGACGATGACCGGTTCTTCCCTTCTAGCGGGGTCCTGATTTTCGGCAAGCAAGGAGCCGGGAATGATGGAGTGGATTACAGCCAAGTGCTGATTACAGATGAGGAAGAAATCAAGGCTACCAACCCCGTGGCAACAGAGGAATATGGAGCAGTGGCCATCAACAACCAGGCCGCTAATACGCAGGCGCAGACCGGACTCGTGCACAACCAGGGGGTGATTCCCGGCATGGTGTGGCAGAACAGAGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCGTCTCCCCTGATGGGCGGCTTTGGACTGAAGCACCCGCCTCCTCAAATTCTCATCAAGAACACACCGGTTCCAGCGGACCCGCCGCTTACCTTCAACCAGGCCAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATCGAGTGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAACACGGAAGGAGTGTATAGCGAGCCTCGCCCCATTGGCACGCGCTACCTCACCCGTAATCTGTAA
配列番号６－ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ＶＰ３核酸配列
ATGGCTTCAGGCGGTGGCGCTCCAATGGCAGACAATAACGAAGGCGCCGACGGAGTGGGTAATTCCTCGGGAAATTGGCATTGCGATTCCACATGGCTGGGGGACAGAGTCATCACCACCAGCACCCGAACCTGGGCCCTGCCCACCTACAACAACCACCTCTACAAGCAAATCTCCAACGGCACCTCGGGAGGAAGCACCAACGACAACACCTACTTTGGCTACAGCACCCCCTGGGGGTATTTTGACTTCAACAGATTCCACTGCCACTTTTCACCACGTGACTGGCAGCGACTCATCAACAACAATTGGGGATTCCGGCCCAAGAGACTCAACTTCAAGCTCTTCAACATCCAGGTCAAGGAAGTCACGACGAACGAAGGCACCAAGACCATCGCCAATAATCTCACCAGCACCGTGCAGGTCTTTACGGACTCGGAGTACCAGCTACCGTACGTGCTAGGATCAGCTCACCAGGGATGTCTGCCTCCGTTCCCGGCGGACGTCTTCATGGTTCCTCAGTACGGTTATCTAACTCTGAACAATGGCAGCCAGGCCCTGGGACGTTCCTCCTTCTACTGCCTGGAGTATTTCCCATCGCAGATGCTGAGAACCGGCAACAACTTTCAGTTCAGCTACACCTTCGAGGACGTGCCTTTCCACAGCAGCTACGCGCACAGCCAAAGCCTGGACAGGCTGATGAATCCCCTCATCGACCAGTACCTGTATTACCTGGTCAGAACGCAGACAACCGGGACTGGAGGGACGCAGACTCTGGCATTCAGCCAAGCAGGCCCTAGCTCAATGGCCAGCCAGGCTAGAAACTGGGTGCCCGGACCGAGCTACCGGCAGCAGCGCGTCTCCACGACAACCAACCAGAACAACAACAGCAACTTTGCCTGGACGGGAGCTGCCAAATTTAAACTGAACGGCCGAGACTCTCTAATGAACCCCGGCGTGGCCATGGCTTCACACAAGGATGACGATGACCGGTTCTTCCCTTCTAGCGGGGTCCTGATTTTCGGCAAGCAAGGAGCCGGGAATGATGGAGTGGATTACAGCCAAGTGCTGATTACAGATGAGGAAGAAATCAAGGCTACCAACCCCGTGGCAACAGAGGAATATGGAGCAGTGGCCATCAACAACCAGGCCGCTAATACGCAGGCGCAGACCGGACTCGTGCACAACCAGGGGGTGATTCCCGGCATGGTGTGGCAGAACAGAGACGTGTACCTGCAGGGTCCCATCTGGGCCAAAATTCCTCACACGGACGGCAACTTTCACCCGTCTCCCCTGATGGGCGGCTTTGGACTGAAGCACCCGCCTCCTCAAATTCTCATCAAGAACACACCGGTTCCAGCGGACCCGCCGCTTACCTTCAACCAGGCCAAGCTGAACTCTTTCATCACGCAGTACAGCACCGGACAGGTCAGCGTGGAAATCGAGTGGGAGCTGCAGAAAGAAAACAGCAAACGCTGGAATCCAGAGATTCAGTACACTTCCAACTACTACAAATCTACAAATGTGGACTTTGCTGTCAACACGGAAGGAGTGTATAGCGAGCCTCGCCCCATTGGCACGCGCTACCTCACCCGTAATCTGTAA
一部の実施形態では、ＡＡＶ－ＤＪカプシドが本開示のｒＡＡＶベクターと併せて使用される。ＡＡＶ－ＤＪはＡＡＶ２カプシドのＨＳＰＧ結合ドメインの中への７アミノ酸の挿入を含み、硝子体内注射に続いてミュラー細胞中で高い発現効率を有する。一部の実施形態では、ＡＡＶ２（７ｍ８）が本開示のｒＡＡＶベクターと併せて使用される。ＡＡＶ２（７ｍ８）カプシドはＡＡＶ－ＤＪと緊密に関連している。一部の実施形態では、ＡＡＶ２／２－ＭＡＸカプシドは５つの点変異、即ちＹ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｔ４９１Ｖを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶＳＨｈ１０およびＡＡＶ６（Ｄ５３２Ｎ）カプシドはＡＡＶ６の誘導体である。一部の実施形態では、ＡＡＶ６－３ｐｍｕｔはＡＡＶ６（ＴＭ６）およびＡＡＶ６（Ｙ７０５＋Ｙ７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ）としても知られている。
一部の実施形態では、開示したｒＡＡＶベクターと併せて使用されるカプシドは、野生型ＡＡＶ２カプシドのアミノ酸残基に非天然アミノ酸置換を含むカプシドである。一部の実施形態では、非天然アミノ酸置換は、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、Ｔ４９１Ｖ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ７００Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ７３０Ｆの１つもしくは複数またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、カプシドは配列番号６で説明される野生型ＡＡＶ６カプシドのアミノ酸残基に非天然アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、非天然アミノ酸置換はＹ４４５Ｆ、Ｙ７０５Ｆ、Ｙ７３１Ｆ、Ｔ４９２Ｖ、Ｓ６６３Ｖの１つもしくは複数またはそれらの組合せを含む。一部の実施形態では、カプシドはＡＡＶ２の変異体であるＡＡＶ２Ｇ９を含む。
一部の実施形態では、カプシドは野生型ＡＡＶ８カプシドのアミノ酸残基５３３に非天然アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、非天然アミノ酸置換はＥ５３３Ｋ、Ｙ７３３Ｆまたはそれらの組合せである。一部の実施形態では、カプシドはＡＡＶ８の変異体であるＡＡＶ７ＢＰ２を含む。
一部の実施形態では、カプシドは野生型ＡＡＶ２カプシドの非天然アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、カプシドは：
（ａ）Ｙ４４４Ｆ；
（ｂ）Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ；
（ｃ）Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ；
（ｄ）Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ；または
（ｅ）Ｙ２７２Ｆ＋Ｙ４４４Ｆ＋Ｙ５００Ｆ＋Ｙ７３０Ｆ＋Ｔ４９１Ｖ
の１つもしくは複数、または野生型ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、もしくはＡＡＶ１０カプシドタンパク質のいずれか１つにおけるそれに対応する等価のアミノ酸位置に置換を含む。
一部の実施形態では、カプシドは野生型ＡＡＶ６カプシドの非天然アミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、カプシドは
（ａ）Ｙ４４５Ｆ；
（ｂ）Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ；
（ｃ）Ｔ４９２Ｖ；
（ｄ）Ｙ７０５Ｆ＋Ｙ７３１Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ；
（ｅ）Ｓ６６３Ｖ；または
（ｆ）Ｓ６６３Ｖ＋Ｔ４９２Ｖ
の１つまたは複数を含む。
種々の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は以下のカプシド、即ちＡＡＶ２：ＤＧＥ－ＤＦ（「Ｖ１Ｖ４ ＶＲ－Ｖ」としても知られている）、Ｐ２－Ｖ２、Ｐ２－Ｖ３、およびＭＥ－Ｂ（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）のカプシド変異体の１つを含む。ＤＧＥ－ＤＦカプシド変異体は、野生型ＡＡＶ２ ＶＰ１のアミノ酸４９２位、４９３位、４９４位、４９９位、および５００位にアスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびフェニルアラニンを含む。Ｐ２－Ｖ２カプシド変異体は、ＡＡＶ２ ＶＰ１の２６３位、４９０位、４９２位、４９９位、５００位、および５３０位にアラニン、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、フェニルアラニン、およびアスパラギン酸を含む。Ｐ２－Ｖ３カプシド変異体は、ＡＡＶ２ ＶＰ１の２６３位、２６４位、４４４位、４５１位、４５４位、４５５位、４５９位、５２７位、５３０位、および５３１位にアスパラギン、アラニン、フェニルアラニン、アラニン、アスパラギン、バリン、スレオニン、アルギニン、アスパラギン酸、およびアスパラギン酸を含む。ＭＥ－Ｂ（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）カプシド変異体は、ＡＡＶ２ ＶＰ１の４９２位、４９３位、４９４位、４９９位、および５００位にそれぞれアスパラギン酸、グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、およびフェニルアラニン、ＡＡＶ２ ＶＰ１の５４６位～５５６位にＳＡＡＧＡＤＸＡＸＤＳ、ならびに以下の置換：Ｙ２７２Ｆ、Ｙ４４４Ｆ、およびＴ４９１Ｖを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ６（３ｐＭｕｔ）、ＡＡＶ２（ｑｕａｄＹＦ＋Ｔ－Ｖ）、またはＡＡＶ２（ｔｒｐＹＦ）から選択されるカプシドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、参照により本明細書に組み込まれる国際特許公開ＷＯ２０１８／１５６６５４号に記載されたカプシド変異体のいずれかを含む。
一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子はＡＡＶ２由来の１つまたは複数のカプシド、例えばＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳカプシドを含む。ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳのカプシド配列（配列番号３６～３８）の例を以下に提供する。
配列番号３６－ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ ＶＰ１アミノ酸配列
MAADGYLPDWLEDTLSEGIRQWWKLKPGPPPPKPAERHKDDSRGLVLPGYKYLGPFNGLDKGEPVNEADAAALEHDKAYDRQLDSGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRVLEPLGLVEEPVKTAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYFLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQGVSKVSADNNNSEFSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRFLTRNL
配列番号３７－ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ ＶＰ２アミノ酸配列
TAPGKKRPVEHSPVEPDSSSGTGKAGQQPARKRLNFGQTGDADSVPDPQPLGQPPAAPSGLGTNTMATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYFLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQGVSKVSADNNNSEFSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRFLTRNL
配列番号３８－ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ ＶＰ３アミノ酸配列
MATGSGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSTWMGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQISSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKRLNFKLFNIQVKEVTQNDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRSSFYCLEYFPSQMLRTGNNFTFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYFLSRTNTPSGTTTQSRLQFSQAGASDIRDQSRNWLPGPCYRQQGVSKVSADNNNSEFSWTGATKYHLNGRDSLVNPGPAMASHKDDEEKFFPQSGVLIFGKQGSEKTNVDIEKVMITDEEEIRTTNPVATEQYGSVSTNLQSGNTQAATADVNTQGVLPGMVWQDRDVYLQGPIWAKIPHTDGHFHPSPLMGGFGLKHPPPQILIKNTPVPANPSTTFSAAKFASFITQYSTGQVSVEIEWELQKENSKRWNPEIQYTSNYNKSVNVDFTVDTNGVYSEPRPIGTRFLTRNL
図８Ａ～８Ｃに示すように、Ｎｒｌ－ＧＦＰマウスの網膜に網膜下注射したｒＡＡＶベクターの形質導入プロファイルを、注射後４～６週で評価した。フローサイトメトリーを使用して形質導入効率を決定した。図８Ｃに示すように、ベクター（ｃｅｃｔｏｒ）に媒介されるＧＦＰの発現および錐体アレスチンの共局在化は、評価したＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ４４．９（Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶｒｈ．８、およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）カプシドが錐体の光受容体に効率的に形質導入されることを示している。
天然の成長研究に関連するＯＣＴの測定および分離活性スコアを評価した。ＲＳ１に対するモノクローナル抗体で染色した１月齢のマウスの網膜切片（陰影付き）を図１４に示す。ヘテロ接合体の雌マウスおよび野生型雄マウスの光受容体の内部／外部セグメント接合部に局在化したＲＳ１の発現は、雄および雌のＲＳ１ ＫＯマウスには存在しない。分離内腔が内部網膜で観察された。
ベクター
組換えＡＡＶベクターが本明細書において説明される。いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるベクターは、自己相補性ｒＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、一本鎖（ｓｓ）ベクターである。いくつかの実施形態において、ベクターは、治療される疾患または状態の１つまたは複数の症状を治療または改善するのに十分な量および時間において、感染性アデノ関連ウイルス粒子、ｒＡＡＶビリオン、または複数の感染性ｒＡＡＶ粒子の１回または複数回の投与によって一方または両方の眼に提供される。
いくつかの態様において、選択された治療薬（例えば、合成ヒトＲＳ１）の治療有効量をそれを必要とする哺乳動物に提供する方法が、本明細書において説明される。いくつかの実施形態において、治療薬は、異種核酸において、または組換えＡＡＶ核酸ベクターに挿入された導入遺伝子において、コードされる。いくつかの実施形態において、核酸ベクターは、プロモーター（例えば、ｈＧＲＫ１プロモーター）に作動可能に連結された目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする配列を含む１つまたは複数の異種核酸を含み、この場合、当該１つまたは複数の導入遺伝子は、ＩＴＲ配列によって両側に隣接される。開示される核酸ベクターは、ＲＳ１異種核酸（導入遺伝子）および他の調節エレメントを含むポリヌクレオチドに隣接するＡＡＶ逆方向末端リピートを含み得る。いくつかの実施形態において、開示される核酸ベクターは、ＲＳ１異種核酸と、ＳＶ４０イントロンと、ＷＰＲＥｓｆエレメントと、ポリＡシグナル配列とを含むポリヌクレオチドに隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。いくつかの実施形態において、ベクターは、ＲＳ１異種核酸と、ＳＶ４０イントロンと、ＷＰＲＥｓｆエレメントと、スタッフ配列と、ポリＡ配列を含むポリヌクレオチドに隣接するＡＡＶ ＩＴＲを含む。
ＩＴＲ配列は、任意のＡＡＶ血清型（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）に由来し得、または２つ以上の血清型に由来し得る。いくつかの実施形態において、第１の血清型のＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７ＡＡＶ８、またはＡＡＶ９に由来する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列は、ＡＡＶ２またはＡＡＶ５に由来する。いくつかの実施形態において、ＩＴＲ配列は、カプシド（例えば、ＡＡＶ５ ＩＴＲ配列およびＡＡＶ５カプシドなど）と同じ血清型である。
ＩＴＲ配列およびＩＴＲ配列を含むプラスミドは、当技術分野において既知であり、ならびに市販されており（例えば、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ；Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，Ｃａ；およびＡｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡから入手可能な製品およびサービスを参照されたい；ならびに骨格筋への遺伝子デリバリーは、結果として、治療タンパク質の持続的発現および全身デリバリーをもたらす。いくつかの実施形態において、核酸ベクターは、ＡＡＶ２ ＩＴＲを含むプラスミドであるｐＴＲ－ＵＦ－１１プラスミド骨格を含む。このプラスミドは、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ ＭＢＡ－３３１）から市販されている。
いくつかの態様において、本明細書において説明されるｒＡＡＶベクターは、複数の（２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、または１０つの）異種核酸を含み得る。ある特定の実施形態では、複数の異種核酸は、単一のポリヌクレオチド分子上に含まれる。複数の異種核酸は、例えば、マルチサブユニットタンパク質によって引き起こされる遺伝子欠損を修正または改善するために使用され得る。様々な実施形態において、異なる異種核酸は、タンパク質の各サブユニットをコードするため、あるいは異なるペプチドまたはタンパク質をコードするために使用され得る。これは、タンパク質サブユニットをコードする核酸のサイズが、例えば、免疫グロブリン、血小板由来増殖因子、またはジストロフィンタンパク質に対して大きい場合、望ましい。細胞がマルチサブユニットタンパク質を産生するために、細胞は、当該異なるサブユニットのそれぞれを含むｒＡＡＶ粒子に感染させられる。あるいは、タンパク質の異なるサブユニットは、同じ核酸配列によってコードされ得る。様々な実施形態において、単一の異種核酸は、当該サブユニットのそれぞれをコードする核酸を含み、各サブユニットに対する当該核酸は、内部リボソーム（ｒｉｂｏｚｙｍｅ）侵入部位によって分離される。これは、サブユニットのそれぞれをコードする核酸のサイズが小さい、例えば、サブユニットおよびＩＲＥＳをコードする核酸の総サイズが５キロ塩基未満である場合に、望ましい。
ＩＲＥＳの代替として、当該核酸は、翻訳後事象において自己切断する２Ａペプチドをコードする配列によって分離され得る。この２Ａペプチドは、ＩＲＥＳより著しく小さく、そのことは、この２Ａペプチドを、スペースが制限因子である場合の使用に対してよく適したものにする。大抵、異種核酸は、それが大きい場合、マルチサブユニットからなるか、または２つの異種核酸がコデリバリー（ｃｏ－ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ）されるか、または所望の異種核酸またはサブユニットを保持するｒＡＡＶ粒子が、単一のベクターゲノムを形成させるために、それらをインビボにおいてコンカテマー化させるために同時投与される。そのような実施形態では、第１のｒＡＡＶ粒子は、単一の異種核酸を発現する発現カセットを保持し得、ならびに、第２のｒＡＡＶ粒子は、宿主細胞での共発現のために異なる異種核酸を発現する発現カセットを保持し得る。ただし、選択された異種核酸は、任意の生物学的に活性な産物または他の産物、例えば、研究にとって望ましい産物、をコードし得る。
いくつかの態様において、当該ｒＡＡＶベクターは、ヒト発現のためにコドン最適化され得る。いくつかの実施形態において、当該ｒＡＡＶベクターは、標的細胞、例えば、ＰＲ細胞など、における増強された形質導入または適合性を提供する修飾されたＫｏｚａｋ核酸配列を有し得る。Ｋｏｚａｋ配列は、翻訳開始コドン（ＡＴＧ）および開始コドンの５’に位置されたヌクレオチドのストレッチを含む。
治療方法および製剤
いくつかの実施形態において、選択された治療薬の治療有効量をそれを必要とする哺乳動物を提供するステップを伴う方法であって、本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子のある量を；選択された治療薬の治療有効量を哺乳物に提供するのに有効な時間において、哺乳動物の片方の眼または両方の眼に投与するステップ含む方法が提供される。
ある特定の実施形態では、当該哺乳動物は、Ｘ連鎖性網膜分離症（Ｘ－ｌｉｎｋｅｄ ｒｅｔｉｎｏｓｃｈｉｓｃｈｉｓ）を患うことが疑われるか、それを発症するリスクにあるか、またはそれを患っていると診断される。
いくつかの実施形態において、哺乳動物の光受容体細胞または網膜色素上皮細胞を形質導入する方法であって、本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子を哺乳動物の片方の眼または両方の眼に投与する工程を含む上記方法が提供される。特定の実施形態において、哺乳動物の１つまたは複数の光受容体細胞においてポリヌクレオチドを発現する方法であって、本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子を哺乳動物の片方の眼または両方の眼に網膜下または硝子体内において投与する工程、またはその組合せを含み、当該ｒＡＡＶ粒子は、哺乳動物の１つまたは複数のＰＲまたはＲＰＥ細胞において治療薬を産生するのに有効な時間において、治療薬をコードする少なくとも第１の異種核酸配列に作動可能に連結されたＰＲまたはＲＰＥ細胞特異的プロモーターを含む少なくとも第１のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドを含む、上記方法が提供される。
特定の実施形態において、再配置コード配列（ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）が、対象（例えば、ヒト）に対して、例えば、光受容体機能を完全にまたは部分的に回復するために、機能的タンパク質、例えば、ＲＳ１タンパク質、を産生させるために対象に投与される。いくつかの実施形態において、対象の標的コード配列の一方または両方のアレルは、対象に（例えば、優位な錐体－桿体変性を有するヒトに）本明細書において開示される異種核酸を含むｒＡＡＶ粒子を投与することによって発現停止される。特定の実施形態において、１つまたは複数の標的コード配列の内因性変異アレルは、本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子を投与することによって発現停止または抑制される。
いくつかの実施形態において、哺乳動物は、ヒト対象である、いくつかの実施形態において、哺乳動物は、非ヒト霊長類対象である。非ヒト霊長類対象の非限定的な例としては、マカクザル（例えば、カニクイザルまたはアカゲザル）、マーモセット、タマリン、クモザル、フクロウザル、尾長ザル、リスザル、ヒヒ、ゴリラ、チンパンジー、およびオランウータンが挙げられる。他の例示的対象としては、飼育動物、例えば、イヌおよびネコなど；家畜、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、およびニワトリなど；ならびに他の動物、例えば、マウス、ラット、モルモット、およびハムスターなど、が挙げられる。
ある特定の実施形態では、哺乳動物の中心窩（例えば、中心窩錐体細胞）に本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子またはその組合せを網膜下投与する方法が提供される。特定の実施形態において、中央窩の剥離は、網膜下投与の際および／または後に最小化される。特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子の網膜下投与は、中央窩の任意の剥離の不在下において実施される。
いくつかの実施形態において、細胞または対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の用量は、１０６ｖｇ／ｍＬから１０１４ｖｇ／ｍＬ（または粒子／ｍＬ）または１０３ｖｇ／ｍＬから１０１５ｖｇ／ｍＬの範囲、あるいはそれぞれの範囲内の任意の値、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ｖｇｓ／ｍＬなど、のオーダーであり得る。特定の実施形態において、５×１０１０ｖｇ／ｍＬの量のｒＡＡＶ粒子が投与される。いくつかの実施形態において、１×１０１１ｖｇ／ｍＬの量のｒＡＡＶ粒子が投与される。いくつかの実施形態において、１×１０１２ｖｇ／ｍＬの量のｒＡＡＶ粒子が投与される。いくつかの実施形態において、対象に投与されるｒＡＡＶ粒子の用量は、１０６ｖｇ／ｍＬから１０１４ｖｇ／ｍＬ、または１０３ｖｇ／ｍＬから１０１５ｖｇ／ｍＬの範囲、あるいはそれぞれの範囲内の任意の値、例えば、約１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、または１０１４ｖｇ／ｍＬなど、のオーダーであり得る。いくつかの実施形態において、１０３ｖｇ／ｍＬを超えるｒＡＡＶ粒子が投与される。ｒＡＡＶ粒子は、単回投与として投与することができ、あるいは特定の疾患、障害、または治療されるべき状態の療法を達成することが必要であり得る場合に２回以上の投与に分割することができる。
特定の実施形態において、ｒＡＡＶ粒子力価は、５×１０１０～１×１０１２ｖｇ／ｍｌの範囲である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子力価は、１×１０１０、２．５×１０１０、５×１０１０、１×１０１１、２．５×１０１１、５×１０１１、１×１０１２、２．５×１０１２、５×１０１２、１×１０１３、２．５×１０１３、または５×１０１３ｖｇ／ｍＬであり得る。いくつかの実施形態において、粒子力価は、５×１０１０ｖｇ／ｍＬ未満である。いくつかの実施形態において、ｒＡＡＶ粒子は、本明細書において開示される方法（例えば、網膜下または硝子体内）によって投与される。特定の実施形態において、粒子は、網膜下投与される。
ｒＡＡＶ粒子は、単回投与として投与することができ、あるいは特定の疾患、障害、または治療されるべき状態の療法を達成することが必要であり得る場合に２回以上の投与に分割することができる（例えば、３つまでの網膜下注入ブレブ）。いくつかの実施形態において、１マイクロリットルから５００マイクロリットルの本願において説明される組成物（例えば、ｒＡＡＶ粒子を含む）が、対象の片方の眼または両方の眼に投与される。例えば、いくつかの実施形態において、約１０、約３０、約４５、約５０、約７５、約９０、約１００、約２００マイクロリットルが、各眼に投与され得る。特定の実施形態において、それぞれ１０μＬから１００μＬのブレブ量の範囲の３回の網膜下注入が、投与され得る。しかしながら、いくつかの実施形態において、より少ない量またはより多い量を投与することもできることは理解されるべきである。
いくつかの実施形態において、本開示は、単独あるいは１つまたは複数の他の種類の療法との組合せにおける、ならびに特に、ヒトの細胞、組織、およびヒトに影響を及ぼす疾患の療法のための、細胞または動物への投与のための薬学的に許容される溶液における本明細書において開示される１つまたは複数のｒＡＡＶベースの組成物の製剤を提供する。
本明細書において開示されるｒＡＡＶ粒子は、さらに他の薬剤、例えば、タンパク質またはポリペプチド、あるいは様々な薬学的に活性な薬剤、例えば、ポリペプチド製剤、その生物学的に活性な断片、またはバリアントの１回または複数回の全身または局所投与など、との組合せにおいて投与され得る。特定の実施形態において、説明されるｒＡＡＶ粒子は、１つまたは複数の炭酸脱水酵素阻害剤（ＣＡＩ）との組合せにおいて投与され得る。いくつかの実施形態において、それらは、ＣＡＩアセタゾールアマイド、ジクロフェナミド（ジクロフェナミドとしても知られる）、メタゾラミド、ドルゾラミド、ブリンゾラミド、エトキスゾラミド、およびゾニサミドと共に共投与され得る。追加の薬剤が標的細胞または宿主組織との接触において著しい有害作用を引き起こさない限り、含ませられ得る他の成分に実質的に限界は存在しない。したがって、ｒＡＡＶ粒子は、特定の場合に必要とされるような様々な他の薬剤と共にデリバリーされ得る。そのような組成物は、宿主細胞または他の生物学的供給源から精製され得るか、または択一的に、本明細書において開示されるように化学合成され得る。
いくつかの実施形態において、ＸＬＲＳの少なくとも１つまたは複数の症状を診断、予防、治療、または改善するための医薬品の調製における、説明されるｒＡＡＶベクター、ウイルス粒子、組成物、および本明細書において説明される（宿主）細胞の使用が、本明細書において説明される。いくつかの実施形態において、当該方法は、影響を受ける哺乳動物の片方または両方の眼における、そのような疾患、機能不全、障害、異常状態、不全、損傷またはトラウマのうちの１つまたは複数の症状を診断、予防、治療、または減少するのに十分な量および時間において、説明されるベクターのうちの１つまたは複数、ウイルス粒子、細胞、組成物、またはそれらの複数の、それを必要とする哺乳動物の片方または両方の眼の硝子体への直接投与を含む。様々な実施形態において、哺乳動物は、ヒト対象である。
いくつかの実施形態において、説明されるｒＡＡＶベクター、粒子、組成物、および宿主細胞の１つまたは複数を含む、ＸＬＲＳを治療するための医薬品の調製における、ＸＬＲＳの治療において有用な組成物が、本明細書において説明される。いくつかの実施形態において、当該組成物は、医薬品の製造ならびにそのようなｒＡＡＶ粒子またはベクターの治療投与を伴う方法における使用のための、少なくとも第１の医薬的に許容される賦形剤を含む。いくつかの実施形態において、医薬製剤は、ヒトまたは他の哺乳動物の片方または両方の眼への硝子体内投与にとって好適である。
いくつかの実施形態において、ヒト光受容体またはＲＰＥ細胞におけるＸＬＲＳの症状を治療または改善するための方法および説明されるｒＡＡＶベクターの使用および組成物が、本明細書において説明される。いくつかの実施形態において、開示される方法および使用は、影響を受ける哺乳動物におけるそのような不全の症状を治療または改善するのに十分な量および時間において、説明される粒子ベクター、粒子、宿主細胞、または組成物のうちの１つまたは複数の、それを必要とする対象の片方また両方の眼への硝子体内または網膜下投与を含む。いくつかの実施形態において、当該方法は、そのような状態を有することが疑われる動物の予防的処置、あるいは診断後または症状の発症前の、そのような状態を発症するリスクにある動物へのそのような組成物の投与を含む。
医薬組成物および細胞
いくつかの態様において、本開示は、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシド、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドをコードする核酸、または本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子を組み入れた粒子を含む宿主細胞を想定する。そのような宿主細胞としては、哺乳動物宿主細胞が挙げられ、この場合、ヒト宿主細胞は好ましく、ならびに、例えば、細胞または組織培養において、単離され得る。いくつかの実施形態において、宿主細胞は、眼の細胞である。
いくつかの実施形態において、本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドを含む）ならびに必要に応じて薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤、および／または緩衝剤を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本明細書おいて説明される組成物は、治療を必要とする哺乳動物（または対象）に投与することができる。いくつかの実施形態において、対象は、網膜分離症を有するかまたは有することが疑われる。いくつかの実施形態において、対象は、１つまたは複数の内因性変異アレル（例えば、眼または網膜の疾患、障害、または状態、例えば、網膜分離症など、に関連するかそれを引き起こす）を有する。
様々な治療レジメン、例えば、網膜下、硝子体内注入、腸管外、静脈内、鼻腔内、関節内、および筋肉内投与および製剤など、における本明細書において説明される特定の組成物を使用するための好適な投薬および治療レジメンの開発である場合の、薬学的に許容される賦形剤または担体溶液の製剤化は、当業者に周知である。
典型的には、これらの製剤は、少なくとも約０．１％以上の治療薬（例えば、ｒＡＡＶ粒子）を含有し得るが、有効成分の割合は、当然ながら、変わり得、ならびに、簡便には、総製剤重量または体積の約１％または２％から約７０％または８０％以上の間であり得る。無論のこと、各治療的に有用な組成物中の治療薬（例えば、ｒＡＡＶ粒子）の量は、好適な投薬量が当該化合物の任意の所定の単位用量において得られるような方法において調製され得る。そのような医薬製剤の調製の要因、例えば、溶解性、バイオアベイラビリティ、生物学的半減期、投与の経路、製品貯蔵期限、ならびに他の薬品作用学的問題など、は、当業者によって想到されるであろうし、したがって、様々な投薬量および治療レジメンが望ましくあり得る。
ある特定の状況において、本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドを含む）を、好適に製剤化された本明細書において開示される医薬組成物において、網膜下、眼内、硝子体内、非経口、皮下、静脈内、脳室内、筋肉内、髄腔内、経口、腹腔内、経口もしくは経鼻吸入、あるいは直接注入による１つまたは複数の細胞、組織、または器官への直接注入、のいずれかによってデリバリーすることは望ましいであろう。
注入可能な使用にとって好適な組成物（例えば、本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子を含む）の医薬品形態としては、無菌水溶液または分散液が挙げられる。いくつかの実施形態において、当該形態は、無菌であり、ならびに容易な注射適用性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動的である。いくつかの実施形態において、当該形態は、製造および貯蔵条件下において安定であり、ならびに、微生物、例えば、細菌および真菌など、の汚染動作に対して保護される。担体は、例えば、水、塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、ならびに／あるいは植物油、を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの保守によって、ならびに界面活性剤の使用によって、維持され得る。
用語「担体」は、本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子を投与するために用いられる、希釈剤、助剤、賦形剤、またはビヒクルを意味する。そのような医薬担体は、水および油などの無菌液体、例えば、石油、例えば、鉱油など、植物油、例えば、落花生油、大豆油、および胡麻油など、動物油、あるいは合成起源の油など、であり得る。生理食塩水ならびにブドウ糖およびグリセリン水溶液も、液体担体として用いることができる。
本開示の組成物は、様々な経路によって眼にデリバリーすることができる。それらは、例えば、ガラス質（硝子体内注入）または網膜下（網膜下注入）の光受容体間のスペースへの、眼への局所適用によって、または眼内注入によって、眼内にデリバリーされ得る。いくつかの実施形態において、それらは、桿体光受容体細胞にデリバリーされる。あるいは、それらは、眼の周りの組織内へ挿入または注入によって局所的にデリバリーされ得る。それらは、経口経路によって、あるいは皮下、静脈内、または筋肉内注入によって、全身にデリバリーされ得る。あるいは、それらは、カテーテルによって、あるいはインプラントによって、デリバリーされ得、この場合、そのようなインプラントは、多孔性物質、非孔性物質、またはゲル状物質、例えば、シラスティック膜などの膜、あるいは、繊維、生分解性ポリマー、またはタンパク性物質など、で作製される。それらは、当該状態の発症の前に、その発生を防ぐために、例えば、眼の手術の間に、または病的状態の発症直後に、または急性または遅延性状態の発生の間に、投与することができる。
注入可能な水溶液の投与の場合、例えば、溶液は、必要であれば、好適に緩衝され得、ならびに、液体希釈剤は、最初に、十分な塩水またはグルコースによって等張にされる。これら特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、硝子体内注入、皮下、および腹腔内注射に対してとりわけ好適である。これに関連して、用いることができる無菌水性媒体は、本開示の観点から当業者に理解されるであろう。例えば、１回投薬量は、１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解され得、ならびに、１０００ｍｌの皮下注入流体に加えられ得るか、または点滴の提示部位に注入され得る（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照されたい）。投薬量におけるいくつかのバリエーションは、治療される対象の状態に応じて、必然的に生じるであろう。投与に対して責任を負う者は、いずれにしても、個々の対象に対して適切な用量を決定するであろう。その上、ヒトへの投与に対して、調製剤は、ＦＤＡ当局の生物基準（ＦＤＡ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ ｓｔａｎｄａｒｄｓ）によって要求される滅菌性、発熱原性、および一般的な安全性および純度の基準を満たすべきである。
滅菌注射用溶液は、本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子を、必要な量において、上記に列挙される他の成分のいくつかを伴う適切な溶媒に組み入れることによって調製され得、必要に応じて、その後に濾過滅菌され得る。概して、分散液は、様々な滅菌された有効生物を塩基性分散媒と上記に列挙した成分のうちの必要な他の成分とを含有する滅菌ビヒクルに組み入れることによって調製される。無菌の注入可能な溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥の技術であり、これらの技術により、有効成分とそれらの予め濾過滅菌した溶液からの任意のさらなる所望の成分とによる粉末を得る。
組成物（例えば、本明細書において説明されるｒＡＡＶ粒子を含む）の量およびそのような組成物の投与の時間は、本教示の恩恵を有する当業者の範囲内であろう。しかしながら、おそらく、本開示の組成物の治療有効量の投与は、単回投与、例えば、そのような治療を受ける患者に治療効果を提供するために十分な数のｒＡＡＶ粒子の１回の注入によって達成され得るであろう。あるいは、状況によって、そのような組成物の投与を監督する開業医によって決定され得るように、比較的短い期間または比較的長い期間にわたって、当該組成物の複数回の投与または連続投与を提供することは望ましくあり得る。
いくつかの実施形態において、視力は、本願において説明される１つまたは複数の組成物を投与した後に維持または回復することができる（例えば、部分的にまたは完全に）。
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の光受容体細胞あるいは１つまたは複数のＲＰＥ細胞は、部分的にまたは完全に保存され得、ならびに／あるいは１つまたは複数の桿体／錐体媒介性機能は、本願において説明される１つまたは複数の組成物を投与した後に部分的にまたは完全に回復され得る。
疾患を「治療」するとは、本明細書において用語が使用される場合、対象によって経験される疾患、障害、または状態（例えば、錐体－桿体ジストロフィ）の少なくとも１つの兆候または症状の頻度または重症度を減じることを意味する。上記において説明される組成物は、典型的には、有効量、即ち、望ましい結果を生じることができる量、において対象に投与される。望ましい結果は、投与される活性剤に依存するであろう。例えば、ｒＡＡＶ粒子の有効量は、異種核酸を宿主の器官、組織、または細胞へ移動させることができる粒子の量であり得る。
本開示の方法において用いられる組成物の毒性および有効性は、ＬＤ５０（集団の５０％を死に至らせる用量）を特定するために、培養中の細胞または実験動物を使用して標準的な製薬手順（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）によって決定することができる。毒性と有効性との間の用量比は、治療指数であり、ならびに、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表現することができる。大きな治療指数を示す組成物が好ましい。毒性副作用を示すものも使用され得るが、そのような副作用の潜在的ダメージを最小化するデリバリーシステムを設計するように、注意が払われなければならない。本明細書において説明される組成物の投薬量は、概して、わずかな毒性かまたは毒性が全くないＥＤ５０を含む範囲内である。当該投薬量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて、この範囲内で変わり得る。
ｒＡＡＶ粒子を作製する方法
偽型ｒＡＡＶ粒子を作製および使用する方法は、当技術分野において既知である（例えば、Duan et al., J. Virol., 75:7662-7671, 2001; Halbert et al., J. Virol., 74:1524-1532, 2000; Zolotukhin et al., Methods, 28:158-167, 2002;およびAuricchio et al., Hum. Molec. Genet., 10:3075-3081, 2001を参照されたい）。ｒＡＡＶ粒子および異種核酸を作製する方法も、当技術分野において既知であり、ならびに商業的に入手可能である（例えば、Zolotukhin et al. Production and purification of serotype 1, 2, and 5 recombinant adeno-associated viral vectors. Methods 28 (2002) 158-167；ならびに米国特許出願公開第２００７／００１５２３８号および同第２０１２／０３２２８６１号を参照されたく、なお、当該特許仮出願は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられ；ならびに、プラスミドおよびキットは、ＡＴＣＣおよびＣｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ， Ｉｎｃ．から入手可能である）。例えば、異種核酸を含むプラスミドは、１つまたは複数のヘルパープラスミド、例えば、ｒｅｐ遺伝子（例えば、Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２、およびＲｅｐ４０をコードする）およびｃａｐ遺伝子（ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３、例えば、本明細書において説明される修飾されたＶＰ領域など、をコードする）を含むものと組み合わせられ得、ならびに、トランスフェクトされ得るかまたは、ｒＡＡＶ粒子がパッケージされ得るようにプロデューサー細胞系へと永久的に統合され得、ならびにその後に精製され得る。
いくつかの実施形態において、当該１つまたは複数のヘルパープラスミドは、ｒｅｐ遺伝子およびｃａｐ遺伝子（例えば、本明細書において説明されるｒＡＡＶカプシドタンパク質をコードする）を含む第１のヘルパープラスミドと、Ｅ１ａ遺伝子、Ｅ１ｂ遺伝子、Ｅ４遺伝子、Ｅ２ａ遺伝子、およびＶＡ遺伝子を含む第２のヘルパープラスミドとを含む。いくつかの実施形態において、当該ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２由来のｒｅｐ遺伝子であり、ならびに当該ｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ４４．９に由来し、本明細書において説明される修飾されたカプシドタンパク質を産生するために、当該遺伝子に対する修飾を含み得る。ヘルパープラスミドおよびそのようなプラスミドを作製する方法は、当技術分野において既知であり、ならびに商業的に入手可能である（例えば、ＰｌａｓｍｉｄＦａｃｔｏｒｙ（ビーレフェルト、ドイツ）製のｐＤＭ、ｐＤＧ、ｐＤＰ１ｒｓ、ｐＤＰ２ｒｓ、ｐＤＰ３ｒｓ、ｐＤＰ４ｒｓ、ｐＤＰ５ｒｓ、ｐＤＰ６ｒｓ、ｐＤＧ（Ｒ４８４Ｅ／Ｒ５８５Ｅ）、およびｐＤＰ８．ａｐｅプラスミド；他の製品およびサービスは、Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｉｏｌａｂｓ（フィラデルフィア、ペンシルベニア州）；Ｃｅｌｌｂｉｏｌａｂｓ（サンディエゴ、カリフォルニア）；Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（サンタクララ、カリフォルニア州）；およびＡｄｄｇｅｎｅ（ケンブリッジ、マサチューセッツ州）から入手可能であり；ｐｘｘ６；Grimm et al. (1998),Novel Tools for Production and Purification of Recombinant Adenoassociated Virus Vectors, Human Gene Therapy, Vol. 9, 2745-2760;Kern, A. et al. (2003),Identification of a Heparin-Binding Motif on Adeno-Associated Virus Type 2 Capsids, Journal of Virology, Vol. 77, 11072-11081.;Grimm et al. (2003),Helper Virus-Free, Optically Controllable, and Two-Plasmid-Based Production of Adeno-associated Virus Vectors of Serotypes 1 to 6, Molecular Therapy,Vol.7, 839-850;Kronenberg et al. (2005), A Conformational Change in the Adeno-Associated Virus Type 2 Capsid Leads to the Exposure of Hidden VP1 N Termini, Journal of Virology, Vol. 79, 5296-5303；およびMoullier, P. and Snyder, R.O. (2008), International efforts for recombinant adeno-associated viral vector reference standards, Molecular Therapy, Vol. 16, 1185-1188を参照されたい）。
例示的な非限定的ｒＡＡＶ粒子製造方法は、次に説明される。それらの天然プロモーターの転写調節下の所望のＡＡＶ血清型およびアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子に対するｒｅｐおよびｃａｐＯＲＦを含む１つまたは複数のヘルパープラスミドが、製造されるかまたは得られる。ｃａｐＯＲＦは、本明細書において説明される修飾されたカプシドタンパク質を作製するための１つまたは複数の修飾も含み得る。ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）から入手可能）は、ＣａＰＯ４媒介性トランスフェクション、脂質またはポリマー分子、例えば、ヘルパープラスミドと本明細書において説明される核酸ベクターを含むプラスミドとを伴うポリエチルエンイミン（ＰＥＩ）など、によってトランスフェクトされる。次いで、ＨＥＫ２９３細胞は、ｒＡＡＶ粒子製造を可能にするために少なくとも６０時間インキュベートされる。あるいは、別の実施例において、Ｓｆ９ベースのプロデューサー安定細胞系は、異種核酸配列を含む単一の組換えバキュロウイルスで感染される。さらなる代替策として、別の実施例において、ＨＥＫ２９３またはＢＨＫ細胞系は、異種核酸配列ならびに必要に応じて、本明細書において説明されるｒｅｐおよびｃａｐＯＲＦを含む１つまたは複数のＨＳＶならびにそれらの天然プロモーターの転写調節下のアデノウイルスＶＡ、Ｅ２Ａ（ＤＢＰ）、およびＥ４遺伝子を含むＨＳＶで感染される。次いで、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、またはＳｆ９細胞は、ｒＡＡＶ粒子製造を可能にするために、少なくとも６０時間インキュベートされ得る。ｒＡＡＶ粒子は、次いで、当技術分野において既知のまたは本明細書で説明される任意の方法を使用して、例えば、イオジキサノールステップ勾配、ＣｓＣｌ勾配、クロマトグラフィ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、および／または親和性捕獲によって、精製することができる。
様々な実施形態において、イオジキサノールステップ勾配精製方法が使用される。ベクターは、哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞）にパッケージされ得、ならびに、イオジキサノールステップ勾配遠心分離によって精製され、その後、緩衝液交換およびＢＳＳ／Ｔｗｅｅｎ緩衝液への濃縮が行われ得る。親和性捕獲ステップも加えてもよい。
本発明の好ましい態様を例示するため、以下の実施例を含める。以下の実施例において開示される技術は、本発明の実施において良好に機能することが本発明者らによって見出された技術を表し、したがって、その実施のための好ましいモードを構成するとみなすことができることは、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を鑑みて、開示される特定の実施形態に多くの変更をなすことができ、そのような変更は、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、依然として同様または類似する結果をもたらすということを理解すべきである。
［実施例１］
マカクザルにおけるレポーター遺伝子をコードするＡＡＶベクターの網膜下投与後の、高められた水平展開および中心窩形質導入
ベンチマークベクターと比較した網膜下注入されたマウスおよびマカクザルにおけるＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドバリアントを組み入れたベクターおよび粒子の性能の評価、密接に関連するＡＡＶｒｈ．８、および未修飾のＡＡＶ４４．９を追及した。ヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターは、非ヒト霊長類桿体および錐体において排他的な活性を有することが特定された。そのため、ｈＧＲＫ１プロモーターを、改良されたＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ベクターにおいてマカクザルの眼における緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターの発現を駆動するその能力について評価した。初期ブレブ境界からの水平展開の程度も評価した。
傍中心窩領域は、中央固視点からおよそ４度の偏心において中心窩に外接する眼のゾーンである。傍中心窩は、桿体の最も高い密度を有するが、同時に、依然として多くの錐体も含有する。それは、錐体優位な網膜と桿体優位な網膜との間の移行ゾーンであり、ならびに、変性が外網膜から内網膜へと進行する疾患との関連において重要である。周中心窩領域は、傍中心窩に外接するゾーンであり、ならびに、斑紋の最も外側の帯を表す。傍中心窩と同様に、周中心窩は、ＲＰのような疾患の進行において重要な役割を有し、網膜の変性（ｄｅｇｅｒａｔｉｏｎ）が周囲において始まり、中央網膜へと進行する。周中心窩は、ＲＰにおける変性を受ける斑紋の最初のゾーンである。
２つのｒＡＡＶベクターであるＡＡＶ４４．９－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰおよびＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰを、マカクザルの眼に網膜下投与した。ベクターを、１×１０１２ｖｇ／ｍＬの濃度においてデリバリーさせた。対照ベクターであるＡＡＶ５－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰも、眼に投与した。
修飾および未修飾のＡＡＶ４４．９ベクターの両方を組み入れた粒子は、網膜下に注入されたマカクザル対象において、高められた水平展開および力価を示した（図１を参照されたい）。ブレブの初期境界および結果として生じるＧＦＰ発現の境界は、図１に白い点線で表される。同じ脈管構造が、参考のために太く暗い線で強調表示されている。ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）によって媒介されるＧＦＰ発現は、注入の１週間後に視認された。ＡＡＶ４４．９およびＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）の両方は、１×１０１２ｖｇ／ｍＬ用量において、霊長類の網膜において良好な忍容性を示した。残された対照ベクターＡＡＶ５媒介性ＧＦＰ制限は、元の注入ブレブ内に限定された。
ＡＡＶ４４．９－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰ（１ｘ１０１２ｖｇ／ｍＬの濃度）の中心窩外網膜下注入を、マカクザル対象において実施した。光干渉断層撮影（ＯＣＴ）スキャンにより、中央窩は注入の際に剥離しないことが明らかとなった（図２）。この中心窩外網膜下注入は、中央窩は剥離しなかったが、中心窩錐体の９８％と中央桿体の１００％を形質導入した（図３の右上を参照されたい）。ブレブ境界は初期境界に比べて広がったため、カプシドは、高められた水平展開を示した。
ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰを注入したマカクザルの眼から画像もキャプチャーした。１つの眼における定量分析により、中心窩錐体形質導入の約５０％がＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）によって媒介されたことが明らかとなった。
合計で９０μＬ（各３０μＬ）のＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰの３つの網膜下注入を、マカクザルの眼の中心窩の外側の上側網膜、側頭側網膜、および下側網膜において実施した。網膜片を、錐体アレスチンに対する抗体で染色し、ならびに、３人の盲検観察者が、中心窩ピット（ｆｏｖｅａｌ ｐｉｔ）を横断する単一平面における５つの網膜領域において、ＧＦＰ陽性錐体および桿体の数をカウントした。この投与の結果は、図４に示される。ＯＣＴスキャンにより、中心窩は注入の際に剥離しなかったことが明らかとなった（図４の右パネルを参照されたい）。
これらの結果は、マカクザルにおけるＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ＧＦＰの中心窩外網膜下注入が、中心窩剥離の不在下における中央錐体細胞および桿体細胞の顕著な形質導入を示すことを示している。周辺の桿体および錐体も、非常に効率的に形質導入された。したがって、中心窩外網膜下注入は、結果として、中心窩領域にわたる高効率の形質導入を生じた。
図５Ａ～５Ｄに示されるように、この注入後の傍中心窩の検査により、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）粒子が、鼻側および耳側の両方から中心窩ピットに位置された傍中心窩錐体を形質導入することが明らかとなった。しかしながら、とりわけ、傍中心窩錐体の形質導入は、未修飾のＡＡＶ４４．９では達成されなかった。この研究結果は、少なくとも、ｉ）傍中心窩錐体は、様々なＡＡＶカプシドバリアントによる形質導入に対して抵抗性である、ならびにｉｉ）加齢および遺伝的網膜疾患による構造および機能の最も早い喪失は、多くの場合、傍中心窩領域において生じる、ということから、興味深かった。この領域での錐体を形質導入するそれらの能力における違いにもかかわらず、修飾および未修飾ＡＡＶ４４．９ベクターは、傍中心窩桿体を実質的に等しい程度まで効率的に形質導入した。
図６Ａおよび６Ｂに示されるように、周中心窩の検査により、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドを組み入れた粒子は周中心窩錐体を形質導入するが、未修飾のＡＡＶ４４．９はしない、という同様のパターンが明らかとなった。周中心窩桿体は、この領域において両方のカプシドによって効率的に形質導入された。周中心窩は傍中心窩に外接する。
これらの結果は、改良されたＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドバリアントベクターによって提供される形質導入の高められた水平展開は、ヒト対象において中心窩剥離を引き起こす有害作用を回避しつつ、傍中心窩領域の網膜下注入が中心窩細胞の形質導入を生じることを可能にし得る。それらは、さらに、高められた水平展開および形質導入が、９０μＬ（それぞれ３０μＬの３つの注入ブレブ）の低いＡＡＶ粒子の総注入量によって達成され得ることを実証している。
材料および方法
ベクター作製
ｍＣｈｅｒｒｙ（ｓｃ－ｓｍＣＢＡ－ｍＣｈｅｒｒｙ）を駆動するトランケートされたキメラＣＭＶ－チキンベータアクチン（ｓｍＣＢＡ）プロモーターを含む自己相補性ＡＡＶ構築物を、二重スタック細胞ファクトリー（１，２７２ｃｍ２の細胞増殖エリア）に播種した付着性ＨＥＫ２９３Ｔにおいて三重トランスフェクション－プラスミドベースのシステムを使用して、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ４４．９（Ｙ７３１Ｆ）、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ５、およびＡＡＶ８（Ｙ７３３Ｆ）にパッケージした。細胞を収穫し、逐次凍結解凍サイクルによって溶解させた。溶解物内のウイルスを、イオジキサノール密度勾配によって精製し、Ｔｗｅｅｎ２０（０．０１４％）を補ったＡｌｃｏｎ ＢＳＳへと緩衝液交換した。ウイルスを、基準に対してｑＰＣＲによって力価測定し、－８０℃で貯蔵した。ＡＡＶ４４．９カプシドへのＹ７３１ＦおよびＥ５３１Ｄ置換の追加を、ＡＡＶ２ｒｅｐ－４４．９ｃａｐプラスミドの部位特異的変異誘発によって達成し、ならびに、サンガー配列決定法によって確認した。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を駆動する錐体特異的ＩＲＢＰｅ－ＧＮＡＴ２キメラプロモーターを含む追加の構築物を、ＡＡＶ４４．９およびＡＡＶ４４．９バリアントベクターにパッケージした。
インビトロ（ｉｎ－ｖｉｔｒｏ）形質導入アッセイ
ＡＲＰＥ－１９（ヒト網膜色素上皮細胞系）および６６１Ｗ（マウス錐体細胞系）細胞を、１．０×１０４細胞／ウェルの濃度において９６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞を、１０，０００ｐ／細胞において感染させた。感染の３日後、固定露光の蛍光顕微鏡法を実施し、細胞を剥がし、フローサイトメトリーを使用して、蛍光によってレポータータンパク質発現（ｍＣｈｅｒｒｙ）を定量化した。平均ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光回数に陽性細胞の数を掛け算することによって、ｍＣｈｅｒｒｙ発現を算出した。グラフは、細胞のみのレベルを引き算した発現レベルを表している。
注入
１μＬのベクター含有溶液中における２×１０９ｖｇを、硝子体内または網膜下のいずれかによってマカクザルの網膜にデリバリーした。首尾よく達成された注入を受けた最低６つの眼を、各実験において分析した。
眼底検査
感染後４週間目に、Ｍｉｃｒｏｎ ＩＩＩカメラ（Ｐｈｏｅｎｉｘ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、プレザントン、カリフォルニア州）を使用して、眼底検査を実施した。網膜の健康およびｍＣｈｅｒｒｙ発現を可視化するために、それぞれ、明視野および赤色蛍光画像を撮影した。露光設定は、実験の間で一定であり、ならびに、図の凡例に示される。
フローサイトメトリーによる網膜の形質導入の測定
１群あたり４つから６つの間のＮｒｌ－ＧＦＰ眼からの神経網膜（ＲＰＥを手作業によって網膜から剥ぎ取った）を採取し、パパインで分離させた。ＧＦＰに対して（桿体光受容体）、ｍＣｈｅｒｒｙに対して（ｒＡＡＶによって形質導入された非桿体網膜ニューロン）、または両方に対して（ｒＡＡＶによって形質導入された桿体光受容体）陽性である細胞の割合を定量化するために、処置された分離網膜および未処置の対照に対してフローサイトメトリーを実施した。各ベクターによって形質導入された桿体および非桿体神経網膜細胞の割合を、別々に平均した。
組織標本および免疫染色
注入の４週間後に、眼を除核し、新たに調製した、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中における４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）において、４℃で一晩固定させた。角膜およびレンズを除去し、当該眼用コップを、３０％スクロース溶液において４℃で一晩インキュベートした。眼をクライオスタット化合物に埋め込み、－８０℃で凍結させた。クライオスタット（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍ、バッファローグローブ、イリノイ州）を使用して、切片（１２μｍ厚）を切断し、スライドガラスに移した。網膜低温切片を１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ですすぎ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でそれぞれ１時間ブロックし、次いで、マウスモノクローナル抗錐体アレスチン抗体（１：１０００、Ｄｒ Ｃｌａｙ Ｓｍｉｔｈにより好意によって提供された）を用いて４℃で一晩インキュベートした。翌日、スライドガラスを１×ＰＢＳですすぎ、次いで、１×ＰＢＳ中におけるアレクシアフルオルロバ－抗マウス二次抗体（１：５００）を用いて、室温で１時間インキュベートし、ＤＡＰＩで対比染色した。共焦点レーザースキャニング顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ８）および蛍光顕微鏡（ＥＶＯＳ）を使用して、画像を取得した。
［実施例２］
網膜分離症のマウスの自然歴研究
マウスがＸＬＲＳの特徴的表現型を示すことを確認するために、ＲＳ１ノックアウト（ＫＯ）マウスの５か月の自然歴研究を行った。マウスの異常網膜機能を、ＥＲＧによって観察し、網膜構造におけるスキーシス形成を、ＯＣＴによって測定した。５か月にわたって各月の終わりに測定を行った。図９Ａ～９Ｅおよび１０～１３を参照されたい。個々の網膜による全腔スコアを作製するために、スコアを平均した。マウスを以下の群にグループ分けした：
・雄Ｒｓ１半接合（Ｒｓ１－／ｙ）ＫＯ（疾患）
・雌Ｒｓ１ホモ接合ＫＯ（疾患）
・雄Ｒｓ１＋／ｙ野性型（正常）
・雌Ｒｓ１＋／－ヘテロ接合（正常）。
マウスの１つの群を１か月後に犠牲にして、免疫組織学によって、レチノスキシン（ＲＳ１）の発現についてそれらの網膜を評価した。結果は、図１８Ａ～１８Ｃおよび２０に示される。
ＯＣＴ結果を解釈するために、スキーシス腔の重症度に対する採点システム（０～４）であり、０はスキーシス腔が存在しないことを表し、４は、最も多い腔カウントであることを表す。ＯＣＴ測定およびスキーシス腔スコアリングチャートが、研究の５か月のそれぞれに対して図１７Ａおよび１８Ａ～１８Ｃに示される。採点システムは以下のように定義される：
０：スキーシス腔なし；１：孤立したスキーシス腔；２：複数の小さなスキーシス腔；３：一部がつながった複数の中程度のスキーシス腔；４：一部がつながった大きな複数のスキーシス腔。
自然歴研究は、ＲＳ１ ＫＯマウスの腔スコアが２か月から３か月でピークを迎え、次いで、時間と共に向上することを示した。ＩＨＣ測定は、ＲＳ１発現は、ヘテロ接合雌マウスおよび野生型雄マウスの光受容体の内側／外側セグメント接合部に局在化し、雄および雌Ｒｓ１ ＫＯマウスには存在しないことを示した。
［実施例３］
網膜分離症マウスに対する合成ｈＲＳ１の網膜下デリバリーにおけるＡＡＶカプシドの治療効率の評価
ｒＡＡＶ粒子の複数回投与による、ＡＡＶ５カプシドと比較した、網膜およびＲＰＥにおけるＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）などの様々なＡＡＶカプシドの生体分布を、５か月の研究に対して評価した。評価するカプシドの１つを含むｒＡＡＶ粒子を、Ｒｓ１ノックアウトマウスに投与した。
１μｌの５×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの用量において、４つの群のそれぞれにおける４匹のマウスに粒子を投与した。したがって、合計で５×１０９のベクターゲノムを各動物にデリバリーした。ＯＤ眼への網膜下注入によって粒子を投与し、反対側の眼は治療しなかった。
合成ヒトＲＳ１導入遺伝子を発現するｒＡＡＶベクターの網膜下注入が、Ｒｓ１ノックアウト（Ｒｓ１－ＫＯ）マウスに治療効果を提供することができるか否かを評価した。ＲＳ１のコード領域のみを含むように、この合成導入遺伝子をトランケートして、５’および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を欠かせた。この導入遺伝子のヌクレオチド配列は、配列番号８として上記において提供される。いくつかの実験において、導入遺伝子にｍｙｃタグ付けした（配列番号１０のヌクレオチド配列を参照されたい）。
他の実験において、当該合成導入遺伝子は、コード配列から除去された４つのＣｐＧアイランドも有し、ならびに、ヒト発現のためにコドン最適化した（配列番号１０のヌクレオチド配列を参照されたい）。
ＰＲにおける最も強い生体分布を誘導するために、いくつかの異なるカプシドを評価した。ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１およびｒＡＡＶ５－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ベクターを、網膜機能および構造を修復したＲｓ１ ＫＯマウスに投与した。これらのカプシドの両方は、ｈＲＳ１導入遺伝子を作動可能に制御するｈＧＲＫ１プロモーターを有する。結果を、ベンチマークベクターｒＡＡＶ５－ＣＢＡ－ｈＲＳ１で治療したＲｓ１ ＫＯマウス、および反対側（ＯＳ）の未治療の眼（全てのグループの）と比較した。
ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１を保持するＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドを含むウイルス粒子は、光受容体細胞を首尾よく形質導入し、ならびに、これらの細胞においてヒト網膜分離の治療レベルを提供した。驚くべきことに、網膜分離腔は、ｒＡＡＶ注入後１か月の早期に、全ての治療した眼において完全に解決された。同様に、網膜機能は、ｒＡＡＶ注入後１か月の早期に、全ての治療した眼において実質的に改善した。表１（下記）は、グループ１～４のマウスの６か月のＥＲＧおよびＯＣＴデータと、グループ６および７のマウスの４か月のＥＲＧおよびＯＣＴデータを示している。「ｖｇ」＝ベクターゲノム；「－Ｎ＊」は、死んだ動物またはＩＨＣのために犠牲にした動物の数（Ｎ）を意味する。
治療した眼のＰＲにおけるヒトＲＳ１の治療レベルの発現の媒介に対して最も強いと評価したプロモーターとして、ヒトロドプシンキナーゼプロモーター（ｈＧＲＫ１）を確認した。
加えて、網膜構造および機能に対する、ｈＲＳ１ｓｙｎ遺伝子を駆動するｈＧＲＫ１または遍在するＣＢＡプロモーターを含む網膜下デリバリーされたＡＡＶ５またはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）の影響を評価する１か月の概念検証（ＰＯＣ）研究を、ＲＳ１－ＫＯ欠損マウス（半接合Ｒｓ１－／ｙ雄）において実施した。ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ｒＡＡＶ５－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、またはＡＡＶ５－ＣＢＡ－ｈＲＳ１ｓｙｎの１回用量（２．３×１０１２ｖｇ／ｍＬ；２．３×１０９ｖｇ／眼）を、生後２５日目に投与した（Ｐ２５）。Ｐ２５の時点を選択したのは、それが、身体的に成熟し切っていない大人（ローティーン）に対応しており、ＸＬＲＳ患者が治療を追及することが予想される時点であるためである。反対側の眼は、注入しないままであった。注入後１か月において、網膜の構造および機能を、光コヒーレンストモグラフィー（ＯＣＴ）および網膜電位図（ＥＲＧ）によって評価した。その直後にマウスを安楽死させ、全てのグループのマウスから両方の眼を収集し、固定し、冷凍保護し、免疫組織学により評価した。図１６は、ＯＣＴ分析による、注入後１か月でのｒＡＡＶ治療ＲＳ１－ＫＯマウスにおける網膜構造の修復（３つ全てのベクターで治療したＲＳ１－ＫＯマウスにおけるスキーシス腔の完全な分解）を示している。さらに、桿体および錐体媒介性網膜機能は、非注入対照と比較して、全てのベクターで治療したＲＳ１－ＫＯマウスの眼において改善した。免疫組織学的分析により、治療した網膜の断面の光受容体内部セグメントにおけるＲＳ１発現の存在が明らかとなった。ＲＳ１発現は、反対側の未治療の眼には存在しなかった。これらの結果は、両方のカプシドｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ、ｒＡＡＶ５－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎは、有効であり、ならびに、光受容体特異的ｈＧＲＫ１プロモーターおよび偏在するＣＢＡプロモーターを含むベクターによる治療後、結果は同様であった。意図される標的（光受容体）への制限された発現に対してｈＧＲＫ１を使用して、さらなる研究を実施し、結果として、オフターゲット発現を回避することによってさらなる安全機能を提供した。１か月での関連するＥＲＧ測定を図１７Ｂに示す。左眼および右眼のＯＣＴデータの比較を図１９に示す。
ＰＯＣ研究に続いて、ＲＳ１－ＫＯマウスにおいてｈＲＳ１ｓｙｎ遺伝子（それぞれｒＡＡＶ５－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎまたはｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ）を駆動するｈＧＲＫ１プロモーターを含むＡＡＶ５またはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドの単一の網膜下投与の後の、網膜の構造および機能の用量応答性改善を評価するために、６か月の薬理学的研究を行った。Ｐ２４からＰ２６の間のマウスに対して、ビヒクル、低（１．４×１０１１ｖｇ／ｍｌ；１．４×１０８ｖｇ／眼）、中（４．７×１０１１ｖｇ／ｍｌ；４．７×１０８ｖｇ／ｍｌ）、または高（１．４×１０１２ｖｇ／ｍｌ；１．４×１０９ｖｇ／眼）用量でのＡＡＶ５またはＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）のいずれかを一方の眼に網膜下注入した。反対側の眼は、非注入のままにした。６か月にわたって毎月、網膜の構造および機能を、それぞれＯＣＴおよびＥＲＧによって評価した。注入後６か月で安楽死させた後、網膜を凍結させて切片を切り出し、免疫組織学的にＲＳ１発現を評価した。
ＯＣＴ分析により、注入後１か月で開始した全ての用量において両方のベクターで治療したＲＳ１－ＫＯマウスにおけるスキーシス腔の安定した分解が明らかとなった。低い用量グループより２つのより高い用量の群において、より低い網膜分離症が観察される、明らかな用量応答性が観察された。低用量を含む全ての用量での両方のベクターによる治療後に、両方の桿体および錐体媒介性ＥＲＧ機能における著しい改善も観察された。暗順応ｂ波振幅の場合、ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－治療動物とビヒクル治療動物との間において有意差が観察される時点の数は、低用量での３つの時点（２、５、６か月）、中用量での４つの時点（２、３、５、６か月）から、高用量で治療した動物における６つ全ての時点へ増加した。同様の観察が、明順応ｂ波振幅に対してなされた。これらのデータは、ＲＳ１－ＫＯマウスにおいて網膜機能を正常化する際での、ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎの用量応答性を示唆している。同様の観察が、ｒＡＡＶ５－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎを注入した動物においても見られた。免疫組織学的分析により、ＲＳ１－ＫＯマウスの治療された眼からの網膜の断面での光受容体内部セグメントにおけるＲＳ１発現の存在が明らかとなった。反対側の非治療の眼とビヒクルのみで治療した眼からは、ＲＳ１発現は存在しなかった。
１～６の月のそれぞれにおけるＥＲＧ測定結果を、それぞれ、図２０～２５に示す。グループ６および７のＥＲＧ測定によって特定される場合の、注入ウイルス対ビヒクルのｂ波の統計分析を、図２６～３０に示す。注入後４か月の時点でのＩＨＣ測定を図３１に示す。
結論として、これらの研究結果は、１）ｒＡＡＶ５およびｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ベクターの網膜下注入は、ＲＳ１－ＫＯマウスにおける用量の範囲にわたって同等な力価を有する、２）両方のｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎおよびｒＡＡＶ５－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎの間において用量応答性関係が観察され、ならびに、ＲＳ１－ＫＯマウスにおける構造的欠損および機能障害の修正が観察された。およそ１．４×１０１１ｖｇ／ｍｌ（１．４×１０８ｖｇ／眼）の最小有効用量（ＭＥＤ）が特定された。さらに、３）光受容体特異的ｈＧＲＫ１プロモーターは、治療されたマウスにおける治療レベルでのＲＳ１発現を駆動する。
追加の研究により、誘導された網膜分離症の有無の非ヒト霊長類において、最適カプシドを有するｒＡＡＶ粒子の形質導入および生体分布に及ぶ用量を評価した。追加の研究は、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を有するクローニングＡＡＶ－ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ベクターの投与を伴い、この場合、ＷＰＲＥは、投与のために安全である（「ＷＰＲＥｓｆ」）。この構築物は、ＲＳ１のより高い発現をもたらし、それは、ベクター用量の減少がこれらの眼の遺伝子療法の安全プロファイルをさらに向上させるのを可能にする。
表1. マウスにおけるERG/OCTデータ
Figure 2023535956000006

［実施例４］
スタッファー配列を伴うｈＲＳ１含有ｒＡＡＶベクターの評価
効果的なパッケージングに役立つゲノムサイズを有する、最適化されたｈＲＳ１含有ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ベクターを評価するために、この研究を行った。目標は、少なくともｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００１と同程度に有効な構築物を特定することであった。
ｐＴＲ－Ｘ００１の小さいパッケージングサイズ（１７２３ｂｐ）および異種ゲノムのパッケージングの可能性に起因して、ＡＡＶの天然の運搬能力（約４．７ＫｂのＩＴＲからＩＴＲへのカセット）に迫るカセットサイズを有するいくつかの新しい構築物を設計した。これは、ベクターカセットの５’から（Ｘ００１－５ｐ）または３’から（Ｘ００１－３ｐ）ｈＧＲＫ１－ｈＲＳ１ｓｙｎ－ｂＧＨポリＡ（それぞれ、ｐＴＲ－Ｘ００１－５ｐおよびｐＴＲ－Ｘ００１－３ｐ）内に挿入された不活性スタッファー配列を加えることによって、達成した。当該スタッファーＤＮＡは、新たに合成した（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ニュージャージー州）。さらに、ｈＲＳ１ｓｙｎとｂＧＨポリＡ（ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐ）との間に位置されたウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を組み入れたバージョンを作製した。使用するＷＰＲＥの変異体バージョンは、他の眼の遺伝子治療臨床試験において使用されるＡＡＶベクターに以前に組み入れられている。全ての構築物は、同じｈＧＲＫ１プロモーター、ＳＶ４０ＳＤ／ＳＡ、およびｂＧＨポリＡシグナル配列を含んだ。これらの発現カセットならびに４５３４～４５４９ヌクレオチドのサイズの範囲のベクターゲノムをパッケージすることによって、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）ベクターを作製した。評価される複数の構築物を、図１５Ｄ～１５Ｆに示す。
ＲＳ１－ＫＯマウスにおいて網膜の構造／機能の修復を試験するために、２つのベクター用量を使用する３か月非臨床試験を実施した。以前に説明したＲＳ１－ＫＯマウス研究において網膜の構造／機能をレスキューした、「詰められていない」ベクターｐＴＲ－Ｘ００１（ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００１）を、コンパレータ対照として含ませた。
カセット選択研究設計の要約を表２に示す。ＲＳ１－ＫＯマウスに、ビヒクル（グループ１）、ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００１（グループ２および３）、ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００１－３ｐ（グループ４および５）、ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００１－５ｐ（グループ６および７）、またはｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００２－３ｐ（グループ８および９）ベクターのいずれかを片方の眼に網膜下注入した。ベクターを、１．０×１０１１ｖｇ／ｍＬ；１．０×１０８ｖｇ／眼（グループ２、４、６、８）または５．０×１０１１ｖｇ／ｍＬ；５．０×１０８ｖｇ／眼（グループ３、５、７、９）のいずれかにおいてデリバリーした。反対側の眼は、非注入のままであった。網膜の構造および機能を、注入のおよそ１か月または２か月後に、それぞれＯＣＴおよびＥＲＧによって評価した。動物を、注入のおよそ３か月後に安楽死させた。安楽死後、網膜を凍結させて切片を切り出し、ならびに、免疫組織化学によってＲＳ１発現を評価した。
表2. 研究設計
Figure 2023535956000007
ＯＣＴ分析により、ベクター治療した眼におけるスキーシス腔の分解が明らかとなった。低用量のｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００１－５ｐで治療し、ならびに注入の１か月後に評価した眼を除いて、両方の時点においてビヒクルを用いた眼とベクターで治療した眼との間には網膜分離症スコアにおける統計的に（ｓｔａｔｉｃａｌｌｙ）有意な差が存在した。１×１０１１ｖｇ／ｍＬ（１．０×１０８ｖｇ／眼）の濃度において、ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００２－３ｐは、ビヒクルのみが注入された眼と比較して、桿体および錐体媒介性の機能において著しい改善をもたらした（図３３Ａ）。５×１０１１ｖｇ／ｍＬ（５．０×１０８ｖｇ／眼）のより高い濃度において、３つ全てのスタッファー構築物は、ビヒクルを注入した対照と比較して、網膜の機能における著しい改善を与えた（図３３Ｂ）。ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）を運搬する詰められた構築物対詰められていない構築物を注入した眼の間において、ＥＲＧ振幅における有意な差は、このより高い用量では観察されなかった。
免疫組織学的分析により、ｒＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）－Ｘ００２－３ｐで治療したＲＳ１－ＫＯマウスの眼からの網膜の光受容体内部セグメントにおけるＲＳ１発現の存在が明らかとなった。反対側の未治療の眼およびビヒクルのみで治療した眼では、ＲＳ１発現は存在しなかった（図３４Ａおよび３４Ｂ）。
［実施例５］
ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲによるＸＬＲＳの治療
ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲを含む本願のベクターを用いたＲＳ１－ＫＯマウスにおける複数の薬理学的研究を実施した。これらの研究は、ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドによって媒介される光受容体形質導入および光受容体特異的ｈＧＲＫ１プロモーターによって駆動されるＲＳ１発現が、用量依存様式において、ＲＳ１－ＫＯマウスに対して網膜の構造および機能を安定に回復することを確立した。
ｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲは、桿体および錐体光受容体における特定の発現のためのヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターの転写調節下のＲＳ１ ｃＤＮＡを含む。ｈＧＲＫ１プロモーターを、ＳＶ４０スプライスドナー／スプライスアクセプターにカップリングさせ、それらは、ＳＶ４０イントロンの除去後の細胞質へのｍＲＮＡ輸送を促進する。翻訳は、ｈＲＳ１ｓｙｎ開始コドンの直前に先行するコンセンサスＫｏｚａｋ配列の組み入れによって高められる。合成ヒトＲＳ１遺伝子は、ＮＣＢＩ参照配列と比べて４つのサイレント変化を含み、コード領域のみに制限される。当該ベクターは、ＲＳ１タンパク質の発現を高めるために、ウッドチャック肝炎ウイルス翻訳後調節エレメント（ＷＰＲＥ）のｍｕｔ６バージョンも含有する。このＷＰＲＥは、推定上のＸタンパク質ＯＲＦの発現を取り除くように設計された変異を含む。当該発現カセットは、ウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨポリＡ）も含む。異種パッケージングの可能性を有する、プロモーター－治療ベクターの小さなパッケージングサイズ（１７２３ｂｐ）により、４５４９ｂｐのカセットサイズ（ＩＴＲからＩＴＲ）を達成するために、不活性ベクターカセットスタッファー配列を挿入した。このカセットをｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲ内にパックし、ならびに当該カセットは、ＲＳ１－ＫＯマウスモデルにおいて、詰められていないカセットと比較して、改良された有効性を示した。ベクターゲノムの概略図が図１５Ｆに示されており、ならびに、ＩＴＲからＩＴＲまでの配列は、配列番号３３として提供される。配列エレメントの説明を表３に示す。
Figure 2023535956000008
Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）を患う患者の視力低下を回復または軽減するために、ヒト網膜剥離（ＲＳ１）遺伝子を眼の光受容体に導入するためにＡＡＶカプシドバリアントＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）と共にｐＴＲ－Ｘ００２－３ｐＳＲを投与した。ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）は、ベンチマークカプシッドより強力であり、ならびに、他のＡＡＶとは異なり、網膜下に注入されたカニクイザルにおいて傍中心窩錐体を効果的に形質導入し、ならびに、剥離の必要なしに、斑紋／中心窩の形質導入を可能にする。加えて、アデノウイルス５型由来のＥ２ａ、Ｅ４、およびＶＡ ＲＮＡヘルパー遺伝子を細胞の野生型ウイルスの共感染を必要としないサポートベクター製造に提供するため、ヘルパープラスミドが利用され得る。例示的ヘルパープラスミドは、例えば、Ａｌｄｅｖｒｏｎ（ファーゴ、ノースダコタ州）などから、商業的に供給され得る。
追加の実施形態
本明細書において説明される実施例および実施形態は、説明のみを目的としたものであり、それらの観点から様々な修正あるいは変更が当業者に示唆され、それらが本願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれるべきであることは、理解されるべきである。刊行物、特許出願、および特許を含め、本明細書で引用される全ての参考文献は、あたかも各参考文献が個々にかつ明確に参照によって本明細書に組み入れられることが示され、その内容全体が本明細書に記載された場合と同程度に、参照によって本明細書に組み入れられる。本明細書における値の範囲の列挙は、そうでないことを本明細書に明記しない限り、範囲内に該当する個別の各値を個々に言及する簡便な方法として役立つように意図されるだけであり、個別の各値は、あたかもそれが個別に明記されているかのように本明細書に組み込まれる。要素を参照しながら、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語を使用した本発明の任意の態様または実施形態の本明細書の説明は、明記されるかまたは文脈よって明確に否定されない限り、特定の要素を「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ）」、「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」、または「実質的に含む（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」本発明の同様の態様または実施形態に対する支援を提供することをいとするものである（例えば、特定の要素を含むとして本明細書において説明される組成物は、特に明記されるかまたは文脈において明確に否定されない限り、その要素からなる組成物も説明するとして理解されるべきである）。
本明細書において開示および特許請求される組成物および方法の全ては、本開示を鑑みて、過度な実験を行うことなくなされ、実行され得る。好ましい実施形態に関して本発明の組成物および方法について説明したが、当業者には、本発明の概念、趣旨、および範囲を逸することなく、本明細書において説明される組成物および方法ならびに方法の工程または工程の順序に変更を加えることができることが明らかである。より詳細には、化学的および／または生理学的に関連するある特定の薬剤は、本明細書において説明される薬剤に代えても、同じまたは類似した結果が達成されるということが明らかである。当業者に明らかであるそのような同様な代用および修正は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨、範囲、および概念内に入るものとみなされる。
以下の番号付けした実施形態は、例示を意図している。
１．レチノシシンタンパク質をコードする異種核酸およびＳＶ４０イントロンを含むポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
２．前記ＳＶ４０イントロンがスプライスドナー領域および／またはスプライスアクセプター領域を含む、実施形態１に記載のＡＡＶベクター。
３．前記ＳＶ４０イントロンが、配列番号２０の核酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１または２に記載のＡＡＶベクター。
４．前記ＳＶ４０イントロンが配列番号２０の核酸配列を含む、実施形態１または２に記載のＡＡＶベクター。
５．前記レチノシシンタンパク質がヒトレチノシシンタンパク質である、実施形態１から４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
６．前記異種核酸がヒトレチノシシンの５’非翻訳領域を含まない、実施形態１から５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
７．前記５’非翻訳領域が配列番号３９の核酸配列を含む、実施形態６に記載のＡＡＶベクター。
８．前記核酸がヒトレチノシシンの３’非翻訳領域を含まない、実施形態１から７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
９．前記３’非翻訳領域が配列番号４０の核酸配列を含む、実施形態８に記載のＡＡＶベクター。
１０．配列番号８の核酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む異種核酸を含むポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター。
１１．前記異種核酸が配列番号８、９、または１０で説明される核酸配列を含む、実施形態１から１０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１２．前記異種核酸が、光受容体細胞または網膜色素上皮細胞中の前記異種核酸の発現を指令する１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている、実施形態１から１１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１３．前記レチノシシンタンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態１から１２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１４．前記レチノシシンタンパク質が配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施形態１から１３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１５．前記ポリヌクレオチドがプロモーターを含む、実施形態１から１４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１６．前記プロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＩＲＢＰプロモーター、キメラヒトレチノシシン－ＩＲＢＰエンハンサー（ＲＳ／ＩＲＰＢ）、赤／緑コーンオプシンプロモーター、コーンアレスチンプロモーター、キメラＩＲＢＰエンハンサー－コーントランスデューシンプロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーター、および切断されたキメラニワトリベータアクチン（ｓｍＣＢＡ）プロモーターから選択される、実施形態１５に記載のｒＡＡＶベクター。
１７．前記プロモーターがロドプシンキナーゼプロモーターである、実施形態１５または１６に記載のｒＡＡＶベクター。
１８．前記プロモーターがヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターである、実施形態１５から１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１９．前記プロモーターが配列番号７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１５から１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２０．前記プロモーターが配列番号７の核酸配列を含む、実施形態１５から１８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２１．前記ポリヌクレオチドがＷＰＲＥエレメントを含む、実施形態１から２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２２．前記ＷＰＲＥエレメントが配列番号１５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含むか、配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、実施形態２１に記載のｒＡＡＶベクター。
２３．前記ＷＰＲＥエレメントが前記異種核酸の３’に位置している、実施形態２１または２２に記載のｒＡＡＶベクター。
２４．自己相補性である、実施形態１から２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２５．前記ポリヌクレオチドが１つまたは複数の逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している、実施形態１から２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
２６．前記１つまたは複数のＩＴＲ配列が第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含む、実施形態２５に記載のｒＡＡＶベクター。
２７．前記第１のＩＴＲ配列が配列番号２２～２３のいずれか1つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態２６に記載のｒＡＡＶベクター。
２８．前記第１のＩＴＲ配列が配列番号２２～２３のいずれか１つの核酸配列を含む、実施形態２６または２７に記載のｒＡＡＶベクター。
２９．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４～２５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態２６から２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３０．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４～２５のいずれか１つの核酸配列を含む、実施形態２６から２９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３１．前記ポリヌクレオチドがポリアデニル化シグナルをさらに含む、実施形態１から３０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３２．前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ヒト増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリアデニル化シグナルから選択される、実施形態３１に記載のｒＡＡＶベクター。
３３．前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ポリアデニル化シグナルを含む、実施形態３２に記載のｒＡＡＶベクター。
３４．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態３１から３３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３５．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９を含む、実施形態３１から３４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３６．配列番号１６、１７、および３１～３５のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、実施形態１から３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３７．配列番号１６、１７、および３１～３５のいずれか１つのヌクレオチド配列のいずれか１つを含む、実施形態１から３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３８．前記ＳＶ４０イントロンが前記異種核酸の５’に位置している、実施形態１から３７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
３９．前記ＳＶ４０イントロンが前記プロモーターの３’に位置している、実施形態１から３８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４０．前記ＳＶ４０イントロンが前記プロモーターと異種核酸との間に位置している、実施形態１から３９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４１．前記ＳＶ４０イントロンが前記異種核酸の３’に位置している、実施形態１から４０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
４２．ロドプシンキナーゼプロモーターに作動可能に連結されたレチノシシンタンパク質をコードする異種核酸を含むポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクター。
４３．前記プロモーターがヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターである、実施形態４２に記載のｒＡＡＶベクター。
４４．前記プロモーターが配列番号７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態４２または実施形態４３に記載のＡＡＶベクター。
４５．前記プロモーターが配列番号７の核酸配列を含む、実施形態４２から４４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
４６．ポリアデニル化シグナルを含む、実施形態４２から４５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
４７．前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ヒト増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリアデニル化シグナルから選択される、実施形態４６に記載のＡＡＶベクター。
４８．前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ポリアデニル化シグナルを含む、実施形態４７に記載のＡＡＶベクター。
４９．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態４６から４８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
５０．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９を含む、実施形態４６から４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
５１．１つまたは複数のＩＴＲを含む、実施形態４２から５０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
５２．前記１つまたは複数のＩＴＲが第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含む、実施形態５１に記載のＡＡＶベクター。
５３．前記第１のＩＴＲ配列が配列番号２２～２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態５２に記載のＡＡＶベクター。
５４．前記第１のＩＴＲ配列が配列番号２２～２３の核酸配列を含む、実施形態５２または５３に記載のＡＡＶベクター。
５５．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４～２５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態５２から５４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
５６．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４から２５の核酸配列を含む、実施形態５２から５５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
５７．ＷＰＲＥエレメントを含む、実施形態４２から５６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
５８．前記ＷＰＲＥエレメントが配列番号１５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態５７に記載のｒＡＡＶベクター。
５９．前記ＷＰＲＥエレメントが配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、実施形態５８に記載のｒＡＡＶベクター。
６０．前記ＷＰＲＥエレメントが前記異種核酸の３’に位置している、実施形態５７から５９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
６１．レチノシシンタンパク質をコードする異種核酸およびポリアデニル化シグナルを含むポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクター。
６２．前記ポリアデニル化シグナルが、ウシ増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ヒト増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリアデニル化シグナルから選択される、実施形態６１に記載のＡＡＶベクター。
６３．前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ポリアデニル化シグナルを含む、実施形態６２に記載のＡＡＶベクター。
６４．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態６１から６３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
６５．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９を含む、実施形態６１から６４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
６６．１つまたは複数のＩＴＲを含む、実施形態６１から６５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
６７．前記１つまたは複数のＩＴＲが第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含む、実施形態６６に記載のＡＡＶベクター。
６８．前記第１のＩＴＲ配列が配列番号２２～２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態６７に記載のＡＡＶベクター。
６９．前記第１のＩＴＲ配列が配列番号２２～２３の核酸配列を含む、実施形態６７または６８に記載のＡＡＶベクター。
７０．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４～２５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態６７から６９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
７１．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４～２５の核酸配列を含む、実施形態６７から７０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
７２．ＷＰＲＥエレメントを含む、実施形態６１から７１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
７３．前記ＷＰＲＥエレメントが配列番号１５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態７２に記載のｒＡＡＶベクター。
７４．前記ＷＰＲＥエレメントが配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、実施形態７３に記載のｒＡＡＶベクター。
７５．前記ＷＰＲＥエレメントが前記異種核酸の３’に位置している、実施形態７２から７４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
７６．前記ポリヌクレオチドがプロモーターを含む、実施形態６１から７５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
７７．前記プロモーターがロドプシンキナーゼプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＩＲＢＰプロモーター、ＲＳ／ＩＲＰＢプロモーター、赤／緑コーンオプシンプロモーター、コーンアレスチンプロモーター、キメラＩＲＢＰエンハンサー－コーントランスデューシンプロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーター、およびｓｍＣＢＡプロモーターから選択される、実施形態７６に記載のｒＡＡＶベクター。
７８．前記プロモーターがロドプシンキナーゼプロモーターである、実施形態７６に記載のＡＡＶベクター。
７９．前記プロモーターがヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターある、実施形態７８に記載のｒＡＡＶベクター。
８０．前記プロモーターが配列番号７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態７６から７９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
８１．前記プロモーターが配列番号７の核酸配列を含む、実施形態７６から８０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
８２．ｉ）レチノシシンタンパク質をコードする異種核酸を含むポリヌクレオチドおよびｉｉ）１つまたは複数のＩＴＲを含む、ＡＡＶベクター。
８３．前記１つまたは複数のＩＴＲが第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含む、実施形態８２に記載のＡＡＶベクター。
８４．前記第１のＩＴＲ配列が配列番号２２～２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態８３に記載のＡＡＶベクター。
８５．前記第１のＩＴＲ配列が配列番号２２～２３の核酸配列を含む、実施形態８３または８４に記載のＡＡＶベクター。
８６．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４～２５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態８３から８５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
８７．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４～２５の核酸配列を含む、実施形態８３から８６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
８８．ポリアデニル化シグナルを含む、実施形態８２から８７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
８９．前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ヒト増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリアデニル化シグナルから選択される、実施形態８８に記載のＡＡＶベクター。
９０．前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ポリアデニル化シグナルを含む、実施形態８９に記載のＡＡＶベクター。
９１．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態８８から９０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
９２．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９を含む、実施形態８８から９１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
９３．ＷＰＲＥエレメントを含む、実施形態８２から９２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９４．前記ＷＰＲＥエレメントが配列番号１５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態９３に記載のｒＡＡＶベクター。
９５．前記ＷＰＲＥエレメントが配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、実施形態９４に記載のｒＡＡＶベクター。
９６．前記ＷＰＲＥエレメントが前記異種核酸の３’に位置している、実施形態９３から９５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９７．前記ポリヌクレオチドがプロモーターを含む、実施形態８２から９６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
９８．前記プロモーターがロドプシンキナーゼプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＩＲＢＰプロモーター、ＲＳ／ＩＲＰＢプロモーター、赤／緑コーンオプシンプロモーター、コーンアレスチンプロモーター、キメラＩＲＢＰエンハンサー－コーントランスデューシンプロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーター、およびｓｍＣＢＡプロモーターから選択される、実施形態９７に記載のｒＡＡＶベクター。
９９．前記プロモーターがロドプシンキナーゼプロモーターである、実施形態９７に記載のＡＡＶベクター。
１００．前記プロモーターがヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターである、実施形態９９に記載のｒＡＡＶベクター。
１０１．前記プロモーターが配列番号７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態９７から１００のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１０２．前記プロモーターが配列番号７の核酸配列を含む、実施形態９７から１０１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１０３．ｉ）レチノシシンタンパク質をコードする異種核酸を含むポリヌクレオチド、およびｉｉ）ＷＰＲＥエレメントを含む、ＡＡＶベクター。
１０４．前記ＷＰＲＥエレメントが配列番号１５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１０３に記載のｒＡＡＶベクター。
１０５．前記ＷＰＲＥエレメントが配列番号１５のヌクレオチド配列を含む、実施形態１０４に記載のｒＡＡＶベクター。
１０６．前記ＷＰＲＥエレメントが前記異種核酸の３’に位置している、実施形態１０３から１０５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１０７．１つまたは複数のＩＴＲを含む、実施形態１０３から１０６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１０８．前記１つまたは複数のＩＴＲが第１のＩＴＲ配列および第２のＩＴＲ配列を含む、実施形態１０７に記載のＡＡＶベクター。
１０９．前記第１のＩＴＲが配列番号２２～２３と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１０８に記載のＡＡＶベクター。
１１０．前記第１のＩＴＲ配列が配列番号２２～２３の核酸配列を含む、実施形態１０８または１０９に記載のＡＡＶベクター。
１１１．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４～２５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１０８から１１０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１１２．前記第２のＩＴＲ配列が配列番号２４～２５の核酸配列を含む、実施形態１０８から１１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１１３．ポリアデニル化シグナルを含む、実施形態１０３から１１２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１１４．前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ヒト増殖因子ホルモンポリアデニル化シグナル、およびｒｂＧｌｏｂポリアデニル化シグナルから選択される、実施形態１１３に記載のＡＡＶベクター。
１１５．前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ポリアデニル化シグナルを含む、実施形態１１４に記載のＡＡＶベクター。
１１６．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１１３から１１５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１１７．前記ポリアデニル化シグナルが配列番号１９を含む、実施形態１１３から１１６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１１８．前記ポリヌクレオチドがプロモーターを含む、実施形態１０３から１１７のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１１９．前記プロモーターがロドプシンキナーゼプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＩＲＢＰプロモーター、ＲＳ／ＩＲＰＢプロモーター、赤／緑コーンオプシンプロモーター、コーンアレスチンプロモーター、キメラＩＲＢＰエンハンサー－コーントランスデューシンプロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーター、およびｓｍＣＢＡプロモーターから選択される、実施形態１１８に記載のｒＡＡＶベクター。
１２０．前記プロモーターがロドプシンキナーゼプロモーターである、実施形態１１８に記載のＡＡＶベクター。
１２１．前記プロモーターがヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターである、実施形態１１８から１２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
１２２．前記プロモーターが配列番号７と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、実施形態１１８から１２１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１２３．前記プロモーターが配列番号７の核酸配列を含む、実施形態１１８から１２２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１２４．前記ポリヌクレオチドがＳＶ４０イントロンをさらに含む、実施形態４２から１２３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１２５．前記ＳＶ４０イントロンがスプライスドナー領域および／またはスプライスアクセプター領域を含む、実施形態１２４に記載のＡＡＶベクター。
１２６．前記ＳＶ４０イントロンが配列番号２０の核酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、実施形態１２４または１２５に記載のＡＡＶベクター。
１２７．前記ＳＶ４０イントロンが配列番号２０の核酸配列を含む、実施形態１２６に記載のＡＡＶベクター。
１２８．前記レチノシシンタンパク質がヒトレチノシシンタンパク質である、実施形態４２から１２７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１２９．前記異種核酸がヒトレチノシシンの５’非翻訳領域を含まない、実施形態４２から１２８のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１３０．前記５’非翻訳領域が配列番号３９の核酸配列を含む、実施形態１２９に記載のＡＡＶベクター。
１３１．前記核酸がヒトレチノシシンの３’非翻訳領域を含まない、実施形態４２から１３０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１３２．前記３’非翻訳領域が配列番号４０の核酸配列を含む、実施形態１３１に記載のＡＡＶベクター。
１３３．前記異種核酸が配列番号８、９、または１０で説明される核酸配列を含む、実施形態４２から１３２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子。
１３４．前記レチノシシンタンパク質が配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、実施形態４２から１３３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１３５．前記レチノシシンタンパク質が配列番号１２のアミノ酸配列を含む、実施形態４２から１３４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１３６．前記ポリヌクレオチドがスプライスドナー領域および／またはスプライスアクセプター領域を含む、実施形態４２から１３５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１３７．前記ＡＡＶベクターが第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲを含み、前記第１のＩＴＲと前記第２のＩＴＲとの間の前記ＡＡＶベクターの長さが約２０００ヌクレオチド～約６０００ヌクレオチドである、実施形態１から１３６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１３８．前記第１のＩＴＲと前記第２のＩＴＲとの間の前記ＡＡＶベクターの長さが約３０００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドである、実施形態１３７に記載のＡＡＶベクター。
１３９．前記第１のＩＴＲと前記第２のＩＴＲとの間の前記ＡＡＶベクターの長さが約４０００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチドである、実施形態１３８に記載のＡＡＶベクター。
１４０．前記第１のＩＴＲと前記第２のＩＴＲとの間の前記ＡＡＶベクターの長さが約４５００ヌクレオチドである、実施形態１３９に記載のＡＡＶベクター。
１４１．スタッファー－配列を含む、実施形態１から１４０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１４２．ヒトレチノシシンタンパク質をコードする核酸およびスタッファー配列を含むポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクター。
１４３．前記スタッファー配列が約１０００ヌクレオチド～約４０００ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１４１または１４２に記載のＡＡＶベクター。
１４４．前記スタッファー配列が２０００ヌクレオチド～約３０００ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１４１から１４３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１４５．前記スタッファー配列が約２８００ヌクレオチドの長さを有する、実施形態１４１から１４４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１４６．前記スタッファー配列が約２２００ヌクレオチドの全長を有する、実施形態１４１から１４４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１４７．前記スタッファー配列が配列番号２６～３０のいずれか１つの少なくとも１００の連続する塩基と約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、実施形態１４１から１４６のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１４８．前記スタッファー配列が前記異種核酸の３’に位置している、実施形態１４１から１４７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１４９．前記スタッファー配列が前記異種核酸の５’に位置している、実施形態１４１から１４７のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１５０．前記スタッファー配列がＩＴＲ配列の間に位置している、実施形態１４１から１４９のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
１５１．配列番号２６～３０のいずれか１つの少なくとも１００の連続する塩基と約または少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である配列を含む、核酸スタッファー配列。
１５２．実施形態１５１の核酸スタッファー配列を含むＡＡＶベクター。
１５３．実施形態１から１５２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターおよびカプシドを含むＡＡＶ粒子。
１５４．前記カプシドがＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ４４．９（Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｅ５３１Ｄ）、およびＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ５およびその変異体、ＡＡＶ７およびその変異体、ＡＡＶ８およびその変異体、ＡＡＶ９およびその変異体、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ８（Ｙ４４７Ｆ＋Ｙ７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ２ＴＴ、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＤＧＥ－ＤＦ、Ｐ２－Ｖ２、Ｐ２－Ｖ３、ならびにＭＥ－Ｂ（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）から選択される、実施形態１５３に記載のＡＡＶ粒子。
１５５．前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ４４．９（Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｅ５３１Ｄ）、およびＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）から選択される、実施形態１５３に記載のＡＡＶ粒子。
１５６．前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）である、実施形態１５３に記載のＡＡＶ粒子。
１５７．前記ＡＡＶカプシドがＤＧＥ－ＤＦ、Ｐ２－Ｖ２、Ｐ２－Ｖ３、およびＭＥ－Ｂ（Ｙ－Ｆ＋Ｔ－Ｖ）から選択される、実施形態１５３に記載のＡＡＶ粒子。
１５８．前記ＡＡＶカプシドがＡＡＶ５カプシドタンパク質またはその変異体を含む、実施形態１５３に記載のＡＡＶ粒子。
１５９．実施形態１５３から１５８のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子および薬学的に許容される担体、緩衝剤、希釈剤、もしくは賦形剤、またはそれらの任意の組合せを含む組成物。
１６０．実施形態１から１５２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、実施形態１５３から１５８のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態１５９に記載の組成物を含む細胞。
１６１．実施形態１から１５２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、実施形態１５３から１５８のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子、または実施形態１５９に記載の組成物を細胞に投与することを含む、細胞に形質導入する方法。
１６２．前記細胞が光受容体細胞である、実施形態１６０または１６１に記載の方法。
１６３．前記細胞が網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞である、実施形態１６０または１６１に記載の方法。
１６４．実施形態１から１５２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター、実施形態１５３から１５８のいずれか一項に記載のＡＡＶ粒子、実施形態１５９に記載の組成物、または実施形態１６０に記載の細胞を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるＸ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）を処置する方法。
１６５．前記投与が前記哺乳動物の一眼または両眼への投与である、実施形態１６４に記載の方法。
１６６．前記投与の工程が前記哺乳動物の一眼または両眼への硝子体内投与または網膜下投与を含む、実施形態１６４または１６５に記載の方法。
１６７．３０μＬ～１５０μＬの容量のベクター、粒子、または組成物が投与される、実施形態１６４から１６６のいずれか一項に記載の方法。
１６８．約９０μＬの容量のベクター、粒子、または組成物が投与される、実施形態１６７に記載の方法。
１６９．前記粒子が５×１０１０～１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの量で投与される、実施形態１６４から１６８のいずれか一項に記載の方法。
１７０．投与の工程が、ａ）１つもしくは複数の光受容体細胞を維持するか、ｂ）層状の網膜構造を修復するか、ｃ）杆体および／または錐体に媒介される１つもしくは複数の機能を修復するか、ｄ）一眼もしくは両眼の視覚行動を完全にもしくは部分的に修復するか、またはｅ）それらの任意の組合せである、実施形態１６４から１６９のいずれか一項に記載の方法。
１７１．前記哺乳動物がヒトである、実施形態１６４から１７０のいずれか一項に記載の方法。

Claims (55)

  1. （ｉ）レチノシシンタンパク質をコードする異種核酸、および（ｉｉ）イントロン、スプライスドナー領域、スプライスアクセプター領域、またはそれらの２つ以上の任意の組合せを含むポリヌクレオチドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター。
  2. スプライスドナー領域および／またはスプライスアクセプター領域を含むイントロンを含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
  3. 配列番号２０または２１の核酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含むイントロンを含む、請求項１または２に記載のＡＡＶベクター。
  4. 前記イントロンが配列番号２０または２１の核酸配列を含む、請求項３に記載のＡＡＶベクター。
  5. ＳＶ４０イントロンを含むイントロンを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  6. 転写後制御エレメントを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  7. （ｉ）レチノシシンタンパク質をコードする異種核酸および（ｉｉ）転写後制御エレメントを含むポリヌクレオチドを含む、ＡＡＶベクター。
  8. 前記転写後制御エレメントがウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項６または請求項７に記載のＡＡＶベクター。
  9. 前記転写後制御エレメントが配列番号１５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項６から８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  10. 前記転写後制御エレメントが前記異種核酸の３’に位置している、請求項６から９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  11. 前記レチノシシンタンパク質がヒトレチノシシンタンパク質である、請求項１から１０のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  12. 前記異種核酸がヒトレチノシシンの５’非翻訳領域を含まない、請求項１から１１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  13. 前記５’非翻訳領域が配列番号３９の核酸配列を含む、請求項１２に記載のＡＡＶベクター。
  14. 前記核酸がヒトレチノシシンの３’非翻訳領域を含まない、請求項１から１３のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  15. 前記３’非翻訳領域が配列番号４０の核酸配列を含む、請求項１４に記載のＡＡＶベクター。
  16. 前記異種核酸が配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  17. 配列番号８のヌクレオチド配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む異種核酸を含むポリヌクレオチドを含む、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター。
  18. 前記ポリヌクレオチドが転写後制御エレメントを含む、請求項１７に記載のｒＡＡＶベクター。
  19. 前記転写後制御エレメントが配列番号１５と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する配列を含む、請求項１８に記載のｒＡＡＶベクター。
  20. 前記転写後制御エレメントが前記異種核酸の３’に位置している、請求項１８または１９に記載のｒＡＡＶベクター。
  21. 前記異種核酸が配列番号８のヌクレオチド配列と５、１０、１５、２０、２５ヌクレオチド、または２５ヌクレオチドを超えて異なる配列を含む、請求項１から２０のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  22. 前記異種核酸が配列番号８で説明される配列を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  23. 前記異種核酸が配列番号９で説明される配列を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  24. 前記ポリヌクレオチドが配列番号１０の配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  25. 前記異種核酸が、光受容体細胞または網膜色素上皮細胞中の前記異種核酸の発現を指令する１つまたは複数の制御エレメントに作動可能に連結されている、請求項１から２４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  26. 前記ポリヌクレオチドが、哺乳動物の眼の１つまたは複数の光受容体または網膜色素上皮細胞の中で核酸配列を発現することができるプロモーターを含む、請求項１から２５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  27. 前記プロモーターが、ロドプシンキナーゼプロモーター、ロドプシンプロモーター、ＩＲＢＰプロモーター、キメラヒトレチノシシン－ＩＲＢＰエンハンサー（ＲＳ／ＩＲＰＢ）、赤／緑コーンオプシンプロモーター、コーンアレスチンプロモーター、キメラＩＲＢＰエンハンサー－コーントランスデューシンプロモーター、ニワトリベータアクチンプロモーター、および切断されたキメラニワトリベータアクチン（ｓｍＣＢＡ）プロモーターから選択される、請求項２６に記載のｒＡＡＶベクター。
  28. 前記プロモーターがヒトロドプシンキナーゼ（ｈＧＲＫ１）プロモーターである、請求項２６または２７に記載のｒＡＡＶベクター。
  29. 自己相補性である、請求項１から２８のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  30. 前記ポリヌクレオチドが１つまたは複数の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列に隣接している、請求項１から２９のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  31. 前記１つまたは複数のＩＴＲ配列が配列番号２２～２５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％の同一性を有する核酸配列を含む、請求項３０に記載のＡＡＶベクター。
  32. 前記１つまたは複数のＩＴＲ配列が配列番号２２～２５の核酸配列を含む、請求項３０または３１に記載のＡＡＶベクター。
  33. ポリアデニル化シグナルをさらに含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
  34. 前記ポリアデニル化シグナルがウシ増殖因子ポリアデニル化シグナルを含む、請求項３３に記載のＡＡＶベクター。
  35. 配列番号１６、１７、および３１～３５のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９５％、９８％、または９９％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  36. 配列番号１６、１７、および３１～３５のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクター。
  37. カプシドを含み、請求項１から３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターをさらに含む、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
  38. 前記カプシドがＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドを含む、請求項３７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  39. 前記カプシドが配列番号１～６、１８、および３６～３８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むタンパク質を含む、請求項３７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  40. ＡＡＶ４４．９（Ｅ５３１Ｄ）カプシドおよび請求項１から３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターを含む組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子。
  41. 前記カプシドが以下のカプシドタンパク質：ＡＡＶ４４．９（Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）、ＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｅ５３１Ｄ）、およびＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）のいずれかを含む、請求項３７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  42. 前記カプシドが以下のカプシドタンパク質：ＡＡＶ５およびその変異体、ＡＡＶ７およびその変異体、ＡＡＶ８およびその変異体、ＡＡＶ９およびその変異体、ＡＡＶ２（４ｐＭｕｔ）ΔＨＳ、ＡＡＶ４４．９、ＡＡＶ８（Ｙ４４７Ｆ＋Ｙ７３３Ｆ＋Ｔ４９４Ｖ）、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶ２ＴＴ、ＡＡＶ２ＨＢＫＯ、およびＡＡＶＡｎｃ８０のいずれかを含む、請求項３７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  43. 前記カプシドがＡＡＶ５カプシドタンパク質またはその変異体を含む、請求項３７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  44. 前記カプシドタンパク質がＡＡＶ４４．９（Ｙ４４６Ｆ＋Ｔ４９２Ｖ＋Ｅ５３１Ｄ）を含む、請求項３７に記載のｒＡＡＶ粒子。
  45. １つまたは複数の薬学的に許容される担体、緩衝剤、希釈剤、または賦形剤をさらに含む、請求項３７から４４のいずれか一項に記載の複数のｒＡＡＶ粒子を含む組成物。
  46. 請求項１から３６のいずれか一項に記載のｒＡＡＶベクターまたは請求項３７から４４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子を含む細胞。
  47. 哺乳動物細胞である、請求項４６に記載の細胞。
  48. 請求項３７から４４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項４５に記載の組成物を哺乳動物の一眼または両眼に投与することを含む、哺乳動物の光受容体細胞または網膜色素上皮細胞に形質導入する方法。
  49. 請求項３７から４４のいずれか一項に記載のｒＡＡＶ粒子または請求項４５に記載の組成物を、哺乳動物における網膜分離症の１つまたは複数の症状を処置または改善するために十分な量で前記哺乳動物の一眼または両眼に網膜下投与することを含む、哺乳動物におけるＸ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）を処置または改善する方法。
  50. 前記哺乳動物がヒトである、請求項４９に記載の方法。
  51. 前記粒子が５×１０１０～１×１０１２ベクターゲノム（ｖｇ）／ｍＬの量で投与される、請求項４８から５０のいずれか一項に記載の方法。
  52. 投与の工程が、ａ）１つもしくは複数の光受容体細胞を維持するか、ｂ）層状の網膜構造を修復するか、ｃ）杆体および／または錐体に媒介される１つもしくは複数の機能を修復するか、ｄ）一眼もしくは両眼の視覚行動を完全にもしくは部分的に修復するか、またはｅ）それらの任意の組合せである、請求項４８から５１のいずれか一項に記載の方法。
  53. 前記投与の工程が層状の網膜構造を修復する、請求項４８から５２のいずれか一項に記載の方法。
  54. 前記投与の工程が前記哺乳動物の一眼または両眼の網膜窩への網膜下投与を含む、請求項４８から５３のいずれか一項に記載の方法。
  55. 前記網膜窩の剥離が最小化される、請求項５４に記載の方法。
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