PL208368B1 - Sposób diagnozowania jaskry - Google Patents

Sposób diagnozowania jaskry

Info

Publication number
PL208368B1
PL208368B1 PL362437A PL36243701A PL208368B1 PL 208368 B1 PL208368 B1 PL 208368B1 PL 362437 A PL362437 A PL 362437A PL 36243701 A PL36243701 A PL 36243701A PL 208368 B1 PL208368 B1 PL 208368B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
frp
gene
cells
wnt
protein
Prior art date
Application number
PL362437A
Other languages
English (en)
Other versions
PL362437A1 (pl
Inventor
Abbot F. Clark
John Fingert
Lorette Mcnatt
Edwin M. Stone
Wan-Heng Wang
Original Assignee
Alcon Inc
Univ Iowa Res Found
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alcon Inc, Univ Iowa Res Found filed Critical Alcon Inc
Publication of PL362437A1 publication Critical patent/PL362437A1/pl
Publication of PL208368B1 publication Critical patent/PL208368B1/pl

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/48—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase
    • C12Q1/485—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving transferase involving kinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
    • G01N33/5041—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects involving analysis of members of signalling pathways
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/16—Ophthalmology
    • G01N2800/168—Glaucoma

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób diagnozowania jaskry.
Jaskra jest to grupa chorób oczu, charakteryzująca się występowaniem zwyrodnienia nerwu wzrokowego. Jest to jedna z najczęstszych przyczyn ślepoty w skali światowej. Jednym z głównych czynników ryzyka w przypadku jaskry jest obciążająca historia rodzinna. Opisano dotąd kilka różnych postaci jaskry.
Pierwotna jaskra wrodzona lub dziecięca jest chorobą dziedziczną, charakteryzującą się nieprawidłowym rozwojem systemu odpływu cieczy wodnistej w oku, co prowadzi do zwiększenia ciśnienia wewnątrzgałkowego, powiększenia rogówki (tj. woloocza), zniszczenia nerwu wzrokowego i, ostatecznie, do upośledzenia wzroku.
Pierwotna jaskra z otwartym kątem przesączania (POAG, ang. primary open angle glaucoma) jest dość powszechnie występującą chorobą charakteryzującą się zanikiem nerwu wzrokowego, co prowadzi do utraty pola widzenia i ostatecznie do ślepoty. W zależności od wieku wystąpienia pierwszych objawów choroby oraz różnic w obrazie klinicznym, POAG dzieli się na dwie główne grupy. Młodzieńcza postać POAG objawia się zazwyczaj w okresie późno dziecięcym lub w początkowym okresie życia dorosłego. Przebieg choroby jest szybki i ciężki z wysokim ciśnieniem wewnątrzgałkowym. Ten rodzaj POAG słabo odpowiada na leczenie i wymaga zwykle przeprowadzenia zabiegu chirurgicznego. Dorosła lub późna postać POAG jest najczęstszą postacią jaskry. Jest to postać łagodniejsza i rozwija się bardziej stopniowo niż postać młodzieńcza POAG ze zmiennym początkiem zwykle po ukończeniu 40 lat życia. Ta postać POAG związana jest z lekkim do umiarkowanego wzrostem ciśnienia wewnątrzgałkowego i często odpowiada satysfakcjonująco na regularnie monitorowane leczenie. Niestety, wykrycie choroby może się opóźniać aż do momentu wystąpienia nieodwracalnego uszkodzenia nerwu wzrokowego, co związane jest z faktem bezbolesnego i stopniowego przebiegu choroby.
Obie postacie POAG związane są często z podwyższonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym, co jest skutkiem zahamowania odpływu cieczy wodnistej przez siateczkę włókien kolagenowych w kącie przesączania oka. Patofizjologia nieprawidłowego rozwoju ludzkiej siateczki włókien kolagenowych w kącie przesą czania oka (HTM, ang. human trabecular meshwork) w POAG charakteryzuje się wzrostem obecności składników substancji zewnątrzkomórkowej i spadkiem liczby komórek siateczki włókien kolagenowych. Jest zatem prawdopodobne, że zaburzenie struktury, funkcji i liczby komórek HTM wpływa na patogenezę POAG. Patofizjologia POAG obejmuje także komórki ludzkiej blaszki sitowej (HLC, ang. human lamina cribrosa), dla której wzór ekspresji białek jest zbliżony do HTM (Steely i wsp. (2000) Exp Eye Res 70:17-30). Zgodnie z tym, POAG może mieć swój początek przyczynowy w dwóch tkankach, najbardziej odpowiedzialnych za uszkodzenia siatkówki nerwowej. Dlatego też bardzo ważne będzie zidentyfikowanie i zrozumienie mechanizmów kontroli komórkowej w HTM i HLC, co umoż liwić moż e zrozumienie molekularnej etiologii POAG i identyfikacj ę unikalnych modulatorów leczenia.
W hodowlach komórek HTM obserwuje się ekspresję mRNA dla licznych receptorów czynników wzrostu. Ponadto wykazano, że te wyrażone receptory być są funkcjonalne, gdyż podanie egzogennych czynników wzrostu wywołuje odpowiednią reakcję fizjologiczną (Wordinger i wsp. (1998) Invest Ophtalmol Vis Sci 39: 1575-89). W sytuacji in vivo, receptory te mogą być aktywowane przez czynniki wzrostu obecne w cieczy wodnistej oka (sygnał autokrynny/parakrynny) lub przez czynniki wzrostu syntetyzowane i uwalniane lokalnie przez same komórki siateczki włókien kolagenowych (sygnał autokrynny). Rzeczywiście, wykazano, że izoformy TGF-b znacząco hamują stymulowaną przez EGF proliferację komórek siateczki włókien kolagenowych, podczas gdy FGF-1, TGF-a, EGF, IL-1a, Il-1b, HGF, TNF-a, PDGF-AA, oraz IGF-1 istotnie stymulują zewnątrzkomórkowe zakwaszenie (ibid.). Swoiste czynniki wzrostu, działające przez receptory o wysokim powinowactwie, mogą brać udział w utrzymywaniu prawidłowego mikrośrodowiska HTM i mogą też uczestniczyć w patogenezie POAG.
Pewną wiedzę o molekularnej patologii uzyskać też można z obserwacji glukokortykoidów, które mogą wywoływać nadciśnienie wewnątrzgałkowe zarówno u zwierząt, jak i u ludzi, a także mogą zmieniać strukturę cytoszkieletu komórek HTM w hodowli (Wilson i wsp. (1993) Current Eye Res 12:783-93). Te zmiany cytoszkieletu obejmują reorganizację mikrofilamentów aktynowych w usieciowaną strukturę CLAN (ang. cross-linked actin network) i to właśnie przekształcenie strukturalne może być ostateczną zmianą wywołującą nadciśnienie wewnątrzgałkowe (Clark i wsp. (1993) J Glaucoma 4:183-88). Rzeczywiście, obniżający ciśnienie steroid tetrahydrokortyzol, który pokazał, że obniża
PL 208 368 B1 ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP) w nadciśnieniu wewnątrzgałkowym indukowanym glukokortykoidem, wydaje się też hamować wywołane działaniem glukokortykoidu zmiany w cytoszkielecie HTM (Clark i wsp. (1996) Inv Ophtal & Vis Sci 37: 805-813).
W patentach USA nr 5925748, 5916778 oraz 5885776 ujawniono sposoby diagnozowania jaskry związanej z mutacjami w genie GLC1A i testy identyfikujące leki modulujące aktywność białka
MYOC, kodowanego przez gen GLC1A.
Szlak sygnałowy Wnt
Geny z rodziny Wnt kodują sekrecyjne białka ligandowe, odgrywające kluczową rolę w różnicowaniu i rozwoju. Rodzina ta obejmuje przynajmniej 15genów kręgowców i bezkręgowców, łącznie z genem polaryzacji segmentów wingless u Drosophila - muszki owocowej i jednym z jego homologów u kręgowców - genem integrated, od których wywodzi się nazwa Wnt. Białka Wnt okazało się, że ułatwiają szereg procesów rozwojowych i homeostatycznych. Na przykład, okazało się, że Wnt1 kręgowców bierze udział w indukowaniu tworzenia miotomu wewnątrz somitów i w ustanawianiu granic śródmózgowia (patrz McMahon i Bradley (1990) Cell 62: 1073; Ku i Melton (1993) Development 119:1161; Stern i wsp. (1995) Development 121: 3675). Podczas gastrulacji u ssaków Wnt3a, Wnt5a oraz Wnt5b ulegają ekspresji w różnych, ale zachodzących na siebie regionach w obrębie smugi pierwotnej. Wnt3a jest jedynym białkiem Wnt obserwowanym w tych regionach smugi, które tworzy później grzbietową (somitową) mezodermę, a u myszy homozygotycznych względem allelu null w genie Wnt3a brak jest somitów za kończynami przednimi w kierunku ogona. Geny Wnt są również ważne dla ustanowienia procesu polaryzacji kończyn kręgowców, w sposób analogiczny do roli bezkręgowcowego homologa wingless w ustanawianiu polaryzacji podczas rozwoju kończyn owadzich. W obu przypadkach obserwuje się również oddziaływanie z białkami z rodziny Hedgehog.
Szlak sygnałowy Wnt obejmuje szereg białek biorących udział w przetwarzaniu sygnałowym Wnt/wingless i jest blisko związany ze szlakiem rozwojowym hedgehog. U muszki owocowej sekrecyjne białko wingless pośredniczy we wzajemnym oddziaływaniu między komórkami w szlaku wingless-hedgehog, przyłączając się do sąsiednich komórek przez receptor Frizzled. Receptor Frizzled aktywuje następnie białko Dishelveled, które blokuje działanie inhibicyjne kinazy Zeste-white-3 wobec białka Armadillo (białka beta-kateniny). Aktywne białko Armadillo współdziała z białkiem LEF/TCF (ang. Lymphoid Enhancer Factor/T-Cell Factor) z wysoce mobilnej grupy HMG (ang. high mobility group), promując ekspresję jądrową genu hedgehog (hh). Hedgehog jest białkiem sekrecyjnym, które wiąże się z komórkami przylegającymi do komórki aktywowanej przez Wnt/wringless przez inny receptor, białko Patched. Wiązanie się białka Hedgehog z receptorem Patched aktywuje ekspresję jądrową białka wingless, które jest następnie wydzielane i dalej wzmacnia wzajemne oddziaływanie sygnałowe z sąsiednią komórką wydzielającą białko hedgehog. Wzajemnie oddziałujący system sygnałowy Wnt/Wingless-Hedgehog ułatwia w ten sposób określenie procesu różnicowania dwóch sąsiednich komórek podczas rozwoju kręgowców i bezkręgowców. Prowadzi to do stabilizacji zróżnicowanej granicy, w której tkanka z jednej strony wydziela białko Hedgehog, a tkanka z drugiej strony produkuje Wingless. Istotnie, powierzchnie komórek pełnią niezwykle decydującą rolę w procesach rozwoju i homeostazy, wpływając na zróżnicowane przyleganie jednej komórki do drugiej, oraz przyleganie komórek do macierzy zewnątrzkomórkowej. Ponadto, po zajściu procesu zróżnicowanego przylegania komórek, działanie procesów Wnt/Wingless-Hedgehog ułatwia ciągłą sygnalizację pomiędzy sąsiednimi warstwami komórek.
Granica Wnt/Wingless odgrywa kluczową rolę w wytwarzaniu segmentów i przydatków u muszki owocowej, a także podziału mózgu i kończyn u ssaków (Ingham (1994) Curr Biol 4: 1; Niswander i wsp. (1994) Nature 371: 609; Wilder i Perrimon (1995) Development 121:477). U Xenopus, receptor frizzled-2 (xfz2) ulega wzmocnionej ekspresji po procesie gastrulacji w zaczątku oka i w pęcherzyku usznym (Deardorf i Klein (1999) Mech Dev 87: 229), natomiast u kury wykazano, że szczególny członek z rodziny genów Wnt, Wnt13, ulega ekspresji w proliferującym nabłonku soczewek i w pigmentowanych i niepigmentowanych warstwach brzegu rzęskowego (Jasoni i wsp. (1999) Dev Dyn 215: 215). Szlak wzajemnego oddziaływania Wnt/Wingless-Hedgehog może również odgrywać rolę w utrzymywaniu prawidłowo zróżnicowanej tkanki somatycznej. Na przykład, u ludzi, sporadyczne mutacje typu utraty funkcji w genie patched w tkankach somatycznych wywołują raka podstawnokomórkowego, najczęstszą postać raka u człowieka.
Ponadto, dziedziczne mutacje w genie patched prowadzą do wystąpienia zespołu znamieniowatych nabłoniaków podstawnokomórkowych, choroby o dziedziczeniu autosomalnym dominującym,
PL 208 368 B1 charakteryzującej się zaburzeniami rozwoju, w tym, zmian żeber i twarzy i złośliwymi nowotworami (Hahn i wsp. (1996) Cell 85: 841; Johnson i wsp. (1996) Science 272: 1668).
Wykazano niedawno, że białko homologiczne do receptora Wnt Frizzled u ssaka, nazwane wydzielanym albo rozpuszczalnym białkiem spokrewnionym z białkiem frizzled 5 (SFRP5,) jest preferencyjnie wyrażane w nabłonku barwnikowym siatkówki (, RPE) u kręgowców (Chang i wsp. (1999) Hum Mol Genet 8: 575). Ponadto wykazano również, że inne białko SFRP, a mianowicie SFRP2, ulega swoistej ekspresji w komórkach wewnętrznej warstwy jądrowej. W wyniku tego, komórki fotoreceptorowe siatkówki są wystawione na działanie dwóch odwrotnych gradientów cząsteczek SFRP. Ponieważ białka spokrewnione z Frizzled nie zawierają domen transbłonowych, uważa się, że są to sekrecyjne, rozpuszczalne postaci receptora, który interferuje ze szlakiem sygnałowym Wnt przez normalny, zawierający siedem domen transbłonowych receptor Frizzled. Rzeczywiście, białko FrzA, będące białkiem sFRP, które ulega podwyższonej ekspresji w śródbłonku naczyniowym i szeregu tkanek nabłonkowych, wiąże się swoiście z białkiem Wnt-1, blokując w ten sposób szlak sygnałowy Wnt-1 przebiegający przez receptor Frizzled (Dennis i wsp. (1999) J Cell Sci 112: 3815).
Sposób diagnozowania jaskry według wynalazku obejmuje wykrywanie poziomu ekspresji mRNA kodującego ludzkie białko spokrewnione z białkiem frizzled-1 (FRP-1), którego sekwencję aminokwasową przedstawiono w Sekw. Id. Nr:2, w próbce pacjenta z komórek siatki włókien kolagenowych w kącie przesączania oka (TM), przy czym wykrywanie obejmuje wykorzystanie testu hybrydyzacji z zastosowaniem sondy kwasu nukleinowego swoiś cie hybrydyzują cej z mRNA kodującym FRP-1, a zaburzony wyższy poziom mRNA w stosunku do poziomu u osoby zdrowej stanowi diagnozę stanu jaskry.
Korzystnie poziom ekspresji mRNA kodującego FRP-1 określa się przez wykrycie tworzenia się kompleksu mRNA i sondy kwasu nukleinowego, która swoiście hybrydyzuje z mRNA.
Korzystnie sonda kwasu nukleinowego jest znakowana fluorescencyjnie.
Informacja uzyskana sposobem według wynalazku jest przydatna do określenia, czy należy się spodziewać, że osoba niewykazująca objawów choroby ma jaskrę. Dodatkowo, informacja ta może pozwolić na wprowadzenie bardziej rutynowego podejścia do zapobiegania lub leczenia choroby.
Jeśli u pacjenta poddanego diagnozowaniu sposobem według wynalazku wykryje się jaskrę, można go leczyć związkami chemicznymi, które przetestowano w warunkach in vitro i in vivo, umożliwiających potwierdzenie, że związki te nadają się do leczenia lub zapobiegania jaskrze. Szczególnie korzystnie związki chemiczne stosowane jako leki promują sygnalizację Wnt.
W jednym z wykonań , sposób testowania związków przydatnych jako leki przeciw jaskrze obejmuje test wiązania, który składa się zasadniczo z etapów (a) wytworzenia mieszaniny reakcyjnej, zawierającej: (i) FRP lub polipeptyd szlaku sygnałowego Wnt, (ii) partnera wiążącego FRP lub polipeptyd szlaku sygnałowego Wnt, oraz (iii) testowany związek i (b) wykrywania oddziaływania FRP lub polipeptydu ze szlaku sygnałowego Wnt z białkiem wiążącym. Statystycznie istotna zmiana (wzmaganie lub hamowanie) oddziaływań FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt z białkiem wiążącym w obecnoś ci testowanego zwią zku wskazuje na potencjalnego agonistę (mimetyk lub czynnik wzmacniający działanie) lub antagonistę (inhibitor) szlaku sygnałowego Wnt. Mieszanina reakcyjna może być bezkomórkowym preparatem białkowym, np. mieszaniną zrekonstytuowanych białek lub lizatem komórkowym, układem hodowli komórkowej lub też może to być zrekombinowana komórka zawierająca heterologiczny kwas nukleinowy wyrażający przez rekombinowanie DNA partnera wiążącego.
Jeszcze inny przykładowy test polega na przeszukiwaniu związków w celu zidentyfikowania czynników promujących lub zwiększających szybkość szlaku sygnałowego Wnt i/lub ekspresji genów, które są regulowane przez szlak sygnałowy Wnt w siateczce włókien kolagenowych w kącie przesączania oka. Test przesiewowy obejmuje doprowadzenie do kontaktu komórki stransfekowanej genem reporterowym (połączonym funkcjonalnie z promotorem regulowanym przez białka z grupy białek o wysokiej mobilnoś ci (HMG) (np. Lymphoid Enhancer Factor/ T-Cell Factor) z testowanym zwią zkiem i okreś lenie poziomu ekspresji genu reporterowego. Gen reporterowy może np. kodować produkt genowy, który zapoczątkowuje wykrywalny sygnał, taki jak kolor, fluorescencja, luminescencja, przeżywalność komórki, zaspokojenie wymagań odżywczych komórki, wzrost komórki lub oporność na antybiotyk. Na przykład, gen reporterowy może kodować produkt wybrany z grupy obejmującej acetylotransferazę chloramfenikolową, lucyferazę, beta-galaktozydazę i fosfatazę alkaliczną.
Krótki opis figur
Fig. 1 przedstawia sekwencję cDNA dla ludzkiego białka spokrewnionego z białkiem Frizzle FRP-1 (SEK NR ID: 1).
PL 208 368 B1
Fig. 2 przedstawia sekwencję aminokwasową ludzkiego białka FRP-1.
Fig. 3 przedstawia schematycznie szlak sygnałowy Wnt. Fig. 3 (a) przedstawia hamowanie ekspresji genu oparte na wiązaniu FRP z Wnt. Fig. 3 (b) przedstawia ekspresję genu stymulowaną przez Wnt. Wiązanie się Wnt z białkiem frizzled (Fz) aktywuje białko dishelved (Dsh), które z kolei zapobiega wiązaniu kinazy GSK3 (ang. glycogen-synthase-kinase 3) przez kinazę białkową C (APC), co prowadzi do akumulacji β-kateniny, a to z kolei ułatwia oddziaływanie z czynnikiem transkrypcyjnym, czynnik komórki T (ang. T cell factor, TCF), promującym ekspresję genu.
Ogólnie biorąc, wynalazek oparty jest na ujawnieniu, że białko FRP-1 jest silniej wyrażane w siateczce włókien kolagenowych (TM) u pacjentów z jaskrą. Choć teza ta nie musi być uznana za ostatecznie wiążącą, przyjmuje się, że szlak sygnałowy Wnt działa w TM w sposób przedstawiony na Fig. 3(b), regulując ważne funkcje komórek TM, oraz że FRP-1 antagonizuje prawidłowe działanie szlaku Wnt, w sposób przedstawiony na Fig. 3(b), oddziałując tym samym z funkcją komórek TM.
Definicje
Dla ułatwienia, przedstawiono poniżej znaczenie pewnych terminów i zwrotów wykorzystanych w opisie, przykładach oraz załączonych zastrzeżeniach.
Stosowany tu termin „zaburzony ma oznaczać zmianę w poziomie produktu genu lub też jego aktywności biologicznej, co obserwuje się w tkance jaskrowej, ale nie w tkankach lub komórkach nie objętych jaskrą. Na przykład, zaburzony wysoki poziom produktu genu białka spokrewnionego z białkiem Friezled związany jest z komórkami niejaskrowymi TM uzyskanymi od pacjenta z jaskrą, ale nie z komórkami TM uzyskanymi od zdrowego pacjenta. Ponadto, nieprawidłowo niska aktywność biologiczna składników szlaku sygnałowego Wnt jest związana z komórkami TM uzyskanymi od zdrowego pacjenta.
Termin „zaburzona aktywność, używany w stosunku do aktywności polipeptydu, takiego jak FRP, odnosi się do aktywności, która różni się od aktywności polipeptydu dzikiego typu lub która różni się od aktywności polipeptydu u zdrowych osób. Aktywność polipeptydu może być zaburzona, ponieważ jest silniejsza niż aktywność natywnego odpowiednika. Alternatywnie, aktywność polipeptydu może być zaburzona, ponieważ jest słabsza niż aktywność natywnego odpowiednika lub też jej brak. Zaburzenie aktywności może być również zmianą w swoistości oddziaływania. Na przykład, polipeptyd o zaburzonej funkcji może oddziaływać z innym peptydem docelowym. Komórka może mieć zaburzoną aktywność FRP wskutek nadekspresji lub też obniżenia ekspresji genu kodującego FRP.
Stosowane tu określenie „agonista ma odnosić się do czynnika, który bezpośrednio lub pośrednio wzmacnia, wzbogaca lub podwyższa ekspresję genu zainicjowaną przez Wnt lub poziom lub aktywność białka kodowanego przez gen regulowany przez Wnt lub też genu albo białka ze szlaku sygnałowego Wnt.
Termin „allel, który używany jest tutaj wymiennie z terminem „wariant alleliczny, odnosi się do alternatywnych postaci genu lub jego części. Allele zajmują ten sam locus lub pozycję na homologicznych chromosomach. Gdy osoba ma dwa identyczne allele genu mówi się o niej jako o heterozygocie pod względem genu lub allelu. Gdy osoba ma dwa różne allele genu mówi się o niej jako o heterozygocie pod względem danego genu. Allele danego genu mogą różnić się od siebie pojedynczym nukleotydem lub kilkoma nukleotydami i mogą zawierać podstawienia, delecje i insercje nukleotydów. Allelem genu może być również postać genu zawierająca mutację.
Stosowany tu termin „antagonista odnosi się do czynnika, który bezpośrednio lub pośrednio zapobiega, minimalizuje lub tłumi ekspresję genu zainicjowaną przez Wnt, lub tłumi poziom lub aktywność białka kodowanego przez gen regulowany przez Wnt (lub gen albo białko uczestniczące w szlaku sygnałowym Wnt).
Stosowany tu termin „partner wiążący odnosi się do substancji, która oddziałuje (przez siły niekowalencyjne) z określonym produktem genu. Na przykład, „partnerzy wiążący dla produktu genu białka spokrewnionego z białkiem frizzled obejmują substancję, która oddziałuje z mRNA genu dla białka spokrewnionego z białkiem frizzled, tak jak polinukleotyd antysensowny FRP-1 i substancje, które oddziałują z polipeptydami białka spokrewnionego z białkiem frizzled, takie jak polipeptydy Wnt.
Stosowane tu określenie „biologicznie aktywny fragment polipeptydu odnosi się do fragmentu całego polipeptydu, który to fragment naśladuje specyficznie lub antagonizuje aktywność odpowiadającego mu polipeptydu pełnej długości typu dzikiego.
Terminy „komórki, „komórki gospodarza oraz „rekombinowane komórki gospodarza są tu używane wymiennie. Rozumie się, że terminy te nie odnoszą się jedynie do konkretnej opisanej tu komórki, ale również do potencjalnego potomstwa tej komórki. Ponieważ w następujących po sobie
PL 208 368 B1 pokoleniach wystąpić mogą pewne modyfikacje wywołane albo mutacjami albo wpływem środowiska, komórki potomne rzeczywiście nie mogą być identyczne z komórkami rodzicielskimi, jednak są wciąż objęte stosowanym tu terminem.
„Polipeptyd chimerowy lub „polipeptyd fuzyjny jest fuzją pierwszej sekwencji aminokwasowej, kodującej na przykład, jeden z polipeptydów FRP z drugą sekwencją aminokwasową, określającą domenę (np. część polipeptydu) obcą dla FRP i nie wykazującą znaczącej homologii z żadną domeną polipeptydu FRP. Polipeptyd chimerowy może zawierać obcą domenę, która jest stwierdzona (choć w innym polipeptydzie) w organizmie wyraż ają cym również pierwszy polipeptyd, lub też moż e to być fuzja „międzygatunkowa, „międzyrodzajowa itd., czyli fuzja struktur polipeptydowych wyrażanych przez różne rodzaje organizmów. Ogólnie rzecz biorąc, polipeptyd fuzyjny może być reprezentowany przez wzór ogólny X-FRP-Y, gdzie FRP odpowiada części polipeptydu pochodzącej z polipeptydu FRP, a X i Y reprezentują sekwencje aminokwasowe (z których jedna może być nieobecna), które nie są związane z sekwencją FRP w organizmie, w tym, w naturalnie występujących mutantach.
„Kompleks dostarczający ma oznaczać środki doprowadzające do celu (np. cząsteczkę, która daje większe powinowactwo wiązania genu, białka, polipeptydu lub peptydu z powierzchnią komórki docelowej i/lub zwiększa komórkowy lub jądrowy wychwyt przez komórkę docelową). Przykładami środków doprowadzających do celu są sterole (np. cholesterol), lipidy (np. lipidy kationowe, wirosomy lub liposomy), wirusy (np. adenowirus, AAV - wirus satelitarny adenowirusa lub retrowirus) albo czynniki wiążące swoiste dla komórki docelowej (np. ligandy rozpoznawane przez receptory swoiste dla komórek docelowych). Korzystne kompleksy są wystarczająco stabilne in vivo, żeby zapobiec znaczącemu rozprzężeniu przed internalizacją przez komórkę docelową. Jednakże kompleks podlega rozszczepieniu w odpowiednich warunkach wewnątrz komórki, tak że gen, białko, polipeptyd lub peptyd zostają uwolnione w postaci funkcjonalnej.
Jak dobrze wiadomo, geny mogą występować pojedynczo lub w wielu kopiach w genomie osobnika. Takie zduplikowane geny mogą być identyczne lub też mogą zawierać pewne modyfikacje obejmujące podstawienia nukleotydowe, addycje, inwersje lub delecje, jednak wciąż kodują polipeptydy mające zasadniczo taką samą aktywność. Termin „sekwencja DNA kodująca polipeptyd FRP może zatem odnosić się do jednego lub więcej genów danego osobnika. Dodatkowo, występują również pewne różnice obserwowane w sekwencjach nukleotydowych między pojedynczymi organizmami, a warianty te nazywane są allelami. Takie róż nice alleliczne mogą , choć nie muszą , prowadzić do różnic w sekwencji aminokwasowej kodowanego polipeptydu, a zakodowany polipeptyd ma nadal taką samą aktywność biologiczną.
„Białko spokrewnione z białkiem frizzled (FRP) może być dowolnym członkiem rodziny białek sekrecyjnych, wykazujących podobieństwo do zewnątrzkomórkowej, wiążącej ligand domeny w białkach Frizzled. Białka FRP są również określane jako sekrecyjne lub rozpuszczalne białka spokrewnione z białkiem frizzled (sFRP), ponieważ nie zawierają domeny transbłonowej i dlatego też działają jako dominująco negatywne receptory białek Wnt. Białka FRP są kodowane przez szereg różnych genów kręgowców, w tym, ludzki gen Frz-1 kodujący sekrecyjne białko spokrewnione z białkiem frizzled (nr dostępu Genbank AF056087); ludzki gen SFRP5 kodujący sekrecyjne białko spokrewnione z biał kiem frizzled (nr dostę pu Genbank AF117758); ludzki gen FrzB (nr dostępu Genbank U24163) oraz gen FrzA z Xenopus (nr dostępu Genbank AF049908).
Stosowany tu termin „jaskra odnosi się do grupy chorób oczu, charakteryzujących się zwyrodnieniem tarczy nerwu wzrokowego i utratą pola widzenia, co często spowodowane jest zwiększonym ciśnieniem wewnątrzgałkowym wskutek blokady kanału, przez który odpływa ciecz wodnista (jaskra przewlekła lub otwartego kąta przesączania) lub też wskutek ciśnienia tęczówki na soczewkę (jaskra ostra lub z zamkniętym kątem przesączania).
„Homologia lub „identyczność albo „podobieństwo odnoszą się do podobieństwa sekwencji między dwoma peptydami lub między dwiema cząsteczkami kwasu nukleinowego. Homologię można określić przez porównanie pozycji w każdej sekwencji, co można uczynić drogą dopasowania liniowego. Gdy pozycja w porównywanej sekwencji jest zajmowana przez tę samą zasadę lub aminokwas, wówczas cząsteczki są identyczne w tej pozycji. Stopień homologii lub podobieństwa lub identyczności między sekwencjami kwasu nukleinowego jest funkcją liczby identycznych lub pasujących nukleotydów w pozycjach występujących w obu sekwencjach kwasu nukleinowego. Stopień identyczności między sekwencjami aminokwasowymi jest funkcją liczby identycznych aminokwasów w pozycjach występujących w obu sekwencjach. Stopień homologii lub podobieństwa między sekwencjami aminokwasowymi jest funkcją liczby identycznych aminokwasów (tj. strukturalnie pokrewnych) w pozycjach
PL 208 368 B1 występujących w obu sekwencjach aminokwasowych. Procentową homologię między sekwencjami kwasu nukleinowego lub polipeptydowymi można określić stosując kilka matematycznych algorytmów, które są dobrze znane specjalistom (przykładem może być algorytm wykorzystywany przez oprogramowanie BLAST do określania homologii sekwencji, dostępny pod adresem internetowym:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Sekwencje „niespokrewnione lub „niehomologiczne wykazują mniej niż 40% identyczności, korzystnie mniej niż 25% identyczności wobec jednej z sekwencji FRP według niniejszego wynalazku.
Stosowany tu termin „oddziaływać ma obejmować wykrywalne interakcje między cząsteczkami, takie które mogą być wykryte przy użyciu np. drożdżowego testu dwuhybrydowego. Termin „oddziaływać ma również obejmować interakcje „wiązania między cząsteczkami. Oddziaływaniami mogą być, na przykład, oddziaływaniami białko-białko, białko-kwas nukleinowy lub kwas nukleinowy-kwas nukleinowy w naturze.
Termin „wyizolowany, stosowany tu wobec kwasów nukleinowych, takich jak DNA lub RNA, odnosi się do cząsteczek oddzielonych od innych cząsteczek DNA lub RNA, odpowiednio, które są obecne w naturalnym źródle makrocząsteczki. Na przykład, izolowany kwas nukleinowy kodujący jeden z omawianych polipeptydów FRP korzystnie obejmuje więcej niż 10 tys. par zasad (kb) sekwencji kwasu nukleinowego, która bezpośrednio flankuje gen FRP w genomowym DNA, korzystniej nie więcej niż 5 kb takich naturalnie występujących sekwencji flankujących, a najkorzystniej mniej niż 1,5 kb takich naturalnie występujących sekwencji flankujących. Stosowany tu termin „wyizolowany odnosi się również do kwasu nukleinowego lub peptydu, które są zasadniczo wolne od materiału komórkowego, materiału wirusowego lub podłoża hodowlanego (w przypadku wytwarzania przy użyciu technik rekombinowania DNA) lub też od chemicznych prekursorów lub innych związków chemicznych, gdy są syntetyzowane chemicznie. Ponadto, termin „wyizolowany kwas nukleinowy ma obejmować fragmenty kwasu nukleinowego, które normalnie nie występują jako fragmenty i nie mogłyby być jako takie znalezione w naturze. Również tu stosowany termin „wyizolowany odnosi się do polipeptydów, które są izolowane od innych białek komórkowych i ma obejmować zarówno peptydy oczyszczone, jak i zrekombinowane.
Stosowane tu określenie „modulacja odnosi się zarówno do regulacji pozytywnej (tj. aktywacji lub stymulacji (np. przez stosowanie agonistów lub wzmacniaczy)) jak i do regulacji negatywnej (tj. inhibicji lub supresji (np. przez użycie antagonistów lub inhibitorów).
Termin „gen zmutowany odnosi się do allelicznej postaci genu, która zdolna jest zmienić fenotyp osobnika mającego zmutowany gen w porównaniu z osobnikiem nie mającym zmutowanego genu. Jeśli osobnik musi być homozygotą pod względem tej mutacji, aby mieć zmieniony fenotyp, mówi się, że mutacja jest recesywna. Jeśli jedna kopia zmutowanego genu wystarcza do zmiany fenotypu osobnika, mutację określamy jako dominującą. Jeśli osobnik ma jedną kopię zmutowanego genu, a jego fenotyp jest fenotypem pośrednim między fenotypem osobnika homozygotycznego i heterozygotycznego (dla genu), mówi się, że mutacja jest kodominująca.
Termin „zwierzęta oprócz człowieka obejmuje ssaki, takie jak gryzonie, naczelne z wyjątkiem ludzi, owce, psy, krowy i króliki, kury, płazy, gady, króliki, itd. Zwierzęta oprócz człowieka, korzystnie, są wybrane z rodziny gryzoni obejmując szczura i mysz, najkorzystniej mysz, choć transgeniczne płazy, takie członkowie rodzaju Xenopus i transgeniczne kury mogą być również ważnymi narzędziami dla zrozumienia i identyfikacji czynników wpływających, na przykład, na embriogenezę i tworzenie tkanek. Termin „zwierzę chimerowe oznacza tutaj zwierzęta, u których znaleziono zrekombinowany gen lub u których zrekombinowany gen ulega ekspresji w niektórych, ale nie wszystkich komórkach. Termin „tkankowo-specyficzne zwierzę chimerowe wskazuje, że jeden ze zrekombinowanych genów jest obecny i/lub ulega ekspresji lub został uszkodzony w niektórych tkankach, lecz nie w pozostałych.
Stosowany tu termin „kwas nukleinowy odnosi się do polinukleotydów, takich jak kwas deoksyrybonukleinowy (DNA), i jeśli jest to odpowiednie, kwas rybonukleinowy (RNA). Termin ten powinien być również rozumiany jako obejmujący, jako ekwiwalenty, analogi RNA lub DNA wytworzone z analogów nukleotydów oraz, zastosowane w opisanym tu wykonaniu, jednoniciowe (sensowne lub antysensowne) i dwuniciowe polinukleotydy.
Termin „sekwencja nukleotydowa komplementarna do sekwencji nukleotydowej przedstawionej w SEK NR ID: x odnosi się do sekwencji nukleotydowej nici komplementarnej do nici kwasu nukleinowego o sekwencji przedstawionej jako SEK NR ID: x. Termin „nić komplementarna jest używany tutaj wymiennie z określeniem „dopełnienie. Dopełnienie nici kwasu nukleinowego może być dopełnieniem nici kodującej lub dopełnieniem nici niekodującej. W odniesieniu do podwójnej nici kwasu
PL 208 368 B1 nukleinowego, dopełnienie kwasu nukleinowego mającego SEK NR ID: x dotyczy nici komplementarnej do nici przedstawionej jako SEK NR ID x lub do jakiegokolwiek kwasu nukleinowego mającego sekwencję nukleotydową nici komplementarnej do SEK NR ID: x. W odniesieniu do jednoniciowego kwasu nukleinowego mającego sekwencję nukleotydową SEK NR ID x, dopełnieniem tego kwasu nukleinowego jest kwas nukleinowy mający sekwencję komplementarną do tej przedstawionej w SEK NR ID x. Sekwencje nukleotydowe i ich sekwencje komplementarne są zawsze podawane w orientacji od 5' do 3'.
Termin „polimorfizm odnosi się do współistnienia więcej niż jednej postaci genu lub jego fragmentu (np. wariantu allelicznego). Fragment genu, dla którego występują przynajmniej dwie różne postaci, tj. dwie różne sekwencje nukleotydowe, jest określany jako „region polimorficzny genu. Region polimorficzny może dotyczyć pojedynczego nukleotydu, którego identyczność jest różna w różnych allelach. Region polimorficzny może mieć też długość kilku nukleotydów.
„Gen polimorficzny odnosi się do genu mającego przynajmniej jeden region polimorficzny.
Stosowany tu termin „promotor oznacza sekwencję DNA, która reguluje ekspresję wybranej sekwencji DNA połączonej funkcjonalnie z promotorem i która wpływa na ekspresję wybranej sekwencji DNA w komórkach. Termin ten obejmuje promotory „specyficzne tkankowo, tj. promotory, które wpływają na ekspresję wybranej sekwencji DNA tylko w specyficznych komórkach (np. komórkach konkretnej tkanki). Termin ten obejmuje też tzw. promotory „przeciekające, które regulują ekspresję wybranego DNA głównie w jednej tkance, ale powodują również ekspresję w innych tkankach. Termin ten obejmuje też promotory niespecyficzne tkankowo oraz promotory o ekspresji konstytutywnej albo podlegające indukcji (tj. można kontrolować poziom ekspresji).
Terminy „białko, „polipeptyd i „peptyd używane są tu wymiennie w odniesieniu do produktu genowego zawierającego aminokwasy.
Termin „zrekombinowane białko odnosi się do polipeptydu, który jest wytwarzany przy użyciu technik rekombinowania DNA, gdzie na ogół, DNA kodujący polipeptyd FRP jest wstawiany do odpowiedniego wektora ekspresyjnego, który z kolei jest używany do transformowania komórki gospodarza w celu wytworzenia heterologicznego białka. Ponadto, zwrot „pochodzący z w odniesieniu do zrekombinowanego genu FRP ma obejmować, w obrębie znaczenia zwrotu „zrekombinowane białko, te białka, które mają sekwencję aminokwasową natywnego polipeptydu FRP lub też sekwencję aminokwasową do niej podobną, utworzoną przez wprowadzenie mutacji, obejmujących podstawienia i delecje (w tym skrócenia) w naturalnie występującej postaci polipeptydu.
Stosowane tu określenie „mała cząsteczka odnosi się do kompozycji o masie cząsteczkowej mniejszej niż 5 kD, najkorzystniej mniej niż 4 kD. Małe cząsteczki mogą być kwasami nukleinowymi, peptydami, polipeptydami, peptydomimetykami, węglowodanami, lipidami lub innymi organicznymi (zawierającymi węgiel) lub nieorganicznymi cząsteczkami. Wiele kompanii farmaceutycznych ma ogromne biblioteki chemicznych i/lub biologicznych mieszanin, często wyciągów grzybowych, bakteryjnych lub glonowych, które można przeszukiwać przy użyciu dowolnego testu pod kątem identyfikacji związków modulujących FRP lub aktywności biologicznych szlaku sygnałowego Wnt.
Stosowany tu termin „hybrydyzuje specyficznie lub „wykrywa specyficznie odnosi się do zdolności cząsteczki kwasu nukleinowego do hybrydyzowania z przynajmniej 6, 12, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 300, 350, 400 lub 425 kolejnymi nukleotydami z genu kręgowców, korzystnie FRP.
„Transkrypcyjna sekwencja regulatorowa jest powszechnym terminem stosowanym tu do określenia sekwencji DNA, takich jak sygnały inicjacyjne, wzmacniacze i promotory, które indukują bądź kontrolują transkrypcję sekwencji kodujących białko, z którymi są funkcjonalnie połączone.
Stosowany tu termin „transfekcja oznacza wprowadzenie kwasu nukleinowego, np. w wektorze ekspresyjnym, do komórki biorcy drogą przenoszenia genów za pośrednictwem kwasu nukleinowego. Termin „transformacja odnosi się tutaj do procesu, w którym genotyp komórki zmienia się na skutek pobrania przez komórkę egzogennego DNA lub RNA i, przykładowo, stransformowana komórka może wyrażać zrekombinowaną postać polipeptydu FRP lub też, w przypadku antysensownej ekspresji z przeniesionego genu, przerwana może być ekspresja występującej naturalnie formy polipeptydu FRP.
Stosowane tu określenie „transgen oznacza sekwencję kwasu nukleinowego (kodującą np. jeden z polipeptydów FRP lub jego antysensowny transkrypt), która została wprowadzona do komórki. Transgen może być całkowicie lub częściowo heterologiczny, tj. obcy dla zwierzęcia transgenicznego lub komórki, do której został wprowadzony. Może on być też homologiczny wobec endogennego genu zwierzęcia transgenicznego lub komórki, do której został wprowadzony, lecz jest wówczas zaprojekPL 208 368 B1 towany do wprowadzenia (lub wprowadzony) do genomu zwierzęcego w taki sposób, żeby zmienić genom komórki, do której został wprowadzony (np. jest wprowadzony do miejsca, które różni się od naturalnej pozycji genu lub też wynikiem jego wstawienia jest nokaut). Transgen może być także obecny w komórce w postaci episomu. Transgen może obejmować jedną lub więcej transkrypcyjnych sekwencji regulatorowych i inny kwas nukleinowy, takie jak introny, które mogą być konieczne dla optymalnej ekspresji wybranego kwasu nukleinowego.
Termin „zwierzę transgeniczne odnosi się do każdego zwierzęcia, korzystnie ssaka oprócz człowieka, ptaka lub płaza, u którego jedna lub więcej komórek zawiera heterologiczny kwas nukleinowy wprowadzony drogą ludzkiej interwencji, np. przy użyciu technik transgenicznych dobrze znanych w tej dziedzinie. Kwas nukleinowy wprowadza się do komórki bezpośrednio lub pośrednio przez wprowadzenie do prekursora komórki, drogą rozmyślnych manipulacji genetycznych, takich jak mikroiniekcja lub infekcja zrekombinowanym wirusem. Termin „manipulacja genetyczna nie obejmuje klasycznego krzyżowania lub też zapłodnienia in vitro ale jest raczej zaprojektowana z myślą o wprowadzeniu zrekombinowanej cząsteczki DNA. Cząsteczka ta może integrować się z chromosomem lub może być pozachromosomowo replikującym się DNA.
Stosowany tu termin „leczenie obejmuje zarówno całkowite wyleczenie, jak i jedynie polepszenie co najmniej jednego objawu stanu lub choroby. Termin „wektor odnosi się do cząsteczki kwasu nukleinowego zdolnej do transportowania innego kwasu nukleinowego, z którym została połączona. Jednym z rodzajów korzystnego wektora jest episom, tj. kwas nukleinowy zdolny do pozachromosomowej replikacji. Korzystne wektory to te, które są zdolne do samodzielnej replikacji i do ekspresji kwasów nukleinowych, z którymi są połączone. Wektory zdolne do kierowania ekspresją połączonych z nimi genów określane są tutaj jako „wektory ekspresyjne. Ogólnie biorąc, wektory ekspresyjne używane w technikach rekombinowania DNA są zwykle w postaci „plazmidów, co oznacza ogólnie biorąc koliste dwuniciowe pętle DNA, które, w postaci wektora, nie są związane z chromosomem. W niniejszym opisie, terminy „plazmid i „wektor są używane wymiennie, jako że plazmid jest najpowszechniej używaną postacią wektora. Jednakże, wynalazek ten ma obejmować również inne postaci wektorów ekspresyjnych, które pełnią podobne funkcje i które staną się znane specjalistom w tej dziedzinie.
Termin „allel typu dzikiego odnosi się do allelu genu, który, gdy jest obecny w dwóch kopiach, prowadzi do wystąpienia fenotypu typu dzikiego. Może istnieć kilka alleli typu dzikiego danego genu, ponieważ pewne zmiany nukleotydowe w genie mogą nie wpływać na fenotyp osobnika mającego dwie kopie genu ze zmianami nukleotydowymi.
Termin „składnik szlaku sygnałowego Wnt odnosi się do białka lub genu kodującego białko, włączone w szlak sygnałowy Wnt. Przykłady takich białek obejmują: Wnt, frizzled (Fz), disheveled (Dsh), kinazę syntazy glikogenowej 3 (GSK3), kinazę białkową C (APC), β-kateniny i białka z grupy HMG (np. LEF/TCF (limfoidalny czynnik wzmacniający/czynnik komórek T)).
Termin „białko Wnt odnosi się do białek kodowanych przez dużą grupę genów ssaczych obejmującą Wnt3a, Nnt5a i Wnt5b.
Prognostyka i diagnostyka jaskry
W oparciu o zmiany w poziomie ekspresji genu FRP na poziomie mRNA można opracować testy diagnostyczne. Sekwencje są z ludzkiego genomu, a zatem są znane i łatwo dostępne. Klon imago ma numer dostępu NM-003012 dostępny z biblioteki NIM-MGC-91.
Testy przesiewowe do wykrywania środków leczniczych przeciwko jaskrze
Lek przeciwko jaskrze może być dowolnym rodzajem związku, obejmującym białko, peptyd, peptydomimetyk, małą cząsteczkę i kwas nukleinowy. Kwas nukleinowy może być, na przykład, genem, antysensownym kwasem nukleinowym, rybozymem lub cząsteczką trójniciową. Lek przeciwko jaskrze może być agonistą aktywności Wnt lub antagonistą FRP lub aktywności antagonistycznej w stosunku do szlaku sygnałowego Wnt. Do korzystnych agonistów należą składniki szlaku sygnałowego Wnt lub geny i białka, których ekspresja jest regulowana przez szlak sygnałowy Wnt.
Dokonano identyfikacji leków przeciwko jaskrze, które mogą wiązać się z białkiem FRP, przeszkadzając tym samym w blokowaniu przez nie szlaku sygnałowego Wnt lub leków, które mogą wiązać się ze składnikiem szlaku sygnałowego Wnt, tym samym zaburzając aktywność składnika szlaku sygnałowego Wnt.
Związki mogące być lekami przeciwko jaskrze można identyfikować za pomocą różnych testów, w zależności od rodzaju związku i pożądanej aktywności związku. Poniżej przedstawiono przynajmniej kilka testów, które można zastosować do identyfikacji leków przeciwko jaskrze. W zakresie umiejętności specjalistów w tej dziedzinie mieści się projektowanie dodatkowych testów identyfikacji leków prze10
PL 208 368 B1 ciwko jaskrze w oparciu o aktywację genów komórek siateczki włókien kolagenowych w kącie przesączania oka przez szlak sygnałowy Wnt.
Testy w układzie bezkomórkowym
Testy w układzie bezkomórkowym można zastosować do identyfikacji związków, które mogą oddziaływać z FRP, składnikiem szlaku sygnałowego Wnt lub jego partnerem wiązania. Taki związek może np. zmieniać strukturę FRP, składnika szlaku sygnałowego Wnt lub jego partnera wiążącego, a tym samym wpływać na jego aktywność. Testy w układzie bezkomórkowym można również stosować do identyfikacji związków, które modulują oddziaływanie między FRP lub składnikiem szlaku sygnałowego Wnt i partnera wiążącego. Korzystnie testy w układzie bezkomórkowym dla identyfikacji takich związków obejmują zasadniczo mieszaninę reakcyjną, zawierającą FRP lub składnik szlaku sygnałowego Wnt oraz związek testowany lub bibliotekę związków testowanych, w obecności lub nieobecności partnera wiążącego. Związek testowany może być np. pochodną partnera wiążącego, np. nieaktywnym biologicznie peptydem docelowym lub małą cząsteczką.
A zatem, przykładowy test przesiewowy obejmuje etapy doprowadzenia do kontaktu FRP, składnika szlaku sygnałowego Wnt lub ich funkcjonalnego fragmentu ze związkiem testowanym lub biblioteką związków testowanych i wykrywania tworzenia się kompleksów. Dla potrzeb wykrywania cząsteczkę można wyznakować specyficznym markerem, a związek testowany lub bibliotekę związków testowanych innym markerem. Oddziaływanie związku testowanego z FRP, składnikiem szlaku sygnałowego Wnt lub ich fragmentem albo partnerem wiązania można wówczas stwierdzić określając poziom dwóch znaczników po etapach inkubacji i przemywania. Obecność dwóch znaczników po etapie przemywania wskazuje na obecność oddziaływania.
Oddziaływanie między cząsteczkami można również zidentyfikować za pomocą analizy BIA w czasie rzeczywistym (Biomolecular Interaction Analysis, Pharmacia Biosensor AB), która wykrywa powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), zjawisko optyczne. Detekcja zależy od zmian stężenia masy makrocząsteczek na biospecyficznej powierzchni rozdziału i nie wymaga żadnego znakowania oddziałujących cząsteczek. W jednym z wykonań bibliotekę związków testowanych można unieruchamiać na powierzchni sensorowej, np. takiej która tworzy jedną ze ścianek kuwety mikroprzepływowej. Roztwór, zawierający FRP, składnik szlaku sygnałowego Wnt, ich funkcjonalny fragment lub partnera wiążącego, przepływa w sposób ciągły nad powierzchnią sensorową. Zmiana kąta rezonansu, wykazana dzięki rejestracji sygnału, wskazuje na wystąpienie oddziaływania. Technika ta jest dokładniej opisana np. w BIAtechnology Handbook firmy Pharmacia.
Inny przykładowy test przesiewowy obejmuje etapy (a) tworzenia mieszaniny reakcyjnej, zawierającej (i) FRP lub składnik szlaku sygnałowego Wnt, (ii) jego partnera wiążącego i (iii) związek testowany oraz (b) wykrywania oddziaływania FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt z białkiem wiążącym. FRP lub składnik szlaku sygnałowego Wnt oraz partnera wiążącego można otrzymać drogą rekombinacji, izolować ze źródła, np. osocza albo zsyntetyzować chemicznie, jak tu opisano. Statystycznie istotna zmiana (wzmocnienie lub hamowanie) oddziaływania FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt z białkiem wiążącym w obecności testowanego związku, w stosunku do oddziaływania pod nieobecność testowanego związku, wskazuje, że testowany związek może mieć potencjalną aktywność biologiczną agonisty (mimetyka lub substancji wzmagającej efekt) lub antagonisty (inhibitora) FRP lub szlaku sygnałowego Wnt. W tym teście można doprowadzać do kontaktu związków jednocześnie. Alternatywnie można najpierw doprowadzić do kontaktu FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt ze związkiem testowanym przez odpowiednio długi czas, po czym do mieszaniny reakcyjnej dodawany jest partner wiązania. Skuteczność związku można określić, tworząc na podstawie danych uzyskanych przy różnych stężeniach związku testowanego krzywe reakcji na dawkę. Ponadto można przeprowadzić test kontrolny, uzyskując porównawczą linię zerową. W teście kontrolnym wyizolowane i oczyszczone FRP lub składniki szlaku sygnałowego Wnt dodawane są do kompozycji zawierającej partnera wiążącego dla FRP lub partnera wiążącego dla składnika szlaku sygnałowego Wnt, a tworzenie kompleksu wyznacza się ilościowo pod nieobecność związku testowanego.
Tworzenie kompleksu między białkiem FRP i partnerem wiązania dla FRP można wykryć za pomocą szeregu technik. Modulację tworzenia kompleksów można określić ilościowo, stosując, na przykład, białka znakowane w sposób odpowiedni dla wykrywania, takie jak znakowanie radioizotopowe, znakowane fluorescencyjnie lub znakowane enzymatycznie FRP, składniki szlaku sygnałowego Wnt lub partnerzy wiązania, za pomocą testu immunologicznego lub detekcji chromatograficznej.
Zazwyczaj celowe będzie unieruchomienie FRP, składnika szlaku sygnałowego Wnt lub jego partnera wiążącego, w celu ułatwienia oddzielenia kompleksów od form nieskompleksowanych, dla
PL 208 368 B1 jednego lub obydwu białek, a także dla umożliwienia automatyzacji testu. Wiązanie FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt z partnerem wiązania może zajść w każdym naczyniu odpowiednim dla reagentów. Przykłady obejmują płytki do mikromiareczkowania, probówki laboratoryjne i probówki do mikrowirówek. W jednym z wykonań można dostarczyć białko fuzyjne, które ma domenę, umożliwiającą białku związanie się z podłożem. Na przykład, białka fuzyjne S-transferazy glutationowej mogą ulec adsorpcji na kulkach glutationylowanej sefarozy (Sigma Chemical, St. Louis, MO) lub płytkach do mikromiareczkowania, derywatyzowanych za pomocą glutationu, do których następnie dodaje się partnera wiążącego, np. partnera wiążącego, znakowanego za pomocą 35S oraz związek testowany, a mieszaninę inkubuje się w warunkach sprzyjających tworzeniu kompleksu, np. w warunkach fizjologicznych pod względem stężenia soli i pH, choć mogą być celowe nieco ostrzejsze warunki. Po inkubacji kulki przemywa się w celu usunięcia niezwiązanego znacznika, a unieruchomiony na nośniku znacznik radioizotopowy oznacza się bezpośrednio (np. kulki umieszcza się w liczniku scyntylacyjnym) albo oznacza się w supernatancie po oddysocjowaniu kompleksów. Alternatywnie, kompleksy można oddysocjować od podłoża, rozdzielić za pomocą SDS-PAGE, a poziom FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt lub partnera wiążącego, obecnego we frakcji nośnika, oznaczyć ilościowo z żelu, stosując standardowe techniki elektroforetyczne, jak te, które opisano w dołączonych przykładach.
W opisywanym teś cie można również zastosować inne techniki unieruchamiania biał ek na podłożach. Na przykład, FRP, składnik szlaku sygnałowego Wnt lub odpowiedni partner wiązania można unieruchomić, stosując połączenie biotyny ze streptawidyną. Na przykład, biotynylowane FRP lub składniki szlaku sygnałowego Wnt można otrzymać za pomocą biotyny-NHS (N-hydroksybursztynoimid), stosując techniki dobrze znane w tej dziedzinie (np. zestaw do biotynylacji, Pierce Chemicals, Rockford, IL), a następnie unieruchamiać w studzienkach 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania, pokrytych streptawidyną (Pierce Chemical). Alternatywnie, można zderywatyzować przeciwciała, reaktywne w stosunku do FRP lub składników szlaku sygnałowego Wnt, przyłączając je do studzienek płytki, a FRP lub składniki szlaku sygnałowego Wnt pułapkować w studzienkach przez połączenie z przeciwciałem. Tak jak powyżej, próbki, zawierające FRP lub składnik szlaku sygnałowego Wnt, białko wiążące i związek testowany, inkubuje się w studzienkach płytki, prezentujących FRP lub składnik szlaku sygnałowego Wnt, określając ilość kompleksu złapanego przez studzienkę. Przykładowe sposoby wykrywania takich kompleksów, w dodatku do tych, które opisano powyżej dla kompleksów unieruchamianych za pomocą GST, obejmują immunodetekcję kompleksów z użyciem przeciwciał reaktywnych w stosunku do partnera wiążącego dla FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt albo reaktywnych w stosunku do FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt i konkurujących z partnerem wiązania; jak również testy enzymatyczne, które polegają na wykrywaniu aktywności enzymatycznej, związanej z partnerem wiązania, albo aktywności własnej białka, albo zewnętrznej. W tym ostatnim przypadku enzym może być sprzężony chemicznie lub dostarczony jako białko fuzyjne z partnerem wiązania. W celu zilustrowania, partner wiązania może być usieciowany chemicznie lub stanowić fuzję genetyczną z peroksydazą chrzanową, a ilość polipeptydu uwięzionego w kompleksie określa się za pomocą chromogennego substratu enzymu, np. tetrachlorowodorku 3,3'-diaminobenzadyny lub 4-chloro-1-naftolu.
Podobnie, można dostarczyć białko fuzyjne, zawierające polipeptyd i S-transferazę glutationową, a tworzenie kompleksu wyznaczyć ilościowo, wykrywając aktywność GST za pomocą 1-chloro-2,4-dinitrobenzenu (Habig i wsp. (1974) J Biol Chem 249: 7130).
W procesach, w których oznaczenie iloś ciowe opiera się na immunodetekcji jednego z biał ek uwięzionych w kompleksie, można zastosować przeciwciała przeciw temu białku. Alternatywnie, białko, które należy wykryć w kompleksie, może być „znakowane epitopem w postaci białka fuzyjnego, które oprócz sekwencji FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt zawiera drugi polipeptyd, dla którego są powszechnie dostępne przeciwciała (np. ze źródeł handlowych). Na przykład, białka fuzyjne GST, opisane powyżej, mogą być również zastosowane do ilościowego oznaczenia wiązania, z użyciem przeciwciał przeciw reszcie GST. Do innych użytecznych znaczników epitopowych zalicza się epitopy myc (np. patrz Ellison i wsp. (1991) J Biol Chem 266: 21150-21157), które zawierają 10-resztową sekwencję z c-myc, a także układ pFLAG (International Biotechnologies, Inc.) lub układ pEZZ-białko A (Pharmacia, NJ).
Testy w układzie bezkomórkowym można również zastosować do identyfikacji związków, które oddziaływają z FRP lub składnikiem szlaku sygnałowego Wnt i modulują ich oddziaływanie. A zatem, doprowadza się do kontaktu FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt ze związkiem testowanym i śledzi się aktywność katalityczną FRP lub składnika składowego szlaku sygnałowego Wnt. W jednym
PL 208 368 B1 z wykonań określa się zgodnie ze sposobami znanymi w dziedzinie zdolność FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt do wiązania się z peptydem docelowym.
Testy komórkowe
Poza testami w układzie bezkomórkowym, takimi jak opisane powyżej, białka FRP ułatwiają zaprojektowanie testów komórkowych, np. dla identyfikacji agonistów lub antagonistów niskocząsteczkowych. Komórka, wyrażająca białko FRP na zewnętrznej powierzchni swej błony komórkowej, jest inkubowana w obecności samego związku testowanego lub związku testowanego i cząsteczki, o której wiadomo, że oddziałuje z FRP, przy czym oddziaływanie między FRP i związkiem testowanym wykrywa się np. z użyciem mikrofizjometru (McConnell i wsp. (1992) Science 257: 1906). Oddziaływanie między białkiem FRP i związkiem testowanym wykrywa się przy pomocy mikrofizjometru, jako zmianę kwasowości środowiska. Korzystnie testy komórkowe wykorzystują komórki człowieka, uzyskane z tkanki siateczki włókien kolagenowych tkanki ocznej pacjentów zdrowych lub dotkniętych jaskrą.
Namnażanie komórek siateczki włókien kolagenowych człowieka w hodowli umożliwia badanie właściwości strukturalnych i funkcjonalnych tego szczególnego typu komórek w powtarzalnych warunkach eksperymentalnych. Komórki siateczki włókien kolagenowych człowieka można skutecznie hodować z eksplantów tkanki siateczki włókien kolagenowych, a komórki w hodowli zachowują swoiste cechy ultrastruktury niehodowanych komórek siateczki włókien kolagenowych w ciągu wielu pasaży in vitro. Komórki siateczki włókien kolagenowych posiadają szeroką gamę cech biochemicznych i strukturalnych, które mogą mieć znaczenie dla podtrzymania drogi odpływu cieczy wodnistej. Do tych cech należą wzrost komórek siateczki włókien kolagenowych w postaci pojedynczej warstwy śródbłonkowej z nietrombogeniczną powierzchnią komórkową, produkcja aktywatora plazminogenu, wysoka fagocytoza oraz zdolność do syntezy glikozaminoglikanów, kolagenu, fibronektyny i innych składników tkanki łącznej. Obecność hialuronidazy i innych enzymów lizosomalnych podkreśla fakt, że komórki siateczki włókien kolagenowych człowieka są zdolne do metabolizmu kwasu hialuronidowego i innych substancji pozakomórkowych. Potencjalne mechanizmy uszkodzenia komórek siateczki włókien kolagenowych in vitro można badać wyznaczając, na przykład, wpływ wielokrotnego pasażowania, ekspozycji na nadtlenki i działania laserem na morfologię komórki.
Testy komórkowe, oparte na komórkach siateczki włókien kolagenowych w kącie przesączania oka lub innych typach komórek, można również zastosować do identyfikacji związków, które modulują ekspresję genu FRP, modulują translację mRNA FRP lub modulują trwałość mRNA lub białka FRP. Zgodnie z tym, w jednym z wykonań, komórka zdolna do wytwarzania FRP, np. komórka siateczki włókien kolagenowych w kącie przesączania oka, jest inkubowana ze związkiem testowanym, a ilość FRP wytworzonego w pożywce jest mierzona i porównywana z ilością wytworzoną przez komórkę, która nie miała kontaktu ze związkiem testowanym. Specyficzność związku w stosunku do FRP można potwierdzić za pomocą różnych analiz kontrolnych, np. mierząc ekspresję jednego lub więcej genów kontrolnych.
Związki, które można badać, obejmują małe cząsteczki, białka i kwasy nukleinowe. W szczególności ten test można zastosować do wyznaczenia skuteczności cząsteczek antysensownych FRP albo rybozymów.
W innym wykonaniu wpływ związku testowanego na transkrypcję genu FRP określa się w eksperymentach transfekcji, stosując gen reporterowy, połączony funkcjonalnie przynajmniej z częścią promotora genu FRP. Region promotorowy genu można wyizolować np. z biblioteki genowej, zgodnie ze sposobami znanymi w tej dziedzinie. Genem reporterowym może być każdy gen kodujący białko, które można łatwo oznaczyć ilościowo, np. lucyferaza lub gen CAT, dobrze znane w tej dziedzinie.
Korzystnie genem reporterowym jest naturalny lub syntetyczny gen, który jest aktywowany transkrypcyjnie w odpowiedzi na sygnał Wnt. Na przykład, gen engrailed ulega aktywacji w odpowiedzi na indukcję Wnt. Ponadto podwyższona ekspresja genu engrailed powoduje indukcję transkrypcyjną genu hedgehog, który jest następnie aktywowany w odpowiedzi na Wnt. W końcu, syntetyczne geny reporterowe, które są aktywowane przez jądrową LEF(tcf)/beta-kateninę stanowią czułe geny reporterowe dla pomiaru indukcji Wnt.
„Lekiem przeciw jaskrze, antagonistą lub agonistą, może być odpowiednio każda z opisanych powyżej substancji, w tym izolowane polipeptydy, konstrukty terapii genowej, cząsteczki antysensowne, peptydomimetyki, małe cząsteczki, nie-kwasy nukleinowe, nie-peptydy lub czynniki zidentyfikowane w dostarczonych tutaj testach leków.
PL 208 368 B1
Profilaktyka jaskry
Zdiagnozowanej sposobem według wynalazku jaskrze zapobiega się przez podawanie pacjentowi czynnika, który moduluje ekspresję FRP lub składników szlaku Wnt lub co najmniej jedną aktywność FRP lub składnika szlaku sygnałowego Wnt. Osobniki zagrożone taką chorobą można zidentyfikować za pomocą testu diagnostycznego lub prognostycznego, np. takiego, jak opisany powyżej
Podawanie czynnika profilaktycznego może nastąpić zanim pojawią się objawy charakterystyczne dla zaburzenia FRP lub składników szlaku Wnt, tak by zapobiec schorzeniu bądź chorobie lub, alternatywnie, opóźnić jej postęp. W zależności od rodzaju zaburzenia FRP lub składników szlaku Wnt, można zastosować do profilaktyki u pacjenta, na przykład, agonistów FRP lub składników szlaku Wnt albo antagonistów FRP lub składników szlaku Wnt.
Leczenie jaskry
W ogólności, jaskrę wywołuje lub przyczynia się do niej zaburzona aktywność FRP lub składników szlaku Wnt. Zatem pacjentowi ze zdiagnozowaną jaskrą należy podać skuteczną ilość związku, który posiada zdolność modulowania aktywności FRP lub składników szlaku Wnt. Wśród takich związków są, na przykład, cząsteczki antysensowne, rybozymy i cząsteczki o potrójnej helisie albo małe cząsteczki organiczne, jak opisano powyżej. Przykłady odpowiednich związków obejmują antagonistów, agonistów i homologi, opisane tu szczegółowo.
Skuteczna dawka
Toksyczność i leczniczą skuteczność takich związków można określić dzięki standardowym procedurom farmaceutycznym w hodowlach komórek lub na zwierzętach doświadczalnych, np. przez określenie LD50 (dawka letalna dla 50% populacji) i ED50 (dawka skuteczna leczniczo dla 50% populacji). Proporcja pomiędzy toksycznością a skutecznością leczniczą dawki stanowi wskaźnik terapeutyczny i można go wyrazić jako stosunek LD50/ED50. Korzystne są peptydy, które wykazują wysokie wskaźniki terapeutyczne. Jakkolwiek można zastosować związki, które wykazują toksyczne efekty uboczne, należy starannie zaprojektować system dostarczania, który dostarcza takie związki do miejsca dotkniętej chorobą tkanki w celu zminimalizowania potencjalnego uszkodzenia komórek nie dotkniętych chorobą, a zatem zmniejszenia efektów ubocznych.
Dane otrzymane z testów na hodowlach komórkowych i badań na zwierzętach można użyć do ustalania zakresu dawki, która jest nietoksyczna przy stosowaniu u ludzi. Korzystnie dawka takich peptydów leży w zakresie stężeń w układzie krążenia, które obejmują stężenia χ dla ED50 o małej lub bez toksyczności. Dawka może być zróżnicowana w tym zakresie, w zależności od postaci zastosowanej dawki i użytej drogi podawania. Dla dowolnego związku stosowanego do leczenia jaskry skuteczną leczniczo dawkę można ustalić wyjściowo z testów hodowli komórkowych. Dawkę można ustalić w modelach zwierzęcych, tak aby uzyskać stężenie w układzie krążenia w zakresie, który obejmuje IC50 obejmujące stężenia χ IC50 (tj. stężenie związku testowego, przy którym uzyskuje się połowę maksymalnego zahamowania objawów) jak określono testach w hodowli komórkowej. Taką informację można wykorzystać do bardziej precyzyjnego ustalania przydatnych dawek u ludzi. Poziomy w osoczu można mierzyć, na przykład, przez wysokosprawną chromatografię cieczową. Monitorowanie działania leków FRP/Wnt w trakcie testów klinicznych
Możliwość namierzenia populacji, dla których można oczekiwać największych korzyści klinicznych, w oparciu o FRP lub składniki szlaku Wnt albo o profil genetyczny choroby, może pozwolić na 1) przesunięcie sprzedawanych leków, wykazujących niezadowalające wyniki rynkowe; 2) przywrócenie kandydatów na leki, dla których zaprzestano badań klinicznych ze względu na problemy z bezpieczeństwem stosowania lub skutecznością, które dotyczą podgrup pacjentów i 3) przyspieszenie i obniżenie kosztów opracowania kandydatów na leki oraz bardziej optymalne etykietowanie (np. dlatego, że zastosowanie FRP lub składników szlaku Wnt jako markerów jest przydatne do optymalizacji skutecznej dawki).
Leczenie osobnika lekiem opartym na FRP lub składnikach szlaku Wnt można monitorować, ustalając cechy charakterystyczne FRP lub składników szlaku Wnt, takie jak poziom lub aktywność białka FRP lub składników szlaku Wnt, poziom mRNA genów FRP lub składników szlaku Wnt i/lub poziom transkrypcji FRP lub składników szlaku Wnt. Te pomiary wykażą, czy leczenie jest skuteczne, czy też należy je poprawić lub zoptymalizować. FRP lub składniki szlaku Wnt mogą być zatem stosowane jako markery skuteczności leku podczas prób klinicznych.
Korzystnie można monitorować skuteczności leczenia osobnika za pomocą czynnika (np. agonisty, antagonisty, peptydomimetyka, białka, peptydu, kwasu nukleinowego, małej cząsteczki lub innego kandydata na lek, zidentyfikowanego w opisanych tutaj testach przesiewowych), obejmującego
PL 208 368 B1 etapy (i) pobrania próbki od osobnika przed podaniem czynnika; (ii) pomiaru poziomu ekspresji białka FRP lub składników szlaku Wnt, mRNA lub DNA genomowego w próbce sprzed podawania; (iii) pobrania od osobnika jednej lub więcej próbek po podaniu; (iv) pomiaru poziomu ekspresji lub aktywności białka FRP lub składników szlaku Wnt, mRNA lub DNA genomowego w próbkach po podaniu; (v) porównania poziomu ekspresji białka FRP lub składników szlaku Wnt, mRNA lub DNA genomowego w próbce sprzed podania z poziomem ekspresji lub aktywności białka FRP lub składników szlaku Wnt, mRNA lub DNA genomowego w próbkach po podaniu oraz (vi) dokonania odpowiedniej zmiany w podawaniu czynnika osobnikowi. Przykładowo, dla podniesienia ekspresji lub aktywności FRP lub składników szlaku Wnt do poziomu wyższego niż stwierdzony, tj. dla podniesienia skuteczności czynnika, może być celowe podwyższenie stosowania czynnika. Alternatywnie, dla zmniejszenia ekspresji lub aktywności FRP lub składników szlaku Wnt do poziomu niższego niż stwierdzony, tj. dla obniżenia skuteczności czynnika, może być celowe obniżenie stosowania czynnika.
Komórki osobnika można również otrzymać przed lub po podaniu leku z FRP lub składnikami szlaku Wnt w celu wykrycia poziomu ekspresji innej niż FRP lub składników szlaku Wnt, w celu stwierdzenia, czy lek oparty na FRP lub składnikach szlaku Wnt nie powoduje podniesienia lub obniżenia ekspresji genów, które mogłoby być szkodliwe. Można tego dokonać np. za pomocą analizy profili transkrypcyjnych. Zatem mRNA z komórek eksponowanych in vivo na lek, oparty na FRP lub składnikach szlaku Wnt i mRNA z komórek tego samego rodzaju, których nie eksponowano na lek oparty na FRP lub składniku szlaku Wnt, można poddać odwrotnej transkrypcji i hybrydyzować z macierzą zawierającą DNA z licznych genów, aby w ten sposób porównać ekspresję genów w komórkach poddanych i nie poddanych działaniu leku opartego na FRP lub składniku szlaku Wnt. Jeśli, na przykład, lek oparty na FRP lub składniku szlaku Wnt włącza u danego osobnika ekspresję protoonkogenu, to stosowanie tego konkretnego leku opartego na FRP lub składniku szlaku Wnt może być niepożądane.
Kompozycje i zastosowanie
Kompozycje farmaceutyczne można wytworzyć w sposób konwencjonalny, stosując jeden lub większą ilość dopuszczalnych fizjologicznie nośników lub zaróbek. Zatem związki oraz ich dopuszczalne fizjologicznie sole i solwaty można przygotować dla podawania, na przykład, przez iniekcję, inhalację lub wdmuchiwanie (przez usta lub przez nos) lub podawanie miejscowe, doustne, dopoliczkowe, pozajelitowe lub doodbytnicze.
Dla potrzeb takiego leczenia, związki te można przygotować dla różnych dróg podawania, takich jak podawanie ogólnoustrojowe, miejscowe lub zlokalizowane. Techniki i kompozycje można ogólnie znaleźć w Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Nie jest prawdopodobne, aby iniekcja była korzystnym sposobem podawania ogólnoustrojowego; są nim doustne postacie dawkowania. Miejscowe kompozycje oczne związków można wytworzyć jedną lub większą liczbą dopuszczalnych fizjologicznie zaróbek, takich jak czynniki buforujące, środki konserwujące (w tym wspomagające środki konserwujące), czynniki ustalające toniczność, środki powierzchniowo czynne, czynniki ułatwiające rozpuszczanie, czynniki stabilizujące, czynniki podnoszące komfort stosowania, środki zmiękczające, czynniki ustalające pH i smary. Kompozycje oczne do podawania miejscowego będą na ogól wytwarzane w pH 4,5 - 8, z osmolarnością 26 - 320 mOSm/kg. Korzystnie do podawania ogólnoustrojowego są iniekcje, w tym, domięśniowe, dożylne, do jamy ciała i podskórne. Do iniekcji związki można wytworzyć w roztworze wodnym, korzystnie w odpowiednim fizjologicznie buforze, takim jak roztwór Hanka lub roztwór Ringera. Dodatkowo, związki można przygotować w postaci ciała stałego i rozpuścić lub zawiesić bezpośrednio przed użyciem. Obejmuje to również postacie zliofilizowane.
Do podawania doustnego, kompozycje farmaceutyczne mogą przybrać postać, na przykład, tabletek lub kapsułek, wytworzonych za pomocą konwencjonalnych sposobów z zastosowaniem dopuszczalnych fizjologicznie zaróbek, takich jak czynniki wiążące (np. preżelatynowana skrobia kukurydziana, poliwinylopirolidon lub hydroksypropylometyloceluloza); wypełniacze (np. laktoza, celuloza mikrokrystaliczna lub kwaśny fosforan wapnia); czynniki smarujące (np. stearynian magnezu, talk lub krzemionka); środki dezintegrujące (np. skrobia ziemniaczana lub glikolan sodowy skrobi) lub czynniki zwilżające (np. siarczan laurylowo-sodowy). Tabletki można pokryć przy zastosowaniu sposobów dobrze znanych w tej dziedzinie. Kompozycje ciekłe do podawania doustnego mogą przybrać postać, na przykład, roztworów, syropów lub zawiesin, albo mogą być dostarczane jako produkt suchy do odtworzenia przed użyciem za pomocą wody lub innego odpowiedniego podłoża. Takie kompozycje ciekłe można przygotować konwencjonalnymi sposobami z zastosowaniem dopuszczalnych farmaPL 208 368 B1 ceutycznie dodatków, takich jak czynniki ułatwiające tworzenie zawiesin (np. syrop sorbitolowy, pochodne celulozy lub uwodornione tłuszcze jadalne); emulgatory (takie jak lecytyna lub guma arabska); podłoża niewodne (np. olej ationdowy, estry oleiste, alkohol etylowy lub frakcjonowane oleje roślinne) oraz środki konserwujące (np. metylo- lub propylo-p-hydroksybenzoesany lub kwas sorbowy). Kompozycje mogą również zawierać sole buforowe, środki smakowo-zapachowe, czynniki barwiące i słodzące, w miarę potrzeb.
Korzystnie, jeżeli preparaty do podawania doustnego są odpowiednio wytworzone, tak aby dawać kontrolowane uwolnienie związku aktywnego. Do podawania dopoliczkowego, kompozycje mogą przyjmować postać tabletek albo pastylek do ssania wytworzonych w konwencjonalny sposób.
Do podawania przez inhalację, dogodne jest podawanie związków w postaci aerozolu z pojemnika ciśnieniowego albo nebulizatora z zastosowaniem odpowiednich propelentów, np. dichlorodifluorometanu, trichlorofluoromethanu, dichlorotetrafluoroetanu, ditlenku węgla lub innego odpowiedniego gazu. W przypadku aerozolów ciśnieniowych, jednostkę dawki można ustalić przez dostarczenie zaworu dostarczającego odmierzoną ilość. Można wytworzyć kapsułki i pojemniki np. z żelatyny do użycia w inhalatorze albo insuflatorze zawierające sproszkowaną mieszaninę składnika i odpowiedniego podłoża dla proszku, takiego jak laktoza lub skrobia.
Związki można przygotować do podawania pozajelitowego, np. jako pojedynczą iniekcję albo stały wlew. Formulacje do iniekcji mogą być w postaci pojedynczej dawki, np. w ampułkach albo w wielodawkowych pojemnikach z dodanym ś rodkiem konserwującym. Kompozycje mogą przyjmować postać zawiesin, roztworów albo emulsji w nośnikach olejowych lub wodnych i mogą zawierać czynniki do wytwarzania, takie jak czynniki zawieszające, stabilizujące i/lub rozpraszające. Alternatywnie, składnik aktywny może być w postaci proszku do przygotowania przed użyciem przy zastosowaniu odpowiedniego nośnika, np. jałowej, wolnej od pirogenów wody.
Związki można również wytwarzać jako kompozycje doodbytnicze, takie jak czopki lub utrzymujące się wlewy np. zawierające konwencjonalne podłoża podstawowe do czopków, takie jak masło kokosowe lub inne glicerydy.
Poza formulacjami opisanymi uprzednio, związki można również wytworzyć jako preparat depot. Takie długo działające kompozycje można podawać miejscowo, przez wszczepienie (na przykład podskórnie lub domięśniowo) lub w iniekcji domięśniowej. A zatem, związki można zmieszać, na przykład, z odpowiednimi materiał ami polimerowymi lub hydrofobowymi (na przykł ad jako emulsja w akceptowalnym oleju) lub żywicami jonowymiennymi, albo jako pochodne słabo rozpuszczalne, na przykład, słabo rozpuszczalna sól. Inne odpowiednie układy do podawania obejmują mikrokulki, które dają możliwość lokalnego, nieinwazyjnego podawania leków przez dłuższy czas. Ta technologia wykorzystuje mikrokulki o rozmiarach mniejszych od naczyń włosowatych, które można wprowadzić przez cewnik wieńcowy do dowolnej wybranej części np. serca lub innych organów, nie wywołując stanu zapalnego lub niedotlenienia. Podawany lek jest powoli uwalniany z tych mikrokulek i pobierany przez komórki otaczającej tkanki (np. komórki śródbłonka).
Podawanie ogólnoustrojowe może się również odbyć za pomocą środków przezśluzówkowych lub przezskórnych. Do podawania przezśluzówkowego lub przezskórnego, w kompozycji stosuje się czynniki ułatwiające pokonanie bariery, swoiste dla bariery, która ma zostać przekroczona. Takie czynniki penetrujące są ogólnie znane w tej dziedzinie i obejmują, na przykład, sole żółciowe i pochodne kwasu fusydowego do podawania przezśluzówkowego. Dla ułatwiania przenikania można dodatkowo zastosować detergenty. Podawanie przezśluzówkowe można wykonać za pomocą rozpylaczy donosowych lub stosując czopki. Dla podawania miejscowego, oligomery przygotowuje się w maś ciach, balsamach, ż elach lub kremach, zgodnie z ogólną wiedzą w tej dziedzinie. Dla leczenia zranienia lub zapalenia, by przyspieszyć gojenie, można zastosować miejscowo roztwór do przemywania.
W warunkach klinicznych można wprowadzić pacjentowi system dostarczania genu dla leku opartego na genie FRP lub składnika szlaku Wnt, przy zastosowaniu dowolnego z licznych sposobów, które są dobrze znane w tej dziedzinie. Na przykład, preparat farmaceutyczny z systemem dostarczania genu można wprowadzić za pomocą iniekcji śródgałkowej lub ogólnoustrojowo, np. przez iniekcję dożylną, a swoista transdukcja białka w komórkach docelowych zachodzi, przede wszystkim, dzięki swoistości transfekcji zapewnionej przez przenośnik dostarczający gen, ekspresji swoistej dla danego typu komórki lub danego typu tkanki, wynikającej z sekwencji regulujących transkrypcję, które kontrolują ekspresję genu receptorowego, albo z kombinacji tych efektów. W innych wykonaniach początkowe podanie rekombinowanego genu jest bardziej ograniczone, a wprowadzanie do organizmu zwie16
PL 208 368 B1 rzęcia w dużej mierze zlokalizowane. Na przykład, nośnik dostarczający gen można wprowadzić przez cewnik (patrz patent USA 5328470) lub przez iniekcję stereotaktyczną (np. Chen i wsp. (1994) PNAS 91: 30543057). FRP lub składnik szlaku Wnt można dostarczyć w konstrukcie do terapii genowej za pomocą elektroporacji, przy zastosowaniu technik opisanych, na przykład, przez Dev i wsp. ((1994) Cancer Treat Rev 20: 105-115) lub za pomocą jontoforezy przeztwardówkowej.
Preparat farmaceutyczny dla konstruktu do terapii genowej lub związku może składać się zasadniczo z systemu dostarczania genu w dopuszczalnym rozcieńczalniku albo może zawierać matrycę do powolnego uwalniania, w której umieszczony jest nośnik dostarczający gen lub związek. Alternatywnie, tam gdzie pełny system dostarczania genu można otrzymać w całości ze zrekombinowanych komórek, np. w przypadku wektorów retrowirusowych, preparat farmaceutyczny może zawierać jedną lub więcej komórek, które wytwarzają system dostarczania genu.
Kompozycje mogą być, jeśli to celowe, obecne w opakowaniu albo urządzeniu do porcjowania, które może zawierać jeden albo większą liczbę jednostek postaci dawkowania zawierającej składnik aktywny. Opakowanie może obejmować, na przykład, metal albo folię plastykową, jak opakowanie typu blister. Do opakowania albo urządzenia porcjującego może być dołączona instrukcja podawania.
Zestawy
Można przygotować zestawy do stosowania w sposobie diagnostycznym albo do leczenia choroby lub stanu związanego z zaburzoną aktywnością lub ekspresją białka FRP lub składnika szlaku Wnt, oraz zestawy do ustalenia, które z FRP lub składników szlaku Wnt należy podać pacjentowi. Zestaw dla celów diagnostycznych obejmuje zestawy do wykrywania obecności mRNA FRP w próbce biologicznej. Na przykład, zestaw może zawierać znakowany związek lub czynnik, zdolny do wykrycia mRNA FRP w próbce biologicznej; środki dla wykrycia ilości FRP lub składnika szlaku Wnt w próbce i środki dla porównania ilości FRP lub składników szlaku Wnt w próbce ze standardem. Związek lub czynnik może być zapakowany w odpowiednim pojemniku. Zestaw może również zawierać instrukcje do stosowania zestawu do wykrycia mRNA lub białka FRP lub składników szlaku Wnt.
Zestaw może zawierać kompozycję farmaceutyczną zawierającą skuteczną ilość leku, będącego antagonistą FRP lub składników szlaku Wnt oraz instrukcję stosowania w leczeniu lub zapobieganiu nadciśnieniu. Inny zestaw może zawierać kompozycję farmaceutyczną zawierającą skuteczną ilość leku, będącego agonistą genów FRP lub składników szlaku Wnt oraz instrukcję stosowania w leczeniu zaburzeń lub chorób oczu, takich jak jaskra. Generalnie, zestaw obejmuje kompozycję farmaceutyczną zawierającą skuteczną ilość leku, będącego antagonistą lub agonistą FRP lub składników szlaku Wnt oraz instrukcję dostosowania jako czynnik leczniczy przeciw jaskrze. Na przykład, zestaw może zawierać kompozycję farmaceutyczną zawierającą skuteczną ilość leku, będącego agonistą FRP lub składników szlaku Wnt oraz instrukcję do stosowania jako środek przeciwbólowy.
Jeszcze inne zestawy mogą być stosowane do określenia, czy dany osobnik ma lub prawdopodobnie rozwinie się u niego choroba lub stan związany z zaburzoną aktywnością FRP lub składnika szlaku Wnt. Taki zestaw może zawierać np. jedną lub więcej sond kwasu nukleinowego, zdolnych do swoistej hybrydyzacji z mRNA kodującym FRP-1
Inne zastosowania białek lub kwasów nukleinowych genów FRP lub składników szlaku Wnt 20
Kwasy nukleinowe FRP lub składników szlaku Wnt mogą być również zastosowane w następujących testach.
Kwasy nukleinowe FRP lub składników szlaku Wnt mające SEK NR ID: 1 lub jej część albo kwas nukleinowy, który z nią hybrydyzuje, można zastosować do ustalenia lokalizacji chromosomalnej genów FRP lub składników szlaku Wnt. Porównanie lokalizacji chromosomalnej genów FRP lub składników szlaku Wnt z położeniem regionów chromosomalnych, których powiązanie z konkretnymi chorobami lub stanami wykazano, np. za pomocą analizy sprzężeń (współdziedziczenie sąsiadujących fizycznie genów) może wskazywać na choroby lub stany, w których mogą odgrywać rolę FRP lub składniki szlaku Wnt. Listę regionów chromosomowych, które powiązano z konkretnymi chorobami lub stanami można znaleźć, na przykład, w V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (dostępne w sieci za pośrednictwem Johns Hopkins University Welch Medical Library) i pod adresem http://www3. ncbi. nlm. nih. gov/Omim/ (Online Mendelian Inheritance in Man). Ponadto geny FRP lub składników szlaku Wnt można również zastosować jako markery chromosomowe w badaniach sprzężeń genetycznych, dotyczących genów innych niż geny FRP lub składników szlaku Wnt.
Lokalizację chromosomową genu można ustalić za pomocą kilku sposobów dobrze znanych w tej dziedzinie. Na przykład, do ustalenia, na którym chromosomie lub w którym fragmencie chromosomu znajduje się konkretny gen, można zastosować hybrydyzację techniką Southerna lub mapowaPL 208 368 B1 nie hybrydowych komórek somatycznych za pomocą PCR. Do innych strategii mapowania, które w podobny sposób moż na zastosować do ustalenia, na którym chromosomie lub, w którym fragmencie chromosomu znajduje się gen, należą hybrydyzacja in situ, wstępne przeszukiwanie z użyciem znakowanych chromosomów uporządkowanych przepływowo oraz preselekcja przez hybrydyzację w celu konstrukcji bibliotek cDNA specyficznych dla chromosomów.
Ponadto fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH) kwasu nukleinowego, np. kwasu nukleinowego FRP lub składnika składowego szlaku Wnt na płytce z rozłożonymi chromosomami metafazowymi jest jednoetapowym sposobem, który daje precyzyjną lokalizację chromosomową kwasu nukleinowego. Tą technikę można zastosować do kwasów nukleinowych o długości zaledwie 500 lub 600 zasad, jednakże klony większe niż 2000 bp mają większe prawdopodobieństwo związania się w pojedynczym miejscu na chromosomie z intensywnością sygnału wystarczającą dla prostej detekcji. Takie techniki są opisane np. w Verma i wsp., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988). Stosując takie techniki można zlokalizować gen w obszarze chromosomowym, zawierającym od około 50 do około 500 genów.
Jeśli wykaże się, że geny FRP lub składników szlaku Wnt znajdują się w obszarze chromosomowym, który kosegreguje, tj. który jest powiązany z konkretną chorobą, to można ustalić różnice w sekwencjach genomowych lub cDNA mię dzy osobnikami nią dotknię tymi i od niej wolnymi. Obecność mutacji u niektórych lub wszystkich spośród osobników dotkniętych chorobą, ale nie u osobników zdrowych, będzie wskazaniem, że prawdopodobne jest wywoływanie lub udział w chorobie tej mutacji.
Zawartość wszystkich cytowanych odnośników (włączając w to odnośniki literaturowe, wydane patenty, opublikowane zgłoszenia patentowe, cytowane w tym zgłoszeniu) jest tu dokładnie włączona jako odniesienie. Przy wykonywaniu niniejszego wynalazku wykorzystuje się, o ile nie zaznaczono inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórki, hodowli komórkowej, biologii molekularnej, biologii transgenicznej, mikrobiologii, rekombinowania DNA oraz immunologii, które są znane w tej dziedzinie. Takie techniki są w pełni wyjaśnione w literaturze. Patrz na przykład Molecular Cloning A Laboratory Manual, wydanie 2, wyd. Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, tom I i II (wyd. D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (wyd. M. J. Gait, 1984); Mullis i wsp. patent USA 4683195; Nucleic Acid Hybridization (wyd. B. D. Hames & S. J. Higgins 1984); Transcription And Translation (wyd. B. D. Hames & S. J. Higgins 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); traktat, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (wyd. J. H. Miller i M. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, tomy 154 i 155 (wyd. Wu i wsp.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (wyd. Mayer i Walker, Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, tomy I-IV (wyd. D. M. Weir i C. C. Blackwell, 1986); Manipulating the
Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).
Farmakogenomika
Znajomość konkretnej zmiany lub zmian, sprawiających, że dany osobnik ma uszkodzenie lub niedobór w genach lub białkach FRP lub składników szlaku Wnt (profil genetyczny genów FRP lub składników szlaku Wnt) sama przez się lub w połączeniu z informacją o innych defektach genetycznych, mających wkład w tą samą chorobę (profil genetyczny danej choroby) pozwala na dostosowanie leczenia danej choroby do profilu genetycznego danego osobnika, co stanowi cel „farmakogenomiki. Na przykład, osoby mające specyficzne allele genów FRP lub składników szlaku Wnt, mogą przejawiać lub nie przejawiać objawów danej choroby, albo wykazywać podatność na rozwinięcie objawów danej choroby. Ponadto, jeśli te osoby wykazują objawy, to mogą one zareagować lub nie zareagować na dany lek, np. konkretny lek oparty na FRP lub składnikach szlaku Wnt, lecz mogą zareagować na inny. A zatem utworzenie profilu genetycznego FRP lub składników szlaku Wnt (np. kategoryzacja zmian w genie FRP lub składników szlaku Wnt, które są związane z rozwojem danej choroby) dla populacji osób, które wykazują objawy choroby lub stanu, który jest wywołany przez, lub w którym uczestniczy uszkodzenie i/lub niedobór w genie i/lub białku FRP lub składniku szlaku Wnt (populacyjny profil genetyczny genów FRP lub składników szlaku Wnt) oraz porównanie profilu FRP lub składników szlaku Wnt danego osobnika z genetycznym profilem populacji, umożliwią wybór lub zaprojektowanie leków, po których spodziewa się, że będą bezpieczne i skuteczne dla danego pacjenta lub populacji pacjentów (tj. grupy pacjentów, mających tą samą zmianę genetyczną).
PL 208 368 B1
Na przykład, można ustalić populacyjny profil genetyczny FRP lub składników szlaku Wnt, określając profil genetyczny FRP lub składników szlaku Wnt, np. identyczność genów FRP lub składników szlaku Wnt w populacji pacjentów cierpiących na chorobę, która jest wywołana przez, lub w której uczestniczy uszkodzenie lub niedobór genów białek FRP lub składników szlaku Wnt. Ewentualnie, genetyczny profil populacyjny FRP lub składników szlaku Wnt może również zawierać informacje, odnoszące się do odpowiedzi populacji na lek oparty na FRP lub składników szlaku Wnt, przy zastosowaniu dowolnego z szeregu sposobów obejmujących monitorowanie: 1) nasilenia objawów związanych z chorobą dotyczącą FRP lub składników szlaku Wnt, 2) poziomu ekspresji genów FRP lub składników szlaku Wnt, 3) poziomu mRNA FRP lub składników szlaku Wnt i/lub 4) poziomu białek FRP lub składników szlaku Wnt oraz (iii) podzielenia lub skategoryzowania populacji w zależności od danej zmiany lub zmian, obecnych w genach FRP lub składników szlaku Wnt. Populacyjny profil genetyczny FRP lub składników szlaku Wnt może również, ewentualnie, wskazywać na te konkretne zmiany, przy których pacjent był albo wrażliwy, albo niewrażliwy na dany lek. Ta informacja lub profil populacyjny jest wówczas przydatny dla przewidywania, w oparciu o indywidualne profile genetyczne FRP lub składników szlaku Wnt, którzy pacjenci powinni zareagować na poszczególne leki.
Badania farmakogenomiczne można również przeprowadzać z użyciem zwierząt transgenicznych. Na przykład, można uzyskać myszy transgeniczne, np. w sposób tu opisany, które zawierają specyficzny wariant alleliczny genu FRP lub składnika szlaku Wnt. Te myszy można uzyskać np. zastępując natywny gen FRP lub składnika szlaku Wnt allelem genu FRP lub składnika szlaku Wnt człowieka. Można wówczas ustalić reakcję tych myszy na dane leki, oparte na FRP lub składników szlaku Wnt.
Zwierzęta transgeniczne do identyfikacji leków
Zwierzęta transgeniczne, które można wykorzystać do rozmaitych celów, np. do identyfikacji leków przeciw jaskrze obejmują zwierzęta zawierające mutacje w sekwencjach kwasu nukleinowego, dające nieprawidłowo wysokie poziomy FRP (np. mutacje w genach kodujących czynniki transkrypcyjne regulujące ekspresję FRP). Alternatywnie, zwierzęta transgeniczne mogą zawierać mutacje w składnikach szlaku sygnałowego Wnt, takich jak frizzled (Fz); disheveled (Dsh); kinaza syntazy glikogenowej 3 (GSK3), kinaza białkowa C (APC), β-kateniny, oraz białka HMG (np. LEF/TCF (limfoidalny czynnik wzmacniający/czynnik komórek T)). Zwierzęta takie mogą być wykorzystane np. do określania skutków fenotypowych zaburzeń ekspresji tych genów w komórkach siateczki włókien kolagenowych w kącie przesączania oka, których ekspresja jest regulowana przez szlak sygnałowy Wnt.
Zwierzęta transgeniczne mogą być też zwierzętami zawierającymi transgen, np. gen reporterowy, pod kontrolą promotora FRP lub jego fragmentu. Zwierzęta te mogą być przydatne np. do identyfikacji leków modulujących wytwarzanie FRP, na przykład, przez modulację ekspresji genu FRP. Promotor genu FRP może być wyizolowany np. przez przeszukiwanie biblioteki genomowej przy użyciu fragmentu cDNA FRP i scharakteryzowany sposobami znanymi w tej dziedzinie.
Jeszcze inne zwierzęta nie będące ludźmi niosą geny kodujące składniki szlaku sygnałowego Wnt, u których ekspresja endogennego genu uległa mutacji lub zlikwidowaniu poprzez tzw. „nokaut. Zwierzęta te mogą być wykorzystane do sprawdzania, czy brak któregoś ze składników szlaku sygnałowego Wnt prowadzi do specyficznego fenotypu. Sposoby otrzymywania zwierząt transgenicznych i z nokautem są znane specjalistom z tej dziedziny i omówione poniżej.
Na przykład, korzystnie zwierzęta transgeniczne niosą heterologiczny gen wyrażający FRP, co prowadzi do podwyższenia poziomu ekspresji genu FRP w tkance oka.
Korzystnie tkanką tą jest siateczka włókien kolagenowych w kącie przesączania, a komórkami wykazującymi nadekspresję FRP są komórki siateczki włókien kolagenowych. Korzystnie, zwierzęta transgeniczne wykazujące podwyższony poziom ekspresji FRP w komórkach siateczki włókien kolagenowych mają przynajmniej jeden objaw charakterystyczny dla jaskry, taki jak zwiększone ciśnienie wewnątrzgałkowe (IOP). Korzystnie, zwierzęta transgeniczne dostarczają systemu in vivo, który może być wykorzystany do przeszukiwania związków pod kątem zastosowania w leczeniu jaskry oraz do opracowywania testów diagnostycznych dla tej choroby.
Systemy oparte na zwierzętach
Systemy oparte na zwierzętach dotyczą zwierząt transgenicznych zbudowanych z komórek (tego zwierzęcia) zawierających transgen, które korzystnie (choć jest to jedna z opcji) wyrażają egzogenne białko FRP w więcej niż jednej komórce zwierzęcia. Transgen FRP może kodować białko typu dzikiego lub jego homologi, łącznie z agonistami i antagonistami, a także konstrukty antysensowne. Korzystnie, ekspresja transgenu jest ograniczona do specyficznych grup komórek, tkanek lub etapów
PL 208 368 B1 rozwoju zwierzęcia, co osiąga się stosując np. sekwencje działające w pozycji cis, które kontrolują ekspresję w żądany sposób. Takie mozaikowe wyrażanie białka FRP może odgrywać istotną rolę w przypadku wielu form analizowania linii komórkowych, i dodatkowo dostarcza np. sposobu badania różnych skutków braku ekspresji FRP, który to brak może znacznie zaburzać rozwój małych obszarów tkanek w obrębie normalnego na pozór zarodka. W związku z powyższym, sekwencje regulatorowe swoiste względem tkanki, a także warunkowe sekwencje regulatorowe, mogą być wykorzystane do kontroli ekspresji transgenu w ramach określonych wzorów przestrzennych. Ponadto, badać też można czasowe zróżnicowanie ekspresji, stosując np. warunkowe systemy rekombinacyjne lub prokariotyczne transkrypcyjne sekwencje regulacyjne.
Techniki genetyczne, umożliwiające regulację ekspresji transgenów przez miejscowo specyficzne manipulacje genetyczne in vivo, znane są specjalistom z tej dziedziny. Na przykład, dostępne są systemy genetyczne umożliwiające regulowaną ekspresję rekombinazy, która katalizuje rekombinację genetyczną docelowej sekwencji. Stosowany tu zwrot „sekwencja docelowa odnosi się do sekwencji nukleotydowej, która jest genetycznie rekombinowana przez rekombinazę. Sekwencja docelowa jest oflankowana sekwencjami rozpoznawanymi przez rekombinazę i jest na ogół albo wycinana albo też odwracana w komórkach wykazujących aktywność rekombinazy. Zdarzenia rekombinacji katalizowane przez rekombinazę mogą być tak zaprojektowane, że dają w efekcie aktywację lub represję ekspresji jednego z rozważanych tu białek FRP. Na przykład, można zaprojektować wycięcie sekwencji docelowej zaburzającej ekspresję zrekombinowanego genu FRP, takiej która np. koduje antagonistyczny homolog lub transkrypt antysensowny, tak aby osiągnąć aktywację ekspresji tego genu. Zaburzenie wyrażania białka może wynikać z rozmaitych mechanizmów, takich jak np. przestrzenne rozdzielenie genu FRP i elementu promotorowego lub też obecność wewnętrznego kodonu terminacyjnego. Ponadto, można wytworzyć transgen, w którym sekwencja kodująca genu jest oflankowana sekwencjami rozpoznawanymi przez rekombinazę i jest początkowo transfekowana do komórek w orientacji 3'-5' względem elementu promotorowego. W takim przypadku, odwrócenie sekwencji docelowej zmieni orientację danego genu przez umieszczenie końca 5' sekwencji kodującej w pozycji umożliwiającej promotorowi aktywację transkrypcji.
Zwierzęta transgeniczne zawierają w obrębie swoich licznych komórek transgen, który to transgen zmienia fenotyp „komórki gospodarza pod względem regulacji funkcji komórki, wzrostu komórki, śmierci i/lub różnicowania komórki. Ponieważ możliwe jest wytwarzanie transgenicznych organizmów przy użyciu jednego lub większej liczby opisanych tu konstruktów, podany będzie poniżej ogólny opis wytwarzania transgenicznych organizmów odnoszący się głównie do egzogennego materiału genetycznego. Ten ogólny opis może być zaadaptowany przez specjalistów w tej dziedzinie w celu włączenia sekwencji specyficznych transgenów do organizmów przy użyciu sposobów i materiałów opisanych poniżej.
Specyficzny miejscowo system rekombinacji genetycznej in vivo można wytworzyć przy użyciu systemu rekombinazy cre/loxP bakteriofaga P1 (Lakso i wsp. (1992) PNAS 89:6232-6236; Orban i wsp. (1992) PNAS 89:6861-68 65) lub też systemu rekombinazy FLP Saccharomyces cerevisiae (O'Gorman i wsp. (1991) Science 251:1351-155; publikacja PCT WO 92/15694). Rekombinaza Cre katalizuje specyficzną miejscowo rekombinację sekwencji docelowej położonej między sekwencjami loxP. Sekwencje loxP są sekwencjami powtórzonymi o długości 34 par zasad, do których przyłącza się rekombinaza Cre i które są wymagane do katalizowanej przez nią rekombinacji genetycznej. Orientacja sekwencji loxP decyduje o tym, czy leżąca między nimi sekwencja docelowa jest wycinana lub odwracana w obecności rekombinazy Cre (Abramski i wsp. (1984) J. Biol. Chem. 259:1509-1514); rekombinaza katalizuje wycięcie sekwencji docelowej, gdy sekwencje loxP są ułożone w tej samej orientacji, a inwersję sekwencji docelowej, gdy sekwencje loxP są ułożone jako powtórzenia odwrócone.
Zgodnie z powyższym, rekombinacja genetyczna sekwencji docelowej jest zależna od ekspresji rekombinazy Cre. Ekspresja rekombinazy może być regulowana przez elementy promotorowe podlegające kontroli regulacyjnej, np. tkankowo specyficznej, swoistej dla stadium rozwoju, indukowanej lub hamowanej przez czynniki dodane z zewnątrz. Ta regulowana kontrola będzie prowadzić do rekombinacji genetycznej sekwencji docelowej jedynie w tych komórkach, w których ekspresja rekombinazy jest aktywowana przez element promotorowy. Tak więc aktywacja ekspresji zrekombinowanego białka FRP będzie regulowana poprzez kontrolę ekspresji rekombinazy.
Zastosowanie systemu rekombinazy cre/loxP do regulowania ekspresji zrekombinowanego białka FRP wymaga skonstruowania transgenicznego zwierzęcia zawierającego transgen kodujący zarówno rekombinazę Cre, jak i badane białko. Zwierzęta zawierające zarówno gen rekombinazy Cre,
PL 208 368 B1 jak i zrekombinowany gen FRP, można otrzymać przez skonstruowanie „podwójnych zwierząt transgenicznych. Dogodnym sposobem otrzymania takich zwierząt jest krzyżowanie dwóch transgenicznych zwierząt, z których każdy zawiera inny transgen, np. gen FRP i gen rekombinazy.
Jedna z korzyści wynikająca z początkowego konstruowania transgenicznych zwierząt zawierających transgen FRP w układzie ekspresyjnym regulowanym przez rekombinazę jest związana z istnieniem pewnego prawdopodobieństwa, że badane białko, o działaniu agonistycznym lub antagonistycznym, może być bardzo szkodliwe w przypadku ekspresji w transgenicznym zwierzęciu. W takim wypadku, populacja założycielska, w której transgen jest nieaktywny we wszystkich tkankach, może być rozmnażana i utrzymywana. Osobniki z tej populacji założycielskiej mogą być krzyżowane np. ze zwierzętami wyrażającymi rekombinazę w jednej lub większej liczbie tkanek i/lub według żądanego wzoru czasowego. Tak więc utworzenie populacji założycielskiej, w której np. antagonistyczny transgen FRP jest nieaktywny, pozwoli badać jego potomstwo, u którego zaburzenie funkcji FRP w konkretnej tkance lub w pewnym momencie rozwoju będzie powodować np. wystąpienie fenotypu letalnego.
Podobne warunkowe transgeny można dostarczyć wykorzystując prokariotyczne sekwencje promotorowe, które wymagają jednoczesnego wyrażania białek prokariotycznych do ułatwienia ekspresji transgenu FRP. Przykładowe promotory i odpowiadające im białka prokariotyczne, działające w pozycji trans, są opisane w patencie USA nr 4833080.
Ponadto, ekspresja warunkowych transgenów może być indukowana przez sposoby zbliżone do terapii genowej, gdzie gen kodujący białko aktywujące w pozycji trans (np. rekombinazę lub białko prokariotyczne) jest dostarczany do tkanki i poddany ekspresji w sposób specyficzny komórkowo. Tym sposobem, transgen FRP może pozostawać nieaktywny aż do okresu dorosłego, gdy zostaje „włączony przez wprowadzenie trans-aktywatora.
„Transgeniczne zwierzęta nie będące człowiekiem wytwarza się przez wprowadzanie transgenów do linii komórek płciowych zwierzęcia niebędącego człowiekiem. Do wprowadzenia transgenu można zastosować zarodkowe komórki docelowe na różnym etapie rozwoju. W zależności od etapu rozwoju zarodkowego komórki docelowej stosuje się różne sposoby. Specyficzne linie hodowlane dowolnego użytego zwierzęcia wybiera się pod kątem ogólnego dobrego stanu zdrowia, wysokiej wydajności wytwarzania zarodków, dobrej widoczności przedjądrza w zarodku i dobrych cech reprodukcyjnych. Dodatkowo, ważnym czynnikiem jest haplotyp. Na przykład, gdy wytwarzane mają być transgeniczne myszy, często używane są takie szczepy jak C57BL/6 lub FVB (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Korzystnie szczepy mają haplotypy H-2b, H-2d lub H-2q, takie jak C57BL/6 lub DBA/1. Wykorzystywane linie same mogą być liniami transgenicznymi i/lub liniami z nokautem (tj. otrzymanymi ze zwierząt, u których jeden lub więcej genów poddano częściowej lub całkowitej supresji).
Konstrukt z transgenem wprowadza się do zarodka w fazie jednokomórkowej. Zygota jest najlepszym celem dla mikroiniekcji. U myszy, męskie przedjądrze osiąga rozmiary około 20 mikrometrów średnicy, co pozwala na powtarzalną mikroiniekcję 1-2 pl roztworu DNA. Główną zaletą stosowania zygot jako celu transferu genowego jest to, że w większości przypadków wprowadzone DNA ulegnie wbudowaniu do genomu gospodarza przed zajściem pierwszego podziału (Brinster i (1985) PNAS 82:4438-4442). W konsekwencji, wszystkie komórki transgenicznego zwierzęcia będą zawierać wbudowany transgen. Znajdzie to też, na ogół, swoje odbicie w wydajnym przekazywaniu transgenu potomstwu założyciela, skoro 50% komórek płciowych będzie zawierało transgen.
Zapłodnione zarodki są zazwyczaj inkubowane w odpowiedniej pożywce do momentu pojawienia się przedjądrzy. Mniej więcej w tym czasie sekwencja nukleotydowa zawierająca transgen jest wprowadzana do żeńskiego lub męskiego przedjądrza, jak opisano poniżej. W niektórych gatunkach, takich jak mysz, korzystniej jest używać przedjądrza męskiego. Najkorzystniej jest, gdy egzogenny materiał jest dodawany do męskiego DNA w zygocie przed jego kontaktem z jądrem komórki jajowej lub żeńskim przedjądrzem zarodka. Uważa się, że jądro komórki jajowej lub żeńskie przedjądrze uwalniają cząsteczki, które wpływają w pewien sposób na męską część DNA, prawdopodobnie przez zastąpienie protamin histonami, ułatwiając w ten sposób łączenie żeńskiego i męskiego DNA i utworzenie diploidalnej zygoty.
Tak więc korzystnie egzogenny materiał genetyczny dodaje się do męskiego DNA lub jakiegokolwiek innego odpowiedniego, przed rozpoczęciem opisanego działania żeńskiego przedjądrza. Na przykład, egzogenny materiał genetyczny dodaje się do wczesnego męskiego przedjądrza tuż po jego utworzeniu. W tym momencie męskie i żeńskie przedjądrza są od siebie wyraźnie oddzielone
PL 208 368 B1 i oba ulokowane są w pobliżu błony komórkowej. Alternatywnie, egzogenny materiał genetyczny można dodać do jąder spermatocytów po wzbudzeniu ich dekondensacji. Spermatocyty zawierające egzogenny materiał genetyczny można następnie dodać do komórki jajowej lub też zdekondensowane spermatocyty można dodać do komórki jajowej, a bezpośrednio potem dodać konstrukty transgenowe.
Wprowadzenie sekwencji nukleotydowej transgenu do zarodka można dokonać sposobami znanymi specjalistom z tej dziedziny, takimi jak np. mikroiniekcja, elektroporacja lub lipofekcja. Po wprowadzeniu sekwencji nukleotydowej transgenu do zarodka, zarodek ten może być inkubowany in vitro przez różny czas lub reimplantowany do zastępczego gospodarza albo też poddany obu tym zabiegom. Inkubację przeprowadza się do dojrzałości. Jeden z powszechnie stosowanych sposobów obejmuje inkubację zarodków in vitro przez okres 1-7 dni, w zależności od gatunku, a następnie ich reimplantację do gospodarza zastępczego.
Zygota jest zasadniczo komórką diploidalną, która zdolna jest rozwinąć się w kompletny organizm. Generalnie, zygota składać się będzie z komórki jajowej zawierającej jądro utworzone, drogą naturalną lub sztuczną, przez fuzję dwóch haploidalnych jąder gamety lub gamet. Tak więc jądra gamet muszą być naturalnie zgodne tj. muszą prowadzić do utworzenia zygoty zdolnej do przejścia procesu różnicowania i rozwoju, prowadzącego do powstania funkcjonującego organizmu. Generalnie, korzystnie zygota jest euploidalna. W przypadku otrzymania zygoty aneuplodalnej, liczba chromosomów nie powinna różnić się od liczby euploidalnej w organizmie, z którego pochodziła gameta, o więcej niż jeden.
Oprócz podobnych uwarunkowań biologicznych, także uwarunkowania fizyczne decydują o ilości (tj. objętości) egzogennego materiału genetycznego, który można dodać do jądra zygoty lub też który tworzy część jądra zygoty. Jeśli nie usuwa się żadnego materiału genetycznego, wówczas ilość dodawanego egzogennego materiału genetycznego jest ograniczona ilością, która może być absorbowana bez powodowania fizycznych uszkodzeń. Generalnie, objętość wprowadzonego egzogennego materiału nie będzie przekraczać 10 pikolitrów. Fizyczne skutki wprowadzenia materiału do zygoty nie powinny prowadzić do dużych uszkodzeń zaburzających żywotność zygoty. Ograniczenia biologiczne dotyczące liczby i różnorodności sekwencji DNA zależeć będą od konkretnej zygoty i od funkcji egzogennego materiału genetycznego i będą oczywiste dla specjalistów z tej dziedziny, ponieważ materiał genetyczny, w tym, egzogenny materiał genetyczny, powstającej zygoty musi być biologicznie zdolny do inicjacji i kontynuacji różnicowania oraz rozwoju zygoty prowadzącego do powstania funkcjonującego organizmu.
Liczba kopii konstruktów transgenu, które dodaje się do zygoty, zależy od całkowitej ilości dodawanego egzogennego materiału genetycznego. Będzie to też ilość, która umożliwi zajście transformacji genetycznej. Choć teoretycznie wymagana jest tylko jedna kopia, to jednak w praktyce korzysta się z wielu kopii, np. 1000-20000 kopii konstruktu transgenu, w celu zapewnienia obecności jednej funkcjonalnej kopii. W niniejszym przypadku dużą zaletę stanowiłoby posiadanie więcej niż jednej funkcjonującej kopii każdej wstawionej egzogennej sekwencji DNA, co wzmacniałoby ekspresję fenotypową egzogennych sekwencji DNA.
Dowolna technika pozwalająca na dodawanie egzogennego materiału genetycznego do jądrowego materiału genetycznego może być wykorzystywana tak długo, jak długo nie powoduje ona uszkodzeń komórki, błony komórkowej albo innych struktur komórkowych lub genetycznych. Korzystnie wprowadza się egzogenny materiał genetyczny do jądrowego materiału genetycznego przy użyciu mikroiniekcji. Technika mikroiniekcji komórek i struktur komórkowych jest techniką znaną specjalistom z tej dziedziny.
Reimplantację wykonuje się przy użyciu standardowych sposobów. Zazwyczaj, gospodarz zastępczy jest usypiany, a zarodki są wprowadzane do jajowodu. Liczba zarodków implantowanych w konkretnym organizmie gospodarza będzie zależeć od gatunku, jednak w większości przypadków będzie zbliżona do liczby potomstwa, które dany gatunek produkuje w normalnych warunkach.
Potomstwo transgeniczne zastępczego gospodarza może być przeszukiwane pod kątem obecności i/lub ekspresji transgenu przy użyciu odpowiednich sposobów. Analiza przesiewowa jest zwykle przeprowadzana przy użyciu PCR, techniki Southerna lub analizy Northern przy użyciu sondy komplementarnej przynajmniej do części transgenu. Jako alternatywny lub dodatkowy sposób przesiewania pod kątem obecności produktu transgenu wykorzystać można analizę Western z użyciem przeciwciał skierowanych przeciwko białku kodowanemu przez transgen. Alternatywnie, te tkanki lub komórki, które powinny wykazywać najwyższy poziom ekspresji transgenu, są testowane pod kątem obecności
PL 208 368 B1 i ekspresji transgenu przy uż yciu techniki Southerna lub PCR, aczkolwiek wszystkie tkanki i komórki mogą być użyte do tego typu analizy.
Alternatywne lub dodatkowe sposoby oceniania obecności transgenu obejmują, bez ograniczeń, odpowiednie testy biochemiczne, takie jak testy enzymatyczne i/lub immunologiczne, barwienia histologiczne dla konkretnego markera lub aktywności enzymatycznej, analizę cytometrii przepływowej, itp. Analiza krwi może również być użyteczna przy wykrywaniu obecności produktu transgenu we krwi, jak również przy ocenianiu efektu transgenu na poziomie różnego typu komórek krwi i innych składników krwi.
Potomstwo zwierząt transgenicznych można otrzymać krzyżując transgeniczne zwierzę z odpowiednim partnerem, lub też poprzez zapłodnienie in vitro komórek jajowych i/lub spermatocytów, otrzymanych od zwierzęcia transgenicznego. W przypadku krzyżowania z partnerem, partner ten może być, lecz nie musi, zwierzęciem transgenicznym lub z nokautem. Jeśli jest to zwierzę transgeniczne, może zawierać ten sam lub odmienny transgen, albo zarówno jeden, jak i drugi. Alternatywnie, partner może pochodzić z linii rodzicielskiej. W przypadku zapłodnienia in vitro, zapłodniony zarodek można implantować do gospodarza zastępczego lub inkubować in vitro, bądź też zastosować obie te procedury. Po zastosowaniu każdego z tych sposobów, potomstwo można oceniać pod kątem obecności transgenu przy użyciu sposobów opisanych powyżej, lub też innych odpowiednich sposobów.
Wytwarzane transgeniczne zwierzęta zawierać będą egzogenny materiał genetyczny. Jak opisano powyżej, egzogenny materiał genetyczny będzie w pewnych wykonaniach zawierał sekwencję DNA wywołującą wytwarzanie białka FRP (agonistycznego lub antagonistycznego) lub transkrypt antysensowny albo też zmutowaną wersję FRP. W takich wykonaniach sekwencja może być przyłączona do elementu kontroli transkrypcyjej, np. promotora, który korzystnie umożliwia ekspresję produktu transgenu w specyficznym typie komórek.
Do wprowadzania transgenu do organizmu zwierzęcia można również wykorzystać infekcję retrowirusową. Rozwijający się zarodek zwierzęcy może być hodowany in vitro do etapu blastocysty. W tym czasie, blastomery mogą być poddane infekcji retrowirusowej (Jeanich, R. (1976) PNAS 73:1260-1264). Wydajną infekcję blastomerów otrzymuje się po enzymatycznym usunięciu błony przejrzystej (zona pellucida) (Manipulating the Mouse Embryo, red. Hogan (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986). Wirusowy system wektorowy używany do wprowadzania transgenu obejmuje zwykle defektywnego pod względem replikacji retrowirusa niosącego transgen (Jahner i wsp. (1985) PNAS 82:6927-6931; Van der Putten i wsp. (1985) PNAS 82:6148-6152). Transfekcję przeprowadza się łatwo i wydajnie przez hodowanie blastomerów na monowarstwie komórek produkujących wirusa (Van der Putten i wsp., jak wyżej; Stewart i wsp. (1987) EMBO J. 6:383-388). Alternatywnie, można przeprowadzić infekcję w późniejszym etapie rozwoju. Wirusy, lub komórki je produkujące, można wstrzyknąć do blastoceli (Jahner i wsp. (1982) Nature 298:623-628). Większość osobników założycielskich będzie mozaikami pod względem transgenu, ponieważ inkorporacja zachodzi tylko w części komórek tworzących zwierzę transgeniczne. Ponadto, założyciel może zawierać różne retrowirusowe insercje transgenu w różnych pozycjach w genomie, które generalnie będą segregować w potomstwie. Dodatkowo, możliwe jest wprowadzenie transgenów do linii komórek płciowych przez przeprowadzenie wewnątrzmacicznej infekcji retrowirusowej zarodka środkowego okresu ciąży (Jahner i wsp. (1982) jak wyżej).
Trzecim rodzajem komórek docelowych, wykorzystywanym do wprowadzania transgenu, są zarodkowe komórki macierzyste (ES, ang. embryonal stem) (Evans i wsp. (1981) Nature 292:154-156; Bradley i wsp. (1984) Nature 309:255-258; Gossler i wsp. (1986) PNAS 83:9065-9069; oraz Robertson i wsp. (1986) Nature 322:445-448). Transgeny można wydajnie wprowadzać do ES przez transfekcję DNA lub transdukcję przy użyciu retrowirusów. Takie stransformowane komórki ES mogą być następnie łączone z blatocystami zwierzęcia. Komórki ES kolonizują wówczas zarodek i wchodzą także w skład linii komórek płciowych u otrzymywanej w ten sposób chimery zwierzęcej (dla przeglądu patrz Jaenisch, R. (1988) Science 240:1468-1474).
Do wprowadzania zmian w hodowanych zarodkowych komórkach macierzystych wykorzystuje się metodę kierowania genu do celu, opartą na modyfikacji genomu zwierzęcego drogą homologicznej rekombinacji. Przez kierowanie do celu genu FRP będącego przedmiotem zainteresowania w komórkach ES, można wprowadzać tego typu zmiany w linii komórek płciowych zwierzęcia, otrzymując chimerę. Procedurę kierowania genu do celu przeprowadza się wprowadzając do komórek linii hodowlanej konstrukty DNA, zawierające segment homologiczny do docelowego locus FRP oraz zamierzoną modyfikację w sekwencji genomowej FRP (np. insercję, delecję, mutację punktową). Tak potraktowaPL 208 368 B1 ne komórki są następnie przeszukiwane pod kątem precyzyjnego nakierowania na cel dla zidentyfikowania klonów i izolowania tych, u których udało się trafić we właściwe miejsce.
Kierowanie do celu w zarodkowych komórkach macierzystych jest w zasadzie schematem rozpatrywanym niniejszym jako sposób na uszkodzenie funkcji genu FRP przez użycie nakierowanego konstruktu transgenowego zaprojektowanego tak, aby podlegał homologicznej rekombinacji z jedną lub większą liczbą sekwencji genomowych FRP. Konstrukt ten może być także tak zaprojektowany, aby po rekombinacji z elementem genu FRP, do kodującej sekwencji genu wprowadzony został na drodze insercji (lub wymiany) marker selekcji pozytywnej. Wprowadzona sekwencja zaburza funkcję genu FRP, dostarczając jednocześnie cechy służącej do pozytywnej selekcji. Przykładowe konstrukty do nakierowanej wymiany genu FRP opisane zostały szczegółowo poniżej.
Generalnie, zarodkowe komórki macierzyste (komórki ES) używane do wytwarzania zwierząt z nokautem będą pochodziły z tego samego gatunku, do którego należeć będzie zwierzę z nokautem, które ma zostać otrzymane. Przykładowo więc, do wytwarzania myszy z nokautem używać się będzie na ogół mysich zarodkowych komórek macierzystych.
Zarodkowe komórki macierzyste uzyskuje się i hoduje przy zastosowaniu znanych specjalistom sposobów, takich jak te opisane przez Doetschmana i wsp. ((1985) J. Embryol. Exp. Morphol. 87:27-45). Wykorzystać można dowolną linię komórek ES, jednak wybiera się zwykle takie linie, których komórki wykazują zdolność do integracji i współtworzenia linii komórek płciowych rozwijającego się zarodka, tak aby uzyskać później przekazywanie konstruktu nokautowego przez linię komórek płciowych. Tak więc każda linia komórek ES, która wykazuje takie zdolności, może być tu zastosowana. Szczepem mysim wykorzystywanym często do wytwarzania komórek ES, jest szczep 129J. Inna linia komórek ES to mysia linia komórkowa D3 (ATCC, nr katalogowy CKL 1934). Jeszcze inną korzystną linią komórkową ES jest linia WW6 (Ioffe i wsp. (1995) PNAS 92:7357-7361). Komórki są hodowane i przygotowywane do wprowadzenia konstruktów nokautowych przy użyciu znanych specjalistom sposobów, takich jak te przedstawione przez Robertsona w: Teratocarcinomas and Embryonic Stern Cells: A Practical Approach, E.J. Robertson, IRL Press, Waszyngton, D.C. [1987]; przez Bradley'a i wsp. (1986) Current Topics in Devel. Biol. 20:357-371) oraz przez Hogana i wsp. (Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY [1986]).
Wstawienie konstruktu nokautowego do komórek ES można osiągnąć przy użyciu rozmaitych sposobów znanych specjalistom, obejmujących np. elektroporację, mikroiniekcję, oraz traktowanie fosforanem wapnia. Korzystnym sposobem wprowadzania jest elektroporacja.
Każdy konstrukt nokautowy wprowadzany do komórki musi mieć postać liniową. Dlatego też, jeśli konstrukt nokautowy został wprowadzony do wektora (opisanego poniżej), dokonuje się jego linearyzacji przez trawienie DNA odpowiednią endonukleazą restrykcyjną, wybraną tak, aby cięła jedynie w obrębie sekwencji wektora, a nie w obrębie sekwencji konstruktu nokautowego.
W celu przeprowadzenia insercji, konstrukt nokautowy jest dodawany do komórek ES przy zachowaniu warunków odpowiednich dla stosowanego sposobu insercji, znanych specjalistom z tej dziedziny. Gdy do komórek ES wprowadza się więcej niż jeden konstrukt, konstrukty nokautowe mogą być wprowadzane jednocześnie lub osobno w różnym czasie.
W przypadku stosowania elektroporacji, komórki ES oraz konstrukty nokautowe DNA poddaje się działaniu pulsu elektrycznego, przy użyciu maszyny do elektroporacji, stosując się do instrukcji producenta. Po elektroporacji, pozwala się zwykle komórkom ES na dojście do siebie, stosując odpowiednie warunki inkubacji. Następnie komórki przeszukuje się pod kątem obecności konstruktu nokautowego.
Badanie przesiewowe można przeprowadzić na wiele sposobów. Gdy genem markerowym jest np. gen oporności na antybiotyk, można hodować komórki w obecności stężeń antybiotyku w innym wypadku letalnych. Komórki ES, które przeżyją, mają przypuszczalnie konstrukt nokautowy. Jeśli gen markerowy nie jest genem oporności na antybiotyk, można wykorzystać technikę Southerna do badania genomowego DNA komórek ES, przy użyciu sondy będącej sekwencją DNA hybrydyzującą jedynie z sekwencją markera. Alternatywnie, można do tego wykorzystać PCR. Jeśli natomiast genem markerowym jest gen kodujący enzym, którego aktywność można wykrywać (np. b-galaktozydaza), do komórek można dodać w odpowiednich warunkach substrat dla enzymu, a następnie analizować aktywność enzymatyczną. Specjaliście z tej dziedziny znane będą inne użyteczne markery i sposoby wykrywania ich obecności w danej komórce. Konstrukt nokautowy może się wintegrować w kilku miejscach w genomie komórek ES i może też wbudować się w różnych miejscach w poszczególnych genomach komórek ES w wyniku zachodzenia przypadkowej insercji. Celowe miejsce insercji to pozycja
PL 208 368 B1 komplementarna do sekwencji DNA przeznaczonej do znokautowania, np. sekwencji kodującej genu FRP, sekwencji regulującej transkrypcję, itp. Zazwyczaj, mniej niż około 1-5% komórek ES, które zawierać będą konstrukt nokautowy, będzie mieć ten konstrukt włączony w żądanym miejscu. Aby zidentyfikować komórki ES zawierające prawidłowo wbudowane konstrukty nokautowe, izoluje się całkowity DNA z komórek ES, przy użyciu standardowych sposobów. DNA może być następnie analizowany techniką Southerna przy użyciu sondy lub sond zaprojektowanych tak, aby tworzyły charakterystyczny wzór po hybrydyzacji z fragmentami powstałymi w wyniku trawienia DNA genomowego konkretnym enzymem restrykcyjnym. Alternatywnie lub dodatkowo, można amplifikować genomowy DNA przy użyciu reakcji PCR, stosując swoiste startery, zaprojektowane tak, aby powielać fragmenty DNA o konkretnej wielkości i sekwencji (tj. tylko komórki zawierające konstrukt nokautowy włączony w prawidłowej pozycji będą dawać w fragmenty DNA o odpowiedniej wielkości).
Po zidentyfikowaniu odpowiednich komórek zawierających konstrukt nokautowy w odpowiedniej pozycji, komórki mogą być wprowadzone do zarodka. Proces ten może być przeprowadzony na wiele sposobów, znanych specjalistom z tej dziedziny, jednak korzystnym sposobem jest mikroiniekcja. W przypadku mikroiniekcji, zbiera się10-30 komórek do mikropipety i wstrzykuje się je do zarodków znajdujących się na odpowiednim etapie rozwoju, co umożliwia włączenie obcych komórek ES, zawierających znokautowany konstrukt do rozwijającego się zarodka. Na przykład, jak opisano to w załączonych przykładach, stransformowane komórki ES można wprowadzić do blastocyst stosując mikroiniekcję.
Odpowiedni wiek rozwoju dla zarodka używanego do wprowadzenia komórek ES zależy w dużym stopniu od gatunku, przy czym dla myszy jest to około 3,5 dnia. Zarodki otrzymuje się przez perfuzję macicy ciężarnych samic myszy. Odpowiednie sposoby wykonania tego zabiegu znane są specjalistom i przedstawione np. w Bradley i wsp. (jak wyżej).
Jakkolwiek wszystkie zarodki w odpowiedniej fazie rozwoju są odpowiednie do zastosowania, korzystnie stosuje się zarodki męskie. U myszy, korzystnie zarodki mają również geny kodujące kolor sierści, który jest odmienny od koloru kodowanego przez geny komórek ES. W ten sposób można w prosty sposób przeszukiwać potomstwo pod kątem obecności konstruktu nokautowego, wyszukując osobniki o mozaikowym kolorze sierści (co wskazuje, że komórki ES wbudowały się do rozwijającego się zarodka). A zatem, na przykład, jeśli linia komórek ES niesie gen dla białego futra, wybrany zarodek będzie niósł geny dla futra brązowego lub czarnego.
Po wprowadzeniu komórek ES do zarodka, może on być poddany implantacji do macicy matki zastępczej (będącej w stanie ciąży rzekomej). Choć można wykorzystać każdą matkę zastępczą, wybiera się ją zazwyczaj pod kątem zdolności do rozmnażania i opiekowania się potomstwem. Takie zastępcze matki przygotowuje się zwykle przez kojarzenie z samcami tego samego gatunku, poddanymi wcześniej wazektomii. Okres ciąży rzekomej matki zastępczej jest istotny dla udanej implantacji i zależy od gatunku. W przypadku myszy powinien to być 2-3 dzień ciąży rzekomej.
Potomstwo urodzone przez matkę zastępczą może być początkowo przeszukiwane pod kątem koloru sierści, jeśli zastosowano tę strategię (opisaną powyżej i w załączonych przykładach). Dodatkowo lub jako alternatywa, testować można DNA pochodzący z tkanki ogonowej potomstwa pod kątem obecności konstruktu nokautowego przy użyciu techniki Southerna i/lub PCR (jak opisano powyżej). Potomstwo, które wydaje się mieć cechy mozaikowe, można dalej krzyżować ze sobą, jeśli uważa się, że osobniki te mogą nieść transgen w swoich liniach komórek płciowych, w celu otrzymania homozygotycznych zwierząt z nokautem. Homozygoty mogą być identyfikowane przy użyciu techniki Southerna z zastosowaniem ekwiwalentnych ilości genomowego DNA pochodzącego z myszy będących produktem takiej krzyżówki oraz z myszy szczepu dzikiego i heterozgot.
Dostępne są również inne sposoby identyfikowania i charakteryzowania potomstwa z nokautem. Przykładowo, technika Northern może być wykorzystana do sondowania mRNA pod kątem obecności lub braku transkryptów kodujących znokautowany gen lub gen markerowy lub też oba geny. Dodatkowo, można wykorzystać technikę Western do oceny poziomu ekspresji znokautowanego genu FRP w różnych tkankach potomstwa, stosując przeciwciała skierowane przeciwko konkretnemu białku FRP lub też przeciwciało przeciwko produktowi genu markerowego, gdy gen ten ulega ekspresji. Na koniec wreszcie, wykorzystać można również analizę in situ (np. utrwalając komórki i znakując je przeciwciałami) i/lub FACS (aktywowane fluorescencyjnie sortowanie komórek ang. fluorescence activated cell sorting) do analizowania różnych komórek potomstwa przy użyciu odpowiednich przeciwciał, badając w ten sposób obecność lub brak produktu genu konstruktu nokautowego.
PL 208 368 B1
Jeszcze inne sposoby otrzymywania transgenicznych zwierząt z nokautem lub unieczynnionyn genem są również ogólnie znane. Patrz np. Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (Cold Spring Harbor, N.Y., 1986). Można też tworzyć nokauty zależne od rekombinazy, np. przez wykorzystanie homologicznej rekombinacji do wprowadzania sekwencji docelowych, tak, że specyficzna tkankowo i/lub okresowa regulacja inaktywacji genu FRP może być kontrolowana przez sekwencje rekombinazy (jak opisano poniżej).
Zwierzęta zawierające więcej niż jeden konstrukt nokautowy i/lub więcej niż jeden transgenowy konstrukt ekspresyjny wytwarza się dowolnym z szeregu sposobów.
Korzystnie sposób polega na otrzymywaniu serii zwierząt, z których każde zawiera jeden z żądanych fenotypów transgenicznych. Takie zwierzęta są poddawane serii krzyżówek, krzyżówek wstecznych i procesów selekcji, co w ostateczności prowadzi do otrzymania pojedynczego zwierzęcia zawierającego wszystkie żądane konstrukty nokautowe i/lub konstrukty ekspresyjne, przy czym zwierzę to jest w zasadzie kongeniczne (identyczne genetycznie) z typem dzikim, wyjątkiem obecności konstruktów nokautowych i/lub transgenicznych.
Wykonywanie niniejszego wynalazku będzie obejmować, o ile nie zaznaczono inaczej, konwencjonalne techniki biologii komórki, hodowli komórkowej, biologii molekularnej, biologii transgenicznej, mikrobiologii, rekombinowania DNA oraz immunologii, które to techniki są znane w tej dziedzinie. Techniki te są wyczerpująco objaśnione w literaturze. Patrz np. Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2 wyd., red. Sambrook, Fritsch, Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, tom I i II f (red. D. N. Glover, 1985); Oligonucleotide Synthesis (red. M. J. Gait, 1984); Mullis i wsp. Patent USA nr 4683195; Nucleic Acid Hybridization (red. B. D. Hames, S. J. Higgins 1984); Transcription And Translation (red. B. D. Hames, S. J. Higgins 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); rozprawa: Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (red. J. H. Miller and M. P. Calos, 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, tomy 154 i 155 (red. Wu i wsp.), Immunochemical Methods in Cell And Molecular Biology (red. Mayer and Walker, Academic Press, Londyn, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, tomy I-IV (red. D. M. Weir, C. C. Blackwell, 1986); Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1986).
Związek białka spokrewnionego z białkiem Frizzled (FRP-1) z jaskrą
Materiały i Metody
Sekwencja cDNA białka spokrewnionego z białkiem Frizzled zidentyfikowana przy użyciu różnicowego obrazowania RNA:
AACAGCCTGCCTGTCCCCCCGCACTTTTTACATATATTTGTTTCATTTCTGCAGAT GGAAAGTTGACATGGGTGGGGTGTCCCCATCCAGCGAGAGAGTTTCAAAAGCAAAACATCT CTGCAGTTTTTCCCAAGTACCCTGAGATACTTCCCAAAGCCCTTATGTTTAATCAGCGATG TATATAAGCCAGTTCACTTAGACAACTTTACCCTTCTTGTCCAATGTACAGGAAGTAGTTC T (SEK. Id. Nr :3)
Wyrażanie zrekombinowanego FRP lub białek szlaku Wnt w komórkach COS
W przykładzie tym opisano sposób konstruowania ludzkich genów FRP lub składników szlaku Wnt (o pełnej długości) w ssaczym systemie ekspresyjnym.
Konstrukt ekspresyjny zawierający kwas nukleinowy kodujący białko FRP lub składnik szlaku Wnt pełnej długości albo rozpuszczalne białko FRP lub składnik szlaku Wnt, można skonstruować w następujący sposób. Kwas nukleinowy kodujący białko FRP lub składnik szlaku Wnt pełnej długości lub też rozpuszczalne białko FRP lub składnik szlaku Wnt, opisane powyżej, otrzymuje się przez odwrotną transkrypcję (RT-PCR) przeprowadzoną na mRNA wyekstrahowanym z ludzkich komórek, wyrażających FRP lub składnik szlaku Wnt, np. komórek siateczki włókien kolagenowych w kącie przesączania oka, przy użyciu starterów PCR opartych na sekwencji przedstawionej w SEK NR ID: 1. Startery PCR zawierają odpowiednie miejsca restrykcyjne pozwalające na późniejsze wstawienie do plazmidu ekspresyjnego. Powielony kwas nukleinowy jest następnie wstawiany do eukariotycznego plazmidu ekspresyjnego, takiego jak pcDNAI/Amp (InVitrogen) zawierającego: 1) miejsce startu replikacji SV40, 2) gen oporności na ampicylinę, 3) miejsce startu replikacji E. coli, 4) promotor CMV, a za nim sekwencja polilinkera, intron SV40 i miejsce poliadenylacji. Fragment DNA kodujący ludzkie białko FRP lub składnik szlaku Wnt pełnej długości oraz znacznik HA lub myc, przyłączone do końca 3' genu
PL 208 368 B1 z zachowaniem ramki odczytu, sklonowano w regionie polilinkera wektora. Znacznik HA to epitop pochodzący z białka hemaglutyniny wirusa grypy (I. Wilson, H. Niman, R. Heighten, A. Cherenson, M. Connolly, R. Lerner, 1984, Cell 37, 767). Przyłączenie znacznika HA do FRP lub składnika szlaku Wnt umożliwia łatwą detekcję zrekombinowanego białka przy użyciu przeciwciała rozpoznającego epitop HA.
W celu otrzymania ekspresji zrekombinowanego FRP lub składnika szlaku Wnt, transfekuje się komórki COS wektorem ekspresyjnym, stosując metodę z użyciem DEAE-DEXTRAN (J. Sambrook, E. Fritsch, T. Maniatis; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Laboratory Press, (1989)). Wyrażone a białko FRP lub składniki szlaku Wnt, połączonych z epitopem HA, można wykryć przy użyciu znakowania radioaktywnego i immunoprecypitacji z zastosowaniem przeciwciała anty-HA (E. Harlow, D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1988)). W tym celu, transfekowane komórki znakuje się cyteiną-35S dwa dni po transfekcji. Komórki lub alternatywnie, pożywka hodowlana np. w przypadku rozpuszczalnych FRP i składników szlaku Wnt), są następnie wykorzystywane do immunoprecypitacji białka FRP lub składnika szlaku Wnt, przy użyciu specyficznego wobec HA monoklonalnego przeciwciała. Alternatywnie, ekspresja zrekombinowanego białka może być wykrywana przy użyciu techniki Western. W celu określenia, czy FRP lub składnik szlaku Wnt pełnej długości są białkami błonowymi czy białkami sekrecyjnymi, komórki stransfekowane wektorem kodującym FRP lub składnik szlaku Wnt pełnej długości można poddać lizie przy użyciu detergentu (bufor RIPA (150 mM NaCl; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% DOC, 50 mM Tris, ph 7,5) (Wilson I. i wsp., Cell 37:767 (1984)). Wytrącone białka mogą być następnie analizowane na żelu SDS-PAGE. Tak więc obecność FRP lub składnika szlaku Wnt w komórce będzie wskazywać na to, że białko FRP lub składnik szlaku Wnt pełnej długości mogą być białkami związanymi z błoną, natomiast obecność białka FRP lub składnika szlaku Wnt w supernatancie wskazywać będzie, że białko może występować również w formie rozpuszczalnej, czy to wytwarzane jako białko sekrecyjne czy uwalniane poprzez wyciekanie z komórki.
PL 208 368 B1
LISTA SEKWENCJI <110> ALCON LABORATORIES, INC.
<i20>Diagnostyka i leczenie jaskry <130> ALA-003.25 <140> PCT/US01/06100 <141> 2001-02-26 <150> 60/186,073 <151> 2000-02-29 <160> 3 ci70> patentln wer. 2.1 <210> i <211> 4469 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cctgcagcct ccggagtcag tgccgcgcgc ccgccgcccc gcgccttcct gctcgccgca 60 cctccgggag ccggggcgca cccagcccgc agcgccgcct ccccgcccgc gccgcctccg 120 accgcaggco gagggccgcc actggccggg gggaccgggc agcagcttgc ggccgcggag 180 ccgggcaacg ctggggactg cgccttttgt ccccggaggt ccctggaagt ttgcggcagg 240 acgcgcgcgg ggaggcggcg gaggcagccc cgacgtcgcg gagaacaggg cgcagagccg 300 gcatgggcat cgggcgcagc gaggggggcc gccgcggggc cctgggcgtg otgctggcgc 360 tgggcgcggc gcttctggcc gtgggctcgg ccagcgagta cgactacgtg agcttccagt 420 cggacatcgg cccgtaccag agcgggcgct tctacaccaa gccacctcag tgcgtggaca 480 tccccgcgga cctgcggctg tgccacaacg tgggctacaa gaagatggtg ctgcccaacc 540 tgctggagca cgagaccatg gcggaggtga agcagcaggc cagcagctgg gtgcccctgc 600 tcaacaagaa ctgccacgcc gggacccagg tcttcctctg ctcgctcttc gcgcccgtct 660 gcctggaccg gcccatctac ccgtgtcgct ggctctgcga ggccgtgcgc gactcgtgcg 720 agccggtcat gcagttcttc ggcttctact ggcccgagat gcttaagtgt gacaagttcc 780 cggaggggga cgtctgcatc gccatgacgc cgcccaatgc caccgaagcc tccaagcccc 840 aaggcacaac ggtgtgtcct ccctgtgaca acgagttgaa atctgaggcć atcattgaac 900 atctctgtgc cagcgagttt gcactgagga tgaaaataaa agaagtgaaa aaagaaaatg 960 gcgacaagaa gattgtcccc aagaagaaga agcccctgaa gttggggccc atcaagaaga 1020 aggacctgaa gaagcttgtg ctgtacctga agaatggggc tgactgtccc tgccaccagc 1080 tggacaacct cagccaccac ttcctcatca tgggccgcaa ggtgaagagc cagtacttgc 1140 tgacggccat ccacaagtgg gacaagaaaa acaaggagtt caaaaacttc atgaagaaaa 1200 tgaaaaacca tgagtgcccc acctttcagt ccgtgtttaa gtgattctcc cgggggcagg 1260 gtggggaggg agcctcgggt ggggtgggag cgggggggac agtgcccggg aacccgtggt 1320 cacacacacg cactgccctg tcagtagtgg acattgtaat ccagtcggct tgttcttgca 1380 gcattcccgc tecctttccc tccatagcca cgctccaaac cccagggtag ccatggccgg 1440 gtaaagcaag ggccatttag attaggaagg tttttaagat ccgcaatgtg gagcagcagc 1500 cactgcacag gaggaggtga caaaccattt ccaacagcaa cacagccact aaaacacaaa 1560 aagggggatt gggcggaaag tgagagccag cagcaaaaac tacattttgc aacttgttgg 1620 tgtggatcta ttggctgatc tatgcctttc aactagaaaa ttctaatgat tggcaagtca 1680 cgttgttttc aggtccagag tagtttcttt ctgtctgctt taaatggaaa cagactcata 1740 ccacacttac aattaaggtc aagcccagaa agtgataagt gcagggagga aaagtgcaag 1800 tccattatct aatagtgaca gcaaagggac caggggagag gcattgcctt ctctgcccac 1860 agtctttccg tgtgattgtc tttgaatctg aatcagccag tctcagatgc cocaaagttt 1920 cggttcctat gagcccgggg catgatctga tccccaagac atgtggaggg gcagcctgtg 1980 cctgcctttg tgtcagaaaa aggaaaccac agtgagcctg agagagacgg cgattttcgg 2040
PL 208 368 B1 gctgagaagg cagtagtttt caaaacacat agttaaaaaa gaaacaaatg aaaaaaattt 2100 tagaacagtc cagcaaattg ctagtcaggg tgaattgtga aattgggtga agagcttagg 2160 attctaatct catgtttttt ccttttcaca tttttaaaag aacaatgaca aacacccact 2220 tatttttcaa ggttttaaaa cagtctacat tgagcatttg aaaggtgtgc tagaacaagg 2280 tctcctgatc cgtccgaggc tgcttcccag aggagcagct ctccccaggc atttgccaag 2340 ggaggcggat ttccctggta gtgtagctgt gtggctttcc ttcctgaaga gtccgtggtt 2400 gccctagaac ctaacacccc ctagcaaaac tcacagagct ttccgttttt ttctttcctg 2460 taaagaaaca tttcctttga acttgattgc ctatggatca aagaaattca gaacagcctg 2520 cctgttcccc cgcacttttt acatatattt gtttcatttc tgcagatgga aagttgacat 2580 gggtggggtg tccccatcca gegagagagt ttcaaaagca aaacatctet gcagtttttc 2640 ccaagtaccc tgagatactt cccaaagccc ttatgtttaa tcagcgatgt atataagcca 2700 gttcacttag acaactttac ccttcttgtc caatgtacag gaagtagttc taaaaaaaat 2760 gcatattaat ttcttccccc aaagccggat tcttaattct ctgcaacact ttgaggacat 2820 ttatgattgt ccctctgggc caatgcttat acccagtgag gatgctgcag tgaggctgta 2880 aagtggcccc ctgcggccct agcctgaccc ggagaaagga tggtagatte tgttaactct 2940 tgaagactcc agtatgaaaa tcagcatgcc cgcctagtta cctaccggag agttatcctg 3000 ataaattaac ctctcacagt tagtgatcct gtccttttaa cacctttttt gtggggttct 3060 ctctgacctt tcatcgtaaa gtgctgggga ccttaagtga tttgcctgta attttggatg 3120 attaaaaaat gtgtatatat attagctaat tagaaatatt ctacttctct gttgtcaaac 3180 tgaaattcag agcaagttcc tgagtgcgtg gatctgggtc ttagttctgg ttgattcact 3240 caagagttca gtgctcatac gtatctgctc attttgacaa agtgcctcat gcaaccgggc 3300 cctctctctg cggcagagtc cttagtggag gggtttacct ggaacataag tagttaccac 3360 agaatacgga agagcaggtg actgtgctgt gcagctctct aaatgggaat tctcaggtag 3420 gaagcaacag cttcagaaag agctcaaaat aaattggaaa tgtgaatcgc agctgtgggt 3480 tttaccaccg tctgtctcag agtcccagga ccttgagtgt cattagttac tttattgaag 3540 gttttagacc catagcagct ttgtctctgt cacatcagca atttcagaac caaaagggag 3600 gctctctgta ggcacagagc tgcactatca cgagcctttg tttttctcca caaagtatct 3660 aacaaaacca atgtgcagac tgattggcct ggtcattggt ctccgagaga ggaggtttgc 3720 ctgtgatttg cctgtgattt cctaattatc gctagggcca aggtgggatt tgtaaagctt 3780 tacaataatc attctggata gagtcctggg aggtccttgg cagaactcag ttaaatcttt 3840 gaagaatatt tgtagttatc ttagaagata gcatgggagg tgaggattcc aaaaacattt 3900 tatttttaaa atatcctgtg taacacttgg ctcttggtac ctgtgggtta gcatcaagtt 3960 ctccccaggg tagaattcaa tcagagctcc agtttgcatt tggatgtgta aattacagta 4020 atcccatttc ccaaacctaa aatctgtttt tctcatcaga ctctgagtąa ctggttgctg 4080 tgtcataact tcatagatgc aggaggctca ggtgatctgt ttgaggagag caccctaggc 4140 agcctgcagg gaataacata ctggccgttc tgacctgttg ccagcagata cacaggacat 4200 ggatgaaatt eccgtttcct ctagtttctt cctgtagtac tcctctttta gatcctaagt 4260 ctcttacaaa agctttgaat actgtgaaaa tgttttacat tccatttcat ttgtgttgtt 4320 tttttaactg cattttacca gatgttttga tgttatcgct tatgttaata gtaattcccg 4380 tacgtgttca ttttattttc atgctttttc agccatgtat caatattcac ttgactaaaa 4440 tcactcaatt aatcaatgaa aaaaaaaaa 4469 <210> 2 <211> 313 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Gly Ile Gly Arg Ser Glu Gly Gly Arg Arg Gly Ala Leu Gly Val
1 5 10 15
Leu Leu Ala Leu Gly Ala Ala Leu Leu Ala Val Gly Ser Ala Ser Glu
20 25 30
Tyr Asp Tyr Val Ser Phe Gin Ser Asp Ile Gly Pro Tyr Gin Ser Gly
35 40 45
PL 208 368 B1
Arg Phe 50 Tyr Thr Lys Pro Pro Gin 55 Cys Val Asp Ile 60 Pro Ala Asp Leu
Arg Leu Cys His Asn Val Gly Tyr Lys Lys Met Val Leu Pro Asn Leu
65 70 75 80
Leu Glu His Glu Thr Met Ala Glu Val Lys Gin Gin Ala Ser Ser Trp
85 90 95
Val Pro Leu Leu Asn Lys Asn Cys His Ala Gly Thr Gin Val Phe Leu
100 105 110
Cys Ser Leu Phe Ala Pro Val Cys Leu Asp Arg Pro Ile Tyr Pro Cys
115 120 125
Arg Trp Leu Cys Glu Ala Val Arg Asp Ser Cys Glu Pro Val Met Gin
130 135 140
Phe Phe Gly Phe Tyr Trp Pro Glu Met Leu Lys Cys Asp Lys Phe Pro
145 150 155 160
Glu Gly Asp Val Cys Ile Ala Met Thr Pro Pro Asn Ala Thr Glu Ala
165 170 175
Ser Lys Pro Gin Gly Thr Thr Val Cys Pro Pro Cys Asp Asn Glu Leu
180 185 190
Lys Ser Glu Ala Ile Ile Glu His Leu Cys Ala Ser Glu Phe Ala Leu
195 200 205
Arg Met Lys Ile Lys Glu Val Lys Lys Glu Asn Gly Asp Lys Lys Ile
210 215 220
Val Pro Lys Lys Lys Lys Pro Leu Lys Leu Gly Pro Ile Lys Lys Lys
225 230 235 240
Asp Leu Lys Lys Leu Val Leu Tyr Leu Lys Asn Gly Ala Asp Cys Pro
245 250 255
Cys His Gin Leu Asp Asn Leu Ser His His Phe Leu Ile Met Gly Arg
260 265 270
Lys Val Lys Ser Gin Tyr Leu Leu Thr Ala Ile His Lys Trp Asp Lys
275 280 285
Lys Asn Lys Glu Phe Lys Asn Phe Met Lys Lys Met Lys Asn His Glu
290 295 300
Cys Pro Thr Phe Gin Ser Val Phe Lys
305 310 <210> 3 <211> 240 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 aacagcctgc ctgtcccccc gcacttttta catatatttg tttcatttct gcagatggaa 60 agttgacatg ggtggggtgt ccccatccag cgagagagtt tcaaaagcaa aacatctctg 120 cagtttttcc caagtaccct gagatacttc ccaaagccct tatgtttaat cagcgatgta 180 tataagccag ttcacttaga caactttacc cttcttgtcc aatgtacagg aagtagttct 240

Claims (3)

1. Sposób diagnozowania jaskry, znamienny tym, że obejmuje wykrywanie poziomu ekspresji mRNA kodującego ludzkie białko spokrewnione z białkiem frizzled-1 (FRP-1), którego sekwencję aminokwasową przedstawiono w Sekw. Id. Nr:2, w próbce pacjenta z komórek siatki włókien kolagenowych w kącie przesączania oka (TM), przy czym wykrywanie obejmuje wykorzystanie testu hybrydyzacji z zastosowaniem sondy kwasu nukleinowego swoiście hybrydyzującej z mRNA kodującym FRP-1, a zaburzony wyższy poziom mRNA w stosunku do poziomu u osoby zdrowej stanowi diagnozę stanu jaskry.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że poziom ekspresji mRNA kodującego FRP-1 określa się przez wykrycie tworzenia się kompleksu mRNA i sondy kwasu nukleinowego, która swoiście hybrydyzuje z mRNA.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że sonda kwasu nukleinowego jest znakowana fluorescencyjnie.
PL362437A 2000-02-29 2001-02-26 Sposób diagnozowania jaskry PL208368B1 (pl)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US18607300P 2000-02-29 2000-02-29

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL362437A1 PL362437A1 (pl) 2004-11-02
PL208368B1 true PL208368B1 (pl) 2011-04-29

Family

ID=22683545

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL362437A PL208368B1 (pl) 2000-02-29 2001-02-26 Sposób diagnozowania jaskry

Country Status (12)

Country Link
US (3) US7033755B2 (pl)
EP (2) EP1974738A3 (pl)
JP (2) JP2004512008A (pl)
KR (1) KR100748297B1 (pl)
CN (3) CN100460874C (pl)
AU (2) AU2001241768B2 (pl)
BR (1) BR0108802A (pl)
CA (2) CA2401775A1 (pl)
MX (1) MXPA02008487A (pl)
PL (1) PL208368B1 (pl)
WO (1) WO2001064949A2 (pl)
ZA (1) ZA200207647B (pl)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7704498A (en) * 1997-05-29 1998-12-30 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Human frp and fragments thereof including methods for using them
US6600018B1 (en) 2000-04-10 2003-07-29 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Secreted frizzled related protein, sFRP, fragments and methods of use thereof
US20030082233A1 (en) * 2000-12-01 2003-05-01 Lyons Karen M. Method and composition for modulating bone growth
TW201041580A (en) 2001-09-27 2010-12-01 Alcon Inc Inhibitors of glycogen synthase kinase-3 (GSK-3) for treating glaucoma
WO2003074735A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-12 Flammer, Josef Diagnostic method for glaucoma
CA2501235A1 (en) * 2002-10-04 2004-04-22 The Regents Of The University Of California Methods for treating cancer by inhibiting wnt signaling
AU2003293013A1 (en) * 2002-11-21 2004-06-18 University Of Massachusets Diagnosing and treating hematopoietic cancers
WO2005111234A2 (en) * 2004-05-12 2005-11-24 Sugen, Inc. Methods of using zc1 and zc3 kinase substrate phosphorylation as biomarkers
AU2005248351A1 (en) * 2004-05-14 2005-12-08 The Regents Of The University Of California Methods for treating cancer using anti-Wnt2 monoclonal antibodies and siRNA
TWI401316B (zh) * 2004-12-23 2013-07-11 Alcon Inc 用於治療青光眼之血清澱粉樣蛋白Ａ的ＲＮＡｉ抑制作用
JPWO2006077824A1 (ja) * 2005-01-18 2008-08-07 国立大学法人京都大学 神経細胞再生のための医薬
WO2006081379A1 (en) * 2005-01-26 2006-08-03 Wyeth Use of sfrps as markers of bmp activity
AU2006223131A1 (en) * 2005-03-11 2006-09-21 Alcon, Inc. RNAi-mediated inhibition of frizzled related protein-1 for treatment of glaucoma
US20060239951A1 (en) * 2005-03-30 2006-10-26 Alexandre Valentin Methods for stimulating hair growth by administering BMPs
WO2006116503A2 (en) * 2005-04-26 2006-11-02 Irm Llc Methods and compositions for modulating wnt signaling pathway
CA2715080C (en) 2007-09-28 2021-09-28 Intrexon Corporation Therapeutic gene-switch constructs and bioreactors for the expression of biotherapeutic molecules, and uses thereof
CN117159463A (zh) * 2017-08-20 2023-12-05 加州大学董事会 治疗青光眼的Wnt5a的调节
US20230221332A1 (en) * 2020-06-09 2023-07-13 Shimadzu Corporation Eye disease evaluation method
CN113405645B (zh) * 2021-06-08 2022-09-27 哈尔滨工程大学 一种基于活塞的耐静水压光纤水听器

Family Cites Families (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS5235043B2 (pl) * 1973-01-24 1977-09-07
GB8311018D0 (en) 1983-04-22 1983-05-25 Amersham Int Plc Detecting mutations in dna
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4833080A (en) 1985-12-12 1989-05-23 President And Fellows Of Harvard College Regulation of eucaryotic gene expression
US4998617A (en) 1986-09-15 1991-03-12 Laura Lupton Inc Facial cosmetic liquid make up kit
US5328470A (en) 1989-03-31 1994-07-12 The Regents Of The University Of Michigan Treatment of diseases by site-specific instillation of cells or site-specific transformation of cells and kits therefor
US5459039A (en) 1989-05-12 1995-10-17 Duke University Methods for mapping genetic mutations
FR2650840B1 (fr) 1989-08-11 1991-11-29 Bertin & Cie Procede rapide de detection et/ou d'identification d'une seule base sur une sequence d'acide nucleique, et ses applications
US6004744A (en) 1991-03-05 1999-12-21 Molecular Tool, Inc. Method for determining nucleotide identity through extension of immobilized primer
WO1992015694A1 (en) 1991-03-08 1992-09-17 The Salk Institute For Biological Studies Flp-mediated gene modification in mammalian cells, and compositions and cells useful therefor
US5922773A (en) * 1992-12-04 1999-07-13 The Children's Medical Center Corp. Glaucoma treatment
US5547835A (en) 1993-01-07 1996-08-20 Sequenom, Inc. DNA sequencing by mass spectrometry
US5593826A (en) 1993-03-22 1997-01-14 Perkin-Elmer Corporation, Applied Biosystems, Inc. Enzymatic ligation of 3'amino-substituted oligonucleotides
US5925748A (en) 1994-04-28 1999-07-20 The University Of Iowa Research Foundation DNA diagnostics for glaucoma
US5916778A (en) 1994-04-28 1999-06-29 University Of Iowa Research Foundation Diagnostics based on a glaucoma causing gene
US5885776A (en) 1997-01-30 1999-03-23 University Of Iowa Research Foundation Glaucoma compositions and therapeutic and diagnositic uses therefor
JP4063341B2 (ja) * 1994-07-06 2008-03-19 メイ株式会社 緑内障治療剤及び眼圧降下剤
US5789169A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Regents Of The University Of California Methods for the diagnosis of glaucoma
US5798380A (en) 1996-02-21 1998-08-25 Wisconsin Alumni Research Foundation Cytoskeletal active agents for glaucoma therapy
WO1997041854A1 (en) * 1996-05-07 1997-11-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibitors of glycogen synthase kinase-3 and methods for identifying and using the same
US5928662A (en) 1996-07-31 1999-07-27 Phillips; Andrew F. Ocular drug delivery device
EP0943014B1 (en) * 1996-12-05 2007-02-21 Alcon Manufacturing, Ltd. Methods for diagnosing glaucoma and discovering anti-glaucoma drugs
CA2283932A1 (en) * 1997-03-24 1998-10-01 Onyx Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing/treating disease based on beta-catenin/transcription factor interactions
WO1998044108A1 (en) * 1997-04-01 1998-10-08 The Regents Of The University Of California Diagnosis and prognosis of glaucoma
EP0879885A1 (en) * 1997-05-23 1998-11-25 Smithkline Beecham Corporation A novel human gene similar to a secreted murine protein sFRP-1
AU7704498A (en) * 1997-05-29 1998-12-30 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Human frp and fragments thereof including methods for using them
AU9017598A (en) 1997-08-12 1999-03-08 Human Genome Sciences, Inc. Human frezzled-like protein
JP2002505255A (ja) * 1998-02-21 2002-02-19 マックス−デルブルック−セントラム フュール モレクラーレ メディツィン βカテニンに基づくヒトの疾患の治療薬、その製造及び使用
EP0943684A3 (en) * 1998-03-10 2002-01-23 Smithkline Beecham Plc Frizzled-like polypeptides and polynucleotides
JPH11292764A (ja) * 1998-04-07 1999-10-26 Mitsui Chem Inc グルタミン酸類が関与する疾患の治療および／または予防薬
US6378526B1 (en) * 1998-08-03 2002-04-30 Insite Vision, Incorporated Methods of ophthalmic administration
MXPA02002624A (es) 1999-09-13 2002-07-30 Wyeth Corp Composiciones farmaceuticas y metodos de uso de proteinas secretadas relacionadas con la familia "frizzled".

Also Published As

Publication number Publication date
KR20030005212A (ko) 2003-01-17
CN100460874C (zh) 2009-02-11
JP2012025763A (ja) 2012-02-09
US7033755B2 (en) 2006-04-25
WO2001064949B1 (en) 2002-12-05
ZA200207647B (en) 2003-12-23
US20090226425A1 (en) 2009-09-10
JP2004512008A (ja) 2004-04-22
KR100748297B1 (ko) 2007-08-09
US20060216732A1 (en) 2006-09-28
MXPA02008487A (es) 2002-12-13
AU2001241768B2 (en) 2006-04-27
EP1974738A3 (en) 2008-12-17
US20020049177A1 (en) 2002-04-25
BR0108802A (pt) 2003-12-23
EP1974738A2 (en) 2008-10-01
US7807355B2 (en) 2010-10-05
PL362437A1 (pl) 2004-11-02
CA2729889A1 (en) 2001-09-07
CN101117644A (zh) 2008-02-06
CN1426482A (zh) 2003-06-25
WO2001064949A3 (en) 2002-09-19
AU4176801A (en) 2001-09-12
EP1259648A2 (en) 2002-11-27
CN1196797C (zh) 2005-04-13
CA2401775A1 (en) 2001-09-07
WO2001064949A9 (en) 2003-02-20
WO2001064949A2 (en) 2001-09-07
CN1667416A (zh) 2005-09-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL208368B1 (pl) Sposób diagnozowania jaskry
AU2001241768A1 (en) Diagnostics and therapeutics for glaucoma
US6399326B1 (en) Nucleic acids encoding neural/pancreatic receptor tyrosine phosphatase
US20060242724A1 (en) Receptor
JP2000511410A (ja) ナンセンス介在ｒｎａ崩壊の哺乳動物の調節因子
US7141543B2 (en) RIEG compositions and therapeutic and diagnostic uses therefor
JP2002510508A (ja) 緑内障の治療剤および診断剤
US7635766B2 (en) Insulin-responsive DNA binding proteins-1 and methods to regulate insulin-responsive genes
WO1999007854A2 (en) Serine/threonine kinase, and uses related thereto
US20090162848A1 (en) Noxin, a novel stress-induced gene involved in cell cycle and apoptosis
US20030165897A1 (en) Dispatched polypeptides
EP1228209B1 (en) &#34;insulin-responsive sequence dna binding protein-1&#34; (irsdbp-1), gene encoding it and uses thereof
US6306586B1 (en) Methods and compositions for the diagnosis and treatment of cataracts
US7098007B2 (en) Cloning and functional assays of Xenopus ATR
US20030106076A1 (en) Methods for identifying genes expressed in selected lineages, and a novel genes identified using the methods

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification