BR112020010928A2 - synpiii, um promotor para a expressão de gene específica em epitélio de pigmento retinal - Google Patents

Abstract

A presente invenção refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende, ou que consiste em, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1 ou uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 1000 bp que tem pelo menos 80% de identidade em relação à dita sequência da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolado leva, especificamente, à expressão em células do epitélio de pigmento retinal de um gene quando operativamente ligado a uma codificação de sequência de ácidos nucleicos para o dito gene.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "SYNPIII,

UM PROMOTOR PARA A EXPRESSÃO DE GENE ESPECÍFICA EM EPITÉLIO DE PIGMENTO RETINAL". CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos que leva à expressão de genes especificamente em células do epitélio de pigmento retinal.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Para fins de expressão, os genes recombinantes são normalmente transfectados nas células-alvo, populações ou tecidos celulares, como construtos de cDNA no contexto de um cassete de expressão ativo para permitir a transcrição do gene heterólogo. O construto de DNA é reconhecido pela maquinaria de transcrição celular em um processo que envolve a atividade de muitos fatores de transcrição de ação trans (TF) em elementos reguladores cis, incluindo intensificadores, silenciadores, isoladores e promotores (denominados globalmente no presente documento como "promotores").

[0003] Os promotores de gene estão envolvidos em todos esses níveis de regulação, que servem como o determinante em transcrição de gene integrando-se as influências da sequência de DNA, ligação de fator de transcrição e recursos epigenéticos. Os mesmos determinam a força de, por exemplo, expressão de transgene que é codificada por um vetor de plasmídeo, assim como em qual tipo ou tipos de célula o dito transgene será expresso.

[0004] Os promotores mais comuns usados para acionar a expressão genética heteróloga em células de mamífero são os promotores precoces imediatos principais de citomegalovírus (CMV) humano e de camundongo. Os mesmos conferem uma forte expressão e se demonstraram robustos em diversos tipos celulares. Outros promotores virais, como o promotor precoce imediato SV40 e o promotor de repetição de terminal longo (LTR) do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV) também são usados frequentemente em cassetes de expressão.

[0005] Em vez de promotores virais, promotores celulares também podem ser usados. Entre os promotores conhecidos estão aqueles genes de manutenção que codificam transcrições celulares abundantemente transcritas, como beta-actina, fator de alongamento 1- alfa (EF-1alfa) ou ubiquitina. Em comparação com promotores virais, a expressão genética eucariótica é mais complexa e necessita de uma coordenação precisa de diversos fatores diferentes.

[0006] Um dos aspectos em relação ao uso de elementos reguladores endógenos para expressão de transgene é a geração de mMRNA estável e essa expressão pode ocorrer no ambiente nativo da célula hospedeira, onde fatores de transcrição de ação trans são consequentemente fornecidos. Visto que a expressão de genes eucarióticos é controlada por uma maquinaria complexa de elementos reguladores de ação cis e trans, a maior parte dos promotores celulares sofre de uma falta de caracterização funcional extensiva. Partes do promotor eucariótico estão normalmente localizadas imediatamente a montante de sua sequência transcrita e servem como o ponto de iniciação transcricional. O promotor nuclear circunda imediatamente o sítio de início de transcrição (TSS) que é suficiente para ser reconhecido pela maquinaria de transcrição. O promotor proximal compreende a região a montante do promotor nuclear e contém o TSS e outros recursos de sequência necessários para a regulação transcricional. Fatores de transcrição atuam a sequência específica ligando-se a motivos reguladores no promotor e sequência intensificadora, assim ativando as enzimas de modificação de cromatina e histona que alteram a estrutura de nucleossoma e sua posição que finalmente permite a iniciação de transcrição. A identificação de um promotor funcional é principalmente dependente da presença de elementos intensificadores a montante ou a jusante associados.

[0007] Outro aspecto crucial em relação ao uso de elementos reguladores endógenos para a expressão de transgene é que alguns promotores podem atuar de maneira específica de célula e levarão à expressão do transgene em células de um tipo específico ou, dependendo do promotor, em células de um subconjunto particular.

[0008] Portanto, um objetivo da presente invenção é obter novas sequências adequadas para expressar genes recombinantes em células de mamíferos com altos níveis de expressão e de maneira específica de tipo celular.

[0009] Tal sequência aborda uma necessidade na técnica por promotores específicos de células retinais para desenvolver sistemas para o estudo de distúrbios neurodegenerativos, restauração de visão, descoberta de fármacos, terapias de tumor e diagnóstico de distúrbios.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0010] Um indivíduo pode dividir a retina em duas partes, o epitélio de pigmento retinal (RPE) e a retina neurossensorial. RPE é ativamente envolvido no mantimento de função de retina neurossensorial. A retina neurossensorial é organizada como uma rede neural incluindo fotorreceptores e células ganglionares retinais (RGC, ou gânglios retinais)) Os fotorreceptores convertem informações de luz em informações elétricas direcionadas a RGCs, em que o último é responsável pela transmissão de informações visuais da retina ao córtex visual. Entre esses tipos celulares diferentes, também podem ser encontradas células que têm funções reguladoras, como células horizontais que induzem uma retroalimentação negativa que permite a adaptação da resposta de retina a várias condições de intensidade de luz e aumentam as informações de contraste.

[0011] A camada pigmentada de retina ou epitélio de pigmento retinal (RPE), também conhecido como o pigmentum nigrum, é a camada celular pigmentada logo fora da retina neurossensorial que nutre as células visuais retinais, e é firmemente fixada ao coroide subjacente e células visuais retinais subjacentes. O RPE é composto de uma camada única de células hexagonais que são densamente embaladas com grânulos de pigmento. Na ora serrata, o RPE continua como uma membrana que passa sobre o corpo ciliar e continua como a superfície posterior do íris. Isso gera as fibras do dilatador. Diretamente abaixo desse epitélio está o neuroepitélio (isto é, hastes e cones) que passam juntamente com o RPE. Ambos, combinados, são entendidos como sendo o epitélio ciliar do embrião. A continuação da extremidade frontal da retina é o epitélio da íris posterior, que adquire pigmento quando o mesmo entra na íris. Quando vistas a partir da superfície externa, essas células são lisas e hexagonais no formato. Quando vistas em seção, cada célula consiste em uma parte não pigmentada que contém um núcleo oval grande e uma porção pigmentada interna que se estende como uma série de processos em linha reta entre as hastes, isso sendo especialmente o caso quando o olho é exposto à luz. O RPE tem diversas funções, a saber, absorção de luz, transporte epitelial, tamponamento de íon espacial, ciclo visual, fagocitose, secreção e modulação imunológica.

[0012] Diversas doenças foram associadas ao RPE, a saber, degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética ou hipertrofia de epitélio de pigmento retinal.

[0013] Um promotor que pode acionar especificamente a expressão de gene em células do epitélio de pigmento retinal (RPE) é extremamente útil para abordar e alvejar a expressão de gene em células de epitélio de pigmento retinal em retina com doença de, por exemplo, pacientes com degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética ou hipertrofia de epitélio de pigmento retinal.

[0014] Uma expressão alvejada em células do RPE de versão saudável do gene responsável por uma dessas doenças, ou fatores de neuroproteção de codificação de gene, pode permitir o tratamento destas patologias. Portanto, é essencial poder obter expressão de gene forte e específica nessas células para fornecer terapia gênica.

[0015] Os presentes inventores combinaram epigenética, bioinformática e neurociência para constatar promotores que, quando no olho, acionam a expressão de gene apenas em células do epitélio de pigmento retinal.

[0016] A sequência de ácidos nucleicos da sequência da invenção é:

GTTCTTTGGGTTCCATATTTTCCOTCATTCCCOTTCAAGTCTAGCOTG GATTGCAAAGTTAAGCTTATGATTATGAATAAAAACTATTGAGTATA TTTTCAAGGAAATAGTGACTTACCTTTTAAGGTCACTTCCTGCTCTT TCATCTGACCCAGAAACACTGAATAATAAAGCCATCATTTGTTGAA TGACCACTGTGTAATTTTTATTTAGAACTCTAATGTTGGTAATCTGC TTGGGGCTGTGGGTTAAGAATCTTTGGGTTGCTTGAGGAAATGCA CTTAATTAAAATAAACATTAAACTTTTCCACACTGGCCTTTGTCTCC CCCTGGCGGATCCTAGCAACAGATACCAGCAAGTTGTCTTACTTG GTATTTAGGGCAATGTGATGCAGCCCTAACCCAAAGTGTTGTCAC ACCAAACCCTTCACACCCAAGAGGATGTTTCGCTCTGAAGTCATC AGCTCTAACAAATATTTGTAAGTAAACAGGTTTTTCTTTAAGGAGG CCTTCATTTGTAACCAACACCATGCTCTCCTTTTTCEGCTCTCTGAA GTCATCAGCTCTAAAGGAAATCAATCTCAATGCCCTATTATACCCT GATCTCTGGCCTTTGGAGGGGCTGTTCAAAGATTCTCTGAGGACT TATAGGCTAATAAGGTTGAGGATTTTGTGATTTAAAGAACTCCTTA ATCCACTGCTTCCTGCCTACCATAAGCCAAGGCCACCCTTGCCOTT TTTTTTTCTTATCCCCTGCTGAACCTGAAAAMACCCTCTCTTTTCTAC AGTTTTCTGTTCCCAGGCCCCAAGTACAGTTAAACAATTCAACTCA ACTTGTTTAATCCTCTCGTCTTAAATTATTCACATTGCCAAGTATTT CAACAGAATGTACTGGCAAGTTCATAAACAGAGTGCAAATCACCC AAGCAGAAGTAATTTACTGCTTTTAAGTCAAAGCCCTGCTTAGCTA GGGAGTCAGCTGTAGGAATTAACCAGAACAAAATCCTGATTAAAC AGCTAATCGGTTCTACTCCGCTAACCCAGTGGCCTGAGCAAATCA CAAGGAGGATTGGTTCCTTGCATCTGGTTTGGGCACCGCCCACCT GGAACCCTAGGGGCGGGGCCGCTTAAGTGGCAGGAGGGATATAT ATCAGGATGCAAAAGACCCTGCCAACTGGAAAAATAAGAAGGCAG CAGCTTTGGATTTTCCACTCATGGAAGAGGGGAGGAAAGGGCAG

AGGGTGGGGGCTTCCTTGGGAAGCTTGGGATGAGTCACCACGGG ATTGGGGAGTGGAGGGTGGATAGGATATGGAGAAGGGTGG (SEQ ID NO:1).

[0017] A presente invenção fornece, então, uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende, ou que consiste em, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1 ou uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 1000 bp que tem pelo menos 70% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolado leva especificamente à expressão em células do epitélio de pigmento retinal de um gene operativamente ligado à dita codificação de sequência de ácidos nucleicos para o dito gene. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, tem pelo menos 80% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 85% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 90% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp,

e tem pelo menos 95% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 96% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 97% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 98% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 99% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem 100% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1.

[0018] A molécula de ácido nucleico isolado da invenção pode compreender ainda um promotor mínimo, por exemplo, um promotor mínimo SV40, por exemplo, o promotor mínimo SV40 ou o usado nos exemplos, por exemplo,

ATCCTCACATGGTCCTGCTGGAGTTAGTAGAGGGTATATAATGGA

AGCTCGACTTCCAGCTATCACATCCACTGTGTTGTTGTGAACTGG AATCCACTATAGGCCA (SEQ ID NO:2).

[0019] Também é fornecida uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que hibridiza sob condições rigorosas em relação a uma molécula de ácido nucleico isolado da invenção conforme descrito acima.

[0020] A presente invenção também fornece um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico isolado da invenção conforme descrito acima, em que o dito promotor é operativamente ligado a pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um gene a ser expresso especificamente em células do epitélio de pigmento retinal.

[0021] A presente invenção fornece ainda um vetor que compreende o cassete de expressão da invenção. Em algumas modalidades, o dito vetor é um vetor viral.

[0022] A presente invenção também abrange o uso de um ácido nucleico da invenção, de um cassete de expressão da invenção ou de um vetor da invenção para a expressão de um gene em células do epitélio de pigmento retinal.

[0023] A presente invenção fornece ainda um método para expressar gene em células do epitélio de pigmento retinal que compreende as etapas de transfectar uma célula isolada, uma linhagem celular ou a população celular (por exemplo, um tecido) com um cassete de expressão da invenção, em que o gene a ser expresso será expresso pela célula isolada, a linhagem celular ou a população celular se a dita célula for, ou as ditas células compreenderem, as células do epitélio de pigmento retinal. Em algumas modalidades, a célula isolada, linhagem celular ou população ou tecido celular é humano.

[0024] A presente invenção também fornece uma célula isolada que compreende o cassete de expressão da invenção. Em algumas modalidades, o cassete de expressão ou vetor é estavelmente integrado ao genoma da dita célula.

[0025] Um gene típico que pode ser operativamente ligado ao promotor da invenção é um gene que codifica uma halorrodopsina ou uma rodopsina de canal. Os genes terapêuticos, isto é, genes que codificam uma proteína terapêutica útil para o tratamento de afecções patológicas, também podem ser usados. Os exemplos de genes terapêuticos incluem, mas sem limitação, ácidos nucleicos para substituição de um gene ausente ou que sofreu mutação conhecido por causar doença retinal, como MT-NDA4 (ID de Gene: 4538), MT-ND1 (ID de Gene: 4535), MT-ND6 (ID de Gene: 4541), MT-CYB (ID de Gene: 4519), MT-CO3 (ID de Gene: 4514), MT-ND5 (ID de Gene: 4540), MT- ND?2 (ID de Gene: 4536), 5 MT-CO! (ID de Gene: 4512), MT-ATP6 (ID de Gene: 4508), MT-ND4L (ID de Gene: 4539), OPA1 (ID de Gene: 4976), OPA3 (ID de Gene: 80207), OPA7 (ID de Gene: 84233), e ACO2 (ID de Gene: 50). O gene terapêutico também pode codificar fatores neurotróficos, como GDNF (ID de Gene: 2668), CNTF (ID de Gene: 1270), FGF2 (ID de Gene: 2247), BDNF (ID de Gene: 627) e EPO (ID de Gene: 2056), genes antiapoptóticos, como BCL2 (ID de Gene: 596) e BCL2L1 (ID de Gene: 598), fatores antiangiogênicos, como endostatina, angiostatina e sFIt, fatores anti-inflamatórios, como IL10 (ID de Gene: 3586), ILIR1 (ID de Gene: 3554), TGFBI (ID de Gene: 7045) e IL4 (ID de Gene: 3565), ou o fator de viabilidade de cone derivado de haste (RAdCVF) (ID de Gene: 115861).

[0026] Além disso, a presente invenção também fornece um kit para expressar gene em células do epitélio de pigmento retinal, cujo kit compreende uma molécula de ácido nucleico isolado da invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0027] Figura 1: Expressão alvejada a células de epitélio de pigmento retinal em retina primata de promotor ID NO:1. As imagens de microscopia confocal de varredura a laser de expressão de EGFP do promotor compreendem a SEQ ID NO:1 3 meses após a injeção subretinal de AAV-synPII|l-ChR2-EGFP em olhos de macacos adultos (Macaca mulatta). A expressão induzida em células de epitélio pigmentado retinal pode ser observada. Verde = EGFP acionada pela SEQ ID NO:1. Branco = Hoechst.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0028] Um indivíduo pode dividir a retina em duas partes, o epitélio de pigmento retinal (RPE) e a retina neurossensorial. RPE é ativamente envolvido no mantimento de função de retina neurossensorial. A retina neurossensorial é organizada como uma rede neural incluindo fotorreceptores e células ganglionares retinais (RGC, ou gânglios retinais). Os fotorreceptores convertem informações de luz em informações elétricas direcionadas a RGCs, em que o último é responsável pela transmissão de informações visuais da retina ao córtex visual. Entre esses tipos celulares diferentes, também podem ser encontradas células que têm funções reguladoras, como células horizontais que induzem uma retroalimentação negativa que permite a adaptação da resposta de retina a várias condições de intensidade de luz e aumentam as informações de contraste.

[0029] A camada pigmentada de retina ou epitélio de pigmento retinal (RPE), também conhecido como o pigmentum nigrum, é a camada celular pigmentada logo fora da retina neurossensorial que nutre as células visuais retinais, e é firmemente fixada ao coroide subjacente e células visuais retinais subjacentes. O RPE é composto de uma camada única de células hexagonais que são densamente embaladas com grânulos de pigmento. Na ora serrata, o RPE continua como uma membrana que passa sobre o corpo ciliar e continua como a superfície posterior do íris. Isso gera as fibras do dilatador. Diretamente abaixo desse epitélio está o neuroepitélio (isto é, hastes e cones) que passam juntamente com o RPE. Ambos, combinados, são entendidos como sendo o epitélio ciliar do embrião. A continuação da extremidade frontal da retina é o epitélio da íris posterior, que adquire pigmento quando o mesmo entra na íris. Quando vistas a partir da superfície externa, essas células são lisas e hexagonais no formato. Quando vistas em seção, cada célula consiste em uma parte não pigmentada que contém um núcleo oval grande e uma porção pigmentada interna que se estende como uma série de processos em linha reta entre as hastes, isso sendo especialmente o caso quando o olho é exposto à luz. O RPE tem diversas funções, a saber, absorção de luz, transporte epitelial, tamponamento de íon espacial, ciclo visual, fagocitose, secreção e modulação imunológica.

[0030] Diversas doenças foram associadas ao RPE, a saber, degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética ou hipertrofia de epitélio de pigmento retinal.

[0031] Um promotor que pode acionar especificamente a expressão de gene em células do epitélio de pigmento retinal (RPE) é extremamente útil para abordar e alvejar a expressão de gene em células de epitélio de pigmento retinal em retina com doença de, por exemplo, pacientes com degeneração macular relacionada à idade, retinite pigmentosa, retinopatia diabética ou hipertrofia de epitélio de pigmento retinal.

[0032] Uma expressão alvejada em células do RPE de versão saudável do gene responsável por uma dessas doenças, ou fatores de neuroproteção de codificação de gene, pode permitir o tratamento destas patologias. Portanto, é essencial poder obter expressão de gene forte e específica nessas células para fornecer terapia gênica.

[0033] Os presentes inventores combinaram epigenética, bioinformática e neurociência para constatar promotores que, quando no olho, acionam a expressão de gene apenas em células do epitélio de pigmento retinal.

[0034] A sequência de ácidos nucleicos da sequência da invenção é:

GTTCTTTGGGTTCCATATTTTCCTCATTCCCCOTTCAAGTCTAGCOTG GATTGCAAAGTTAAGCTTATGATTATGAATAAAAACTATTGAGTATA TTTTCAAGGAAATAGTGACTTACCTTTTAAGGTCACTTCCTGCTCTT TCATCTGACCCAGAAACACTGAATAATAAAGCCATCATTTGTTGAA TGACCACTGTGTAATTTTTATTTAGAACTCTAATGTTGGTAATCTGC TTGGGGCTGTGGGTTAAGAATCTTTGGGTTGCTTGAGGAAATGCA CTTAATTAAAATAAACATTAAACTTTTCCACACTGGCCTTTGTCTCC CCCTGGCGGATCCTAGCAACAGATACCAGCAAGTTGTCTTACTTG GTATTTAGGGCAATGTGATGCAGCCCTAACCCAAAGTGTTGTCAC ACCAAACCCTTCACACCCAAGAGGATGTTTCGCTCTGAAGTCATC AGCTCTAACAAATATTTGTAAGTAAACAGGTTTTTCTTTAAGGAGG CCTTCATTTGTAACCAACACCATGCTCTCCTTTTTCGCTCTCTGAA GTCATCAGCTCTAAAGGAAATCAATCTCAATGCCCTATTATACCCT GATCTCTGGCCTTTGGAGGGGCTGTTCAAAGATTCTCTGAGGACT TATAGGCTAATAAGGTTGAGGATTTTGTGATTTAAAGAACTCCTTA ATCCACTGCTTCCTGCCTACCATAAGCCAAGGCCACCCTTGCCTT TTTTTTTCTTATOCCCCTGCTGAACCTGAAAAACCCTCTCTTTTCTAC AGTTTTCTGTTCCCAGGCCCCAAGTACAGTTAAACAATTCAACTCA ACTTGTTTAATCCTCTCGTCTTAAATTATTCACATTGCCAAGTATTT CAACAGAATGTACTGGCAAGTTCATAAACAGAGTGCAAATCACCC AAGCAGAAGTAATTTACTGCTTTTAAGTCAAAGCCCTGCTTAGCTA GGGAGTCAGCTGTAGGAATTAACCAGAACAAAATCCTGATTAAAC AGCTAATCGGTTCTACTCCGCTAACCCAGTGGCCTGAGCAAATCA CAAGGAGGATTGGTTCCTTGCATCTGGTTTGGGCACCGCCCACCOT GGAACCCTAGGGGCGGGGCCGCTTAAGTGGCAGGAGGGATATAT ATCAGGATGCAAAAGACCCTGCCAACTGGAAAAATAAGAAGGCAG CAGCTTTGGATTTTCCACTCATGGAAGAGGGGAGGAAAGGGCAG

AGGGTGGGGGCTTCCTTGGGAAGCTTGGGATGAGTCACCACGGG ATTGGGGAGTGGAGGGTGGATAGGATATGGAGAAGGGTGG (SEQ ID NO:1).

[0035] A presente invenção fornece, então, uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende, ou que consiste em, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1 ou uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 1000 bp que tem pelo menos 70% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolado leva especificamente à expressão em células do epitélio de pigmento retinal de um gene operativamente ligado à dita codificação de sequência de ácidos nucleicos para o dito gene. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1800 bp, tem pelo menos 80% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 85% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1800 bp, e tem pelo menos 90% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 95% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1800 bp, e tem pelo menos 96% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 97% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 98% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem pelo menos 99% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos tem pelo menos 1000 bp, e tem 100% de identidade em relação à dita sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1. A sequência de ácidos nucleicos pode ter pelo menos 1000 bp, 1100 bp, 1200 bp, 1300 bp ou 1317 bp.

[0036] A molécula de ácido nucleico isolado da invenção pode compreender ainda um promotor mínimo, por exemplo, um promotor mínimo SV40, por exemplo, o promotor mínimo SV40 ou o usado nos exemplos, por exemplo,

ATCCTCACATGGTCCTGCTGGAGTTAGTAGAGGGTATATAATGGA

AGCTCGACTTCCAGCTATCACATCCACTGTGTTGTTGTGAACTGG AATCCACTATAGGCCA (SEQ ID NO:2).

[0037] Também é fornecida uma molécula de ácido nucleico isolado que compreende uma sequência que hibridiza sob condições rigorosas em relação a uma molécula de ácido nucleico isolado da invenção conforme descrito acima.

[0038] A presente invenção também fornece um cassete de expressão que compreende um ácido nucleico isolado da invenção conforme descrito acima, em que o dito promotor é operativamente ligado a pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um gene a ser expresso especificamente em células do epitélio de pigmento retinal.

[0039] A presente invenção fornece ainda um vetor que compreende o cassete de expressão da invenção. Em algumas modalidades, o dito vetor é um vetor viral.

[0040] A presente invenção também abrange o uso de um ácido nucleico da invenção, de um cassete de expressão da invenção ou de um vetor da invenção para a expressão de um gene em células do epitélio de pigmento retinal.

[0041] A presente invenção fornece ainda um método para expressar gene em células do epitélio de pigmento retinal que compreende as etapas de transfectar uma célula isolada, uma linhagem celular ou a população celular (por exemplo, um tecido) com um cassete de expressão da invenção, em que o gene a ser expresso será expresso pela célula isolada, a linhagem celular ou a população celular se a dita célula for, ou as ditas células compreenderem, as células do epitélio de pigmento retinal. Em algumas modalidades, a célula isolada, linhagem celular ou população ou tecido celular é humano.

[0042] A presente invenção também fornece uma célula isolada que compreende o cassete de expressão da invenção. Em algumas modalidades, o cassete de expressão ou vetor é estavelmente integrado ao genoma da dita célula.

[0043] Um gene típico que pode ser operativamente ligado ao promotor da invenção é um gene que codifica uma halorrodopsina ou uma rodopsina de canal. Os genes terapêuticos, isto é, genes que codificam uma proteína terapêutica útil para o tratamento de afecções patológicas, também podem ser usados. Os exemplos de genes terapêuticos incluem, mas sem limitação, ácidos nucleicos para substituição de um gene ausente ou que sofreu mutação conhecido por causar doença retinal, como MT-NDA4 (ID de Gene: 4538), MT-ND1 (ID de Gene: 4535), MT-ND6 (ID de Gene: 4541), MT-CYB (ID de Gene: 4519), MT-CO3 (ID de Gene: 4514), MT-ND5 (ID de Gene: 4540), MT- ND?2 (ID de Gene: 4536), 5 MT-CO! (ID de Gene: 4512), MT-ATP6 (ID de Gene: 4508), MT-ND4L (ID de Gene: 4539), OPA1 (ID de Gene: 4976), OPA3 (ID de Gene: 80207), OPA7 (ID de Gene: 84233), e ACO2 (ID de Gene: 50). O gene terapêutico também pode codificar fatores neurotróficos, como GDNF (ID de Gene: 2668), CNTF (ID de Gene: 1270), FGF2 (ID de Gene: 2247), BDNF (ID de Gene: 627) e EPO (ID de Gene: 2056), genes antiapoptóticos, como BCL2 (ID de Gene: 596) e BCL2L1 (ID de Gene: 598), fatores antiangiogênicos, como endostatina, angiostatina e sFIt, fatores anti-inflamatórios, como IL10 (ID de Gene: 3586), ILIR1 (ID de Gene: 3554), TGFBI (ID de Gene: 7045) e IL4 (ID de Gene: 3565), ou o fator de viabilidade de cone derivado de haste (RAdCVF) (ID de Gene: 115861).

[0044] Além disso, a presente invenção também fornece um kit para expressar gene em células do epitélio de pigmento retinal, cujo kit compreende uma molécula de ácido nucleico isolado da invenção.

[0045] Conforme usado no presente documento, o termo "promotor" se refere a quaisquer elementos reguladores cis, incluindo intensificadores, silenciadores, isoladores e promotores. Um promotor é uma região de DNA que está geralmente localizada a montante (em direção à região 5') do gene que precisa ser transcrito. O promotor permite a ativação ou repressão apropriada do gene que controla. No contexto da presente invenção, os promotores levam à expressão específica de genes ligados operativamente aos mesmos nas células do epitélio de pigmento retinal. "Expressão específica", também denominada "expressão apenas em um certo tipo de célula" significa que pelo menos mais do que 75% das células que expressam o gene de interesse são do tipo especificado, isto é, células do epitélio de pigmento retinal no presente caso.

[0046] Os cassetes de expressão são tipicamente introduzidos em um vetor que facilita a entrada do cassete de expressão em uma célula hospedeira e manutenção do cassete de expressão na célula hospedeira. Tais vetores são comumente usados e são bastante conhecidos por aqueles versados na técnica. Diversos dos tais vetores estão comercialmente disponíveis, por exemplo, pela Invitrogen, Stratagene, Clontech, etc., e são descritos em diversos guias, tais como Ausubel, Guthrie, Strathem ou Berger, todos acima. Tais vetores incluem tipicamente promotores, sinais de poliadenilação, etc., em combinação com múltiplos sítios de clonagem, assim como elementos adicionais, tais como origens de replicação, genes marcadores selecionáveis (por exemplo, LEU2, URA3, TRP 1, HIS3, GFP), sequências centroméricas, etc.

[0047] Vetores virais, por exemplo, um AAV, um PRV ou um lentivírus, são adequados para alvejar e entregar genes às células do epitélio de pigmento retinal com o uso de um promotor da invenção.

[0048] O estímulo de células retinais pode ser medido com o uso de um método elétrico, como uma matriz de múltiplos eletrodos ou um patch-clamp, ou com o uso de um método visual, como a detecção de fluorescência.

[0049] Os métodos com o uso de sequência de ácidos nucleicos da invenção podem ser usados para identificar agentes terapêuticos para o tratamento de um distúrbio neurológico ou de um distúrbio das células que envolvem retina do epitélio de pigmento retinal, em que o dito método compreende as etapas de contactar um composto de teste com células do epitélio de pigmento retinal que expressa um ou mais transgene sob um promotor da invenção, e comparando-se pelo menos um estímulo de células do epitélio de pigmento retinal obtido na presença do dito composto de teste com a mesma saída obtida na ausência do dito composto de teste.

[0050] Além disso, os métodos com o uso de promotores da invenção também podem ser usados para teste in vitro de restauração de visão, em que o dito método compreende as etapas de contactar células do epitélio de pigmento retinal que expressam um ou mais transgenes sob o controle de um promotor da invenção com um agente, e que comparam pelo menos um estímulo obtido após o contato com o dito agente com o mesmo estímulo obtido antes do dito contato com o dito agente.

[0051] As rodopsinas de canal são uma subfamília de proteínas opsina que funcionam como canais iônicos dependentes de luz. As mesmas servem como fotorreceptores sensoriais em algas verdes unicelulares, que controlam fototaxia, isto é, movimento em resposta à luz. Expressas em células de outros organismos, as mesmas permitem o uso de luz para controlar acidez intracelular, influxo de cálcio, excitabilidade elétrica e outros processos celulares. Pelo menos três rodopsinas de canal "naturais" são atualmente conhecidas: Rodopsina de canal 1 (ChR1), rodopsina de canal 2 (ChR2) e rodopsina de canal Volvox (VChR1). Além disso, algumas versões modificadas/melhoradas dessas proteínas também existem. Todas as rodopsinas de canal conhecidas são canais de cátion não específicos, que conduzem íons H+, Na+, K+ e Ca2+.

[0052] Halorrodopsina é uma bomba de íon conduzida por luz, específica para íons de cloreto e encontrada em "bactérias" (archaea) filogeneticamente antigas, conhecidas como halobactérias. A mesma é uma proteína de sete transmembranas da família de proteína retinilideno, homóloga à bacteriorrodopsina de bomba de próton conduzida por luz, e similar em estrutura terciária (mas não estrutura de sequência primária) às rodopsinas de vertebrado, os pigmentos que detectam luz na retina. Halorrodopsina também compartilha similaridade de sequência com rodopsina de canal, um canal de fon conduzido por luz. Halorrodopsina contém o derivado de vitamina A isomerizável por luz essencial totalmente transretinal. Halorrodopsina é uma dentre algumas proteínas de membrana cuja estrutura cristalina é conhecida. Isoformas de halorrodopsina podem ser encontradas em múltiplas espécies de halobactérias, que incluem H. salinarum e N. pharaonis. Diversas pesquisas em andamento exploram essas diferenças, e usam as mesmas para analisar separadamente as propriedades de fotociclo e bomba. Após bacteriorrodopsina, halorrodopsina pode ser a melhor opsina de tipo | (microbiana) estudada. O pico de absorbância do complexo retinal de halorrodopsina é de cerca de 570 nm. Recentemente, halorrodopsina se tornou uma ferramenta em optogenética. Logo que a rodopsina de canal 2 de canal de íon ativado por luz azul abre a capacidade para ativar células excitáveis (como neurônios, células musculares, células pancreáticas e células imunológicas) com breves pulsações de luz azul, a halorrodopsina abre a capacidade para silenciar células excitáveis com breves pulsações de luz amarela. Desse modo, halorrodopsina e rodopsina de canal, juntas, permitem ativação óptica por múltiplas cores, silenciamento e dessincronização de atividade neural, o que cria um arsenal de neuroengenharia poderoso.

[0053] Em algumas modalidades, o promotor é parte de um vetor que alvejou uma retina, em que o dito vetor expressa pelo menos um gene-repórter que é detectável em células vivas do epitélio de pigmento retinal.

[0054] Os vetores virais adequados para a invenção são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, um AAV, um PRV ou um lentivírus, são adequados para alvejar e entregar genes às células do epitélio de pigmento retinal.

[0055] Ao trabalhar com a retina isolada, a entrega viral ideal para células retinianas pode ser alcançada montando-se o lado de célula ganglionar para baixo, de modo que o lado fotorreceptor da retina seja exposto e possa, desse modo, ser mais bem transfectado. Outra técnica é cortar, por exemplo, com uma lâmina, a membrana de limitação interna da retina, de modo que os vírus de entrega possam penetrar nas membranas internas. Uma maneira adicional é inserir a retina em ágar, cortar a dita retina e aplicar os vírus de entrega a partir do lado da fatia.

[0056] O estímulo de células transfectadas pode ser medido com o uso de métodos bem conhecidos, por exemplo, com o uso de um método elétrico, como uma matriz de múltiplos eletrodos ou um patch- clamp, ou com o uso de um método visual, como a detecção de fluorescência. Em alguns casos, a membrana de limitação interna é removida por microcirurgia da membrana de limitação interna. Em outros casos, a gravação é alcançada através de cortes realizados na membrana de limitação interna.

[0057] Qualquer fonte de células retinais pode ser usada para a presente invenção. Em algumas modalidades da invenção, as células retinais são provenientes de, ou estão em, uma retina humana. Em outras modalidades, a retina é de um animal, por exemplo, de bovinos ou de origem de roedor. Retina humana pode ser facilmente obtida a partir de bancos de córnea onde as ditas retinas são normalmente descartadas após a dissecação da córnea. Retina de ser humano adulto tem uma grande superfície (cerca de 1100 mm?) e pode, portanto, ser facilmente separada em diversas sub-regiões, experimentalmente. Além disso, as retinas também podem ser usadas como um modelo diferenciado para comunicação sináptica visto que a retina tem sinapses que são idênticas ao resto do cérebro.

[0058] Conforme usado no presente documento, o termo "animal" é usado no presente documento para incluir todos os animais. Em algumas modalidades da invenção, o animal não humano é um vertebrado. Exemplos de animais são seres humanos, camundongos, ratos, vacas, porcos, cavalos, galinhas, patos, gansos, gatos, cães, etc. O termo "animal" também inclui um animal individual em todos os estágios de desenvolvimento, incluindo os estágios embrionário e fetal. Um "animal geneticamente modificado" é qualquer animal que contém uma ou mais células que carregam informações genéticas alteradas ou recebidas, diretamente ou indiretamente, através de manipulação genética deliberada em um nível subcelular, tal como através de recombinação alvejada, microinjeção ou infecção com vírus recombinante. O termo "animal geneticamente modificado" não é destinado a abranger cruzamento clássico ou fertilização in vitro, porém, em vez disso, significa englobar animais nos quais uma ou mais células são alteradas por, ou recebem, uma molécula de DNA recombinante. Essa molécula de DNA recombinante pode ser especificamente alvejada em um local genético definido, pode ser aleatoriamente integrada a um cromossomo, ou pode ser DNA extracromossomicamente replicante. O termo "animal geneticamente modificado de linhagem germinal" se refere a um animal geneticamente modificado no qual a alteração genética ou informações genéticas foram introduzidas em células de linhagem germinal, desse modo, conferindo a habilidade em transferir as informações genéticas para sua prole. Se tal prole, de fato, tem alguma ou toda dessa alteração ou informações genéticas, as mesmas também são animais geneticamente modificados.

[0059] A alteração ou informações genéticas podem ser estranhas para a espécie de animal à qual o recipiente pertence, ou estranhas apenas ao recipiente individual particular, ou podem ser informações genéticas já tidas pelo recipiente. No último caso, o gene alterado ou introduzido pode ser expressado de maneira diferente do gene nativo, ou não expressado.

[0060] Os genes usados para alterar um gene-alvo podem ser obtidos através de uma ampla variedade de técnicas que incluem, mas sem limitação, isolamento de fontes genômicas, preparação de cDNAs a partir de modelos de mRNA isolado, síntese direta ou uma combinação das mesmas.

[0061] Um tipo de células-alvo para introdução de transgene são as células ES. Células ES podem ser obtidas a partir de embriões de pré- implantação cultivados in vitro e fundidas com embriões (Evans et al. (1981), Nature 292:154 a 156; Bradley et al. (1984), Nature 309:255 a 258; Gossler et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83:9065 a 9069; Robertson et al. (1986), Nature 322:445 a 448; Wood et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4582 a 4584). Transgenes podem ser introduzidos de maneira eficiente nas células ES por técnicas padrão, tais como transfecção de DNA com o uso de eletroporação ou por transdução mediada por retrovírus. As células ES transformadas resultantes podem, após isso, ser combinadas com mórulas através de agregação ou injetadas em blastocistos a partir de um animal não humano. As células ES introduzidas, após isso, colonizam o embrião e contribuem para a linhagem germinal do animal quimérico resultante (Jaenisch (1988), Science 240:1468 a 1474). O uso de células ES de gene alvejado na geração de camundongos geneticamente modificados de gene alvejado foi descrito 1987 (Thomas et al. (1987), Cell 51:503 a 512) e é revisto em outro lugar (Frohman et al. (1989), Cell 56:145 a 147; Capecchi (1989), Trends in Genet. 5:70 a 76; Baribault et al. (1989), Mol. Biol. Med. 6:481 a 492; Wagner (1990), EMBO J. 9:3025 a 3032; Bradley et al. (1992), Bio/Technology 10:534 a 539).

[0062] Técnicas estão disponíveis para inativar ou alterar qualquer região genética em qualquer mutação desejada com o uso de recombinação homóloga alvejada para inserir mudanças específicas em alelos cromossômicos.

[0063] Conforme usado no presente documento, um "gene alvejado" é uma sequência de DNA introduzida na linhagem germinal de um animal não humano através de intervenção humana, incluindo, mas sem limitação, os métodos descritos no presente documento. Os genes alvejados da invenção incluem sequências de DNA que são projetadas para alterar especificamente alelos endógenos cognatos.

[0064] Na presente invenção, "isolado" se refere a material removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for de ocorrência natural) e, assim, é alterado "pela mão do homem" a partir de seu estado natural. Por exemplo, um polinucleotídeo isolado pode ser parte de um vetor ou uma composição de matéria, ou pode estar contido em uma célula, e ainda estar "isolado" pois aquele vetor, composição de matéria ou célula particular não é o ambiente original do polinucleotídeo. O termo "isolado" não se refere às bibliotecas genômicas ou de cDNA, o total de célula inteira ou preparações de mRNA, preparações de DNA genômico (que incluem aquelas separadas por eletroforese e transferidas em manchas), preparações de DNA genômico de célula inteira quebrada ou outras composições em que a técnica não demonstra nenhum recurso de distinção do polinucleotídeo/sequências da presente invenção. Exemplos adicionais de moléculas de DNA isolado incluem moléculas de DNA recombinante mantidas em células hospedeiras heterólogas ou moléculas de DNA purificado (parcial ou substancialmente) em solução. Moléculas de RNA isolado incluem transcrições de RNA in vivo ou in vitro das moléculas de DNA da presente invenção. No entanto, um ácido nucleico contido em um clone que é um membro de uma biblioteca (por exemplo, uma biblioteca genômica ou de cDNA) que não foi isolado de outros membros da biblioteca (por exemplo, na forma de uma solução homogênea que contém o clone e outros membros da biblioteca) ou um cromossomo removido de uma célula ou um lisado celular (por exemplo, uma "dispersão de cromossomo", como em um cariótipo), ou uma preparação de DNA genômico aleatoriamente compartilhado ou uma preparação de corte de DNA genômico com uma ou mais enzimas de restrição não é "isolada" para os fins desta invenção. Conforme discutido ainda no presente documento, moléculas de ácido nucleico isoladas, de acordo com a presente invenção, podem ser produzidas de maneira natural, recombinante ou sintética.

[0065] "Polinucleotídeos" podem ser compostos por DNA de fita dupla e única, DNA que é uma mistura de regiões de fita dupla e única, RNA de fita dupla e única, e RNA que é uma mistura de regiões de fita dupla e única, moléculas híbridas que compreendem DNA e RNA que podem ser de fita única ou, mais tipicamente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de fita dupla e única. Além disso, os polinucleotídeos podem ser compostos por de fita tripla regiões de fita tripla que compreendem RNA ou DNA ou tanto RNA quanto DNA. Polinucleotídeos também podem conter uma ou mais bases modificadas ou cadeias principais de DNA ou RNA modificadas para estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns, como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita em DNA e RNA; assim, "polinucleotídeo" — abrange formas química, enzimática ou metabolicamente modificadas.

[0066] A expressão "polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo" abrange um polinucleotídeo que inclui apenas sequência de codificação para o polipeptídeo, assim como um polinucleotídeo que inclui sequência de codificação e/ou não codificação adicional.

[0067] "Condições de hibridização rigorosas" se refere a uma incubação de um dia para o outro a 42 graus C em uma solução que compreende formamida 50%, SSC 5x (NaCl 750 mM, citrato trissódico 75 mM), fosfato de sódio 50 mM (pH 7,6), solução de Denhardt 5x, sulfato de dextrano 10% e DNA de esperma de salmão quebrado e desnaturado 20 pg/ml, seguido por lavagem dos filtros em SSC 0,1xa cerca de 50 graus C. Mudanças na rigorosidade de hibridização e detecção de sinal são principalmente concluídas através da manipulação de concentração de formamida (porcentagens inferiores de formamida resultam em rigorosidade diminuída); condições de sal ou temperatura. Por exemplo, condições de rigorosidade moderadamente alta incluem uma incubação de um dia para o outro a 37 graus C em uma solução que compreende SSPE 6X (SSPE 20X = NaCl 3 M; NaH2PO, 0,2 M; EDTA 0,02 M, pH 7,4), SDS 0,5%, formamida 30%, DNA de bloqueio de esperma de salmão 100 pg/ml; seguido por lavagens a 50 graus C com SSPE 1X, SDS 0,1%. Ainda, para atingir rigorosidade ainda menor, lavagens realizadas depois de hibridização rigorosa podem ser realizadas em concentrações de sal mais altas (por exemplo, SSC 5X). Variações nas condições acima podem ser alcançadas através da inclusão e/ou substituição de reagentes de bloqueio alternativos usados para suprimir os antecedentes em experimentos de hibridização. Reagentes de bloqueio típicos incluem reagente de Denhardt, BLOTTO, heparina, DNA de esperma de salmão desnaturado e formulações proprietárias comercialmente disponíveis. A inclusão de reagentes de bloqueio específicos pode necessitar da modificação das condições de hibridização descritas acima, devido a problemas com compatibilidade.

[0068] Os termos "fragmento", "derivado" e "análogo" quando em referência com os polipeptídeos significam polipeptídeos que retêm substancialmente a mesma função ou atividade biológica que tais polipeptídeos. Um análogo inclui uma pró-proteína que pode ser ativada por clivagem da porção de pró-proteína para produzir um polipeptídeo maduro ativo.

[0069] O termo "gene" significa o segmento de DNA envolvido na produção de uma cadeia de polipeptídeo; o mesmo inclui regiões anteriores e posteriores à região de codificação "principal e atrelada", assim como sequências de intervenção (íntrons) entre segmentos de codificação individuais (éxons).

[0070] Polipeptídeos podem ser compostos de aminoácidos unidos uns aos outros por ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isoésteres de peptídeo, e podem conter aminoácidos diferentes dos aminoácidos codificados por 20 genes. Os polipeptídeos podem ser modificados por processos naturais, como processamento pós-translacional, ou por técnicas de modificação química que são bem conhecidas na arte. Tais modificações são bem descritas nos textos básicos e em monografias mais detalhadas, assim como em uma literatura de pesquisa volumosa. Modificações podem ocorrer em qualquer lugar no polipeptídeo, que incluem a cadeia principal de peptídeo, as cadeias laterais de aminoácido e as terminações amino ou carboxila. Será verificado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente em graus iguais ou variáveis em diversos sítios em um dado polipeptídeo. Além disso, um dado polipeptídeo pode conter muitos tipos de modificações. Polipeptídeos podem ser ramificados, por exemplo, como um resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Polipeptídeos cíclicos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais pós-tradução ou podem ser produzidos por métodos sintéticos. Modificações incluem, porém, sem limitação a acetilação, acilação, biotinilação, ribosilação de ADP, amidação, ligação covalente de flavina, ligação covalente de uma porção química heme, ligação covalente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, ligação covalente de um lipídeo ou derivado de lipídeo, ligação covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, denivatização por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama- carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligante celular, metilação, miristoilação, oxidação, peguilação, processamento proteolítico (por exemplo, clivagem), fosforilação, prenilação, racemização, selenoílação, sulfação, adição mediada por RNA de transferência de aminoácidos a proteínas, como arginilação, e ubiquitinação. (Consultar, por exemplo, PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES, 2º Edição, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, Nova lorque (1993); POSTTRANSLATIONAL COVALENT MODIFICATION OF PROTEINS, B. C. Johnson, Ed,, Academic Press, Nova lorque, páginas 1 a 12 (1983); Seifter et al., Meth Enzymol 182:626 a 646 (1990); Rattan et al., Ann NY Acad Sci 663:48 a 62 (1992).)

[0071] Um fragmento de polipeptídeo "que tem atividade biológica" se refere a polipeptídeos que exibem atividade similar, porém, não necessariamente idêntica a uma atividade do polipeptídeo original, que inclui formas maduras, conforme medido em um ensaio biológico particular, com ou sem dependência de dose. No caso em que a dependência de dose existe, a mesma não precisa ser idêntica àquela do polipeptídeo, porém, em vez disso substancialmente similar à dependência de dose em uma dada atividade em comparação com o polipeptídeo original (isto é, o polipeptídeo candidato exibirá maior atividade ou não mais que cerca de 25 vezes menos e, em algumas modalidades, não mais que cerca de dez vezes menos atividade, ou não mais que cerca de três vezes menos atividade em relação ao polipeptídeo original).

[0072] Espécies homólogas podem ser isoladas e identificadas produzindo-se sondas ou iniciadores adequados a partir das sequências fornecidas no presente documento e analisando-se uma fonte de ácido nucleico adequada para o homólogo desejável.

[0073] "Variante" se refere a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que se difere do polinucleotídeo ou polipeptídeo original, mas que retém propriedades essenciais do mesmo. Em geral, variantes são globalmente bastante similares, e, em muitas regiões, idênticas ao polinucleotídeo ou polipeptídeo original.

[0074] De maneira prática, o caso de qualquer molécula de ácido nucleico ou polipeptídeo particular ser pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico a uma sequência de nucleotídeo da presente invenção, pode ser determinado de maneira convencional com o uso de programas de computador conhecidos. Um método preferencial para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de busca (uma sequência da presente invenção) e uma sequência submetida, também denominada alinhamento de sequência global, pode ser determinado com o uso do programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237 a 245). Em um alinhamento de sequência, as sequências de busca e submetida são ambas sequências de DNA.

Uma sequência de RNA pode ser comparada convertendo-se Us em Ts.

O resultado do dito alinhamento de sequência global está no percentual de identidade.

Parâmetros preferenciais usados em um alinhamento FASTDB de sequências de DNA para calcular o percentual de identidade são: Matriz = Unitária, k-tuplo = 4, Penalidade de Incompatibilidade -- 1, Penalidade de União -- 30, Comprimento de Grupo de Aleatorização = O, Pontuação de Corte = 1, Penalidade de Intervalo -- 5, Penalidade de Tamanho de Intervalo 0,05, Tamanho de Janela = 500 ou o comprimento da sequência de nucleotídeo submetida, qualquer que seja menor.

Se a sequência submetida for mais curta que a sequência de busca devido às deleções de 5' ou 3', não devido às deleções internas, uma correção manual deve ser feita nos resultados.

Isso ocorre devido ao fato de o programa FASTDB não contar os truncamentos de 5' e 3' da sequência submetida ao calcular percentual de identidade.

Para sequências submetidas truncadas nas extremidades de 5' ou 3', com relação à sequência de busca, o percentual de identidade é corrigido calculando-se o número de bases da sequência de busca que são 5' e 3' da sequência submetida, que não estão correspondidas/alinhadas, como um percentual das bases totais da sequência de busca.

A possibilidade de um nucleotídeo estar correspondido/alinhado é determinada por resultados do alinhamento de sequência FASTDB.

Essa porcentagem é, então, subtraída do percentual de identidade, calculada pelo programa FASTDB acima com o uso dos parâmetros especificados, para se chegar a uma pontuação de percentual de identidade final.

Essa pontuação corrigida é a que é usada para os fins da presente invenção.

Apenas bases fora das bases de 5' e 3' da sequência submetida, conforme exibido pelo alinhamento de FASTDB, que não são correspondidas/alinhadas com a sequência de busca, são calculadas para os fins de ajustar manualmente a pontuação de percentual de identidade. Por exemplo, uma sequência submetida de 90 bases está alinhada com uma sequência de busca de 100 bases para determinar o percentual de identidade. As deleções ocorrem na extremidade 5' da sequência submetida e, portanto, o alinhamento de FASTDB não mostra uma correspondência/alinhamento das primeiras 10 bases na extremidade de 5'. As 10 bases prejudicadas representam 10% da sequência (número de bases nas extremidades de 5' e 3' não correspondidas/número total de bases na sequência de busca), assim, 10% são subtraídos da pontuação de percentual de identidade calculada pelo programa FASTDB. Se as 90 bases restantes fossem perfeitamente correspondidas, o percentual de identidade final seria 90%. Em outro exemplo, uma sequência submetida de 90 bases é comparada com uma sequência de busca de 100 bases. Dessa vez as deleções são deleções internas de modo que não haja bases em 5' ou 3' da sequência submetida que não seja correspondida/alinhada com a busca. Nesse caso, o percentual de identidade calculado por FASTDB não é manualmente corrigido. Novamente, apenas bases de 5' e 3' da sequência submetida que não estão correspondidas/alinhadas com a sequência de busca são manualmente corrigidas.

[0075] Por um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos, por exemplo, 95% "idêntica" a uma sequência de aminoácidos de busca da presente invenção, acredita-se que a sequência de aminoácidos do polipeptídeo submetido seja idêntica à sequência de busca exceto pelo fato de que a sequência de polipeptídeos submetida pode incluir até cinco alterações de aminoácido para cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de busca. Em outras palavras, para obter um polipeptídeo que tem uma sequência de aminoácidos pelo menos 95% idêntica a uma sequência de aminoácidos de busca, até 5% dos resíduos de aminoácido na sequência submetida podem ser inseridos, deletados ou substituídos por outro aminoácido. Essas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições de terminal amino ou carbóxi da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer lugar entre essas posições de terminal, intercaladas individualmente entre os resíduos na sequência de referência ou em um ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência.

[0076] De maneira prática, se qualquer polipeptídeo particular for pelo menos 80%, 85%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% idêntico, por exemplo, às sequências de aminoácidos mostradas em uma sequência ou à sequência de aminoácidos codificada por clone de DNA depositado pode ser determinado convencionalmente com o uso de programas de computador conhecidos. Um método preferencial para determinar a melhor correspondência global entre uma sequência de busca (uma sequência da presente invenção) e uma sequência submetida, também denominada alinhamento de sequência global, pode ser determinado com o uso do programa de computador FASTDB com base no algoritmo de Brutlag et al. (Comp. App. Biosci. (1990) 6:237 a 245). Em um alinhamento de sequência, as sequências de busca e submetidas são ambas sequências de nucleotídeo ou ambas sequências de aminoácidos. O resultado do dito alinhamento de sequência global está no percentual de identidade. Parâmetros preferenciais usados em um alinhamento de aminoácido de FASTDB são: Matriz = PAM O, k-tuplo = 2, Penalidade de Incompatibilidade -- 1, Penalidade de União = 20, Comprimento de Grupo de Aleatorização = O, Pontuação de Corte = 1, Tamanho de Janela = comprimento de sequência, Penalidade de Intervalo -- 5, Penalidade de Tamanho de Intervalo -- 0,05, Tamanho de Janela = 500 ou o comprimento da sequência de aminoácidos submetida, qualquer que seja menor. Se a sequência submetida for mais curta que a sequência de busca devido às deleções de terminal N ou C, não devido às deleções internas, uma correção manual deve ser feita nos resultados. Isso ocorre devido ao programa FASTDB não contar os truncamentos de terminal N e C da sequência submetida ao calcular o percentual de identidade global. Para sequências submetidas truncadas nos terminais N e C, com relação à sequência de busca, o percentual de identidade é corrigido calculando- se o número de resíduos da sequência de busca que são os terminais N e C da sequência submetida, que não são correspondidos/alinhados com um resíduo submetido correspondente, como um percentual das bases totais da sequência de busca. Se um resíduo estiver correspondido/alinhado é determinado por resultados do alinhamento de sequência FASTDB. Essa porcentagem é, então, subtraída do percentual de identidade, calculada pelo programa FASTDB acima com o uso dos parâmetros especificados, para se chegar a uma pontuação de percentual de identidade final. Essa pontuação de percentual de identidade final é a que é usada para os fins da presente invenção. Apenas resíduos para os terminais N e C da sequência submetida, que não são correspondidos/alinhados com a sequência de busca, são considerados para os fins de ajustar manualmente a pontuação de percentual de identidade. Isto é, apenas posições de resíduo de busca fora dos resíduos de terminal N e C mais afastados da sequência submetida. Apenas as posições de resíduo fora das extremidades de terminal N e C da sequência submetida, conforme exibido no alinhamento de FASTDB, que não são correspondidas/alinhadas com a sequência de busca são manualmente corrigidas. Nenhuma outra correção manual deve ser feita para os fins da presente invenção.

[0077] Variantes de proteina de ocorrência natural são denominadas "variantes alélicas", e se referem a uma dentre diversas formas alternativas de um gene ocupar um dado local em um cromossomo de um organismo. (Genes 11, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nova lorque (1985).) Essas variantes alélicas podem variar no nível de polinucleotídeo e/ou polipeptídeo. Alternativamente, variantes de ocorrência não natural podem ser produzidas por técnicas de mutagênese ou por síntese direta.

[0078] "Marcação" se refere a agentes que têm capacidade de fornecer um sinal detectável, seja diretamente ou através de interação com um ou mais membros adicionais de um sistema de produção de sinal. Marcações que são diretamente detectáveis e podem ser úteis na invenção incluem marcações fluorescentes. Fluoróforos específicos incluem fluoresceína, rodamina, BODIPY, corantes de cianina e similares.

[0079] Uma "marcação fluorescente" se refere a qualquer marcação com a habilidade para emitir luz de um determinado comprimento de onda quando ativada por luz de outro comprimento de onda.

[0080] "Fluorescência" se refere a qualquer característica detectável de um sinal fluorescente, que inclui intensidade, espectro, comprimento de onda, distribuição intracelular, etc.

[0081] "Detectar" fluorescência se refere a avaliar a fluorescência de uma célula com o uso de métodos qualitativos ou quantitativos. Em algumas das modalidades da presente invenção, fluorescência será detectada de uma maneira qualitativa. Em outras palavras, o marcador fluorescente está presente, o que indica que a proteína de fusão recombinante é expressada, ou não. Em outros casos, a fluorescência pode ser determinada com o uso de meios quantitativos, por exemplo, medir a intensidade de fluorescência, espectro ou distribuição intracelular, o que permite a comparação estatística de valores obtidos sob diferentes condições. O nível também pode ser determinado com o uso de métodos qualitativos, como a análise visual e comparação por um ser humano de múltiplas amostras, por exemplo, amostras detectadas com o uso de um microscópio fluorescente ou outro detector óptico (por exemplo, sistema de análise de imagem, etc.). Uma

"alteração" ou "modulação" em fluorescência se refere a qualquer diferença detectável na intensidade, distribuição intracelular, espectro, comprimento de onda ou outro aspecto de fluorescência sob uma condição particular em comparação com outra condição. Por exemplo, uma "alteração" ou "modulação" é detectada quantitativamente, e a diferença é uma diferença estatisticamente significativa. Quaisquer "alterações" ou "modulações" em fluorescência podem ser detectadas com o uso de instrumentação padrão, como um microscópio fluorescente, CCD, ou qualquer outro detector fluorescente, e podem ser detectadas com o uso de um sistema automatizado, como os sistemas integrados, ou podem refletir uma detecção subjetiva de uma alteração por um observador humano.

[0082] A "proteína verde fluorescente" (GFP) é uma proteína, composta por 238 aminoácidos (26,9 kDa), originalmente isolada de Aequorea victoria/Aequorea aequorea/Aequorea forskalea de água-viva que fluoresce verde quando exposta à luz azul. A GFP de A. victoria tem um pico de excitação maior em um comprimento de onda de 395 nm e um menor em 475 nm. Seu pico de emissão está em 509 nm que está na porção verde inferior do espectro visível. A GFP da amor-perfeito do mar (Renilla reniformis) tem um único pico de excitação maior a 498 nm. Devido ao potencial para uso difundido e as necessidades progressivas de pesquisadores, diversos mutantes diferentes de GFP foram projetados. O primeiro melhoramento principal foi uma mutação de ponto único (S65T) relatada em 1995 em Nature por Roger Tsien. Essa mutação melhorou drasticamente as características espectrais de GFP, resultando em fluorescência aumentada, fotoestablilidade e uma alteração do pico de excitação maior para 488 nm com o pico de emissão mantido a 509 nm. A adição do mutante de ponto de eficiência de dobragem a 37ºC (F64L) a esse arcabouço rendeu GFP aprimorado (EGFP). EGFP tem um coeficiente de extinção (indicado por e), também conhecido como seu corte transversal óptico de 9,13 x 10-21 m?/molécula, também citado como 55.000 L/(mol:cm). Superfolder GFP, uma série de mutações que permite que GFP rapidamente dobre e amadureça mesmo quando fundida em peptídeos fracamente dobráveis, foi relatada em 2006.

[0083] A "proteína fluorescente amarela" (YFP) é um mutante genético da proteína fluorescente verde, derivada de Aequorea victoria. Seu pico de excitação é 514 nm e seu pico de emissão é 527 nm.

[0084] Conforme usado no presente documento, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem referentes plurais, a menos que o contexto dite claramente o contrário.

[0085] Um "vírus" é um agente infeccioso submicroscópico que não tem capacidade de cultivar ou reproduzir fora de uma célula hospedeira. Cada partícula viral, ou vírion, consiste em material genético, DNA ou RNA, dentro de um revestimento de proteína protetora denominado um capsídeo. O formato de capsídeo varia de formas helicoidal simples e icosaédricas (poliédrico ou próximo a esférico), para estruturas mais complexas com caudas ou um envelope. Vírus infeccionam formas de vida celular e estão agrupados em tipos animal, vegetal e bacteriano, de acordo com o tipo de hospedeiro infectado.

[0086] O termo "vírus transsináptico" conforme usado no presente documento se refere a vírus que têm capacidade para migrar de um neurônio para outro, conectando o neurônio através de uma sinapse. Exemplos de tais vírus transsinápticos são rabdovírus, por exemplo, vírus da raiva, e alfa-herpes-vírus, por exemplo, vírus da pseudorraiva ou herpes simples. O termo "vírus transsináptico" conforme usado no presente documento também engloba subunidades virais que têm, por si só, a capacidade de migrar de um neurônio para outro, conectando o neurônio através de uma sinapse e vetores biológicos, tais como vírus modificados, que incorporam tal subunidade e demonstram uma capacidade de migrar de um neurônio para outro, conectando o neurônio através de uma sinapse.

[0087] A migração transsináptica pode ser anterógrada ou retrógrada. Durante uma migração retrógrada, um vírus se deslocará de um neurônio pós-sináptico para um pré-sináptico. Consequentemente, durante migração anterógrada, um vírus se deslocará de um neurônio pré-sináptico para um pós-sináptico.

[0088] Homólogos se referem a proteínas que compartilham um ancestral em comum. Análogos não compartilham um ancestral em comum, porém, têm alguma similaridade funcional (em vez de estrutural) que faz com que sejam incluídos em uma classe (por exemplo, proteinases de serina similares a tripsina e subtilisina claramente não estão relacionadas - suas estruturas fora do sítio ativo são completamente diferentes, porém, têm sítios ativos virtual e geometricamente idênticos e, assim, são consideradas um exemplo de evolução convergente para análogos).

[0089] Há duas subclasses de homólogos - ortólogos e parálogos. Ortólogos são o mesmo gene (por exemplo, citocromo 'c'), em diferentes espécies. Dois genes no mesmo organismo não podem ser ortólogos. Parálogos são os resultados de duplicação de gene (por exemplo, beta e delta hemoglobina). Se dois genes/proteínas são homólogos e estão no mesmo organismo, os mesmos são parálogos.

[0090] Conforme usado no presente documento, o termo "distúrbio" se refere a uma enfermidade, doença, malignidade, afecção clínica ou afecção patológica.

[0091] Conforme usado no presente documento, o termo "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um meio veículo que não interfere na eficácia da atividade biológica do ingrediente ativo, é quimicamente inerte e não é tóxico para o paciente ao qual é administrado.

[0092] Conforme usado no presente documento, o termo "derivado farmaceuticamente aceitável" se refere a qualquer homólogo, análogo, ou fragmento de um agente, por exemplo, identificado com o uso de um método de avaliação da invenção, que é relativamente não tóxico ao indivíduo.

[0093] O termo "agente terapêutico" se refere a qualquer molécula, composto, ou tratamento, que auxilia na prevenção ou tratamento de distúrbios, ou complicações de distúrbios.

[0094] Composições que compreendem tal agente formulado em um veículo farmacêutico compatível podem ser preparadas, embaladas e marcadas para tratamento.

[0095] Se o complexo for solúvel em água, então o mesmo pode ser formulado em um tampão apropriado, por exemplo, solução salina tamponada de fosfato ou outras soluções fisiologicamente compatíveis.

[0096] Alternativamente, se o complexo resultante tem fraca solubilidade em solventes aquosos, então, o mesmo pode ser formulado com um tensoativo não iônico, tal como Tween, ou polietilenoglicol. Assim, os compostos e seus solvatos fisiologicamente aceitáveis podem ser formulados para administração através de inalação ou insuflação (através da boca ou do nariz) ou administração oral, bucal, parenteral, retal ou, no caso de tumores, diretamente injetados em um tumor sólido.

[0097] Para administração oral, a preparação farmacêutica pode estar na forma líquida, por exemplo, soluções, xaropes ou suspensões, ou pode ser apresentada como um produto de fármaco para reconstituição com água ou outro veículo adequado antes do uso. Tais preparações líquidas podem ser preparadas por meios convencionais com aditivos farmaceuticamente aceitáveis, como agentes de suspensão (por exemplo, xarope de sorbitol, derivados de celulose ou gorduras hidrogenadas comestíveis); agentes emulsificantes (por exemplo, lecitina ou acácia); veículos não aquosos (por exemplo, óleo de amêndoa, ésteres oleosos ou óleos vegetais fracionados); e conservantes (por exemplo, metila ou propil-p-hidroxibenzoatos ou ácido sórbico). As composições farmacêuticas podem assumir a forma de, por exemplo, comprimidos ou cápsulas preparados por meios convencionais com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes de ligação (por exemplo, amido de mais pré-gelatinizado, polivinilpirrolidona ou hidroxipropilmetilcelulose); cargas (por exemplo, lactose, celulose microcristalina ou hidrogenofosfato de cálcio); lubrificantes (por exemplo, estearato de magnésio, talco ou sílica); desintegrantes (por exemplo, amido de batata ou glicolato de amido de sódio); ou agentes umectantes (por exemplo, lauril sulfato de sódio). Os comprimidos podem ser revestidos por métodos bem conhecidos na técnica.

[0098] Preparações para administração oral podem ser adequadamente formuladas para gerar liberação controlada do composto ativo.

[0099] Os compostos podem ser formulados para administração parenteral por injeção, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com um conservante adicionado.

[0100] As composições podem assumir tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos, e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, estabilização e/ou distribuição. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar na forma de pó para a constituição com um veículo adequado, por exemplo, água livre de pirogênio estéril, antes do uso.

[0101] Os compostos também podem ser formulados como uma aplicação tópica, como um creme ou loção.

[0102] Além das formulações descritas anteriormente, os compostos também podem ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de longa atuação podem ser administradas por implantação (por exemplo, intraocular, subcutânea ou intramuscular) ou por injeção intraocular.

[0103] Desse modo, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou como derivados solúveis com moderação, por exemplo, como um sal solúvel com moderação. Lipossomos e emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos ou veículos de entrega para fármacos hidrofílicos.

[0104] As composições podem, se desejável, ser apresentadas em uma embalagem ou dispositivo de distribuição que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária que contêm o ingrediente ativo. À embalagem pode, por exemplo, compreender folha de metal ou plástico, tal como uma embalagem alveolar. A embalagem ou dispositivo de distribuição pode estar acompanhado por instruções para administração.

[0105] A invenção também fornece kits para executar os regimes terapêuticos da invenção. Tais kits compreendem em um ou mais recipientes quantidades terapêutica ou profilaticamente eficazes das composições em forma farmaceuticamente aceitável.

[0106] A composição em um frasco de um kit pode estar na forma de uma solução farmaceuticamente aceitável, por exemplo, em combinação com solução salina estéril, solução de dextrose ou solução tamponada, ou outro fluido estéril farmaceuticamente aceitável. Alternativamente, o complexo pode ser liofilizado ou desidratado; nesse caso, o kit compreende de modo opcionalmente adicional em um recipiente uma solução farmaceuticamente aceitável (por exemplo, solução salina, solução de dextrose, etc.), preferencialmente estéril, para reconstituir o complexo para formar uma solução para fins de injeção.

[0107] Em outra modalidade, um kit compreende, ainda, uma agulha ou seringa, preferencialmente embalada na forma estéril, para injetar o complexo e/ou um coxim de álcool embalado. Instruções estão opcionalmente incluídas para administração de composições por um médico ou pelo paciente.

[0108] Uma "célula ganglionar retinal" (RGC) é um tipo de neurônio localizado próximo à superfície interna (a camada celular ganglionar) da retina do olho. A mesma recebe informações visuais a partir de fotorreceptores por meio de dois tipos neuronais intermediários: células bipolares e células amácrinas retinais. As células ganglionares retinais transmitem coletivamente as informações visuais formadoras de imagem e não formadoras de imagem da retina na forma de potencial de ação para diversas regiões no tálamo, hipotálamo e mesencéfalo, ou cérebro intermediário. As células ganglionares retinais variam significativamente em termos de seu tamanho, conexões e respostas a estímulos visuais, mas todos compartilham a propriedade definidora de ter um axônio longo que se estende no cérebro. Os axônios formam o nervo óptico, quiasma óptico e trato óptico. Uma porcentagem pequena de células ganglionares retinais contribuem pouco ou nada para a visão, mas os mesmos são fotossensíveis; seus axônios formam o trato retino- hipotalâmico e contribuem para ritmos circadianos e reflexo da pupila à luz, o redimensionamento da pupila.

[0109] A menos que definido de outra maneira, todos os termos técnicos e científicos usados no presente documento têm o mesmo significado do comumente entendido por um indivíduo de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Embora métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos no presente documento possam ser usados na prática ou teste da presente invenção, os métodos e materiais adequados são descritos abaixo. No caso de conflito, o presente relatório descritivo, que inclui definições, prevalecerá. Além disso, os materiais, métodos e exemplos são apenas ilustrativos e não se destinam a ser limitantes.

EXEMPLOS Construto de vetor

[0110] O promotor sintético usado nesse estudo (1317 bp; SEQ ID NO:1) foi gerado por montagem ordenada de elementos de DNA filogeneticamente conservados identificados em uma sequência de nucleotídeo que precede o sítio de iniciação de transcrição de genes Pde6h, Pde6c, Cngb3, Fabp7, Gngt2, Ppm1j, Gckr, Igj, Arhgadib, Clca3, Len2. A sequência de codificação ChR2-GFP foi inserida imediatamente após esse promotor e a sequência Kozak otimizada (GCCACC), e seguido por um elemento regulador pós-transcrição de vírus de hepatite de marmota (WPRE) e sítio de poliadenilação SV40. Os neurônios retinais primatas não humanos foram alvejados com o uso de AAV serotipo BP2 com um título de 4,27E+13 GC/ml. Transfecção viral e preparação de tecido

[0111] A administração de AAV foi realizada em colaboração com um oftamologista e um contratador de terceiros em Kunming, China. Os macacos rhesus foram anestesiados com cetamina e fenobarbital sódico. Dois túneis de punção foram criados com o uso de uma agulha de punção de calibre 25, os quais foram localizados na região nasal e da esclera temporal, respectivamente. Uma fibra de iluminação foi injetada na câmara vítrea através de um túnel, e 50ul de AAV foram injetados de modo subretinal com o uso de uma agulha de calibre 30 montada em seringa Hamilton através do segundo túnel. Após 3 meses, as retinas isoladas foram fixadas por 30 min em PFA 4% em PBS, seguidas por uma etapa de lavagem em PBS a 4ºC. As retinas inteiras foram tratadas com soro de asno normal 10% (NDS), BSA 1%, Triton X- 100 0,5% em PBS por 1 h à temperatura ambiente. O tratamento com

Ab anti-GFP de rato monoclonal (Molecular Probes Inc.; 1:500) em NDS 3%, BSA 1%, Triton X-100 0,5% em PBS foi executado por 5 dias à temperatura ambiente.

O tratamento com Ab Alexa Fluor-488 antirrato de burro secundário (Molecular Probes Inc.; 1:200) foi feito por 2 h.

Seções foram lavadas, montadas com reagente antifade ProLong Gold (Molecular Probes Inc.) em lâminas de vidro e fotografadas com o uso de um microscópio confocal de varredura a laser Zeiss LSM 700 Axio Imager Z2 (Carl Zeiss Inc.).

Claims (12)

REIVINDICAÇÕES

1. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que compreende, ou que consiste em, a sequência de ácidos nucleicos da SEQ ID NO:1, ou que consiste em uma sequência de ácidos nucleicos de pelo menos 1000 bp que tem pelo menos 80% de identidade em relação à dita sequência da SEQ ID NO:1, em que a dita molécula de ácido nucleico isolado leva à expressão específica de um gene em células do epitélio de pigmento retinal quando uma codificação de sequência de ácidos nucleicos para o dito gene é operativamente ligada à dita molécula de ácido nucleico isolado.

2. Molécula de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um promotor mínimo, por exemplo, o promotor mínimo da SEQ ID NO:2.

3. Molécula de ácido nucleico isolado, caracterizada pelo fato de que compreende uma sequência que hibridiza sob condições rigorosas em relação a uma molécula de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2.

4. Cassete de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende, como uma expressão de gene promotora de elemento em células específicas, um ácido nucleico isolado, como definido na reivindicação 1 ou 2, em que o dito ácido nucleico isolado é operativamente ligado a pelo menos uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um gene a ser expresso especificamente em células do epitélio de pigmento retinal.

5. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o cassete de expressão, como definido na reivindicação 4.

6. Vetor, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o vetor é um vetor viral.

7. Uso de um ácido nucleico, como definido na reivindicação 1 ou 2, de um cassete de expressão, como definido na reivindicação 4, ou de um vetor, como definido na reivindicação 5, caracterizado por ser para expressão de um gene em células do epitélio de pigmento retinal.

8. Método de expressar um gene em células do epitélio de pigmento retinal, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de transfectar uma célula isolada, uma linhagem celular ou uma população celular com um cassete de expressão, como definido na reivindicação 4, em que o gene a ser expresso será especificamente expresso pela célula isolada, pela linhagem celular ou pela população celular se a dita célula for, ou as ditas células compreenderem, células do epitélio de pigmento retinal.

9. Célula isolada, caracterizada pelo fato de que compreende o cassete de expressão, como definido na reivindicação 4 ou o vetor, como definido na reivindicação 5.

10. Célula, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o cassete de expressão ou o vetor é estavelmente integrado no genoma da dita célula.

11. Molécula de ácido nucleico isolado, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, cassete de expressão, de acordo com a reivindicação 4, vetor, de acordo com a reivindicação 5, uso, de acordo com a reivindicação 7, método, de acordo com a reivindicação 8, ou célula, de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo fato de que o produto do gene é uma molécula sensível à luz, por exemplo, halorrodopsina ou rodopsina de canal.

12. Kit para expressar gene em células do epitélio de pigmento retinal, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico isolado, como definida na reivindicação 1 ou

2.

Células de epitélio pigmentado retinado (EGFP) Hoechst 4 e) CARA So 4 O IRA e” à POSSE | 10um Figura 1